CN107921147B

CN107921147B - 一种新的前体miRNA及其在肿瘤治疗中的应用

Info

Publication number: CN107921147B
Application number: CN201680026015.2A
Authority: CN
Inventors: 张辰宇; 曾科; 陈熹; 张峻峰; 梁宏伟
Original assignee: Jiangsu Micromedmark Biotech Co Ltd
Current assignee: Jiangsu Micromedmark Biotech Co Ltd
Priority date: 2015-05-05
Filing date: 2016-05-05
Publication date: 2021-12-24
Anticipated expiration: 2036-05-05
Also published as: US10533173B2; WO2016177343A1; CN107921147A; US20180223277A1

Abstract

提供一种新的前体miRNA及其在肿瘤治疗中的应用，其中前体miRNA其5’至3’端具有式I所示的结构：B1为待表达的anti‑miRNA和/或siRNA；B2为与B1基本互补或完全互补的序列，且B2与C不互补；C为茎环结构序列；A1和A2各自独立地为无，或任选的由4‑5个碱基组成的RNA序列；其中，所示的前体miRNA能在宿主中加工形成anti‑miRNA和/或siRNA。

Description

一种新的前体miRNA及其在肿瘤治疗中的应用

技术领域

本发明涉及肿瘤治疗领域，具体地，涉及一种新的前体miRNA，以及该前体miRNA用于抑制肿瘤生长中的方法及应用。

背景技术

microRNA来源于长度约1000bp的长链RNA初始转录产物(Pri-miRNA)，Pri-miRNA分子在细胞核中经Drosha酶剪切形成长度约60-80nt的具有茎环结构的miRNA前体。前体miRNA转运至胞质后，被进一步切割成长约18-26nt的双链miRNA。双链miRNA解开后，成熟的miRNA进入RNA诱导基因沉默复合物(RNA-induced silencing complex，RISC)，与互补mRNA完全或不完全配对，降解靶mRNA或阻遏其表达。

尽管microRNA在细胞总RNA中所占的比重很小，但由于miRNA参与生命过程中一系列的重要进程，包括早期胚胎发育、细胞增殖和细胞死亡、细胞凋亡与脂肪代谢、细胞分化以及在基因表达调控中的作用。而细胞增殖及凋亡等常在肿瘤中发生异常，因此推测miRNA的异常缺失、突变或过表达将导致人类疾病的发生。

近来，越来越多证据显示miRNA在抑制肿瘤生长、繁殖、分化中扮演者及其重要的角色。本领域迫切需要了解在肿瘤治疗领域，各种不同miRNA的作用，以开发新的肿瘤治疗药物。

RNA干涉(RNAi)在实验室中是一种强大的实验工具，利用具有同源性的双链RNA(dsRNA)诱导序列特异的目标基因的沉寂，迅速阻断基因活性。siRNA在RNA沉默通路中起中心作用，是对特定信使RNA(mRNA)进行降解的指导要素。siRNA是RNAi途径中的中间产物，是RNAi发挥效应所必需的因子。siRNA的形成主要由Dicer和Rde-1调控完成。由于RNA病毒入侵、转座子转录、基因组中反向重复序列转录等原因，细胞中出现了dsRNA，Rde-1(RNAi缺陷基因-1)编码的蛋白质识别外源dsRNA，当dsRNA达到一定量的时候，Rde-1引导dsRNA与Rde-1编码的Dicer(Dicer是一种RNaseIII活性核酸内切酶，具有四个结构域：Argonaute家族的PAZ结构域，III型RNA酶活性区域，dsRNA结合区域以及DEAH/DEXHRNA解旋酶活性区)结合，形成酶-dsRNA复合体。Dicer切割后形成siRNA，然后，在ATP的参与下，细胞中存在的一种RNA诱导的沉默复合体RNA-induced silencing complex RNAi干涉的关键步骤是组装RISC和合成介导特异性反应的siRNA蛋白。siRNA并入RISC中，然后与靶标基因编码区或UTR区完全配对，降解靶标基因，因此说siRNA只降解与其序列互补配对的mRNA。其调控的机制是通过互补配对而沉默相应靶位基因的表达，所以是一种典型的负调控机制。siRNA识别靶序列是有高度特异性的，因为降解首先在相对于siRNA来说的中央位置发生，所以这些中央的碱基位点就显得极为重要，一旦发生错配就会严重抑制RNAi的效应。siRNA作为一种新兴的治疗技术，也已经以一种前所未有的速度迈进了临床试验阶段，

K-RAS是RAS基因家族成员之一，编码K-RAS蛋白。与肿瘤的生成，增殖，迁移，扩散以及血管生成均有关系。

K-RAS蛋白具有GTPase活性，结合GTP时为活化态，结合GDP时为失活态。主要定位于细胞膜上，PKC使K-RAS磷酸化后，这种磷酸化过程导致K-RAS与细胞膜的结合减弱而改变位置，并移至内质网、高尔基体和粒线体等位置。K-RAS具有分子开关作用，在很多信号通路中具有重要作用。

研究表明约30％的人类恶性肿瘤与RAS基因突变有关，RAS突变后的产物可以一直处于活化状态。在白血病，肺癌，直肠癌和胰腺癌中，K-RAS突变均很常见，其中直肠癌中30％-35％患者有突变。其与肿瘤细胞的生存，增殖，迁移，扩散，血管生成均有关系。K-RAS基因分为突变型和野生型，常见突变位点为K-RAS基因2号外显子的12号密码子和13号密码子上，3号外显子的61号密码子，其中有7个突变热点：G12C、G12R、G12S、G12V、G12D、G12A、G13V/D.这7种突变占到了90％以上。

目前市面上的EGFR的靶向药物主要有：吉非替尼Gefitinib(易瑞沙，Iressa)，厄罗替尼erlotinib(特罗凯，Tarceva)，西妥昔单抗Cetuximab(爱必妥，ERBITUX)、帕尼单抗panitumumab(Vectibix)。但是EGFR靶向药物对于K-RAS突变型患者疗效很差，因为没有EGFR的信号，K-RAS也处于活化状态向下游传递信号，故在个性要用药中要先检测K-RAS基因状态再选择用药。若K-RAS为突变型则不建议使用EGFR靶向药物。

因此，考虑到如果可以同时靶向EGFR和K-RAS通路，则可以进而同时抑制通路的上下游，从而使EGFR靶向药物对K-RAS突变患者产生更好的治疗效果，因此，目前急缺一种可以靶向抑制K-RAS基因的治疗方法及对应的药物，以解决目前尚无药物特异性针对K-RAS突变、以及K-RAS突变导致EGFR靶向药物无效等问题。

发明内容

本发明提供了一种新的表达anti-miRNA-214的前体miRNA，及其在治疗肿瘤中的应用。

本发明第一方面，提供一种药物制剂，所述的制剂含有：

(a)用于表达anti-miRNA和/或siRNA的表达载体；以及

(b)药学上可接受的载体。

在另一优选例中，所述的表达载体所表达的式I-1所示的前体，

B1为所需要的第一核糖核酸序列，所述的第一核糖核酸序列包括anti-miRNA序列形式或siRNA序列形式；

B2为与B1基本互补或完全互补的序列，且B2与C不互补；

C为茎环结构序列；

A1和A2分别为无，或任选的由4-5个碱基组成的RNA序列；

其中，所述前体能在宿主中表达(或产生或富集)所述的第一核糖核酸序列，而不表达(或产生或富集)与所述第一核糖核酸序列互补的第二核糖核酸序列。

在另一优选例中，所述的第一核糖核酸序列为5p形式，而第二核糖核酸序列为3p形式。

在另一优选例中，所述的第一核糖核酸序列为3p形式，而第二核糖核酸序列为5p形式。

在另一优选例中，所述的第一核糖核酸序列为anit-miRNA和/或siRNA。

在另一优选例中，所述的B1为抗肿瘤的miRNA或siRNA。

在另一优选例中，所述的B1为anti-miRNA-214-5p。

在另一优选例中，第一核糖核酸序列为anti-miRNA-214-5p，而第二核糖核酸序列为anti-miRNA-214-3p。

在另一优选例中，所述的制剂为液体剂型。

在另一优选例中，所述的制剂为注射剂。

在另一优选例中，所述的表达载体包括质粒。

在另一优选例中，所述的表达载体或质粒含有启动子、复制起点和标记基因。

在另一优选例中，所述的表达载体或质粒含有pCMV启动子、壮观霉素、pUC启动子。

在另一优选例中，所述的表达载体中含有表达anti-miRNA和/或siRNA的表达盒。

在另一优选例中，所述的表达盒(即多核苷酸)为双链，并且具有以下结构：

启动子-attB1-任选的标签蛋白(如GFP或emGFP)-5’miR侧翼区序列-式I所示的序列-5’miR侧翼区序列-attB2-任选的TKPA元件。

在另一优选例中，所述的制剂为脂质体制剂。

在另一优选例中，所述的anti-miRNA和/或siRNA为选自下组的RNA：

anti-miRNA-214、K-RAS siRNA、EGFR siRNA、PDL1 siRNA、PDCD1 siRNA、ALKsiRNA、IDO1 siRNA；

优选地，所述的anti-miRNA-214具有如SEQ ID NO：2所示的序列；

所述的K-RAS siRNA为选自下组的序列：SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：35、SEQ IDNO：50、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：107、SEQID NO：110、SEQ ID NO：115(或表11中第3、26、41、47、52、73、88、98、101和106号)；

所述的EGFR siRNA为选自下组的序列：SEQ ID NO：294、SEQ ID NO：297、SEQ IDNO：312、SEQ ID NO：319、SEQ ID NO：324、SEQ ID NO：329、SEQ ID NO：336、SEQ ID NO：340、SEQ ID NO：345、SEQ ID NO：349(或表14中第17、20、35、42、47、52、59、63、68和72号)；

所述的PDL1 siRNA为选自下组的序列：SEQ ID NO：693、SEQ ID NO：694、SEQ IDNO：695、SEQ ID NO：696、SEQ ID NO：697、SEQ ID NO：698、SEQ ID NO：699、SEQ ID NO：700、SEQ ID NO：701、SEQ ID NO：702(或表15中第1、2、3、4、5、6、7、8、9和10号)；

所述的PDCD1 siRNA为选自下组的序列：SEQ ID NO：494、SEQ ID NO：513、SEQ IDNO：529、SEQ ID NO：534、SEQ ID NO：537、SEQ ID NO：572、SEQ ID NO：575、SEQ ID NO：579、SEQ ID NO：605、SEQ ID NO：634(或表16中第18、37、53、58、61、96、99、103、129和158号)；

所述的ALK siRNA为选自下组的序列：SEQ ID NO：708、SEQ ID NO：713、SEQ IDNO：718、SEQ ID NO：721、SEQ ID NO：725、SEQ ID NO：729、SEQ ID NO：732、SEQ ID NO：734、SEQ ID NO：742、SEQ ID NO：743(或表17中第6、11、16、19、23、27、30、32、40和41号)

所述的IDO1 siRNA为选自下组的序列：SEQ ID NO：825、SEQ ID NO：827、SEQ IDNO：831、SEQ ID NO：832、SEQ ID NO：834、SEQ ID NO：836、SEQ ID NO：849、SEQ ID NO：851、SEQ ID NO：852、SEQ ID NO：870(或表18中第2、4、8、9、11、13、26、28、29和47号)。

