CN107960107A - 测量嵌合状态的方法 - Google Patents
测量嵌合状态的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN107960107A CN107960107A CN201680035111.3A CN201680035111A CN107960107A CN 107960107 A CN107960107 A CN 107960107A CN 201680035111 A CN201680035111 A CN 201680035111A CN 107960107 A CN107960107 A CN 107960107A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cell
- dna
- isolated
- genomic dna
- cnv
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 193
- 206010068051 Chimerism Diseases 0.000 title claims abstract description 125
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims abstract description 87
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims abstract description 58
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 550
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 164
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 claims description 149
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 139
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 138
- 238000011134 hematopoietic stem cell transplantation Methods 0.000 claims description 131
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 80
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 38
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 38
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 30
- 210000004700 fetal blood Anatomy 0.000 claims description 29
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 28
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 27
- 238000002513 implantation Methods 0.000 claims description 27
- 208000014951 hematologic disease Diseases 0.000 claims description 24
- 208000019838 Blood disease Diseases 0.000 claims description 23
- 208000018706 hematopoietic system disease Diseases 0.000 claims description 23
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 23
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 21
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 17
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 16
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 16
- 230000009467 reduction Effects 0.000 claims description 16
- 230000008685 targeting Effects 0.000 claims description 16
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 claims description 14
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 claims description 14
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 claims description 13
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 claims description 11
- 238000002650 immunosuppressive therapy Methods 0.000 claims description 9
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 claims description 9
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 8
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 claims description 8
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 claims description 6
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 claims description 5
- 230000004087 circulation Effects 0.000 claims description 5
- 208000002250 Hematologic Neoplasms Diseases 0.000 claims description 4
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 claims description 4
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 claims description 4
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 claims description 3
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 claims description 3
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 claims description 3
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 453
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 27
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 27
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 13
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 12
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 description 12
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 12
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 102100030988 Angiotensin-converting enzyme Human genes 0.000 description 10
- 238000010322 bone marrow transplantation Methods 0.000 description 10
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 10
- 208000024908 graft versus host disease Diseases 0.000 description 10
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 9
- 238000001963 scanning near-field photolithography Methods 0.000 description 8
- 238000013461 design Methods 0.000 description 7
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 7
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 7
- 108010021724 tonin Proteins 0.000 description 7
- 239000000463 material Substances 0.000 description 6
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 6
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 6
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 6
- 238000011160 research Methods 0.000 description 6
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 5
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 5
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 5
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 5
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 5
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 5
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 5
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 5
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 5
- 208000015914 Non-Hodgkin lymphomas Diseases 0.000 description 4
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 4
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 4
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 4
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 4
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 4
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 4
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 3
- 102100024222 B-lymphocyte antigen CD19 Human genes 0.000 description 3
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 3
- 208000009329 Graft vs Host Disease Diseases 0.000 description 3
- 101000980825 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD19 Proteins 0.000 description 3
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 3
- 208000033559 Waldenström macroglobulinemia Diseases 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 3
- 108091092240 circulating cell-free DNA Proteins 0.000 description 3
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 3
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 3
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000012252 genetic analysis Methods 0.000 description 3
- 239000007943 implant Substances 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 3
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 3
- 235000015170 shellfish Nutrition 0.000 description 3
- 210000003954 umbilical cord Anatomy 0.000 description 3
- 208000031261 Acute myeloid leukaemia Diseases 0.000 description 2
- 208000010839 B-cell chronic lymphocytic leukemia Diseases 0.000 description 2
- 208000003950 B-cell lymphoma Diseases 0.000 description 2
- 101100111711 Botryotinia fuckeliana BOT2 gene Proteins 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000031422 Lymphocytic Chronic B-Cell Leukemia Diseases 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 108091092878 Microsatellite Proteins 0.000 description 2
- 208000033776 Myeloid Acute Leukemia Diseases 0.000 description 2
- WGZDBVOTUVNQFP-UHFFFAOYSA-N N-(1-phthalazinylamino)carbamic acid ethyl ester Chemical compound C1=CC=C2C(NNC(=O)OCC)=NN=CC2=C1 WGZDBVOTUVNQFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010052779 Transplant rejections Diseases 0.000 description 2
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 2
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 2
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 210000001772 blood platelet Anatomy 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 210000002230 centromere Anatomy 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 230000002354 daily effect Effects 0.000 description 2
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 2
- 210000003979 eosinophil Anatomy 0.000 description 2
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 2
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 210000002751 lymph Anatomy 0.000 description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000000527 lymphocytic effect Effects 0.000 description 2
- 201000000564 macroglobulinemia Diseases 0.000 description 2
- 238000007726 management method Methods 0.000 description 2
- 238000011880 melting curve analysis Methods 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 230000002969 morbid Effects 0.000 description 2
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 2
- 230000004987 nonapoptotic effect Effects 0.000 description 2
- 239000002096 quantum dot Substances 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 239000012224 working solution Substances 0.000 description 2
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037914 B-cell disorder Diseases 0.000 description 1
- 208000032791 BCR-ABL1 positive chronic myelogenous leukemia Diseases 0.000 description 1
- 208000010833 Chronic myeloid leukaemia Diseases 0.000 description 1
- 230000008836 DNA modification Effects 0.000 description 1
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000160765 Erebia ligea Species 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 1
- 101000917858 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-A Proteins 0.000 description 1
- 101000917839 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-B Proteins 0.000 description 1
- 101000946889 Homo sapiens Monocyte differentiation antigen CD14 Proteins 0.000 description 1
- 101000581981 Homo sapiens Neural cell adhesion molecule 1 Proteins 0.000 description 1
- 206010062717 Increased upper airway secretion Diseases 0.000 description 1
- 102100029185 Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-B Human genes 0.000 description 1
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 208000030289 Lymphoproliferative disease Diseases 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 102100035877 Monocyte differentiation antigen CD14 Human genes 0.000 description 1
- 201000003793 Myelodysplastic syndrome Diseases 0.000 description 1