本发明第二方面提供一种施用药物的方法，包括步骤：

将本发明第一方面所述的药物制剂施用于哺乳动物的第一部位，从而使得所述表达载体在所述哺乳动物体内被加工形成微粒子(microvesicle)，并被运输到所述哺乳动物的第二部位，并在所述的第二部位表达所述的anti-miRNA和/或siRNA。

在另一优选例中，所述的哺乳动物包括人和非人哺乳动物。

在另一优选例中，所述的第一部位包括皮下、静脉或肠胃道。

在另一优选例中，所述的第二部位包括肝脏、肺、肾脏。

在另一优选例中，所述的施用包括口服、皮下注射、肌内注射、静脉注射。

本发明第三方面提供一种前体序列，其5’至3’端具有式I所示的结构：

B1为所需要的第一核糖核酸序列，其中所述的第一核糖核酸序列包括anti-miRNA序列形式或siRNA序列形式；

B2为与B1基本互补或完全互补的序列，且B2与C不互补；

C为茎环结构序列；

A1和A2分别为无，或任选的由4-5个碱基组成的RNA序列；

本发明第四方面，提供了一种前体序列，其5’至3’端具有式I所示的结构：

B1为anti-miRNA-214-5p；

B2为与B1基本互补或完全互补的序列，且B2与C不互补；

C为茎环结构序列，较佳地为SEQ ID NO.：1所示的序列(GUUUUGGCCACUGACUGAC)；

A1和A2分别为无，或任选的由4-5个碱基组成的RNA序列；

其中，所示的前体序列能在宿主中加工形成anti-miRNA-214，且在所述anti-miRNA-214中，只表达anti-miRNA-214-5p，不表达anti-miRNA-214-3p。

在另一优选例中，所述的“只表达anti-miRNA-214-5p，不表达anti-miRNA-214-3p”表示F5/F3之比≥5，较佳地≥10，更佳地≥20，最佳地≥50，其中F5为anti-miRNA-214-5p的表达量，而F3为anti-miRNA-214-3p的表达量。在另一优选例中，所述的anti-miRNA-214-5p如SEQ ID NO.：2所示(ACUGCCUGUCUGUGCCUGCUGU)。

在另一优选例中，所述的anti-miRNA-214-3p如SEQ ID NO.：3所示(ACAGGCAGGCAGACAGGCAGU)。

在另一优选例中，所述B2与B1有2-8个碱基不互补，较佳地，所述B2与B1有3-5个碱基不互补。

在另一优选例中，所述B2较B1添加或缺失1-2个碱基。

在另一优选例中，所述的B2较B1缺失1-2个碱基，更佳地，缺失2个碱基。

在另一优选例中，所述的被缺失的1-2个碱基位于B1的中部，即9-14位中的1-2个碱基，如第9-10位，第10-11位，第11-12位，第12-13位或第13-14位。

在另一优选例中，所述的A1为UGCUG；和/或

所述的A2为CAGG或CAGGA。

在另一优选例中，A2优选为CAGG。

在另一优选例中，所述的前体序列5’至3’端具有式I所示的结构：

B1为K-RAS siRNA；

B2为与B1基本互补或完全互补的序列，且B2与C不互补；

C为茎环结构序列，优选为SEQ ID NO.：1所示的序列；

A1和A2分别为无，或任选的由4-5个碱基组成的RNA序列；

其中，所示的前体序列能在宿主中加工形成K-RAS siRNA；

其中，所述K-RAS siRNA正义链的核苷酸序列选自序列表中：SEQ ID NO：12、SEQID NO：35、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：97、SEQID NO：107、SEQ ID NO：110、SEQ ID NO：115(或表11中第3、26、41、47、52、73、88、98、101和106号)所示序列；

B1为EGFR siRNA；

B2为与B1基本互补或完全互补的序列，且B2与C不互补；

C为茎环结构序列，优选为SEQ ID NO.：1所示的序列；

A1和A2分别为无，或任选的由4-5个碱基组成的RNA序列；

其中，所示的前体序列能在宿主中加工形成EGFR siRNA；

其中，所述EGFR siRNA正义链的核苷酸序列选自序列表中：SEQ ID NO：294、SEQID NO：297、SEQ ID NO：312、SEQ ID NO：319、SEQ ID NO：324、SEQ ID NO：329、SEQ ID NO：336、SEQ ID NO：340、SEQ ID NO：345、SEQ ID NO：349(或表14中第17、20、35、42、47、52、59、63、68和72号)所示序列。

在另一优选例中，所述的B1为PDL1 siRNA，其中所述PDL1 siRNA正义链的核苷酸序列选自序列表中：SEQ ID NO：693、SEQ ID NO：694、SEQ ID NO：695、SEQ ID NO：696、SEQID NO：697、SEQ ID NO：698、SEQ ID NO：699、SEQ ID NO：700、SEQ ID NO：701、SEQ ID NO：702(或表15中第1、2、3、4、5、6、7、8、9和10号)所示序列。

在另一优选例中，所述的B1为PDCD1 siRNA，其中所述PDL1 siRNA正义链的核苷酸序列选自序列表中：SEQ ID NO：494、SEQ ID NO：513、SEQ ID NO：529、SEQ ID NO：534、SEQID NO：537、SEQ ID NO：572、SEQ ID NO：575、SEQ ID NO：579、SEQ ID NO：605、SEQ ID NO：634(或表16中第18、37、53、58、61、96、99、103、129和158号)所示序列。

在另一优选例中，所述的B1为ALK siRNA，其中所述ALK siRNA正义链的核苷酸序列选自序列表中：SEQ ID NO：708、SEQ ID NO：713、SEQ ID NO：718、SEQ ID NO：721、SEQ IDNO：725、SEQ ID NO：729、SEQ ID NO：732、SEQ ID NO：734、SEQ ID NO：742、SEQ ID NO：743(或表17中第6、11、16、19、23、27、30、32、40和41号)所示序列。

在另一优选例中，所述的B1为IDO1siRNA，其中所述IDO1 siRNA正义链的核苷酸序列选自序列表中：SEQ ID NO：825、SEQ ID NO：827、SEQ ID NO：831、SEQ ID NO：832、SEQ IDNO：834、SEQ ID NO：836、SEQ ID NO：849、SEQ ID NO：851、SEQ ID NO：852、SEQ ID NO：870(或表18中第2、4、8、9、11、13、26、28、29和47号)所示序列。

本发明第五方面，提供了一种多核苷酸，所述的多核苷酸能被宿主转录形成本发明第四方面中所述的前体序列。

在另一优选例中，所述的多核苷酸为双链，并且具有以下结构：

attB1-任选的标签蛋白(如GFP或emGFP)-5’miR侧翼序列-式I所示的序列-5’miR侧翼序列-attB2。

本发明第六方面，提供了一种表达载体，所述的表达载体含有本发明第四方面所述的前体序列或本发明第五方面所述的多核苷酸。

在另一优选例中，所述的表达载体包括病毒载体、非病毒载体。

在另一优选例中，所述的表达载体为质粒。

在另一优选例中，所述的表达载体的菌种包括大肠杆菌DH5α、XL10-GOLD、BB4、DE3、BM25.5、BMH71-18mutS、BW313、C-la、C600、DH1、DH5、DP50supF、ED8654、ED8767、ER1647、HB101、HMS174、JM83、JM101、JM105、JM106、JM107、JM108、JM109、JM110、K802、K803、LE392、MC1061、MV1184、MV1193、NovaBlue、RR1、TAP90、TG1、TG2、XL1-Blue、x1776、Y-1088、Y-1089、Y-1090。

在另一优选例中，所述的表达载体的菌种包括大肠杆菌DH5α、XL10-GOLD。

在另一优选例中，所述的表达载体的菌种包括大肠杆菌DH5α。

在另一优选例中，所述的本发明第五方面所述的多核苷酸的上游为启动子，并且其下游为TKPA元件。

本发明第七方面，提供了一种药物组合物，所述的药物组合物含有本发明第四方面所述的前体序列、或本发明第六方面所述的表达载体，和药学上可接受的载体。

在另一优选例中，所述的药物组合物包括anti-miR-214质粒。

在另一优选例中，所述的药物组合物为本发明第六方面所述的表达载体，较佳地，为含有本发明第四方面所述前体序列的质粒。

在另一优选例中，所述的药物组合物的剂型包括：

片剂、胶囊剂、粉剂、丸剂、颗粒剂、糖浆剂、溶液、混悬液、乳剂、混悬剂、注射液、或粉针剂。

在另一优选例中，所述的药物组合物的剂型还包括喷雾剂、气雾剂、粉雾剂、挥发性液体、外用溶液剂、洗剂、浇淋剂、搽剂、巴布膏剂、膏药、橡胶膏剂、软膏剂、硬膏剂、糊剂、滴眼剂、滴鼻剂、眼用软膏剂、含漱剂、舌下片剂或栓剂。

在另一优选例中，所述的剂型为注射剂，较佳地，为静脉注射剂、腹腔注射剂。

本发明第八方面，提供了本发明第四方面所述前体序列、或本发明第六方面所述表达载体的用途，包括，(i)用于制备miRNA-214的抑制剂；和/或(ii)用于制备抗miRNA-214高表达恶性肿瘤的药物组合物。

在另一优选例中，所述的恶性肿瘤包括肝癌、肺癌、胃癌、食管癌、卵巢癌、结直肠癌、宫颈癌、胰腺癌、前列腺癌、白血病、或乳腺癌。

本发明第九方面，提供了一种体外非治疗性抑制miRNA-214高表达恶性肿瘤细胞生长的方法，包括步骤：

在本发明第七方面所述药物组合物存在情况下培养miRNA-214高表达恶性肿瘤细胞，从而抑制miRNA-214高表达恶性肿瘤细胞的生长。

本发明第十方面，提供了一种治疗miRNA-214高表达恶性肿瘤的方法，将安全有效量的本发明第六方面所述的表达载体或本发明第七方面所述的药物组合物施用于所需对象，从而治疗miRNA-214高表达恶性肿瘤。

在另一优选例中，所述施用的剂量为0.05-10mg/kg，较佳地，为0.1-5mg/kg。

在另一优选例中，所述施用包括：口服、呼吸道、注射、透皮、粘膜或腔道给药；

在另一优选例中，所述施用包括注射质粒。

本发明第十一方面，提供了一种治疗miRNA-214高表达恶性肿瘤的方法，其特征在于，将含有本发明第四方面所述的前体序列的anti-miR-214质粒通过静脉注射施用于所需对象，从而治疗miRNA-214高表达恶性肿瘤。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1本发明的代表性的质粒图谱。其中，“flanking region”表示侧翼区(序列)。

图2显示了从小鼠尾静脉注射anti-miR-214过表达质粒后，在1h，3h，6h，24h等时间节点后检测各组织或脏器中该siRNA的含量。

图3显示了CD4⁺T细胞的数量变化。

图4显示了各个组织anti-miR-214含量。

图5显示anti-miR-214的C_T值。

图6显示质粒的C_T值。

图7显示壮观霉素mRNA的C_T值。

图8显示pre-anti-miR-214的C_T值。

图9显示anti-miR-214的C_T值和表达水平。图9A显示anti-miR-214的C_T值，图9B显示anti-miR-214的表达水平。

图10显示exosome中质粒、pre-anti-miR-214、anti-miR-214的C_T值。图10A显示质粒的C_T值；图10B显示pre-anti-miR-214的C_T值；图10C显示anti-miR-214的C_T值。

图11显示CD4⁺T cell细胞中anti-miR-214的C_T值和表达水平。图11A显示anti-miR-214的C_T值；图11B显示anti-miR-214的表达水平。

图12显示CD4⁺T cell细胞中miR-214的相对表达水平和PTEN的蛋白水平。图12A显示CD4⁺T cell细胞中miR-214的相对表达水平；图12B显示PTEN的蛋白水平。

图13显示Treg的比率和细胞因子的表达水平。图13A显示Treg的比率；图13B显示细胞因子的表达水平。

图14显示anti-miR-214 plasmid对荷瘤鼠体重影响。

图15显示anti-miR-214的CT值和表达水平。图15A显示anti-miR-214的CT值；图15B显示anti-miR-214的表达水平。

图16显示miR-214的表达水平。

图17显示各组CD4⁺T cell内PTEN蛋白的表达水平。图17A显示各组CD4⁺T cell内PTEN蛋白的western blotting结果；图17B是图17A对应的各组CD4⁺T cell内PTEN蛋白的表达水平。

图18显示各组小鼠血液中Treg含量。

图19显示Anti-miR-214对小鼠Lewis肺癌治疗作用肿瘤组织切片图。其中A：×40；B：×100；C：×400。

图20显示各给药组对Lewis肺癌的治疗作用结果图。图20A显示肺癌的分值；图20B显示肺癌敏感度的分值。

图21显示了肿瘤末期志愿者注射质粒前后血细胞和血浆中anti-miR-214的含量。

图22显示了血清中miR-214的表达水平。

图23显示了pcDNA3质粒的图谱结构。

图24是改造前的质粒的示意图；

图25是各个组织器官中K-RAS siRNA含量的CT值示意图；

图26是肺中K-RAS mRNA的表达水平示意图；

图27是肺中K-RAS蛋白的表达水平电泳图；

图28是肺中K-RAS蛋白的表达水平示意图；

图29是小鼠肝脏和肺脏中病理切片结果示意图；

图30是结肠癌移植瘤中K-RAS mRNA的表达水平示意图；

图31是结肠癌移植瘤中K-RAS蛋白的表达水平示意图；

图32是胰脏中K-RAS mRNA的表达水平示意图；

图33是胰脏中K-RAS蛋白的表达水平示意图；

图34是小鼠肝脏和胰脏中病理切片结果示意图；

图35是肺中10条K-RAS siRNA导入后K-RAS mRNA的表达水平示意图；

图36是肺中10条K-RAS siRNA导入后K-RAS蛋白的表达水平示意图；

图37是肺脏siRNA I、siRNA II、本申请siRNA作用下K-RAS mRNA的表达水平。

图38是各个组织器官中EGFR siRNA的含量；

图39是肺中EGFR mRNA的表达水平示意图；

图40是肺中EGFR蛋白的表达水平western blotting结果图；

图41是肺中EGFR蛋白的表达水平示意图；

图42是小鼠肺脏中病理切片结果示意图；

图43是结肠癌移植瘤中EGFR mRNA的表达水平示意图；

图44是结肠癌移植瘤中EGFR蛋白的表达水平示意图；

图45是胰脏中EGFR mRNA的表达水平示意图；

图46是胰脏中EGFR蛋白的表达水平示意图；

图47是转入siRNA后肺中EGFR mRNA的表达水平。

图48是转入siRNA后肺中EGFR蛋白的表达水平。

图49是小鼠肺脏siRNA I、siRNA II、本申请siRNA作用下EGFR mRNA的表达水平。

图50显示肺中PDL1 mRNA的表达水平。

图51显示肺中PDL1蛋白的表达水平。

图52显示肺中PDCD1 mRNA的表达水平。

图53显示肺中PDCD1蛋白的表达水平。

图54显示黑色素移植瘤中PDL1 mRNA的表达水平。

图55显示黑色素移植瘤中PDL1蛋白的表达水平。

图56显示黑色素移植瘤中PDCD1 mRNA的表达水平。

图57显示黑色素移植瘤中PDCD1蛋白的表达水平。

图58显示肺中ALK mRNA的表达水平。

图59显示提取肺组织蛋白后，利用western blotting实验检测肺组织内ALK蛋白的表达水平。

图60显示肺中IDO1 mRNA的表达水平，结果显示筛选出的10条IDO1 siRNA构建的质粒都降低了肺组织器官内IDO1的mRNA水平。

图61显示提取肺组织蛋白后，利用western blotting实验检测肺组织内IDO1蛋白的表达水平。

图62显示结直肠癌移植瘤中IDO1 mRNA的表达水平。

图63显示提取结直肠癌移植瘤组织蛋白，利用western blotting实验检测移植瘤组织内IDO1蛋白的表达水平。

图64显示胰脏中IDO1 mRNA的表达水平。

图65显示提取胰脏组织蛋白，利用western blotting实验检测胰脏组织内IDO1蛋白的表达水平。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入地研究，首次设计制备了一种能够高效表达anti-miRNA-214的前体miRNA。本发明前体miRNA经过宿主细胞的加工后，能够高效地表达anti-miRNA-214-5p，而不产生或基本不产生anti-miRNA-214-3p，从而有效地避免了目的序列的反向互补序列对目的序列发挥功能的干扰作用。实验证明，本发明前体miRNA能够在体内有效表达anti-miRNA-214-5p序列，并对多种恶性肿瘤都具有更有效的治疗作用。在此基础上，完成了本发明。

miRNA及其前体

如本文所用，所述的“miRNA”是指一类RNA分子，从可形成miRNA前体的转录物加工而来。成熟的miRNA通常具有18-26个核苷酸(nt)(更特别的约19-22nt)，也不排除具有其它数目核苷酸的miRNA分子。miRNA通常可被Northern印迹检测到。

人来源的miRNA可被从人细胞中分离。如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

miRNA可从前体miRNA(Precursor miRNA，Pre-miRNA)加工而来，所述的前体miRNA可折叠成一种稳定的茎环(发夹)结构，所述的茎环结构长度一般在50-100bp之间。所述的前体miRNA可折叠成稳定的茎环结构，茎环结构的茎部两侧包含基本上互补的两条序列。

在本发明中，所述的前体miRNA为人工合成的前体miRNA，且所述的前体miRNA具有式I所示的结构：

作为代表性的例子，B1为anti-miRNA-214-5p；

B2为与B1互补(包括基本互补和完全互补)的序列；

C为SEQ ID NO.：1所示的序列(GUUUUGGCCACUGACUGAC)；

A1和A2分别为无，或任选的由4个-5个碱基组成的核苷酸序列；

其中，所示的前体miRNA能在宿主中加工形成需要表达的anti-miRNA和/或siRNA，例如anti-miRNA-214。且在表达所述anti-miRNA和/或siRNA中，只表达anti-miRNA-214-5p或其他待表达序列，不表达anti-miRNA-214-3p。

在本发明中，形成anti-miRNA-214-5p的前体miRNA可被剪切生成与拮抗miRNA-214的miRNA，即anti-miRNA-214-5p(SEQ ID NO.：2)。

在式I中，B2和B1为基本互补。如本文所用，“基本上互补”是指核苷酸的序列是足够互补的，可以以一种可预见的方式发生相互作用，如形成二级结构(如茎环结构)。通常，两条“基本上互补”的核苷酸序列互相之间至少有70％的核苷酸是互补的；优选的，至少有80％的核苷酸是互补的；更优选的，至少有90％的核苷酸是互补的。一般地，两条足够互补的分子之间可以具有最多8个不匹配的核苷酸，优选地，具有1、2、3、4、5个不匹配的核苷酸。

如本申请所用，“茎环”结构也被称作“发夹”结构，是指一种核苷酸分子，其可形成一种包括双链区域(茎部)的二级结构，所述的双链区域由该核苷酸分子的两个区域(位于同一分子上)形成，两个区域分列双链部分的两侧；其还包括至少一个“环”结构，包括非互补的核苷酸分子，即单链区域。即使该核苷酸分子的两个区域不是完全互补的，核苷酸的双链部分也可保持双链状态。例如，插入、缺失、取代等可导致一个小区域的不互补或该小区域自身形成茎环结构或其它形式的二级结构，然而，该两个区域仍可基本上互补，并在可预见的方式中发生相互作用，形成茎环结构的双链区域。茎环结构是本领域技术人员所熟知的，通常在获得了一条具有一级结构的核苷酸序列的核酸后，本领域技术人员能够确定该核酸是否能形成茎环结构。

本发明中，“茎环结构”可存在于式I所示前体miRNA的末端，例如由于B1和B2形成基本互补后，C会形成一固定的末端茎环结构；所述的“茎环结构”还可存在于式I所式前体miRNA内部，例如由于B1和B2之间并非完全互补，造成未互补结合的B1或B2的碱基会形成一内部的茎环(internal loop)。

本发明所述的miRNA-214是指：微小RNA-214(miRNA-214)家族，所述miRNA-214家族包括：miRNA-214或经修饰的miRNA-214衍生物，其功能与miRNA-214-相同或基本相同。

根据本发明所提供的miRNA序列，可设计出在被导入后可被加工成可影响相应的mRNA表达的miRNA的多核苷酸构建物，例如，所述多核苷酸构建物能够在体内上调相应的anti-miRNA-214-5p的量，从而降低miRNA-214的量。因此，本发明提供了一种分离的多核苷酸(构建物)，所述的多核苷酸(构建物)可被人细胞转录成前体miRNA，所述的前体miRNA可被人细胞剪切且表达成所述的miRNA。

多核苷酸构建物

作为本发明的一种优选方式，所述的多核苷酸构建物自5’至3’端含有式II所示的结构：

a1-b1-c-b2-a2

式II

式II中，

b1为可在细胞中表达成所述的anti-miRNA-214-5p的核苷酸序列，b2为与b1基本上互补或完全互补的核苷酸序列；c为位于b1和b2之间的间隔序列，并且所述间隔序列与B1和B2不互补；

a1和a2分别为无，或任选的由4个-5个碱基组成的核苷酸序列；

式II所示的结构在转入细胞后，形成式I所示的二级结构：

通常，所述的多核苷酸构建物位于表达载体上。因此，本发明还包括一种载体，它含有所述的miRNA，或所述的多核苷酸构建物。所述的表达载体通常还含有启动子、复制起点和/或标记基因等。本领域的技术人员熟知的方法能用于构建本发明所需的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如卡拉霉素、庆大霉素、潮霉素、氨苄青霉素抗性。

在本发明中，所述表达载体没有特别限制，包括市售的或用常规制备的表达载体。代表性的例子包括(但并不限于)：pcDNATM6.2-GW/miR、pcDNA3、pMIR-REPORT miRNA、pAdTrack-CMV、pCAMBIA3101+pUC-35S、pCMVp-NEO-BAN、pBI121、pBin438、pCAMBIA1301、pSV2、CMV4表达载体、pmiR-RB-ReportTM、pshOK-basic、mmu-mir 300-399miRNASelectTM、pshRNA-copGFP Lentivector、GV317、GV309、GV253、GV250、GV249、GV234、GV233、GV232、GV201、GV159或其他GV系列表达载体。

在另一优选例中，在所述表达载体中，与所述表达所述前体miRNA多核苷酸操作性相连的启动子包括组成型启动子或组织特异性启动子，优选在肝脏组织中特异性启动的启动子。换言之，这些启动子用于驱动前体miRNA的表达。