- 208000033761 Myelogenous Chronic BCR-ABL Positive Leukemia Diseases 0.000 description 1
- 208000014767 Myeloproliferative disease Diseases 0.000 description 1
- 201000007224 Myeloproliferative neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 102100027347 Neural cell adhesion molecule 1 Human genes 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 108090000882 Peptidyl-Dipeptidase A Proteins 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000021161 Plasma cell disease Diseases 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 101100120176 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) FKS1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100006923 Schizosaccharomyces pombe (strain 972 / ATCC 24843) cnd1 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000002903 Thalassemia Diseases 0.000 description 1
- 206010066901 Treatment failure Diseases 0.000 description 1
- 208000006110 Wiskott-Aldrich syndrome Diseases 0.000 description 1
- 238000002679 ablation Methods 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 210000004381 amniotic fluid Anatomy 0.000 description 1
- 230000000919 anti-host Effects 0.000 description 1
- 238000009175 antibody therapy Methods 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 210000000941 bile Anatomy 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- 238000004820 blood count Methods 0.000 description 1
- 238000010241 blood sampling Methods 0.000 description 1
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 1
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 1
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 238000005336 cracking Methods 0.000 description 1
- 210000002726 cyst fluid Anatomy 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000013480 data collection Methods 0.000 description 1
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 1
- -1 device Substances 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 210000001840 diploid cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 239000003344 environmental pollutant Substances 0.000 description 1
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 201000003444 follicular lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 1
- 210000000224 granular leucocyte Anatomy 0.000 description 1
- 208000034737 hemoglobinopathy Diseases 0.000 description 1
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- 230000016507 interphase Effects 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 210000004561 lacrimal apparatus Anatomy 0.000 description 1
- 238000010234 longitudinal analysis Methods 0.000 description 1
- 208000019420 lymphoid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000010801 machine learning Methods 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- MIKKOBKEXMRYFQ-WZTVWXICSA-N meglumine amidotrizoate Chemical compound C[NH2+]C[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO.CC(=O)NC1=C(I)C(NC(C)=O)=C(I)C(C([O-])=O)=C1I MIKKOBKEXMRYFQ-WZTVWXICSA-N 0.000 description 1
- 208000030159 metabolic disease Diseases 0.000 description 1
- 238000010208 microarray analysis Methods 0.000 description 1
- 210000003097 mucus Anatomy 0.000 description 1
- 238000010202 multivariate logistic regression analysis Methods 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 239000013610 patient sample Substances 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 230000000505 pernicious effect Effects 0.000 description 1
- 239000002831 pharmacologic agent Substances 0.000 description 1
- 208000026435 phlegm Diseases 0.000 description 1
- 231100000719 pollutant Toxicity 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 238000012805 post-processing Methods 0.000 description 1
- 244000144977 poultry Species 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 1
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 239000000565 sealant Substances 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000011896 sensitive detection Methods 0.000 description 1
- 238000010206 sensitivity analysis Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 238000004088 simulation Methods 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 210000000106 sweat gland Anatomy 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 1
- 210000001138 tear Anatomy 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 238000012549 training Methods 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 238000007473 univariate analysis Methods 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6881—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for tissue or cell typing, e.g. human leukocyte antigen [HLA] probes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2537/00—Reactions characterised by the reaction format or use of a specific feature
- C12Q2537/10—Reactions characterised by the reaction format or use of a specific feature the purpose or use of
- C12Q2537/16—Assays for determining copy number or wherein the copy number is of special importance
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本公开涉及使用信息性拷贝数变异(CNV)测量生物样品中的嵌合状态的方法。
Description
发明领域
本公开涉及使用信息性拷贝数变异(informative copy number variation，CNV)测量生物样品中的嵌合状态的方法。
发明背景
嵌合状态(Chimerism)描述了来源于多于一个个体的细胞的共存。嵌合状态的一个最常见的例子是来自接受造血干细胞移植(hematopoietic stem-celltransplantation，HSCT)的个体的生物样品。
HSCT是患有某些恶性和非恶性血液病症的患者的常见治疗。HSCT临床管理的一个重要组成部分是嵌合状态分析，用于及时评估治疗成功(例如，植入)或失败(例如，疾病复发、移植物排斥和移植物抗宿主疾病)。
用于监测HSCT后的嵌合状态的最常用方法之一是短串联重复序列(short tandemrepeat，STR)基因座的PCR扩增，接着进行毛细管电泳(Thiede等.Bone MarrowTransplant,23:1055-1060,1999；Nuckols等.Am J Clin Pathol,113:135-140,2000)。然而，必须分析多个STR基因座以鉴定区分供体(donor)和接受者的基因座。由于供体和接受者经常是相关的并因此共有多个遗传决定簇，所以尤其如此。
监测嵌合状态的另一种已建立的方法包括使用X和Y特异性染色体探针对细胞核进行荧光原位杂交(FISH)，用于在细胞学区分供体细胞和接受者细胞。但是，FISH具有需要供体和接受者之间的性别错配(gender mismatch)的限制。FISH还具有约>1％的灵敏度，这对于早期复发检测是不够的。
最近描述的用于监测嵌合状态的方法包括SNP或插入缺失标记的TaqMan实时PCR。这些实时形式的缺点是每种标记具有相对较低的分辨能力，因此需要评估相对大量的基因座。此外，并非在所有情况下都可获得信息性多态性。
因此，对于测量生物样品中嵌合状态的准确和有效的方法仍然存在未满足的需求。
发明概述
本发明人已经发现他们能够通过评估遗传上不同的细胞群中的信息性拷贝数变异(CNV)多态性来准确地测量生物样品中的嵌合状态。这些发现表明，评估基因组DNA中的CNV多态性可以提供测量嵌合状态的有用的体外方法。因此，在一个实例中，本公开涉及测量获自包含两种或更多种遗传上不同的细胞群体的受试者的生物样品中的嵌合状态的方法，所述方法包括基于拷贝数变异(CNV)多态性测定分离自第一遗传上不同的细胞群体的样品中基因组DNA的水平，所述拷贝数变异(CNV)多态性是所述第一遗传上不同的细胞群体的信息性标记，其中来自所述遗传上不同的细胞群体的分离的基因组DNA的水平提供了对所述样品中嵌合状态的度量。
在另一个实例中，所述方法还包括基于CNV多态性测定分离自第二遗传上不同的细胞群体的样品中基因组DNA的水平，所述CNV多态性是所述第二遗传上不同的细胞群体的信息性标记，其中分离的基因组DNA的水平提供了对所述样品中嵌合状态的度量。
在一个实例中，遗传上不同的细胞群体的信息性标记包括：
-在分离自第一细胞群体的基因组DNA中是纯合存在并且在分离自第二细胞群体的基因组DNA中是纯合不存在的CNV多态性；以及，
-在分离自第二细胞群体的基因组DNA中是纯合存在并且在分离自第一细胞群体的基因组DNA中是纯合不存在的CNV多态性。
本发明人还发现，他们能够使用内部验证步骤来验证本公开的方法的准确性。因此，在一个实例中，本公开的方法还包括通过测定所述样品中的总分离的基因组DNA来验证分离自遗传上不同的细胞群体的DNA的水平，其中分离自所述遗传上不同的细胞群体的基因组DNA的水平约等于总DNA的水平表明验证了分离的基因组DNA的水平。在一个实例中，嵌合状态的度量表示为所述样品中总细胞群体中遗传上不同的细胞的百分比。在另一个实例中，嵌合状态的度量表示为所述样品中遗传上不同的细胞的比率(第一细胞群体:第二细胞群体)。
在另一个实例中，CNV多态性是拷贝数缺失(CND)多态性。在一个实例中，遗传上不同的细胞群体的信息性标记包括：
-在分离自第一细胞群体的基因组DNA中是纯合缺失并且在分离自第二细胞群体的基因组DNA中是杂合或纯合未缺失的CND多态性；和/或，
-在分离自第二细胞群体的基因组DNA中是纯合缺失并且在分离自第一细胞群体的基因组DNA中是杂合或纯合未缺失的CND多态性。
在另一个实例中，遗传上不同的细胞群体的信息性标记包括：
-在分离自第一细胞群体的基因组DNA中是纯合缺失并且在分离自第二细胞群体的基因组DNA中是杂合或纯合未缺失的至少两种CND多态性；和/或，
-在分离自第二细胞群体的基因组DNA中是纯合缺失并且在分离自第一细胞群体的基因组DNA中是杂合或纯合未缺失的至少两种CND多态性。
在另一个实例中，遗传上不同的细胞群体的信息性标记包括：
-在分离自第一细胞群体的基因组DNA中是纯合缺失并且在分离自第二细胞群体的基因组DNA中是杂合或纯合未缺失的至少三种CND多态性；和/或，
-在分离自第二细胞群体的基因组DNA中是纯合缺失并且在分离自第一细胞群体的基因组DNA中是杂合或纯合未缺失的至少三种CND多态性。
在另一个实例中，遗传上不同的细胞群体的信息性标记包括：
-在分离自第一细胞群体的基因组DNA中是纯合缺失并且在分离自第二细胞群体的基因组DNA中是杂合或纯合未缺失的至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10种CND多态性；和/或，
-在分离自第二细胞群体的基因组DNA中是纯合缺失并且在分离自第一细胞群体的基因组DNA中是杂合或纯合未缺失的至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10种CND多态性。
在另一个实例中，遗传上不同的细胞群体的信息性标记包括至少5、或至少6、或至少7、或至少10、或至少20、或至少30、或至少38种CND。在另一个实例中，测定分离自遗传上不同的细胞群体的基因组DNA的水平包括使用引物对所述DNA进行扩增反应，所述引物靶向为所述遗传上不同的细胞群体的信息性标记的CNV。在一个实例中，引物靶向信息性CNV的内部区域。在另一个实例中，使用表7所示引物对所述CNV多态性进行扩增。
在另一个实例中，测定分离自遗传上不同的细胞群体的基因组DNA的水平包括利用不依赖于定量扩增的检测方法来评估DNA，所述检测方法靶向为所述遗传上不同的细胞群体的信息性标记的CNV。
在另一个实例中，CNV多态性选自表1中所列的CND多态性。在另一个实例中，CNV多态性选自表1中所列的多态性CND_01至CND_10。
在一个实例中，通过使用NGS、NanoString技术、液滴数字PCR、定量RT-PCR评估CNV多态性来测定分离自遗传上不同的细胞群体的基因组DNA的水平，所述CNV多态性是所述遗传上不同的细胞群体的信息性标记。例如，可以使用液滴数字PCR来测定从遗传上不同的细胞群中分离的基因组DNA的水平。
在一个实例中，已经处理生物样品以从样品中基本上除去循环的无细胞DNA。在另一个实例中，生物样品是血液样品。在另一个实例中，生物样品是外周血单核细胞。在另一个实例中，生物样品是纯化的免疫细胞群体或纯化的免疫细胞的混合物。在另一个实例中，免疫细胞是白细胞。在另一个实例中，生物样品是纯化的T细胞、B细胞、粒细胞或其混合物的群体。在另一个实例中，纯化获自所述受试者的所述生物样品以提供至少两种细胞群体，并且在每种细胞群体中测量嵌合状态。在一个实例中，所述两种细胞群体包含B细胞和粒细胞。在另一个实例中，纯化获自所述受试者的所述生物样品以提供至少三种细胞群体，并且在每种细胞群体中测量嵌合状态。在一个实例中，所述三种细胞群体包含B细胞、粒细胞和T细胞。
在一个实例中，遗传上不同的细胞群体包含自身细胞(第一细胞群体)和非自身细胞(第二细胞群体)。在另一个实例中，受试者是造血干细胞移植(HSCT)接受者。在另一个实例中，本公开的方法包括测定HSCT接受者中的植入水平。在这个实例中，非自身细胞的水平大于约90％指示移植物的植入。
在另一个实例中，本公开的方法包括监测HSCT移植后造血干细胞移植(HSCT)接受者自身骨髓的重建。在这个实例中，自身细胞水平大于约10％指示所述HSCT接受者骨髓的重建。
在一个实例中，每天、每周、每月、每两个月或每三个月进行本公开的方法。在这些实例中，本公开的方法可以用于监测随时间的嵌合状态水平。在一个实例中，自身细胞水平的升高和/或非自身细胞水平的降低指示HSCT接受者骨髓的重建。在一个实例中，监测随时间的嵌合状态可以帮助临床医生施用或改变患者治疗或治疗方案。在一个实例中，自身细胞水平的升高和/或非自身细胞水平的降低指示应向HSCT接受者施用免疫抑制疗法或应修改HSCT接受者的免疫抑制疗法。在另一个实例中，本公开的方法包括监测移植物抗宿主病(GVHD)。在另一个实例中，本公开的方法包括监测有需要的患者中的最小残留疾病。
在一个实例中，HSCT接受者接受HSCT以治疗血液病症。在一个实例中，血液病症是血液恶性肿瘤。在一个实例中，血液恶性肿瘤是白血病。在一个实例中，自身细胞水平大于约1％指示HSCT接受者的血液病症的复发。在一个实例中，自身细胞水平的升高和/或非自身细胞水平的降低指示HSCT接受者的血液病症的复发。在一个实例中，自身细胞水平的升高和/或非自身细胞水平的降低指示应向所述HSCT接受者施用用于所述血液病症的疗法或应修改所述HSCT接受者的疗法。
在另一个实例中，遗传上不同的细胞群体包含胎儿细胞(第一细胞群体)和母体细胞(第二细胞群体)。在一个实例中，生物样品是脐带血。在另一个实例中，本公开的方法包括鉴定脐带血样品的母体污染。在一个实例中，嵌合状态的比率(胎儿细胞:母体细胞)大于约1:100、约1:50、约1:20、约1:10、约3:20指示脐带血样品不适合用于造血干细胞移植。
在另一个实例中，本公开涉及用于本公开的方法的试剂盒，其包含选自表7中所列引物的引物。
在另一个实例中，本公开涉及一种测量HSCT移植接受者中的HSCT植入的方法，所述方法包括：基于拷贝数变异(CNV)多态性测定获自所述HSCT接受者的生物样品中自身细胞和非自身细胞的水平，所述拷贝数变异(CNV)多态性是所述自身细胞和非自身细胞的信息性标记，其中所述信息性标记包括：
-在分离自自身细胞的基因组DNA中是纯合缺失并且在分离自非自身细胞的基因组DNA中是杂合或纯合未缺失的CND多态性；以及
-在分离自非自身细胞的基因组DNA中是纯合缺失并且在分离自自身细胞的基因组DNA中是杂合或纯合未缺失的CND多态性；
其中非自身细胞水平大于约90％的指示所述HSCT接受者骨髓的植入。
在另一个实例中，本公开涉及一种测量HSCT接受者中的最小残留疾病的方法，所述方法包括：基于拷贝数变异(CNV)多态性测定获自所述HSCT接受者的生物样品中自身细胞和非自身细胞的水平，所述拷贝数变异(CNV)多态性是所述自身细胞和非自身细胞的信息性标记，
其中所述信息性标记包括：
-在分离自自身细胞的基因组DNA中是纯合缺失并且在分离自非自身细胞的基因组DNA中是杂合或纯合未缺失的CND多态性；以及
-在分离自非自身细胞的基因组DNA中是纯合缺失并且在分离自自身细胞的基因组DNA中是杂合或纯合未缺失的CND多态性；
其中自身细胞水平大于约1％指示所述HSCT接受者骨髓的重建。
在另一个实例中，本公开涉及一种测量脐带血样品中的母体污染的方法，包括：基于拷贝数变异(CNV)多态性测定所述脐带血样品中自身细胞和非自身细胞的水平，所述拷贝数变异(CNV)多态性是所述自身细胞和非自身细胞的信息性标记，
其中所述信息性标记包括：
-在分离自自身细胞的基因组DNA中是纯合缺失并且在分离自非自身细胞的基因组DNA中是杂合或纯合未缺失的CND多态性；以及
-在分离自非自身细胞的基因组DNA中是纯合缺失并且在分离自自身细胞的基因组DNA中是杂合或纯合未缺失的CND多态性；
其中胎儿细胞:母体细胞的比率大于约1:100、约1:50、约1:20、约1:10、约3:20指示所述脐带血样品不适合用于造血干细胞移植。