代表性的启动子包括(但并不限于)：Pcmv启动子、U6、H1、CD43启动子、CD45(LCA)启动子、CD68启动子、Endoglin(CD105)启动子、Fibronectin启动子、Flt-1(VEGFR-1)启动子、GFAP启动子、GPIIb(IntegrinαIIb)启动子、ICAM-2(CD102)启动子、MB(Myoglobin)启动子、NphsI(Nephrin)启动子、SPB启动子、SV40/hAlb启动子、SYN1启动子、WASP启动子或其组合。

药物组合物及施用方法

如本文所用，术语“有效量”或“有效剂量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。

如本文所用，术语“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。

本发明的药物组合物含有安全有效量的本发明的活性成分以及药学上可接受的载体。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。通常药物制剂应与给药方式相匹配，本发明的药物组合物的剂型为注射剂、口服制剂(片剂、胶囊、口服液)、透皮剂、缓释剂。例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。所述的药物组合物宜在无菌条件下制造。

本发明所述的活性成分的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：所述的活性成分的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。通常，当本发明的活性成分每天以约0.00001mg-50mg/kg动物体重(较佳的0.0001mg-10mg/kg动物体重)的剂量给予，能得到令人满意的效果。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。

本发明所述的药学上可接受的载体包括(但不限于)：水、盐水、脂质体、脂质、微粒子(micro particle)、微泡(micro vesicle)、外泌体(exosomes)、脱落囊泡(sheddingvesicle)、纳米胶囊(Nanocapsules/Nanoparticles)、β环糊精胶囊(β-cyclodextriniclusion compound)蛋白、蛋白-抗体缀合物、肽类物质、纤维素、纳米凝胶、或其组合。载体的选择应与给药方式相匹配，这些都是本领域的普通技术人员所熟知的。

在本发明中，可将所述的表达载体直接施用于对象，也可将所述的表达载体与药学上可接受的载体制备成药物组合后进行施用。所述的施用包括静脉注射。

治疗方法

本发明还提供了一种治疗miRNA-214高表达恶性肿瘤的方法，即，将安全有效量的本发明表达载体或药物组合物施用于所需对象，从而治疗miRNA-214高表达恶性肿瘤。通常，“miRNA-214高表达恶性肿瘤”指的是所述的肿瘤中，miRNA-214的表达量E1与癌旁组织或正常组织中miRNA-214的量E0相比具有显著性差异，较佳地，所述“高表达”指的是E1≥1.5E0，更佳地E1≥2E0。肿瘤组织中，miRNA-214是否高表达可以通过常规方法检测。通常，所述的miRNA-214高表达恶性肿瘤包括(但不限于)肝癌、肺癌、胃癌、食管癌、卵巢癌、结直肠癌、宫颈癌、胰腺癌、前列腺癌、白血病、或乳腺癌。

本发明有益效果

本发明前体miRNA能够有效的避免在过表达目的序列得同时也过表达目的序列得反向互补序列，从而有效避免了目的序列得反向互补序列对目的序列发挥功能的干扰作用。

本发明前体miRNA能够在体内有效表达anti-miRNA-214-5p序列，并对多种恶性肿瘤都具有有效的治疗作用，从而用于开发新的肿瘤治疗药物。

实施例1：Anti-miR-214过表达载体构建

MicroRNA载体利用CMV启动子可以在众多哺乳动物细胞中快速、高效、持续表达pre-miRNA，经过Drosha(RNaseIII)作用形成small hairpin pre-miRNAs(约70nt)，再过Dicer作用形成成熟的microRNA(约22nt)，作用靶mRNA，起到表达调控作用。利用优化过的载体，模拟anti-miR-214的表达模块，有效的避免了有些内源miRNA表达时产生-3p，-5p的问题。

1.anti-miR-214-5p序列

＞anti-miR-214-5p

5”-ACUGCCUGUCUGUGCCUGCUGU-3”(SEQ ID NO.：2)

2.anti-miR-214载体

2.1.Oligo DNA的设计与合成

根据基因序列设计并合成2对互补oligo DNA(oligo设计方法及架构请参见产品使用说明第6条)，序列见表1。

设计合成的oligo结构如下：

表1、oligo DNA序列及其对应的前体miRNA元件

2.2miRNA载体的构建与验证

2.2.1材料

含有EmGFP的BLOCK-iT^TM Pol II miR RNAi表达载体盒(购自Life)

oligo DNA(购自Life)

感受态细胞DH5α(购自Life)

2.2.2方法

(1)退火

将2对合成好的寡聚单链DNA用ddH2O溶解成100μM，互补单链各取5μl两两混合，按表2给出体系进行退火。将2份oligo混合物在95℃加热5分钟，然后放置室温20分钟，形成双链DNA。

表2、oligo DNA退火体系

100μM top strand oligo	5μl
		100μM b ottom strand oligo	5μl
10×oligo annealing buffer	2μl
		ddH2O	8μl
总体积	20μl

(2)连接

将退火的双链DNA继续稀释成10nM浓度，按表3给出体系在室温连接30分钟。

表3、酶连接体系

注：pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR和pcDNA6.2-GW/miR的结构如图1所示。

(3)转化

取10μl连接产物转化100μl感受态细胞DH5α，涂LB平板(含50μg/ml壮观霉素)后，37℃孵育。

(4)测序验证

每个转化平板分别挑取3个克隆，摇菌抽提质粒后进行测序，以验证重组克隆中插入片段序列是否与设计的寡聚单链DNA序列一致。

实施例2：细胞实验验证过表达anti-miR-214的效率

在A549细胞(购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心)中转染anti-miR-214质粒，统一总RNA后分别利用从ABI公司定制的anti-miR-214-5p，anti-miR-214-3p，miR-214的引物Real-time-PCR检测anti-miR-214-5p、anti-miR-214-3p、miR-214的水平。结果均以Ct值代表每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数，其中，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小；起始拷贝数越少，Ct值越大。表4显示了利用Real-time PCR对anti-miRNA和miRNA表达水平进行测定。

表4、anti-miR-214-5p、anti-miR-214-3p、miR-214的表达水平

结论：在A549细胞中转染anti-miR-214质粒后，能检测到anti-miR-214-5p的急剧上升(p＜0.01)，基本检测不到anti-miR-214-3p(p＞0.05)，且不会引起miR-214的上升，相反会导致miR-214下降(p＜0.05)。基于Ct值的差异，可以判断出F5/F3之比远大于50/1。

实施例3：体内实验验证过表达anti-miR-214的效率

给C57/BL6小鼠尾静脉注射anti-miR-214质粒，24h后灌流，取血、心、肝、脾、肺、肾、脑、肌肉组织，统一总RNA，然后进行q-PCR检测anti-miR-214-5p、anti-miR-214-3p、miR-214的水平。结果见表5。

表5、anti-miR-214-5p、anti-miR-214-3p的表达水平

(Ct)	anti-miR-214-5p	anti-miR-214-3p
			空白小鼠血	38.80±0.4171	30.80±0.8066
0.1mg质粒小鼠血	24.11±0.4588	30.74±0.1667
			0.01mg质粒小鼠血	28.09±0.9880	30.50±0.1404
空白小鼠肝	39.37±0.8329	30.61±0.1288
			0.1mg质粒小鼠肝	20.52±0.3156	30.67±0.1311
0.01mg质粒小鼠肝	25.30±0.1404	33.70±0.1351
			空白小鼠肺	39.25±0.5662	33.12±0.1290
0.1mg质粒小鼠肺	26.37±0.3754	30.08±0.1283
			0.01mg质粒小鼠肺	30.76±0.1895	33.58±0.1387

实验结果说明：

从实验结果来看，注射0.1mg质粒后，小鼠全血，肝，肺中anti-miR-214-5p水平已经显著升高(p＜0.05)，而检测不到anti-miR-214-3p的变化(p＜0.05)。

实施例4：体内实验验证过表达siRNA的代谢动力学

从小鼠尾静脉注射anti-miR-214过表达质粒(以下实验中，anti-miR-214均指anti-miR-214-5p)，在1h，3h，6h，9h，12h，24h，36h，48h后检测血浆、心脏、肝、脾、肺、肾、脑、骨骼肌、CD4+T细胞中该siRNA的含量，具体结果见图2。从图2可以看出，siRNA确实可以进入肺部并且在6h后达到最高浓度，在24h内均能够检测到。

实施例5：植瘤小鼠实验

从小鼠尾静脉注射LLC cell，构建肺癌转移模型，模型构建成功后，尾静脉注射anti-miR-214过表达质粒，观察治疗效果，处死小鼠后取小鼠各个组织进行Real-time PCR检测小鼠各个组织内anti-miR-214的分布，并进行组织切片检测以观察治疗效果。

(1)CD25⁺，Foxp3⁺T cell数量变化

具体结果见图3。从图3可以看出，anti-miR-214质粒可以有效抑制肿瘤小鼠体内抑制新T细胞CD25⁺，Foxp3⁺T cell(Treg)的数量，并且呈剂量依赖性，随着注射质粒浓度的提高，CD25⁺，Foxp3⁺T cell(Treg)的数量随之减少。

(2)各个组织anti-miR-214含量

具体结果见图4。从图4可以看出，注射anti-miR-214质粒后，anti-miR-214可以被肝脏运送到多个组织，并且使多个组织anti-miR-214水平急剧升高。

实施例6：细胞实验验证肝脏细胞可以过表达anti-miR-214，并且能够利用微囊泡将anti-miR-214运输到CD4⁺T细胞

实验过程

1)将anti-miR-214质粒利用脂质体转染到HepG2细胞中，6h后换液，24h后收集细胞，提取RNA，检测anti-miR-214表达水平。

2)将anti-miR-214质粒利用脂质体转染到HepG2细胞中，6h后换液，24h后收集细胞培养液，分离微囊泡(exosome)，提取RNA，检测anti-miR-214表达水平。

3)将anti-miR-214质粒利用脂质体转染到HepG2细胞中，6h后换液，24h后收集细胞培养液，分离exosome，将exosome加入到培养的CD4+T细胞中，提取RNA，检测anti-miR-214，miR-214，PTEN表达水平。

实验结果

利用合成的单链anti-miR-214通过q-PCR技术检测anti-miR-214探针的线性检测范围，具体结果见图5。NO-template control：逆转的时候不加RNA，单纯用水，即水背景。图5显示anti-miR-214的C_T值。由实验结果发现anti-miR-214探针最低可以检测到0.1amol，水背景为C_T＝28.5。

随后将anti-miR-214质粒利用脂质体转染到HepG2细胞中，首先检测anti-miR-214质粒水平(质粒利用q-PCR检测，引物序列如下：正向引物：5′-GGCATGGACGAGCTGTACAA-3′；反向引物：5′-CTCTAGATCAACCACTTTGT-3′)。具体结果见图6。图6显示质粒的C_T值。NO-template control：逆转的时候不加RNA，单纯用水，即水背景；Mock：HepG2细胞，不加任何处理，空白对照；Control plasmid：pcDNA6.2空白骨架，不表达任何microRNA序列，做对照。由结果可以看出，anti-miR-214质粒可以有效地被转染入HepG2细胞中。