特别地，本发明人发现，通过从血液样品中的细胞中分离基因组DNA，然后基于在自身DNA中是杂合或纯合未缺失并且在非自身DNA中是纯合缺失的CND多态性测量自身DNA的水平，以及基于在非自身DNA中是杂合或纯合未缺失并且在自身DNA中是纯合缺失的CND测量非自身DNA的水平，他们能够准确地测量含有自身细胞和非自身细胞的血液样品中的嵌合状态。基于在非自身DNA中是杂合或纯合未缺失并且在自身DNA中是纯合缺失的CND测量非自身DNA的水平以及基于在自身DNA中是杂合或纯合未缺失并且在非自身DNA中是纯合缺失的CND多态性测量自身DNA的水平是有利的，因为可以评估DNA水平而不会遇到来自自身DNA或非自身DNA的背景影响。
除非另有特别说明，否则本文的任何实例都可被加以必要的变通以适用于任何其他实例。
本发明的范围不限于本文描述的具体实例，所述实例仅旨在举例说明的目的。如本文所述，功能上等同的产品、组合物和方法显然在本发明的范围内。
在整个说明书中，除非另有特别说明或上下文另外要求，否则提及单个步骤、物质组合物、步骤的组或物质组合物的组应当包括一个和多个(即，一个或更多个)那些步骤、物质组合物、步骤的组或物质组合物的组。
以下通过以下非限制性实施例并参照附图来描述本发明。
附图简述
图1：对于21个对照样品获得的基因分型结果。
图2：在三个独立群组中观察到的“纯合缺失”CND频率的分布。
图3：使用三种代表性靶标记(CNV01B、CNV02B和CNV09B)的ddPCR的整个检测范围和极限上的测量线性；将每种加标至对于这些标记是纯合缺失的DNA中，以给出一式三份地指示和测量的嵌合分数。
图4：在加标系列中一式三份测量的3种CNV标记的测定内和测定间变异，所述系列通过将来自已知对于各标记是杂合缺失的个体的DNA在来自已知是纯合缺失的个体的DNA中稀释来制备。
图5：来自临床病例的纵向采样期间的每个时间点的8种信息性供体CNV标记和5种信息性接受者CNV标记的测定间变异(标准偏差，CV)，其中使用嵌合状态分析指导关于移植物抗宿主病的免疫抑制管理的决策制定。
图6：ddPCR绝对定量原始数据。
图7：样品1的嵌合状态结果。
图8：样品2的嵌合状态结果。
图9：样品3的嵌合状态结果。
图10：样品4的嵌合状态结果。对于CND15和CND3B，纯的供体DNA样品对纯的接受者DNA样品的污染，被检测为通过高灵敏度的ddPCR/CND测定检测的痕量水平。
图11：CNV嵌合状态与先前的STR分析的相关性。
图12：利用来自4个移植接受者的15个纵向采集的血液样品的DNA通过SNP/rtPCR方法，使用CNV方法(左图)与使用雄性和雌性细胞的加标系列的X/Y FISH方法(右图)的嵌合状态测量的比较。
图13：来自35位供体的32位移植接受者的方法信息性的直方图。在所有基因分型的个体中，存在至少一种信息性标记(左图)。通常使用约15或30种CNV标记的组对个体进行基因分型，尽管在5/67(7％)病例中测定37-38种CNV标记以使信息性标记的数目最大化(中图)。在大多数个体中，10-30％的测试标记是信息性的(右图)。
图14：移植后样品中的CND植入(A)和最小残留疾病(B)分析。
图15：移植后样品的CND分析
图16：脐带血样品的CND分析
发明详述
一般技术和选择的定义
除非另外特别定义，否则本文使用的所有技术和科学术语应被认为具有与本领域(例如，在分子遗传学、表达分析、生物化学、诊断学中)普通技术人员通常理解的相同的含义。
如本领域技术人员理解的，本公开中使用的各种分子技术以及DNA修饰和检测方法是本领域技术人员熟知的标准程序。这些技术在以下来源的文献中通篇描述和解释：例如，J.Perbal,A Practical Guide to Molecular Cloning,John Wiley and Sons(1984)，J.Sambrook 等,Molecular Cloning:ALaboratory Manual,Cold Spring HarbourLaboratory Press(1989)，T.A.Brown(编辑),Essential Molecular Biology:APracticalApproach,第1卷和第2卷,IRL Press(1991)，D.M.Glover和B.D.Hames(编辑)，以及F.M.Ausubel等.(编辑),Current Protocols in Molecular Biology,GreenePub.Associates and Wiley-Interscience(1988，包括迄今为止的所有更新)，Ed Harlow和David Lane(编辑)Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring HarbourLaboratory,(1988)，以及J.E.Coligan等.(编辑)Current Protocols in Immunology,John Wiley&Sons(包括迄今为止的所有更新)。
本领域技术人员将理解，除了具体描述的那些以外，本文所描述的公开内容可以进行变化和修改。应理解，本公开包括所有这些变化和修改。本公开还包括在本说明书中单独地或共同地提到或指示的所有步骤、特征、组合物和化合物，以及所述步骤或特征的任何和全部组合或任何两个或更多个。例如，本领域技术人员将了解“连锁不平衡”，其涉及从单个祖先染色体传下的两个或更多个基因座处的等位基因的非随机关联。如以下所概述的，本公开描述了可用于测定生物样品中接受者或供体DNA的水平的一系列拷贝数变异(CNV)，特别是拷贝数缺失(CND)。本公开的CNV涵盖处于连锁不平衡中的相关CNV。此外，设想基于本公开的CNV测定自身或非自身DNA的水平包括通过评估与特定公开的CNV处于连锁不平衡的其他CNV来测定自身或非自身DNA的水平。
术语“和/或”如“X和/或Y”应理解为是指“X和Y”或“X或Y”，并且应被理解为对两种含义或任一含义提供明确的支持。
如本文所用，术语“约”是指定值的+/-10％，更优选+/-5％，除非有相反说明。
在整个说明书中，词语“包括”或者诸如“包含”或者“含有”的变化将被理解为暗示包括所指出要素、整体或步骤或者要素、整体或步骤的组，但是不排除任何其他要素、整体或步骤或者要素、整体或步骤的组。
如本文所用，“患者”可以是可以从其获得包含自身细胞和非自身细胞的样品的任何生物体。在一个实例中，患者是哺乳动物。哺乳动物可以是伴侣动物，例如狗或猫，或者家畜，例如马或牛。在一个实例中，患者是人。例如，患者可以是成年人。在另一个实例中，患者可以是儿童。在另一个实例中，患者可以是青少年。诸如“患者”、“受试者”或“个体”的术语是在本公开的上下文中可以互换使用的术语。
如本文所用，诸如“自身”、“自身核酸”和“自身DNA”的术语用于指来自从其获得生物样品的受试者(例如HSCT接受者)的核酸和DNA。相反，诸如“非自身”、“非自身核酸”和“非自身DNA”的术语用于定义从其获得样品的受试者外源的核酸和DNA(例如HSCT供体)。
在整个说明书中，除非另有特别说明或上下文另外要求，否则术语DNA用于指胞内基因组DNA。例如，“自身DNA”和“非自身DNA”是指分离自生物样品中的自身细胞和非自身细胞的基因组DNA。
在HSCT移植接受者血液样品中，自身DNA来自移植接受者，非自身DNA来自移植供体。本领域技术人员将会理解，移植供体“非自身DNA”可以包含来自多个个体的DNA。例如，移植供体自身可能先前已经接受了移植，其中他们的样品也可以包含非自身DNA。在这种情况下，样品可以包含自身DNA和多种类型的非自身DNA。设想本公开的方法允许评估样品中的“自身DNA”和多种类型的“非自身DNA”。在脐带血样品中，自身DNA是胎儿DNA，而非自身DNA是母体DNA。
本公开的方法可以作为体外测定进行。如本领域技术人员将理解的，测定是用于定性评估或定量测量靶标的存在或量或功能活性的调查(分析)程序或方法。
在一个实例中，根据本公开的方法或测定可以并入到治疗方案中。例如，治疗有需要的受试者中的病症的方法可以包括执行体现本公开的方法的测定。在一个实例中，在向施用治疗或改变患者的治疗之前，临床医师等可能希望执行或要求执行根据本公开的测定。例如，在选择施用或改变诸如免疫疗法的治疗之前，临床医师可以在HSCT接受者上执行或要求执行根据本公开的测定。
拷贝数变异(CNV)多态性
当执行本公开的方法时，基于为细胞群体的信息性标记的拷贝数变异(CNV)多态性测定分离自遗传上不同的细胞群体的基因组DNA水平。“CNV”多态性包括拷贝数缺失(CND)插入或重复。术语“信息性标记”在本公开的上下文中用于指在遗传学上区分生物样品中的一种细胞群体与另一种细胞群体的标记。信息性标记允许测定分离自遗传上不同的细胞群体的基因组DNA的水平(例如通过使用定量方法，如液滴数字PCR)。
在一个实例中，信息性标记可以是存在于分离自生物样品中的第一细胞群体的基因组DNA中但不存在于分离自第二遗传上不同的细胞群体的基因组DNA中的CNV多态性。在一个实例中，信息性标记可以是存在于分离自生物样品中的自身细胞群体的基因组DNA中但不存在于分离自非自身细胞群体的基因组DNA中的CNV多态性。在另一个实例中，信息性标记可以是至少两种CNV多态性，一种存在于分离自生物样品中的第一细胞群体的基因组DNA中但不存在于分离自第二遗传上不同的细胞群体的基因组DNA中，一种不存在于分离自第一细胞群体的基因组DNA中但存在于分离自第二细胞群体的基因组DNA中。
存在于分离的基因组DNA中的CNV多态性可以被称为“纯合存在(homozygouspresent)”、“纯合不存在(homozygous not present)”或“杂合”。当2拷贝的CNV多态性存在时(例如，二倍体个体在两个同源染色体中的每一个的基因座处具有相同CNV的拷贝)，在本公开的上下文中使用术语“纯合存在”。当2拷贝的CNV多态性不存在时(例如，二倍体个体在两个同源染色体中的每一个的基因座处具有0拷贝的CNV)，在本公开的上下文中使用术语“纯合不存在”。当1拷贝CNV多态性存在时(例如，具有两种不同等位基因各一拷贝的二倍体个体)时，在本公开的上下文中使用术语“杂合”。因此，术语“杂合”包括其中1拷贝CNV多态性存在的“杂合存在(heterozygous present)”和其中1拷贝CNV多态性不存在的“杂合不存在(heterozygous not present)”。
在拷贝数缺失的情况下，术语“纯合存在”用于指其中2拷贝的缺失存在(即，“纯合缺失(homozygous deleted)”；“2拷贝缺失”)的基因型，而“纯合不存在”用于指其中2拷贝的缺失不存在(即，“纯合未缺失(homozygous non-deleted)”；“0拷贝缺失”)的基因型。术语“杂合”用于指其中1拷贝的缺失存在(即，“杂合缺失(heterozygous deleted)”、“1拷贝缺失”)的基因型。
在拷贝数重复的情况下，“纯合存在”用于指其中2拷贝的重复存在(即，“纯合重复(homozygous duplicated)”；2拷贝重复)的基因型，而“纯合不存在”用于指其中2拷贝的重复不存在(即，“纯合未重复(homozygous non-duplicated)”；0拷贝重复)的基因型。术语“杂合”用于指其中1拷贝的重复存在(即，“杂合重复(heterozygous duplicated)”；1拷贝重复)的基因型。
在一个实例中，信息性CNV在遗传上不同的细胞群体中是纯合存在。在另一个实例中，信息性CNV在遗传上不同的细胞群体中是杂合。在另一个实例中，信息性CNV在遗传上不同的细胞群体是纯合不存在。
在一个实例中，遗传上不同的细胞群体的信息性标记包括至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29、至少30、至少31、至少32、至少33、至少34、至少35、至少36、至少37、至少38、至少39、至少40、至少41、至少42、至少43、至少44、至少45种杂合CNV多态性。在另一个实例中，遗传上不同的细胞群体的信息性标记包括至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29、至少30、至少31、至少32、至少33、至少34、至少35、至少36、至少37、至少38、至少39、至少40、至少41、至少42、至少43、至少44、至少45种纯合存在CNV多态性。在另一些实例中，遗传上不同的细胞群体的信息性标记包括至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29、至少30、至少31、至少32、至少33、至少34、至少35、至少36、至少37、至少38、至少39、至少40、至少41、至少42、至少43、至少44、至少45种纯合不存在CNV多态性。
在另一个实例中，信息性CNV多态性在第一群体中是杂合并且在遗传上不同的细胞群体中是纯合存在或纯合不存在。在另一个实例中，信息性CNV多态性在第一群体中是纯合存在并且在遗传上不同的细胞群体中是纯合不存在或杂合。在另一个实例中，信息性CNV多态性在第一群体中是纯合不存在并且在遗传上不同的细胞群体中是杂合、纯合存在。在另一个实例中，信息性CNV多态性在自身群体中是杂合并且在非自身群体中是纯合存在或纯合不存在。在另一个实例中，信息性CNV多态性在自身群体中是纯合存在并且在非自身群体中是纯合不存在或杂合。在另一个实例中，信息性CNV多态性在自身群体中是纯合存在并且在非自身群体中是纯合不存在或杂合。
在另一个实例中，遗传上不同的细胞群体的信息性标志物包含至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29、至少30、至少31、至少32、至少33、至少34、至少35、至少36、至少37、至少38、至少39、至少40、至少41、至少42、至少43、至少44、至少45种纯合存在CNV多态性，其在生物样品中遗传上不同的细胞群体中是纯合不存在。在另一个实例中，遗传上不同的细胞群体的信息性标志物包含至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29、至少30、至少31、至少32、至少33、至少34、至少35、至少36、至少37、至少38、至少39、至少40、至少41、至少42、至少43、至少44、至少45种纯合存在CNV多态性，其在生物样品中遗传上不同的细胞群体中是杂合。在另一个实例中，遗传上不同的细胞群体的信息性标志物包含至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29、至少30、至少31、至少32、至少33、至少34、至少35、至少36、至少37、至少38、至少39、至少40、至少41、至少42、至少43、至少44、至少45种杂合CNV多态性，其在生物样品中遗传上不同的细胞群体中是纯合不存在。
在另一个实例中，在生物样品中评估至少一种CNV以鉴定信息性标记。在另一些实例中，在生物样品中评估至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29、至少30、至少31、至少32、至少33、至少34、至少35、至少36、至少37、至少38、至少39、至少40、至少41、至少42、至少43、至少44、至少45种CNV多态性以鉴定信息性标记。例如，在生物样品中评估至少4种CNV多态性以鉴定信息性标记。例如，在生物样品中评估至少6种CNV多态性以鉴定信息性标记。
在一个实例中，CNV是拷贝数缺失(CND)多态性。在一个实例中，信息性CND在遗传上不同的细胞群体中是杂合缺失。在另一个实例中，信息性CND在遗传上不同的细胞群体中是纯合缺失。在另一个实例中，信息性CND在遗传上不同的细胞群体中是纯合未缺失。
例如，信息性标记可以是在分离自生物样品中的第一细胞群体的基因组DNA中是纯合缺失但在分离自第二遗传上不同的细胞群体的基因组DNA中是杂合或纯合未缺失的CND多态性。在一个实例中，信息性标记是在分离自生物样品中的自身细胞群体的基因组DNA中是纯合缺失但在分离自非自身细胞群体的基因组DNA中是杂合或纯合未缺失的CND多态性。在另一个实例中，信息性标记可以是至少两种CND多态性，一种在分离自生物样品中的第一细胞群体的基因组DNA中是纯合缺失或杂合缺失但在分离自第二遗传上不同的细胞群体的基因组DNA中是纯合未缺失，一种在分离自第一细胞群体的基因组DNA中是纯合未缺失但在分离自第二细胞群体的基因组DNA中是纯合缺失或杂合缺失。
在另一些实例中，遗传上不同的细胞群体的信息性标记包括至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29、至少30、至少31、至少32、至少33、至少34、至少35、至少36、至少37、至少38、至少39、至少40、至少41、至少42、至少43、至少44、至少45种杂合缺失CND多态性。在另一个实例中，遗传上不同的细胞群体的信息性标记包括至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29、至少30、至少31、至少32、至少33、至少34、至少35、至少36、至少37、至少38、至少39、至少40、至少41、至少42、至少43、至少44、至少45种纯合缺失CND多态性。
在另一个实例中，遗传上不同的细胞群体的信息性标记包括至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29、至少30、至少31、至少32、至少33、至少34、至少35、至少36、至少37、至少38、至少39、至少40、至少41、至少42、至少43、至少44、至少45种杂合缺失CND多态性，其在生物样品中遗传上不同的细胞群体中是纯合缺失。在另一个实例中，遗传上不同的细胞群体的信息性标记包括至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29、至少30、至少31、至少32、至少33、至少34、至少35、至少36、至少37、至少38、至少39、至少40、至少41、至少42、至少43、至少44、至少45种杂合缺失CND多态性，其在生物样品中遗传上不同的细胞群体中是纯合未缺失。在另一个实例中，遗传上不同的细胞群体的信息性标记包括至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29、至少30、至少31、至少32、至少33、至少34、至少35、至少36、至少37、至少38、至少39、至少40、至少41、至少42、至少43、至少44、至少45种纯合缺失CND多态性，其在生物样品中遗传上不同的细胞群体中是纯合未缺失。
例如，信息性CND多态性可以是在第一群体中是杂合缺失并且在遗传上不同的细胞群体中是纯合缺失或纯合未缺失。在另一个实例中，信息性CND多态性可以是在第一群体中是纯合缺失并且在遗传上不同的细胞群体中是杂合或纯合未缺失。在另一个实例中，信息性CND多态性可以是在第一群体中是纯合未缺失并且在遗传上不同的细胞群体中是杂合或纯合缺失。在另一个实例中，信息性CND多态性可以是在自身群体中是杂合缺失并且在非自体群体中是纯合缺失或纯合未缺失。在另一个实例中，信息性CND多态性可以是在自身群体中是纯合缺失并且在非自体群体中是杂合缺失或纯合未缺失。在另一个实例中，信息性CND多态性可以是在自身群体中是纯合未缺失并且在非自身群体中是纯合缺失或杂合缺失。
在另一个实例中，信息性CND在分离自第一细胞群体的基因组DNA中是杂合缺失并且在分离自遗传上不同的细胞群体的基因组DNA中是纯合缺失或纯合未缺失。在另一个实例中，信息性CND在分离自第一细胞群体的基因组DNA中是纯合缺失的并且在分离自遗传上不同的细胞群体的基因组DNA中是杂合或纯合未缺失。在另一个实例中，信息性CND在分离自第一细胞群体的基因组DNA中是纯合未缺失并且在分离自遗传上不同的细胞群体的基因组DNA中是杂合或纯合缺失。例如，信息CND在分离自自身细胞的基因组DNA中是杂合缺失并且在分离自非自身细胞的基因组DNA中是纯合缺失或纯合未缺失。例如，信息性CND在分离自自身细胞的基因组DNA中是纯合缺失并且在分离自非自身细胞的基因组DNA中是杂合或纯合未缺失。例如，信息性CND在分离自自身细胞的基因组DNA中是纯合未缺失并且在分离自非自身细胞的基因组DNA中是杂合或纯合缺失。
例如，遗传上不同的细胞群体的信息性标记可以是约5至40、约7至20、约6至30、约8至10种CND多态性。在这些实例中，CND可以选自表1。例如，遗传上不同的细胞群体的信息性标记可以包含来自表1的10种CND多态性。例如，信息性标记可以选自表1的组CND 01至CND 10。以下考虑包含来自表1的CND的组合的其他信息性标记。
在另一些实例中，遗传上不同的细胞群体的信息性标记包括至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29、至少30、至少31、至少32、至少33、至少34、至少35、至少36、至少37、至少38种来自表1的杂合CND多态性。在另一些实例中，遗传上不同的细胞群体的信息性标记包括至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29、至少30、至少31、至少32、至少33、至少34、至少35、至少36、至少37、至少38种来自表1的纯合缺失CND多态性。
在另一些实例中，遗传上不同的细胞群体的信息性标记包括至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29、至少30、至少31、至少32、至少33、至少34、至少35、至少36、至少37、至少38种来自表1的杂合缺失CND多态性，其在遗传上不同的细胞群体中是纯合缺失或纯合未缺失。在另一些实例中，遗传上不同的细胞群体的信息性标记包括至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29、至少30、至少31、至少32、至少33、至少34、至少35、至少36、至少37、至少38种来自表1的纯合缺失CND多态性，其在遗传上不同的细胞群体中是杂合缺失或纯合未缺失。在另一些实例中，遗传上不同的细胞群体的信息性标记包括至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29、至少30、至少31、至少32、至少33、至少34、至少35、至少36、至少37、至少38种来自表1的纯合未缺失CND多态性，其在遗传上不同的细胞群体中是杂合缺失或纯合缺失。在一个实例中，CND不位于HLA基因座中。
在一个实例中，在生物样品中评估至少一种CND以鉴定信息性标记。在一些实例中，在生物样品中评估至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29、至少30、至少31、至少32、至少33、至少34、至少35、至少36、至少37、至少38、至少39、至少40、至少41、至少42、至少43、至少44、至少45种CND多态性以鉴定信息性标记。例如，在生物样品中评估至少4种CND多态性以鉴定信息性标记。例如，在生物样品中评估至少6种CND多态性以鉴定信息性标记。
表1：
在另一个实例中，CNV是拷贝数重复多态性。在一个实例中，信息性拷贝数重复在遗传上不同的细胞群体中是纯合重复。在另一个实例中，信息性拷贝数重复在遗传上不同的细胞群体中是杂合重复。在另一个实例中，信息性拷贝数重复在遗传上不同的细胞群体中是纯合未重复。在另一些实例中，遗传上不同的细胞群体的信息性标记包括至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29、至少30、至少31、至少32、至少33、至少34、至少35、至少36、至少37、至少38、至少39、至少40、至少41、至少42、至少43、至少44、至少45种杂合重复拷贝数重复多态性。在另一些实例中，遗传上不同的细胞群体的信息性标记包括至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29、至少30、至少31、至少32、至少33、至少34、至少35、至少36、至少37、至少38、至少39、至少40、至少41、至少42、至少43、至少44、至少45种纯合重复拷贝数重复多态性。在另一个实例中，遗传上不同的细胞群体的信息性标记包括至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29、至少30、至少31、至少32、至少33、至少34、至少35、至少36、至少37、至少38、至少39、至少40、至少41、至少42、至少43、至少44、至少45种纯合重复拷贝数重复多态性，其在生物样品中遗传上不同的细胞群体中是杂合或纯合未重复。在另一个实例中，遗传上不同的细胞群体的信息性标记包括至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29、至少30、至少31、至少32、至少33、至少34、至少35、至少36、至少37、至少38、至少39、至少40、至少41、至少42、至少43、至少44、至少45种重合未重复拷贝数重复多态性，其在生物样品中遗传上不同的细胞群体中是杂合或纯合重复。在另一个实例中，遗传上不同的细胞群体的信息性标记包括至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29、至少30、至少31、至少32、至少33、至少34、至少35、至少36、至少37、至少38、至少39、至少40、至少41、至少42、至少43、至少44、至少45种杂合重复拷贝数重复多态性，其在生物样品中遗传上不同的细胞群体中是纯合未重复或纯合重复。
例如，信息性拷贝数重复多态性可以是在第一群体中是杂合重复并且在遗传上不同的细胞群体中是纯合重复或纯合未重复。在另一个实例中，信息性拷贝数重复多态性可以是在第一群体中是纯合重复并且在遗传上不同的细胞群体中是杂合或纯合未重复。在另一个实例中，信息性拷贝数重复多态性可以是在第一群体中是纯合未重复并且在遗传上不同的细胞群体中是杂合或纯合重复。在另一个实例中，信息性拷贝数重复多态性可以是在自身群体中是杂合并且在非自体群体中是纯合重复或纯合未重复。在另一个实例中，信息性拷贝数重复多态性可以是在自身群体中是纯合重复并且在非自身群体中是杂合重复的或纯合未重复。在另一个实例中，信息性拷贝数重复多态性可以是在自身群体中是纯合未重复并且在非自身群体中是杂合重复或纯合重复。
在一个实例中，在生物样品中评估至少一种拷贝数重复以鉴定信息性标记。在另一些实例中，在生物样品中评估至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29、至少30、至少31、至少32、至少33、至少34、至少35、至少36、至少37、至少38、至少39、至少40、至少41、至少42、至少43、至少44、至少45种拷贝数重复多态性以鉴定信息性标记。例如，在生物样品中评估至少4种拷贝数重复多态性以鉴定信息性标记。例如，在生物样品中评估至少6种拷贝数重复多态性以鉴定信息性标记。
在一个实例中，信息性CNV多态性的大小为至少约0.5kb至100百万碱基(megabase，Mb)。在另一个实例中，信息性CNV多态性的大小为至少约1kb至50Mb。在另一个实例中，信息性CNV多态性的大小为至少约1.5kb至25Mb。在另一个实例中，信息性CNV多态性的大小为至少约2kb至10Mb。在另一个实例中，信息性CNV多态性的大小为至少约2.5kb至1Mb。在另一个实例中，信息性CNV多态性的大小小于约5kb、约4.5kb、约4kb、约3.5kb、约3kb、约2.5kb、约2kb、约1.5kb、约1kb、约0.5kb。在一个实例中，信息性CNV多态性的大小小于3kb。在另一个实例中，所有信息性CNV的大小小于3kb。
在一个实例中，信息性CNV是多态性的。在另一个实例中，信息性CNV不具有已知的内在临床意义。
在一个实例中，信息性CNV的零拷贝等位基因频率大于约0.1、约0.2、约0.3、约0.4、约0.5、约0.6、约0.7、约0.8、约0.9。
在另一些实例中，信息性CND多态性可以包括约50bp至100Mb的缺失。因此，在一个实例中，可以在本公开的上下文中使用CND来描述长度超过50个碱基对的遗传片段的损失或增益。在另一些实例中，CND可以包括至少约50、约60、约70、约80、约90、约l00bp、约10、约20、约30、约40、约50、约60、约70、约80、约90、约100、约200、约300、约400、约500、约600、约700、约800、约900或约l,000kb的缺失。在另一个实例中，CND多态性可以包括至少约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19、约20、约21、约22、约23、约24、约25、约26、约27、约28、约29、约30、约31、约32、约33、约34、约35、约36、约37、约38、约39、约40、约41、约42、约43、约44、约45、约46、约47、约48、约49、约50、约51、约52、约53、约54、约55、约56、约57、约58、约59、约60、约61、约62、约63、约64、约65、约66、约67、约68、约69、约70、约71、约72、约73、约74、约75、约76、约77、约78、约79、约80、约81、约82、约83、约84、约85、约86、约87、约88、约89、约90、约91、约92、约93、约94、约95、约96、约97、约98、约99或约100Mb的缺失。
本领域技术人员可以容易地鉴定出为遗传学上不同细胞群体的信息性标记的CNV多态性。例如，本领域技术人员可以使用表7中所列的任何一种或全部引物组来鉴定分离自生物样品的基因组DNA中的信息性标记。可以在多种生物样品中鉴定信息性CNV多态性。例如，可以在获自流体样品的DNA中鉴定信息性CNV多态性。例如，可以通过评估分离自血液样品的DNA来鉴定信息性CNV。
在一个实例中，可以通过与从获自无嵌合状态的样品的DNA进行比较来鉴定自身和/或非自身DNA中的信息性CNV多态性。在一个实例中，通过与获自已知的自身细胞群体的DNA进行比较来鉴定自身DNA中的信息性CNV多态性。在另一个实例中，通过与获自已知的非自身细胞群体的DNA进行比较来鉴定非自身DNA中的信息性CNV多态性。可以获得已知的自身细胞或非自身细胞的示例性样品包括活检和切除材料、溶血产物、淋巴液、滑液、脊髓液、尿液、精液、粪便、痰、粘液、羊水、泪腺液、囊肿液(cyst fluid)、汗腺分泌物、胆汁、乳、泪液或唾液。在另一个实例中，可获得的已知的自身或非自身细胞的可以通过脸颊拭子获得口腔细胞。
基因组嵌合状态
本公开涉及测量获自受试者的生物样品中的“嵌合状态”的方法。在本公开的上下文中使用术语“嵌合状态”来描述获自受试者的生物样品中遗传上不同的细胞群体的共存。例如，术语“嵌合状态”包括获自受试者的生物样品中自身细胞群体和非自身细胞群体的共存。嵌合状态的多种实例是本领域中已知的。例如，嵌合状态可以存在于接受HSCT的受试者中。在该实例中，来自接受HSCT的受试者的生物样品中遗传上不同的细胞群体包括来自HSCT供体的细胞群体和来自HSCT接受者的细胞群体。胎儿-母体嵌合状态一个实例。在胎儿-母体嵌合状态的情况下，遗传上不同的细胞群体可以共存于获自胎儿的脐带的生物样品中。例如，获自脐带的生物样品中遗传上不同的细胞群体可以包含来自母亲的细胞群体和来自胎儿的细胞群体。
术语嵌合状态不旨在限于两种遗传上不同的细胞群体的共存。例如，嵌合状态可以存在于接受来自之前已接受了HSCT的供体的HSCT的受试者中。在该实例中，获自该受试者的生物样品中遗传上不同的细胞群体可以包含来自HSCT供体之供体的细胞群体，来自HSCT供体的细胞群体和来自HSCT接受者的细胞群体。因此，在一个实例中，生物样品可以包含至少3种遗传上不同的细胞群体。在另一些实例中，生物样品可以包含至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10种遗传上不同的细胞群体。在一个实例中，遗传上不同的细胞群体可以被表征为第一群体和第二群体。在另一个实例中，遗传上不同的细胞群体可以被表征为第一群体、第二群体，以及第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九或第十群体中的任何一个或多个。
在本公开的上下文中使用术语“遗传上不同”来基于其基因组构成来区分两种细胞群体。因此，遗传上不同的细胞群体具有不同的基因型。例如，非自身细胞与自身细胞是遗传上不同的。例如，来自骨髓移植供体(非自身细胞)的细胞与骨髓移植接受者细胞(自身细胞)是遗传上不同的。在另一个实例中，胎儿细胞与母体细胞是遗传上不同的。
在一个实例中，基于CNV多态性的存在或不存在将细胞群体表征为遗传上不同的。例如，基于一种细胞群体在其分离的基因组DNA中包含不存在于分离自另一种细胞群体的基因组DNA中的CNV多态性，将两种遗传上不同的细胞群体彼此区分。在另一个实例中，基于一种细胞群体在其分离的基因组DNA中包含不存在于分离自另一种细胞群体的基因组DNA中的至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少35、至少38种CNV多态性，将两种遗传上不同的细胞群体彼此区分。在另一个实例中，基于至少两种CNV多态性将两种遗传上不同的细胞群体彼此区分，一种CNV存在于分离自第一细胞群体的基因组DNA中但不存在于分离自第二细胞群体的基因组DNA中，并且一种CNV不存在于分离自第一细胞群体的基因组DNA中但存在于分离自第二细胞群体的基因组DNA中。
在另一个实例中，可以基于至少三种CNV多态性将两种遗传上不同的细胞群体彼此区分，两种CNV存在于分离自第一细胞群体的基因组DNA中但不存在于分离自第二细胞群体的基因组DNA中，一种CNV不存在于分离自第一细胞群体的基因组DNA中但存在于分离自第二细胞群体的基因组DNA中。在另一个实例中，可以基于至少四种CNV多态性将两种遗传上不同的细胞群体彼此区分，两种CNV存在于分离自第一细胞群体的基因组DNA中但不存在于分离自第二细胞群体的基因组DNA中，两种CNV不存在于分离自第一细胞群体的基因组DNA中但存在于分离自第二细胞群体的基因组DNA中。因此可以基于CNV的各种其他组合来区分遗传上不同的细胞群体。
嵌合状态的度量
在一个实例中，本公开涉及测量获自受试者的生物样品中的嵌合状态的方法。在一个实例中，来自遗传上不同的细胞群体的分离的基因组DNA的水平提供了生物样品中嵌合状态的度量。在本公开的上下文中，分离的基因组DNA主要来自分离自样品内的完整细胞的“细胞内基因组DNA”。术语“细胞内基因组DNA”与术语循环的无细胞DNA(circulatingcell-free DNA，ccfDNA)形成对比使用，后者可存在于个体的血浆中。随着凋亡和坏死细胞分解，ccfDNA从凋亡和坏死细胞释放到个体的血液中。在本公开的上下文中使用术语“细胞内基因组DNA嵌合状态”来指其中在从获自受试者的生物样品中的细胞中分离的DNA中存在遗传上不同(例如，“自身”和“非自身”)DNA的混合物的情况。当测量细胞内DNA嵌合状态时，评估分离自遗传上不同的细胞群体(例如，自身细胞和非自细胞)的DNA。术语“血浆DNA嵌合状态”是指在个体的血浆中存在遗传上不同(例如，“自身”和“非自身”)的循环的无细胞DNA(ccfDNA)的混合物的情况。为了避免疑问，术语“细胞内DNA嵌合状态”不包括“血浆DNA嵌合状态”，反之亦然。
在另一个实例中，生物样品中遗传上不同的细胞群体中的细胞数量提供了样品中嵌合状态的度量。二倍体细胞通常含有已知量的DNA。因此，在这个实例中，分离自遗传上不同的细胞群体DNA水平可用于计算群体中遗传上不同的细胞的数量。例如，如果来自HSCT供体(即第一遗传上不同的细胞群体)的基因组DNA的水平是生物样品中总DNA的80％并且来自HSCT接受者(即第二种遗传上不同的细胞群体)的基因组DNA的水平是样品中总DNA的20％，则样品中嵌合状态的度量可以表示为包含80％供体细胞(非自身)和20％接受者细胞(自身)。在一个实例中，样品中嵌合状态的度量继而提供了受试者中的嵌合状态水平，这允许评估HSCT移植成功(例如植入)或失败(例如移植排斥)。
在涉及测量脐带血样品中的嵌合状态的另一个实例中，如果来自胎儿(即第一遗传上不同的细胞群体)的基因组DNA的水平是生物样品中总DNA的98％并且来自母亲(即第二种遗传上不同的细胞群体)的基因组DNA的水平是样品中总DNA的2％，则样品中嵌合状态的度量可以表示为包含98％的胎儿细胞和2％的母体细胞。在一个实例中，样品中嵌合状态的度量继而提供了脐带血样品中的嵌合状态水平，后者指示脐带血母体污染的水平。
在另一个实例中，将分离自两种或更多种遗传上不同的细胞群体的DNA水平进行比较以提供样品中嵌合状态的度量。在这些实例中，可以测定分离自遗传上不同的细胞的基因组总DNA水平。例如，可以基于非多态性靶序列来测定总DNA水平。在本公开的上下文中使用“非多态性靶序列”来指纯合双拷贝对照。换言之，在遗传上不同的细胞群体中存在二拷贝的非多态性靶序列。例如，可以根据编码血管紧张素I转化酶的基因(例如#NM_000789)中的靶序列测定总DNA水平。
在另一个实例中，基于非自身DNA和自身DNA中存在的纯合多态性测定总DNA水平。例如，可以基于非自身DNA和自身DNA存在的纯合CNV多态性测定总DNA水平。
在另一个实例中，将自身DNA的水平与总DNA水平进行比较以提供自身DNA/总DNA的比率。因此，在一个实例中：
自身DNA的水平/总DNA的水平＝
自身DNA的水平:总DNA的水平
在另一个实例中，将非自身DNA的水平与总DNA水平进行比较以提供非自身DNA/总DNA的比率。因此，在一个实例中：
非自身DNA的水平/总DNA的水平＝
非自身DNA的水平:总DNA的水平
在另一个实例中，将非自身DNA的水平与自身DNA的水平进行比较以提供非自身DNA/非自身DNA的比率。因此，在一个实例中：
非自身DNA的水平/自身DNA的水平＝
非自身DNA的水平:自身DNA的水平
在另一个实例中，将自身DNA和非自身DNA的水平与总DNA水平进行比较，以提供自身DNA/总DNA的比率和非自身DNA/总DNA的比率。在另一个实例中，自身DNA的水平可以表示为总DNA的百分比。在另一个实例中，非自身DNA的水平可以表示为总DNA的百分比。
在一个实例中，本公开的方法可以包括内部验证步骤。例如，可以通过与样品中总DNA水平进行比较来验证分离自第一细胞群体的基因组DNA的水平和分离自第二遗传上不同的细胞群体的基因组DNA的水平。在一个实例中，在以下情况下验证了分离自第一细胞群体的基因组DNA的水平和分离自第二遗传上不同的细胞群体的基因组DNA的水平：
分离自第一种细胞群体的DNA的水平+分离自第二细胞群体的DNA的水平约＝总DNA。
在这个实例中，当来自第一群体的DNA水平+来自第二细胞群体的DNA水平不等于总DNA水平时，结果可指示样品中存在另外的遗传上不同的细胞群体。
在一个实例中，
-基于信息性CNV多态性测定分离自第一细胞群体的DNA的水平；
-基于信息性CNV多态性测定分离自第二细胞群体的DNA的水平；以及
-基于非多态性靶序列如血管紧张素I转化酶测量总DNA的水平，
其中当DNA水平的和约等于总DNA的水平时，验证了来自所述第一细胞群体和第二细胞群体的DNA的水平。
在另一个实例中，
-基于在分离自第一细胞群体的DNA中是杂合或纯合未缺失并且在分离自第二遗传上不同的细胞群体的DNA中是纯合缺失的CND多态性测定分离自第一细胞群体的DNA的水平；
-基于在分离自第一细胞群体的DNA中是纯合缺失并且在分离自第二遗传上不同的细胞群体的DNA中是杂合或纯合未缺失的CND多态性测定分离自第二细胞群体的DNA的水平；以及
-基于非多态性靶序列如血管紧张素I转化酶测量总DNA的水平，
其中当DNA水平的和约等于总DNA的水平时，验证了来自所述第一细胞群体和第二细胞群体的DNA的水平。
在另一个实例中，当基于分离自第一细胞群体和第二细胞的基因组DNA中存在的纯合CNV计算总DNA水平时，分离自第一细胞群体的DNA水平+分离自第二细胞群体的DNA水平不约等于总DNA水平也可指示DNA水平是的不准确的。
在另一个实例中，
-基于信息性CNV多态性测定分离自第一细胞群体的DNA的水平；
-基于信息性CNV多态性测定分离自第二细胞群体的DNA的水平；以及
-基于在分离自第一细胞群体和第二细胞群体二者的基因组DNA中纯合存在的CNV多态性测量总DNA的水平，
其中当所述水平的和约等于总DNA水平时，验证了DNA的水平。
在另一个实例中，
-基于在分离自第一细胞群体的DNA中是杂合或纯合未缺失并且在分离自第二遗传上不同的细胞群体的DNA中是纯合缺失的CND多态性测定分离自第一细胞群体的DNA的水平；
-基于在分离自第一细胞群体的DNA中是纯合缺失并且在分离自第二遗传上不同的细胞群体的DNA中是杂合或纯合未缺失的CND多态性测定分离自第二细胞群体的DNA的水平；以及
-基于在分离自第一细胞群体和第二细胞群体二者的基因组DNA中纯合存在的CNV多态性测量总DNA的水平，
其中当所述水平的和约等于总DNA水平时，验证了DNA的水平。
在这些实例中，当组合的DNA水平不等于总DNA水平时，分离自第一细胞群体和第二细胞群体的DNA的水平可能不准确。例如，样品中可能存在其他遗传上不同的细胞群体。
在另一个实例中，使用分离自两种或更多种遗传上不同的细胞群体的DNA水平来计算这些群体中的细胞数量。在一个实例中，比较每个群体中遗传上不同的细胞的数目，以提供样品中嵌合状态的比较度量。
在一个实例中，比较生物样品中的细胞群体数量以提供嵌合状态的百分比。例如，可以比较非自身细胞和自身细胞的数量以提供嵌合状态的百分比。在一个实例中，比较生物样品中的细胞群体以提供比率。例如，可以比较生物样品中自身细胞和非自身细胞的数量，以将嵌合状态的度量表示为自身细胞:非自身细胞的比率。因此，在一个实例中：
自细胞数量/非自细胞数量＝
自细胞数量:非自细胞数量
在另一个实例中，总DNA的水平可以用来计算样品中细胞的总数。
测定基因组DNA的水平
在一个实例中，基于上文讨论的信息性CNV多态性测定分离自遗传上不同的细胞群体的基因组DNA的水平。可以使用本领域已知的各种方法基于这些CNV测定DNA的水平。例如，可以使用靶向期望CNV的引物通过扩增反应或者通过不依赖于扩增的检测手段来测定DNA的水平。在一个实例中，测定DNA的水平包括利用靶向信息性CND多态性的引物对分离的DNA进行扩增反应。一旦鉴定了信息性CNV，本领域技术人员可以容易地设计靶向该区域的引物。例如，可以使用诸如PrimerQuest(Integrated DNA Technologies)的引物设计工具基于信息性CNV的核酸序列产生合适的引物。在一个实例中，可以使用靶向信息性CNV的内部区域的引物通过扩增反应来测定DNA的水平。在另一个实例中，可以使用靶向信息性CNV边界的引物通过扩增反应来测定DNA的水平。在另一个实例中，可以使用靶向信息性CNV的外部区域的引物和靶向信息性CNV的内部区域的引物通过扩增反应来测定DNA的水平。本领域技术人员将理解，在该实例中，杂合缺失的CND将提供1拷贝PCR产物，纯合缺失的CND将提供0拷贝PCR产物，而纯合未缺失CND将提供2拷贝PCR产物。在另一个实例中，可以使用靶向CNV边界的相对侧(即，紧邻信息性CNV“外部CNV边界”的区域和紧邻信息性CNV“内部CNV边界”的区域)的引物组通过扩增反应来测定DNA的水平。在另一个实例中，可以通过使用靶向信息性CND的内部区域的引物通过扩增反应来测定DNA的水平。在另一个实例中，可以使用靶向信息性CND边界的引物通过扩增反应来测定DNA的水平。在另一个实例中，可以使用靶向信息性CNV的外部区域的引物和靶向信息性CND的内部区域的引物通过扩增反应来测定DNA的水平。在另一个实例中，可以使用靶向CND边界的相对侧(即，紧邻信息性CND“外部CND边界”的区域和紧邻信息性CND“内部CND边界”的区域)的引物组通过扩增反应来测定DNA的水平。在另一个实例中，可以基于使用表7中所示引物扩增信息性CND多态性来测定DNA的水平。示例性的基于扩增的检测方法包括液滴数字PCR和定量RT-PCR。
本领域技术人员将理解，鉴定在第一细胞群体中是杂合或纯合未缺失并且在遗传上不同的细胞群体中是纯合缺失的CND多态性是有利的，因为可以测定分离自第一细胞群体的基因组DNA的水平而无分离自遗传上不同的细胞群体的基因组DNA的背景扩增(“零背景”)。还有利的是鉴定在第二细胞群体中是杂合或纯合未缺失并且在第一细胞群体中是纯合缺失的CND多态性，因为也可以在零背景下测定分离自第二细胞群体的基因组DNA的水平。因此，在一个实例中，基于至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10种CND多态性测定第一细胞群体中DNA的水平，所述CND多态性在分离自遗传上不同的细胞群体的基因组DNA中是纯合缺失，并且在分离自第一细胞群体的基因组DNA中是杂合或纯合未缺失。因此，在一个实例中，基于至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10种CND多态性测定第二细胞群体中DNA的水平，所述CND多态性在分离自第一细胞群体的基因组DNA中是纯合缺失，并且在分离自遗传上不同的细胞群体的基因组DNA中是杂合或纯合未缺失。在这些实例中，可以使用靶向信息性CND的内部区域的引物来测定基因组DNA的水平。
在另一个实例中，测定DNA的水平包括利用靶向信息性CNV多态性的不依赖于定量扩增的检测手段评估DNA。例如，可以通过使用诸如下一代测序(NGS)、大规模平行测序和NanoString技术的方法评估信息性CNV多态性来测定DNA的水平。本领域技术人员可以基于CNV的信号强度(例如通过定量扩增或通过不依赖于扩增的NGS或NanoString技术测量)来测定分离自遗传上不同的细胞群体的基因组DNA的量。例如，可以使用Lo等.Am JHumGenet.62:768 1998描述的公式计算DNA浓度。
样品制备和分析
使用本公开的方法在分离自受试者的生物样品上评估嵌合状态。认为诸如“生物样品”和“样本”的术语可以在本公开的上下文中互换使用。在一个实例中，样品分离自人。例如，样品可分离自儿童、青少年或成人受试者。在一个实例中，受试者是HSCT接受者。在一个实例中，受试者接受骨髓移植。在另一个实例中，受试者接受脐带血移植。
在本公开中，任何细胞材料都可以用作上述生物样品，只要其可以从受试者收集并且可以从细胞中分离DNA并且根据本公开的方法进行分析即可。例如，样品可以是流体样品。例如，样品可以是血液样品(例如，分离的静脉血液)。在一个实例中，样品是含有自身细胞和非自身细胞的血液样品。
在本公开的上下文中使用术语“血液样品”来指全血或全血中细胞亚群的样品。全血中的细胞亚群包括血小板、红细胞(红血球)、血小板和白细胞(即由嗜中性粒细胞、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和单核细胞组成的外周血白细胞)。这五种类型的白细胞可以进一步分为两组：粒细胞(也称为多形核白细胞，包括嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞)和单核白细胞(包括单核细胞和淋巴细胞)。淋巴细胞可以进一步分为T细胞、B细胞和NK细胞。可以通过例如离心、亲和色谱(例如，免疫吸附方式)和过滤处理血液样品以除去全部细胞。