检测了壮观霉素的表达情况(壮观霉素利用q-PCR检测，引物序列如下：正向引物：5′-TGAGGCGCTAAATGAAACCT-3′；反向引物：5′-ATTTGCCGACTACCTTGGTG-3′)。具体结果见图7。图7显示壮观霉素mRNA的C_T值。DH5αlpha：空白感受态细菌；DH5α1pha(anti-miR-214质粒)：转化了anti-miR-214质粒的感受态细菌；HepG2 cell：不做任何处理的HepG2细胞；HepG2 cell(Control plasmid)：转染了空白质粒的HepG2细胞；HepG2 cell(anti-miR-214质粒)：转染了anti-miR-214质粒的HepG2细胞。由结果可以看出，壮观霉素没有在真核细胞HepG2细胞中表达。这个实验的目的是为了确保质粒在原核细菌中表达的抗生素筛选基因不会在真核细胞内表达。

检测了anti-pre-miR-214的表达情况(利用Qrt-pcr检测，引物序列如下：RT引物：

5′-CTGTCTGTGTGCTGTGTCAGTC-3′；正向引物：

5′-GGCACAGACAGGCAGTCAGCA-3′；反向引物：

5′-CTGTCTGTGTGCTGTGTCAGTC-3′.)具体结果见图8。图8显示pre-anti-miR-214的C_T值。由结果可以看出anti-miR-214质粒在HepG2细胞中表达。

检测了anti-miR-214的表达情况(使用的是QIAGEN加尾法的试剂盒，逆转录引物和Qrt-PCR的反向引物是通用的。正向引物是：

5’-ACACTCCAGCTGGGACTGCCTGTCTGTGCC-3’.)具体结果见图9。图9显示anti-miR-214的C_T值和表达水平。图9A显示anti-miR-214的C_T值，图9B显示anti-miR-214的表达水平。由结果可以看出anti-miR-214质粒在HepG2细胞中表达。

利用超高速离心的方法，从培养HepG2细胞培养上清液中分离exosome，随后从提取的exosome中的一部分分离DNA，检测anti-miR-214质粒的含量，另外一部分提取RNA，检测pre-miR-214和miR-214成熟体含量。具体结果见图10。图10显示exosome中质粒、pre-anti-miR-214、anti-miR-214的C_T值。图10A显示质粒的C_T值；图10B显示pre-anti-miR-214的C_T值；图10C显示anti-miR-214的C_T值。如图A所示，结果发现exosome中不含有质粒，如图B所示，exosome中不含有pre-miR-214，如图C所示exosome中含有高含量的anti-miR-214。

利用Miltenyi Biotec公司的CD4⁺T cell Isolation Kit分离小鼠的CD4⁺T cell培养在细胞培养皿中，然后加入从HepG2细胞培养上清中分离的exosome，随后检测CD4⁺Tcell细胞中anti-miR-214的含量。具体结果见图11。图11显示CD4⁺T cell细胞中anti-miR-214的C_T值和表达水平。图11A显示anti-miR-214的C_T值；图11B显示anti-miR-214的表达水平。结果发现exosome可以有效地将anti-miR-214带入CD4⁺T细胞。

随后测定了CD4⁺T cell细胞中miR-214的含量，具体结果见图12。图12显示CD4⁺Tcell细胞中miR-214的相对表达水平和PTEN的蛋白水平。图12A显示CD4⁺T cell细胞中miR-214的相对表达水平；图12B显示PTEN的蛋白水平。结果发现加了含有anti-miR-214exosome的CD4⁺T cell细胞中miR-214的含量显著下降，并且能够提高miR-214靶基因PTEN的蛋白含量。

随后利用流式细胞仪检测了CD4⁺T cell诱导Treg的比率，具体结果见图13。图13显示Treg的比率和细胞因子的表达水平。图13A显示Treg的比率；图13B显示细胞因子的表达水平。结果显示，加了含有anti-miR-214exosome的CD4⁺T cell细胞的Treg诱导率显著下降，并且Treg释放的IL-10也发生了显著下降。

实施例7：Anti-miR-214对小鼠Lewis肺癌治疗作用研究

通过C57BL/6小鼠在体肿瘤造模，Anti-miR-214静脉给药对小鼠Lewis肺癌的治疗作用，为后续研究提供参考。

收集对数生长期的LCC肿瘤细胞，按1×10⁶/鼠通过尾静脉注射建立原位Lewis肺癌模型。成模后，静脉注射给予系列浓度的Anti-miR-214，并观察给药期动物生活状况。给药结束后，取肺脏进行病理切片检查，观察肺肿瘤严重程度及Anti-miR-214治疗效果。

1.试验材料与方法

1.1试验材料

受试化合物：Anti-miR-214，含量：6.4mg/ml，由南京大学生命科学学院提供。试验时用注射用生理盐水稀释成所需浓度。

LCC细胞系：由南京大学生命科学学院提供。DMEM为Hyclone公司产品。胎牛血清为Gibco公司产品。试验时，LCC细胞系用含10％FBS、100ug/ml青霉素和100ug/ml链霉素的DMEM完全培养基于37℃、5％CO₂培养箱中培养。

动物：C57BL/6小鼠40只，雌雄各半，6周龄，由扬州大学实验动物中心提供，合格证号：SCXK(苏)2007-0001。

1.2试验方法

将培养至对数生长期的LCC细胞用胰酶消化后，1000rpm离心，弃上清，用无菌生理盐水洗涤两次，将细胞悬浮于生理盐水中，台盼蓝染色观察细胞活力，并进行细胞计数，调整细胞密度为5×10⁶/ml。试验时，取健康C57BL/6鼠，按0.2ml/只尾静脉缓慢注射，注射结束后，将所有造模小鼠分为Group 1：尾静脉缓慢注射PBS(阴性对照组)；Group 2：尾静脉缓慢注射control plasmid(5mg/kg)；Group 3：尾静脉缓慢注射anti-miR-214plasmid(5mg/kg)；Group 4：尾静脉缓慢注射anti-miR-214 plasmid(0.5mg/kg)；Group 5：尾静脉缓慢注射anti-miR-214 plasmid(0.05mg/kg)。此外另取一组正常小鼠作为正常对照(Normal)。造模期间，定期观察C57BL/6小鼠的精神、饮食、排便、体重和活动等情况。第14天开始，按0.1ml/10g体重尾静脉注射给药，对照组给予相应的生理盐水。给药期间，每3天给药一次，共7次。末次给药后第3天，小鼠乙醚麻醉，取血、肺及肝脏。将肺、肝脏放10％福尔马林中，做病理切片，观察肺癌成模情况及Anti-miR-214对肺癌治疗情况。

肺部肿瘤病理切片及评分

对所有肺组织进行病理切片观察。根据肉眼大体观察状况，取3个不同病变部位进行切片，根据肺部成瘤情况及严重程度，分为“-”表示镜下未见肿瘤灶；“±”表示轻微肿瘤灶；“+”表示轻度肿瘤灶；“++”表示中度肿瘤灶；“+++”表示重度肿瘤灶，并相应评分为0-4分。

1.3统计学处理

所有计量资料采用

表示。采用SPSS 16.0软件包进行统计学分析处理，多组间比较采用方差分析F检验，组间比较采用成组t检验，P＜0.05为具有统计学意义。

2.结果

2.1造模及给药期间动物一般状况观察

造模期间，所有动物生活状态良好，未见竖毛、目光呆滞、呼吸异常、活动迟缓、粪便异常等不良反应。造模后两周期间，动物体重均有增加，但与造模前相比无统计学差异(P＞0.05)。给药期间，各给药组所有动物均未见药物引起的异常反应。结果见下图14。图14显示anti-miR-214 plasmid对荷瘤鼠体重影响。从结果可以看出，给药期间，所有动物体重均出现不同程度的增加。

2.2 anti-miR-214 plasmid对小鼠Lewis肺癌治疗作用

C57BL/6小鼠Lewis肺癌造模2w后静脉注射给予anti-miR-214 plasmid治疗，给药期间，每3天一次，于末次给药后的第3天处死动物，采血、肺脏，肝脏及各个组织器官。利用qRT-PCR检测各个组织器官中anti-miR-214的含量。具体结果见图15。图15显示anti-miR-214的C_T值和表达水平。图15A显示anti-miR-214的C_T值；图15B显示anti-miR-214的表达水平。由测定结果可以看出，anti-miR-214进入了除脑和骨骼肌之外的诸如肝脏，肺等其他组织和器官，尤其是能够被运输入CD4⁺T cell。

随后检测个各个组织器官中miRNA的表达水平，具体结果见图16。图16显示miR-214的表达水平。实验结果提示anti-miR-214显著降低了肝脏，肺等组织器官内miR-214的水平，尤其是显著降低了CD4⁺T cell内miR-214的水平。

利用Miltenyi Biotec公司的CD4⁺T cell Isolation Kit分离小鼠的CD4⁺T cell，然后提取蛋白，利用western blotting实验检测各组CD4⁺T cell内PTEN蛋白的表达水平，具体结果见图17。图17显示各组CD4⁺T cell内PTEN蛋白的表达水平。图17A显示各组CD4⁺Tcell内PTEN蛋白的western blotting结果；图17B是图17A对应的各组CD4⁺T cell内PTEN蛋白的表达水平。实验结果发现anti-miR-214 plasmid可以显著提高CD4⁺T cell内PTEN蛋白，并成剂量依赖。

利用流式细胞仪测定各组小鼠血液中Treg含量，具体结果见图18。图18显示各组小鼠血液中Treg含量。结果发现，不给治疗的肺癌组小鼠(Group 1和Group 2)Treg显著上升，而给予anti-miR-214 plasmid治疗的肺癌组小鼠(Group 3，Group 4和Group 5)Treg显著下降，Group 5的Treg水平甚至恢复到正常水平。

除了检测分子指标外，其余肺脏与肝脏用福尔马林固定，进行组织病理切片检查该脏器肿瘤状况。具体结果见图19。图19显示各组肿瘤组织病理切片结果。结果表明：所有各组肝脏切片未见有肿瘤灶。在肺部，各治疗组可见不同程度的片状核大深染的肿瘤细胞聚集灶。

各给药组中，大剂量即Group 5对在体Lewis肺癌有很好的治疗作用，其分值与严重程度均较对照组轻，光镜下未见肿瘤灶个体鼠数也多于对照组；中剂量组Group4和小剂量Group3组对原位Lewis肺癌亦有一定的治疗作用，结果见下图20。图20显示各给药组对Lewis肺癌的治疗作用结果图。图20A显示肺癌评分；图20B显示肺癌严重度评分。肺癌评分指肺癌综合评分，包括肿瘤大小，分布等；肺癌严重度评分特指肺癌在肺内站位的程度，也就是肺癌对于小鼠肺呼吸功能的影响程度评分。

3.结论

给药期间，所有动物生活状况良好，未见与用药相关的异常反应，且给药组动物体重明显增加，与造模或给药前相比，有显著差异(P＜0.05)。病理切片表明，各给药组肿瘤严重程度均较对照组有所减轻，Anti-miR-214在5mg/kg时抑瘤作用明显。

Anti-miR-214对在体小鼠Lewis肺癌有一定剂量依赖性的治疗作用，其中浓度到达5mg/kg治疗作用最明显，给药期间未见与用药相关的异常反应。

实施例8、临床实验

给乳腺癌转移终末期的志愿者注射anti-miR-214质粒，每周两次点滴，每次1mg。在开始用药一个月后检测志愿者的各项指标。

(1)anti-miR-214检测

具体结果见图21。从图21可以看出，肿瘤末期志愿者注射质粒后(治疗后)，肿瘤末期志愿者血细胞和血浆中都能够检测到高含量的anti-miR-214，这充分说明通过静脉注射anti-miR-214质粒，确实可以在体内高表达anti-miR-214。

(2)血清中miR-214结果

图22显示了血清中miR-214的表达水平。从图22可以看出，注射质粒后，志愿者患者血清中miR-214相比于治疗前显著下降，几乎降至和正常人相当的水平，这不仅提示了注射anti-miR-214质粒可以在体内表达，而且还具有功能，能够吸附体内miR-214，从而使它的表达水平显著下降。

(3)肿瘤的变化情况

注射anti-miR-214质粒后，乳腺癌转移终末期志愿者的情况得到一定改善，肿瘤大小、体积没有变化，肿瘤没有发生转移，由此可见，miR-214抑制剂对肿瘤生长有抑制作用，miR-214抑制剂可用于肿瘤治疗。

实施例9前体miRNA适用于其他过表达载体

前体miRNA结构插入表达载体pcDNA3，构建的表达模块，同样有效的避免了有些内源miRNA表达时产生-3p，-5p的问题。pcDNA3图谱结构如图23所示。

1.anti-miR-214-5p序列

＞anti-miR-214-5p

5’-ACUGCCUGUCUGUGCCUGCUGU-3’(SEQ ID NO.：2)

2.anti-miR-214载体

2.1.Oligo DNA的设计与合成

根据anti-miR-214设计并合成2对互补oligo DNA如实施例1中的2.1所述，即前体miRNA的结构。

2.2 miRNA载体的构建与验证

具体操作步骤如实施例1中的2.2所述。过表达anti-miR-214的效率验证方法同实施例2。表6显示了利用Real-time PCR对anti-miRNA和miRNA表达水平进行测定。

表6、anti-miR-214-5p、anti-miR-214-3p、miR-214的表达水平

(Ct)	anti-miR-214-5p
		空白质粒	38.25±0.2564
anti-miR-214质粒	25.43±0.5123

(Ct)	anti-miR-214-3p
		空白质粒	31.25±0.4585
anti-miR-214质粒	32.89±0.6245

(Ct)	miR-214
		空白质粒	21.03±0.5874
anti-miR-214质粒	24.08±0.1254

结论：在A549细胞中转染前体miRNA构建的其他过表达载体质粒后，能检测到anti-miR-214-5p的急剧上升(p＜0.01)，检测不到anti-miR-214-3p，且不会引起miR-214的上升，相反会导致miR-214下降(p＜0.05)。前体miRNA结构插入其他表达载体，同样有效的避免了有些内源miRNA表达时产生-3p，-5p的问题。

对比例1

利用anti-miR-214构建与本发明不同的前体miRNA，将所构建的前体miRNA插入与本发明相同的载体pcDNA^TM 6.2。在A549细胞中转染anti-miR-214质粒，统一总RNA后分别利用从ABI公司定制的anti-miR-214-5p，anti-miR-214-3p，miR-214的引物q-PCR检测anti-miR-214-5p、anti-miR-214-3p、miR-214的水平。

1.anti-miR-214-5p序列

＞anti-miR-214-5p

5’-ACUGCCUGUCUGUGCCUGCUGU-3’(SEQ ID NO：2)

2.anti-miR-214载体

2.1.Oligo DNA的设计与合成

根据基因序列设计并合成2对互补oligo DNA，序列见表7。

设计合成的oligo结构如下：

表7、oligo DNA序列及其对应的前体miRNA元件

2.2 miRNA载体的构建与验证

具体操作步骤如实施例1中的2.2所述。结果见表8。

表8、anti-miR-214-5p、anti-miR-214-3p、miR-214的表达水平

(Ct)	anti-miR-214-5p
		空白质粒	35.92±0.1545
anti-miR-214质粒	26.45±0.1535

(Ct)	anti-miR-214-3p
		空白质粒	32.12±0.1657
anti-miR-214质粒	25.48±0.1456

(Ct)	miR-214
		空白质粒	21.26±0.5652
anti-miR-214质粒	21.43±0.4586

从表8可以看出，在A549细胞中转染与本发明不同的前体miRNA质粒后，虽然能检测到anti-miR-214-5p的急剧上升(p＜0.05)，但是anti-miR-214-3p表达水平也非常高(p＜0.05)，且miR-214水平没有发生显著改变。这是因为与本发明不同的前体miRNA质粒不仅能够表达anti-miR-214-5p，也能够表达anti-miR-214-3p，由于竞争性结合，大量的anti-miR-214-5p被anti-miR-214-3p吸附，从而不能降低miR-214的表达水平。

实施例10

重复实施例1和2，不同在于：将A2的结构从CAGG改为CAGGA。

结果表明，将A2的结构从CAGG改为CAGGA，F5/F3之比进一步上升了约50％。这表明，采用CAGGA更有助于提高F5/F3之比。

实施例11前体序列有效表达KRAS siRNA，并对癌症有治疗作用

1表达载体构建

根据生物安全性原因，首先对质粒进行改造。通过DNA限制性内切酶，切除EmGFP和Blasticidin等具有生物毒性的元件。图24所示的是改造前的质粒，切除EmGFP和Blasticidin后的质粒与实施例1改造后的质粒相同。

其中pCMV代表真核启动子，pUC ori代表在原核核细胞内质粒的复制起始位点，该起始位点不表达插入序列，Spectinomycin表示壮观霉素抗性基因，用于质粒的筛选。

表达载体构建过程与实施例1相同，不同的是，根据K-RAS基因序列设计并合成互补oligo DNA，K-RAS siRNA序列：5’-GGTGACTTAGGTTCTAGAT-3’，序列见表9。

表9、oligo DNA序列及其对应的前体siRNA元件

2 K-RAS siRNA对小鼠Lewis肺癌的治疗作用

具体试验材料与方法参照实施例2，所不同的是，受试化合物：K-RAS siRNA质粒，由南京大学生命科学学院提供。

C57BL/6小鼠Lewis肺癌造模两周后静脉注射给予K-RAS siRNA plasmid治疗，给药期间，每3天一次，于末次给药后的第3天处死动物，采血、肺脏，肝脏及各个组织器官。利用qRT-PCR检测各个组织器官中K-RAS siRNA的含量。图25所示的是各个组织器官中K-RASsiRNA含量的CT值，图25中每组柱状图从左到右依次为Normal、PBS、control plasmid、EGFRsiRNA plasmid，由测定结果可以看出，K-RAS siRNA进入了除脑和骨骼肌之外的诸如肝脏、肺等其他组织和器官。

图26所示的是肺中K-RAS mRNA的表达水平，结果显示K-RAS siRNA显著降低了肺组织器官内K-RAS的mRNA水平。

图27、图28所示的是提取肺组织蛋白后，利用western blotting实验检测肺组织内K-RAS蛋白的表达水平。

除检测分子指标外，其余肺脏与肝脏用福尔马林固定，进行组织病理切片检查该脏器肿瘤状况。病理切片结果见图29，其中所有各组肝脏切片未见有肿瘤灶。在肺部，各治疗组可见不同程度的片状核大深染的肿瘤细胞聚集灶。

上述结果显示K-RAS siRNA质粒可以显著降低肺内肿瘤组织的K-RAS蛋白表达水平。

3 K-RAS siRNA plasmid对小鼠结肠癌的治疗作用

结肠癌细胞株：小鼠结肠癌细胞CT-26(BALB/c来源，H-2Kd)：由南京大学生命科学学院提供。

建模实验动物：BALB/c小鼠，雌性，6-7周龄，由南京大学模式动物所提供。

动物模型建立：BALB/c小鼠为肿瘤CT-26细胞株同种系动物。将复苏后的CT-26传代培养。待细胞长至一定量时，取对数生长期的细胞加入0.9％生理盐水调整细胞浓度为5×10⁶/ml，按每只小鼠0.2ml的剂量(约1×10⁶cells/只)，将肿瘤细胞接种于小鼠右侧腋部皮下，接种后普通饮食饲养。

1周后15只BALB/c荷瘤小鼠腋部均可见肿瘤长出，即造模成功。选取15只，随机分为：

1组：左侧腋部皮下注射PBS(阴性对照组)；

2组：左侧腋部皮下注射control plasmid(5mg/kg)；

3组：左侧腋部皮下注射K-RAS siRNA plasmid(5mg/kg)。

此外另取一组正常小鼠作为正常对照(Normal)。

造模期间，定期观察BALB/c荷瘤小鼠的生活情况、肿瘤大小与外观。第8天开始给药，按0.1ml/10g体重尾静脉注射给药，对照组给予相应的生理盐水。给药期间，每3天给药一次，共7次。末次给药后第3天，脊椎脱臼法处死全部小鼠，于肿瘤生长部位迅速切开皮肤，将肿瘤完整切除。

随后验证K-RAS siRNA plasmid对小鼠结肠癌的治疗作用。

K-RAS siRNA plasmid对小鼠结肠癌皮下移植瘤体积的影响

用游标卡尺测量肿瘤的长径(a)和短径(b)，计算肿瘤体积V(mm³)：＝1/6πab²。测量后，10％甲醛固定。

计算抑瘤率：抑瘤率(％)＝(对照组V-实验组V)/对照组V×100％。

相较于1组和2组的肿瘤体积，3组体积明显较小(P＜0.05)，如下表10所示。

表10不同组别的实验小鼠的肿瘤体积和抑瘤率

*相对于2组，^#相对于1组

利用qRT-PCR检测移植瘤中K-RAS siRNA的含量，结果显示K-RAS siRNA进入了移植瘤。

随后我们检测各移植瘤中K-RAS mRNA的表达水平，实验结果显示(图30)K-RASsiRNA plasmid显著降低了移植瘤中K-RAS的mRNA水平。

提取肿瘤组织蛋白，利用western blotting实验检测肿瘤组织内K-RAS蛋白的表达水平，实验结果(如图31)发现K-RAS siRNA plasmid可以显著降低肿瘤组织的K-RAS蛋白。

K-RAS siRNA plasmid对在体结肠癌有治疗作用，给药期间未见与用药相关的异常反应。

4 K-RAS siRNA plasmid对小鼠胰腺癌的治疗作用

PATU8988人胰腺癌细胞系由ATCC提供。

RPMI-1640完全培养基、胎牛血清由GIBCO提供。试验时，将人胰腺癌细胞株放入含10％的RPMI-1640完全培养基中，置于37℃、5％CO₂培养箱中，每2d换液1次，2～3d，0.25％的胰酶消化，一传三传代培养。

试验动物为裸小鼠BALB/c(nu/nu)15只，雌雄各半，6周龄，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。

待人胰腺癌细胞布满瓶底时，收集单细胞悬液，每只5×106肿瘤细胞，0.2ml，胰腺原位注射胰腺癌细胞，建立肿瘤模型。

将胰腺癌小鼠随机分为三组：

组1：尾静脉缓慢注射PBS(阴性对照组)；

组2：尾静脉缓慢注射对照质粒(5mg/kg)；

组3：尾静脉缓慢注射K-RAS siRNA质粒(5mg/kg)。

此外另取一组正常小鼠作为正常对照。造模期间，定期观察裸小鼠BALB/c(nu/nu)的精神、饮食、排便、体重和活动等情况。第14天开始给药，按0.1ml/10g体重尾静脉注射给药，对照组给予相应的生理盐水。给药期间，每3天给药一次，共7次。末次给药后第3天，小鼠乙醚麻醉，取血、胰脏及肝脏。将胰脏、肝脏放10％福尔马林中，做病理切片，观察胰腺癌成模情况及K-RAS siRNA质粒对胰腺癌治疗情况。

BALB/c(nu/nu)小鼠人胰腺癌造模两周后静脉注射给予K-RAS siRNA plasmid治疗，给药期间，每3天一次，于末次给药后的第3天处死动物，取血、胰脏及肝脏。

随后检测植瘤中K-RAS mRNA的表达水平，实验结果显示(图32)K-RAS siRNAplasmid显著降低了移植瘤中K-RAS的mRNA水平。

提取肿瘤组织蛋白，利用western blotting实验检测肿瘤组织内K-RAS蛋白的表达水平，实验结果(如图33)发现K-RAS siRNA plasmid可以显著降低肿瘤组织的K-RAS蛋白。病理切片结果见图34，其中所有各组肝脏切片未见有肿瘤灶。在胰脏，各治疗组可见不同程度的片状核大深染的肿瘤细胞聚集灶。

5 更多K-RAS siRNA序列的设计及验证

本实施例进一步针对K-RAS基因的多个位点设计了多达260条可能的siRNA序列，详见表11。并从上述siRNA序列中，进一步通过筛选出了10条稳定性优异、且特异性抑制作用明显的siRNA序列进行表达验证，该10条siRNA在表11中的序号分别为3、26、41、47、52、73、88、98、101和106号。

分别使用实施例1中的表达载体构建方法及实施例2中的验证方法验证K-RASmRNA及蛋白表达水平。

图35所示的是肺中K-RAS mRNA的表达水平，结果显示筛选出的10条K-RAS siRNA构建的质粒都降低了肺组织器官内K-RAS的mRNA水平。

图36所示的是提取肺组织蛋白后，利用western blotting实验检测肺组织内K-RAS蛋白的表达水平。

上述结果显示筛选出的10条K-RAS siRNA构建的质粒可以显著降低肺内肿瘤组织的K-RAS蛋白表达水平。

表11 K-RAS siRNA的正义链序列

对比例2

选取美国专利US8008474 B2中抑制K-RAS表达的两条siRNA(命名为siRNA I和siRNA II)，

siRNA I：

正义链：5’-CGAAUAUGAUCCAACAAUA-3’；

反义链：5’-UAUUGUUGGAUCAUAUUCG-3’。

siRNA II：

正义链：5’-GAUGAUGCCUUCUAUACAU-3’；

反义链：5’-AUGUAUAGAAGGCAUCAUG-3’。

按实施例1的方式构建质粒载体，分别命名为siRNAI质粒和siRNAII质粒，按实施例2中的方法应用于小鼠Lewis肺癌模型，然后检测个肺中K-RAS mRNA的表达水平，实验结果显示(图37)示，本申请的K-RAS siRNA质粒相较于siRNA质粒I、siRNA质粒II更显著地降低了肺组织器官内K-RAS的mRNA水平，说明其抑制效果优于现有技术中抑制K-RAS的siRNA序列。

实施例12前体序列有效表达EGFR siRNA，并对癌症有治疗作用

1.EGFR siRNA过表达载体构建

表达载体构建过程与实施例1相同，不同的是，根据EGFR基因序列设计并合成2对互补oligo DNA，序列见表12。

表12、oligo DNA序列及其对应的前体siRNA元件

2.EGFR siRNA plasmid对小鼠Lewis肺癌的治疗作用

具体试验材料与方法参照实施例2，所不同的是，受试化合物：EGFR siRNA质粒，由南京大学生命科学学院提供。

C57BL/6小鼠Lewis肺癌造模2w后静脉注射给予EGFR siRNA plasmid治疗，给药期间，每3天一次，于末次给药后的第3天处死动物，采血、肺脏，肝脏及各个组织器官。利用qRT-PCR检测各个组织器官中EGFR siRNA的含量。由测定结果可以看出(图38所示，图38中每组柱状图从左到右依次为Normal、PBS、control plasmid、EGFR siRNA plasmid)，EGFRsiRNA进入了除脑和骨骼肌之外的诸如肝脏，肺等其他组织和器官。

随后检测肺中EGFR mRNA的表达水平，实验结果显示(图39)EGFR siRNA plasmid显著降低了肺组织器官内EGFR的mRNA水平。

提取肺组织蛋白，利用western blotting实验检测肺组织内EGFR蛋白的表达水平，实验结果(图40和图41)发现EGFR siRNA plasmid可以显著降低肺内肿瘤组织的EGFR蛋白。

除了检测分子指标外，其余肺脏与肝脏用福尔马林固定，进行组织病理切片检查该脏器肿瘤状况。病理切片结果表明：所有各组肝脏切片未见有肿瘤灶。在肺部，各治疗组可见不同程度的片状核大深染的肿瘤细胞聚集灶(结果如图42所示)。

EGFR siRNA plasmid对在体小鼠Lewis肺癌有治疗作用，给药期间未见与用药相关的异常反应。

3.EGFR siRNA plasmid对小鼠结肠癌的治疗作用

具体试验材料与方法参照实施例11，所不同的是，受试化合物：EGFR siRNA质粒，由南京大学生命科学学院提供。

EGFR siRNA plasmid对小鼠结肠癌皮下移植瘤体积的影响

相较于1组和2组的肿瘤体积，3组体积明显较小(P＜0.05)。

如下表13所示

表13不同组别的实验小鼠的肿瘤体积和抑瘤率

*相对于2组，^#相对于1组

利用qRT-PCR检测移植瘤中EGFR siRNA的含量，结果显示EGFR siRNA进入了移植瘤。

随后我们检测个移植瘤中EGFR mRNA的表达水平，实验结果显示(图43)EGFRsiRNA plasmid显著降低了移植瘤中EGFR的mRNA水平。

提取移植瘤组织蛋白，利用western blotting实验检测移植瘤组织内EGFR蛋白的表达水平，实验结果(如图44)发现EGFR siRNA plasmid可以显著降低移植瘤组织的EGFR蛋白。

EGFR siRNA plasmid对结肠癌有治疗作用，给药期间未见与用药相关的异常反应。

4.EGFR siRNA plasmid对小鼠胰腺癌的治疗作用

BALB/c小鼠胰腺癌造模两周后静脉注射给予EGFR siRNA plasmid治疗，给药期间，每3天一次，于末次给药后的第3天处死动物，采胰脏，利用qRT-PCR检测胰脏中EGFRsiRNA的含量，结果显示EGFR siRNA进入了胰脏中。

图45所示的是胰脏中EGFR mRNA的表达水平，结果显示EGFR siRNA显著降低了胰脏组织器官内EGFR的mRNA水平。

图46所示的是提取胰脏肿瘤组织蛋白后，利用western blotting实验检测胰脏组织内EGFR蛋白的表达水平。

上述结果显示EGFR siRNA质粒可以显著降低胰脏肿瘤组织的EGFR蛋白表达水平。

5 更多EGFR siRNA序列的设计及验证

本实施例进一步给出了针对EGFR基因的196条siRNA序列，详见表14。并从上述siRNA序列中进一步筛选出了10条稳定性优异、且特异性抑制作用明显的siRNA序列进行表达验证，该10条siRNA在表14中的序号分别为17、20、35、42、47、52、59、63、68和72号。

分别使用实施例1中的表达载体构建方法及实施例2中的验证方法验证EGFR mRNA及蛋白表达水平。

图47所示的是肺中EGFR mRNA的表达水平，结果显示筛选出的10条EGFR siRNA构建的质粒都降低了肺组织器官内EGFR的mRNA水平。

图48所示的是提取肺组织蛋白后，利用western blotting实验检测肺组织内EGFR蛋白的表达水平。

上述结果显示筛选出的10条EGFR siRNA构建的质粒可以显著降低肺内肿瘤组织的EGFR蛋白表达水平。

表14 EGFR siRNA的正义链序列

对比例3

将中国专利文献CN101353656中的抑制EGFR表达的siRNA(命名为siRNA I)和CN104232743A中的抑制EGFR表达的siRNA(命名为siRNA II)，

siRNA I：

正义链：5’-GGCUGGUUAUGUCCUCAUU-3’；

反义链：5’-AAUGAGGACAUAACCAGCC-3’。

siRNA II：

正义链：5’-CCAUAAAUGCUACGAAUAU-3’；

反义链：5’-AUAUUCGUAGCAUUUAUGG-3’。

按实施例1的方式构建质粒载体，分别命名为siRNA I plasmid和siRNA IIplasmid，实施例2中的方法应用于小鼠Lewis肺癌模型，然后检测个肺中EGFR mRNA的表达水平，实验结果显示(图49)示，本申请的EGFR siRNA plasmid相较于siRNA I plasmid、siRNA II plasmid很显著降低了肺组织器官内EGFR的mRNA水平。

实施例13前体序列有效表达PDCD1 siRNA、PDL1 siRNA，并对癌症有治疗作用

前体序列的第一核糖核酸序列包括siRNA序列形式，除了有效表达KRAS siRNA、EGFR siRNA外，还可以有效表达PDCD1 siRNA、PDL1 siRNA，并对癌症有治疗作用。

本实施例针对PDCD1基因位点设计了10条可能的siRNA序列，序列请见表15，重复实施例1中的表达载体构建方法，构建PDCD1 siRNA表达载体。

表15 PDCD1 siRNA的正义链序列

序列号

siRNA正义链

序列号

siRNA正义链

1

5’

CCCUGUGGUUCUAUUAUAU

3’

6

5’

GUUUCAGGGAAGGUCAGAA

3’

2

5’

CAGGCCUAGAGAAGUUUCA

3’

7

5’

CUAGAGAAGUUUCAGGGAA

3’

3

5’

CCAGGAUGGUUCUUAGACU

3’

8

5’

CUAAACUGGUACCGCAUGA

3’

4

5’

GCUUCGUGCUAAACUGGUA

3’

9

5’

CAUUUCCUCAGGAGAAGCA

3’

5

5’

GAGUAUGCCACCAUUGUCU

3’

10

5’

CAUUGUCUUUCCUAGCGGA

3’

本实施例针对PDL1基因位点设计了216条可能的siRNA序列，序列请见表16，从上述siRNA序列中进一步筛选出了10条稳定性优异、且特异性抑制作用明显的siRNA序列进行表达验证，该10条siRNA在表16中的序号分别为18、37、53、58、61、96、99、103、129和158号。

表16 PDL1 siRNA的正义链序列

重复实施例1中的表达载体构建方法，构建PDL1 siRNA表达载体。

利用构建的PDL1 siRNA、PDCD1 siRNA过表达载体进行体内抗肿瘤作用研究。

1.PDL1 siRNA、PDCD1 siRNA对肺癌的抑制作用

具体试验材料与方法参照实施例2，所不同的是，受试化合物：PDL1 siRNA质粒、PDCD1 siRNA质粒，由南京大学生命科学学院提供。

检测肺中PDL1、PDCD1 mRNA及蛋白表达水平。

图50显示肺中PDL1 mRNA的表达水平，结果显示筛选出的10条PDL1 siRNA构建的质粒都降低了肺组织器官内PDL1的mRNA水平。

图51显示提取肺组织蛋白后，利用western blotting实验检测肺组织内PDL1蛋白的表达水平。上述结果显示筛选出的10条PDL1 siRNA构建的质粒可以显著降低肺内肿瘤组织的PDL1蛋白表达水平。

图52显示肺中PDCD1 mRNA的表达水平，结果显示筛选出的10条PDCD1 siRNA构建的质粒都降低了肺组织器官内PDCD1的mRNA水平。

图53显示提取肺组织蛋白后，利用western blotting实验检测肺组织内PDCD1蛋白的表达水平。上述结果显示筛选出的10条PDCD1 siRNA构建的质粒可以显著降低肺内肿瘤组织的PDCD1蛋白表达水平。

PDL1 siRNA质粒、PDCD1 siRNA质粒对肺癌有治疗作用，给药期间未见与用药相关的异常反应。

2.PDL1 siRNA、PDCD1 siRNA对黑色素瘤的抑制作用

受试化合物：PDL1 siRNA plasmid、PDCD1 siRNA plasmid，由南京大学生命科学学院提供。试验时用注射用生理盐水稀释成所需浓度。control plasmid由南京大学生命科学学院提供。试验时用注射用生理盐水稀释成所需浓度。

细胞株：B16小鼠黑色素瘤细胞株，由南京大学生命科学学院提供。

建模实验动物：C57BL/6小鼠，雄性，5-6周龄，由南京大学模式动物所提供。

动物模型建立：取对数生长期的细胞，Versene消化后培养基重悬收集细胞。用无菌生理盐水调整细胞浓度备用，乙醚麻醉小鼠3-5s，75％酒精消毒小鼠前肢腋下皮肤，取已经调好浓度的B16小鼠黑色素瘤细胞接种于小鼠前肢腋部皮下。按每只小鼠0.2ml的剂量，接种后普通饮食饲养。

1周后B16小鼠荷瘤小鼠腋部均可见肿瘤长出，即造模成功。

选取20只，将黑色素瘤小鼠随机分为四组：

组1：左侧腋部皮下注射PBS(阴性对照组)；

组2：左侧腋部皮下注射对照质粒(5mg/kg)；

组3：左侧腋部皮下注射PDL1 siRNA质粒(5mg/kg)；

组3：左侧腋部皮下注射PDCD1 siRNA质粒(5mg/kg)；

此外另取一组正常小鼠作为正常对照。造模期间，定期观察荷瘤小鼠的生活情况、肿瘤大小与外观。第14天开始给药，按0.1ml/10g体重尾静脉注射给药，对照组给予相应的生理盐水。给药期间，每3天给药一次，共7次。末次给药后第3天，小鼠乙醚麻醉，于肿瘤生长部位迅速切开皮肤，将肿瘤完整切除。

参照实施例2检测移植瘤中PDL1、PDCD1的mRNA及蛋白水平。

图54显示黑色素移植瘤中PDL1 mRNA的表达水平，结果显示筛选出的10条PDL1siRNA构建的质粒都降低了黑色素移植瘤中PDL1的mRNA水平。

图55显示提取移植瘤组织蛋白，利用western blotting实验检测移植瘤组织内PDL1蛋白的表达水平，上述结果显示筛选出的10条PDL1 siRNA构建的质粒可以显著降低黑色素移植瘤中PDL1蛋白表达水平。

图56显示黑色素移植瘤中PDCD1 mRNA的表达水平，结果显示筛选出的10条PDCD1siRNA构建的质粒都降低了黑色素移植瘤中PDCD1的mRNA水平。

图57显示提取移植瘤组织蛋白，利用western blotting实验检测肺组织内PDCD1蛋白的表达水平。上述结果显示筛选出的10条PDCD1 siRNA构建的质粒可以显著降低黑色素移植瘤中PDCD1蛋白表达水平。

PDL1 siRNA质粒、PDCD1 siRNA质粒对黑色素瘤有治疗作用，给药期间未见与用药相关的异常反应。

PDL1 siRNA、PDCD1 siRNA可有效阻断PDL1/PDCD1通路，有效抑制肿瘤生长。同样，PDL1 siRNA与PDCD1 siRNA联合使用对肿瘤有更好的抑制作用，可抑制非小细胞肺癌、黑色素瘤、乳腺癌、胃癌、肠癌、食管癌、卵巢癌、宫颈癌、胰腺癌、肾癌、膀胱癌等，干预PD-1/PD-L1信号将成为肿瘤免疫治疗的新策略。

实施例14前体序列有效表达ALK siRNA，并对癌症有治疗作用

前体序列还可以有效表达ALK siRNA，并对癌症有治疗作用。

本实施例针对ALK基因位点设计了121条可能的siRNA序列，序列请见表17，从上述siRNA序列中进一步筛选出了10条稳定性优异、且特异性抑制作用明显的siRNA序列进行表达验证，该10条siRNA在表17中的序号分别为6、11、16、19、23、27、30、32、40和41号。

表17 ALK siRNA的正义链序列

重复实施例1中的表达载体构建方法，构建ALK siRNA表达载体。

利用构建的ALK siRNA过表达载体进行体内抗肿瘤作用研究。

具体试验材料与方法参照实施例2，所不同的是，受试化合物：ALK siRNA质粒，由南京大学生命科学学院提供。

检测肺中ALK mRNA及蛋白表达水平。

图58显示ALK mRNA的表达水平，结果显示筛选出的10条ALK siRNA构建的质粒都降低了肺组织器官内ALK的mRNA水平。

图59显示提取肺组织蛋白后，利用western blotting实验检测肺组织内ALK蛋白的表达水平。上述结果显示筛选出的10条ALK siRNA构建的质粒可以显著降低肺内肿瘤组织的ALK蛋白表达水平。

ALK siRNA质粒对肺癌有治疗作用，给药期间未见与用药相关的异常反应。

实施例15前体序列有效表达IDO1 siRNA

前体序列还可以有效表达IDO1 siRNA，并对癌症有治疗作用。

本实施例针对IDO1基因位点设计了107条可能的siRNA序列，序列请见表18，从上述siRNA序列中进一步筛选出了10条稳定性优异、且特异性抑制作用明显的siRNA序列进行表达验证，该10条siRNA在表18中的序号分别为2、4、8、9、11、13、26、28、29和47号。

表18 IDO1 siRNA的正义链序列

重复实施例1中的表达载体构建方法，构建IDO1 siRNA表达载体。

利用构建的IDO1 siRNA过表达载体进行体内抗肿瘤作用研究，观察该品对肺癌、结直肠癌、胰腺癌的抑制作用。

1.IDO1 siRNA对肺癌有抑制作用

具体试验材料与方法参照实施例2，所不同的是，受试化合物：IDO1 siRNA质粒，由南京大学生命科学学院提供。

检测肺中IDO1 mRNA及蛋白表达水平。

图60显示IDO1 mRNA的表达水平，结果显示筛选出的10条IDO1 siRNA构建的质粒都降低了肺组织器官内IDO1的mRNA水平。

图61显示提取肺组织蛋白后，利用western blotting实验检测肺组织内IDO1蛋白的表达水平。上述结果显示筛选出的10条IDO1 siRNA构建的质粒可以显著降低肺内肿瘤组织的IDO1蛋白表达水平。

IDO1 siRNA质粒对肺癌有治疗作用，给药期间未见与用药相关的异常反应。

2.IDO1 siRNA对结直肠癌有抑制作用

具体试验材料与方法参照实施例11，所不同的是，受试化合物：IDO1 siRNA质粒，由南京大学生命科学学院提供。

检测移植瘤中IDO1 mRNA和蛋白的表达水平。

图62显示结直肠癌移植瘤中IDO1 mRNA的表达水平，结果显示IDO1 siRNA质粒显著降低了移植瘤中IDO1的mRNA水平。

图63显示提取结直肠癌移植瘤组织蛋白，利用western blotting实验检测移植瘤组织内IDO1蛋白的表达水平，上述结果显示IDO1 siRNA plasmid可以显著降低移植瘤组织的IDO1蛋白。

IDO1 siRNA plasmid对结肠癌有治疗作用，给药期间未见与用药相关的异常反应。

3.IDO1siRNA对胰腺癌有抑制作用

检测胰脏中IDO1 mRNA和蛋白的表达水平。

图64显示胰脏中IDO1 mRNA的表达水平，结果显示IDO1 siRNA质粒显著降低了胰脏中IDO1的mRNA水平。

图65显示提取胰脏组织蛋白，利用western blotting实验检测胰脏组织内IDO1蛋白的表达水平，上述结果显示IDO1 siRNA plasmid可以显著降低胰脏组织的IDO1蛋白。

IDO1 siRNA plasmid对胰腺癌有治疗作用，给药期间未见与用药相关的异常反应。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

1.一种药物制剂，其特征在于，所述的制剂含有：

(a)用于表达anti-miRNA和/或siRNA的表达载体；以及

(b)药学上可接受的载体；且所述的表达载体表达前体序列，且所述的前体序列5’至3’端具有式I所示的结构：

，式I，

B2为与B1基本互补或完全互补的序列，且B2与C不互补；其中，所述的基本互补指所述B2与B1有2-8个碱基不互补；

C为SEQ ID NO.: 1所示的序列；

所述的A1为UGCUG，且所述的A2为CAGG或CAGGA；

其中，所述前体能在宿主中表达所述的第一核糖核酸序列，而不表达与所述第一核糖核酸序列互补的第二核糖核酸序列；

且所述的第一核糖核酸序列为GGUGACUUAGGUUCUAGAU。

2.一种前体序列，其特征在于，其5’至3’端具有式I所示的结构：

，式I，

C为SEQ ID NO.: 1所示的序列；

所述的A1为UGCUG，且所述的A2为CAGG或CAGGA；

且所述的第一核糖核酸序列为GGUGACUUAGGUUCUAGAU。

3.如权利要求2所述的前体序列，其特征在于，所述的基本互补指所述B2与B1有3-5个碱基不互补。

4.如权利要求2所述的前体序列，其特征在于，所述的B2较B1缺失1-2个碱基。

5.一种多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸能被宿主转录形成权利要求2中所述的前体序列。

6.一种表达载体，其特征在于，所述的表达载体含有权利要求2所述的前体序列或权利要求5所述的多核苷酸。

7.一种药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物含有权利要求2所述的前体序列、或权利要求6所述的表达载体，和药学上可接受的载体。

8.如权利要求7所述的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物为权利要求6所述的表达载体；和/或

所述药物组合物的剂型包括片剂、胶囊剂、粉剂、丸剂、颗粒剂、糖浆剂、溶液、混悬液、乳剂。

9.如权利要求7所述的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物为含有权利要求2所述前体序列的质粒；和/或

所述药物组合物的剂型选自下组：注射液、或粉针剂。

10.如权利要求7所述的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物的施用方法包括：口服、呼吸道、注射、透皮、粘膜给药。

11.如权利要求7所述的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物的施用方法为腔道给药。

12.权利要求2所述前体序列、或权利要求6所述表达载体的用途，其特征在于，(i) 用于制备抗K-RAS的RNA的抑制剂；和/或(ii) 用于制备抗K-RAS蛋白高表达恶性肿瘤的药物组合物。

13.如权利要求12所述的用途，其特征在于，所述的恶性肿瘤为肺癌、结肠癌、或胰腺癌。