在一个实例中，样品可以包含从受试者直接分离的或者从获自受试者的样品纯化的特定细胞类型或细胞类型的混合物。例如，样品可以是外周血单核细胞(pBMC)。在另一个实例中，可以从血液样品中纯化任何以上提到的细胞类型，并使用本公开的方法进行评估。例如，可以在T细胞中评估基因组DNA水平。在另一个实例中，可以在B细胞中评估基因组DNA水平。在另一个实例中，可以在粒细胞中评估基因组DNA水平。在另一个实例中，可以在获自受试者血液样品的T细胞、B细胞和NK细胞中评估基因组DNA水平。在另一个实例中，可以在获自受试者血液样品的T细胞、B细胞和粒细胞中评估基因组DNA水平。纯化细胞亚群的多种方法是本领域已知的。例如，可以使用多种已知的基于Ficoll的离心方法(例如Ficoll-Hypaque密度梯度离心)从全血中纯化pBMC。以下还举例说明了从全血中纯化pBMC的方法。可以使用诸如荧光激活细胞分选(FACS)或基于磁珠的分离技术等技术基于其多种细胞表面标记的表达来免疫选择其他细胞群体。例如，可以基于其CD3和CD4和/或CD8的表达来选择T细胞，可以基于其CD19的表达来选择B细胞，并且可以基于其CD16和/或CD56的表达来选择NK细胞。在另一些实例中，可以基于其CD14的表达来纯化单核细胞。在另一个实例中，基于CD3和CD19的表达纯化T细胞和粒细胞，T细胞是CD3+CD19+，粒细胞是CD3-CD19-。
在另一个实例中，在从细胞中分离基因组DNA之前，将生物样品纯化或处理以除去循环无细胞核酸。例如，可以使用离心从生物样品中纯化血浆。在另一个实例中，可以从受试者获得全血样品，并且可以在凝结后通过离心除去血清。
从生物样品中的细胞中提取DNA用于分析。在一个实例中，从细胞中提取的DNA是基因组DNA。从细胞中分离DNA(特别是基因组DNA)的多种方法是本领域技术人员已知的。一般来说，已知的方法涉及破坏和裂解初始材料，随后除去蛋白质和其他污染物，并最终回收DNA。例如，涉及酒精沉淀、有机酚/氯仿萃取和盐析的技术已用于提取和分离DNA多年。以下举例说明了DNA分离的一个实例(例如Qiagen All-prep试剂盒)。但是，有多种用于基因组DNA提取的其他市售试剂盒(例如Life technologies；Qiagen)。DNA的纯度和浓度可以通过各种方法评估，例如分光光度法。
检测生物样品中遗传上不同的细胞群体
HSCT为接受者提供至少两种遗传上不同的细胞群体(例如自身细胞和非自细胞)。在HSCT之前，将接受者骨髓(自身细胞群体)消融。例如，受试者在施用HSCT之前通常接受强烈的化学疗法和/或辐射。消融的骨髓被供体骨髓(非自身细胞)替代。然后供体骨髓可开始产生非自身细胞，如血细胞。这个过程被称为植入。在一个实例中，本公开的方法涉及测定HSCT接受者中植入的水平。例如，本公开的方法可以用于通过测定获自HSCT接受者的生物样品中非自身细胞的水平来测定HSCT接受者中的植入水平。因此，在一个实例中，本公开的方法涉及测定HSCT接受者中的植入水平的方法，所述方法包括基于拷贝数变异(CNV)多态性测定获自HSCT接受者的生物样品中分离自遗传上不同的细胞群体的基因组DNA的水平，所述拷贝数变异(CNV)多态性是所述遗传上不同的细胞群体的信息性标记，其中来自所述遗传上不同的细胞群体的分离的基因组DNA的水平提供了对HSCT接受者中的植入的度量。在这个实例中，遗传上不同的细胞群体可以与受试者遗传上不同。例如，遗传上不同的细胞群体可以由非自身细胞组成。在另一个实例中，遗传上不同的细胞群体可以是非自身细胞。
在一个实例中，比较来自自身细胞和非自身细胞的分离的基因组DNA的水平，以提供对HSCT接受者中植入的度量。在另一个实例中，将自身DNA的水平和/或非自身DNA的水平与DNA总水平进行比较以提供植入的百分比。
例如，非自身细胞占总细胞的百分比提供了植入的百分比。在多个实例中，非自身细胞的百分比大于约60％、约65％、约70％、约75％、约76％、约77％、约78％、约79％、约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％指示HSCT的植入。在另一个实例中，100％非自身细胞指示完全植入。在另一个实例中，自身细胞的百分比小于约40％、约35％、约30％、约25％、约24％、约23％、约22％、约21％、约20％、约19％、约18％、约17％、约16％、约15％、约14％、约13％、约12％、约11％、约10％、约9％、约8％、约7％、约6％、约5％、约4％、约3％、约2％、约1％指示HSCT的植入。在另一个实例中，0％自身细胞指示完全植入。
在另一个实例中，将自身DNA的水平和/或非自身DNA的水平与总DNA水平进行比较以提供植入比率。在一个实例中，自身细胞:非自身细胞大于约3:20、约1:10、约1:20、约1:50、约1:100指示HSCT受试者中的植入。
在另一个实例中，本公开的方法可用于测量HSCT接受者自身骨髓的重建(即自身细胞的重建)。例如，本公开的方法涉及测定HSCT接受者骨髓重建的水平的方法，所述方法包括基于拷贝数变异(CNV)多态性测定获自HSCT接受者的生物样品中分离自遗传上不同的细胞群体的基因组DNA的水平，所述拷贝数变异(CNV)多态性是所述遗传上不同的细胞群体的信息性标记，其中来自所述遗传上不同的细胞群体的分离的基因组DNA的水平指示HSCT接受者骨髓是否重建。在这个实例中，遗传上不同的细胞群体可以与受试者遗传上不同。例如，遗传上不同的细胞群体可以由非自身细胞组成。在另一个实例中，遗传上不同的细胞群体可以是非自身细胞。
在一个实例中，比较来自自身细胞和非自身细胞的分离的基因组DNA的水平，以提供对HSCT接受者中植入的度量。
在另一个实例中，将自身DNA的水平和/或非自身DNA的水平与总DNA水平进行比较以提供骨髓重建的百分比。例如，自细胞占总细胞的百分比提供了骨髓重建的百分比。在另一个实例中，非自身细胞的百分比提供了骨髓重建的百分比。在多个实例中，自身细胞的百分比大于约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约11％、约12％、约13％、约14％、约15％、约16％、约17％、约18％、约19％、约20％、约21％、约22％、约23％、约24％、约25％、约30％、约35％、约40％指示HSCT接受者骨髓的重建。在另一个实例中，非自身细胞的百分比小于约60％、约65％、约70％、约75％、约76％、约77％、约78％、约79％、约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％指示HSCT接受者骨髓的重建。在另一个实例中，将自身DNA的水平和/或非自身DNA的水平与总DNA水平进行比较以提供HSCT接受者骨髓重建的比率。在一个实例中，自身细胞:非自身细胞大于约3:20、约1:10、约1:20、约1:50、约1:100指示HSCT接受者骨髓的重建。
本公开的方法可用于测量由于各种原因而接受HSCT的受试者中的嵌合状态。在一个实例中，受试者接受HSCT以治疗血液病症。在一个实例中，受试者接受HSCT以治疗血液恶性肿瘤。示例性血液恶性肿瘤包括套细胞淋巴瘤(MCL)、多发性骨髓瘤(MM)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin’s lymphoma)(NHL)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、慢性或急性骨髓性白血病(AML)、小淋巴细胞性淋巴瘤(SLL)或急性淋巴性白血病、滤泡性淋巴瘤、瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症(Waldenstrom’s macroglobulinemia)(WM)、B细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、骨髓发育不良瘤或骨髓增生异常瘤。在一个实例中，受试者接受HSCT以治疗B细胞疾病。在另一个实例中，受试者接受了HSCT以治疗B细胞恶性肿瘤。在另一个实例中，受试者接受了HSCT以治疗浆细胞疾病。在另一个实例中，受试者接受HSCT以治疗淋巴组织增生性疾病。例如，受试者可以接受HSCT以治疗多发性骨髓瘤、B细胞淋巴瘤、霍奇金和非霍奇金淋巴瘤以及巨球蛋白血症。在另一个实例中，受试者可接受HSCT以治疗免疫缺陷。例如，受试者可接受HSCT以治疗维斯科特-奥尔德里奇综合征(Wiskott-Aldrich syndrome)、慢性肉芽肿病和地中海贫血。在另一些实例中，受试者可能已经接受HSCT以治疗代谢病症、血红蛋白病、自身免疫疾病或骨髓衰竭。
在另一个实例中，本公开的方法可用于测量HSCT接受者血液病症的重建。例如，本公开的方法涉及测定HSCT接受者B细胞病症的重建的方法，所述方法包括基于拷贝数变异(CNV)多态性测定获自HSCT接受者的生物样品中分离自遗传上不同的细胞群体的基因组DNA的水平，所述拷贝数变异(CNV)多态性是所述遗传上不同的细胞群体的信息性标记，其中来自所述遗传上不同的细胞群体的分离的基因组DNA的水平指示HSCT接受者血液病症是否重建。在这个实例中，遗传上不同的细胞群体可以与受试者遗传上不同。例如，遗传上不同的细胞群体可以由非自身细胞组成。在另一个实例中，遗传上不同的细胞群体可以是非自身细胞。
在另一个实例中，将自身DNA的水平和/或非自身DNA的水平与DNA总水平进行比较以提供血液病症重建的百分比。在一个实例中，自细胞占总细胞的百分比提供了血液病症重建的百分比。在一个实例中自身细胞的百分比大于约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约11％、约12％、约13％、约14％、约15％、约16％、约17％、约18％、约19％、约20％、约21％、约22％、约23％、约24％、约25％、约30％、约35％、约40％指示HSCT接受者血液病症的重建。在另一个实例中，非自身细胞的百分比提供了血液病症重建的百分比。在一个实例中，非自身细胞的百分比99％、约98％、约97％、约96％、约95％、约94％、约93％、约92％、约91％、约90％、约89％、约88％、约87％、约86％、约85％、约84％、约83％、约82％、约81％、约80％、约79％、约78％、约77％、约76％、约75％、约70％、约65％、约60％指示HSCT接受者血液病症的重建。
在另一个实例中，将自身DNA的水平和/或非自身DNA的水平与总DNA水平进行比较以提供血液病症重建的比率。在一个实例中，自身细胞:非自身细胞大于约3:20、约1:10、约1:20、约1:50、约1:100指示HSCT接受者血液病症的重建。
在另一个实例中，本公开的方法可以用于测量患者中的疾病复发。在另一个实例中，本公开的方法可用于测量有需要的患者中的最小残留疾病。例如，本公开的方法涉及测量最小残留疾病的方法，所述方法包括基于拷贝数变异(CNV)多态性测定获自患者的生物样品中分离自遗传上不同的细胞群体的基因组DNA的水平，所述拷贝数变异(CNV)多态性是所述遗传上不同的细胞群体的信息性标记，其中来自所述遗传上不同的细胞群体的分离的基因组DNA的水平指示最小残留疾病的水平。在另一个实例中，遗传上不同的细胞群体可以是非自身细胞。在另一个实例中，根据本公开的方法测定分离自自身细胞和非自身细胞的基因组DNA的水平。在一个实例中，比较来自自身细胞和非自身细胞的分离的基因组DNA的水平以测定最小残留疾病的水平。在另一个实例中，根据本公开的方法测定样品中总DNA的水平。在另一个实例中，将自身DNA的水平和/或非自身DNA的水平与总DNA水平进行比较以提供最小残留疾病的百分比。在另一个实例中，将自身DNA的水平和/或非自身DNA的水平与总DNA水平进行比较以提供最小残留疾病的比率。
在上面的实例中，可以跨细胞类型测量嵌合状态。上面概述了示例性的细胞类型。例如，可以在T细胞、B细胞和粒细胞中评估嵌合状态。在这个实例中，获得了嵌合状态的三个度量。嵌合状态的这些度量可以告知治疗状态。在一个实例中，接受者T细胞水平降低可以指示免疫抑制过高。在这种情况下，主治医生可以降低接受者中的免疫抑制。相反，接受者的升高的T细胞水平提供了提高免疫抑制(如果需要的话)的范围。在T细胞介导的疾病例如GVHD中，这些实例可能特别有利。在这些疾病中，治疗的目的是维持T细胞抑制和移植存活之间的适当平衡。因此，在一个实例中，本公开的方法涉及治疗GVHD的方法，所述方法包括测量T细胞、B细胞和粒细胞中的嵌合状态，并且基于测量的嵌合状态水平施用治疗。
在另一个实例中，本公开的方法可用于鉴定生物样品的污染。在这个实例中，术语“污染”用于定义生物样品中两种或更多种遗传上不同的细胞群体的存在。在一个实例中，本公开的方法涉及测定血液样品中污染的水平。例如，设想本公开的方法包括鉴定脐带血样品的母体污染(例如，胎儿“自身”脐带血样品中母体“非自身”细胞的存在)。例如，本公开的方法涉及测定脐带血样品中母体污染的水平的方法，所述方法包括基于拷贝数变异(CNV)多态性测定脐带血样品中分离自遗传上不同的细胞群体的基因组DNA的水平，所述拷贝数变异(CNV)多态性是所述遗传上不同的细胞群体的信息性标记，其中来自所述遗传上不同的细胞群体的分离的基因组DNA的水平提供了对脐带血样品中污染的度量。在这个实例中，遗传上不同的细胞群体可以与胎儿遗传上不同。例如，遗传上不同的细胞群体可以是母体细胞。在另一个实例中，遗传上不同的细胞群体可以是胎儿细胞。
在一个实例中，比较来自自身细胞和非自身细胞的分离的基因组DNA的水平，以提供对脐带血样品中污染的度量。在另一个实例中，根据本公开的方法测定样品中总DNA的水平。在另一个实例中，将自身DNA的水平和/或非自身DNA的水平与总DNA水平进行比较以提供污染百分比。例如，自细胞占总细胞的百分比提供了污染的百分比。例如，自细胞占总细胞的百分比提供了污染的百分比。在另一个实例中，将自身DNA的水平和/或非自身DNA的水平与总DNA水平进行比较以提供污染的比率。在一个实例中，自身细胞:非自身细胞大于约3:20、约1:10、约1:20、约1:50、约1:100指示指示脐带血样品的污染。
监测
通过在至少两个时间点上进行本公开的方法，可以使用本公开的方法监测受试者中随时间的嵌合状态。例如，本公开的方法可用于在HSCT之后监测受试者。在另一个实例中，本公开的方法可以用于监测植入。在另一个实例中，本公开的方法可用于监测受试者骨髓的重建。在另一个实例中，本公开的方法可用于监测受试者血液病症的重建。在另一个实例中，本公开的方法可用于监测最小残留疾病。例如，本公开的方法可用于监测移植物抗宿主病(GVHD)。在另一个实例中，本公开的方法可用于监测疾病复发。在另一个实例中，本公开的方法可用于监测移植HSCT排斥。在另一个实例中，本公开的方法可以用于预测治疗失败。在一个实例中，本公开的方法可以每天进行。在一个实例中，本公开的方法可以每周进行。在另一个实例中，本公开的方法可以每月进行。在另一个实例中，本公开的方法可以每两个月进行。在另一个实例中，本公开的方法可以每三个月、每四个月、每六个月进行。在另一个实例中，本公开的方法可以每年进行。
在一个实例中，自身细胞水平的升高和/或非自身细胞水平的降低指示HSCT接受者骨髓的重建。受试者骨髓的重建可以指示HSCT排斥。因此，自身细胞水平的升高和/或非自身细胞水平的降低可以表明应向HSCT接受者施用免疫抑制疗法或者应修改HSCT接受者的免疫抑制疗法。在另一个实例中，自身细胞水平的升高和/或非自身细胞水平的降低可以表明应向HSCT接受者施用用于所述血液病症的治疗或应修饰所述HSCT接受者的治疗。当观察到自身细胞水平的升高和/或非自身细胞水平的降低时，对免疫抑制疗法的示例性修改包括增加免疫抑制疗法。
在一个实例中，可将本公开的方法并入用于测定合适的治疗方案的测定中。例如，本公开提供了治疗受试者中的HSCT排斥的方法，所述方法包括监测获自HSCT接受者的样品中分离自自身细胞和非自身细胞的基因组DNA的水平，其中如果监测到自身细胞水平的升高和/或非自身细胞水平的降低，则向HSCT接受者施用免疫抑制疗法或者修改HSCT接受者的免疫抑制疗法。在另一个实例中，本公开提供了治疗受试者中的血液病症的方法，所述方法包括监测获自HSCT接受者的样品中分离自自身细胞和非自身细胞的基因组DNA的水平，其中如果监测到自身细胞水平的升高和/或非自身细胞水平的降低，则向HSCT接受者施用治疗或者修改HSCT接受者的治疗。在这个实例中，治疗可以包括化学疗法、放射疗法、免疫疗法、抗体疗法、HSCT或其他药理学试剂。当观察到自身细胞水平的升高和/或非自身细胞水平的降低时，示例性的治疗修改包括增加治疗。
计算机执行的方法
设想本公开的方法可以通过系统(例如计算机执行的方法)来实现。例如，系统可以是包括一个或多个处理器的计算机系统，所述处理器可以一起操作(为了方便起见，称为“处理器”)连接到存储器。存储器可以是非暂时性计算机可读介质，例如硬盘驱动器、固态盘或CD-ROM。作为可执行指令或程序代码(例如分组为代码模块的程序代码)的软件可以存储在存储器上，并且当由处理器执行时，可以使计算机系统执行诸如以下的功能：确定待执行的任务以帮助用户确定从来自受试者的生物样品获得的DNA中的信息性CNV多态性；接收指示样品中DNA水平(例如自身DNA和/或非自身DNA)的数据；处理数据以基于DNA水平检测样品中嵌合状态的水平；输出样品中嵌合状态的水平。
例如，所述存储器可以包括程序代码，当由处理器执行时，所述序代码使系统测定受试者中嵌合状态的度量，或者接收指示受试者中嵌合状态的度量的数据；处理数据以基于分离自遗传上不同的细胞群体的基因组DNA水平来测量嵌合状态；报告受试者中嵌合状态的度量。
在另一个实例中，系统可以耦合到用户界面以使系统能够从用户接收信息和/或输出或显示信息。例如，用户界面可以包括图形用户界面、语音用户界面或触摸屏。
在一个实例中，系统可以被配置为通过通信网络(例如无线通信网络)与至少一个远程设备或服务器进行通信。例如，系统可以被配置成通过通信网络从设备或服务器接收信息并且通过通信网络将信息传送至相同或不同的设备或服务器。在另一些实施例中，系统可以与直接用户交互隔离。
在另一个实例中，通过测定获自受试者中遗传上不同的细胞群体的DNA水平(基于信息性CNV多态性测定DNA水平)执行本发明的方法以测量受试者中的嵌合状态能够基于DNA水平建立诊断或预后规则。例如，诊断或预后规则可以基于相对于对照的嵌合状态的度量。
在另一个实例中，诊断或预后规则基于统计和机器学习算法的应用。这种算法使用嵌合状态的度量与在训练数据(具有已知疾病状态)中观察到的疾病状态之间的关系来推断关系，然后将所述关系用于预测未知状态的患者的状态。采用提供诸如以下的概率指数的算法：
-已经发生植入；
-患者的骨髓已经重建；
-患者的血液病症已经复发。
在一个实例中，该算法执行多变量或单变量分析函数。
在另一个实例中，本公开涉及一种允许使用者确定HSCT接受者的状态、预后和/或治疗响应的方法，所述方法包括：(a)接收指示受试者中嵌合状态的度量的数据；b)处理数据以确定受试者嵌合状态的度量；以及c)输出受试者的状态、预后和/或治疗响应。
在另一个实例中，本公开涉及一种允许使用者确定患有疾病的受试者的状态、预后和/或治疗响应的方法，所述方法包括：(a)接收指示受试者中嵌合状态的度量的数据；b)处理数据以确定受试者嵌合状态的度量；和c)输出受试者的状态、预后和/或治疗响应。
在一个实例中，嵌合状态的度量提供了疾病的存在、状态、分类、缓解或进展的相关性。
组合物/试剂盒
在一个实例中，本公开涉及用于在本公开的方法中使用的试剂盒，其包含特别配置为扩增本公开中概述的CNV多态性的PCR引物对(参见例如表7)。例如，试剂盒可以包含：
a)表1中所示的CNV多态性特异性的探针和/或引物；和/或
b)表7中所示的探针和/或引物。
在一个实例中，试剂盒组分可包装在合适的溶剂中或以冻干形式包装。试剂盒组分可以任选地被包装在合适的容器中，所述容器具有用于执行本公开的方法的书面说明书。在一个实例中，本公开涉及本文公开的引物在制造用于执行本公开的方法的非侵入性体外诊断测定中的用途。
本领域技术人员将理解，可以对上述实施方案进行许多变化和/或修改，而不脱离本公开的宽广的一般范围。因此，本发明在所有方面的实施方案因被认为是说明性的而不是限制性的。本文讨论和/或参考的所有出版物都整体并入本文。已经包括在本说明书中的对文件、动作、材料、装置、制品等的任何讨论仅为了提供本公开的背景。不能认为承认任何或所有这些事项由于其存在于本申请的每个权利要求的优先权之前而构成现有技术基础的一部分或者是在与本公开相关的领域中的公知常识。本申请要求于201年6月15日提交的AU2015902274的优先权，其公开内容通过引用并入本文。
实施例
实施例1-CNV缺失基因座的选择
每个个体基因组具有不同的拷贝数变异(CNV)谱，其由扩散在整个基因组中的数千个损失(即缺失)和收益(即，愉快(delectation)、扩增等)组成。其中一些发生在已经在大规模CNV基因分型研究中鉴定的拷贝数可变区，但是许多也是独特的。在已知的CNV区域中，这些可以根据拷贝数状态(即0、1、2、3等)的等位基因分布、基因组大小和群体频率进行分层。为了检测DNA样品中的嵌合状态，选择具有0、1、2的等位基因分布(但不重复)并且纯合缺失(0拷贝PCR产物)等位基因频率大于0.4的CNV区域。后者不应被视为一种限制，而是反映了用于开发能够检测绝大多数样品中的嵌合状态而不需要筛选父本基因组的一组测定的方法。此类CNV是群体中常见的，并且通过对公共HapMap数据(Conrad等.Nature,4(54):704-712,2010)；McCarrol等.Nature Genet 40(10):1166-1174,2008)进行计算机分析选择了10个(CND_01-CND_10；表1)的初始组。Hap Map数据包括通过高分辨率微阵列分析鉴定的每种CNV的拷贝数信息。对于频率计算，仅包括来自不相关个体的数据(n＝122)。选择具有纯合缺失(0拷贝PCR产物)、杂合缺失(1拷贝PCR产物)和纯合未缺失(2拷贝PCR产物)基因型的CNV用于分析。排除具有延伸到超过2个拷贝的等位基因分布的CNV以及染色体X和Y CNV。对于每个选择的CNV，计算基因型频率。排除与片段重复重叠的CNV。全部十种CNV的大小都小于3kb；然而该方法适用于所有尺寸范围的CNV。在临床应用方面，重要的是注意到，全部十种CNV区域都是多态性的，并且它们都没有任何内在的临床意义。
表1：
实施例2-基因分型
利用位于10个‘CNV缺失’基因座(CND_01-CND_10；表1)的内部(即，内部PCR)和侧翼(即，外部PCR)的引物设计了PCR。内部PCR给出杂合缺失(1拷贝PCR产物)或纯合未缺失(2拷贝PCR产物)基因型的特定产物，并且缺少特定产物指示纯合缺失基因型(0拷贝PCR产物)。外部PCR产生比“野生型”更短的精确产物(注意：不存在较大的“野生型”产物，因为未缺失的等位基因太大而不能扩增)，证实了由内部PCR检测到的所有缺失。使用内部PCR和外部PCR的组合来测定母体细胞DNA中每种CND的基因型状态(即，纯合未缺失(2拷贝PCR产物)、杂合缺失(1拷贝PCR产物)或纯合缺失(2拷贝PCR产物))。对于21个对照样品获得的基因分型结果示出在图1中。缺少条带指示具有“纯合缺失”(0拷贝PCR产物)基因型的个体(图1a)，并且其在12个个体中观察到。这与CND_01的预测的50％频率一致。显示出PCR产物条带的9个个体是“杂合缺失(1拷贝PCR产物)或纯合未缺失(2拷贝PCR产物)，如从外部PCR结果(图1b)推断的。外部PCR的结果(图1b)也证实了纯合缺失(0拷贝PCR产物)是真实的，而不是PCR失败。为了明确证明基因分型测定是准确的，对示出的“内部PCR”和“外部PCR”产物进行测序并使用BLAT将其作图回基因组位置。在所有情况下，这都是正确的、独特的基因组基因座。通过对来自局部一般群体的100个个体的DNA样品进行基因分型来确认所有CNV缺失的预期频率(表1)。对于大多数CND，预期频率和观察到的频率类似，除了CND_10，在我们的对照群体中其具有相对低的纯合缺失(0拷贝PCR产物)频率。
实施例3-加标实验
对于组中的每个CND，使用通过混合来自基因型状态不同的个体的对照DNA获得的“嵌合”DNA的滴定，经验地模拟嵌合状态测量中的灵敏度下限和特异性。简单地说，将来自所选CNV缺失基因座的杂合缺失(1拷贝PCR产物)个体的DNA样品加标至来自所选CNV缺失基因座的“纯合缺失”(0拷贝PCR产物)个体的DNA样品中。在加标样品上进行CNV缺失qPCR测定和基于SRY的qPCR测定。
实施例4-CND标记的计算机选择
通过对两个高分辨率数据集进行计算机分析来鉴定纯合缺失(0拷贝PCR产物)缺失频率为0.3至0.7的CND。数据集1：通过以500bp分辨率测试450个HapMap样品产生的5238个CNV基因座的基因型数据(Conrad等.(2010)同上)。数据集2：通过以2Kb分辨率测试270个HapMap样品产生的1319个CNV基因座的基因型数据(McCarrol等.(2008)同上)。分析仅使用CEPH数据。由于CEPH HapMap数据包括先证者(proband)和父母的三重数据，所以仅使用亲本数据进行纯合缺失(0拷贝PCR产物)、杂合缺失(1拷贝PCR产物)和纯合未缺失(2拷贝PCR产物)基因型频率的计算，以尽量减少高估。没有进一步校正，进行例如同合性(autozygosity)(Stevens等.(2012)EJHG 20:657-667；Stevens等.(2012)PLOS One 7:49575)。计算机选择使用以下标准：每种CNV构成人类基因组中跨越小于3千个碱基(超滤性别偏差)的单个基因座。这得到了38个候选物；所有这些CNV区域都是多态性的，并且没有任何已知的内在临床意义。
实施例5-CND组
在以上鉴定的38种CND中，选择预测具有最多信息性“纯合缺失”(0拷贝PCR产物)基因型频率等级的10个作为用于体外评估的初始阻(CND_01-CND_10；表1)。纯合缺失基因型(0拷贝PCR产物)频率的范围为0.410至0.508，平均值为0.452，标准偏差为0.038。基于这些纯合缺失(0拷贝PCR产物)基因型频率，计算并且随后通过观察确认了，对于组中的至少一种CND，99％的个体可能是纯合缺失的(0拷贝PCR产物)。CND频率的体外估计
将通过计算机选择获得的10种CND的估计的群体频率与93个健康个体的未选择样品中的群体频率进行比较。采集该样品的局部群体在种族上变化很大，并且假设我们的随机抽样反映了这一点。尽管这些CND在不同种族群体中的信息很少，但是通过计算机突出了这些CND标记用于不同群体中的嵌合状态测试的潜力，并且体外频率非常类似。
实施例6-样品基因分型
设计PCR引物以定位在组中每种CND标记的缺失区域的内部(即，内部PCR)和侧翼(即，外部PCR)。选择大小范围为58-74bp(平均65bp)的短扩增子用于内部PCR。具有纯合缺失(0拷贝PCR产物)基因型的样品不产生内部PCR产物。使用产生独特的PCR产物的外部PCR测定来进行纯合缺失(0拷贝PCR产物)基因型的验证。使用Sanger测序确认内部PCR扩增子和外部PCR扩增子的同一性。将未缺失等位基因的所有内部PCR扩增子序列作图到CND基因座内的预期区域，并且将缺失等位基因的外部PCR扩增子作图到CND基因座的侧翼区域。内部/外部PCR结果的组合区分了纯合缺失(0拷贝PCR产物)、杂合缺失(1拷贝PCR产物)和纯合未缺失(2拷贝PCR产物)基因型(例如参见图1)。
在三个独立的群体中观察到的纯合缺失(0拷贝PCR产物)CND频率的分布几乎是可重叠，并且表明平均来说，任何个体的10个组基因型含有4-5个纯合缺失(0拷贝PCR产物)CND(图2)。
实施例7-验证研究
在同种异体骨髓移植病例中，移植后监测用于预测治疗失败(如疾病复发)、移植物排斥和移植物抗宿主病(GVHD)。在这种情况下，嵌合状态分析对于预测患者结果和帮助临床医生建立适当的患者管理策略至关重要。
通过使用拷贝数缺失变异标记和液滴数字PCR(ddPCR)，已经建立了简单、有效的嵌合状态分析来监测骨髓移植病例中的植入。该方法已经成功监测涉及4个个体(三个密切相关)的非常复杂的骨髓移植病例中的植入(见实施例9)。
灵敏度评估
对来自所述组的3种随机选择的CNV标记进行灵敏度分析。将来自对各CNV标记显示未杂合缺失的个体的基因组DNA加标至来自已知对此标记为纯合缺失的个体的DNA中，以产生跨越100％至0.049％的分数范围的加标系列。由于0.049％嵌合分数以下的少量DNA，使用系列稀释产生从0.049％降低至0.0061％的嵌合分数。
在整个分数范围，使用每孔100ng基因组DNA的标准输入如所述对加标的样品一式三份地进行ddPCR。测定每种CNV测定的线性模型。通过计算每个稀释度下每种CNV标记的一式三份测量的变异系数(CV)来测量测定内变异。通过在每个稀释步骤计算所有三种CNV标记的CV来测量测定间变异。检测限定义为所有重复均测出信息性CNV标记的最低嵌合分数。
还使用来自高信息性的不相关的BMT供体-接受者对的纵向嵌合状态分析数据在实践中评估测定间变异。由每个时间点供体和接受者的所有信息性标记计算标准偏差和CV。
所有三种CNV标记检测低至0.006％的嵌合状态。将检测下限测定为0.012％。在整个动态范围(0％至100％)内，所有三种CNV标记的表现为线性(r>0.99，p<0.001)(图3)。对于从100％下降到0.1％的嵌合分数，每种标记的重复内的CV(测定内变异)的范围为4.6％-14.6％(图4)。在0.1％至0.01％嵌合状态之间，CV的范围为35-41％。对于从100％嵌合状态降低到0.09％嵌合状态，标记重复的平均值之间的CV(测定间变异)的范围为3.3％-15％。在此之下，测定间CV为5％-34％。
从加标系列获得的测定间CV结果与从供体具有5种信息性CNV标记并且接受者具有8种信息性CNV标记的纵向采样临床病例获得的那些结果相匹配(图5)。在整个3％-96％的嵌合分数内，测定间嵌合分数标准偏差的范围为0.003-0.03且CV的范围为2-11％。
再现性评估
使用Qubit荧光定量(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA,USA)对如所述提取的BMT后嵌合基因组DNA样品进行定量并稀释至约7.5ng/uL。如所述使用ddPCR针对该样品运行十六种CNV标记。在第1、2、5、6、7和8天对同一样品重复实验。第8天，在早晨(第8a天)和下午(第8b天)重复实验。使用反应中每种CNV标记的浓度来计算每种标记随时间的重现性CV。另外，在每个时间点进行CNV嵌合状态分析，并在整个时间点内将所得嵌合分数进行比较。
在七次情形下使用十六种CNV标记对同一个嵌合样品进行重复分析，产生了一致的结果，除了一个以外其他的标记表现出3.3-5％的CV。在一种标记(CNV09B)中，变异系数因一次运行中的异常值升高到9.9％。当将这些标记用于测定嵌合分数时，来自同一样品的嵌合状态在全部时间点内类似地一致，范围为0.024％-0.050％(标准偏差0.013％)。
如下所述使用BioRad Qx200滴数字系统(Bio-red,Pleasanton,CA)进行ddPCR。来自各运行的ddPCR绝对定量原始数据示出在图6中。各CND测定的绝对测量结果在不同日间基本上重叠，其大部分CV范围为3.3-5.0％(例外是CND09；9.9％的相对较高的CV是由于星期五测定中的单个异常值测量导致的)。为了比较来自每日运行内和每日运行间的嵌合状态结果，将供体和接受者基因型进行比较以鉴定独特的多态性(信息性标记)。分别地分析信息性标记以评估接受者和供体DNA的总DNA拷贝(表2)。每个单个信息性CND多态性提供了用于计算嵌合状态结果的独立测量。因此，使用所有杂合缺失(1拷贝PCR产物)标记的平均值来表示样品中接受者和供体DNA的量。然后如下所述通过将接受者和供体DNA相加来计算总DNA量。
表2:
嵌合状态结果表示为供体和接受者的百分比谱(表4)。标准偏差表示为日间和日内运行结果的百分比(0.013％)。来自日内和日间的原始数据示出在表5中。信息性标记的日间变异结果示出在表6中。下面的标准偏差表明基于信息性CND多态性标记的嵌合状态分析是一致的并具有非常高的重现性。
表3：
准确度评估
使用来自4组患者的15个基因组DNA样品作为用于评估测定的比较样品。每组样品包括供体、接受者和时间过程混合的嵌合状态样品(见表4)。之前已经通过评估短串联重复序列(STR)在所有样品中测定了植入物状态。然而，在使用信息性CNV多态性评估嵌合状态之前，研究人员不知道植入物状态。比较通过STR和CNV评估的植入物状态。
表4：
| 患者 | 样品 | ng/ul以量子位计 |
| 患者1 | 接受者 | 7.62 |
| 患者1 | 供体 | 6.54 |
| 患者1 | 测试A | 6.69 |
| 患者1 | 测试B | 7.04 |
| 患者1 | 测试C | 6.49 |
| 患者2 | 接受者 | 6.9 |
| 患者2 | 供体 | 7.18 |
| 患者2 | 测试A | 6.73 |
| 患者2 | 测试B | 6.52 |
| 患者2 | 测试C | 6.26 |
| 患者2 | 测试D | 5.91 |
| 患者3 | 接受者 | 9.96 |
| 患者3 | 供体 | 6.69 |
| 患者3 | 测试A | 7.24 |
| 患者3 | 测试B | 6.89 |
| 患者3 | 测试C | 6.65 |
| 患者3 | 测试D | 7.17 |
| 患者3 | 测试E | 7.43 |
| 患者4 | 接受者 | 40.5 |
| 患者4 | 供体 | 39.6 |
| 患者4 | 测试A | 50.5 |
| 患者4 | 测试B | 40.9 |
| 患者4 | 测试C | 46.5 |
利用纯合对照(2拷贝PCR产物)，使用15种CND多态性标记筛选包括供体、接受者和嵌合状态样品的所有样品(图7-10)。如上所述分析每个样品的嵌合状态结果。CNV嵌合状态分析与之前的STR分析相关性良好(0.997)(图11)。强相关性表明CNV分析至少与STR分析一样准确。此外，相对于STR分析，CNV嵌合状态分析具有以下优点：
i)该测定可用于性别移植(gender transplant)，不限制于性别错配的HSCT；
ii)每种信息性CND标记提供了独立的嵌合状态测量；
iii)测定对于技术重复非常稳健，如通过固体测定性能和绝对DNA拷贝数定量所显示的；
iv)由于零本底和非常高的灵敏度，测定具有非常低的检测限；
v)可获得38种CND标记的大组，其可用于任何不同的供体-接受者骨髓移植对。
与基于FISH的方法的比较
从一名女性和一名男性获得全血样品。获得每个样品的白细胞计数。将样品离心并分离血沉棕黄层。将细胞在磷酸盐缓冲盐水中洗涤两次，然后在磷酸盐缓冲盐水中稀释至原始样品体积。然后将女性和男性样品混合以产生含有约100％、80％、60％、40％、20％和0％女性细胞的加标系列。
根据常规程序制备用于FISH的玻片，并且根据标准程序使用CytoCellAneuVysion X着丝粒(DXZ1)和Y着丝粒(DYZ3)探针同时进行分析。在每个嵌合分数下，由两名独立分析人员分析总共300个间期细胞(200个由分析员分析，且100个由检查员分析)。
如所描述的对加标系列进行CNV嵌合状态分析。将反应中每种CNV标记的浓度用于计算每个稀释步骤的CNV标记的CV。然后计算嵌合分数，并与通过FISH方法测量的结果进行比较。
使用四种独特的男性和女性信息性标记来通过CNV方法测定嵌合状态分数。在每个稀释步骤，全部标记之间的测定间CV小于8％。使用CNV方法测量的嵌合状态分数和通过性别错配FISH分析测定的嵌合状态分数之间具有强的线性相关性(r＝0.9957,95％CI0.9591-0.9995,p<0.001)(图12，左图)。
与基于SNP的方法的比较
基于Harries等(3)修改的方法，对来自四名单供体BMT的接受者的15个纵向收集的外周血样品进行临床指示的基于规定的SNP的rtPCR嵌合状态分析。对供体和移植前接受者血液样品进行基因分型。使用Coulter Ac-T diff Analyzer(Beckman Coulter,LaneCove,New South Wales,Australia)分离白细胞并计数，然后用PBS稀释至200uL中约5×106个白细胞的浓度。使用QIAamp DNA Blood Mini-Kit(QIAGEN,Hilden,Germany)根据生产商说明书进行DNA提取，并使用NanoDrop 2000(Thermo Scientific,Wilmington,USA)测量浓度以提供10ng/uL的工作溶液。
使用靶向TSC0955234、rs3918344和rs338773(3)的三个引物-探针组进行基于SNP的等位基因鉴别。使用来自移植前接受者和供体样品的基因分型来确认信息组合。每个样品和阳性对照(供体和接受者细胞的50:50混合物)一式三份地与阴性对照一起运行。每个反应物由5uL工作溶液DNA、10uL TaqMan Master Mix(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA,USA)、1uL引物/探针混合物和4uL蒸馏水组成。使用Corbett Rotorgene 3000(QIAGEN,Hilden,Germany)进行rtPCR，在95℃下运行10分钟，然后为92℃持续15秒和60℃持续60秒的40个循环。使用stock Rotor-Gene 6000系列软件进行阈值定义和分析。使用delta delta循环阈值方法进行嵌合状态定量。还使用CNV方法在相同的样品上进行设盲嵌合状态分析，并且比较嵌合分数。
通过SNP测定测得的嵌合状态分数的范围为10-95％(该测定的灵敏度极限)。独特供体和接受者信息性CNV的数目如下：移植对1(接受者3，供体2)，对2(接受者3，供体4)，对3(接受者1，供体2)和对4(接受者5，供体2)。使用CNV方法测量的嵌合状态分数与SNP测定结果线性相关(r＝0.997,95％CI 0.992-0.999,p<0.001)(图12，右图)。
信息性分析
回顾了在我们的机构进行过用于临床指征的CNV嵌合状态分析的32名接受者(和35个供体基因组)系列的基因分析结果。测定了在移植排列中测试的标记的数目和对于每个个体为信息性的标记的数目。计算满足三种信息性标记的目标的个体的数目。测试多供体移植排列的贡献和移植对之间的相关性以降低标记信息度。
至少有一种信息性标记在回顾的所有67个供体和接受者基因分型数据中被鉴定(图13)。52/67(78％)具有三种或更多种信息性标记。63/67(94％)具有两种或更多种信息性标记。在4/15(26％)具有少于3种信息性标记的病例中，由于需要加快结果，仅使用15-16种标记的组进行了不完全基因分型。供体和接受者之间获得少于三种信息性标记的可能性没有差异(OR 1.3,95％CI 0.36-5,p＝0.84)。11/67(16％)是多供体移植排列的一部分(即由于同时或先前的移植，嵌合状态研究必须区分接受者和超过一种可能的供体基因组)。在可获得相关性数据的51名个体中，18/51(35％)是相关的。在多供体移植排列(0.09(0.05-0.13)vs 0.18(0.13-0.23),p＝0.003)和相关对(0.10(0.06-0.16)vs0.2(0.13-0.28),p<0.001)中，测试的信息性CNV靶标的比例较低。尽管如此，如果是多供体移植排列的一部分(OR 3.7,95％CI 0.75-18.3,p＝0.10)或相关的(OR 3.5,95％CI 0.76-17.2,p＝0.08)，具有少于三种信息性标记的个体数目没有显著增加。
实施例8-相对于用于常规监测的当前方法，使用多态性“纯合缺失”拷贝数变异监测复杂骨髓移植中的植入和最小残留疾病被证明具有优势。
在HSCT之后，使用多态性“纯合缺失”(0拷贝PCR产物)拷贝数变异来区分患者中的四种不同基因组。患者是具有X连锁免疫缺陷病症(维斯科特-奥尔德里奇综合征)的18岁男性。患者最近接受了来自不相关男性供体的第二次骨髓移植，其在15年前接受过来自他的同样受影响的兄弟的移植(失败)，而他的兄弟自身接受过来自伯母的移植(即背驮式移植)。
在这种情况下，基于普遍存在的高度杂合的拷贝数缺失通过使用研究性嵌合状态测定研究监测植入。使用液滴数字PCR(ddPCR)评估DNA样品中的一组常见大拷贝数缺失(表1)。
可从兄弟、伯母和18岁男性接受者(移植前获得)获得血液样品。还从不相关男性供体和18岁男性接受者移植前#2(其潜在地由伯母、兄弟和他自身的DNA组成)采集血液样品。
从来自所有血液样品的细胞中分离基因组DNA。使用Bio-Rad QX200滴数字系统(Bio-red,Pleasanton,CA)使用表1中所示的一组38种CND对所有样品进行基因分析以鉴定“纯合缺失”(0拷贝PCR产物)、“杂合缺失”(1拷贝PCR产物)和“纯合未缺失”(2拷贝PCR产物)CND。CND引物序列示出在表7中。使用血管紧张素I转化酶(ACE；#NM_000789)内的非多态性靶序列作为纯合(2拷贝PCR产物)对照。
使用在线引物设计工具PrimerQuest(Integrated DNA Technologies)生成用于所有ddPCR测定的PCR引物和Zen双猝灭探针(DQP-ZEN和Iowa Black FQ猝灭剂)。每个引物对的特异性通过ddPCR或ViiA 7实时PCR系统(Applied Biosystems)上的高分辨率熔融曲线分析与凝胶电泳一起测试每个引物对的特异性。为了能够进行双重测定，利用荧光报告染料FAM或HEX或VIC来产生CND和ACE探针。鉴定伯母(三种杂合缺失(1拷贝PCR产物)CND)、兄弟(二种杂合缺失(1拷贝PCR产物)CND)和接受者(一种杂合缺失(1拷贝PCR产物)CND)的独特CND。将这些用于测定每一种在移植前#2样品中的比例分布。几乎所有DNA表现为来源于接受者(98.5％)；其余1.5％来源于伯母且没有一个是由兄弟贡献的。为了测量移植后样品中的植入，在供体DNA中鉴定了两种杂合缺失(1拷贝PCR产物)CND(图14B)，其在移植前#2DNA样品中是纯合缺失(0拷贝PCR产物)。在移植后180天的时期内在五次情况下对这些标记进行定量显示100％植入(图15)。图2突出了这种方法监测HSCT后随着时间推移患者自身骨髓的重建的能力。为了测量最小残留疾病，在移植#2 DNA样品中鉴定了在供体中纯合缺失(0拷贝PCR产物)的一种纯合缺失(0拷贝PCR产物)(CND1)和五种杂合缺失(1拷贝PCR产物)CND(CND 3、5、6、9和10；图14A)。这些标记在移植后样品中均不可检出(图14)。
这个例子说明了使用多态性CND监测任何同种异体骨髓移植中植入和残留疾病的可能性。尽管原来的背驮式供体和接受者之间具有密切的遗传关系，但是对于参与第二移植的后处理和监测所有四名个体鉴定了独特的CND标记。这需要筛选扩大组的38种CND以鉴定涉及最后和之前移植的四个个体中的每一个的独特标记。在典型的单供体情况下，从一组仅10种常见高杂合CND可能鉴定至少5种纯合缺失(0拷贝PCR产物)CND。预计这些CND中的一半是信息性的，即在供体中是杂合缺失(1拷贝PCR产物)或纯合缺失(0拷贝PCR产物)(表1)。
将CND方法与液滴数字PCR相结合提供了对低水平嵌合状态的高度灵敏的检测。相对于序列多态性如SNP、插入缺失或微卫星，使用多态性CND的一个独特优势是使用纯合缺失等位基因(0拷贝PCR产物)，其在理论和实践中都提供了零接受者本底，使得可以稳健地且以很高的灵敏度量化供体DNA。此外，使用多种CND给出了供体、接受者和总DNA水平的独立度量。因此，上述方法允许通过针对样品中的总DNA水平交叉检查来对供体和接受者DNA水平进行内部验证。
实施例9-脐带血污染
使用多态性“纯合缺失”(0拷贝PCR产物)拷贝数变体来评估脐带血样品中是否存在遗传上不同的细胞群体(母体和胎儿)。通过评估从母亲获得的血样中分离的基因组DNA，鉴定母亲独特的CND多态性(两种杂合缺失(0拷贝PCR产物)CND多态性；CND1B，CND3B；标记的*图16)。这些独特的CND多态性用于评估母亲对脐带血样品的比例贡献(如果有的话)。使用血管紧张素I转化酶内的非多态性靶序列作为纯合对照(2拷贝PCR产物)。在从脐带血样品中分离的基因组DNA中没有检测到独特的母体CND多态性CND1B和CND3B。该结果表明从脐带血样品中分离的所有DNA都来源于胎儿。鉴定胎儿中独特的CND多态性(杂合缺失；CND12)。在母亲和胎儿二者中，CND7B是纯合缺失(2拷贝PCR产物)并且CND9B是杂合缺失(1拷贝PCR产物)。CND15在母亲中是纯合缺失(0拷贝PCR产物)，并且在胎儿中是杂合缺失(1拷贝PCR产物)(图16)。
这个实例例证了使用多态性CND鉴定脐带血样品的污染的可能性。尽管母亲和胎儿具有密切的遗传关系，但是鉴定了两名个体的独特的CND标记。
实施例10-材料和方法
样品处理和DNA提取
通常在EDTA存在下通过静脉穿刺采集血液样品，并在采血后4-6小时内进行处理。将血液样品在4℃在15mL falcon管中以1600g离心10分钟以从血浆中分离血细胞。根据制造商的说明书使用Chemagic DNA Blood Kit(CMG-1074；Perkin Elmer,Waltham,MA)提取DNA。
基因分型样品
可通过使用表7所示的引物评估表1中所示的一组38种，来对样品进行基因分型以鉴定纯合缺失(0拷贝PCR产物)、杂合缺失(1拷贝PCR产物)或纯合未缺失(2拷贝PCR产物)CND。可以使用数字PCR(ddPCR)系统(例如Bio-Rad QX200液滴数字系统(Bio-red,Pleasanton,CA))或实时PCR来进行基因分析测定。血管紧张素I转化酶(ACE)内的非多态性靶序列可以用作纯合对照(2拷贝PCR产物)。表7中还示出了ACE引物序列。
或者，可以使用在线引物设计工具PrimerQuest(Integrated DNA Technologies)生成用于所有ddPCR测定的PCR引物和Zen双猝灭探针(DQP-ZEN和Iowa Black FQ猝灭剂)。通过在ViiA 7实时PCR系统(Applied Biosystems)上的高分辨率熔融曲线分析和凝胶电泳二者测试用于表1所示相关拷贝数变化的表7所示每个引物对的特异性。为了能够进行双重测定，可以使用荧光报告染料FAM或HEX来产生CND和ACE探针。
ddPCR
可根据制造商的说明书进行ddPCR测定。简单来说，配制25ul ddPCR反应混合物，其包含2×Droplet PCR Supermix(目录号1863024)、引物(900nM)、探针(250nM)和2.5ulDNA模板。然后将20ul ddPCR混合物和70ul液滴发生器油(目录号1863004)装载到Bio-RadDG8柱(目录号1864008)中，并将放置的柱放置在Bio-Rad QX200液滴发生器中。将液滴制备物转移到Eppendrof Twin Tec PCR半-有缘的96孔板(目录号Epp0030128.605)中，将其使用Bio-Rad PX1 PCR板密封剂热封，然后放入Bio-Rad C1000TM热循环仪(Bio-Rad C1000TMThermal Cycler)中用于PCR。每个ddPCR运行均包括无模板对照PCR后，通过Bio-RadQX200液滴读板仪(Bio-Rad QX200 Droplet Reader)读取平板。
使用Bio-Rad QuantaSoft软件分析ddPCR数据。可以使用无模板对照液滴幅度水平来应用幅度阈值以区分正负液滴。使用Lo等.Am J HumGenet.62:7681998描述的公式将绝对浓度数据(拷贝/μl)转换成GE/mL。
CND ddPCR测定开发
基于表1中所示的38种拷贝数缺失标记的组，利用Zenprobes(IDT)开发用于HSCT移植接受者样品的ddPCR测定。引物序列示出在表7中。每个ddPCR测定使用拷贝数缺失-特异性内部PCR引物和靶标特异性Zen探针(表7)。用FAM或HEX荧光报告子标记CND测定。在10μL的反应体积中一式两份地进行定量PCR，并在ViiA 7实时PCR系统(Applied Biosystems,Melbourne,Australia)上进行反应。使用ViiA 7软件1.2版(Applied Biosystems)进行数据分析。定量周期(Cq)基于扩增曲线和经验调整的阈值之间的交点。在所有38个CND qPCR测定中，将PCR效率归一化；所有测定的斜率为-3.3至-3.6(平均值-3.4)。
例如，对于1000GE标准曲线点，DNA输入体积为2.5μl，因此输入DNA的浓度为反应体积中DNA的终浓度为100GE/μl(总共1000GE)。Cq基于扩增曲线和经验调整的阈值之间的交点。
引物和探针的设计
开发一组38种CNV缺失(CND)标记和血管紧张素I转化酶(ACE)对照用于DDPCR测定。血管紧张素I转化酶(ACE)以每个二倍体人类基因组DNA中2拷贝存在，并因此可以用作对照以测量总的分离的基因组DNA的水平。使用Integrated DNA Technologies的在线引物设计工具PrimerQuest生成用于所有ddPCR测定的PCR引物和Zen双猝灭探针(DQP-ZEN和Iowa Black FQ猝灭剂)(IDT Zen探针已经显示能够提高5'核酸酶qPCR实验的精确度和可靠性)。通过在ViiA 7实时PCR系统(Applied Biosystems)上的高分辨率熔融曲线分析和凝胶电泳二者测试每个引物对的特异性。为了能够在一个ddPCR反应中进行双重ddPCR测定，利用荧光报告染料FAM或HEX随机产生CND标记和ACE。38种CND的组和ACE对照的序列详情如下表7所示。
序列表
<110> Murdoch Childrens Research Institute
<120> 测量嵌合状态的方法
<130> 522589
<160> 78
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 1
agcctcaatt caggaccta 19
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 2
ctccttggag agcttgttat c 21
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 3
tgtcatgtgc aatagagact gtt 23
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 4
ttctggccag ggcaattc 18
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 5
actggcttcc aaatgtgact aa 22
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 6
taacctgcag ctctggga 18
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 7
actgacacac tcaagctatg g 21
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 8
agcataaatc tctgctccct tt 22
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 9
agcaaatgat gatgttgtat gagc 24
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 10
taaatgccag caccctgcta 20
<210> 11
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 11
gccatgcctc ccacatt 17
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 12
tggccctaac agtttggata tg 22
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 13
tcacaggtcc taccagcttt a 21
<210> 14
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 14
gacgaaagat gtcttaattt ggttcag 27
<210> 15
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 15
ccagcgtctt ctcttatgtc ag 22
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 16
acaagccaac aacgtacagg 20
<210> 17
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 17
tttggtgact gatacatggc t 21
<210> 18
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 18
cctagctact attccctcta gaaca 25
<210> 19
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 19
atatcctctg gatttgacag tg 22
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 20
atgttgagag cattggactt 20
<210> 21
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 21
ttccaaagac acaaggcagt a 21
<210> 22
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 22
ggacattcct gatgggagaa a 21
<210> 23
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 23
ccaagtatga tgttatttgt ggga 24
<210> 24
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 24
cacaagtaga ttcagattag aaggg 25
<210> 25
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 25
catattgaga tccagaaaca acctt 25
<210> 26
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 26
agaaataaac tgaggcctgg ata 23
<210> 27
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 27
ccttactgac actctctgtt tctt 24
<210> 28
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 28
gagcacccag taggaataga attag 25
<210> 29
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 29
cagggagaga gtgtagaaag aatag 25
<210> 30
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 30
gcctgatctc taaacactgg ag 22
<210> 31
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 31
acactccaat tccaactcta cc 22
<210> 32
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 32
gagaaatcag aggcccaaag a 21
<210> 33
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 33
gcctgtgcct acctgtttaa ta 22
<210> 34
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 34
aaatccacag ccagtacctt c 21
<210> 35
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 35
gagaaatcca tcttcaggtc ag 22
<210> 36
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 36
aaagaccctt cacactttgt t 21
<210> 37
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 37
tacaccagtg gaaggactat 20
<210> 38
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 38
ccctactaat gacatccaga ataa 24
<210> 39
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 39
gaggaatgag agacaacact tc 22
<210> 40
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 40
ccttctgtag cctcttccta 20
<210> 41
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 41
ggcagcaata atcacctctg a 21
<210> 42
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 42
caatctgata agctttctag ggtagt 26
<210> 43
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 43
ttcttccctt tccagactca 20
<210> 44
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 44
gaaagccaga gaatgagaga g 21
<210> 45
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 45
ctagaacctt ccatccttaa tgt 23
<210> 46
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 46
gctcctacat ggctacaaag 20
<210> 47
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 47
gctttgttgg gagagttaga 20
<210> 48
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 48
caattcattg agaagtgcca a 21
<210> 49
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 49
aaagcagctc aacctcttaa t 21
<210> 50
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 50
tgaaagattc ctgagttatt agcc 24
<210> 51
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 51
ccgactttct acttattcca ca 22
<210> 52
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 52
gctgtataaa ccctccacag 20
<210> 53
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 53
cccaaactcc tctcatcttt c 21
<210> 54
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 54
aaggctgatt agccgtaatg 20
<210> 55
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 55
aaagtcaact tctctgtgcg a 21
<210> 56
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 56
ttattcttcc accattatcc ctcat 25
<210> 57
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 57
tgtcgtttct aaggatggga aag 23
<210> 58
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 58
gtttcatgaa gctgcctctc t 21
<210> 59
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 59
atgcctggct tcatgttact 20
<210> 60
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 60
aattactgac ctagaccttt caaga 25
<210> 61
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 61
gtgtggacat tggttccttt 20
<210> 62
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 62
ttagggcaaa caagatgaga aa 22
<210> 63
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 63
tttcttccag cagagctcac 20
<210> 64
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 64
gccagccctg gatgaat 17
<210> 65
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 65
tcactcttcc caccctctta t 21
<210> 66
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 66
catctcaaga aagagggctc aa 22
<210> 67
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 67
cccaactcaa tttcaagctg 20
<210> 68
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 68
ccaaagatcc aattagcaca tc 22
<210> 69
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 69
acctatcaac ttggttaccc taaa 24
<210> 70
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 70
tttgtgtggg aatctttatc tgtg 24
<210> 71
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 71
tgtcccaatg cacagactt 19
<210> 72
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 72
aaacagggtg ggcctaaa 18
<210> 73
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 73
ctttcggttc tctccaacca 20
<210> 74
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 74
aacaacttcc ctgagacgtg 20
<210> 75
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 75
cacaccaaat tgttaagagt tacc 24
<210> 76
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 76
gtcctggtaa caaatccagt taata 25
<210> 77
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 77
ggtctttagt gggcgtacc 19
<210> 78
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 78
tcctctcacc gaagatacca 20
Claims (51)
1.一种测量获自包含两种或更多种遗传上不同的细胞群体的受试者的生物样品中的嵌合状态的方法，所述方法包括：
基于拷贝数变异(CNV)多态性测定分离自第一遗传上不同的细胞群体的样品中基因组DNA的水平，所述拷贝数变异(CNV)多态性是所述第一遗传上不同的细胞群体的信息性标记，
其中来自所述遗传上不同的细胞群体的分离的基因组DNA的水平提供了对所述样品中嵌合状态的度量。
2.如权利要求1所述的方法，其还包括基于CNV多态性测定分离自第二遗传上不同的细胞群体的样品中基因组DNA的水平，所述CNV多态性是所述第二遗传上不同的细胞群体的信息性标记，其中分离的基因组DNA的水平提供了对所述样品中嵌合状态的度量。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中遗传上不同的细胞群体的信息性标记包括：
-在分离自第一细胞群体的基因组DNA中是纯合缺失并且在分离自第二细胞群体的基因组DNA中是纯合未缺失的CNV多态性；以及，
-在分离自第二细胞群体的基因组DNA中是纯合缺失并且在分离自第一细胞群体的基因组DNA中是纯合未缺失的CNV多态性。
4.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其还包括通过测定所述样品中的总分离的基因组DNA来验证分离自遗传上不同的细胞群体的DNA的水平，
其中分离自所述遗传上不同的细胞群体的基因组DNA的水平等于总DNA的水平表明验证了分离的基因组DNA的水平。
5.如权利要求4所述的方法，其中所述嵌合状态的度量表示为所述样品中总细胞群体中遗传上不同的细胞的百分比。
6.如权利要求4所述的方法，其中所述嵌合状态的度量表示为所述样品中遗传上不同的细胞的比率(第一细胞群体:第二细胞群体)。
7.如权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述CNV多态性是拷贝数缺失(CND)多态性。
8.如权利要求7所述的方法，其中遗传上不同的细胞群体的信息性标记包括：
-在分离自所述第一细胞群体的基因组DNA中是纯合缺失并且在分离自第二细胞群体的基因组DNA中是杂合或纯合未缺失的CND多态性；和/或，
-在分离自第二细胞群体的基因组DNA中是纯合缺失并且在分离自所述第一细胞群体的基因组DNA中是杂合或纯合未缺失的CND多态性。
9.如权利要求7所述的方法，其中遗传上不同的细胞群体的信息性标记包括：
-在分离自所述第一细胞群体的基因组DNA中是纯合缺失并且在分离自第二细胞群体的基因组DNA中是杂合或纯合未缺失的至少两种CND多态性；和/或，
-在分离自所述第二细胞群体的基因组DNA中是纯合缺失并且在分离自所述第一细胞群体的基因组DNA中是杂合或纯合未缺失的至少两种CND多态性。
10.如权利要求7所述的方法，其中遗传上不同的细胞群体的信息性标记包括：
-在分离自所述第一细胞群体的基因组DNA中是纯合缺失并且在分离自第二细胞群体的基因组DNA中是杂合或纯合未缺失的至少三种CND多态性；和/或，
-在分离自所述第二细胞群体的基因组DNA中是纯合缺失并且在分离自所述第一细胞群体的基因组DNA中是杂合或纯合未缺失的至少三种CND多态性。
11.如权利要求7所述的方法，其中所述遗传上不同的细胞群体的信息性标记包括至少5、或至少6、或至少7、或至少10、或至少20、或至少30或至少38种CND。
12.如权利要求7所述的方法，其中所述遗传上不同的细胞群体的信息性标记包括：
-在分离自所述第一细胞群体的基因组DNA中是纯合缺失并且在分离自第二细胞群体的基因组DNA中是杂合或纯合未缺失的至少4、至少5、至少6种CND多态性；和/或
-在分离自第二细胞群体的基因组DNA中是纯合缺失并且在分离自所述第一细胞群体的基因组DNA中是杂合或纯合未缺失的至少4、至少5、至少6种CND多态性。
13.如权利要求1至12中任一项所述的方法，其中测定分离自所述遗传上不同的细胞群体的基因组DNA的水平包括使用引物对所述DNA进行扩增反应，所述引物靶向为所述遗传上不同的细胞群体的信息性标记的CNV多态性。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述引物靶向所述一种或多种信息性CNV的内部区域。
15.如权利要求13所述的方法，其中使用选自表7的引物对所述CNV多态性进行扩增。
16.如权利要求1至15中任一项所述的方法，其中所述CNV多态性选自表1中所列的CND多态性。
17.如权利要求1至16中任一项所述的方法，其中通过使用NGS、NanoString技术、液滴数字PCR、定量RT-PCR评估所述CNV多态性来测定分离自所述遗传上不同的细胞群体的基因组DNA的水平，所述CNV多态性是所述遗传上不同的细胞群体的信息性标记。
18.如权利要求1至17中任一项所述的方法，其中已经处理所述生物样品以从所述样品中基本上除去循环的无细胞DNA。
19.如权利要求1至18中任一项所述的方法，其中所述生物样品是血液样品。
20.如权利要求1至18中任一项所述的方法，其中所述生物样品是外周血单核细胞。
21.如权利要求1至18中任一项所述的方法，其中所述生物样品是纯化的免疫细胞群体或纯化的免疫细胞的混合物。
22.如权利要求21所述的方法，其中所述免疫细胞是白细胞。
23.如权利要求1至18中任一项所述的方法，其中所述生物样品是纯化的T细胞、B细胞、粒细胞或其混合物的群体。
24.如权利要求1至18中任一项所述的方法，其中纯化获自所述受试者的所述生物样品以提供至少两种细胞群体，并且在每种细胞群体中测量嵌合状态。
25.如权利要求25所述的方法，其中所述两种细胞群体包含B细胞和粒细胞。
26.如权利要求1至18中任一项所述的方法，其中纯化获自所述受试者的所述生物样品以提供至少三种细胞群体，并且在每种细胞群体中测量嵌合状态。
27.如权利要求27所述的方法，其中所述三种细胞群体包含B细胞、粒细胞和T细胞。
28.如权利要求1至28中任一项所述的方法，其中所述遗传上不同的细胞群体包含自身细胞(第一细胞群体)和非自身细胞(第二细胞群体)。
29.如权利要求1至29中任一项所述的方法，其中所述受试者是造血干细胞移植(HSCT)接受者。
30.如权利要求1至30中任一项所述的方法，其用于测定HSCT接受者中的植入水平。
31.如权利要求31所述的方法，其中非自身细胞的水平大于约90％指示移植物的植入。
32.如权利要求1至30中任一项所述的方法，其用于监测HSCT移植后造血干细胞移植(HSCT)接受者自身骨髓的重建。
33.如权利要求33所述的方法，其中自身细胞水平大于约10％指示所述HSCT接受者骨髓的重建。
34.如权利要求1至34中任一项所述的方法，其中每天、每周、每月、每两个月或每三个月进行所述方法。
35.如权利要求35所述的方法，其中自身细胞水平的升高和/或非自身细胞水平的降低指示所述HSCT接受者骨髓的重建。
36.如权利要求35或36所述的方法，其中所述自身细胞水平的升高和/或所述非自身细胞水平的降低指示应向所述HSCT接受者施用免疫抑制疗法或应修改所述HSCT接受者的免疫抑制疗法。
37.如权利要求1至30中任一项所述的方法，其用于监测有需要的患者中的最小残留疾病。
38.如权利要求31或33所述的方法，其中所述HSCT接受者接受HSCT以治疗血液病症。
39.如权利要求39所述的方法，其中所述血液病症是血液恶性肿瘤。
40.如权利要求40所述的方法，其中所述血液恶性肿瘤是白血病。
41.如权利要求39至41中任一项所述的方法，其中自身细胞水平大于约1％指示所述HSCT接受者的血液病症的复发。
42.如权利要求39至42中任一项所述的方法，其中所述自身细胞水平的升高和/或非自身细胞水平的降低指示所述HSCT接受者的血液病症的复发。
43.如权利要求39至43中任一项所述的方法，其中自身细胞水平的升高和/或非自身细胞水平的降低指示应向所述HSCT接受者施用用于所述血液病症的治疗或应修饰所述HSCT接受者的治疗。
44.如权利要求1至19中任一项所述的方法，其中所述遗传上不同的细胞群体包含胎儿细胞(第一细胞群体)和母体细胞(第二细胞群体)。
45.如权利要求1至19中任一项所述的方法，其中所述生物样品是脐带血。
46.如权利要求1至19或45至46中任一项所述的方法，其用于鉴定脐带血样品的母体污染。
47.如权利要求47所述的方法，其中嵌合状态的比率(胎儿细胞:母体细胞)大于约1:100、约1:50、约1:20、约1:10、约3:20指示所述脐带血样品不适合用于造血干细胞移植。
48.包含选自表7中所列引物的引物的试剂盒，其用于如权利要求1至48中任一项所述的方法。
49.一种测量HSCT移植接受者中的HSCT植入的方法，所述方法包括：基于拷贝数变异(CNV)多态性测定获自所述HSCT接受者的生物样品中自身细胞和非自身细胞的水平，所述拷贝数变异(CNV)多态性是所述自身细胞和非自身细胞的信息性标记，
其中所述信息性标记包括：
-在分离自自身细胞的基因组DNA中是纯合缺失并且在分离自非自身细胞的基因组DNA中是杂合或纯合未缺失的CND多态性；以及
-在分离自非自身细胞的基因组DNA中是纯合缺失并且在分离自自身细胞的基因组DNA中是杂合或纯合未缺失的CND多态性；
其中非自身细胞水平大于约90％的指示所述HSCT接受者骨髓的植入。
50.一种测量HSCT接受者中的最小残留疾病的方法，所述方法包括：基于拷贝数变异(CNV)多态性测定获自所述HSCT接受者的生物样品中自身细胞和非自身细胞的水平，所述拷贝数变异(CNV)多态性是所述自身细胞和非自身细胞的信息性标记，
其中所述信息性标记包括：
-在分离自自身细胞的基因组DNA中是纯合缺失并且在分离自非自身细胞的基因组DNA中是杂合或纯合未缺失的CND多态性；以及
-在分离自非自身细胞的基因组DNA中是纯合缺失并且在分离自自身细胞的基因组DNA中是杂合或纯合未缺失的CND多态性；
其中自身细胞水平大于约1％指示所述HSCT接受者骨髓的重建。
51.一种测量脐带血样品中的母体污染的方法，其包括：基于拷贝数变异(CNV)多态性测定所述脐带血样品中自身细胞和非自身细胞的水平，所述拷贝数变异(CNV)多态性是所述自身细胞和非自身细胞的信息性标记，
其中所述信息性标记包括：
-在分离自自身细胞的基因组DNA中是纯合缺失并且在分离自非自身细胞的基因组DNA中是杂合或纯合未缺失的CND多态性；以及
-在分离自非自身细胞的基因组DNA中是纯合缺失并且在分离自自身细胞的基因组DNA中是杂合或纯合未缺失的CND多态性；
其中胎儿细胞:母体细胞的比率大于约1:100、约1:50、约1:20、约1:10、约3:20指示所述脐带血样品不适合用于造血干细胞移植。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| AU2015902274 | 2015-06-15 | ||
| AU2015902274A AU2015902274A0 (en) | 2015-06-15 | A method of measuring chimerism | |
| PCT/AU2016/050499 WO2016201507A1 (en) | 2015-06-15 | 2016-06-15 | Method of measuring chimerism |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN107960107A true CN107960107A (zh) | 2018-04-24 |
Family
ID=57544605
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201680035111.3A Pending CN107960107A (zh) | 2015-06-15 | 2016-06-15 | 测量嵌合状态的方法 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (4) | US20180327820A1 (zh) |
| EP (1) | EP3307912B1 (zh) |
| JP (1) | JP2018517421A (zh) |
| CN (1) | CN107960107A (zh) |
| AU (1) | AU2016281193B2 (zh) |
| IL (1) | IL256088A (zh) |
| WO (1) | WO2016201507A1 (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111041106A (zh) * | 2019-12-30 | 2020-04-21 | 江苏艾尔康生物医药科技有限公司 | 一种基于荧光定量pcr技术区分人源dna的方法 |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113265474B (zh) * | 2021-07-19 | 2021-11-02 | 深圳荻硕贝肯精准医学有限公司 | 数字pcr嵌合率的检测引物组、探针组及其应用 |
Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2009039589A1 (en) * | 2007-09-28 | 2009-04-02 | Murdoch Childrens Research Institute | Cell detection, monitoring and isolation method |
| CN101509040A (zh) * | 2009-03-19 | 2009-08-19 | 上海市血液中心 | 造血干细胞移植后嵌合状态分析试剂盒及其应用 |
| CN101575643A (zh) * | 2009-05-31 | 2009-11-11 | 中国人民解放军第二军医大学 | 一种检测异基因造血干细胞移植后供受嵌合率的方法 |
| CN102409088A (zh) * | 2011-09-22 | 2012-04-11 | 郭奇伟 | 一种基因拷贝数变异的检测方法 |
| WO2013049892A1 (en) * | 2011-10-07 | 2013-04-11 | Murdoch Childrens Research Institute | Diagnostic assay for tissue transplantation status |
| CN103069006A (zh) * | 2010-07-23 | 2013-04-24 | 艾索特里克斯遗传实验室有限责任公司 | 区别表达的胚胎或母源基因组区的鉴定及其用途 |
| CN103374518A (zh) * | 2012-04-12 | 2013-10-30 | 维里纳塔健康公司 | 拷贝数变异的检测和分类 |
| WO2015042649A1 (en) * | 2013-09-27 | 2015-04-02 | Murdoch Children's Research Institute | A quantitative assay for target dna in a mixed sample comprising target and non-target dna |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2007105037A (ja) * | 2005-09-16 | 2007-04-26 | Univ Of Tokyo | キメリズムを利用した幹細胞移植のための検査 |
| AU2010243276B2 (en) * | 2009-04-30 | 2016-09-15 | Fondazione Telethon Ets | Gene vector |
| PL2697392T3 (pl) * | 2011-04-12 | 2016-08-31 | Verinata Health Inc | Rozdzielanie frakcji genomowych z wykorzystaniem liczby polimorfizmów |
-
2016
- 2016-06-15 WO PCT/AU2016/050499 patent/WO2016201507A1/en active Application Filing
- 2016-06-15 US US15/737,230 patent/US20180327820A1/en not_active Abandoned
- 2016-06-15 EP EP16810619.3A patent/EP3307912B1/en active Active
- 2016-06-15 JP JP2017565309A patent/JP2018517421A/ja active Pending
- 2016-06-15 CN CN201680035111.3A patent/CN107960107A/zh active Pending
- 2016-06-15 AU AU2016281193A patent/AU2016281193B2/en active Active
-
2017
- 2017-12-04 IL IL256088A patent/IL256088A/en unknown
-
2020
- 2020-02-13 US US16/790,510 patent/US20200239942A1/en not_active Abandoned
-
2021
- 2021-11-30 US US17/538,876 patent/US20220098650A1/en not_active Abandoned
-
2024
- 2024-03-22 US US18/614,496 patent/US20240271188A1/en active Pending
Patent Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2009039589A1 (en) * | 2007-09-28 | 2009-04-02 | Murdoch Childrens Research Institute | Cell detection, monitoring and isolation method |
| CN101509040A (zh) * | 2009-03-19 | 2009-08-19 | 上海市血液中心 | 造血干细胞移植后嵌合状态分析试剂盒及其应用 |
| CN101575643A (zh) * | 2009-05-31 | 2009-11-11 | 中国人民解放军第二军医大学 | 一种检测异基因造血干细胞移植后供受嵌合率的方法 |
| CN103069006A (zh) * | 2010-07-23 | 2013-04-24 | 艾索特里克斯遗传实验室有限责任公司 | 区别表达的胚胎或母源基因组区的鉴定及其用途 |
| CN102409088A (zh) * | 2011-09-22 | 2012-04-11 | 郭奇伟 | 一种基因拷贝数变异的检测方法 |
| WO2013049892A1 (en) * | 2011-10-07 | 2013-04-11 | Murdoch Childrens Research Institute | Diagnostic assay for tissue transplantation status |
| CN103374518A (zh) * | 2012-04-12 | 2013-10-30 | 维里纳塔健康公司 | 拷贝数变异的检测和分类 |
| WO2015042649A1 (en) * | 2013-09-27 | 2015-04-02 | Murdoch Children's Research Institute | A quantitative assay for target dna in a mixed sample comprising target and non-target dna |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| DAMIEN L BRUNO等: "Use of copy number deletion polymorphisms to assess DNA chimerism", 《CLIN CHEM》 * |
| DAVID GEORGE等: "Detection and quantification of chimerism by droplet digital PCR", 《CHIMERISM》 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111041106A (zh) * | 2019-12-30 | 2020-04-21 | 江苏艾尔康生物医药科技有限公司 | 一种基于荧光定量pcr技术区分人源dna的方法 |
| CN111041106B (zh) * | 2019-12-30 | 2023-10-27 | 江苏艾尔康生物医药科技有限公司 | 一种基于荧光定量pcr技术区分人源dna的方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU2016281193A1 (en) | 2017-12-07 |
| US20200239942A1 (en) | 2020-07-30 |
| EP3307912A4 (en) | 2018-12-12 |
| IL256088A (en) | 2018-02-28 |
| US20240271188A1 (en) | 2024-08-15 |
| EP3307912A1 (en) | 2018-04-18 |
| AU2016281193B2 (en) | 2022-06-16 |
| US20180327820A1 (en) | 2018-11-15 |
| EP3307912B1 (en) | 2021-09-15 |
| WO2016201507A1 (en) | 2016-12-22 |
| JP2018517421A (ja) | 2018-07-05 |
| US20220098650A1 (en) | 2022-03-31 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Poon et al. | Tissue adaptation and clonal segregation of human memory T cells in barrier sites | |
| Toffalori et al. | Immune signature drives leukemia escape and relapse after hematopoietic cell transplantation | |
| US11519031B2 (en) | Non-invasive prenatal diagnosis of fetal genetic condition using cellular DNA and cell free DNA | |
| Van Heijst et al. | Quantitative assessment of T cell repertoire recovery after hematopoietic stem cell transplantation | |
| Canté-Barrett et al. | Loss of CD44dim expression from early progenitor cells marks T-cell lineage commitment in the human thymus | |
| CN109661475A (zh) | 多重优化错配扩增(moma)靶标数目 | |
| CN105189748A (zh) | 测序免疫组库的方法 | |
| CN111164700B (zh) | 使用下一代测序的免疫-肿瘤学应用 | |
| US20200131564A1 (en) | High-coverage and ultra-accurate immune repertoire sequencing using molecular identifiers | |
| Finning et al. | Evaluation of red blood cell and platelet antigen genotyping platforms (ID CORE XT/ID HPA XT) in routine clinical practice | |
| US20240271188A1 (en) | Method of measuring chimerism | |
| Mariani et al. | Comprehensive assessment of the TCRBV repertoire in small T-cell samples by means of an improved and convenient multiplex PCR method | |
| Chitgopeker et al. | T-cell receptor gene rearrangement detection in suspected cases of cutaneous T-cell lymphoma | |
| Cusick et al. | Performance characteristics of chimerism testing by next generation sequencing | |
| CN103923981B (zh) | Hla-b*27等位基因检测方法及其试剂盒 | |
| KR20210071983A (ko) | 임산부로부터 분리된 순환 페탈 세포가 현재 또는 과거의 임신의 것인지 확인하는 방법 | |
| CN114424291A (zh) | 免疫组库健康评估系统和方法 | |
| US20180051334A1 (en) | Method for Studying V(D)J Combinatory Diversity | |
| Martello et al. | Identification of a maturation plasma cell index through a highly sensitive droplet digital PCR assay gene expression signature validation in newly diagnosed multiple myeloma patients | |
| Ma | Rapid and Direct Enumeration of Hematopoietic Stem Cells in Unenriched Cell Populations | |
| Blake | Finding Signals in the Noise: Elucidating the Many Sources of Heterogeneity in Breast Cancer Metastasis Using Single-Cell ‘Omics | |
| Louie et al. | CAR+ and CAR-T cells differentiate into an NK-like subset that is associated with increased inflammatory cytokines following infusion | |
| CN106749603B (zh) | Foxc1基因h446hg突变体及其应用 | |
| Osterstock et al. | Assessing familial aggregation of paratuberculosis in beef cattle of unknown pedigree | |
| Osman et al. | Importance of extended blood group genotyping in multiply transfused patients |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20180424 |
|
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |