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CN107921145A - Ksp抑制剂与抗‑tweakr抗体的抗体药物缀合物（adc） - Google Patents

Ksp抑制剂与抗‑tweakr抗体的抗体药物缀合物（adc） Download PDF

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CN107921145A CN201680046802.3A CN201680046802A CN107921145A CN 107921145 A CN107921145 A CN 107921145A CN 201680046802 A CN201680046802 A CN 201680046802A CN 107921145 A CN107921145 A CN 107921145A
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represent
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S·马希
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C·马勒特
S·格利文
A·萨默
S·伯恩特
L·迪茨
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Abstract

本申请涉及新的结合体药物缀合物(ADC)、这些ADC的活性代谢物、制备这些ADC的方法、这些ADC用于治疗和/或预防疾病的用途以及这些ADC用于制备用于治疗和/或预防疾病——特别是过度增殖性疾病和/或血管原性疾病，例如癌症——的药物的用途。所述治疗可作为单一疗法起作用或与其他药物或其他治疗措施相结合。

Description

KSP抑制剂与抗-TWEAKR抗体的抗体药物缀合物(ADC)
技术领域
本发明涉及纺锤体驱动蛋白抑制剂的结合体药物缀合物(ADC)、这些ADC的活性代谢物、制备这些ADC的方法、这些ADC用于治疗和/或预防疾病的用途及这些ADC用于制备用于治疗和/或预防疾病——特别是过增生性疾病和/或血管原性疾病例如癌症——的药物的用途。这些治疗可以单一疗法的形式或者与其他药物或或其他治疗措施相结合进行。
背景技术
癌症是大多数不同组织的不受控的细胞生长的结果。在许多情况下，新的细胞渗透至现有组织中(侵袭性生长)或它们转移至远离的器官中。癌症发生在多种多样的不同器官中并通常具有组织特异性病程。因此术语“癌症”作为通用术语描述一大类不同器官、组织和细胞类型的确定的疾病。
一些肿瘤在早期可通过手术和放射治疗措施而除去。转移的肿瘤通常只能通过化疗药物而姑息治疗。本文的目标是获得生命质量改善和生命延长的最佳结合。
结合体蛋白与一个或更多个活性化合物分子的缀合物的是已知的，特别是以抗体药物缀合物(ADC)的形式，在所述抗体药物缀合物(ADC)中针对肿瘤相关抗原的内嵌抗体通过接头共价连接至细胞毒性剂。在将ADC引入至肿瘤细胞中以及随后的缀合物解离后，细胞毒性剂本身或由其形成的细胞毒性代谢物在肿瘤细胞内释放并可在其中直接地选择性地发挥其作用。以此方式，与传统化学疗法相比，对正常组织的损伤被局限于明显更窄的范围内[参见，例如，J.M.Lambert，Curr.Opin.Pharmacol.5，543-549(2005)；A.M.Wu和P.D.Senter，Nat.Biotechnol.23，1137-1146(2005)；P.D.Senter，Curr.Opin.Chem.Biol.13，235-244(2009)；L.Ducry和B.Stump，Bioconjugate Chem.21，5-13(2010)]。因此，WO2012/171020描述了其中多个毒簇分子经聚合的接头连接至抗体上的ADC。作为可能的毒簇，WO2012/171020尤其提到物质SB 743921、SB 715992(Ispinesib)、MK-0371、AZD8477、AZ3146和ARRY-520。
最后提到的物质是纺锤体驱动蛋白抑制剂。纺锤体驱动蛋白(KSP，也称作Eg5、HsEg5、KNSL1或KIF11)是双极有丝分裂纺锤体发挥作用所必需的类似驱动蛋白的动力蛋白。KSP的抑制导致有丝分裂阻滞并经较长时间导致细胞凋亡(Tao等，Cancer Cell 2005Jul 8(1)，39-59)。在发现第一个可透过细胞的KSP抑制剂Monastrol后，KSP抑制剂本身已被确立为一类新型化疗药物(Mayer等人，Science 286：971-974，1999)，且已成为许多专利申请的主题(例如WO2006/044825；WO2006/002236；WO2005/051922；WO2006/060737；WO03/060064；WO03/040979；WO03/049527)。然而，由于KSP仅在分裂期期间在较短时期内是有活性的，因此KSP抑制剂在这些时期期间必须以足够高的浓度存在。WO2014/151030公开了包含某些KSP抑制剂的ADC。
发明内容
在这一背景下，本发明的一个目的是提供在以相对低的浓度给药后可呈现细胞凋亡作用并因此有益于癌症治疗的物质。
为实现该目的，本发明提供了发挥适度的激动作用或非激动作用的抗-TWEAKR抗体(例如源自鼠的ITEM-4抗体)和该抗体的嵌合的或人源化的变体与下式(I)化合物的缀合物，其中一个或更多个式(I)化合物通过接头L连接至所述抗体。
本发明表明，采用含抗-TWEAKR抗体的缀合物观察到显著改善的肿瘤选择性以及降低的对抗行为。
ITEM-4是由Nakayama等人(Nakayama，et al.，2003，Biochem Biophy Res Comm，306：819-825)描述的抗-TWEAKR抗体。Zhou等人(Zhou et al.，2013，J InvestDermatol.133(4)：1052-62)以及在WO 2009/020933中描述了该抗体的基于CDR接枝的人源化变体。
所述抗体优选为人源化的或嵌合的单克隆抗-TWEAKR抗体。特别优选人源化的或嵌合的ITEM-4变体：TPP-7005、TPP-7006、TPP-7007、TPP-7053、TPP-7073、TPP-7074、TPP-7075和TPP-7076。
式(I)的化合物及其盐、溶剂合物、溶剂合物的盐和差向异构体：
其中
R1代表H、-L-#1、-MOD或-(CH2)0-3Z，其中Z代表-H、-NHY3、-OY3、-SY3、卤素、CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2各自独立地代表H、NH2、-(CH2CH2O)0-3-(CH2)0-3Z‘(例如-(CH2)0-3Z‘)或-CH(CH2W)Z‘，且Y3代表H或-(CH2)0-3Z‘，其中Z‘代表H、NH2、SO3H、COOH、-NH-CO-CH2-CH2-CH(NH2)COOH或-(CO-NH-CHY4)1-3COOH，其中W代表H或OH，
其中Y4代表任选地被-NHCONH2取代的直链或支链的C1-6烷基，或代表任选地被-NH2取代的芳基或苄基；
R2代表H、-MOD、-CO-CHY4-NHY5或-(CH2)0-3Z，
其中Z代表-H、卤素、-OY3、-SY3、NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2各自独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z‘，且Y3代表H或-(CH2)0-3Z‘，其中Z‘代表H、SO3H、NH2或COOH；
其中Y4代表任选地被-NHCONH2取代的直链或支链的C1-6-烷基，或代表任选地被-NH2取代的芳基或苄基，且Y5代表H或-CO-CHY6-NH2，其中Y6代表直链或支链的C1-6-烷基；
R4代表H、-L-#1、-SGlys-(CO)0-1-R4’、-CO-CHY4-NHY5或-(CH2)0-3Z，
其中SGlys代表可被溶酶体酶裂解的基团，特别是由二肽或三肽组成的基团；R4’代表可被-NH2、-NH-烷基、-N(烷基)2、NH-CO-烷基、N(烷基)-CO烷基、-SO3H、-SO2NH2、-SO2-N(烷基)2、-COOH、-CONH2、-CON(烷基)2或-OH单取代或多取代的C1-10-烷基、C5-10-芳基或C6-10-芳烷基、C5-10-杂烷基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳基、C5-10-杂环烷基、杂芳基、杂芳基烷基、杂芳基烷氧基、C1-10-烷氧基、C6-10-芳氧基或C6-10-芳烷氧基、C5-10-杂芳烷氧基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳氧基或C5-10-杂环烷氧基基团，或代表-H或基团-Ox-(CH2CH2O)y-R4″(其中x代表0或1，且v代表1至10的数，且R4″代表-H、-烷基(优选C1-12-烷基)、-CH2-COOH、-CH2-CH2-COOH或-CH2-CH2-NH2)，其中裂解后存在伯胺基团(相应于R4＝H)；
其中Z代表-H、卤素、-OY3、-SY3、NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2各自独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z‘，且Y3代表H或-(CH2)0-3Z‘，其中Z‘代表H、SO3H、NH2或COOH；
其中Y4代表任选地被-NHCONH2取代的直链或支链的C1-6-烷基，或代表任选地被-NH2取代的芳基或苄基，且Y5代表H或-CO-CHY6-NH2，其中Y6代表直链或支链的C1-6-烷基；
或R2和R4一起(其中形成吡咯烷环)代表-CH2-CHR11-或-CHR11-CH2-、其中R11代表-H、-NH2、-SO3H、-COOH、-SH、卤素(特别是F或C1)、C1-4-烷基、C1-4-卤代烷基、C1-4-烷氧基、羟基-取代的C1-4-烷基、COO(C1-4-烷基)或OH；
A代表CO、SO、SO2、SO2NH或CNNH2；
R3代表-L-#1、-MOD或任选地被取代的烷基、环烷基、芳基、杂芳基、杂烷基、杂环烷基基团，优选地-L-#1或可被以下基团取代的C1-10-烷基、C6-10-芳基或C6-10-芳烷基、C5-10-杂烷基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳基或C5-10-杂环烷基基团：1-3个-OH基团、1-3个卤素原子、1-3个卤代烷基基团(各自具有1-3个卤素原子)、1-3个O-烷基基团、1-3个-SH基团、1-3个-S-烷基基团、1-3个-O-CO-烷基基团、1-3个-O-CO-NH-烷基基团、1-3个-NH-CO-烷基基团、1-3个-NH-CO-NH-烷基基团、1-3个-S(O)n-烷基基团、1-3个-SO2-NH-烷基基团、1-3个-NH-烷基基团、1-3个-N(烷基)2基团、1-3个-NH2基团或1-3个-(CH2)0-3Z基团，其中n代表0、1或2，Z代表-H、卤素、-OY3、-SY3、-NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，其中Y1和Y2各自独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z‘，且Y3代表H、-(CH2)0-3-CH(NHCOCH3)Z‘、-(CH2)0-3-CH(NH2)Z‘或-(CH2)0-3Z‘，其中Z‘代表H、SO3H、NH2或COOH(其中“烷基”优选地代表C1-10-烷基)；
R5代表H、NH2、NO2、卤素(特别是F、Cl、Br)、-CN、CF3、-OCF3、-CH2F、-CH2F、SH或-(CH2)0-3Z，其中Z代表-H、-OY3、-SY3、卤素、NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2各自独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z‘，且Y3代表H或-(CH2)0-3Z‘，其中Z‘代表H、SO3H、NH2或COOH；
R6和R7各自独立地代表H、氰基、(任选地氟化的)C1-10-烷基、(任选地氟化的)C2-10-烯基、(任选地氟化的)C2-10-炔基、羟基、NO2、NH2、COOH或卤素(特别是F、Cl、Br)，
R8代表(任选地氟化的)C1-10-烷基、(任选地氟化的)C2-10-烯基、(任选地氟化的)C2-10-炔基、(任选地氟化的)C4-10-环烷基或-(CH2)0-2-(HZ2)，其中HZ2代表具有至多两个选自N、O和S的杂原子的4-至7-元杂环，其中这些基团各自可被-OH、CO2H或NH2取代；
R9代表H、F、CH3、CF3、CH2F或CHF2；
其中取代基R1、R3或R4中的一个代表或(在R8的情况下)包含-L-#1，
L代表接头且#1代表键合至结合体或其衍生物的键，
其中-MOD代表-(NR10)n-(G1)o-G2-G3，其中
R10代表H或C1-C3-烷基；
G1代表-NHCO-或-CONH-(其中，如果G1代表-NHCO-、R10不代表NH2)；
n代表0或1；
o代表0或1；且
G2代表直链和/或支链的烃基，其具有1至10个碳原子且可被一个或更多个以下基团中断一次或更多次：-O-、-S-、-SO-、SO2、-NRy-、-NRyCO-、CONRy-、-NRyNRy-、-SO2NRyNRy-、-CONRyNRy-(其中Ry代表H、苯基、C1-C10-烷基、C2-C10-烯基或C2-C10-炔基，其各自可被NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代)、-CO-或-CRx＝N-O-(其中Rx代表H、C1-C3-烷基或苯基)，其中包括任意侧链的烃链可被-NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代，G3代表-H或-COOH，且其中基团-MOD优选地具有至少一个基团-COOH。
本发明的缀合物可具有化学不稳定接头、酶不稳定接头或稳定接头。特别优选稳定接头和可通过蛋白酶裂解的接头。
本发明还提供用于制备本发明的缀合物的方法，以及用于所述制备的前体和中间体。
本发明的缀合物的制备经常包括以下步骤：
制备任选地带有保护基且具有能够偶联至抗体的反应性基团的接头前体；
将接头前体缀合至式(I)(其中在这些式中还不存在键合至接头的键)的KSP抑制剂的衍生物，所述衍生物任选地带有保护基，从而得到任选地带有保护基的反应性KSP抑制剂/接头缀合物；
除去KSP抑制剂/接头缀合物中存在任何保护基；以及
将抗体缀合至KSP抑制剂/接头缀合物，从而得到本发明的抗体/KSP抑制剂缀合物。
反应性基团的连接还可发生在构建了任选地被保护的KSP抑制剂/接头前体缀合物之后。
取决于所述接头，琥珀酰亚胺-连接的ADC可在缀合后根据方案26转化成开链琥珀酰亚胺，其具有有利的稳定性特性。
如上所述，接头前体与低分子量KSP抑制剂的缀合可通过由接头取代式(I)中R1、R3或R4上的氢原子来进行。在缀合之前的合成步骤中，存在的任何官能团也可以以被保护的形式存在。在缀合步骤前，将这些保护基通过已知的肽化学方法除去。所述缀合可通过各种路线以化学的方式发生，如在实施例中在方案20至31中以示例性方式所示出的。特别地，可任选地修饰用于缀合至接头的低分子量KSP抑制剂，例如通过引入保护基或离去基团以帮助取代。
特别地，本发明提供缀合至发挥适度的激动作用或非激动作用的抗-TWEAKR抗体(例如ITEM-4)的新的低分子量KSP抑制剂。这些KSP抑制剂或它们的抗体缀合物具有以下通式(II)及其盐、溶剂合物、溶剂合物的盐和差向异构体：
其中
R1代表H、-L-结合体、-MOD或-(CH2)0-3Z，其中Z代表-H、-NHY3、-OY3、-SY3、卤素、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中
Y1和Y2各自独立地代表H、NH2、-(CH2CH2O)0-3-(CH2)0-3Z‘(例如-(CH2)0-3Z‘)或-CH(CH2W)Z‘，
Y3代表H或-(CH2)0-3Z‘，
Z‘代表H、NH2、SO3H、COOH、-NH-CO-CH2-CH2-CH(NH2)COOH或-(CO-NH-CHY4)1-3COOH；
W代表H或OH，
Y4代表任选地被-NH-C(＝O)-NH2取代的直链或支链的C1-6烷基，或代表任选地被-NH2取代的芳基或苄基；
R2代表H、-MOD、-C(＝O)-CHY4-NHY5或-(CH2)0-3Z，
或
R2和R4一起(其中形成吡咯烷环)代表-CH2-CHR11-或-CHR11-CH2-，
其中
R11代表-H、-NH2、-SO3H、-COOH、-SH、卤素(特别是F或Cl)、C1-4-烷基、C1-4-卤代烷基、C1-4-烷氧基、羟基取代的C1-4-烷基、COO(C1-4-烷基)或-OH；
Z代表-H、卤素、-OY3、-SY3、NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
Y1和Y2各自独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z‘，且Y3代表H或-(CH2)0-3Z‘，其中Z‘代表H、SO3H、NH2或COOH；
其中Y4代表任选地被-NHCONH2取代的直链或支链的C1-6-烷基，或代表任选地被-NH2取代的芳基或苄基，且Y5代表H或-CO-CHY6-NH2，其中Y6代表直链或支链的C1-6-烷基；
R4代表H、-L-结合体、-SGlys-(CO)0-1-R4’、-CO-CHY4-NHY5或-(CH2)0-3Z，
其中SGlys代表可被溶酶体酶裂解的基团，特别是由二肽或三肽组成的基团，R4’代表可被-NH2、-NH-烷基、-N(烷基)2、NH-CO-烷基、N(烷基)-CO烷基、-SO3H、-SO2NH2、-SO2-N(烷基)2、-COOH、-CONH2、-CON(烷基)2或-OH单取代或多取代的C1-10-烷基、C5-10-芳基或C6-10-芳烷基、C5-10-杂烷基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳基、C5-10-杂环烷基、杂芳基、杂芳基烷基、杂芳基烷氧基、C1-10-烷氧基、C6-10-芳氧基或C6-10-芳烷氧基、C5-10-杂芳烷氧基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳氧基、C5-10-杂环烷氧基基团，或代表-H或基团-Ox-(CH2CH2O)y-R4”(其中x代表0或1，v代表1至10的数，且R4”代表-H、-烷基(优选C1-12-烷基)、-CH2-COOH、-CH2-CH2-COOH或-CH2-CH2-NH2)，其中裂解后存在伯胺基(相应于R4＝H)；
其中Z代表-H、卤素、-OY3、-SY3、NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2各自独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z‘，且Y3代表H或-(CH2)0-3Z‘，其中Z‘代表H、SO3H、NH2或COOH；
其中Y4代表任选地被-NHCONH2取代的直链或支链的C1-6-烷基，或代表任选地被-NH2取代的芳基或苄基，Y5代表H或-CO-CHY6-NH2，其中Y6代表直链或支链的C1-6-烷基；
或R2和R4一起(其中形成吡咯烷环)代表-CH2-CHR11-或-CHR11-CH2-，其中R11代表H、NH2、SO3H、COOH、SH、卤素(特别是F或Cl)、C1-4-烷基、C1-4-卤代烷基、C1-4-烷氧基、羟基-取代C1-4-烷基、COO(C1-4-烷基)或OH；
A代表-C(＝O)-、-S(＝O)-、-S(＝O)2-、-S(＝O)2-NH或-CNNH2-；
R3代表-L-结合体、-MOD或任选地被取代的烷基、环烷基、芳基、杂芳基、杂烷基、杂环烷基基团，优选-L-结合体或可被以下基团取代的C1-10-烷基、C6-10-芳基或C6-10-芳烷基、C5-10-杂烷基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳基或C5-10-杂环烷基基团：1-3个-OH基团、1-3个卤素原子、1-3个卤代的烷基基团(各自具有1-3个卤素原子)、1-3个O-烷基基团、1-3个-SH基团、1-3个-S-烷基基团、1-3个-O-CO-烷基基团、1-3个-O-CO-NH-烷基基团、1-3个-NH-CO-烷基基团、1-3个-NH-CO-NH-烷基基团、1-3个-S(O)n-烷基基团、1-3个-SO2-NH-烷基基团、1-3个-NH-烷基基团、1-3个-N(烷基)2基团、1-3个-NH2基团或1-3个-(CH2)0-3Z基团，其中Z代表-H、卤素、-OY3、-SY3、-NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，其中Y1和Y2各自独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z‘且Y3代表H、-(CH2)0-3-CH(NHCOCH3)Z‘、-(CH2)0-3-CH(NH2)Z‘或-(CH2)0-3Z‘，其中Z‘代表H、SO3H、NH2或COOH(其中“烷基”优选地代表C1-10-烷基)；
n代表0、1或2，
R5代表H、NH2、NO2、卤素(特别是F、Cl、Br)、-CN、CF3、-OCF3、-CH2F、-CH2F、SH或-(CH2)0-3Z，其中Z代表-H、-OY3、-SY3、卤素、NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2各自独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z‘，且Y3代表H或-(CH2)0-3Z‘，其中Z‘代表H、SO3H、NH2或COOH；
R8代表(任选地氟化的)C1-10-烷基、(任选地氟化的)C2-10-烯基、(任选地氟化的)C2-10-炔基、(任选地氟化的)C4-10-环烷基或-(CH2)0-2-(HZ2)，其中HZ2代表具有至多两个选自N、O和S的杂原子的4-至7-元杂环(优选氧杂环丁烷)，其中这些基团中的每一个皆可被-OH、CO2H或NH2取代；
R9代表H、F、CH3、CF3、CH2F或CHF2；
其中L代表接头且结合体代表发挥适度的激动作用或非激动作用的抗-TWEAKR抗体，例如ITEM-4和ITEM-4的嵌合的或人源化的变体，其中所述结合体可任选地结合至多个活性化合物分子，
其中R1、R3和R4中的一个代表-L-结合体；
R6和R7各自独立地代表H、氰基、(任选地氟化的)C1-10-烷基、(任选地氟化的)C2-10-烯基、(任选地氟化的)C2-10-炔基、羟基、NO2、NH2、COOH或卤素(特别是F、Cl、Br)，
其中-MOD代表-(NR10)n-(G1)o-G2-G3，其中
R10代表H或C1-C3-烷基；
G1代表-NHCO-或-CONH-(其中，如果G1代表-NHCO-，则R10不代表NH2)；
n代表0或1；
o代表0或1；且
G2代表直链和/或支链的烃基，其具有1至10个碳原子且可被一个或更多个以下基团中断一次或更多次：-O-、-S-、-SO-、SO2、-NRy-、-NRyCO-、CONRy-、-NRyNRy-、-SO2NRyNRy-、-CONRyNRy-(其中Ry代表H、苯基、C1-C10-烷基、C2-C10-烯基或C2-C10-炔基，其各自可被NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代)、-CO-、-CRx＝N-O-(其中Rx代表H、C1-C3-烷基或苯基)，其中包含任意侧链的烃链可被-NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代，G3代表-H或-COOH，其中基团-MOD优选地具有至少一个基团-COOH。
附图说明
图1：带有注释的抗体的序列。对于每个抗体或抗体片段，突出了CDR区域(HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、LCDR3)和可变区域(VH、VL)。
图2：序列方案。
具体实施方式
本发明提供发挥适度的激动作用或非激动作用的抗-TWEAKR抗体(例如ITEM-4和ITEM-4的嵌合的或人源化的变体)与一个或更多个活性化合物分子的缀合物，其中活性化合物分子为通过接头L连接至抗体的纺锤体驱动蛋白抑制剂(KSP抑制剂)。本发明表明，采用含有抗-TWEAKR抗体的缀合物观察到显著改善的肿瘤选择性并具有降低的对抗行为。
本发明的缀合物可由以下通式表示
其中结合体代表发挥适度的激动作用或非激动作用的抗-TWEAKR抗体，例如ITEM-4和ITEM-4的嵌合的或人源化的变体，L代表接头，KSP代表KSP抑制剂，且n代表1至50的数，优选1.2至20，特别优选2至8。此处，n为每个结合体KSP抑制剂/接头缀合物的数目平均值。优选地，KSP-L具有以上所示的式(I)。此外，接头优选地与抗体的不同氨基酸相连。特别优选结合至结合体的不同半胱氨酸残基。所述抗体优选为人源化的或嵌合的单克隆ITEM-4抗-TWEAKR抗体。特别优选人源化的或嵌合的ITEM-4变体：TPP-7005、TPP-7006、TPP-7007、TPP-7053、TPP-7073、TPP-7074、TPP-7075和TPP-7076。
下面描述了本发明可使用的抗体、本发明可使用的KSP抑制剂和本发明可使用的接头，其可不加任何限制地组合使用。特别地，在每种情况下作为优选或特别优选方案的结合体可与在每种情况下作为优选或特别优选方案的KSP抑制剂、任选地与在每种情况下作为优选或特别优选方案的接头组合使用。
KSP抑制剂和它们的结合体缀合物
定义
术语“取代的”意指涉及的原子或基团上的一个或更多个氢被所提及的基团选项取代，条件是在目前情况下不超过所涉及的原子的正常价。取代基和/或变量的组合是允许的。
术语“任选地被取代的”意指取代基的数目可等于零或不同于零。除非另有所述，任选地被取代的基团可被通过在任意可用碳原子或氮原子上用非氢取代基代替氢原子而容纳的尽可能多的任选取代基取代。通常，任选取代基(如果存在)的数目可为1、2、3、4或5，特别是1、2或3。
本文中使用的术语“一次或更多次”，例如在本发明的通式的化合物的取代基的定义中，意指“1、2、3、4或5次，优选1、2、3或4次，特别优选1、2或3次，非常特别优选1或2次”。
如果本发明化合物中的基团被取代，则除非另有所述，所述基团可被单取代或多取代。在本发明的范围内，出现不止一次的所有基团的含义是各自独立的。被一个、两个或三个相同或不同的取代基的取代是优选的。被一个取代基的取代是特别优选的。
烷基
烷基代表具有1至10个碳原子(C1-C10-烷基)、通常1至6个碳原子(C1-C6-烷基)、优选1至4个碳原子(C1-C4-烷基)且特别优选1至3个碳原子(C1-C3-烷基)的直链或支链的饱和的单价烃基。
通过实例及作为优选而提及以下基团：
甲基-、乙基-、丙基-、丁基-、戊基-、己基-、异丙基-、异丁基-、仲丁基、叔丁基-、异戊基-、2-甲基丁基-、1-甲基丁基-、1-乙基丙基-、1，2-二甲基丙基-、新戊基-、1，1-二甲基丙基-、4-甲基戊基-、3-甲基戊基-、2-甲基戊基-、1-甲基戊基-、2-乙基丁基-、1-乙基丁基-、3，3-二甲基丁基-、2，2-二甲基丁基-、1，1-二甲基丁基-、2，3-二甲基丁基-、1，3-二甲基丁基-和1，2-二甲基丁基-。
特别优选甲基-、乙基-、丙基-、异丙基-和叔丁基基团。
杂烷基
杂烷基代表具有1至10个碳原子的直链和/或支链的烃链，其可被一个或更多个以下基团中断一次或更多次：-O-、-S-、-C(＝O)-、-S(＝O)-、-S(＝O)2-、-NRy-、-NRyC(＝O)-、-C(＝O)-NRy-、-NRyNRy-、-S(＝O)2-NRyNRy-、-C(＝O)-NRyNRy-、-CRx＝N-O-，且其中包含侧链——如果存在——的烃链可被-NH-C(＝O)-NH2、-C(＝O)-OH、-OH、-NH2、-NH-C(＝NNH2)-、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代，
此处，Ry在每种情况下代表-H、苯基-、C1-C10-烷基-、C2-C10-烯基-或C2-C10-炔基-，其本身可各自被-NH-C(＝O)-NH2、-C(＝O)-OH、-OH、-NH2、-NH-C(＝NNH2)-、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代。
此处，Rx代表-H、C1-C3-烷基-或苯基-。
烯基
烯基代表具有一个或两个双键和2、3、4、5、6、7、8、9或10个碳原子(C2-C10-烯基)、特别是2或3个碳原子(C2-C3-烯基)的直链或支链的单价烃链，其应理解为，如果烯基基团含有不止一个双键，则双键可彼此隔离或彼此共轭。烯基基团为，例如，次乙基(或乙烯基)、丙-2-烯-1-基(或“烯丙基”)、丙-1-烯-1-基、丁-3-烯基、丁-2-烯基、丁-1-烯基、戊-4-烯基、戊-3-烯基、戊-2-烯基、戊-1-烯基、己-5-烯基、己-4-烯基、己-3-烯基、己-2-烯基、己-1-烯基、丙-1-烯-2-基(或“异丙烯基”)、2-甲基丙-2-烯基、1-甲基丙-2-烯基、2-甲基丙-1-烯基、1-甲基丙-1-烯基、3-甲基丁-3-烯基、2-甲基丁-3-烯基、1-甲基丁-3-烯基、3-甲基丁-2-烯基、2-甲基丁-2-烯基、1-甲基丁-2-烯基、3-甲基丁-1-烯基、2-甲基丁-1-烯基、1-甲基丁-1-烯基、1，1-二甲基丙-2-烯基、1-乙基丙-1-烯基、1-丙基乙烯基、1-异丙基乙烯基、4-甲基戊-4-烯基、3-甲基戊-4-烯基、2-甲基戊-4-烯基、1-甲基戊-4-烯基、4-甲基戊-3-烯基、3-甲基戊-3-烯基、2-甲基戊-3-烯基、1-甲基戊-3-烯基、4-甲基戊-2-烯基、3-甲基戊-2-烯基、2-甲基戊-2-烯基、1-甲基戊-2-烯基、4-甲基戊-1-烯基、3-甲基戊-1-烯基、2-甲基戊-1-烯基、1-甲基戊-1-烯基、3-乙基丁-3-烯基、2-乙基丁-3-烯基、1-乙基丁-3-烯基、3-乙基丁-2-烯基、2-乙基丁-2-烯基、1-乙基丁-2-烯基、3-乙基丁-1-烯基、2-乙基丁-1-烯基、1-乙基丁-1-烯基、2-丙基丙-2-烯基、1-丙基丙-2-烯基、2-异丙基丙-2-烯基、1-异丙基丙-2-烯基、2-丙基丙-1-烯基、1-丙基丙-1-烯基、2-异丙基丙-1-烯基、1-异丙基丙-1-烯基、3，3-二甲基丙-1-烯基、1-(1，1-二甲基乙基)次乙基、丁-1，3-二烯基、五-1，4-二烯基或六-1-5-二烯基基团。所述基团特别是乙烯基或烯丙基。
炔基
炔基代表具有三键和2、3、4、5、6、7、8、9或10个碳原子(C2-C10-炔基)、特别是2或3个碳原子(C2-C3-炔基)的直链或支链的单价烃链。C2-C6-炔基基团为，例如，乙炔基、丙-1-炔基、丙-2-炔基(或炔丙基)、丁-1-炔基、丁-2-炔基、丁-3-炔基、戊-1-炔基、戊-2-炔基、戊-3-炔基、戊-4-炔基、己-1-炔基、己-2-炔基、己-3-炔基、己-4-炔基、己-5-炔基、1-甲基丙-2-炔基、2-甲基丁-3-炔基、1-甲基丁-3-炔基、1-甲基丁-2-炔基、3-甲基丁-1-炔基、1-乙基丙-2-炔基、3-甲基戊-4-炔基、2-甲基戊-4-炔基、1-甲基戊-4-炔基、2-甲基戊-3-炔基、1-甲基戊-3-炔基、4-甲基戊-2-炔基、1-甲基戊-2-炔基、4-甲基戊-1-炔基、3-甲基戊-1-炔基、2-乙基丁-3-炔基、1-乙基丁-3-炔基、1-乙基丁-2-炔基、1-丙基丙-2-炔基、1-异丙基丙-2-炔基、2，2-二甲基丁-3-炔基、1，1-二甲基丁-3-炔基、1，1-二甲基丁-2-炔基-或3，3-二甲基丁-1-炔基基团。炔基基团特别是乙炔基、丙-1-炔基或丙-2-炔基。
环烷基
环烷基代表具有3-12个碳原子的饱和的单价的单环-或双环烃基(C3-C12-环烷基)。
此处，单环烃基代表通常具有3至10个碳原子(C3-C10-环烷基)、优选3至8个碳原子(C3-C8-环烷基)且特别优选3至7个碳原子(C3-C7-环烷基)的单价烃基。
对于单环烃基，可通过实例并作为优选而提及如下基团：
环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基和环辛基。
特别优选环丙基、环丁基、环戊基、环己基和环庚基。
此处，双环烃基代表通常具有3至12个碳原子的烃基(C3-C12-环烷基)，其应理解为两个饱和的环系统共享两个直接相邻的原子的稠合。对于双环烃基，可通过实例并作为优选而提及如下基团：双环[2.2.0]己基、双环[3.3.0]辛基、双环[4.4.0]癸基、双环[5.4.0]十一基、双环[3.2.0]庚基、双环[4.2.0]辛基、双环[5.2.0]壬基、双环[6.2.0]癸基、双环[4.3.0]壬基、双环[5.3.0]癸基、双环[6.3.0]十一基和双环[5.4.0]十一基。
杂环烷基
杂环烷基代表具有一个、两个、三个或四个可相同或不同的杂原子的非芳族的单环体系或双环环体系。存在的杂原子可为氮原子、氧原子或硫原子。
根据本发明的单环环体系可具有3至8个、优选4至7个、特别优选5或6个环原子。
对于具有3个环原子的杂环烷基，可通过实例并作为优选而提及如下基团：
氮丙定基。
对于具有4个环原子的杂环烷基，可通过实例并作为优选而提及如下基团：
氮杂环丁基、氧杂环丁基。
对于具有5个环原子的杂环烷基，可通过实例并作为优选而提及如下基团：
吡咯烷基、咪唑烷基、吡唑烷基、吡咯啉基、二氧戊环基和四氢呋喃基。
对于具有6个环原子的杂环烷基，可通过实例并作为优选而提及如下基团：
哌啶基、哌嗪基、吗啉基、二噁烷基、四氢吡喃基和硫吗啉基。
对于具有7个环原子的杂环烷基，可通过实例并作为优选而提及如下基团：
氮杂环庚基、氧杂环庚基、1，3-二氮杂环庚基、1，4-二氮杂环庚基。
对于8个环原子的杂环烷基，可通过实例并作为优选而提及如下基团：
氧杂环辛基、氮杂环辛基。
在单环杂环烷基中，优选具有至多2个选自O、N和S的杂原子的4-至7-元饱和杂环基基团。
特别优选吗啉基、哌啶基、吡咯烷基和四氢呋喃基。
具有一个、两个、三个或四个可相同或不同的杂原子的双环环系统可根据本发明具有6至12个环原子，优选6至10个环原子，其中一个、两个、三个或四个碳原子可被相同或不同的选自O、N和S的杂原子替代。
可通过实例而提及如下基团：氮杂双环[3.3.0]辛基、氮杂双环[4.3.0]壬基、二氮杂双环[4.3.0]壬基、氧氮杂双环[4.3.0]壬基、硫氮杂双环[4.3.0]壬基或氮杂双环[4.4.0]癸基，以及根据所述定义衍生自其他可能的组合的基团。
特别优选全氢环戊[c]吡咯基、全氢呋喃并[3，2-c]吡啶基、全氢吡咯并[1，2-a]吡嗪基、全氢吡咯并[3，4-c]吡咯基和3，4-亚甲基二氧苯基。
芳基
芳基是由碳原子组成的单价单环-或双环芳族环系统。实例为萘基和苯基；优选苯基或苯基自由基。
C6-C10-芳烷基
在本发明上下文中，C6-10-芳烷基代表单环芳族芳基，例如苯基，其与C1-C4-烷基基团相连。
示例性的C6-10-芳烷基基团为苄基。
杂芳基
杂芳基为具有5、6、8、9、10、11、12、13或14环体系(“5-至14-元杂芳基”基团)、特别是5、6、9或10个环原子的单价的单环、双环或三环芳族环体系，其含有至少一个环杂原子和任选地一个、两个或三个其他选自N、O和S的环杂原子且其通过环碳原子连接或任选地(化合价允许的情况下)通过环氮原子连接。
杂芳基基团可为5元杂芳基基团，例如，噻吩基、呋喃基、吡咯基、噁唑基、噻唑基、咪唑基、吡唑基、异噁唑基、异噻唑基、噁二唑基、三唑基、噻二唑基或四唑基；或6元杂芳基基团，例如，吡啶基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基或三嗪基；或三环杂芳基基团，例如，咔唑基、吖啶基或吩嗪基；或9元杂芳基基团，例如，苯并呋喃基、苯并噻吩基、苯并噁唑基、苯并异噁唑基、苯并咪唑基、苯并噻唑基、苯并三唑基、吲唑基、吲哚基、异吲哚基、吲嗪基或嘌呤基；或10元杂芳基基团，例如，喹啉基、喹唑啉基、异喹啉基、噌啉基、酞嗪基、喹喔啉基或蝶啶基。
一般而言，如果不另外提及，杂芳基包括其所有可能的异构体形式，例如互变异构体和相对于与分子其余部分结合的结合点的位置异构体。因而，作为说明性的、非包括性的实例，术语吡啶基包括吡啶-2-基、吡啶-3-基和吡啶-4-基；或术语噻吩基包括噻吩-2-基和噻吩-3-基。
C5-C10-杂芳基
在本发明上下文中，C5-10-杂芳基代表具有一个、两个、三个或四个可相同或不同的杂原子的单环-或双环芳族环体系。可存在的杂原子为：N、O、S、S(＝O)和/或S(＝O)2。结合价(binding valency)可位于任何芳族碳原子或氮原子上。
根据本发明的单环杂芳基基团具有5或6个环原子。
优选具有一个或两个杂原子的杂芳基基团。此处特别优选一个或两个氮原子。
具有5个环原子的杂芳基基团包括，例如，环：
噻吩基、噻唑基、呋喃基、吡咯基、噁唑基、咪唑基、吡唑基、异噁唑基、异噻唑基、噁二唑基、三唑基、四唑基和噻二唑基。
具有6个环原子的杂芳基基团包括，例如，环：
吡啶基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基和三嗪基。
根据本发明的双环杂芳基基团具有9个或10个环原子。
具有9个环原子的杂芳基基团包括，例如，环：
酞基、硫代酞基、吲哚基、异吲哚基、吲唑基、苯并噻唑基、苯并呋喃基、苯并噻吩基、苯并咪唑基、苯并噁唑基、吖辛因基、吲嗪基、嘌呤基、二氢吲哚基。
具有10个环原子的杂芳基基团包括，例如，环：
异喹啉基、喹啉基、喹嗪基、喹唑啉基、喹喔啉基、噌啉基、酞嗪基、1，7-萘啶基和1，8-萘啶基、蝶啶基、苯并二氢吡喃基。
杂烷氧基
杂烷氧基代表具有1至10个碳原子的直链和/或支链的烃链，其通过-O-连接至分子的剩余部分且其还可被一个或更多个以下基团中断一次或更多次：-O-、-S-、-C(＝O)-、-S(＝O)-、-S(＝O)2-、-NRy-、-NRyC(＝O)-、-C(＝O)-NRy-、-NRyNRy-、-S(＝O)2-NRyNRy-、-C(＝O)-NRyNRy-、-CRx＝N-O-，且其中包含侧链——如果存在——的烃链可被-NH-C(＝O)-NH2、-C(＝O)-OH、-OH、-NH2、-NH-C(＝NNH2)-、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代。
此处，Ry在每种情况下代表-H、苯基、C1-C10-烷基、C2-C10-烯基或C2-C10-炔基，其本身可在每种情况下被-NH-C(＝O)-NH2、-C(＝O)-OH、-OH、-NH2、-NH-C(＝NNH2)-、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代。
此处，Rx代表-H、C1-C3-烷基或苯基。
在本发明的上下文中，卤素或卤素原子代表氟(-F)、氯(-Cl)、溴(-Br)或碘(-I)。
氟烷基、氟烯基和氟炔基意指可被氟单取代或多取代的烷基、烯基和炔基。
KSP抑制剂与抗体的缀合可通过多种路线以化学的方式进行，如以示例性方式在实施例的方案20至31中所示出的。特别是，可任选地修饰用于缀合至接头的低分子量KSP抑制剂，例如通过引入保护基或离去基团以帮助取代(以使得在反应中所述离去基团而非氢原子被接头取代)。然后可使以此方式获得的KSP抑制剂-接头分子(其中接头具有用于偶联至结合体的反应性基团)与结合体反应以得到本发明的结合体缀合物。在实验部分，通过大量实施例以示例性方式说明了本方法。
其他特别优选的化合物具有下式(I)或(Ia)：
式(I)的化合物及其盐、溶剂合物、溶剂合物的盐和差向异构体：
其中
R1代表H、-L-#1、-MOD或-(CH2)0-3Z，其中Z代表-H、-NHY3、-OY3、-SY3、卤素、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2各自独立地代表H、NH2、-(CH2CH2O)0-3-(CH2)0-3Z‘(例如-(CH2)0-3Z‘)或-CH(CH2W)Z‘，且Y3代表H或-(CH2)0-3Z‘，其中Z‘代表H、NH2、SO3H、COOH、-NH-CO-CH2-CH2-CH(NH2)COOH或-(CO-NH-CHY4)1-3COOH，其中W代表H或OH，
其中Y4代表任选地被-NHCONH2取代的直链或支链的C1-6烷基，或代表任选地被-NH2取代的芳基或苄基；
R2代表H、-MOD、-CO-CHY4-NHY5或-(CH2)0-3Z，
其中Z代表-H、卤素、-OY3、-SY3、NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2各自独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z‘，且Y3代表H或-(CH2)0-3Z‘，其中Z‘代表H、SO3H、NH2或COOH；
其中Y4代表任选地被-NHCONH2取代的直链或支链的C1-6-烷基，或代表任选地被-NH2取代的芳基或苄基，且Y5代表H或-CO-CHY6-NH2，其中Y6代表直链或支链的C1-6-烷基；
R4代表H、-L-#1、-SGlys-(CO)0-1-R4’、-CO-CHY4-NHY5或-(CH2)0-3Z，
其中SGlys代表可被溶酶体酶裂解的基团，特别是由二肽或三肽组成的基团，R4’代表可被-NH2、-NH-烷基、-N(烷基)2、NH-CO-烷基、N(烷基)-CO烷基、-SO3H、-SO2NH2、-SO2-N(烷基)2、-COOH、-CONH2、-CON(烷基)2或-OH单取代或多取代的C1-10-烷基、C5-10-芳基或C6-10-芳烷基、C5-10-杂烷基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳基、C5-10-杂环烷基、杂芳基、杂芳基烷基、杂芳基烷氧基、C1-10-烷氧基、C6-10-芳氧基或C6-10-芳烷氧基、C5-10-杂芳烷氧基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳氧基或C5-10-杂环烷氧基基团，或代表-H或基团-Ox-(CH2CH2O)y-R4”(其中x代表0或1，v代表1至10的数，且R4”代表-H、-烷基(优选C1-12-烷基)、-CH2-COOH、-CH2-CH2-COOH或-CH2-CH2-NH2)；
其中Z代表-H、卤素、-OY3、-SY3、NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2各自独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z‘，且Y3代表H或-(CH2)0-3Z‘，其中Z‘代表H、SO3H、NH2或COOH；
其中Y4代表任选地被-NHCONH2取代的直链或支链的C1-6-烷基，或代表任选地被-NH2取代的芳基或苄基，且Y5代表H或-CO-CHY6-NH2，其中Y6代表直链或支链的C1-6-烷基；
或R2和R4一起(其中形成吡咯烷环)代表-CH2-CHR11-或-CHR11-CH2-，其中R11代表H、NH2、SO3H、COOH、SH、卤素(特别是F或Cl)、C1-4-烷基、C1-4-卤代烷基、C1-4-烷氧基、羟基-取代的C1-4-烷基、COO(C1-4-烷基)或OH；
A代表CO、SO、SO2、SO2NH或CNNH2；
R3代表-L-#1、-MOD或任选地被取代的烷基、环烷基、芳基、杂芳基、杂烷基、杂环烷基基团，优选可被以下基团取代的C1-10-烷基、C6-10-芳基或C6-10-芳烷基、C5-10-杂烷基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳基或C5-10-杂环烷基：1-3个-OH基团、1-3个卤素原子、1-3个卤代烷基基团(各自具有1-3个卤素原子)、1-3个O-烷基基团、1-3个-SH基团、1-3个-S-烷基基团、1-3个-O-CO-烷基基团、1-3个-O-CO-NH-烷基基团、1-3个-NH-CO-烷基基团、1-3个-NH-CO-NH-烷基基团、1-3个-S(O)n-烷基基团、1-3个-SO2-NH-烷基基团、1-3个-NH-烷基基团、1-3个-N(烷基)2基团、1-3个-NH((CH2CH2O)1-20H)基团、1-3个-NH2基团或1-3个-(CH2)0-3Z基团，其中n代表0、1或2，Z代表-H、卤素、-OY3、-SY3、-NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，其中Y1和Y2各自独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z‘且Y3代表H、-(CH2)0-3-CH(NHCOCH3)Z‘、-(CH2)0-3-CH(NH2)Z‘或-(CH2)0- 3Z‘，其中Z‘代表H、SO3H、NH2或COOH(其中“烷基”优选为C1-10-烷基)；
R5代表H、-MOD、NH2、NO2、卤素(特别是F、Cl、Br)、-CN、CF3、-OCF3、-CH2F、-CH2F、SH或-(CH2)0-3Z，其中Z代表-H、-OY3、-SY3、卤素、NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2各自独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z‘，且Y3代表H或-(CH2)0-3Z‘，其中Z‘代表H、SO3H、NH2或COOH；
R6和R7各自独立地代表H、氰基、(任选地氟化的)C1-10-烷基、(任选地氟化的)C2-10-烯基、(任选地氟化的)C2-10-炔基、羟基、NO2、NH2、COOH或卤素(特别是F、Cl、Br)，
R8代表(任选地氟化的)C1-10-烷基、(任选地氟化的)C2-10-烯基、(任选地氟化的)C2-10-炔基、(任选地氟化的)C4-10-环烷基或-(CH2)0-2-(HZ2)，其中HZ2代表具有至多两个选自N、O和S的杂原子的4-至7-元杂环(优选氧杂环丁烷)，其中这些基团中的每一个皆可被-OH、CO2H或NH2取代；
其中取代基R1、R3和R4中的一个代表-L-#1，
L代表接头且#1代表键合至抗体的键，
R9代表H、F、CH3、CF3、CH2F或CHF2；
其中-MOD代表-(NR10)n-(G1)o-G2-G3，其中
R10代表H或C1-C3-烷基；
G1代表-NHCO-、-CONH-或(其中，如果G1代表-NHCO-或则R10不代表NH2)；
n代表0或1；
o代表0或1；且
G2代表直链和/或支链的烃基，其具有1至10个碳原子且其可被一个或更多个以下基团中断一次或更多次：-O-、-S-、-SO-、SO2、-NRy-、-NRyCO-、CONRy-、-NRyNRy-、-SO2NRyNRy-、-CONRyNRy-(其中Ry代表H、苯基、C1-C10-烷基、C2-C10-烯基或C2-C10-炔基，其各自可被NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸、-CO-或-CRx＝N-O-(其中Rx代表H、C1-C3-烷基或苯基)取代，其中含任何侧链的烃链可被-NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代，其中G3代表-H或-COOH，且其中基团-MOD优选地具有至少一个基团-COOH。
在式(I)的一个优选实施方案中，取代基R1或R3中的一个代表-L-#1。在该实施方案中，特别优选R4代表H或-SGlys-(CO)0-1-R4’，其中SGlys和R4’具有上述相同的含义。在式(I)的另一个优选实施方案中，取代基R4代表-L-#1，其中接头为可在结合至R4的氮原子上处被裂解的接头，以使得裂解后存在伯氨基基团(相应于R4＝H)。这类可裂解的基团详述如下。
如果R1不代表H，R1结合的碳原子为可以以L和/或D构型、优选以L构型存在的立体中心。
如果R2不代表H，则R2结合的碳原子为可以以L和/或D构型存在的立体中心。
式(Ia)的化合物及其盐、溶剂合物、溶剂合物的盐和差向异构体：
其中
R1代表H、-L-#1或-(CH2)0-3Z，其中Z代表-H、-NHY3、-OY3、-SY3、卤素、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2各自独立地代表H、NH2、-(CH2CH2O)0-3-(CH2)0-3Z‘(例如-(CH2)0-3Z‘)或-CH(CH2W)Z‘，且Y3代表H或-(CH2)0-3Z‘，其中Z‘代表H、NH2、SO3H、COOH、-NH-CO-CH2-CH2-CH(NH2)COOH或-(CO-NH-CHY4)1-3COOH，其中W代表H或OH；
其中Y4代表任选地被-NHCONH2取代的直链或支链的C1-6-烷基，或代表任选地被-NH2取代的芳基或苄基。
R2和R4各自独立地代表H、-SGlys-(CO)0-1-R4’、-CO-CHY4-NHY5或-(CH2)0-3Z，
其中SGlys代表可被溶酶体酶裂解的基团，特别是由二肽或三肽组成的基团，R4’代表各自可被-NH2、-NH-烷基、-N(烷基)2、NH-CO-烷基、N(烷基)-CO烷基、-SO3H、-SO2NH2、-SO2-N(烷基)2、-COOH、-CONH2、-CON(烷基)2或-OH单取代或多取代的C1-10-烷基、C5-10-芳基或C6-10-芳烷基、C5-10-杂烷基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳基、C5-10-杂环烷基、杂芳基、杂芳基烷基、杂芳基烷氧基、C1-10-烷氧基、C6-10-芳氧基或C6-10-芳烷氧基、C5-10-杂芳烷氧基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳氧基、C5-10-杂环烷氧基基团，或代表-H或基团-Ox-(CH2CH2O)y-R4”(其中x代表0或1且v代表1至10的数且R4”代表-H、-烷基(优选C1-12-烷基)、-CH2-COOH、-CH2-CH2-COOH或-CH2-CH2-NH2)；
或R2和R4一起(其中形成吡咯烷环)代表-CH2-CHR11-或-CHR11-CH2-，其中R11代表H、NH2、SO3H、COOH、SH、卤素(特别是F或Cl)、C1-4-烷基、C1-4-卤代烷基、C1-4-烷氧基、羟基-取代的C1-4-烷基、COO(C1-4-烷基)或OH；或R2代表H、-CO-CHY4-NHY5或-(CH2)0-3Z且R4代表-L-#1，且其中Z代表-H、卤素、-OY3、-SY3、-NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2各自独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z‘，且Y3代表H或-(CH2)0-3Z‘，其中Z‘代表H、SO3H、NH2或COOH；
其中Y4各自独立地代表任选地被-NHCONH2取代的直链或支链的C1-6-烷基或代表任选地被-NH2取代的芳基或苄基，其中Y4代表任选地被-NHCONH2取代的直链或支链的C1-6-烷基或代表任选地被-NH2取代的芳基或苄基，且Y5代表H或-CO-CHY6-NH2，其中Y6代表直链或支链的C1-6-烷基；
A代表CO、SO、SO2、SO2NH或CNNH2；
R3代表任选地被取代的烷基、芳基、杂芳基、杂烷基、杂环烷基基团，优选-L-#1或可被以下基团取代的C1-10-烷基、C6-10-芳基或C6-10-芳烷基、C5-10-杂烷基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳基或C5-10-杂环烷基基团：1-3个-OH基团、1-3个卤素原子、1-3个卤代烷基基团(各自具有1-3个卤素原子)、1-3个O-烷基基团、1-3个-SH基团、1-3个-S-烷基基团、1-3个-O-CO-烷基基团、1-3个-O-CO-NH-烷基基团、1-3个-NH-CO-烷基基团、1-3个-NH-CO-NH-烷基基团、1-3个-S(O)n-烷基基团、1-3个-SO2-NH-烷基基团、1-3个-NH-烷基基团、1-3个-N(烷基)2基团、1-3个-NH2基团或1-3个-(CH2)0-3Z基团，其中n代表0、1或2，Z代表-H、卤素、-OY3、-SY3、-NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，其中Y1和Y2各自独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z‘且Y3代表H、-(CH2)0-3-CH(NHCOCH3)Z‘、-(CH2)0-3-CH(NH2)Z‘或-(CH2)0-3Z‘，其中Z‘代表H、SO3H、NH2或COOH(其中“烷基”优选代表C1-10-烷基)；
R5代表H、F、NH2、NO2、卤素、SH或-(CH2)0-3Z，其中Z代表-H、卤素、-OY3、-SY3、NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2各自独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z‘，且Y3代表H或-(CH2)0-3Z‘，其中Z‘代表H、SO3H、NH2或COOH；
R6和R7各自独立地代表H、氰基、(任选地氟化的)C1-10-烷基、(任选地氟化的)C2-10-烯基、(任选地氟化的)C2-10-炔基、羟基或卤素；
R8代表(任选地氟化的)C1-10-烷基、(任选地氟化的)C4-10-环烷基或任选地被取代的氧杂环丁基；且
R9代表H、F、CH3、CF3、CH2F或CHF2。
通过R1、R3或R4上氢原子的取代，可以以本技术领域中普通技术人员已知的方式将式(I)或(Ia)化合物(其中取代基R1、R3和R4皆不代表-L-#1)结合至接头。这得到式(I)或(Ia)——其中取代基R1、R3或R4中的一个代表-L-#1，L代表接头且#1代表键合至抗体的键——的缀合物。如果根据式(I)或(Ia)的KSP抑制剂与结合体缀合，则因而取代基R1、R3或R4中的一个代表-L-#1，其中L代表接头且#1代表键合至抗体的键。也就是说，在缀合物的情况下，取代基R1、R3或R4中的一个代表-L-#1，其中-L-#1代表键合至抗体的键。结合体优选为人的、人源化或嵌合的单克隆抗体或其结合抗原的片段。在式(I)或(Ia)的一个优选实施方案中，取代基R1或R3中的一个代表-L-#1。在该实施方案中，特别优选R4代表H或-SGlys-(CO)0-1-R4’，其中SGlys和R4’具有如上所述的相同含义。在式(I)的另一个优选实施方案中，取代基R4代表-L-#1，其中接头为可在结合至R4的氮原子处裂解的接头，以使裂解后存在伯氨基(相应于R4＝H)。这类可裂解基团详述如下。优选发挥适度的激动作用或非激动作用的抗-TWEAKR抗体。所述抗体优选为人源化的或嵌合的单克隆ITEM-4抗-TWEAKR抗体。特别优选人源化的或嵌合的ITEM-4变体：TPP-7005、TPP-7006、TPP-7007、TPP-7053、TPP-7073、TPP-7074、TPP-7075和TPP-7076。
此外，基团-L-#3可代替-L-#1而存在于化合物中，其中L代表接头且#3代表用于结合至抗体的反应性基团。含-L-#3的化合物为与抗体反应的反应性化合物。#3优选为与氨基或硫醇基反应、优选与蛋白质中的半胱氨酸残基反应形成共价键的基团。蛋白质中的半胱氨酸残基可天然地存在于蛋白质中，可通过生物化学方法引入或优选地可通过在先的结合体的二硫化物的还原而产生。
对于A，优选CO(羰基)。
对于R1，优选的是-L-#1、H、-COOH、-CONHNH2、-(CH2)1-3NH2、-CONZ“(CH2)1-3NH2和-CONZ“CH2COOH，其中Z“代表H或NH2。
对于R2和R4优选的是H，或者R2和R4一起(其中形成吡咯烷环)代表-CH2-CHR11-或-CHR11-CH2-，其中R11代表H或F。对于R4，还优选-L-#1，其中-L-#1为可裂解的接头，优选可在细胞内被酶裂解的接头。
对于R3优选的是-L-#1或C1-10-烷基-，其可任选地被以下基团取代：-OH、O-烷基、SH、S-烷基、O-CO-烷基、O-CO-NH-烷基、NH-CO-烷基、NH-CO-NH-烷基、S(O)n-烷基、SO2-NH-烷基、NH-烷基、N(烷基)2或NH2(其中烷基优选为C1-3-烷基)。
对于R5，优选的是H或F。
对于R6和R7，各自独立地，优选为H、(任选地氟化的)C1-3-烷基、(任选地氟化的)C2-4-烯基、(任选地氟化的)C2-4-炔基、羟基或卤素。
对于R8，优选的是支链的C1-5-烷基，特别是式-C(CH3)2-(CH2)0-2-Ry基团，其中Ry代表-H、-OH、CO2H或NH2，或(任选地氟化的)C5-7-环烷基。特别优选式-C(CH3)3基团或环己基基团。
对于R9，优选为H或F。
尤其优选的是式(I)或(Ia)化合物，其中
A代表CO(羰基)；
R1代表H、-L-#1、-COOH、-CONHNH2、-(CH2)1-3NH2、-CONZ“(CH2)1-3NH2或-CONZ“CH2COOH，其中Z“代表H或NH2；
R2和R4代表H，或R2和R4一起(其中形成吡咯烷环)代表-CH2-CHR11-或-CHR11-CH2-，其中R11代表H或F；或R4代表-L-#1且R2代表H；
R3代表-L-#1或可被卤素(特别是F)或任选地氟化的C1-3-烷基单取代或多取代的苯基基团，或代表可任选地被以下基团取代的任选地氟化的C1-10-烷基基团：-OY4、-SY4、-O-CO-Y4、-O-CO-NH-Y4、NH-CO-Y4、-NH-CO-NH-Y4、S(O)n-Y4(其中n代表0、1或2)、-SO2-NH-Y4、NH-Y4或N(Y4)2，其中Y4代表H、苯基(任选地被卤素(特别是F)或任选地氟化的C1-3-烷基单取代或多取代)或烷基(其中烷基基团可被-OH、-COOH和/或-NHCO-C1-3-烷基取代且其中烷基优选地代表C1-3-烷基)；
其中特别优选地，R3可被-OH、O-烷基、SH、S-烷基、O-CO-烷基、O-CO-NH-烷基、NH-CO-烷基、NH-CO-NH-烷基、S(O)n-烷基、SO2-NH-烷基、NH-烷基、N(烷基)2或NH2(其中烷基优选地意指C1-3-烷基)取代；
R5代表H或F；
R6和R7各自独立地代表H、(任选地氟化的)C1-3-烷基、(任选地氟化的)C2-4-烯基、(任选地氟化的)C2-4-炔基、羟基或卤素；
R8代表支链的C1-5-烷基或环己基；且
R9代表H或F。
此外，优选(单独或组合)
R1代表-L-#1、COOH或H，
R2和R4代表H，或R2和R4一起(其中形成吡咯烷环)代表-CH2-CHR11-或-CHR11-CH2-，其中R11代表H，或R4代表-L-#1且R2代表H；
A代表CO，
R3代表-(CH2)OH、-CH(CH3)OH、-CH2SCH2CH(COOH)NHCOCH3、-CH(CH3)OCH3、可被1-3个卤素原子、1-3个氨基基团或1-3个烷基基团(其可任选地被卤代)取代的苯基基团，或代表-L-#1，
R5代表-H，
R6和R7各自独立地代表H、C1-3-烷基或卤素；特别地，R6和R7代表F；
R8代表C1-4-烷基(优选地叔丁基)或环己基；和/或
R9代表H。
另外，根据本发明，优选
R1代表-L-#1、COOH或H，
R2和R4代表H，或R2和R4一起(其中形成吡咯烷环)代表-CH2-CHR11-或-CHR11-CH2-，其中R11代表H，
A代表CO，
R3代表-(CH2)OH、-CH(CH3)OH、-CH2SCH2CH(COOH)NHCOCH3、-CH(CH3)OCH3、可被1-3个卤素原子、1-3个氨基基团或1-3个烷基基团(其可任选地被卤代)取代的苯基基团，或代表-L-#1，
R5代表H，
R6和R7各自独立地代表H、C1-3-烷基或卤素；特别地，R6和R7代表F；
R8代表C1-4-烷基(优选地叔丁基)；且
R9代表H。
其他特别优选的化合物具有下式(II)或(IIa)：
式(II)的化合物及其盐、溶剂合物、溶剂合物的盐和差向异构体：
其中
R1代表H、-L-结合体、-MOD或-(CH2)0-3Z，其中Z代表-H、-NHY3、-OY3、-SY3、卤素、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2各自独立地代表H、NH2、-(CH2CH2O)0-3-(CH2)0-3Z‘(例如-(CH2)0-3Z‘)或-CH(CH2W)Z‘，且Y3代表H或-(CH2)0-3Z‘，其中Z‘代表H、NH2、SO3H、-COOH、-NH-CO-CH2-CH2-CH(NH2)COOH或-(CO-NH-CHY4)1-3COOH，其中W代表H或OH，
其中Y4代表任选地被-NHCONH2取代的直链或支链的C1-6-烷基，或代表任选地被-NH2取代的芳基或苄基；
R2代表H、-MOD、-CO-CHY4-NHY5或-(CH2)0-3Z，其中Y4代表任选地被-NHCONH2取代的直链或支链的C1-6-烷基，或代表任选地被-NH2取代的芳基或苄基，且Y5代表H或-CO-CHY6-NH2，其中Y6代表直链或支链的C1-6-烷基，
其中Z代表-H、卤素、-OY3、-SY3、NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2各自独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z‘，且Y3代表H或-(CH2)0-3Z‘，其中Z‘代表H、SO3H、NH2或COOH；
R4代表H、-L-结合体、-SGlys-(CO)0-1-R4’、-CO-CHY4-NHY5或-(CH2)0-3Z，
其中SGlys代表可被溶酶体酶裂解的基团，特别是由二肽或三肽组成的基团，R4’代表可被-NH2、-NH-烷基、-N(烷基)2、NH-CO-烷基、N(烷基)-CO烷基、-SO3H、-SO2NH2、-SO2-N(烷基)2、-COOH、-CONH2、-CON(烷基)2或-OH单取代或多取代的C1-10-烷基、C5-10-芳基或C6-10-芳烷基、C5-10-杂烷基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳基、C5-10-杂环烷基、杂芳基、杂芳基烷基、杂芳基烷氧基、C1-10-烷氧基、C6-10-芳氧基或C6-10-芳烷氧基、C5-10-杂芳烷氧基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳氧基或C5-10-杂环烷氧基基团，或代表-H或基团-Ox-(CH2CH2O)y-R4”(其中x代表0或1且v代表1至10的数且R4”代表-H、-烷基(优选C1-12-烷基)、-CH2-COOH、-CH2-CH2-COOH或-CH2-CH2-NH2)；
其中Z代表-H、卤素、-OY3、-SY3、NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2各自独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z‘，且Y3代表H或-(CH2)0-3Z‘，其中Z‘代表H、SO3H、NH2或COOH；
其中Y4代表任选地被-NHCONH2取代的直链或支链的C1-6-烷基，或代表任选地被-NH2取代的芳基或苄基，且Y5代表H或-CO-CHY6-NH2，其中Y6代表直链或支链的C1-6-烷基；
或R2和R4一起(其中形成吡咯烷环)代表-CH2-CHR11-或-CHR11-CH2-，其中R11代表H、NH2、SO3H、COOH、SH、卤素(特别是F或Cl)、C1-4-烷基、C1-4-卤代烷基、C1-4-烷氧基、羟基取代的C1-4-烷基、COO(C1-4-烷基)或OH；
A代表CO、SO、SO2、SO2NH或CNNH2；
R3代表-L-结合体、-MOD或任选地被取代的烷基、环烷基、芳基、杂芳基、杂烷基、杂环烷基基团，优选-L-结合体或可被以下基团取代的C1-10-烷基、C6-10-芳基或C6-10-芳烷基、C5-10-杂烷基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳基或C5-10-杂环烷基基团：1-3个-OH基团、1-3个卤素原子、1-3个卤代的烷基基团(各自具有1-3个卤素原子)、1-3个O-烷基基团、1-3个-SH基团、1-3个-S-烷基基团、1-3个-O-CO-烷基基团、1-3个-O-CO-NH-烷基基团、1-3个-NH-CO-烷基基团、1-3个-NH-CO-NH-烷基基团、1-3个-S(O)n-烷基基团、1-3个-SO2-NH-烷基基团、1-3个-NH-烷基基团、1-3个-N(烷基)2基团、1-3个-NH2基团或1-3个-(CH2)0-3Z基团，其中Z代表-H、卤素、-OY3、-SY3、-NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，其中Y1和Y2各自独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z‘且Y3代表H、-(CH2)0-3-CH(NHCOCH3)Z‘、-(CH2)0-3-CH(NH2)Z‘或-(CH2)0-3Z‘，其中Z‘代表H、SO3H、NH2或COOH(其中“烷基”优选地代表C1-10-烷基)；
R5代表H、NH2、NO2、卤素(特别是F、Cl、Br)、-CN、CF3、-OCF3、-CH2F、-CH2F，SH或-(CH2)0-3Z，其中Z代表-H、-OY3、-SY3、卤素、NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2各自独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z‘，且Y3代表H或-(CH2)0-3Z‘，其中Z‘代表H、SO3H、NH2或COOH；
R6和R7各自独立地代表H、氰基、(任选地氟化的)C1-10-烷基、(任选地氟化的)C2-10-烯基、(任选地氟化的)C2-10-炔基、羟基、NO2、NH2、COOH或卤素(特别是F、Cl、Br)，
R8代表(任选地氟化的)C1-10-烷基、(任选地氟化的)C2-10-烯基、(任选地氟化的)C2-10-炔基、(任选地氟化的)C4-10-环烷基或-(CH2)0-2-(HZ2)，其中HZ2代表具有至多两个选自N、O和S的杂原子的4-至7-元杂环，其中这些基团中的每一个可被-OH、CO2H或NH2取代；
R9代表H、F、CH3、CF3、CH2F或CHF2；
其中-MOD代表-(NR10)n-(G1)o-G2-G3，其中
R10代表H或C1-C3-烷基；
G1代表-NHCO-或-CONH-(其中，如果G1代表-NHCO-，R10不代表NH2)；
n代表0或1；
o代表0或1；且
G2代表直链和/或支链的烃基，其具有1至10个碳原子且可被一个或更多个以下基团中断一次或更多次：-O-、-S-、-SO-、SO2、-NRy-、-NRyCO-、CONRy-、-NRyNRy-、-SO2NRyNRy-、-CONRyNRy-(其中Ry代表H、苯基、C1-C10-烷基、C2-C10-烯基或C2-C10-炔基，其各自可被NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸)、-CO-或-CRx＝N-O-(其中Rx代表H、C1-C3-烷基或苯基)取代，其中含任何侧链的烃链可被-NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代，G3代表-H或-COOH，且其中基团-MOD优选地具有至少一个基团-COOH。
在式(II)的KSP抑制剂的结合体缀合物的情况下，R1、R3和R4中的至多一个(或者上面给出的条件之一)可代表-L-结合体，其中L代表接头且结合体代表抗体，其中抗体可任选地结合至多个活性化合物分子。
式(IIa)的化合物及其盐、溶剂合物、溶剂合物的盐和差向异构体：
其中
R1代表-L-结合体、H或-(CH2)0-3Z，其中Z代表-H、-NHY3、-OY3、-SY3、卤素、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2各自独立地代表H、NH2、-(CH2CH2O)0-3-(CH2)0-3Z‘或-CH(CH2W)Z‘，且Y3代表H或-(CH2)0-3Z‘，其中Z‘代表H、NH2、SO3H、COOH、-NH-CO-CH2-CH2-CH(NH2)COOH或-(CO-NH-CHY4)1-3COOH；其中W代表H或OH；
其中Y4代表任选地被-NHCONH2取代的直链或支链的C1-6-烷基，或代表任选地被-NH2取代的芳基或苄基；
R2和R4各自独立地代表H、-SGlys-(CO)0-1-R4’、-CO-CHY4-NHY5或-(CH2)0-3Z，或R2和R4一起(其中形成吡咯烷环)代表-CH2-CHR11-或-CHR11-CH2-，或R2代表H、-CO-CHY4-NHY5或-(CH2)0-3Z和R4代表-L-#1，其中R11代表H、NH2、SO3H、COOH、SH、卤素(特别是F或Cl)、C1-4-烷基、C1-4-卤代烷基、C1-4-烷氧基、羟基-取代的C1-4-烷基、COO(C1-4-烷基)或OH；
其中SGlys代表可被溶酶体酶裂解的基团，特别是由二肽或三肽组成的基团，R4’代表可被-NH2、-NH-烷基、-N(烷基)2、NH-CO-烷基、N(烷基)-CO烷基、-SO3H、-SO2NH2、-SO2-N(烷基)2、-COOH、-CONH2、-CON(烷基)2或-OH单取代或多取代的C1-10-烷基、C5-10-芳基或C6-10-芳烷基、C5-10-杂烷基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳基、C5-10-杂环烷基、杂芳基、杂芳基烷基、杂芳基烷氧基、C1-10-烷氧基、C6-10-芳氧基或C6-10-芳烷氧基、C5-10-杂芳烷氧基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳氧基或C5-10-杂环烷氧基基团，或代表-H或基团-Ox-(CH2CH2O)y-R4”(其中x代表0或1且v代表1至10的数且R4”代表-H、-烷基(优选C1-12-烷基)、-CH2-COOH、-CH2-CH2-COOH或-CH2-CH2-NH2)；
其中Z代表--H、卤素、-OY3、-SY3、NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2各自独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z‘，且Y3代表H或-(CH2)0-3Z‘，其中Z‘代表H、SO3H、NH2或COOH；
其中Y4代表任选地被-NHCONH2取代的直链或支链的C1-6-烷基，或代表任选地被-NH2取代的芳基或苄基，且Y5代表H或-CO-CHY6-NH2，其中Y6代表直链或支链的C1-6-烷基；
A代表CO、SO、SO2、SO2NH或CNNH2；
R3代表-L-结合体或任选地被取代的烷基、芳基、杂芳基、杂烷基、杂环烷基基团，优选-L-结合体或可被以下基团取代的C1-10-烷基、C6-10-芳基或C6-10-芳烷基、C5-10-杂烷基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳基或C5-10-杂环烷基基团：1-3个-OH基团、1-3个卤素原子、1-3个卤代的烷基基团(各自具有1-3个卤素原子)、1-3个O-烷基基团、1-3个-SH基团、1-3个-S-烷基基团、1-3个-O-CO-烷基基团、1-3个-O-CO-NH-烷基基团、1-3个-NH-CO-烷基基团、1-3个-NH-CO-NH-烷基基团、1-3个-S(O)n-烷基基团、1-3个-SO2-NH-烷基基团、1-3个-NH-烷基基团、1-3个-N(烷基)2基团、1-3个-NH2基团或1-3个-(CH2)0-3Z基团，其中Z代表-H、卤素、-OY3、-SY3、-NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，其中Y1和Y2各自独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z‘且Y3代表H、-(CH2)0-3-CH(NHCOCH3)Z‘、-(CH2)0-3-CH(NH2)Z‘或-(CH2)0-3Z‘，其中Z‘代表H、SO3H、NH2或COOH(其中“烷基”优选地代表C1-10-烷基)；
R5代表H、F、NH2、NO2、卤素、SH或-(CH2)0-3Z，其中Z代表-H、卤素、-OY3、-SY3、-NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2各自独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z‘，且Y3代表H或-(CH2)0-3Z‘，其中Z‘代表H、SO3H、NH2或COOH；
其中L代表接头，结合体代表结合体或其衍生物，其中结合体可任选地连接至多个活性化合物分子，
R6和R7各自独立地代表H、氰基、(任选地氟化的)C1-10-烷基、(任选地氟化的)C2-10-烯基、(任选地氟化的)C2-10-炔基、羟基或卤素，
R8代表(任选地氟化的)C1-10-烷基、(任选地氟化的)C4-10-环烷基或任选地被取代的氧杂环丁基；且
R9代表H、F、CH3、CF3、CH2F或CHF2。
此外，本发明优选下面的KSP抑制剂/抗体缀合物：
式(IIb)：
其中R1、R2、R4、R5、R6、R7、R8和R9具有与式(II)或(IIa)中相同的含义，A代表CO，B代表单键、-O-CH2-或-CH2-O-，R20代表NH2、F、CF3或CH3，且n代表0、1或2。
式(IIc)：
其中A、R1、R3、R6、R7、R8和R9具有与式(II)或(IIa)中相同的含义，其中A优选地代表CO且R3代表-CH2OH、-CH2OCH3、CH(CH3)OH或CH(CH3)OCH3。
式(IId)：
其中A、R3、R6、R7、R8和R9具有与式(II)或(IIa)中相同的含义，其中A优选地代表CO且R3代表-CH2-Sx-(CH2)0-4-CHY5-COOH，其中x代表0或1且Y5代表H或NHY6，其中Y6代表H或-COCH3。
式(IIe)：
其中A、R2、R3、R4、R6、R7、R8和R9具有与式(II)或(IIa)中相同的含义，R1代表-L-结合体。
式(III)：
其中A、R1、R2、R3、R6、R7、R8和R9具有与式(II)或(IIa)中相同的含义，R4代表-L-结合体，优选可酶促裂解的结合体，以使得裂解后R4＝H。R1或R3特别优选地代表-MOD。
式(IIj)：
其中
R3代表-L-#1；
A代表CO；且
R6、R7、R8和R9具有与式(I)中相同的含义，
式(IIk)：
其中
R1代表-L-#1；
A代表CO且R3代表-CH2OH；
R3、R6、R7、R8和R9具有与式(I)中相同的含义。
此外，优选式(II)、(IIa)、(IIb)、(IIc)、(IId)、(IIe)、(IIi)、(IIj)和(IIk)的化合物(单独或组合)：
Z代表Cl或Br；
R1代表-(CH2)0-3Z，其中Z代表-COOH或-CO-NY1Y2，其中Y2代表-(CH2CH2O)0-3-(CH2)0- 3Z‘且Y1代表H、NH2或-(CH2CH2O)0-3-(CH2)0-3Z’；
Y1代表H，Y2代表-(CH2CH2O)3-CH2CH2Z‘且Z‘代表-COOH；
Y1代表H，Y2代表-CH2CH2Z‘且Z‘代表-(CONHCHY4)2COOH；
Y1代表H，Y2代表-CH2CH2Z‘，Z‘代表-(CONHCHY4)2COOH且Y4基团之一代表异丙基且其余代表-(CH2)3-NHCONH2；
Y1代表H，Y2代表-CH2CH2Z‘，Z‘代表-(CONHCHY4)2COOH且Y4基团之一代表-CH3且其余代表-(CH2)3-NHCONH2；
Y4代表任选地被-NHCONH2取代的直链或支链的C1-6-烷基；
至少一个Y4选自异丙基和-CH3；
Y1代表H，Y2代表-CH2CH2Z‘，Z‘代表-CONHCHY4COOH且Y4代表代表任选地被-NH2取代的芳基或苄基；
Y4代表氨基苄基；
R2代表-(CH2)0-3Z且Z代表-SY3；
R4代表-CO-CHY4-NHY5，且Y5代表H；
R4代表-CO-CHY4-NHY5，且Y5代表-CO-CHY6-NH2；或
Y4代表任选地被-NHCONH2取代的直链或支链的C1-6-烷基。
此外，优选式(I)或(II)中R1、R2或R3代表-MOD。
特别优选地，R3代表-MOD且R1或R4代表-L-#1或-L-结合体，
其中-MOD代表-(NR10)n-(G1)o-G2-G3，其中
R10代表H或C1-C3-烷基；
G1代表-NHCO-或-CONH-(其中，如果G1代表-NHCO-，则R10不代表NH2)；
n代表0或1；
o代表0或1；且
G2代表直链和/或支链的烃基，其具有1至10个碳原子且可被一个或更多个以下基团中断一次或更多次：-O-、-S-、-SO-、SO2、-NRy-、-NRyCO-、CONRy-、-NRyNRy-、-SO2NRyNRy-、-CONRyNRy-(其中Ry代表H、苯基、C1-C10-烷基、C2-C10-烯基或C2-C10-炔基，其各自被NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、-NH-CNNH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸)、-CO-或-CRx＝N-O-(其中Rx代表H、C1-C3-烷基或苯基)取代，其中含任何侧链的烃链可被NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代，其中G3代表-H或-COOH，且其中基团-MOD优选地具有至少一个基团-COOH；
特别优选地，基团-MOD具有(优选地末端)-COOH基团，例如在甜菜碱基团中。优选地，基团-MOD具有式-CH2-Sx-(CH2)0-4-CHY5-COOH，其中x为0或1，且Y5代表H或NHY6，其中Y6代表H或-COCH3。
其他特别优选的化合物具有下式(III)的化合物及其盐、溶剂合物、溶剂合物的盐和差向异构体：
其中
R1代表-L-结合体、H或-(CH2)0-3Z，其中Z代表-H、-NHY3、-OY3、-SY3、卤素、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2各自独立地代表H、NH2、-(CH2CH2O)0-3-(CH2)0-3Z‘或-CH(CH2W)Z‘，Y3代表H或-(CH2)0-3Z‘，其中Z‘代表H、NH2、SO3H、COOH、-NH-CO-CH2-CH2-CH(NH2)COOH或-(CO-NH-CHY4)1-3COOH；
其中Y4代表任选地被-NHCONH2取代的直链或支链的C1-6烷基，或代表任选地被-NH2取代的芳基或苄基；
R2和R4各自独立地代表H、-SGlys-(CO)0-1-R4’、-CO-CHY4-NHY5或-(CH2)0-3Z，
或R2和R4一起(其中形成吡咯烷环)代表-CH2-CHR11-或-CHR11-CH2-，其中R11代表H、NH2、SO3H、COOH、SH、卤素(特别是F或Cl)、C1-4-烷基、C1-4-卤代烷基、C1-4-烷氧基、羟基-取代的C1-4-烷基、COO(C1-4-烷基)或OH；
其中SGlys代表可被溶酶体酶裂解的基团，特别是由二肽或三肽组成的基团，R4’代表可被-NH2、-NH-烷基、-N(烷基)2、NH-CO-烷基、N(烷基)-CO烷基、-SO3H、-SO2NH2、-SO2-N(烷基)2、-COOH、-CONH2、-CON(烷基)2或-OH单取代或多取代的C1-10-烷基、C5-10-芳基或C6-10-芳烷基、C5-10-杂烷基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳基、C5-10-杂环烷基、杂芳基、杂芳基烷基、杂芳基烷氧基、C1-10-烷氧基、C6-10-芳氧基或C6-10-芳烷氧基、C5-10-杂芳烷氧基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳氧基、C5-10-杂环烷氧基基团，或代表-H或基团-Ox-(CH2CH2O)y-R4”(其中x代表0或1且v代表1至10的数且R4”代表-H、-烷基(优选C1-12-烷基)、-CH2-COOH、-CH2-CH2-COOH或-CH2-CH2-NH2)；
其中Z代表-H、卤素、-OY3、-SY3、NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2各自独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z‘，且Y3代表H或-(CH2)0-3Z‘，其中Z‘代表H、SO3H、NH2或COOH；
其中Y4代表任选地被-NHCONH2取代的直链或支链的C1-6-烷基，或代表任选地被-NH2取代的芳基或苄基，且Y5代表H或-CO-CHY6-NH2，其中Y6代表直链或支链的C1-6-烷基；
A代表CO、SO、SO2、SO2NH或CNNH2；
R3代表-L-结合体或任选地被取代的烷基、芳基、杂芳基、杂烷基、杂环烷基基团，或-CH2-Sx-(CH2)0-4-CHY5-COOH，其中x代表0或1且Y5代表H或NHY6，其中Y6代表H或-COCH3，优选-L-结合体或可被以下基团取代的C1-10-烷基、C6-10-芳基或C6-10-芳烷基、C5-10-杂烷基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳基或C5-10-杂环烷基基团：1-3个-OH基团、1-3个卤素原子、1-3个卤代烷基基团(各自具有1-3个卤素原子)、1-3个O-烷基基团、1-3个-SH基团、1-3个-S-烷基基团、1-3个-O-CO-烷基基团、1-3个-O-CO-NH-烷基基团、1-3个-NH-CO-烷基基团、1-3个-NH-CO-NH-烷基基团、1-3个-S(O)n-烷基基团、1-3个-SO2-NH-烷基基团、1-3个-NH-烷基基团、1-3个-N(烷基)2基团、1-3个-NH2基团或1-3个-(CH2)0-3Z基团，其中Z代表-H、卤素、-OY3、-SY3、-NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，其中Y1和Y2各自独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z‘且Y3代表H、-(CH2)0-3-CH(NHCOCH3)Z‘、-(CH2)0-3-CH(NH2)Z‘或-(CH2)0-3Z‘，其中Z‘代表H、SO3H、NH2或COOH(其中“烷基”优选地代表C1-10-烷基)；
R5代表H、F、NH2、NO2、卤素、SH或-(CH2)0-3Z，其中Z代表-H、卤素、-OY3、-SY3、-NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2各自独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z‘，且Y3代表H或-(CH2)0-3Z‘，其中Z‘代表H、SO3H、NH2或COOH；
其中L代表接头，结合体代表抗体，其中结合体可任选地连接与多个活性化合物分子，
R6和R7各自独立地代表H、氰基、(任选地氟化的)C1-10-烷基、(任选地氟化的)C2-10-烯基、(任选地氟化的)C2-10-炔基、羟基或卤素，
R8代表(任选地氟化的)C1-10-烷基、(任选地氟化的)C4-10-环烷基或任选地被取代的氧杂环丁基；且
R9代表H、F、CH3、CF3、CH2F或CHF2。
此外，优选(单独的或组合的)式(I)、(Ia)、(II)、(IIa)、(IIb)、(IIc)、(IId)、(IIe)、(IIi)、(IIj)、(IIk)或(III)中：
Z代表Cl或Br；
R1代表-(CH2)0-3Z，其中Z代表-CO-NY1Y2，其中Y2代表-(CH2CH2O)0-3-(CH2)0-3Z‘且Y1代表H、NH2或-(CH2CH2O)0-3-(CH2)0-3Z’；
Y1代表H，Y2代表-(CH2CH2O)3-CH2CH2Z‘且Z‘代表-COOH；
Y1代表H，Y2代表-CH2CH2Z‘，Z‘代表-(CONHCHY4)2COOH；
Y1代表H，Y2代表-CH2CH2Z‘，Z‘代表-(CONHCHY4)2COOH且一个Y4代表异丙基且其余代表-(CH2)3-NHCONH2；
Y1代表H，Y2代表-CH2CH2Z‘，Z‘代表-(CONHCHY4)2COOH且一个Y4代表-CH3且其余代表-(CH2)3-NHCONH2；
Y4代表任选地被-NHCONH2取代的直链或支链的C1-6-烷基；
至少一个Y4选自异丙基和-CH3；
Y1代表H，Y2代表-CH2CH2Z‘，Z‘代表-CONHCHY4COOH且Y4代表任选地被-NH2取代的芳基或苄基；
Y4代表氨基苄基；
R2代表-(CH2)0-3Z且Z代表-SY3；
R4代表-CO-CHY4-NHY5且Y5代表H；
R4代表-CO-CHY4-NHY5且Y5代表-CO-CHY6-NH2；和/或
Y4代表任选地被-NHCONH2取代的直链或支链的C1-6-烷基。
此外优选式(I)、(Ia)、(II)、(IIa)或(III)的化合物及其盐、溶剂合物、溶剂合物的盐和差向异构体，
其中
R1代表H、-L-#1或-L-结合体、-MOD或-(CH2)0-3Z，其中Z代表-H、-NHY3、-OY3、-SY3、卤素、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2各自独立地代表H、NH2、-(CH2CH2O)0-3-(CH2)0-3Z‘(例如-(CH2)0-3Z‘)或-CH(CH2W)Z‘，且Y3代表H或-(CH2)0-3Z‘，其中Z‘代表H、NH2、SO3H、COOH、-NH-CO-CH2-CH2-CH(NH2)COOH或-(CO-NH-CHY4)1-3COOH，其中W代表H或OH，
其中Y4代表任选地被-NHCONH2取代的直链或支链的C1-6-烷基，或代表任选地被-NH2取代的芳基或苄基；
R2代表H、-CO-CHY4-NHY5或-(CH2)0-3Z，
其中Z代表-H、卤素、-OY3、-SY3、NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2各自独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z‘，且Y3代表H或-(CH2)0-3Z‘，其中Z‘代表H、SO3H、NH2或COOH；
其中Y4各自独立地代表任选地-NHCONH2被取代的直链或支链的C1-6-烷基，或代表任选地被-NH2取代的芳基或苄基，且Y5代表H或-CO-CHY6-NH2，其中Y6代表直链或支链的C1-6-烷基；
R4代表H或-L-#1或-L-结合体(其中-L-#1或-L-结合体为可酶促地裂解的接头，从而导致R4转化为H)；
A代表CO、SO、SO2、SO2NH或CNNH2；
R3代表-L-#1或-L-结合体、-MOD或任选地被取代的烷基、环烷基、芳基、杂芳基、杂烷基、杂环烷基基团，优选可被以下基团取代的C1-10-烷基、C6-10-芳基或C6-10-芳烷基、C5-10-杂烷基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳基或C5-10-杂环烷基基团：1-3个-OH基团、1-3个卤素原子、1-3个卤代烷基基团(各自具有1-3个卤素原子)、1-3个O-烷基基团、1-3个-SH基团、1-3个-S-烷基基团、1-3个-O-CO-烷基基团、1-3个-O-CO-NH-烷基基团、1-3个-NH-CO-烷基基团、1-3个-NH-CO-NH-烷基基团、1-3个-S(O)n-烷基基团、1-3个-SO2-NH-烷基基团、1-3个-NH-烷基基团、1-3个-N(烷基)2基团、1-3个-NH((CH2CH2O)1-20H)基团、1-3个-NH2基团或1-3个-(CH2)0- 3Z基团，其中Z代表-H、卤素、-OY3、-SY3、-NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，其中Y1和Y2各自独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z‘，且Y3代表H、-(CH2)0-3-CH(NHCOCH3)Z‘、-(CH2)0-3-CH(NH2)Z‘或-(CH2)0-3Z‘，其中Z‘代表H、SO3H、NH2或COOH(其中“烷基”优选为C1-10-烷基)；
R5代表H、-MOD、NH2、NO2、卤素(特别是F、Cl、Br)、-CN、CF3、-OCF3、-CH2F，-CH2F、SH或-(CH2)0-3Z，其中Z代表-H、-OY3、-SY3、卤素、NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2各自独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z‘，且Y3代表H或-(CH2)0-3Z‘，其中Z‘代表H、SO3H、NH2或COOH；
R6和R7各自独立地代表H、氰基、(任选地氟化的)C1-10-烷基、(任选地氟化的)C2-10-烯基、(任选地氟化的)C2-10-炔基、羟基、NO2、NH2、COOH或卤素(特别是F、Cl、Br)，
R8代表(任选地氟化的)C1-10-烷基、(任选地氟化的)C2-10-烯基、(任选地氟化的)C2-10-炔基或(任选地氟化的)C4-10-环烷基；
其中取代基R1和R3之一代表-L-#1或-L-结合体，
L代表接头，#1代表键合至抗体的键，结合体代表抗体，
R9代表H、F、CH3、CF3、CH2F或CHF2；
其中-MOD代表-(NR10)n-(G1)o-G2-G3，其中
R10代表H或C1-C3-烷基；
G1代表-NHCO-或-CONH-(其中，如果G1代表-NHCO-，则R10不代表NH2)；
n代表0或1；
o代表0或1；且
G2代表直链和/或支链的烃基，其具有1至10个碳原子且可被一个或更多个以下基团中断一次或更多次：-O-、-S-、-SO-、SO2、-NRy-、-NRyCO-、CONRy-、-NRyNRy-、-SO2NRyNRy-、-CONRyNRy-(其中Ry代表H、苯基、C1-C10-烷基、C2-C10-烯基或C2-C10-炔基，其可各自被NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代)、-CO-、-CRx＝N-O-(其中Rx代表H、C1-C3-烷基或苯基)，其中含任意侧链的烃链可被-NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代，G3代表-H或-COOH，且其中基团-MOD优选地具有至少一个基团-COOH。
还优选式(I)、(Ia)、(II)、(IIa)或(III)化合物及其盐、溶剂合物、溶剂合物的盐和差向异构体，其中
R1代表H、-L-#1或-L-结合体、-MOD或-(CH2)0-3Z，其中Z代表-H、-NHY3、-OY3、-SY3、卤素、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2各自独立地代表H、NH2、-(CH2CH2O)0-3-(CH2)0-3Z‘(例如-(CH2)0-3Z‘)或-CH(CH2W)Z‘，且Y3代表H或-(CH2)0-3Z‘，其中Z‘代表H、NH2、SO3H、COOH、-NH-CO-CH2-CH2-CH(NH2)COOH或-(CO-NH-CHY4)1-3COOH，其中W代表H或OH，
其中Y4代表任选地被-NHCONH2取代的直链或支链的C1-6-烷基，或代表任选地被-NH2取代的芳基或苄基；
R2代表H、-CO-CHY4-NHY5或-(CH2)0-3Z，
其中Z代表-H、卤素、-OY3、-SY3、NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2各自独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z‘，且Y3代表H或-(CH2)0-3Z‘，其中Z‘代表H、SO3H、NH2或COOH；
其中Y4代表任选地被-NHCONH2取代的直链或支链的C1-6-烷基，或代表任选地被-NH2取代的芳基或苄基，且Y5代表H或-CO-CHY6-NH2，其中Y6代表直链或支链的C1-6-烷基；
R4代表H，
A代表CO、SO、SO2、SO2NH或CNNH2；
R3代表-L-#1或-L-结合体、-MOD或任选地被取代的烷基、环烷基、芳基、杂芳基、杂烷基、杂环烷基基团，优选地可被以下基团取代的C1-10-烷基、C6-10-芳基或C6-10-芳烷基、C5-10-杂烷基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳基或C5-10-杂环烷基基团：1-3个-OH基团、1-3个卤素原子、1-3个卤代烷基基团(各自具有1-3个卤素原子)、1-3个O-烷基基团、1-3个-SH基团、1-3个-S-烷基基团、1-3个-O-CO-烷基基团、1-3个-O-CO-NH-烷基基团、1-3个-NH-CO-烷基基团、1-3个-NH-CO-NH-烷基基团、1-3个-S(O)n-烷基基团、1-3个-SO2-NH-烷基基团、1-3个-NH-烷基基团、1-3个-N(烷基)2基团、1-3个-NH((CH2CH2O)1-20H)基团、1-3个-NH2基团或1-3个-(CH2)0-3Z基团，其中Z代表-H、卤素、-OY3、-SY3、-NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，其中Y1和Y2各自独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z‘且Y3代表H、-(CH2)0-3-CH(NHCOCH3)Z‘、-(CH2)0-3-CH(NH2)Z‘或-(CH2)0-3Z‘，其中Z‘代表H、SO3H、NH2或COOH(其中“烷基”优选为C1-10-烷基)；
R5代表H、-MOD、NH2、NO2、卤素(特别是F、Cl、Br)、-CN、CF3、-OCF3、-CH2F、-CH2F、SH或-(CH2)0-3Z，其中Z代表-H、-OY3、-SY3、卤素、NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2各自独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z‘，且Y3代表H或-(CH2)0-3Z‘，其中Z‘代表H、SO3H、NH2或COOH；
R6和R7各自独立地代表H或卤素(特别是F、Cl、Br)；
R8代表(任选地氟化的)C1-10-烷基；
其中取代基R1和R3中的一个代表-L-#1或-L-结合体，
L代表接头且#1代表键合至抗体的键且结合体代表抗体，
R9代表H、F、CH3、CF3、CH2F或CHF2；
其中-MOD代表-CH2-Sx-(CH2)0-4-CHY5-COOH，其中x为0或1，且Y5代表H或NHY6，其中Y6代表H或-COCH3。
还优选可任选地与酸例如三氟乙酸一起存在的下述化合物。这些化合物可通过对应于位置R1、R3和R4的位置通过接头连接至抗体(其中氢原子被接头取代)：
N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}-2-羟基乙酰胺；
(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-N-甲基丁酰胺(1∶1)；
N-(3-氨基丙基)-N-{(1S)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}乙酰胺；
N-(3-氨基丙基)-N-{(1S)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}-2-羟基乙酰胺；
S-(1-{2-[(N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}-β-丙氨酰基)氨基]乙基}-2，5-二氧代吡咯烷-3-基)-L-半胱氨酸；
S-(1-{2-[(N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}-β-丙氨酰基)氨基]乙基}-2，5-二氧代吡咯烷-3-基)-L-半胱氨酸；
S-[1-(2-{[2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}氨基)乙基]氨基}-2-氧代乙基)-2，5-二氧代吡咯烷-3-基]-L-半胱氨酸；
N-[19-(3(R/S)-{[(2R)-2-氨基-2-羧乙基]硫烷基}-2，5-二氧代吡咯烷-1-基)-17-氧代-4，7，10，13-四氧杂-16-氮杂十九烷-1-酰基]-R/S-{2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}高半胱氨酸；
S-{(3R/S)-1-[2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}氨基)乙基]-2，5-二氧代吡咯烷-3-基}-L-半胱氨酸；
S-[(3R/S)-1-(2-{[6-({2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}硫烷基)己酰基]氨基}乙基)-2，5-二氧代吡咯烷-3-基]-L-半胱氨酸；
S-{1-[2-({[(1R，3S)-3-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}氨基)环戊基]羰基}氨基)乙基]-2，5-二氧代吡咯烷-3-基}-L-半胱氨酸；
S-(2-{[2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}氨基)乙基]氨基}-2-氧代乙基)-L-半胱氨酸；
N6-(N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}-β-丙氨酰基)-N2-{N-[6-(3-{[(2R)-2-氨基-2-羧乙基]硫烷基}-2，5-二氧代吡咯烷-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酰基}-L-赖氨酸；
N-[2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}氨基)乙基]-L-谷氨酰胺；
N6-(N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}-β-丙氨酰基)-L-赖氨酸；
N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}-3，3，3-三氟丙酰胺；
N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}-4-氟苯甲酰胺；
N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}乙酰胺；
N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}-4-(三氟甲基)苯甲酰胺；
(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酸；
(2S)-2-氨基-N-(2-氨基乙基)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰胺；
4-[(2-{[2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}氨基)乙基]氨基}-2-氧代乙基)氨基]-3-{[(2R)-2-氨基-2-羧乙基]硫烷基}-4-氧代丁酸；
4-[(2-{[2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}氨基)乙基]氨基}-2-氧代乙基)氨基]-2-{[(2R)-2-氨基-2-羧乙基]硫烷基}-4-氧代丁酸；
N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}-β-丙氨酸；
N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}-L-丝氨酸；
N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}-L-丙氨酸；
N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}甘氨酸；
N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}-4-甲基苯甲酰胺；
N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}-4-(甲基硫烷基)苯甲酰胺；
(2S)-N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}-2-羟基丙酰胺；
N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}-2-(甲基硫烷基)乙酰胺；
(2S)-N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[4-苄基-1-(2，5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2，2-二甲基丙基}-2-羟基丙酰胺；
4-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}氨基]-4-氧代丁酸甲酯；
4-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}氨基]-4-氧代丁酸；
(2R)-22-[(3R/S)-3-{[(2R)-2-氨基-2-羧乙基]硫烷基}-2，5-二氧代吡咯烷-1-基]-2-[({2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}硫烷基)甲基]-4，20-二氧代-7，10，13，16-四氧杂-3，19-二氮杂二十二烷-1-酸；
N-乙酰基-S-{2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}-L-半胱氨酸；
N-乙酰基-S-[2-([3-(L-丙氨酰基氨基)丙基]{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}氨基)-2-氧代乙基]-L-半胱氨酸；
(2S)-N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}四氢呋喃-2-羧酰胺；
3-({2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}硫烷基)丙酸；
S-{2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}高半胱氨酸；
4-氨基-N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}苯甲酰胺；
4-[(2-{[(2R)-2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}氨基)-2-羧乙基]氨基}-2-氧代乙基)氨基]-3-{[(2R)-2-氨基-2-羧乙基]硫烷基}-4-氧代丁酸；
4-[(2-{[(2R)-2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}氨基)-2-羧乙基]氨基}-2-氧代乙基)氨基]-2-{[(2R)-2-氨基-2-羧乙基]硫烷基}-4-氧代丁酸。
根据本发明特别优选下式IV化合物，其中R1、R2、R3、R4和R5具有上述含义(如例如式(I)或(II)中所述)：
特别优选式IV的化合物，其中R1和R5代表H或-L-#1；R2和R4代表H或R2和R4一起(其中形成吡咯烷环)代表-CH2-CHR11-或-CHR11-CH2-，其中R11代表H；R3代表CH2OH、CH(CH3)OH或-L-#1，其中取代基R1和R3中的一个代表-L-#1。此外，特别优选式IV的化合物，其中R1代表H或COOH；R2和R5代表H；R4代表-L-#1；且R3代表CH2OH或CH(CH3)OH，其中-L-#1为可酶促地裂解的接头，其导致R4转化为H。
接头
文献公开了用于将有机分子共价偶联(缀合)至结合体例如抗体上的多种多样的选项(参见例如K.Lang和J.W.Chin.Chem.Rev.2014，114，4764-4806，M.Rashidian等Bioconjugate Chem.2013，24，1277-1294)。根据本发明优选的是KSP抑制剂通过已作为游离硫醇而存在的或通过二硫桥的还原而产生的抗体的半胱氨酸残基的一个或更多个硫原子和/或通过抗体的赖氨酸残基的一个或更多个NH基团缀合至抗体。但是，也可以通过酪氨酸残基、通过谷氨酰胺残基、通过非天然氨基酸的残基、通过游离羧基或通过抗体的糖残基将KSP抑制剂连接至抗体上。对于偶联，使用的是接头。接头可分类成可体内裂解的接头类别和体内稳定的接头类别(参见L.Ducry和B.Stump，Bioconjugate Chem.21，5-13(2010))。可体内裂解的接头具有可体内裂解的基团，其转而又可区分可体内化学裂解的基团和可体内酶促裂解的基团。“可体内化学裂解”和“可体内酶促裂解”是指该接头或基团在循环中稳定并仅在靶细胞处或靶细胞中通过其中不同的化学或酶环境(较低pH；升高的谷胱甘肽浓度；溶酶体酶如组织蛋白酶或血纤维蛋白溶酶或糖苷酶如β-葡糖醛酸酶的存在)而裂解，由此释放低分子量KSP抑制剂或其衍生物。可体内化学裂解的基团特别是二硫化物、腙、缩醛和缩醛胺；可体内酶促裂解的基团、特别是可通过溶酶体酶裂解的那些特别是2-8-寡肽基团，尤其是三肽基团或二肽基团或糖苷。在Bioconjugate Chem.2002，13，855-869和Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters 8(1998)3341-3346以及BioconjugateChem.1998，9，618-626中公开了肽裂解位点。这些包括，例如，缬氨酸-丙氨酸、缬氨酸-赖氨酸、缬氨酸-瓜氨酸、丙氨酸-赖氨酸和苯丙氨酸-赖氨酸(任选具有额外的酰胺基团)。
体内稳定的接头以高稳定性为特征(在血浆中24小时后少于5％代谢产物)并且没有上文提到的可化学地或酶促地体内裂解的基团。
接头-L-优选地具有下面的基本结构(i)至(iv)之一：
(i)-(CO)m-SG1-L1-L2-
(ii)-(CO)m-L1-SG-L1-L2-
(iii)-(CO)m-L1-L2-
(iv)-(CO)m-L1-SG-L2
其中m为0或1；SG为可(化学地或酶促地)体内裂解的基团(特别是二硫化物、腙、缩醛和缩醛胺；或可被蛋白酶裂解的2-8-寡肽基团)，SG1是寡肽基团或优选二肽基团，L1各自独立地代表体内稳定的有机基团，且L2代表偶联至结合体的偶联基团或单键。在此，优选偶联至抗体的半胱氨酸残基或赖氨酸残基上。或者，可以偶联到抗体的酪氨酸残基、谷氨酰胺残基或非天然氨基酸上。非天然氨基酸可含有例如醛或酮基(例如甲酰基甘氨酸)或叠氮或炔基(参见Lan&Chin，Cellular Incorporation of Unnatural Amino Acids andBioorthogonal Labeling of Proteins，Chem.Rev.2014，114，4764-4806)。
根据本发明特别优选基本接头结构(iii)。通过代谢，具有基本接头结构(iii)且将接头偶联至抗体的半胱氨酸或赖氨酸残基的本发明的缀合物的给药产生下式的半胱氨酸或赖氨酸衍生物：
其中L1在每种情况下连接至低分子量KSP抑制剂，例如式(I)、(Ia)、(II)、(IIa)、(IIb)、(IIca)、(IId)、(IIe)、(IIf)、(III)或(IV)的化合物。
根据本发明还优选基本接头结构(ii)和(iv)，特别是当在R1位置处连接时，特别是当基团L1具有一种以下结构时：
(a)-NH-(CH2)0-4-(CHCH3)0-4-CHY5-CO-Y7，其中Y5代表H或NHY6，其中Y6代表H或-COCH3，且Y7代表单键或-NH-(CH2)0-4-CHNH2-CO-，以使得在裂解后获得相应结构-NH-(CH2)0-4-(CHCH3)0-4-CHY5-COOH或-NH-(CH2)0-4-(CHCH3)0-4-CHY5-CO-NH-(CH2)0-4-CHNH2-COOH。
(b)-CH2-Sx-(CH2)0-4-CHY5-CO-，其中x为0或1，且Y5代表H或NHY6，其中Y6代表H或-COCH3，以使得在裂解后获得相应结构-CH2-Sx-(CH2)0-4-CHY5-COOH。
根据本发明，当结合至位置R4时、特别是如果m＝0，则还优选基本接头结构(i)。
如果接头连接至半胱氨酸侧链或半胱氨酸残基，则L2优选衍生自与半胱氨酸的巯基基团反应的基团。它们包括卤代乙酰基、马来酰亚胺、氮丙啶、丙烯酰、芳基化化合物、乙烯基砜、吡啶基二硫化物、TNB硫醇和二硫化物-还原剂。这些基团通常以亲电子的方式与巯基键反应，从而形成硫化物(例如硫醚)或二硫桥。优选稳定的硫桥。L2优选为
其中
#1表示结合至抗体的硫原子的结合点，
#2表示结合至基团L1的结合点，且
R22代表COOH、COOR、COR、CONHR、CONR2(其中R在每种情况下代表C1-3-烷基)、CONH2，优选COOH。
对于L2，特别优选的是：
或
其中#1表示结合至抗体的硫原子的结合点，#2表示结合至活性化合物的结合点，x代表1或2，且R22代表COOH、COOR、COR、CONR2、CONHR(其中R在每种情况下代表C1-3-烷基)、CONH2，优选COOH。优选x＝1且R22代表COOH。
在本发明的缀合物中或在本发明的缀合物的混合物中，在优选大于80％、特别优选大于90％(在每种情况下基于接头键合至结合体的键的总数计)的程度上存在键合至抗体的半胱氨酸残基的键，特别优选作为式A3或A4的两种结构之一。在此，式A3或A4的结构通常一起存在，优选以60∶40至40∶60的比率，基于键合至抗体的键的数量计。然后其余键以下结构存在：
根据本发明，L1优选由下式代表
#1-(NR10)n-(G1)o-G2-#2
其中
R10代表H、NH2或C1-C3-烷基；
G1代表-NHCO-、-CONH-或(如果G1代表NHCO或则R10优选不为NH2)。
n代表0或1；
o代表0或1；且
G2代表直链或支链的烃链，其具有1至100个来自亚芳基和/或直链和/或支链的和/或环状的亚烷基基团的碳原子且其可被一个或更多个以下基团中断一次或更多次：-O-、-S-、-SO-、SO2、-NRy-、-NRyCO-、-C(NH)NRy-、CONRy-、-NRyNRy-、-SO2NRyNRy-、-CONRyNRy-(其中Ry代表H、苯基、C1-C10-烷基、C2-C10-烯基或C2-C10-炔基，其各自可被NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代)、-CO-、-CRx＝N-O-(其中Rx代表H、C1-C3-烷基或苯基)和/或具有至多四个选自N、O和S的杂原子、-SO-或-SO2-的3-至10-元芳族或非芳族的杂环(优选)，其中含任意侧链的烃链可被-NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代。
G2代表直链或支链的烃链，其具有1至100个来自亚芳基和/或直链和/或支链的和/或环状的亚烷基基团的碳原子且其可被一个或更多个以下基团中断一次或更多次：-O-、-S-、-SO-、SO2、-NH-、-CO-、-NHCO-、-CONH-、-NMe-、-NHNH-、-SO2NHNH-、-CONHNH-和具有至多四个选自N、O和S的杂原子或-SO-的5-至10-元芳族或非芳族的杂环(优选)，其中侧链(如果存在)可被-NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代。
G2优选地代表直链或支链的烃链，其具有1至100个来自亚芳基和/或直链和/或支链的和/或环状的亚烷基基团的碳原子且其可被一个或更多个以下基团中断一次或更多次：-O-、-S-、-SO-、SO2、-NH-、-CO-、-NHCO-、-CONH-、-NMe-、-NHNH-、-SO2NHNH-、-CONHNH-、-CRx＝N-O-(其中Rx代表H、C1-C3-烷基或苯基)和具有至多四个选自N、O和S的杂原子、-SO-或-SO2-的3-至10-元、例如5-至10-元芳族的或非芳族的杂环(优选)，其中含有侧链的烃链(如果存在)可被-NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2，磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代。
G2中其他中断基团优选为
其中Rx代表H、C1-C3-烷基或苯基。
此处，#1为键合至KSP抑制剂的键且#2为键合至抗体的偶联基团(例如L2)的键。
亚芳基基团和/或直链和/或支链的和/或环状亚烷基基团的直链或支链的烃链通常包含具有所述各自碳原子数目的α，ω-二价烷基。可通过实例并作为优选而提及如下基团：亚甲基、乙烷-1，2-二基(1，2-亚乙基)、丙烷-1，3-二基(1，3-亚丙基)、丁烷-1，4-二基(1，4-亚丁基)、戊烷-1，5-二基(1，5-亚戊基)、己烷-1，6-二基(1，6-亚己基)、庚烷-1，7-二基(1，7-亚己基)、辛烷-1，8-二基(1，8-亚辛基)、壬烷-1，9-二基(1，9-亚壬基)、癸烷-1，10-二基(1，10-亚癸基)。然而，烃链中的亚烷基基团还可为酯化的，即上述直链亚烷基的一个或更多个氢原子可任选地被C1-10-烷基基团取代，从而形成侧链。烃链还可包含环状亚烷基基团(环烷烃二基)，例如1，4-环己烷二基或1，3-环戊烷二基。这些环状基团可为不饱和的。特别地，烃基中可存在芳族基团(亚芳基基团)，例如亚苯基。依次类推，同样在环状亚烷基基团和亚芳基基团中，一个或更多个氢原子可任选地被C1-10-烷基基团取代。以此方式，形成任选地支链的烃链。该烃链具有共计0至100个碳原子，优选1至50个、特别优选2至25个碳原子。
侧链(如果存在)可被相同或不同的-NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸单取代或多取代。
烃链可被相同或不同的-O-、-S-、-SO-、SO2、-NH-、-CO-、-NHCO-、-CONH-、-NMe-、-NHNH-、-SO2NHNH-、-CONHNH-和具有至多4个选自N、O和S的杂原子、-SO-或-SO2-的5-至10-元芳族或非芳族杂环(优选)中断一次或更多次。
G2中其他中断基团优选为
优选地，接头符合下式：
§-(CO)m-L1-L2-§§
其中
m代表0或1；
§代表键合至活性化合物分子的键，且
§§代表键合至结合体肽或蛋白质的键，且
L1和L2具有上述含义。
特别优选地，L1具有式-NR11B-，其中
R11代表H或NH2；
B代表-[(CH2)x-(X4)y]w-(CH2)z-，
w＝0至20；
x＝0至5；
y＝0或1；
z＝0至5；且
X4代表-O-、-CONH-，-NHCO-或
根据本发明优选的接头L具有下式：
其中
#3代表键合至活性化合物分子的键，
#4代表键合至结合体肽或蛋白质的键，
R11代表H或NH2；
B代表-[(CH2)x-(X4)y]w-(CH2)z-，
w＝0至20；
x＝0至5；
y＝0或1；
z＝1至5；且
X4代表-O-、-CONH-，-NHCO-或
上述接头在式(I)或(II)的缀合物中是尤其优选的，在式(I)或(II)中，接头通过R1上的氢原子的取代或与R4上可裂解的接头SG1组合进行偶联，即R1代表-L-#1或R4代表-SG1-L-#1，其中#1代表键合至抗体的键。
根据本发明还优选以下接头：在本发明的缀合物中或在本发明的缀合物的混合物中，在优选大于80％、特别优选大于90％(在每种情况下基于接头键合至结合体的键的总数计)的程度上存在键合至抗体的半胱氨酸残基的键，特别优选作为式A5或A6的两种结构之一：
其中
#1表示结合至抗体的硫原子的结合点，
#2表示结合至基团L1的结合点，且
R22代表COOH、COOR、COR、CONR2、CONHR(其中R在每种情况下代表C1-3-烷基)、CONH2，优选COOH。
此处，式A5或A6的结构通常一起存在，优选以60∶40至40∶60的比例，基于键合至抗体的键的数目计。然后其余键以下结构存在：
结合至半胱氨酸侧链或半胱氨酸残基的其他接头-L-具有下式：
其中
§代表键合至活性化合物分子的键，且
§§代表键合至结合体肽或蛋白质的键，
m代表0、1、2或3；
n代表0、1或2；
p代表0至20；且
L3代表
其中
o代表0或1；
且
G3代表直链或支链的烃链，其具有1至100个来自亚芳基基团和/或直链和/或环亚烷基基团的碳原子且被一个或更多个以下基团中断一次或更多次：-O-、-S-、-SO-、SO2、-NH-、-CO-、-NHCO-、-CONH-、-NMe-、-NHNH-、-SO2NHNH-、-CONHNH-和具有至多4个选自N、O和S的杂原子、-SO-或SO2的3-至10-元(优选地5-至10-元)芳族或非芳族杂环(优选)，其中侧链(如果存在)可被-NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代。
在上式中，优选地
m代表1；
p代表0；
n代表0；
且L3代表
其中
o代表0或1；且
G3代表-(CH2CH2O)s(CH2)t(CONH)uCH2CH2O)v(CH2)w-，其中
s、t、v和w各自独立地为0至20且u为0或1。
上述式§-(CO)m-L1-L2-§§中优选的基团L1为下面那些，其中r在每种情况下各自独立地代表0至20、优选0至15、特别优选1至20、尤其优选2至10的数：
表C中给出了L1的其他实例，其中该基团在方框中突出显示。
下表A和A‘中给出了接头部分L1的实例。所述表还说明了在哪种基团L2的情况下这些L1的实例优选被结合，以及优选的偶联点(R1或R3或R4)和优选的m值，这在于L1前面是否存在羰基基团(参见§-(CO)m-L1-L2-§§)。优选将这些接头偶联至半胱氨酸残基。如果L2是琥珀酰亚胺或衍生自琥珀酰亚胺，则该酰亚胺还可全部地或部分地为水解的开链琥珀酰胺形式，如上所述。取决于L1，这种水解呈开链琥珀酰胺的水解可或多或少地是明确地或完全不存在。
表A
＊＊特别优选地，这些行中给出的接头L1结合至选自以下的接头L2：
和/或
其中#1表示结合至结合体的硫原子的结合点，#2表示结合至基团L1的结合点，R22优选代表COOH。在本发明的缀合物中或在本发明的缀合物的混合物中，在优选大于80％、特别优选大于90％(在每种情况下基于接头键合至结合体的键的总数计)的程度上存在键合至结合体的半胱氨酸残基的键，特别优选作为式A7或A8的两种结构之一。此处，式A7或A8的结构通常一起存在，优选以60∶40至40∶60的比率，基于键合至抗体的键的数量计。然后其余键以下结构存在：
表A‘
＊＊：参见表A的注释＊＊。
＊＊＊：当存在这种结构L2时，可同时存在下式的结构L2：
具有相应接头的缀合物的实例具有下述结构，其中X1代表CH，X2代表C，X3代表N且L1具有上面给出的含义，L2和L3具有与L1相同的含义，AK1代表通过半胱氨酸残基结合的发挥适度的激动作用或非激动作用的抗-TWEAKR抗体(例如ITEM-4和ITEM-4的嵌合的或人源化的变体)，n为1至10的数。特别优选地，AK1为人源化或嵌合的单克隆的ITEM-4抗-TWEAKR抗体。特别优选人源化的或嵌合的ITEM-4变体：TPP-7005、TPP-7006、TPP-7007、TPP-7053、TPP-7073、TPP-7074、TPP-7075和TPP-7076。
如果所述接头结合至赖氨酸侧链或赖氨酸残基，其优选具有下式：
-§-(SG)x-L4-CO-§§
其中
§代表键合至活性化合物分子的键，且
§§代表键合至结合体肽或蛋白质的键，
x代表0或1，
SG代表可裂解的基团，优选2-8寡肽，特别优选二肽，
且
L4代表单键或基团-(CO)y-G4-，其中y代表0或1，且
G4代表直链或支链的烃链，其具有1至100个来自亚芳基和/或直链和/或支链的和/或环状的亚烷基基团的碳原子且其可被一个或更多个以下基团中断一次或更多次：-O-、-S-、-SO-、SO2、-NH-、-CO-、-NHCO-、-CONH-、-NMe-、-NHNH-、-SO2NHNH-、-CONHNH-和具有至多4个选自N、O和S的杂原子、-SO-或-SO2-的5-至10-元芳族的或非芳族的杂环(优选)，其中侧链(如果存在)可被-NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代。
下表B给出了连接至赖氨酸残基的接头的实例。所述表还给出了优选的偶联点(R1-R5)。第一栏还说明了使用相应接头的实例编号。
表B：赖氨酸接头
-§-(SG)x-L4-CO-§§
具有相应接头的缀合物的实例具有以下结构，其中X1代表CH，X2代表C，X3代表N且L4具有上面给出的定义，AK2代表通过赖氨酸残基结合的发挥适度的激动作用或非激动作用的抗-TWEAKR抗体例如ITEM-4和ITEM-4的嵌合的或人源化的变体，n为1至10的数。特别优选地，AK2为人源化或嵌合的单克隆的ITEM-4抗-TWEAKR抗体。特别优选人源化的或嵌合的ITEM-4变体：TPP-7005、TPP-7006、TPP-7007、TPP-7053、TPP-7073、TPP-7074、TPP-7075和TPP-7076。
根据本发明还优选基本结构(i)、(ii)或(iv)，其中SG1或SG代表可通过蛋白酶裂解的基团，L1和L2具有上面给出的含义。特别优选以下基团：
-Val-Ala-CONH-(丙氨酸C-末端酰胺处的酰胺键裂解)
-NH-Val-Lys-CONH-(赖氨酸C-末端酰胺处的酰胺键裂解)
-NH-Val-Cit-CONH-(瓜氨酸C-末端酰胺处的酰胺键裂解)
-NH-Phe-Lys-CONH(赖氨酸C-末端酰胺处的酰胺键裂解)
-NH-Ala-Lys-CONH-(赖氨酸C-末端酰胺处的酰胺键裂解)
-NH-Ala-Cit-CONH-(瓜氨酸C-末端酰胺处的酰胺键裂解)
SG1或SG特别优选为
或
或
其中x代表H或可任选地被-NHCONH2、-COOH、-OH、NH2、-NH-CNNH2或磺酸取代的C1-10-烷基。
下表C给出了接头部分-SG1-L1-或-L1-SG-L1-的实例，其中SG1和SG为可通过蛋白酶裂解的基团。表C还说明在哪种基团L2的情况下这些-SG1-L1-和-L1-SG-L1-的实例优选被结合，以及优选的偶联点(R1-R5)和优选的m值，这在于L1前面是否存在羰基(参见§-(CO)m-L1-L2-§§)。将这些接头优选地偶联至半胱氨酸残基。L1基团以方框突出显示。然而，这些基团L1可被上面给出的式§-(CO)m-L1-L2-§§的基团L1之一代替。如果L2为琥珀酰胺或衍生自琥珀酰胺，该酰胺还可全部地或部分地为水解的开链琥珀酰胺，如上所述。
表C
具有基本结构(i)的缀合物的实例具有下述结构，其中X1代表CH，X2代表C，X3代表N，L4具有与L1相同的含义，AK1代表通过半胱氨酸残基结合的发挥适度的激动作用或非激动作用的抗-TWEAKR抗体例如ITEM-4和ITEM-4的嵌合的或人源化的变体，n为1至10的数。特别优选地，AK1为人源化的或嵌合的单克隆ITEM-4抗-TWEAKR抗体。特别优选人源化的或嵌合的ITEM-4变体：TPP-7005、TPP-7006、TPP-7007、TPP-7053、TPP-7073、TPP-7074、TPP-7075和TPP-7076。
KSP抑制剂-接头-中间体以及缀合物的制备
本发明的缀合物通过首先提供带有接头的低分子量KSP抑制剂而制备。然后将以此方式获得的中间体与结合体(优选抗体)反应。
优选地，为偶联至半胱氨酸残基，将下述化合物之一与含半胱氨酸的结合体如抗体(为此目的，其任选地部分地被还原)反应：
其中R代表-H或-COOH，
其中K代表任选地被C1-C6-烷氧基或-OH取代的直链或支链的C1-C6烷基，且
其中X1代表CH，X2代表C且X3代表N，SG1、L1、L2、L3和L4具有与上述相同的含义。
在各上述化合物中以及在下述化合物中，叔丁基可被环己基替代。
化合物可例如以其三氟乙酸盐的形式使用。对于与结合体如抗体的反应，化合物优选以超过结合体2至12倍的摩尔使用。
优选地，为了偶联至赖氨酸残基，使下述化合物之一与含赖氨酸的结合体(如抗体)反应：
其中X1代表CH，X2代表C，X3代表N，L4具有与L1相同的含义且L1具有与上述相同的含义。
对于偶联至半胱氨酸残基的中间体，所述反应说明如下：
可相应地使其他中间体和其他抗体反应。
对于偶联至赖氨酸残基的中间体，所述反应说明如下：
根据本发明，这得到以下缀合物：
取决于接头，琥珀酰亚胺-连接的ADC可在缀合后被转化为开链琥珀酰胺，其具有有利的稳定性特性。
该反应(环打开)可在pH 7.5至9、优选在pH 8下在25℃至37℃的温度下例如通过搅拌进行。优选的搅拌时间为8至30小时。
在上式中，X1代表CH，X2代表C，X3代表N，SG1和L1具有与上述相同的含义，L2、L3和L4具有与L1相同的含义；R和K具有与上述相同的含义。AK1为通过半胱氨酸残基偶联的发挥适度的激动作用或非激动作用的抗-TWEAKR抗体例如ITEM-4和ITEM-4的嵌合的或人源化的变体，且AK2为通过赖氨酸残基偶联的发挥适度的激动作用或非激动作用的抗-TWEAKR抗体例如ITEM-4和ITEM-4的嵌合的或人源化的变体。特别优选地AK1和AK2为人源化的或嵌合的单克隆ITEM-4抗-TWEAKR抗体。特别优选人源化的或嵌合的ITEM-4变体：TPP-7005、TPP-7006、TPP-7007、TPP-7053、TPP-7073、TPP-7074、TPP-7075和TPP-7076。
ITEM-4及其人源化的或嵌合的变体
ITEM-4为抗-TWEAKR抗体，由Nakayama等人(Nakayama等人，2003，Biochem BiophyRes Comm，306：819-825)描述。基于CDR移植的该抗体的人源化变体由Zhou等人(Zhou等人，2013，J Invest Dermatol.133(4)：1052-62)描述并在WO 2009/020933中描述。
文献还公开了将有机分子共价偶联(缀合)至抗体的多种多样的选项。根据本发明优选通过抗体的半胱氨酸残基的一个或更多个硫原子和/或通过抗体的赖氨酸残基的一个或更多个NH基团将毒簇缀合至抗体。然而，还可通过游离羧基或通过抗体的糖残基将毒簇结合至抗体。
抗体可经由键结合到接头上。抗体的结合可经由该结合体的杂原子。根据本发明，可用于结合的抗体的杂原子为硫(在一个实施方案中经由抗体的巯基基团)、氧(根据本发明借助抗体的羧基或羟基)和氮(在一个实施方案中经由抗体的伯胺基或仲胺基或酰胺基)。这些杂原子可存在于天然结合体中或通过化学方法或分子生物学方法引入。根据本发明，抗体与毒簇的结合对抗体对于靶分子的结合活性仅有较小影响。在一个优选实施方案中，所述结合对抗体对于靶分子的结合活性没有影响。
根据本发明，术语“抗体”应以其最广的含义理解并包括免疫球蛋白分子，例如完整的或修饰的单克隆抗体、多克隆抗体或多特异性抗体(例如双特异性抗体)。免疫球蛋白分子优选包含具有通常通过二硫桥连接的四个多肽链、两个重链(H链)和两个轻链(L链)的分子。各重链包含重链可变域(缩写为VH)和重链恒定域。重链恒定域可例如包含三个结构域CH1、CH2和CH3。各轻链包含可变结构域(缩写为VL)和恒定结构域域。轻链恒定结构域包含一个域(缩写为CL)。VH和VL结构域可进一步细分成高变区，也称作互补决定区(缩写为CDR)，和具有低序列变异性的区域(骨架区，缩写为FR)。通常，各VH和VL区由三个CDR和最多四个FR构成。例如从氨基末端到羧基末端的顺序为：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。抗体可获自任何合适的物种，例如兔、美洲驼、骆驼、小鼠或大鼠。在一个实施方案中，抗体来源于人或鼠。抗体可例如是人的、人源化的或嵌合的。
术语“单克隆”抗体是指获自一群基本同质抗体——即该群的各个抗体除天然存在的突变(其可为少数)外是完全相同的——的抗体。单克隆抗体以高特异性识别单个抗原结合位点。术语单克隆抗体不涉及特定制备方法。
术语“完整的”抗体是指包含抗原结合结构域和轻链和重链的恒定结构域的抗体。恒定结构域可以是天然存在的结构域或其具有许多经修饰的氨基酸位置的变体。
术语“修饰的完整的”抗体是指借助共价键(例如肽键)经由它们的氨基末端或羧基末端与非源自抗体的其他多肽或蛋白质融合的完整抗体。此外，可以修饰抗体以在特定位置引入反应性半胱氨酸以帮助偶联至毒簇(参见Junutula等人Nat Biotechnol.2008年8月；26(8)：925-32)。
术语“人”抗体是指可获自人的抗体或是合成的人抗体。“合成的”人抗体是部分或完全地可基于人抗体序列的分析而由合成序列计算机模拟获得的抗体。人抗体可以例如由从人源性抗体序列库中分离的核酸编码。此类抗体的实例可见于等人，NatureBiotech.2000，18：853-856。
术语“人源化的”或“嵌合的”抗体描述由非人部分序列和人部分序列构成的抗体。在这些抗体中，人免疫球蛋白的一部分序列(受体)被非人免疫球蛋白的序列部分(供体)替代。在许多情况下，所述供体是鼠免疫球蛋白。在人源化抗体的情况下，受体的CDR的氨基酸被供体的氨基酸替代。有时，骨架的氨基酸也被供体的相应氨基酸替代。在一些情况下，所述人源化抗体含有在抗体的优化过程中引入的既不存在于受体中又不存在于供体中的氨基酸。在一些情况下，如果受体的氨基酸没有贡献于抗体结合并具有潜在的免疫原性，则供体的CDR的氨基酸被受体的相应氨基酸替换。在嵌合抗体的情况下，供体免疫球蛋白的可变域与人抗体的恒定区融合。
本文所用的术语互补决定区(CDR)是指结合至抗原所需的可变的抗体结构域的那些氨基酸。通常，各可变区具有三个称作CDR1、CDR2和CDR3的CDR区。各CDR区可包含根据Kabat定义的氨基酸和/或根据Chotia定义的高变环(loop)的氨基酸。根据Kabat的定义包含例如来自可变轻链的大致氨基酸位置24-34(CDR1)、50-56(CDR2)和89-97(CDR3)和可变重链的31-35(CDR1)、50-65(CDR2)和95-102(CDR3)的区域(Kabat等人，Sequences ofProteins of Immunological Interest，第5版Public Health Service，NationalInstitutes of Health，Bethesda，MD.(1991))。根据Chotia的定义包含例如来自可变轻链的大致氨基酸位置26-32(CDR1)、50-52(CDR2)和91-96(CDR3)和可变重链的26-32(CDR1)、53-55(CDR2)和96-101(CDR3)的区域(Chothia和Lesk；J MolBiol 196：901-917(1987))。在一些情况下，CDR可包含来自根据Kabat和Chotia定义的CDR区的氨基酸。
取决于重链恒定结构域的氨基酸序列，可以将抗体分成不同种类。完整抗体有五大类：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中几种可分成进一步的亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。与不同种类对应的重链恒定结构域被称作[alpha/α]、[delta/δ]、[epsilon/ε]、[gamma/γ]和[my/μ]。抗体的三维结构和亚单元结构都是已知的。
术语抗体/免疫球蛋白的“功能片段”或“结合抗原的抗体片段”被定义为仍包含抗体/免疫球蛋白的抗原结合结构域的抗体/免疫球蛋白的片段(例如IgG的可变域)。抗体的“抗原结合结构域”通常包含抗体的一个或更多个高变区，例如CDR、CDR2和/或CDR3区。但是，抗体的“框架”或“骨架”区在抗体结合至抗原的过程中也可起到一定作用。框架区形成CDR的骨架。优选地，抗原结合结构域至少包含可变轻链的氨基酸4至103和可变重链的氨基酸5至109，更优选可变轻链的氨基酸3至107和可变重链的4至111，特别优选全部的可变轻链和重链，即VL的氨基酸1-109和VH的1至113(根据WO97/08320编号)。
本发明的“功能片段”或“结合抗原的抗体片段”非决定性地包括Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段、双体、单结构域抗体(DAb)、线性抗体、各抗体链(单链Fv，缩写为scFv)；和多特异性抗体，如双特异性抗体和三特异性抗体，例如由抗体片段形成的双特异性抗体和三特异性抗体(C.A.K Borrebaeck编辑(1995)Antibody Engineering(Breakthroughs inMolecular Biology)，Oxford UniversityPress；R.Kontermann&S.Duebel，编辑(2001)Antibody Engineering(SpringerLaboratory Manual)，Springer Verlag)。除“多特异性”或“多功能”抗体之外的抗体是具有相同结合位点的那些。多特异性抗体可对抗原的不同表位是特异性的或可对不止一种抗原的表位是特异性的(参见例如WO 93/17715；WO 92/08802；WO 91/00360；WO 92/05793；Tutt，等人，1991，J.Immunol.147：6069；美国专利号4,474,893；4,714,681；4,925,648；5,573,920；5,601,819；或Kostelny等人，1992，J.Immunol.148：1547 1553)。可构建F(ab′)2或Fab分子以便减少或完全防止在Ch1和CL结构域之间发生的分子间二硫化物相互作用的数量。
“表位”是指能特异性地结合至免疫球蛋白或T细胞受体上的蛋白质决定簇。表位决定簇通常由分子的化学活性表面基团如氨基酸或糖侧链或其组合构成，并通常具有特定的三维结构性质以及特定的电荷性质。
“功能片段”或“结合抗原的抗体片段”可经其氨基末端或羧基末端借助共价键(例如肽键)与非源自抗体的另一种多肽或蛋白质融合。此外，可通过在特定位置上引入反应性半胱氨酸而修饰抗体和结合抗原的片段，以帮助偶联至毒簇(参见Junutula等人NatBiotechnol.2008Aug；26(8)：925-32)。
多克隆抗体可通过本领域普通技术人员已知的方法制备。单克隆抗体可通过本领域普通技术人员已知的方法制备(和Milstein，Nature，256，495-497，1975)。人和人源化单克隆抗体可通过本领域普通技术人员已知的方法制备(Olsson等人，MethEnzymol.92，3-16或Cabilly等人US 4,816,567或Boss等人US 4,816,397)。
本领域普通技术人员了解制备人抗体及其片段的各种方法，例如借助转基因小鼠(N Lonberg和D Huszar，Int Rev Immunol.1995；13(1)：65-93)或噬菌体展示技术(Clackson等人，Nature.1991年8月15日；352(6336)：624-8)。本发明的抗体可获自例如从众多的大量健康志愿者编译的抗体的氨基酸序列构成的重组抗体库。抗体也可借助已知的重组DNA技术制备。抗体的核酸序列可通过常规测序获得或可获自可公开访问的数据库。
“分离的”抗体或结合体已经纯化以除去细胞的其它成分。可能干扰诊断或治疗用途的细胞的污染成分是例如酶、激素或细胞的其它肽成分或非肽成分。优选的抗体或结合体已纯化至相对于所述抗体或结合体计大于95重量％的程度(例如通过Lowry法、UV-Vis光谱学或通过SDS毛细管凝胶电泳测定)。此外，已纯化至可以决定氨基末端或内部氨基酸序列的至少15个氨基酸的程度或已纯化至同质性的抗体，其中同质性通过SDS-PAGE在还原或非还原条件下测定(可以借助考马斯蓝染色或优选通过银着色进行检测)。但是，正常情况下通过一个或更多个纯化步骤制备抗体。
术语“特异性结合”或“特异性地结合”是指抗体或结合体结合至预定抗原/靶分子上。抗体或结合体的特异性结合通常描述具有至少10-7M的亲和力(作为Kd值；即优选为具有比10-7M小的Kd值的那些)的抗体或结合体，其中抗体或结合体对预定抗原/靶分子的亲和力比对非预定抗原/靶分子或密切相关抗原/靶分子的非特异性抗原/靶分子(例如牛血清白蛋白或酪蛋白)高至少两倍。所述抗体优选具有至少10-7M(作为Kd值；换言之优选为具有比10-7M小的Kd值的那些)、优选至少10-8M、更优选10-9M至10-11M的亲和力。可例如借助表面等离子体共振波谱法测定Kd值。
本发明的抗体-药物缀合物同样表现出在这些范围内的亲和力。所述亲和力优选基本不受药物缀合的影响(一般而言，所述亲和力降低了不到一个量级，换言之，例如最多从10-8M到10-7M)。
根据本发明，所使用的抗体也优选因高选择性而值得注意。如果本发明的抗体对靶蛋白表现出的亲和力比对非依赖性的其它抗原例如人血清白蛋白好至少2倍、优选5倍或更优选10倍(亲和力可例如借助表面等离子体共振波谱法测定)，则存在高选择性。
此外，本发明所用的抗体优选是交叉反应性的。为了能够帮助和更好地解释临床前研究，例如毒理学或活性研究(例如在异种移植小鼠中)，如果根据本发明所使用的抗体不仅结合人靶蛋白还结合用于研究的物种中的物种靶蛋白，是有利的。在一个实施方案中，根据本发明所使用的抗体除人靶蛋白外还对至少一个其它物种的靶蛋白呈交叉反应性。对于毒理学和或活性研究，优选使用啮齿类、犬类和非人灵长类的物种。优选的啮齿类物种是小鼠和大鼠。优选的非人灵长类动物是猕猴、黑猩猩和长尾猕猴。
在一个实施方案中，根据本发明所使用的抗体除人靶蛋白外还对选自小鼠、大鼠和长尾猕猴(食蟹猴)的至少一个其它物种的靶蛋白呈交叉反应性。尤其优选的是除人靶蛋白外至少对小鼠靶蛋白呈交叉反应性的根据本发明所使用的抗体。优选的是这样的交叉反应性抗体，其对其它非人物种的靶蛋白的亲和力与对人靶蛋白的亲和力相差不大于50倍，特别是不大于10倍。
针对癌症靶分子的抗体
结合体例如抗体或其结合抗原的片段所针对的靶分子优选是癌症靶分子。术语“癌症靶分子”是指与相同组织类型的非癌细胞相比更大量地存在于一种或更多种癌细胞种类上的靶分子。优选地，与相同组织类型的非癌细胞相比，癌症靶分子选择性地存在于一种或更多种癌细胞种类上，其中选择性地描述与相同组织类型的非癌细胞相比至少两倍地富集在癌细胞上(“选择性癌症靶分子”)。癌症靶分子的使用使得能够通过本发明的缀合物来选择性地治疗癌细胞。
此处特别优选细胞外的癌症靶分子TWEAKR(SEQ ID NO：101(蛋白质)；SEQ ID No：102(DNA))。癌症靶分子TWEAKR(人直系同源物NCBI基因ID：51330)也以TNFRSF12A(肿瘤坏死因子受体超家族成员12A)、FN14和CD266命名。
术语“抗-TWEAKR抗体”或“特异性结合至TWEAKR的抗体”涉及结合具有足以用于诊断和/或治疗应用的亲和力的癌症靶分子TWEAKR(SEQ ID NO：101(蛋白质))的抗体。在一个实施方案中，抗-TWEAKR抗体和与TWEAKR无关的蛋白质的结合比抗体和TWEAKR的结合少10％，例如通过表面等离子共振波谱测定的。在某些实施方案中，抗体结合TWEAKR(SEQ IDNO：101(蛋白质))，其中解离常数(KD)≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM。在某些实施方案中，抗-TWEAKR抗体结合至不同种类之间的保守表位。
结合癌症靶分子的抗体可由本技术领域普通技术人员使用已知方法制备，例如化学合成或重组表达。用于癌症靶分子的结合体可商购获得或可由本技术领域普通技术人员使用已知方法制备，例如，化学合成或重组表达。用于制备抗体或结合抗原的抗体片段的其他方法记载于WO 2007/070538(参见第22页“抗体”)中。本领域技术人员知道如何编制程序例如噬菌体展示库(例如Morphosys HuCAL Gold)并将其用于发现抗体或结合抗原的抗体片段(参见WO 2007/070538，第24页及后文和第70页的AK实施例1、第72页的AK实施例2)。使用DNA库由B细胞制备抗体的其他方法记载于例如第26页(WO 2007/070538)中。用于人源化抗体的方法记载于WO2007070538的第30-32页并详细记载于Queen等人，Pros.Natl.Acad.Sci.USA 86：10029-10033，1989中或WO 90/0786中。此外，一般而言，用于蛋白质的重组表达和特别地是抗体的重组表达的方法是本领域技术人员已知的(参见，例如，在Berger和Kimrnel(分子克隆技术指南(Guide to Molecular Cloning Techniques)，酶学中的方法(Methods in Enzymology)，Vol.152，学术出版社(Academic Press，Inc.))中；Sambrook，等人，(分子克隆(Molecular Cloning)：实验室手册(A LaboratoryManual)，(第二版，冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)；冷泉港(Cold Spring Harbor)，N.Y.；1989)Vol.1-3)；Current Protocols in MolecularBiology，(F.M.Ausabel等人[Eds.]，Current Protocols，绿色出版协会(GreenPublishing Associates)，Inc./John Wiley&Sons，Inc.)；Harlow等人，(单克隆抗体(Monoclonal Antibodies)：实验室手册(A Laboratory Manual)，冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)(19881，Paul[Ed.])；基础免疫学(FundamentalImmunology)，(Lippincott Williams&Wilkins(1998))；和Harlow等人，(使用抗体(UsingAntibodies)：实验室手册(A Laboratory Manual)，冷泉港实验室出版社(Cold SpringHarbor Laboratory Press)(1998))。本领域技术人员知道相应的蛋白质/抗体表达所必需的载体、启动子和信号肽。此外，普通方法也记载于WO 2007/070538的第41-45页中。制备IgG1抗体的方法记载于例如WO 2007/070538的第74页及后文上的实施例6。允许测定抗体在结合至抗原后的内化的方法是技术人员已知的且记载于例如WO 2007/070538的第80页。本领域技术人员能够使用WO 2007/070538中记载的方法，所述方法用于制备碳酸酐酶IX(Mn)抗体，用于制备具有不同靶分子特异性的抗体类似。
抗-TWEAKR抗体
根据本发明，使用抗-TWEAKR抗体或其结合抗原的片段，优选使用选自下面描述的那些或通过适当突变修饰的那些中的一种。此外，本领域技术人员熟知结合至TWEAKR的抗体，参见例如Nakayama等人，2003，Biochem Biophy Res Comm，306：819-825；Zhou等人，2013，J Invest Dermatol.133(4)：1052-62：WO 2009/020933(A2)，WO2009140177(A2)或WO2014/198817(A1)。
特别地，本发明涉及与发挥适度的激动作用或非激动作用的衍生自源于小鼠的抗体ITEM-4的抗-TWEAKR抗体或其结合抗原的抗体碎片或其变体(Nakayama等人，2003，Biochem Biophy Res Comm，306：819-825)的缀合物。ITEM-4是抗-TWEAKR抗体，由Nakayama等人描述(Nakayama等人，2003，Biochem Biophy Res Comm，306：819-825)。Zhou等人(Zhou等人，2013，J Invest Dermatol.133(4)：1052-62)公开了ITEM-4可变区(VH和VL)的序列。Zhou等人(Zhou等，2013，J Invest Dermatol.133(4)：1052-62)和WO 2009/020933中描述了基于人类框架区中CDR移植的该抗体的人源化变体。
根据所使用的测定系统，ITEM-4和该抗体的人源化的或嵌合的变体是发挥拮抗作用或适度的激动作用的抗体。激动作用仅在Tweak存在时显示。
术语“适度地激动的”或“发挥适度的激动作用的”抗-TWEAKR抗体是指当所述抗体在缺乏Tweak下与表达TWEAKR的细胞接触时结合至TWEAKR并诱导NFκB信号传导级联反应(NFκB信号传导)仅至很小的程度的抗体。NFκB信号传导级联(NFκB信号传导)的诱导至很小的程度上意味着与在NFκB测定中以200ng/ml(100％的值)所使用的人Tweak相比，抗-TWEAKR抗体显示出在至多30μg/ml的抗-TWEAKR抗体使用浓度下小于80％、小于50％、小于25％、小于20％或小于15％的活化。本领域技术人员熟悉这样的NFκB测定。例如，工作实施例中示出了一种这样的测定。
术语“非激动的”或“发挥非激动作用的”的抗TWEAKR抗体是指在这种NFκB测定中在所使用的至多30μg/ml浓度下显示0％活性的抗体。本领域技术人员熟悉这样的NFκB测定。例如，工作实施例中示出了这样的测定。
此外，如果这种测定在Tweak(配体)存在下进行，则抗-TWEAKR抗体优选地发挥激动作用。
抗-TWEAKR抗体的产生
基于ITEM-4的可变区(VH和VL)的序列的公开出版物(Zhou等人(Zhou等，2013，JInvest Dermatol.133(4)：1052-62))以及基于在人框架区的CDR移植的该抗体的人源化变体的公开出版物(Zhou等人(Zhou等人，2013，J Invest Dermatol.133(4)：1052-62)和WO2009/020933)，获得了以下抗体序列：“TPP-7007”、“TPP-7053”、“TPP-7005”、“TPP-7073”、“TPP-7075”和“TPP-7076”。
将ITEM-4的可变区VH和VL连接到κ亚型人IgG1的恒定区(CL，CH1，CH2，CH3)上，获得嵌合抗体“TPP-7006”和“TPP-7074”的序列。
ITEM-4的L-CDR1中潜在的脱酰胺位点的修饰产生抗体“TPP7073”、“TPP-7074”、“TPP-7075”和“TPP-7076”。
ITEM-4抗体的其他人源化变体可通过本领域已知的人源化方法产生。
关于它们产生方法的综述可见于Almagro和Fransson，Front.Biosci.13：1619-1633(2008)，进一步见于Riechmann等人，Nature 332：323-329(1988)；Queen等人，Proc.Natl Acad.Sci.USA 86：10029-10033(1989)；US专利第5,821,337、7,527,791、6,982,321和7,087,409号；Kashmiri等人，Methods 36：25-34(2005)(描述了特异性决定区(SDR)移植)；Padlan，Mol.Immunol.28：489-498(1991)(描述了表面重修)；Dall′Acqua等人，Methods 36：43-60(2005)(描述了FR改组)；和Osboum等人，Methods 36：61-68(2005)和Klimka等人，Br.J.Cancer，83：252-260(2000)(描述了用于FR改组的指导性选择方法)。
抗-TWEAKR抗体的具体实施方案
在本申请中，参考了下面的优选抗体，如下表中所示：“ITEM-4”、“TPP-7006”、“TPP-7007”、“TPP-7053”、“TPP-7005”、“TPP-7073”、“TPP-7074”、“TPP-7075”和“TPP-7076”。
ITEM-4是由Nakayama等人描述的小鼠IgG2b抗体(Nakayama等，2003，BiochemBiophy Res Comm，306：819-825)。ITEM-4可以从多个公司(尤其是从eBioscience以13-9018)商购获得。
TPP-7006和TPP-7074是ITEM-4的嵌合变体，其中可变区VH和VL连接到κ亚型的人IgG1的恒定区(CL，CH1，CH2，CH3)。
抗体TPP-7007、TPP-7053、TPP-7005、TPP-7073、TPP-7075和TPP-7076是ITEM-4的人源化变体，作为人类IgG1κ的亚型。
这些上述抗-TweakR抗体(“ITEM-4”、“TPP-7006”、“TPP-7007”、“TPP-7053”、“TPP-7005”、“TPP-7073”、“TPP-7074”、“TPP-7075”和“TPP-7076”)也代表不依赖它们的非激动作用或适度激动作用的用于偶联本发明的接头和/或毒簇的抗-TWEAKR抗体的优选实施方案。优选地，抗TWEAKR抗体可以在配体Tweak存在下充当拮抗剂。
表：抗体的蛋白质序列：
TPP-7005是包含对应于SEQ ID NO：9的重链区和对应于SEQ ID NO：10的轻链区的抗体。
TPP-7006是包含对应于SEQ ID NO：19的重链区和对应于SEQ ID NO：20的轻链区的抗体。
TPP-7007是包含对应于SEQ ID NO：29的重链区和对应于SEQ ID NO：30的轻链区的抗体。
TPP-7053是包含对应于SEQ ID NO：39的重链区和对应于SEQ ID NO：40的轻链区的抗体。
TPP-7065是包含对应于SEQ ID NO：49的重链区和对应于SEQ ID NO：50的轻链区的抗体。
TPP-7073是包含对应于SEQ ID NO：59的重链区和对应于SEQ ID NO：60的轻链区的抗体。
TPP-7074是包含对应于SEQ ID NO：69的重链区和对应于SEQ ID NO：70的轻链区的抗体。
TPP-7075是包含对应于SEQ ID NO：79的重链区和对应于SEQ ID NO：80的轻链区的抗体。
TPP-7076是包含对应于SEQ ID NO：89的重链区和对应于SEQ ID NO：90的轻链区的抗体。
TPP-7077是包含对应于SEQ ID NO：99的重链区和对应于SEQ ID NO：100的轻链区的抗体。
TPP-7005是包含对应于SEQ ID NO：1的重链可变区和对应于SEQ ID NO：5的轻链可变区的抗体。
TPP-7006是包含对应于SEQ ID NO：11的重链可变区和对应于SEQ ID NO：15的轻链可变区的抗体。
TPP-7007是包含对应于SEQ ID NO：21的重链可变区和对应于SEQ ID NO：25的轻链可变区的抗体。
TPP-7053是包含对应于SEQ ID NO：31的重链可变区和对应于SEQ ID NO：35的轻链可变区的抗体。
TPP-7065是包含对应于SEQ ID NO：41的重链可变区和对应于SEQ ID NO：45的轻链可变区的抗体。
TPP-7073是包含对应于SEQ ID NO：51的重链可变区和对应于SEQ ID NO：55的轻链可变区的抗体。
TPP-7074是包含对应于SEQ ID NO：61的重链可变区和对应于SEQ ID NO：65的轻链可变区的抗体。
TPP-7075是包含对应于SEQ ID NO：71的重链可变区和对应于SEQ ID NO：75的轻链可变区的抗体。
TPP-7076是包含对应于SEQ ID NO：81的重链可变区和对应于SEQ ID NO：85的轻链可变区的抗体。
TPP-7077是包含对应于SEQ ID NO：91的重链可变区和对应于SEQ ID NO：95的轻链可变区的抗体。
根据本发明，用于与接头和/或毒簇偶联的发挥适度的激动作用或非激动作用的抗-TWEAKR抗体的特别优选实施方案为下面的抗体：
1.抗体ITEM-4，小鼠IgG2b抗体，由Nakayama等人描述(Nakayama等人，2003，Biochem Biophy Res Comm，306：819-825)。
2.结合至TWEAKR且为抗体ITEM-4的嵌合的或人源化的变体的抗体或结合抗原的片段(Nakayama等人，2003，Biochem Biophy Res Comm，306：819-825)。
3.结合至TwEAKR的抗体或结合抗原的片段，包括：
可变重链，其包含如SEQ ID NO：2中所示的重链的可变CDR1序列、如SEQ ID NO：3中所示的重链的可变CDR2序列和如SEQ ID NO：4中所示的重链的可变CDR3序列，和
可变轻链，其包含如SEQ ID NO：6中所示的轻链的可变CDR1序列、如SEQ ID NO：7中所示的轻链的可变CDR2序列和如SEQ ID NO：8中所示的轻链的可变CDR3序列，或
可变重链，其包含如SEQ ID NO：12中所示的重链的可变CDR1序列、如SEQ ID NO：13中所示的重链的可变CDR2序列和如SEQ ID NO：14中所示的重链的可变CDR3序列，和
可变轻链，其包含如SEQ ID NO：16中所示轻链的可变CDR1序列、如SEQ ID NO：17中所示轻链的可变CDR2序列和如SEQ ID NO：18中所示轻链的可变CDR3序列，或
可变重链，其包含如SEQ ID NO：22中所示的重链的可变CDR1序列、如SEQ ID NO：23中所示的重链的可变CDR2序列和如SEQ ID NO：24中所示的重链的可变CDR3序列，和
可变轻链，其包含如SEQ ID NO：26中所示的轻链的可变CDR1序列、如SEQ ID NO：27中所示的轻链的可变CDR2序列和如SEQ ID NO：28中所示的轻链的可变CDR3序列，或
可变重链，其包含如SEQ ID NO：32中所示的重链的可变CDR1序列、如SEQ ID NO：33中所示的重链的可变CDR2序列和如SEQ ID NO：34中所示的重链的可变CDR3序列，和
可变轻链，其包含如SEQ ID NO：36中所示的轻链的可变CDR1序列、如SEQ ID NO：37中所示的轻链的可变CDR2序列和如SEQ ID NO：38中所示的轻链的可变CDR3序列，或
可变重链，其包含如SEQ ID NO：52中所示的重链的可变CDR1序列、如SEQ ID NO：53中所示的重链的可变CDR2序列和如SEQ ID NO：54中所示的重链的可变CDR3序列，和
可变轻链，其包含如SEQ ID NO：56中所示的轻链的可变CDR1序列、如SEQ ID NO：57中所示的轻链的可变CDR2序列和如SEQ ID NO：58中所示的轻链的可变CDR3序列，或
可变重链，其包含如SEQ ID NO：62中所示的重链的可变CDR1序列、如SEQ ID NO：63中所示的重链的可变CDR2序列和如SEQ ID NO：64中所示的重链的可变CDR3序列，和
可变轻链，其包含如SEQ ID NO：66中所示的轻链的可变CDR1序列、如SEQ ID NO：67中所示的轻链的可变CDR2序列和如SEQ ID NO：68中所示的轻链的可变CDR3序列，或
可变重链，其包含如SEQ ID NO：72中所示的重链的可变CDR1序列、如SEQ ID NO：73中所示的重链的可变CDR2序列和如SEQ ID NO：74中所示的重链的可变CDR3序列，和
可变轻链，其包含如SEQ ID NO：76中所示的轻链的可变CDR1序列、如SEQ ID NO：77中所示的轻链的可变CDR2序列和如SEQ ID NO：78中所示的轻链的可变CDR3序列，或
可变重链，其包含如SEQ ID NO：82中所示的重链的可变CDR1序列、如SEQ ID NO：83中所示的重链的可变CDR2序列和如SEQ ID NO：84中所示的重链的可变CDR3序列，和
可变轻链，其包含如SEQ ID NO：86中所示的轻链的可变CDR1序列、如SEQ ID NO：87中所示的轻链的可变CDR2序列和如SEQ ID NO：88中所示的轻链的可变CDR3序列。
4.根据实施方案3所述的抗体或其结合抗原的片段，包含：
如SEQ ID NO：1中所示的重链的可变序列，和如SEQ ID NO：5中所示的轻链的可变序列，或
如SEQ ID NO：11中所示的重链的可变序列，和如SEQ ID NO：15中所示的轻链的可变序列，或
如SEQ ID NO：21中所示的重链的可变序列，和如SEQ ID NO：25中所示的轻链的可变序列，或
如SEQ ID NO：31中所示的重链的可变序列，和如SEQ ID NO：35中所示的轻链的可变序列，或
如SEQ ID NO：51中所示的重链的可变序列，和如SEQ ID NO：55中所示的轻链的可变序列，或
如SEQ ID NO：61中所示的重链的可变序列，和如SEQ ID NO：65中所示的轻链的可变序列，或
如SEQ ID NO：71中所示的重链的可变序列，和如SEQ ID NO：75中所示的轻链的可变序列，或
如SEQ ID NO：81中所示的重链的可变序列，和如SEQ ID NO：85中所示的轻链的可变序列。
5.根据前述任一实施方案所述的抗体，其为IgG抗体。
6.根据前述任一实施方案所述的抗体，包含：
如SEQ ID NO：9中所示的重链的序列，和如SEQ ID NO：10中所示的轻链的序列，或
如SEQ ID NO：19中所示的重链的序列，和如SEQ ID NO：20中所示的轻链的序列，或
如SEQ ID NO：29中所示的重链的序列，和如SEQ ID NO：30中所示的轻链的序列，或
如SEQ ID NO：39中所示的重链的序列，和如SEQ ID NO：40中所示的轻链的序列，或
如SEQ ID NO：59中所示的重链的序列，和如SEQ ID NO：60中所示的轻链的序列，或
如SEQ ID NO：69中所示的重链的序列，和如SEQ ID NO：70中所示的轻链的序列，或
如SEQ ID NO：79中所示的重链的序列，和如SEQ ID NO：80中所示的轻链的序列，或
如SEQ ID NO：89中所示的重链的序列，和如SEQ ID NO：90中所示的轻链的序列。
7.根据前述任一实施方案所述的抗体，包括：根据前述任一实施方案的结合抗原的片段或根据前述任一实施方案的抗体的结合抗原的片段，其为scFv、Fab、Fab’片段或F(ab)2片段。
8.根据前述任一实施方案所述的抗体或结合抗原的片段，其为单克隆抗体或其结合抗原的片段。
9.根据前述任一实施方案所述的抗体或结合抗原的片段，其为人的、人源化的或嵌合的抗体或结合抗原的片段。
特别优选抗-TWEAKR抗体“TPP-7005”、“TPP-7006”、“TPP-7007”、“TPP-7053”、“TPP-7073”、“TPP-7074”、“TPP-7075”和“TPP-7076”。
同位素、盐、溶剂合物、同位素变体
本发明还包括本发明的化合物的所有合适的同位素变体。本发明的化合物的同位素变体在此应理解为是指本发明的化合物中的至少一个原子已被具有相同原子序数但原子质量不同于自然界中通常或主要存在的原子质量的另一原子替换的化合物。可纳入本发明的化合物中的同位素的实例是氢、碳、氮、氧、磷、硫、氟、氯、溴和碘的同位素，如2H(氘)、3H(氚)、13C、14C、15N、17O、18O、32p、33p、33S、34S、35S、36S、18F、36Cl、82Br、123I、124I、129I和131I。本发明的化合物的特定同位素变体，尤其是其中已纳入一种或多种放射性同位素的那些，可能有益于例如检查作用机制或体内的活性成分分布；由于比较容易制备和检测，用3H或14C同位素标记的化合物尤其适用于此目的。此外，同位素，例如氘的纳入可由于该化合物的更大代谢稳定性而带来特定治疗益处，例如体内半衰期的延长或所需活性剂量的降低；因此本发明的化合物的此类修饰还可在一些情况下构成本发明的优选实施方案。本发明的化合物的同位素变体可通过本领域技术人员已知的方法制备，例如通过下文进一步描述的方法和工作实施例中描述的步骤、通过使用各自的试剂和/或起始化合物的相应同位素修饰。
本发明上下文中优选的盐是本发明的化合物的生理上可接受的盐。还包括本身不适合药物用途但可例如用于本发明的化合物的分离或纯化的盐。
本发明的化合物的生理上可接受的盐包括无机酸、羧酸和磺酸的酸加成盐，例如盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、甲苯磺酸、萘二磺酸、乙酸、三氟乙酸、丙酸、乳酸、酒石酸、苹果酸、柠檬酸、富马酸、马来酸和苯甲酸的盐。
本发明的化合物的生理可接受盐还包括常规碱的盐，例如且优选碱金属盐(例如钠盐和钾盐)、碱土金属盐(例如钙盐和镁盐)和由氨或具有1至16个碳原子的有机胺(例如且优选乙胺、二乙胺、三乙胺、乙基二异丙胺、单乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、二环己胺、二甲基氨基乙醇、普鲁卡因、二苄胺、N-甲基哌啶、N-甲基吗啉、精氨酸、赖氨酸和1，2-乙二胺)衍生的铵盐。
在本发明的上下文中，溶剂合物是指通过与溶剂分子配位而形成固态或液态的络合物的本发明化合物的那些形式。水合物是溶剂合物的一种特定形式，其中与水发生配位。本发明上下文中优选的溶剂合物是水合物。
此外，本发明还包括本发明的化合物的前药。术语“前药”在此上下文中是指本身可具有生物学活性或不具有活性但其在体内停留期间转化(例如以代谢的方式或以水解的方式)成本发明化合物的化合物。
具体实施方案
下面的实施方案是特别优选的：
实施方案A：
下式的ADC以及ADC的盐、溶剂合物和溶剂合物的盐：
其中KSP-L-代表下式(I)、(Ia)、(II)、(IIa)、(IIb)、(IIc)、(IId)、(IIe)、(IIi)、(IIj)、(IIk)的化合物或下式(IIf)的化合物，结合体为发挥适度的激动作用或非激动作用的抗-TWEAKR抗体(特别优选人源化的或嵌合的单克隆ITEM-4抗-TWEAKR抗体，特别是人源化的或嵌合的ITEM-4变体：TPP-7005、TPP-7006、TPP-7007、TPP-7053、TPP-7073、TPP-7074、TPP-7075和TPP-7076)，且n代表1至10的数；
优选发挥适度的激动作用或非激动作用的抗-TWEAKR抗体。抗体优选为人源化的或嵌合的单克隆ITEM-4抗-TWEAKR抗体。特别优选人源化的或嵌合的ITEM-4变体：TPP-7005、TPP-7006、TPP-7007、TPP-7053、TPP-7073、TPP-7074、TPP-7075和TPP-7076。
式(IIf)：
其中
A代表CO(羰基)；
R1代表-L-#1、H、-COOH、-CONHNH2、-(CH2)1-3NH2、-CONZ“(CH2)1-3NH2和-CONZ“CH2COOH，其中Z“代表H或NH2；
R2和R4代表H，或R2和R4一起(其中形成吡咯烷环)代表-CH2-CHR11-或-CHR11-CH2-，其中R11代表H或F；
R3代表-L-#1或C1-10-烷基-，其可任选地被-OH、O-烷基、SH、S-烷基、O-CO-烷基、O-CO-NH-烷基、NH-CO-烷基、NH-CO-NH-烷基、S(O)n-烷基、SO2-NH-烷基、NH-烷基、N(烷基)2或NH2(其中烷基优选为C1-3-烷基)取代；
R5代表H或F；
R6和R7各自独立地代表H、(任选地氟化的)C1-3-烷基、(任选地氟化的)C2-4-烯基、(任选地氟化的)C2-4-炔基、羟基或卤素；
R8代表支链的C1-5-烷基；且
R9代表H或F，
其中取代基R1和R3之一代表-L-#1，且
-L-代表接头且#1代表键合至抗体的键。
接头优选为以下接头
§-(CO)m-L1-L2-§§
其中
m代表0或1；
§代表键合至KSP的键，且
§§代表键合至抗体的键，且
L2代表
或
其中
#1表示结合至抗体的硫原子的结合点，
#2表示结合至基团L1的结合点，
且L1由下式代表
#1-(NR10)n-(G1)o-G2-#2
其中
R10代表H、NH2或C1-C3-烷基；
G1代表-NHCO-或
n代表0或1；
o代表0或1；且
G2代表直链或支链的烃链，其具有1至100个来自亚芳基和/或直链和/或支链的和/或环状的亚烷基基团的碳原子且其可被一个或更多个以下基团中断一次或更多次：-O-、-S-、-SO-、SO2、-NH-、-CO-、-NHCO-、-CONH-、-NMe-、-NHNH-、-SO2NHNH-、-CONHNH-和具有至多4个选自N、O和S的杂原子或-SO-的3-至10-元芳族的或非芳族的杂环(优选)，其中侧链(如果存在)可被-NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代。
此处，#1为键合至KSP抑制剂的键且#2为键合至抗体的偶联基团(例如L2)的键。
实施方案B：
下式的ADC以及ADC的盐、溶剂合物和溶剂合物的盐：
其中KSP-L-代表下式(I)、(Ia)、(II)、(IIa)、(IIb)、(IIc)、(IId)、(IIe)、(IIf)、(IIi)、(IIj)、(IIk)的化合物或下式(IIg)的化合物，结合体为发挥适度的激动作用或非激动作用的抗-TWEAKR抗体(特别优选人源化的或嵌合的单克隆ITEM-4抗-TWEAKR抗体，特别是人源化的或嵌合的ITEM-4变体：TPP-7005、TPP-7006、TPP-7007、TPP-7053、TPP-7073、TPP-7074、TPP-7075和TPP-7076)，且n代表1至10的数；
式(IIg)：
其中
A代表CO(羰基)；
R1代表-L-#1、H、-COOH、-CONHNH2、-(CH2)1-3NH2、-CONZ“(CH2)1-3NH2和-CONZ“CH2COOH，其中Z“代表H或NH2；
R2和R4代表H，或R2和R4一起(其中形成吡咯烷环)代表-CH2-CHR11-或-CHR11-CH2-，其中R11代表H；
R3代表-L-#1或C1-10-烷基-，其可任选地被-OH、O-烷基、SH、S-烷基、O-CO-烷基、O-CO-NH-烷基、NH-CO-烷基、NH-CO-NH-烷基、S(O)n-烷基、SO2-NH-烷基、NH-烷基、N(烷基)2或NH2(其中烷基优选为C1-3-烷基)取代；
R5代表H或F；
R6和R7各自独立地代表H、(任选地氟化的)C1-3-烷基、(任选地氟化的)C2-4-烯基、(任选地氟化的)C2-4-炔基、羟基或卤素；
R8代表支链的C1-5-烷基；且
R9代表H或F，
其中取代基R1和R3之一代表-L-#1，且
-L-代表接头且#1代表键合至抗体的键，
其中-L-由以下表示
§-(CO)m-L1-L2-§§
其中
m代表0或1；
§代表键合至KSP的键，且
§§代表键合至抗体的键，且
L2代表
或
其中
#1表示结合至抗体的硫原子的结合点，
#2表示结合至基团L1的结合点，
且L1由下式表示
#1-(NR10)n-(G1)o-G2-#2
其中
R10代表H、NH2或C1-C3-烷基；
G1代表-NHCO-或
n代表0或1；
o代表0或1；且
G2代表直链或支链的烃链，其具有1至100个来自亚芳基和/或直链和/或支链的和/或环状的亚烷基基团的碳原子且其可被一个或更多个以下基团中断一次或更多次：-O-、-S-、-SO-、SO2、-NH-、-CO-、-NHCO-、-CONH-、-NMe-、-NHNH-、-SO2NHNH-、-CONHNH-和具有至多4个选自N、O和S的杂原子或-SO-的3-至10-元芳族的或非芳族的杂环(优选)，其中侧链(如果存在)可被-NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代。
#1为键合至KSP抑制剂的键且#2为键合至抗体的偶联基团的键(例如L2)。
实施方案C：
下式的ADC以及ADC的盐、溶剂合物、溶剂合物的盐和差向异构体：
其中KSP-L-代表下式(II)、(IIa)、(IIb)、(IIc)、(IId)、(IIe)、(IIf)、(IIg)、(IIi)、(IIj)、(IIk)的化合物或下式(IIh)的化合物，结合体为发挥适度的激动作用或非激动作用的抗-TWEAKR抗体(特别优选人源化的或嵌合的单克隆ITEM-4抗-TwEAKR抗体，特别是人源化的或嵌合的ITEM-4变体：TPP-7005、TPP-7006、TPP-7007、TPP-7053、TPP-7073、TPP-7074、TPP-7075和TPP-7076)，且n代表1至10的数；
式(IIh)：
其中
A代表CO(羰基)；
R1代表-L-#1；
R2和R4代表H，或R2和R4一起(其中形成吡咯烷环)代表-CH2-CHR11-或-CHR11-CH2-，其中R11代表H；
R3代表C1-10-烷基-，其可任选地被-OH、O-烷基、SH、S-烷基、O-CO-烷基、O-CO-NH-烷基、NH-CO-烷基、NH-CO-NH-烷基、S(O)n-烷基、SO2-NH-烷基、NH-烷基、N(烷基)2或NH2(其中烷基优选为C1-3-烷基)取代，或代表-MOD；
其中-MOD代表-(NR10)n-(G1)o-G2-G3，其中
R10代表H或C1-C3-烷基；
G1代表-NHCO-或-CONH-(其中，如果G1代表-NHCO-或则R10不代表NH2)；
n代表0或1；
o代表0或1；且
G2代表直链或支链的烃基，其具有1至10个碳原子且可被一个或更多个以下基团中断一次或更多次：-O-、-S-、-SO-、SO2、-NRy-、-NRyCO-、CONRy-、-NRyNRy-、-SO2NRyNRy-、-CONRyNRy-(其中Ry代表H、苯基、C1-C10-烷基、C2-C10-烯基或C2-C10-炔基，其各自可被NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代)、-CO-、-CRx＝N-O-(其中Rx代表H、C1-C3-烷基或苯基)，其中含任意侧链的烃链可被-NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代，G3代表--H或-COOH，其中基团-MOD优选地具有至少一个基团-COOH；
R5代表H或F；
R6和R7各自独立地代表H、(任选地氟化的)C1-3-烷基、(任选地氟化的)C2-4-烯基、(任选地氟化的)C2-4-炔基、羟基或卤素；
R8代表支链的C1-5-烷基；且
R9代表H或F，
其中-L-代表接头且#1代表键合至抗体的键，
其中-L-由下式表示
§-(CO)m-L1-L2-§§
其中
m代表0或1；
§代表键合至KSP的键，且
§§代表键合至抗体的键，且
L2代表
或
其中
#1表示结合至抗体的硫原子的结合点，
#2表示结合至基团L1的结合点，
且L1由下式表示
#1-(NR10)n-(G1)o-G2-#2
其中
R10代表H、NH2或C1-C3-烷基；
G1代表-NHCO-或
n代表0或1；
o代表0或1；且
G2代表直链或支链的烃链，其具有1至100个来自亚芳基和/或直链和/或支链的和/或环状的亚烷基基团的碳原子且其可被一个或更多个以下基团中断一次或更多次：-O-、-S-、-SO-、SO2、-NH-、-CO-、-NHCO-、-CONH-、-NMe-、-NHNH-、-SO2NHNH-、-CONHNH-、-CRx＝N-O-(其中Rx代表H、C1-C3-烷基或苯基)和具有至多4个选自N、O和S的杂原子、-SO-或-SO2-的3-至10-元芳族的或非芳族的杂环(优选)，其中含有侧链(如果存在)的烃链可被-NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代，
#1为键合至KSP抑制剂的键，且#2为键合至抗体的偶联基团(例如L2)的键。
实施方案D：
本发明还提供下面通式的结合体/活性化合物缀合物：
其中结合体代表发挥适度的激动作用或非激动作用的抗-TWEAKR抗体(特别优选人源化的或嵌合的单克隆ITEM-4抗-TWEAKR抗体，特别是人源化的或嵌合的ITEM-4变体：TPP-7005、TPP-7006、TPP-7007、TPP-7053、TPP-7073、TPP-7074、TPP-7075和TPP-7076)，L代表接头，WS代表活性化合物，优选KSP抑制剂，例如，根据本发明的式(I)、(Ia)、(II)、(IIa)、(IIb)、(IIc)、(IId)、(IIe)、(IIf)、(IIg)、(IIh)、(IIi)之一的KSP抑制剂，m代表1至2的数，优选1，且n代表1至50的数，优选1.2至20且特别优选2至8，其中L具有一种以下的结构。此处，m代表每个接头的活性化合物分子的数目且n为每个结合体的活性化合物/接头缀合物的数目的平均值。因此缀合物分子中存在的所有WS的总和为m和n的乘积。
WS为在动物中、优选在人中具有局部的或全身的治疗作用的活性化合物。这些活性化合物的分子量通常小于5kDa，优选小于1.5kDa。优选的活性化合物为长春花生物碱、奥利他汀类(auristatins)、tubulysins、多卡米星、激酶抑制剂、MEK抑制剂和KSP抑制剂。
此处，L代表下式A3和A4之一
其中#1表示结合至抗体的硫原子的结合点，#2表示结合至活性化合物的结合点，x代表1或2，且R22代表COOH、COOR、COR(其中R在每种情况下代表C1-3-烷基)、CONH2、Br，优选COOH。
L1具有如上相同的含义。优选地，-L1-#2由下式代表：
#3-(NR10)n-(G1)o-G2-#2
其中
#3表示结合至氮原子的结合点，
R10代表H、NH2或C1-C3-烷基；
G1代表-NHCO-、-CONH-或(其中，如果G1代表NHCO或则R10不代表NH2)，
n代表0或1；
o代表0或1；且
G2代表直链或支链的烃链，其具有1至100个来自亚芳基基团和/或直链和/或支链的和/或环状亚烷基基团的碳原子且其可被一个或更多个以下基团中断一次或更多次：-O-、-S-、-SO-、SO2、-NRy-、-NRyCO-、-C(NH)NRy-、CONRy-、-NRyNRy-、-SO2NRyNRy-、-CONRyNRy-(其中Ry代表H、苯基、C1-C10-烷基、C2-C10-烯基或C2-C10-炔基，其各自皆可被NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代)、-CO-、-CRx＝N-O-(其中Rx代表H、C1-C3-烷基或苯基)和/或具有至多4个选自N、O和S的杂原子、-SO-或-SO2-的3-至10-元芳族的或非芳族的杂环(优选)，其中含任意侧链的烃链可被-NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代。
G2中的其他中断基团优选为
其中Rx代表H、C1-C3-烷基或苯基。
在本发明的缀合物中或在本发明的缀合物的混合物中，在优选大于80％、特别优选大于90％(在每种情况下基于接头键合至结合体的键的总数计)的程度上存在键合至抗体的半胱氨酸残基的键，作为式A3或A4的两种结构之一。
与式A3或A4的接头的缀合物可通过分别将抗体偶联至式A3‘和A4‘的适当的溴衍生物而获得：
这些式A3‘或A4‘的溴衍生物可通过使R22CH2CHBrCOOH或R22CHBrCH2COOH与结合体的胺基团反应而获得，如以示例的方式在下面的方案30至32中所述。
方案30：
[a)：2-溴-1-乙基吡啶鎓四氟硼酸盐(BEP)，DCM，吡啶，RT；b)氯化锌，三氟乙醇，50℃，EDTA；c)3-4当量的TCEP，PBS缓冲液；d)PBS缓冲液，20h RT]
方案31：
[a)：2-溴-1-乙基吡啶鎓四氟硼酸盐(BEP)，DCM，吡啶，RT；b)氯化锌，三氟乙醇，50℃，EDTA；c)3-4当量的TCEP、PBS缓冲液；d)PBS缓冲液，20h RT]
实施方案E：
本发明还提供下面通式的结合体/活性化合物缀合物：
其中结合体代表发挥适度的激动作用或非激动作用的抗-TWEAKR抗体(特别优选人源化的或嵌合的单克隆ITEM-4抗-TWEAKR抗体，特别是人源化的或嵌合的ITEM-4变体：TPP-7005、TPP-7006、TPP-7007、TPP-7053、TPP-7073、TPP-7074、TPP-7075和TPP-7076)，L代表接头，WS代表活性化合物，优选KSP抑制剂，例如，根据本发明式(I)、(Ia)、(II)或(IIa)之一的KSP抑制剂，m代表1至2的数，优选1，且n代表1至50的数，优选1.2至20且特别优选2至8，其中L具有一种下面的结构式。此处，m代表每个接头的活性化合物分子的数目且n为每个结合体的活性化合物/接头缀合物的数目的平均值。因此缀合物分子中存在的所有WS的总和为m和n的乘积。
此处，L代表：
其中#1表示结合至抗体的硫原子的结合点，#2表示结合至活性化合物的结合点，R22代表COOH、COOR、COR(其中R在每种情况下代表C1-3-烷基)、CONH2、Br，优选COOH；连接至结合体的硫原子的连接由此可具有以下结构中的一种：
在每个抗体药物缀合物含有不止一个活性化合物分子WS的抗体药物缀合物的情况下，根据式A1和/或A2的两种结构皆可存在于抗体药物缀合物中。由于本发明的抗体药物缀合物可为不同抗体药物缀合物的混合物，因此该混合物还可既包含式A1或式A2的抗体药物缀合物又包含式A1和A2的那些抗体药物缀合物。
L5为选自-(CH2)m-(CHRS)n-(OCH2CH2)o-(X)p-(CH2)q-的基团，其中m、n、o、p和q各自独立地具有以下值：m＝0-10；n＝0或1；o＝0-10；p＝0或1；且q＝0-10，其中m+n+o＝1-15，优选1-6。x代表5-或6-元芳族的或非芳族的杂环或同素环，优选-C6H4-或-C6H10-。RS代表酸基团，优选-COOH或SO3H。
L6为选自以下的基团：-CONH-、-OCONH-、-NHCO-、-NHCOO-、其中r为1、2或3。
L7为单键或选自直链或支链的烃链的基团，所述直链或支链的烃链具有1至100个(优选1至10个)来自亚芳基和/或直链和/或支链的和/或环状的亚烷基基团的碳原子且其可被一个或更多个以下基团中断一次或更多次：-O-、-S-、-SO-、SO2、-NRy-、-NRyCO-、-C(NH)NRy-、CONRy-、-NRyNRy-、-SO2NRyNRy-、-CONRyNRy-(其中Ry代表H、苯基、C1-C10-烷基、C2-C10-烯基或C2-C10-炔基，其各自被以下基团取代：NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸)、-CO-、-CRx＝N-O-(其中Rx代表H、C1-C3-烷基或苯基)和/或具有至多4个选自N、O和S的杂原子、-SO-或-SO2-的3-至10-元、优选5-至10-元芳族的或非芳族的杂环(优选)，其中含任意侧链的烃链可被-NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代。
L5优选为基团-(CH2)m-(CHRS)n-(OCH2CH2)o-(X)p-(CH2)q-，其中m＝1-3，n＝0，o＝0-7，p＝0且q＝0或1。特别优选基团-(CH2)m-(CHRS)n-(OCH2CH2)o-(X)p-(CH2)q-，其中m＝1或2，n＝0，o＝0或1，p＝0且q＝0或1。
L6优选为选自-CONH-和-NHCO-的基团。
L7优选为单键或-[(CH2)x-(X4)y]w-(CH2)z-，
其中
w＝0至20；
x＝0至5；
y＝0或1；
z＝1至5；且
X4代表-O-、-CONH-、-NHCO-或
特别优选地，L7为单键或基团-[(CH2)x-NHCO-)]，其中x＝1至5。
特别优选地，-L5-L6-L7-代表
-(CH2)m-(CHRS)n-(OCH2CH2)o-(X)p-(CH2)q-NHCO-[(CH2)x-NHCO-)]，其中m＝1或2，n＝0，o＝0或1，p＝0，且q＝0或1，且x＝1-5。
然而，这两种结构还可以共同存在于本发明的缀合物中。
根据本发明，这些抗体药物缀合物可由下式的化合物制备：
其中L具有下式A‘：
优选地，A‘向A的转化通过在低于37℃的温度、优选10至25℃的温度下在pH为7.5至8.5、优选8的pH缓冲液中经至多40个小时、优选1至15个小时的搅拌进行。
实施方案I：
下式的抗体药物缀合物：
其中
R2、R4和R5代表H；
R3代表-CH2OH；
R1代表-L1-L2-结合体，其中
L1代表
其中#2代表结合至L2的结合点，且#1代表结合至其他结合点的结合点；
且L2代表下式A5和A6结构中的一个或两个：
其中
#1表示结合至抗体的硫原子的结合点，
#2表示结合至基团L1的结合点，且
R22代表COOH、COOR、COR、CONHR(其中R在每种情况下代表C1-3-烷基)、CONH2，优选COOH。
在本发明的缀合物中或在本发明的缀合物的混合物中，在优选大于80％、特别优选大于90％(在每种情况下基于接头键合至结合体的键的总数计)的程度上存在键合至抗体的半胱氨酸残基的键，特别优选作为式A5或A6的两种结构之一。
此处，式A5或A6的结构通常一起存在，优选以60∶40至40∶60的比率，基于键合至抗体的键的数量计。然后其余键以下结构存在：
抗体优选为人源化的或嵌合的单克隆ITEM-4抗-TWEAKR抗体。特别优选人源化的或嵌合的ITEM-4变体：TPP-7005、TPP-7006、TPP-7007、TPP-7053、TPP-7073、TPP-7074、TPP-7075和TPP-7076。
具体实施方案
下面提供了特别优选的下式之一的抗体缀合物，其中n为1至20的数，AK1(以及AK1a、AK1b等)和AK2(以及AK2a、AK2b等)为抗体。AK1为通过半胱氨酸结合的抗体，AK2为通过赖氨酸结合的抗体。下式之一中的抗体(AK1或AK2)优选为人源化的或嵌合的单克隆ITEM-4抗-TWEAKR抗体。特别优选人源化的或嵌合的ITEM-4变体：TPP-7005、TPP-7006、TPP-7007、TPP-7053、TPP-7073、TPP-7074、TPP-7075和TPP-7076。
其他缀合物
其他缀合物可具有下式之一的化学式及其盐、溶剂合物、溶剂合物的的盐和差向异构体：
和
其中
AK1代表通过半胱氨酸结合的发挥适度的激动作用或非激动作用的抗-TWEAKR抗体且AK2代表通过赖氨酸结合的发挥适度的激动作用或非激动作用的抗-TWEAKR抗体，
n代表1至20的数；且
L1代表具有1至30个碳原子的直链或支链的烃链，其被相同或不同的以下基团中断一次或更多次：-O-、-S-、-C(＝O)-、-S(＝O)2-、-NH-、环戊基、哌啶基、苯基，
其中所述直链或支链的烃链可被-COOH或-NH2取代。
此处，接头L1优选地代表以下基团：
§-NH-(CH2)2-§§；
§-NH-(CH2)6-§§；
§-NH-(CH2)2-O-(CH2)2-§§；
§-NH-CH(COOH)-(CH2)4-§§
§-NH-NH-C(＝O)-(CH2)5-§§；
§-NH-(CH2)2-C(＝O)-O-(CH2)2-§§；
§-NH-(CH2)2-C(＝O)-NH-(CH2)2-§§；
§-NH-(CH2)2-NH-C(＝O)-CH2-§§；
§-NH-(CH2)3-NH-C(＝O)-CH2-§§；
§-NH-(CH2)2-NH-C(＝O)-(CH2)2-§§；
§-NH-(CH2)2-NH-C(＝O)-(CH2)5-§§；
§-NH-(CH2)2-NH-C(＝O)-CH(CH3)-§§；
§-NH-(CH2)2-O-(CH2)2-NH-C(＝O)-CH2-§§；
§-NH-CH(COOH)-CH2-NH-C(＝O)-CH2-§§；
§-NH-CH(COOH)-(CH2)2-NH-C(＝O)-CH2-§§；
§-NH-CH(COOH)-(CH2)4-NH-C(＝O)-CH2-§§；
§-NH-CH(COOH)-CH2-NH-C(＝O)-(CH2)2-§§；
§-NH-(CH2)2-NH-C(＝O)-CH(C2H4COOH)-§§；
§-NH-(CH2)2-NH-C(＝O)-((CH2)2-O)3-(CH2)2-§§；
§-NH-(CH2)2-S(＝O)2-(CH2)2-NH-C(＝O)-CH2-§§；
§-NH-(CH2)2-NH-C(＝O)-CH2-NH-C(＝O)-CH2-§§；
§-NH-(CH2)3-NH-C(＝O)-CH2-NH-C(＝O)-CH2-§§；
§-NH-CH(COOH)-CH2-NH-C(＝O)-CH(CH2COOH)-§§；
§-NH-(CH2)2-NH-C(＝O)-CH(C2H4COOH)-NH-C(＝O)-CH2-§§；
§-NH-CH(COOH)-CH2-NH-C(＝O)-(CH2)2-NH-C(＝O)-CH2-§§；
§-NH-(CH2)2-NH-C(＝O)-(CH2)2-CH(COOH)-NH-C(＝O)-CH2-§§；
§-NH-CH(COOH)-CH2-NH-C(＝O)-CH(CH2OH)-NH-C(＝O)-CH2-§§；
§-NH-CH[C(＝O)-NH-(CH2)2-O)4-(CH2)2COOH]-CH2-NH-C(＝O)-CH2-§§；
§-NH-CH(COOH)-CH2-NH-C(＝O)-((CH2)2-O)4-(CH2)2-NH-C(＝O)-CH2-§§；
§-NH-(CH2)4-CH(COOH)-NH-C(＝O)-CH(CH3)-NH-C(＝O)-CH(异C3H7)-§§；
§-NH-(CH2)4-CH(COOH)-NH-C(＝O)-CH(CH3)-NH-C(＝O)-CH(异C3H7)-NH-C(＝O)-(CH2)5-§§；
§-NH-(CH2)2-C(＝O)-NH-(CH2)4-CH(COOH)-NH-C(＝O)-CH(CH3)-NH-C(＝O)-CH(异C3H7)-NH-C(＝O)-CH2-§§；
§-NH-(CH2)2-C(＝O)-NH-(CH2)4-CH(COOH)-NH-C(＝O)-CH(CH3)-NH-C(＝O)-CH(异C3H7)-NH-C(＝O)-(CH2)5-§§；
§-NH-(CH2)4-CH(COOH)-NH-C(＝O)-CH[(CH2)3-NH-C(＝O)-NH2]-NH-C(＝O)-CH(异C3H7)-NH-C(＝O)-(CH2)5-§§；
§-NH-(CH2)2-NH-C(＝O)-(CH2)2-CH(COOH)-NH-C(＝O)-CH(CH3)-NH-C(＝O)-CH(异C3H7)-NH-C(＝O)-(CH2)5-§§；
§-NH-CH(CH3)-C(＝O)-NH-(CH2)4-CH(COOH)-NH-C(＝O)-CH(CH3)-NH-C(＝O)-CH(异C3H7)-NH-C(＝O)-(CH2)5-§§；
§-NH-(CH2)2-C(＝O)-NH-(CH2)4-CH(COOH)-NH-C(＝O)-CH[(CH2)3-NH-C(＝O)-NH2]-NH-C(＝O)-CH(异C3H7)-NH-C(＝O)-(CH2)5-§§；
§-NHC(＝O)-NH-(CH2)2-§§；
§-NHC(＝O)-NH-(CH2)2-NH-C(＝O)-CH2-§§；
§-NHC(＝O)-NH-(CH2)4-CH(COOH)-NH-C(＝O)-CH[(CH2)3-NH-C(＝O)-NH2]-NH-C(＝O)-CH(异C3H7)-NH-C(＝O)-(CH2)5-§§；
§-NHC(＝O)-NH-(CH2)4-CH(COOH)-NH-C(＝O)-CH[(CH2)3-NH-C(＝O)-NH2]-NH-C(＝O)-CH(异C3H7)-NH-C(＝O)-(CH2)5-§§；
§-NHC(＝O)-NH-(CH2)4-CH(COOH)-NH-C(＝O)-CH(CH3)-NH-C(＝O)-CH(异C3H7)-NH-C(＝O)-(CH2)5-§§；
§-NH-(CH2)2-C(＝O)-NH-CH(异C3H7)-C(＝O)-NH-CH[(CH2)3-NH-C(＝O)-NH2]-C(＝O)-OC(＝O)-CH2-§§；
§-NH-(CH2)2-C(＝O)-NH-CH(异C3H7)-C(＝O)-NH-CH(CH3)-C(＝O)-OC(＝O)-CH2-§§；
§-NH-(CH2)2-NH-C(＝O)§§；
§-NH-CH(COOH)-CH2-NH-C(＝O)§§；
§-NH-(CH2)2-C(＝O)-NH-CH(CH3)-C(＝O)-NH-CH[(CH2)3-NH-C(＝O)-NH2]-C(＝O)-NH§§；
§-(CH2)2-C(＝O)-NH-(CH2)2-§§；
§-(CH2)2-C(＝O)-NH-(CH2)2-NH-C(＝O)-CH2-§§；
§-CH(CH3)-NH-C(＝O)-CH(异C3H7)-§§；
§-CH(CH3)-NH-C(＝O)-CH(异C3H7)-NH-C(＝O)-CH2-§§；
§-CH(CH3)-NH-C(＝O)-CH(异C3H7)-NH-C(＝O)-(CH2)5-§§；
§-(CH2)2-C(＝O)-NH-((CH2)2-O)4-(CH2)2-NH-C(＝O)-CH2-§§；
§-CH(CH3)-NH-C(＝O)-CH(异C3H7)-NH-C(＝O)-((CH2)2-O)4-(CH2)2-NH-C(＝O)-(CH2)2-§§；
§NH-C(＝O)-CH(CH3)-NH-C(＝O)-CH(异C3H7)-NH-C(＝O)-((CH2)2-O)4-(CH2)2-NH-C(＝O)-(CH2)2-§§；
§-CH2-S-(CH2)2-C(＝O)-NH-(CH2)2-§§；
§-CH2-S-(CH2)5-C(＝O)-NH-(CH2)2-§§；
§-CH2-S-CH2CH(COOH)-NH-C(＝O)-CH2-§§；
§-CH2-S-CH2CH(COOH)-NH-C(＝O)-(CH2)5-§§；
§-CH2-S-(CH2)2-C(＝O)-NH-((CH2)2-O)2-(CH2)2-§§；
§-CH2-S-(CH2)2-C(＝O)-NH-((CH2)2-O)2-(CH2)5-§§；
§-CH2-S-(CH2)2-C(＝O)-NH-(CH2)2-NH-C(＝O)-CH2-§§；
§-CH2-S-(CH2)2-C(＝O)-NH-(CH2)2-NH-C(＝O)-CH5-§§；
§-CH2-S-(CH2)2-C(＝O)-NH-CH(COOH)-CH2-NH-C(＝O)-CH2-§§；
§-CH2-S-CH2CH(NH2)-C(＝O)-NH-(CH2)2-NH-C(＝O)-(CH2)5-§§；
§-CH2-S-(CH2)2-C(＝O)-NH-((CH2)2-O)2-(CH2)2-NH-C(＝O)-CH2-§§；
§-CH2-S-(CH2)2-C(＝O)-NH-((CH2)2-O)4-(CH2)2-NH-C(＝O)-CH2-§§；
§-CH2-S-(CH2)2-C(＝O)-NH-((CH2)2-O)2-(CH2)2-NH-C(＝O)-(CH2)5-§§；
§-CH2-S-(CH2)2-C(＝O)-NH-((CH2)2-O)4-(CH2)2-NH-C(＝O)-(CH2)5-§§；
§-CH2-S-CH2CH(COOH)-NH-C(＝O)-((CH2)2-O)2-(CH2)2-NH-C(＝O)-CH2-§§；
§-CH2-S-CH2CH(COOH)-NH-C(＝O)-((CH2)2-O)4-(CH2)2-NH-C(＝O)-CH2-§§；
§-CH2-S-CH2CH(COOH)-NH-C(＝O)-((CH2)2-O)4-(CH2)2-NH-C(＝O)-(CH2)2-§§；
§-CH2-S-(CH2)2-CH(COOH)-NH-C(＝O)-((CH2)2-O)4-(CH2)2-NH-C(＝O)-(CH2)2-§§；
§-CH2-S-(CH2)2-C(＝O)-NH-CH(C2H4COOH)-C(＝O)-NH-(CH2)2-NH-C(＝O)-CH2-§§；
§-CH2-S-CH2CH[NH-C(＝O)-(CH2)2-COOH]-C(＝O)-NH-(CH2)2-NH-C(＝O)-CH2-§§；
§-CH2-S-CH2CH[NH-C(＝O)-((CH2)2-O)4-CH3]-C(＝O)-NH-(CH2)2-NH-C(＝O)-CH2-§§；
§-CH2-S-CH2CH(COOH)-NH-C(＝O)-CH(CH3)-NH-C(＝O)-CH(异C3H7)-NH-C(＝O)-CH2-§§；
§-CH2-S-CH2CH[NH-C(＝O)-(CH2)2-COOH]-C(＝O)-NH-(CH2)2-S(＝O)2-(CH2)2-NH-C(＝O)-CH2-§§；
§-CH2-S-CH2CH[NH-C(＝O)-(CH2)2-COOH]-C(＝O)-NH-((CH2)2-O)4-(CH2)2-NH-C(＝O)-CH2-§§；
§-CH2-S-CH2CH[C(＝O)-NH-(CH2)2-COOH]-NH-C(＝O)-((CH2)2-O)4-(CH2)2-NH-C(＝O)-CH2-§§；
§-CH2-S-CH2CH[C(＝O)-NH-(CH2)2-COOH]-NH-C(＝O)-((CH2)2-O)4-(CH2)2-NH-C(＝O)-(CH2)2-§§；
§-CH2-S-CH2CH(COOH)-NH-C(＝O)-(CH2)2CH(COOH)-NH-C(＝O)-((CH2)2-O)4-(CH2)2-NH-C(＝O)-CH2-§§
§-CH2-S-CH2CH[C(＝O)-NH-((CH2)2-O)4-(CH2)2-COOH]-NH-C(＝O)-((CH2)2-O)4-(CH2)2-NH-C(＝O)-CH2-§§；
或
§-CH2-S-CH2CH(COOH)-NH-C(＝O)-CH[(CH2)2-COOH]-NH-C(＝O)-((CH2)2-O)4-(CH2)2-NH-C(＝O)-(CH2)2-§§，
其中
§代表键合至活性化合物模块的键，且
§§代表键合至抗体的键和
异C3H7代表异丙基基团。
这些缀合物还包括它们的盐、溶剂合物、溶剂合物的盐和差向异构体。
治疗用途
可利用本发明的化合物治疗的过度增殖疾病特别地包括癌症和肿瘤疾病。在本发明上下文中，这些应理解为尤其是指下列疾病，但不限于它们：乳腺癌和乳腺肿瘤(乳腺癌包括导管和小叶形式，也称为原位癌)、呼吸道肿瘤(小细胞和非小细胞肺癌、支气管癌)、脑肿瘤(例如脑干肿瘤和下丘脑肿瘤、星形细胞瘤、室管膜瘤、胶质母细胞瘤、胶质瘤、髓母细胞瘤、脑膜瘤和神经外胚层和松果体瘤)、消化器官肿瘤(食道癌、胃癌、胆囊癌、小肠癌、大肠癌、直肠癌和肛门癌)、肝肿瘤(尤其是肝细胞癌、胆管上皮癌和混合肝细胞和胆管上皮癌)、头颈区的肿瘤(喉、下咽部、鼻咽、口咽、嘴唇和口腔癌，口黑瘤)、皮肤瘤(基底细胞瘤、spinaliomas、鳞状细胞癌、卡波西肉瘤、恶性黑色素瘤、非黑素瘤皮肤癌、梅克尔细胞皮肤癌、肥大细胞瘤)、间质肿瘤和结缔组织肿瘤(尤其是软组织肉瘤、骨肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、软骨肉瘤、纤维肉瘤、血管肉瘤、平滑肌肉瘤、脂肪肉瘤、淋巴肉瘤和横纹肌肉瘤)、眼睛肿瘤(尤其是眼内黑素瘤和视网膜细胞瘤)、内分泌和外分泌腺的肿瘤(例如甲状腺癌和甲状旁腺癌、胰腺癌和唾液腺癌、腺癌)、尿道肿瘤(膀胱、阴茎、肾、肾盂和输尿管的肿瘤)和生殖器官肿瘤(在女性中为子宫内膜癌、子宫颈癌、卵巢癌、阴道癌、外阴癌和子宫癌，在男性中为前列腺癌和睾丸癌)。这些还包括实体形式和作为循环细胞的血液、淋巴系统和脊髓的增殖性血液病，如白血病、淋巴瘤和骨髓增生性疾病，例如急性髓细胞白血病、急性成淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、慢性骨髓性白血病和毛细胞性白血病，以及AIDS相关淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、皮肤T-细胞淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤和中枢神经系统中的淋巴瘤。
这些已很好地表征的人类疾病也可在其它哺乳动物中以同等的病因学发生，且可同样采用本发明的化合物治疗。
采用本发明的化合物治疗上述癌症疾病既包括实体瘤的治疗也包括其转移形式或循环形式的治疗。
在本发明上下文中，术语“治疗”以传统意义使用并意指为了对抗、减轻、减弱或缓解疾病或健康异常和改善例如在癌症事件中因该疾病受损的生存状况而照料、照顾和护理患者。
本发明因此还提供本发明的化合物用于治疗和/或预防疾病、尤其是前述疾病的用途。
本发明还提供本发明的化合物用于制备用于治疗和/或预防疾病、尤其是前述疾病的药物的用途。
本发明还提供本发明的化合物在治疗和/或预防疾病、尤其是前述疾病的方法中的用途。
本发明还提供使用有效量的至少一种本发明化合物来治疗和/或预防疾病、尤其是前述疾病的方法。
本发明的化合物可以独自使用或如果需要与一种或多种其它药理学活性物质组合使用，只要这种组合不会造成不期望的和不可接受的副作用。因此，本发明还提供含有至少一种本发明的化合物和一种或多种其他活性成分、尤其是用于治疗和/或预防前述疾病的活性成分的药物。
例如，本发明的化合物可与用于治疗癌症的已知抗过度增殖的、细胞生长抑制的或细胞毒性的物质组合。合适的组合活性物质的实例包括：
131I-chTNT、阿巴瑞克、阿比特龙、阿柔比星、阿法替尼、阿柏西普、阿地白介素、阿仑珠单抗、alisertib、阿利维A酸、alpharadin(氯化镭-223)、六甲蜜胺、氨鲁米特、AMP-514、氨柔比星、安吖啶、阿那曲唑、arglabin、三氧化二砷、天冬酰胺酶、AT9283、阿西替尼、阿扎胞苷、巴利昔单抗、贝洛替康、苯达莫司汀、贝伐单抗、贝沙罗汀、比卡鲁胺、比生群、博来霉素、BMS-936559、博舒替尼、硼替佐米、brentuximab vedotin、布舍瑞林、白消安、卡巴他赛、卡博替尼、亚叶酸钙、左亚叶酸钙、卡培他滨、卡铂、卡非佐米(蛋白酶体抑制剂)、卡莫氟、卡莫司汀、卡妥索单抗、塞来昔布、西莫白介素、西妥昔单抗、苯丁酸氮芥、氯地孕酮、氮芥、顺铂、克拉屈滨、氯膦酸、氯法拉滨、copanlisib、crisantaspase、克唑替尼、环磷酰胺、CYC116、环丙孕酮、阿糖胞苷、达卡巴嗪、放线菌素、阿法达贝泊汀、达拉菲尼、达鲁舍替、达沙替尼、道诺霉素、地西他滨、地加瑞克、地尼白介素2、地诺单抗、地洛瑞林、二溴螺氯铵、多西紫杉醇、去氧氟尿苷、多柔比星、多柔比星+雌酮、依库丽单抗、依决洛单抗、依利醋铵、艾曲泼帕、内皮他丁、ENMD-2076、依诺他滨、表柔比星、环硫雄醇、阿法依泊汀、倍他依泊汀、依他铂、艾立布林、埃罗替尼、雌二醇、雌氮芥、依托泊苷、依维莫司、依西美坦、法倔唑、非格司亭、氟达拉滨、氟尿嘧啶、氟他胺、福美坦、福莫司汀、氟维司群、硝酸镓、加尼瑞克、吉非替尼、吉西他滨、吉妥珠单抗、glutoxim、戈舍瑞林、组胺二盐酸盐、组氨瑞林、羟基脲、I-125种子、伊班膦酸、替伊莫单抗、依鲁替尼、伊达比星、异环磷酰胺、伊马替尼、咪喹莫特、INCB24360、英丙舒凡、干扰素-α、干扰素-β、干扰素-γ、易普利姆玛、伊立替康、伊沙匹隆、lambrolizumab、兰瑞肽、拉帕替尼、来那度胺、来格司亭、香菇多糖、来曲唑、亮丙瑞林、左旋咪唑、麦角乙脲、洛铂、洛莫司汀、氯尼达明、马索罗酚、甲羟孕酮、甲地孕酮、美法仑、美雄烷、巯基嘌呤、甲氨蝶呤、甲氧沙林、氨基乙酰丙酸甲酯、甲睾酮、米伐莫肽、米替福新、米铂、二溴甘露醇、米托胍腙、二溴卫矛醇、丝裂霉素、米托坦、米托蒽醌、MLN-8054、Mps1抑制剂(公开于WO2013/087579中，特别是实施例01.01，WO2014/131739中，特别是实施例2中)、萘达铂、奈拉滨、奈莫柔比星、尼洛替尼、尼鲁米特、尼妥珠单抗、尼莫司汀、硝氨丙吖啶、nivolumab、NMS-P715、NMS-P937、奥法木单抗、奥美拉唑、奥普瑞白介素、奥沙利铂、p53基因疗法、紫杉醇、palbociclib、palifermin、钯-103种子、帕米膦酸、帕尼单抗、帕唑帕尼、培门冬酶、PEG-倍他依泊汀(甲氧基-PEG-倍他依泊汀)、聚乙二醇化非格司亭、Peg干扰素-α-2b、培美曲塞、喷他佐辛、喷司他丁、培洛霉素、培磷酰胺、溶链菌、吡柔比星、普乐沙福、普卡霉素、聚氨葡糖、聚磷酸雌二醇、多糖-K、帕纳替尼、卟吩姆钠、普拉曲沙、泼尼莫司汀、丙卡巴肼、喹高利特、R763、雷洛昔芬、雷替曲塞、雷莫司汀、雷佐生、refametinib、瑞格非尼、利塞膦酸、利妥昔单抗、罗米地新、罗米司亭、roninciclib、鲁索利替尼、沙格司亭、sipuleucel-T、西佐喃、索布佐生、甘氨双唑钠、SNS-314、索拉非尼、链脲菌素、舒尼替尼、他拉泊芬、他米巴罗汀、他莫昔芬、他索纳明、替西白介素、替加氟、替加氟+吉美嘧啶+奥特拉西、替莫泊芬、替莫唑胺、坦罗莫司、替尼泊苷、睾酮、替曲膦、沙利度胺、塞替哌、胸腺法新、TKM-PLK1、硫鸟嘌呤、托珠单抗、托泊替康、托瑞米芬、托西莫单抗、托泽色替、曲贝替定、曲美替尼、曲妥珠单抗、曲妥珠单抗emtansine、曲奥舒凡、维甲酸、曲洛司坦、曲普瑞林、曲磷胺、色氨酸、乌苯美司、戊柔比星、凡德他尼、伐普肽、威罗菲尼、长春碱、长春新碱、长春地辛、长春氟宁、长春瑞滨、volasertib、伏立诺他、伏罗唑、XL228、钇-90玻璃微球、净司他丁、净司他丁斯酯、唑来膦酸、佐柔比星。
此外，本发明的化合物可例如与例如可结合至下列靶标的结合体组合：OX-40、CD137/4-1BB、DR3、IDO1/IDO2、LAG-3、CD40。
此外，本发明的化合物也可与放射疗法和/或外科手术联合使用。
通常，采用本发明的化合物与其它细胞生长抑制活性剂或细胞毒性活性剂的组合追求下列目标：
与采用单独的活性化合物治疗相比，在减慢肿瘤生长、减小其尺寸或甚至完全将其消除方面改进的效力；
以比在单一疗法的情况中更低的剂量使用化疗药物的可能性；
与单独给药相比，具有更少副作用的更可耐受的治疗的可能性；
治疗更广谱的肿瘤疾病的可能性；
实现更高的治疗响应率；
与当今标准疗法相比，更长的患者存活时间。
此外，本发明的化合物也可以与放射疗法和/或外科手术联合使用。
本发明还提供包含至少一种本发明的化合物通常与一种或多种惰性、无毒、药学上合适的辅助剂一起的药物，及其用于前述目的的用途。
本发明的化合物可以系统地和/或局部地发挥作用。为此，它们可以以合适的方式(例如以胃肠外的方式、可能的吸入的方式或作为植入物或支架)给药。
本发明的化合物可以以适合这些给药途径的给药形式而给药。
非消化道给药可以绕开吸收步骤(例如静脉内、动脉内、心脏内、脊柱内或腰内)或包括吸收(例如肌肉内、皮下、皮内、经皮或腹膜内)。适合非消化道给药的给药形式包括以溶液、混悬剂、乳剂或冻干产物形式的注射制剂和输液制剂。优选的是非消化道给药，尤其是静脉给药。
一般而言，已经发现，在非消化道给药的情况下为实现有效结果给予大约0.001至1mg/kg、优选大约0.01至0.5mg/kg体重的量是有利的。
然而，在一些情况下可能必须酌情偏离所述量，尤其是根据体重、给药途径、个体对活性成分的响应、制剂性质和给药时间或给药间隔。因此，在一些情况下，少于上述最低量可能是足够的，而在另一些情况下，必须超过所提到的上限。在给予更大量的情况下，可能最好将它们在一天内分成几个单剂。
实施例
下述实施例说明了本发明。本发明不限于所述实施例。
除非另有所述，下面的测试中和实施例中的百分数为重量百分数；份数为重量份数。液/液溶液的溶剂比、稀释比和浓度数据在每种情况下都基于体积计。
在实验的描述中，如果进行反应的温度未说明，则可假定是室温。
合成路线：
作为工作实施例的示例，下述方案示出了得出工作实施例的示例性合成路线：
方案20：半胱氨酸-连接的ADC的合成
方案21：半胱氨酸-连接的ADC的合成
方案22：中间体的合成
[a)：例如三乙酰氧基硼氢化钠，乙酸，DCM，RT；b)例如乙酰氧基乙酰氯，NEt3，DCM，RT；c)例如LiOH，THF/水，RT；d)例如H2，Pd-C，EtOH，RT；e)例如Teoc-OSu，NEt3，二噁烷，RT；f)例如Fmoc-Cl，二异丙基乙胺，二噁烷/水 2∶1，RT]
方案24：中间体的合成
[a)：例如苄基溴，Cs2CO3，DMF，RT；b)例如Pd(dppf)2Cl2，DMF，Na2CO3，85℃；c)例如LiAlH4，THF，0℃；MnO2，DCM，RT；d)例如Ti(iOPr)4，THF，RT；e)例如tBuLi，THF，-78℃；MeOH，NH4Cl；f)例如HCl/1，4-二噁烷]
方案25：半胱氨酸-连接的ADC的合成
方案26：经由水解的琥珀酰胺的半胱氨酸-连接的ADC的合成
特别地，该方法用于将其中L1＝CH2或其中L1＝CH-CH3或其中L1＝苯基的ADC转化成开链连接形式。
方案27：ADC前体分子的合成
[a)：三乙酰氧基硼氢化钠，乙酸，DCM，RT；b)乙酰氧基乙酰氯，二异丙基乙胺，DCM，RT；c)LiOH，MeOH，RT；d)三氟乙酸/1-(2-氨基乙基)-1H-吡咯-2，5-二酮(1∶1)HATU，DMF，二异丙基乙胺，RT；e)氯化锌，三氟乙醇，50℃，EDTA。]
方案28：ADC前体分子的合成
[a)：HATU，DMF，二异丙基乙胺，RT；b)氯化锌，三氟乙醇，50℃，EDTA。]
方案29：ADC前体分子的合成
[a)：三乙酰氧基硼氢化钠，乙酸，DCM，RT；b)乙酰氧基乙酰氯，三乙胺，DCM，RT；c)LiOH，MeOH，RT；d)三氟乙酸/1-(2-氨基乙基)-1H-吡咯-2，5-二酮(1∶1)HATU，DMF，二异丙基乙胺，RT；e)氯化锌，三氟乙醇，50℃，EDTA。]
方案30：ADC的合成
[a)：2-溴-1-乙基吡啶鎓四氟硼酸盐(BEP)，DCM，吡啶，RT；b)氯化锌，三氟乙醇，50℃，EDTA；c)3-4当量的TCEP，PBS缓冲液；d)PBS缓冲液，20h RT。]
方案31：ADC的合成
[a)：2-溴-1-乙基吡啶鎓四氟硼酸盐(BEP)，DCM，吡啶，RT；b)氯化锌，三氟乙醇，50℃，EDTA；c)3-4当量的TCEP，PBS缓冲液；d)PBS缓冲液，20h RT。]
方案32：中间体的合成
[a)例如二甲基锌，环己基MgCl，THF，-78℃；NH4Cl；b)例如HCl/1，4-二噁烷]
方案33：ADC前体分子的合成
[a)：三乙酰氧基硼氢化钠，乙酸，DCM，RT；b)乙酰氧基乙酰氯，三乙胺，DCM，RT；c)L-半胱氨酸，NaHCO3，DBU，异丙醇/水，RT；d)3-巯基丙酸，K2CO3，RT；e)接头，HATU，DMF，二异丙基乙胺，RT；e)氯化锌，三氟乙醇，50℃，EDTA。]
方案34：赖氨酸-连接的ADC的合成
方案35：赖氨酸-连接的ADC的合成
A.实施例
缩写和简称：
A498 人肿瘤细胞系
ABCB1 ATP-结合盒亚家族B成员1(P-gp和MDR1的同义词)
abs. 无水的
Ac 乙酰基
ACN 乙腈
aq. 水性的，水溶液
ATP 三磷酸腺苷
BCRP 乳腺癌抗药性蛋白质，一种外排转运蛋白
BEP 2-溴-1-乙基吡啶鎓四氟硼酸盐
Boc 叔丁氧基羰基
br. 宽峰(在NMR中)
Ex. 实施例
BxPC3 人肿瘤细胞系
CI 化学电离(在MS中)
D 双峰(在NMR中)
D 天
TLC 薄层色谱法
DCI 直接化学电离(在MS中)
DCM 二氯甲烷
Dd 双重双峰(在NMR中)
DMAP 4-N，N-二甲基氨基吡啶
DME 1，2-二甲氧基乙烷
DMEM 达尔贝科(Dulbecco)氏改性的伊格尔培养基(Eagle Medium)(用于细胞培养的标准化的营养培养基)
DMF N，N-二甲基甲酰胺
DMSO 二甲基亚砜
DPBS 达尔贝科氏磷酸盐缓冲的盐溶液
D-PBS，PBS PBS＝DPBS＝D-PBS，pH 7.4，购自Sigma，No D8537
组成：
0.2g KCl
0.2g KH2PO4(无水的)
8.0g NaCl
1.15g Na2HPO4(无水的)
用H2O补充至1升
Dt 三重双峰(在NMR中)
DTT DL-二硫苏糖醇
EDC N′-(3-二甲基氨基丙基)-N-乙基碳二亚胺盐酸盐
EGFR 表皮生长因子受体
EI 电子碰撞电离(在MS中)
ELISA 酶联免疫吸附测定
eq. 当量
ESI 电喷雾电离(在MS中)
ESI-MicroTof ESI-MicroTofq(质谱仪名称，其中
q Tof＝飞行时间且q＝四极杆)
FCS 胎牛血清
Fmoc (9H-芴-9-基甲氧基)羰基
sat. 饱和的
GTP 5′-三磷酸鸟苷
H 小时
HATU O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲鎓六氟磷酸盐
HEPES 4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙烷磺酸
HOAc 乙酸
HOAt 1-羟基-7-氮杂苯并三唑
HOBt 1-羟基-1H-苯并三唑水合物
HOSu N-羟基琥珀酰亚胺
HPLC 高压液相色谱法，高效液相色谱法
IC50 半数最大抑制浓度
i.m. 肌肉内，给药至肌肉内
i.v. 静脉，给药至静脉内
KG-1 人肿瘤细胞系
conc. 浓缩的
KU-19-19 人肿瘤细胞系
LC-MS 液相色谱-质谱联用
LLC-PK1细胞 Lewis肺癌猪肾细胞系
L-MDR 人MDR1转染的LLC-PK1细胞
LoVo 人肿瘤细胞系
m 多重峰(在NMR中)
MDR1 多药耐药蛋白1
MeCN 乙睛
Me 甲基
min 分钟
MS 质谱法
MTT 溴化3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基-2H-四唑鎓
NCI-H292 人肿瘤细胞系
NMM N-甲基吗啉
NMP N-甲基-2-吡咯烷酮
NMR 核磁共振波谱法
NMRI 小鼠品系，源自Naval Medicai Research Institute(NMRI)
裸鼠 裸鼠(受试动物)
NSCLC 非小细胞肺癌
PBS 磷酸盐缓冲的盐溶液
Pd/C 钯活性炭
P-gp P-糖蛋白，一种转运蛋白
PNGaseF 用于裂解糖的酶
quant. 定量(收率)
quart 四重峰(在NMR中)
quint 五重峰(在NMR中)
Rf 保留指数(在TLC中)
RT 室温
Rt 保留时间(在HPLC中)
s 单峰(在NMR中)
s.c. 皮下，在皮肤下给药
SCID小鼠 具有重症联合免疫缺陷的受试小鼠
t 三重峰(在NMR中)
TBAF 四正丁基氟化铵
TEMPO (2，2，6，6-四甲基哌啶-1-基)氧基
tert 叔
TFA 三氟乙酸
THF 四氢呋喃
2，4，6-三丙基-1，3，5，2，4，6-三氧杂三次膦烷2，4，6-三氧化物(2，4，6-tripropyl-1，3，5，2，4，6-trioxatrip hosphinane 2，4，6-trioxide)
UV 紫外光谱法
v/v (溶液的)体积比体积的比例
Z 苄氧基羰基
HPLC和LC-MS方法：
方法1(LC-MS)：
仪器：Waters ACQUITY SQD UPLC系统；色谱柱：Waters Acquity UPLC HSS T31.8μ50×1mm；流动相A：1升水+0.25ml 99％浓度的甲酸，流动相B：1升乙腈+0.25ml 99％浓度的甲酸；梯度：0.0min 90％A→1.2min 5％A→2.0min 5％A，柱温箱：50℃；流速：0.40ml/min；UV检测：208-400nm。
方法2(LC-MS)：
MS仪器类型：Waters Synapt G2S；UPLC仪器类型：Waters Acquity I-CLASS；色谱柱：Waters，BEH300，2.1×150mm，C18 1.7μm；流动相A：1升水+0.01％甲酸；流动相B：1升乙腈+0.01％甲酸；梯度：0.0min 2％B→1.5min 2％B→8.5min 95％B→10.0min 95％B；柱温箱：50℃；流速：0.50ml/min；UV检测：220nm。
方法3(LC-MS)：
MS仪器：Waters(Micromass)QM；HPLC仪器：Agilent 1100系列；色谱柱：AgilentZORBAX Extend-C18 3.0×50mm 3.5-微米；流动相A：1升水+0.01mol碳酸铵，流动相B：1升乙腈；梯度：0.0min 98％A→0.2min 98％A→3.0min 5％A→4.5min 5％A；柱温箱：40℃；流速：1.75ml/min；UV检测：210nm。
方法4(LC-MS)：
MS仪器类型：Waters Synapt G2S；UPLC仪器类型：Waters Acquity I-CLASS；色谱柱：Waters，HSST3，2.1×50mm，C18 1.8μm；流动相A：1升水+0.01％甲酸；流动相B：1升乙腈+0.01％甲酸；梯度：0.0min 10％B→0.3min 10％B→1.7min 95％B→2.5min 95％B；柱温箱：50℃；流速：1.20ml/min；UV检测：210nm。
方法5(LC-MS)：
仪器：Waters ACQUITY SQD UPLC系统；色谱柱：Waters Acquity UPLC HSS T31.8μ50×1mm；流动相A：1升水+0.25ml 99％浓度的甲酸，流动相B：1升乙腈+0.25ml 99％浓度的甲酸；梯度：0.0min 95％A→6.0min 5％A→7.5min 5％A柱温箱：50℃；流速：0.35ml/min；UV检测：210-400nm。
方法6(LC-MS)：
仪器：Micromass Quattro Premier with Waters UPLC Acquity；色谱柱：ThermoHypersll GOLD 1.9μ50×1mm；流动相A：1升水+0.5ml 50％浓度的甲酸，流动相B：1升乙腈+0.5ml 50％浓度的甲酸；梯度：0.0min 97％A→0.5min 97％A→3.2min 5％A→4.0min 5％A柱温箱：50℃；流速：0.3ml/min；UV检测：210nm。
方法7(LC-MS)：
仪器：Agilent MS Quad 6150；HPLC：Agilent 1290；色谱柱：Waters AcquityUPLC HSS T3 1.8μ50×2.1mm；流动相A：1升水+0.25ml99％浓度的甲酸，流动相B：1升乙腈+0.25ml 99％浓度的甲酸；梯度：0.0min 90％A→0.3min 90％A→1.7min 5％A→3.0min5％A柱温箱：50℃；流速：1.20ml/min；UV检测：205-305nm。
方法8(LC-MS)：
MS仪器类型：Waters Synapt G2S；UPLC仪器类型：Waters Acquity I-CLASS；色谱柱：Waters，HSST3，2.1×50mm，C18 1.8μm；流动相A：1升水+0.01％甲酸；流动相B：1升乙腈+0.01％甲酸；梯度：0.0min 2％B→2.0min 2％B→13.0min 90％B→15.0min 90％B；柱温箱：50℃；流速：1.20ml/min；UV检测：210nm。
方法9：LC-MS-预纯化方法例如181-191(方法LIND-LC-MS-预)
MS仪器：Waters，HPLC仪器：Waters(色谱柱Waters X-Bridge C18，19mm×50mm，5μm，流动相A：水+0.05％氨水，流动相B：梯度乙腈(ULC)；流速：40ml/min；UV检测：DAD；210-400nm)。
或
MS仪器：Waters，HPLC仪器：Waters(色谱柱Phenomenex Luna 5μC18(2)100A，AXIATech.50×21.2mm，流动相A：水+0.05％甲酸，流动相B：梯度乙腈(ULC)；流速：40ml/min；UV检测：DAD；210-400nm)。
方法10：实施例181-191(LIND_SQD_SB_AQ)的LC-MS分析方法
MS仪器：Waters SQD；仪器HPLC：Waters UPLC；色谱柱：Zorbax SB-Aq(Agilent)，50mm×2.1mm，1.8μm；流动相A：水+0.025％甲酸，流动相B：乙腈(ULC)+0.025％甲酸；梯度：0.0min 98％A-0.9min 25％A-1.0min 5％A-1.4min 5％A-1.41min 98％A-1.5min98％A；柱温箱：40℃；流速：0.600ml/min；UV检测：DAD；210nm。
方法11(HPLC)：
仪器：HP1100系列
色谱柱：Merck Chromolith SpeedROD RP-18e，50-4.6mm，Cat.No.1.51450.0001，预柱Chromolith Guard Cartridge Kit，RP-18e，5-4.6mm，Cat.No.1.51470.0001
梯度：流速5ml/min
进样量：5μl
溶剂A：HClO4(70％浓度)于水中(4ml/l)
溶剂B：乙腈
开始20％B
0.50min 20％B
3.00min 90％B
3.50min 90％B
3.51min 20％B
4.00min 20％B
柱温：40℃
波长：210nm
方法12(LC-MS)：
MS仪器类型：Thermo Scientific FT-MS；UHPLC+仪器类型：Thermo ScientificUltiMate 3000；色谱柱：Waters，HSST3，2.1×75mm，C18 1.8μm；流动相A：1升水+0.01％甲酸；流动相B：1升乙腈+0.01％甲酸；梯度：0.0min 10％B→2.5min 95％B→3.5min 95％B；柱温箱：50℃；流速：0.90ml/min；UV检测：210nm/最佳整体路径210-300nm。
方法13：(LC-MS)：
MS仪器：Waters(Micromass)Quattro Micro；仪器Waters UPLC Acquity；色谱柱：Waters BEH C18 1.7μ50×2.1mm；流动相A：1升水+0.01mol甲酸铵，流动相B：1升乙腈；梯度：0.0min 95％A→0.1min 95％A→2.0min 15％A→2.5min 15％A→2.51min 10％A→3.0min 10％A；柱温箱：40℃；流速：0.5ml/min；UV检测：210nm。
方法14：(LC-MS)：
MS仪器类型：Thermo Fisher Scientific LTQ-Orbitrap-XL；HPLC仪器类型：Agilent 1200SL；色谱柱：Agilent，POROSHELL 120，3×150mm，SB-C18 2.7μm；流动相A：1升水+0.1％三氟乙酸；流动相B：1升乙腈+0.1％三氟乙酸；梯度：0.0min 2％B→0.3min 2％B→5.0min 95％B→10.0min 95％B；柱温箱：40℃；流速：0.75ml/min；UV检测：210nm。
所有其制备未在下文中明确描述的反应物或试剂皆为商购自通常可获取的来源。对于所有其制备同样未在下文中描述且商业上不可获得或从非通常获取的来源获得的其他反应物或试剂，参考了其中描述了它们的制备方法的公开文献。
原料和中间体：
中间体C2
(2S)-4-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2，2-二甲基丙基}氨基)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]丁酸叔丁酯
将4.22g(14.5mmol)N-(叔丁氧基羰基)-L-高丝氨酸叔丁酯溶于180ml二氯甲烷，然后加入3.5ml吡啶和9.2g(21.7mmol)1，1，1-三乙酰氧基-1λ5，2-苯碘酰-3(1H)-酮。将混合物在RT下搅拌1小时，然后用500ml二氯甲烷稀释并用10％浓度的硫代硫酸钠溶液萃取两次，然后连续地用5％浓度的柠檬酸萃取两次并用10％浓度的碳酸氢钠溶液萃取两次。将有机相分离出、经硫酸镁干燥然后在减压下浓缩。将残余物溶解于DCM中并加入二乙醚和正戊烷的混合物。滤出沉淀物，然后将滤液浓缩并从乙腈/水中冻干。这得到3.7g(93％)(2S)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-4-氧代丁酸叔丁酯，其不经进一步纯化即用于下一步骤(Rf值：0.5(DCM/甲醇95/5))。
将3.5g(9.85mmol)中间体C1溶于160ml DCM中，并加入3.13g(14.77mmol)三乙酰氧基硼氢化钠和0.7ml乙酸。在RT下搅拌5分钟后，加入3.23g(11.85mmol)(2S)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-4-氧代丁酸叔丁酯并将混合物在RT下再搅拌30分钟。然后将溶剂在减压下蒸发并将残余物溶解于乙腈/水中。滤出沉淀出的固体并干燥，得到5.46g(84％)标题化合物。
HPLC(方法11)：Rt＝2.5min；
LC-MS(方法1)：Rt＝1.13min；MS(ESIpos)：m/z＝613(M+H)+。
中间体C11
R/S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}-2，2-二甲基-6，12-二氧代-5-氧杂-7，11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-高半胱氨酸/三氟乙酸盐(1∶1)
首先将990.0mg(2.79mmol)(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙烷-1-胺加入15.0ml二氯甲烷中，并加入828.8mg(3.91mmol)三乙酰氧基硼氢化钠和129.9mg(3.21mmol)乙酸，然后在RT下将混合物搅拌5分钟。加入溶于15.0ml的二氯甲烷的698.1mg(3.21mmol)(3-氧代丙基)氨基甲酸2-(三甲基硅烷基)乙酯(中间体L58)，并将反应混合物在RT下搅拌过夜。将反应混合物用乙酸乙酯稀释，并将有机相在每种情况下都用饱和碳酸钠溶液和饱和NaCl溶液洗涤两次。将有机相经硫酸镁干燥并将溶剂在减压下蒸发。将残余物在硅胶上纯化(流动相：二氯甲烷/甲醇＝100∶2)。将溶剂在减压下蒸发并将残余物在真空下干燥。这得到1.25g(理论值的73％)化合物[3-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}氨基)丙基]氨基甲酸2-(三甲基硅烷基)乙酯。
LC-MS(方法1)：Rt＝1.09min；MS(ESIpos)：m/z＝556(M+H)+。
将151.4mg(1.5mmol)三乙胺和161.6mg(1.43mmol)氯乙酰氯添加至400.0mg(0.65mmol)[3-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}氨基)丙基]氨基甲酸2-(三甲基硅烷基)乙酯。将反应混合物在RT下搅拌过夜。将乙酸乙酯添加至反应混合物，然后将有机相用水洗涤三次并用饱和NaCl溶液洗涤一次。将有机相经硫酸镁干燥并将溶剂在减压下蒸发。将残余物通过硅胶层析法(流动相：环己烷/乙酸乙酯＝3∶1)纯化。将溶剂在减压下蒸发并将残余物在真空下干燥。这得到254.4mg(理论值的57％)化合物{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}(氯乙酰基)氨基]丙基}氨基甲酸2-(三甲基硅烷基)乙酯。
LC-MS(方法1)：Rt＝1.49min；MS(ESIneg)：m/z＝676(M+HCOO-)-。
将117.4mg(0.19mmol){3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}(氯乙酰基)氨基]丙基}氨基甲酸2-(三甲基硅烷基)乙酯溶于10.0ml异丙醇中，并加入928.4μl 1M NaOH和50.2mg(0.37mmol)DL-高半胱氨酸。将反应混合物在50℃下搅拌4.5个小时。将乙酸乙酯加入反应混合物中并将有机相用饱和碳酸氢钠溶液和饱和NaCl溶液洗涤。将有机相经硫酸镁干燥并将溶剂在减压下蒸发。将残余物通过制备型RP-HPLC(色谱柱：Reprosil 250×40；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)纯化。将溶剂在减压下蒸发并将残余物在真空下干燥。这得到75.3mg(理论值的48％)标题化合物。
LC-MS(方法1)：Rt＝1.24min；MS(ESIpos)：m/z＝731(M+H)+。
1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ[ppm]＝0.03(s，9H)，0.40(m，1H)，0.75-0.91(m，11H)，1.30(m，1H)，1.99-2.23(m，2H)，2.63-2.88(m，4H)，3.18-3.61(m，5H)，3.79-4.10(m，3H)，4.89(d，1H)，4.89(d，1H)，5.16(d，1H)，5.56(s，1H)，6.82(m，1H)，6.91(s，1H)，6.97(m，1H)，7.13-7.38(m，6H)，7.49(s，1H)，7.63(m，1H)，8.26(s，3H)。
中间体C12
R/S-[(8S)-11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}-8-羧基-2，2-二甲基-6，12-二氧代-5-氧杂-7，11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基]高半胱氨酸
该合成类似于中间体C11的合成，使用(2S)-4-氧代-2-({[2-(三甲基硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)丁酸甲酯(中间体L57)和中间体C52作为原料进行。
LC-MS(方法1)：Rt＝1.18min；MS(ESIpos)：m/z＝775(M+H)+。
中间体C52
(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙-1-胺
首先将10.00g(49.01mmol)4-溴-1H-吡咯-2-甲酸甲酯加入100.0ml DMF中，并加入20.76g(63.72mmol)碳酸铯和9.22g(53.91mmol)苄基溴。将反应混合物在RT下搅拌过夜。将反应混合物在水和乙酸乙酯之间分配，并将水相用乙酸乙酯萃取。将合并的有机相经硫酸镁干燥并将溶剂在减压下蒸发。使用90.0g 4-溴-1H-吡咯-2-甲酸甲酯重复所述反应。
将两种合并的反应物通过制备型RP-HPLC纯化(色谱柱：Daiso 300×100；10μ，流速：250ml/min，MeCN/水)。将溶剂在减压下蒸发并将残余物在真空下干燥。这得到125.15g(理论值的87％)化合物1-苄基-4-溴-1H-吡咯-2-甲酸甲酯。
LC-MS(方法1)：Rt＝1.18min；MS(ESIpos)：m/z＝295[M+H]+。
在氩气下，首先将4.80g(16.32mmol)1-苄基-4-溴-1H-吡咯-2-甲酸甲酯加入DMF中，并加入3.61g(22.85mmol)(2，5-二氟苯基)硼酸、19.20ml饱和碳酸钠溶液和1.33g(1.63mmol)[1，1′-双(二苯基膦基)二茂铁]-二氯钯(II)：二氯甲烷。将反应混合物在85℃下搅拌过夜。将反应混合物通过硅藻土(Celite)过滤并用乙酸乙酯洗涤滤饼。将有机相用水萃取，然后用饱和NaCl溶液洗涤。将有机相经硫酸镁干燥并将溶剂在减压下蒸发。将残余物通过硅胶层析法(流动相∶环己烷/乙酸乙酯100∶3)纯化。将溶剂在减压下蒸发并将残余物在真空下干燥。这得到3.60g(理论值的67％)化合物1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-甲酸甲酯。
LC-MS(方法7)：Rt＝1.59min；MS(ESIpos)：m/z＝328[M+H]+。
首先将3.60g(11.00mmol)1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-甲酸甲酯加入90.0ml THF中，然后在0℃下加入1.04g(27.50mmol)氢化铝锂(2.4M于THF中)。将反应混合物在0℃下搅拌30分钟。在0℃下，向反应混合物中加入饱和酒石酸钾钠溶液，然后加入乙酸乙酯。将有机相用饱和酒石酸钾钠溶液萃取三次。将有机相用饱和NaCl溶液洗涤一次并经硫酸镁干燥。将溶剂在减压下蒸发然后将残余物溶于30.0ml二氯甲烷中。加入3.38g(32.99mmol)氧化锰(IV)，并将混合物在RT下搅拌48小时。另外加入2.20g(21.47mmol)氧化锰(IV)，并将混合物在RT下搅拌过夜。将反应混合物通过硅藻土过滤，并用二氯甲烷洗涤滤饼。将溶剂在减压下蒸发并将残余物2.80g(1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-甲醛)，其不经进一步纯化即用于下一合成步骤。
LC-MS(方法7)：Rt＝1.48min；MS(ESIpos)：m/z＝298[M+H]+。
首先将28.21g(94.88mmol)1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-甲醛与23.00g(189.77mmol)(R)-2-甲基丙烷-2-亚磺酰胺一起加入403.0ml无水THF中，并加入67.42g(237.21mmol)钛酸四异丙酯并将混合物在RT下搅拌过夜。加入500.0ml饱和NaCl溶液和1000.0ml乙酸乙酯，然后将混合物在RT下搅拌1h。将混合物通过硅藻土(kieselguhr)过滤，并将滤液用饱和NaCl溶液洗涤两次。将有机相经硫酸镁干燥，将溶剂在减压下蒸发并将残余物使用Biotage Isolera(硅胶，色谱柱1500+340g SNAP，流速200ml/min，乙酸乙酯/环己烷1∶10)进行纯化。
LC-MS(方法7)：Rt＝1.63min；MS(ESIpos)：m/z＝401[M+H]+。
首先在氩气下将25.00g(62.42mmol)(R)-N-{(E/Z)-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]亚甲基}-2-甲基丙烷-2-亚磺酰胺加入无水THF中并冷却至-78℃。然后在-78℃下加入12.00g(187.27mmol)叔丁基锂(于戊烷中的1.7M溶液)，并将混合物在此温度下搅拌3小时。然后在-78℃下接连加入71.4ml甲醇和214.3ml饱和氯化铵溶液，并使反应混合物升温至RT，然后在RT下搅拌1小时。将混合物用乙酸乙酯稀释并用水洗涤。将有机相经硫酸镁干燥并将溶剂在减压下蒸发。残余物(R)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}-2-甲基丙烷-2-亚磺酰胺不经进一步纯化即用于下一合成步骤。
LC-MS(方法6)：Rt＝2.97min；MS(ESIpos)：m/z＝459[M+H]+。
首先将28.00g(61.05mmol)(R)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}-2-甲基丙烷-2-亚磺酰胺加入186.7ml 1，4-二噁烷中，并加入45.8ml HCl于1，4-二噁烷中的溶液(4.0M)。将反应混合物在RT下搅拌2小时并将溶剂在减压下蒸发。将残余物通过制备型RP-HPLC(色谱柱：Kinetix 100x30；流速：60ml/min，MeCN/水)进行纯化。将乙腈在减压下蒸发并将二氯甲烷加入至水性残余物中。将有机相用碳酸氢钠溶液洗涤并经硫酸镁干燥。将溶剂在减压下蒸发并将残余物在真空下干燥。这得到16.2g(理论值的75％)标题化合物。
LC-MS(方法6)：Rt＝2.10min；MS(ESIpos)：m/z＝338[M-NH2]+，709[2M+H]+。
1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ[ppm]＝0.87(s，9H)，1.53(s，2H)，3.59(s，1H)，5.24(d，2H)，6.56(s，1H)，6.94(m，1H)，7.10(d，2H)，7.20(m，1H)，7.26(m，2H)，7.34(m，2H)，7.46(m，1H)。
中间体C53
(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-2-{[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基}丁酸
首先，类似于中间体C58，使用(2S)-2-{[(苄氧基)羰基]氨基}-4-氧代丁酸苄酯对中间体C52进行还原烷基化。然后将仲氨基基团用乙酸2-氯-2-氧代乙基酯酰化，如中间体C58中所述，然后在甲醇中将两个酯基团用2M氢氧化锂水解。将以此方式获得的中间体溶于乙醇中，加入钯活性炭(10％)并将混合物在RT下在标准压力下用氢氢化1小时。将脱保护的产物溶于二噁烷/水2∶1中并在最后的步骤中在N，N-二异丙基乙胺的存在下使用9H-芴-9-基甲基氯碳酸酯引入Fmoc保护基。
LC-MS(方法1)：Rt＝1.37min；MS(ESIpos)：m/z＝734(M-H)-。
中间体C54
N-[(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-2-{[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基}丁酰基]-β-丙氨酸
首先，类似于中间体C2，使用N-[(2S)-2-{[(苄氧基)羰基]氨基}-4-氧代丁酰基]-β-丙氨酸苄酯对中间体C52进行还原烷基化。然后将仲氨基基团用乙酸2-氯-2-氧代乙基酯酰化，如中间体C58中所述。将以此方式获得的中间体溶于甲醇，加入钯活性炭(10％)并将混合物在RT下在标准压力下用氢氢化1小时。然后在甲醇中用2M氢氧化锂溶液将酯基团水解。将脱保护的化合物用二噁烷/水2∶1吸收并在最后步骤中在N，N-二异丙基乙胺的存在下使用9H-芴-9-基甲基氯碳酸酯引入Fmoc保护基。获得48mg标题化合物。
LC-MS(方法1)：Rt＝1.38min；MS(ESIpos)：m/z＝807(M+H)+。
中间体C58
(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-2-({[2-(三甲基硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)丁酸
首先，类似于中间体C2，使用(2S)-2-{[(苄氧基)羰基]氨基}-4-氧代丁酸苄酯对中间体C52进行还原烷基化。然后将仲氨基基团用乙酸2-氯-2-氧代乙基酯酰化，如中间体C27中所述，然后在甲醇中将两个酯基团用2M氢氧化锂溶液水解。将以此方式获得的中间体溶于乙醇，加入钯活性炭(10％)并将混合物在RT下在标准压力下用氢氢化1小时。
将500mg(0.886mmol)该完全脱保护的中间体溶解于60ml二噁烷中，并加入253mg(0.975mmol)1-({[2-(三甲基硅烷基)乙氧基]羰基}氧基)吡咯烷-2，5-二酮和198μl三乙胺。在RT下搅拌24小时后，将反应物浓缩并将残余物通过制备型HPLC纯化。将适当流份合并、在减压下浓缩并在高真空下干燥得到312mg(理论值的50％)标题化合物。
LC-MS(方法5)：Rt＝4.61min；MS(ESIpos)：m/z＝658(M+H)+。
或者，中间体C58通过以下路线制备：
将4.3g(12.2mmol)中间体C52溶于525ml DCM，并加入3.63g(17.12mmol)三乙酰氧基硼氢化钠和8.4ml乙酸。在RT下搅拌5分钟后，加入溶于175ml DCM中的8.99g(24.5mmol)中间体L57并将反应物在RT下进一步搅拌45分钟。然后将反应物用300ml DCM稀释并用100ml碳酸氢钠溶液洗涤两次和用饱和NaCl溶液洗涤一次。将有机相经硫酸镁干燥，将溶剂在减压下蒸发并将残余物在真空下干燥。然后将残余物通过制备型RP-HPLC(色谱柱：Chromatorex C18)纯化。在将适当流份合并之后，将溶剂在减压下蒸发并将残余物在真空下干燥。这得到4.6g(理论值的61％)(2S)-4-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}氨基)-2-({[2-(三甲基硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)丁酸甲酯。
LC-MS(方法12)：Rt＝1.97min；MS(ESIpos)：m/z＝614(M+H)+。
将2.06g(3.36mmol)该中间体加入76ml DCM中并在2.1ml三乙胺的存在下用0.81ml(7.17mmol)乙酸2-氯-2-氧代乙基酯酰化。在RT下搅拌20小时后，加入0.36ml乙酸2-氯-2-氧代乙基酯和0.94ml三乙胺并将反应物在RT下进一步搅拌15分钟。然后将混合物用500ml乙酸乙酯稀释并连续地用300ml 5％浓度的柠檬酸萃取两次，用300ml饱和碳酸氢钠溶液萃取两次并用100ml饱和氯化钠溶液萃取一次，然后经硫酸镁干燥并浓缩。在高真空下干燥得到2.17g(理论值的79％)被保护的中间体。
LC-MS(方法1)：Rt＝1.48min；MS(ESIpos)：m/z＝714(M+H)+。
将2.17mg(2.64mmol)该中间体溶于54ml THF和27ml水中，并加入26ml 2-摩尔的氢氧化锂溶液。将混合物在RT下搅拌30分钟然后使用1.4ml TFA将pH调节至3和4之间。将混合物在减压下浓缩。一旦大多数THF已经蒸出，就用DCM将水溶液萃取两次，然后在减压下浓缩至干。将残余物通过制备型HPLC纯化(色谱柱：Chromatorex C18)。将适当流份合并后，将溶剂在减压下蒸发并将残余物从乙腈/水中冻干。这得到1.1g(理论值的63％)标题化合物。
LC-MS(方法1)：Rt＝1.34min；MS(ESIpos)：m/z＝656(M-H)-。
1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ[ppm]＝0.03(s，9H)，0.58(m，1H)，0.74-0.92(m，11H)，1.40(m，1H)，3.3(m，2H)，3.7(m，1H)，3.8-4.0(m，2H)，4.15(q，2H)，4.9和5.2(2d，2H)，5.61(s，1H)，6.94(m，2H)，7.13-7.38(m，7H)，7.48(s，1H)，7.60(m，1H)，12.35(s，1H)。
中间体C59
(2S)-4-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}[(2S)-2-甲氧基丙酰基]氨基)-2-{[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基}丁酸
首先，在三乙胺的存在下将(2S)-4-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}氨基)-2-{[(苄氧基)羰基]氨基}丁酸苄酯的仲氨基用(2S)-2-甲氧基丙酰氯(中间体C53的中间体)酰化，如中间体C53中所述。将获得的中间体溶于乙醇中，加入钯活性炭(10％)并将混合物在RT下在标准压力下用氢氢化1小时。将脱保护的化合物用二噁烷/水2∶1吸收并在最后步骤中在N，N-二异丙基乙胺的存在下使用9H-芴-9-基甲基氯碳酸酯引入Fmoc保护基。
LC-MS(方法1)：Rt＝1.39min；MS(ESIpos)：m/z＝764(M-H)-。
中间体C60
(2S)-4-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}[(2S)-2-甲氧基丙酰基]氨基)-2-{[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基}丁酸
该合成以类似于中间体C53的方式进行。
LC-MS(方法1)：Rt＝1.41min；MS(ESIpos)：m/z＝750(M+H)+。
中间体C61
N-[(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-2-({[2-(三甲基硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)丁酰基]-β-丙氨酸
通过将60mg(0.091mmol)中间体C58与β-氨基丙酸甲酯偶合随后使用2M氢氧化锂溶液酯解而制备标题化合物。这样经2个步骤得到67mg(理论值的61％)标题化合物。
LC-MS(方法1)：Rt＝1.29min；MS(ESIpos)：m/z＝729(M+H)+。
中间体C62
N-[(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-2-({[2-(三甲基硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)丁酰基]-D-丙氨酸
类似于中间体C61，由中间体C58和D-氨基丙酸甲酯制备标题化合物。
LC-MS(方法1)：Rt＝1.32min；MS(ESIpos)：m/z＝729(M+H)+。
中间体C64
三氟乙酸/{(2S)-1-[(2-氨基乙基)氨基]-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-1-氧代丁-2-基}氨基甲酸2-(三甲基硅烷基)乙酯(1∶1)
类似于中间体C63，由中间体C58制备标题化合物。
HPLC(方法11)：Rt＝2.4min；
LC-MS(方法1)：Rt＝1.01min；MS(ESIpos)：m/z＝700(M+H)+。
中间体C65
(8S)-8-{2-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}-(乙醇酰基)氨基]乙基}-2，2-二甲基-6，11-二氧代-5-氧杂-7，10-二氮杂-2-硅杂十四烷-14-酸
首先将215mg(0.59mmol)中间体L66加入25ml二氯甲烷中，并加入377mg(0.89mmol)戴斯-马丁过碘烷(Dess-Martin periodinane)和144μl(1.78mmol)吡啶。将混合物在RT下搅拌30分钟。然后将反应物用300ml二氯甲烷稀释并将有机相在每种情况下都用10％浓度的Na2S2O3溶液、10％浓度的柠檬酸溶液和饱和碳酸氢钠溶液洗涤两次。将有机相经硫酸镁干燥并将溶剂在减压下蒸发。这得到305mg醛，其不经进一步纯化即进行反应。
将175mg(0.49mmol)中间体C52溶于50ml二氯甲烷中，并加入147mg(0.69mmol)三乙酰氧基硼氢化钠和32.5μl乙酸。在RT下搅拌5分钟之后，加入214mg(0.593mmol)上述醛，然后将反应物在RT下搅拌过夜。此处，除了预期产物外，形成[(2S)-4-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}氨基)-1-(2，5-二氧代吡咯烷-1-基)丁-2-基]氨基甲酸2-(三甲基硅烷基)乙酯。由于该酰亚胺还可被转化为标题化合物，因此将反应物浓缩并将残余物通过制备型HPLC纯化。在将适当的含酰亚胺的流份合并后，将溶剂在减压下蒸发并将残余物在真空下干燥。这得到195mg(58％)如上命名的酰亚胺。
LC-MS(方法5)：Rt＝3.32min；MS(ESIpos)：m/z＝667(M+H)+。
将65mg(97.5μmol)该酰亚胺用15ml二氯甲烷吸收，并加入367μl(3.4mmol)乙酰氧基乙酰氯和595μl N，N-二异丙基乙胺。在RT下搅拌30分钟后，将反应物在不进行加热的情况下在减压下浓缩并将残余物通过制备型HPLC纯化。将适当的流份合，将溶剂蒸发并在高真空下干燥后得到28mg(理论值的37％)乙酸(8S)-11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}-8-[(2，5-二氧代吡咯烷-1-基)甲基]-2，2-二甲基-6，12-二氧代-5-氧杂-7，11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基酯。
LC-MS(方法1)：Rt＝1.44min；MS(ESIpos)：m/z＝767(M+H)+。
将28mg(37μmol)该中间体溶于3ml甲醇中，并加入548μl 2M氢氧化锂溶液。在RT下搅拌10分钟后，用三氟乙酸将反应物的pH调节至4，然后浓缩。将残余物通过制备型HPLC纯化。将适当流份合并，将溶剂蒸发并将残余物在真空下干燥，得到26mg(理论值的96％)标题化合物，其为白色固体。
LC-MS(方法1)：Rt＝1.33min；MS(ESIpos)：m/z＝743(M+H)+。
中间体C66
[(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-1-{[2-(甘氨酰基氨基)乙基]氨基}-1-氧代丁-2-基]氨基甲酸2-(三甲基硅烷基)乙酯
首先，根据肽化学的经典方法(HATU偶联和Boc去除)由N-[(苄氧基)羰基]甘氨酸和(2-氨基乙基)氨基甲酸叔丁酯制备三氟乙酸/{2-[(2-氨基乙基)氨基]-2-氧代乙基}氨基甲酸苄酯(1∶1)。
将13mg(0.036mmol)该中间体和25mg(0.033mmol)中间体C58用3ml DMF吸收，并加入19mg(0.05mmol)HATU和17μl N，N-二异丙基乙胺。在RT下搅拌10分钟后，将混合物浓缩并将残余物通过制备型HPLC纯化。这得到17.8mg(理论值的60％)中间体。
LC-MS(方法1)：Rt＝1.36min；MS(ESIpos)：m/z＝891(M+H)+。
将17mg(0.019mmol)该中间体溶于10ml乙醇中，加入钯活性炭(10％)并将混合物在RT下在标准压力下用氢氢化2小时。滤出催化剂，将溶剂在减压下蒸发并将残余物在真空下干燥。这得到9mg(理论值的62％)标题化合物。
LC-MS(方法1)：Rt＝1.03min；MS(ESIpos)：m/z＝757(M+H)+。
中间体C67
[3-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}氨基)丙基]氨基甲酸9H-芴-9-基甲基酯
首先将605.3mg(1.71mmol)(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙-1-胺(中间体C52)加入10.0ml二氯甲烷中，并加入506.7mg(2.39mmol)三乙酰氧基硼氢化钠和117.9mg(1.96mmol)乙酸并将混合物在RT下搅拌5分钟。加入溶于10.0ml二氯甲烷中的580.0mg(1.96mmol)(3-氧代丙基)氨基甲酸9H-芴-9-基甲酯(中间体L70)并将反应混合物在RT下搅拌过夜。将反应混合物用乙酸乙酯稀释并将有机相洗涤在每种情况下用饱和碳酸钠溶液和饱和NaCl溶液洗涤两次。将有机相经硫酸镁干燥并将溶剂在减压下蒸发。将残余物通过硅胶色谱法(流动相∶环己烷/乙酸乙酯3∶1)纯化。将溶剂在减压下蒸发并将残余物在真空下干燥。这得到514.7mg(理论值的46％)标题化合物。
LC-MS(方法1)：Rt＝1.10min；MS(ESIpos)：m/z＝634(M+H)+。
中间体C69
11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}-2，2-二甲基-6，12-二氧代-5-氧杂-14-硫代-7，11-二氮杂-2-硅杂十七烷-17-酸
首先将117.0mg(0.19mmol){3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}(氯乙酰基)氨基]丙基}氨基甲酸(2-(三甲基硅烷基)乙酯(中间体C70)和21.6mg(0.20mmol)3-巯基丙酸加入3.0ml甲醇中，加入89.5mg(0.65mmol)碳酸钾并将混合物在50℃下搅拌4小时。将反应混合物用乙酸乙酯稀释并将有机相用水和饱和NaCl溶液洗涤。将有机相经硫酸镁干燥，将溶剂在减压下蒸发并将残余物在真空下干燥。残余物不经进一步纯化即用于下一合成步骤。这得到106.1mg(理论值的73％)标题化合物。
LC-MS(方法1)：Rt＝1.42min；MS(ESIneg)：m/z＝700(M-H)-。
中间体C70
{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}(氯乙酰基)氨基]丙基}氨基甲酸2-(三甲基硅烷基)乙酯
首先将908.1mg(1.63mmol)[3-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}氨基)丙基]氨基甲酸2-(三甲基硅烷基)乙酯(参见中间体C11的合成)和545.6mg(5.39mmol)三乙胺加入10.0ml二氯甲烷中，然后将混合物冷却至0℃。在此温度下，加入590.5mg(5.23mmol)氯乙酰氯并将混合物在RT下搅拌过夜。将反应混合物用乙酸乙酯稀释并将有机相在每种情况下都用饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化铵溶液洗涤三次。将有机相用饱和NaCl溶液洗涤并经硫酸镁干燥。将残余物通过制备型RP-HPLC纯化(色谱柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)。将溶剂在减压下蒸发并将残余物在真空下干燥。这得到673.8mg(理论值的65％)标题化合物。
LC-MS(方法1)：Rt＝1.53min；MS(ESIneg)：m/z＝676(M+HCOO-)-。
中间体C71
S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}-2，2-二甲基-6，12-二氧代-5-氧杂-7，11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1∶1)
将536.6mg(4.43mmol)L-半胱氨酸与531.5mg(6.33mmol)碳酸氢钠一起悬浮于2.5ml水中。加入400.0mg(0.63mmol)于25.0ml异丙醇中的{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}(氯乙酰基)氨基]丙基}氨基甲酸2-(三甲基硅烷基)乙酯(中间体C70)以及1.16g(7.59mmol)1，8-二氮杂二环[5.4.0]十一碳-7-烯。将反应混合物在50℃下搅拌1.5小时。将乙酸乙酯加入反应混合物中并将有机相用饱和碳酸氢钠溶液反复洗涤并用饱和NaCl溶液洗涤一次。将有机相经硫酸镁干燥，将溶剂在减压下蒸发并将残余物在真空下干燥。将残余物通过制备型RP-HPLC纯化(色谱柱：Reprosil250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)。将溶剂在减压下蒸发并将残余物在真空下干燥。这得到449.5mg(理论值的86％)标题化合物。
LC-MS(方法1)：Rt＝1.20min；MS(ESIpos)：m/z＝717(M+H)+。
中间体C72
(9S)-9-{[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]甲基}-2，2-二甲基-6，11-二氧代-5-氧杂-7，10-二氮杂-2-硅杂十四烷-14-酸
首先将90mg(0.212mmol)中间体L72加入6ml二氯甲烷中，并加入86μl(1.06mmol)吡啶和135mg(0.318mmol)戴斯-马丁过碘烷。将混合物在RT下搅拌30分钟。然后将反应物用30ml二氯甲烷稀释并将有机相用10％浓度的Na2S2O3溶液洗涤两次并用5％浓度的柠檬酸溶液洗涤一次。将有机相经硫酸镁干燥并将溶剂在减压下蒸发。以此方式获得的醛不经进一步纯化即进行反应。
将63mg(0.177mmol)中间体C52溶于15ml二氯甲烷中，并加入52.4mg(0.247mmol)三乙酰氧基硼氢化钠和20.2μl乙酸。在RT下搅拌5分钟后，加入89.6mg(0.212mmol)上述醛，并将反应物在RT下搅拌20分钟。将反应物在减压下浓缩并将残余物通过制备型HPLC纯化。将适当流份合并后，将溶剂在减压下蒸发并将残余物从乙腈/水中冻干。这得到71mg(理论值的53％，经2个步骤)(9R)-9-[({(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}氨基)甲基]-2，2-二甲基-6，11-二氧代-5-氧杂-7，10-二氮杂-2-硅杂十四烷-14-酸苄酯。
LC-MS(方法1)：Rt＝1.21min；MS(ESIpos)：m/z＝761(M+H)+。
将70mg(92μmol)该中间体用15ml二氯甲烷中吸收，将混合物冷却至10℃并加入54μl三乙胺和25.5μl(0.23mmol)乙酰氧基乙酰氯。在RT下搅拌1小时后，加入同样量的酰基氯和三乙胺，再一次在RT下再搅拌一个小时。然后将反应物在RT下再搅拌30分钟，然后在减压下浓缩，并将残余物通过制备型HPLC纯化。将适当的流份合，在将溶剂蒸发并将残余物从乙腈/水中冻干后得到46.5mg(理论值的59％)酰化的中间体。
LC-MS(方法1)：Rt＝1.53min；MS(ESIpos)：m/z＝861(M+H)+。
将46mg(53μmol)该中间体溶于5ml甲醇中，并加入2.7ml 2M的氢氧化锂溶液。在RT下搅拌10分钟后，将反应物用乙酸调节至pH 3-4然后用15ml水稀释。将水相用乙酸乙酯萃取并将有机相经硫酸镁干燥并浓缩。将残余物从乙腈/水中冻干，在将残余物在高真空下干燥后得到37mg(理论值的90％)标题化合物，其为白色固体。
LC-MS(方法1)：Rt＝1.32min；MS(ESIpos)：m/z＝729(M+H)+。
中间体C73
S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}-2，2-二甲基-6，12-二氧代-5-氧杂-7，11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-N-[3-(三甲基硅烷基)丙酰基]-L-半胱氨酸
首先将619mg(0.86mmol)S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}-2，2-二甲基-6，12-二氧代-5-氧杂-7，11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1∶1)(中间体C71)加入8.8ml二氯甲烷中，并加入87mg(0.86mmol)三乙胺和224mg(0.86mmol)N-[2-(三甲基硅烷基)乙氧基羰基氧基]吡咯烷-2，5-二酮。1小时后，加入45mg(0.17mmol)N-[2-(三甲基硅烷基)乙氧基羰基氧基]吡咯烷-2，5-二酮。将反应混合物在RT下搅拌1小时。将混合物在减压下浓缩，将残余物溶于二氯甲烷中然后将有机相用水和饱和碳酸氢钠溶液洗涤两次。将有机相经硫酸镁干燥，在旋转蒸发仪上浓缩并在高真空下干燥。残余物不经进一步纯化即进一步使用。这得到602mg(71％，纯度87％)标题化合物。
LC-MS(方法1)：Rt＝1.58min；MS(ESIpos)：m/z＝861(M+H)+。
中间体C74
三氟乙酸3-氨基-N-[(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-2-({[2-(三甲基硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)丁酰基]-D-丙氨酸2-(三甲基硅烷基)乙酯(1∶1)
将75mg(0.114mmol)中间体C58用12.5ml DMF吸收并在65mg(0.11mmol)HATU和79μl N，N-二异丙基乙胺的存在下与78mg(0.171mmol)中间体L75偶联。通过制备型HPLC纯化后，将中间体溶于20ml乙醇并在RT下在10％钯活性炭上在氢标准压力下氢化1小时。然后滤掉催化剂，在减压下除去溶剂并通过制备型HPLC纯化产物。从乙腈/水1∶1中冻干得到63mg(理论值的64％，经2个步骤)标题化合物。
LC-MS(方法1)：Rt＝1.16min；MS(EIpos)：m/z＝844[M+H]+。
中间体C75
(2S)-4-[(乙酰氧基乙酰基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}氨基]-2-({[2-(三甲基硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)丁酸甲酯
将4.3g(12.2mmol)中间体C52溶于525ml DCM中，并加入3.63g(17.12mmol)三乙酰氧基硼氢化钠和8.4ml乙酸。在RT下搅拌5分钟后，加入溶于175ml DCM中的3.23g(11.85mmol)(2S)-4-氧代-2-({[2-(三甲基硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)丁酸甲酯(由(3S)-3-氨基-4-甲氧基-4-氧代丁酸通过经典方法制备)，并将混合物在RT下再搅拌45分钟。然后将混合物用DCM稀释并用100ml饱和碳酸氢钠溶液然后用饱和氯化钠溶液洗涤两次。将有机相经硫酸镁干燥、过滤并浓缩。将残余物通过制备型HPLC纯化。将适当流份合并、浓缩并将残余物在高真空下干燥得到4.6g(理论值的61％)中间体。
LC-MS(方法12)：Rt＝1.97min；MS(ESIpos)：m/z＝614.32(M+H)+。
将200mg(0.33mmol)该中间体溶于10ml DCM中，并加入105μl三乙胺和77μl(0.717mmol)乙酰氧基乙酰氯。将混合物在RT下搅拌过夜然后在减压下浓缩。将残余物溶解于乙酸乙酯中并用饱和碳酸氢钠溶液然后用饱和氯化钠溶液萃取两次。将有机相经硫酸镁干燥然后浓缩。这得到213mg(75％)标题化合物，其为米米色泡沫状物。
LC-MS(方法1)：Rt＝1.46min；MS(ESIpos)：m/z＝714(M+H)+。
中间体C76
N-[(苄氧基)羰基]-L-缬氨酰基-N-{(1S)-3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-1-羧基丙基}-L-丙氨酰胺
由中间体C75根据肽化学的经典方法(用氯化锌除去Teoc保护基，在HATU的存在下用N-[(苄氧基)羰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酸酰化并在THF/水中用氢氧化锂进行酯裂解)制备标题化合物。
LC-MS(方法1)：Rt＝1.23min；MS(ESIpos)：m/z＝818(M+H)+。
中间体C77
S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}-2，2-二甲基-6，12-二氧代-5-氧杂-7，11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-N-(4-叔丁氧基-4-氧代丁酰基)-L-半胱氨酸
首先将4-叔丁氧基-4-氧代丁酸(8.39mg，48.1μmol)加入1.0ml DMF中，加入7.37mg(48.1μmol)1-羟基-1H-苯并三唑水合物、15.5mg(48.1μmol)(苯并三唑-1-基氧基)双二甲基氨基甲基鎓氟硼酸盐和8.60μl(48.1μmol)N，N-二异丙基乙胺并将混合物在RT下搅拌10分钟。首先将40.0mg(0.048mmol)S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}-2，2-二甲基-6，12-二氧代-5-氧杂-7，11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-L-半胱氨酸三氟乙酸(1∶1)(中间体C71)加入1.0ml DMF中，加入25.4μl(141.9μmol)N，N-二异丙基乙胺，将混合物加入反应物中并将反应混合物在RT下搅拌4小时。将反应混合物通过制备型RP-HPLC(色谱柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)直接纯化。将溶剂在减压下蒸发并将残余物在真空下干燥。这得到35.0mg(理论值的83％)标题化合物。
LC-MS(方法12)：Rt＝2.76min；MS(ESIpos)：m/z＝873[M+H]+。
中间体C78
11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}-2，2-二甲基-6，12-二氧代-5-氧杂-7，11-二氮杂-2-硅杂十五烷-15-酸
首先将197mg(0.354mmol)[3-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}氨基)丙基]氨基甲酸2-(三甲基硅烷基)乙基酯(参见中间体C11的合成)加入5.0ml二氯甲烷中，然后将混合物加热至40℃。在此温度下，加入240μl(3.0mmo1)吡啶和220μl(1.8mmol)4-氯-4-氧代丁酸甲酯，并将混合物在RT下搅拌1小时。并加入240μl(3.0mmol)吡啶和220μl(1.8mmol)4-氯-4-氧代丁酸甲酯，并将混合物在RT下搅拌1小时。并加入240μl(3.0mmol)吡啶和220μl(1.8mmol)4-氯-4-氧代丁酸甲酯，并将混合物在RT下搅拌1小时。将反应混合物用乙酸乙酯稀释并将有机相在每种情况下都用5％浓度的KHSO4溶液萃取三次。将有机相用饱和NaCl溶液洗涤并经硫酸镁干燥。将溶剂在减压下蒸发。将残余物通过制备型RP-HPLC纯化(色谱柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)。将溶剂在减压下蒸发并将残余物在真空下干燥。这得到74.1mg(理论值的31％)11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}-2，2-二甲基-6，12-二氧代-5-氧杂-7，11-二氮杂-2-硅杂十五烷-15-酸甲酯。
LC-MS(方法1)：Rt＝1.49min；MS(ESIpos)：m/z＝670[M+H]+。
首先将78.3mg(117，μmol)11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}-2，2-二甲基-6，12-二氧代-5-氧杂-7，11-二氮杂-2-硅杂十五烷-15-酸甲酯加入4.0ml THF中，并加入800μl甲醇、160μl水和230μl(230，μmol)LiOH水溶液(1M)。将反应混合物在RT下搅拌3小时，用乙酸淬灭并通过制备型RP-HPLC(色谱柱：Reprosil 250x 30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)直接纯化。将溶剂在减压下蒸发并将残余物在真空下干燥。这得到64.8mg(理论值的85％)标题化合物。
LC-MS(方法12)：Rt＝2.61min；MS(ESIneg)：m/z＝654[M-H]-。
中间体C79
三氟乙酸3-氨基-N-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}-2，2-二甲基-6，12，17-三氧代-5-氧杂-14-硫代-7，11-二氮杂-2-硅杂十七烷-17-基)-D-丙氨酸2-(三甲基硅烷基)乙酯(1∶1)
首先将57.4mg(81.8μmol)11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}-2，2-二甲基-6，12-二氧代-5-氧杂-14-硫代-7，11-二氮杂-2-硅杂十七烷-17-酸(中间体C69)加入5.7ml DMF中，加入74.0mg(164μmol)3-{[(苄氧基)羰基]氨基}-D-丙氨酸三氟乙酸2-(三甲基硅烷基)乙酯(1∶1)(中间体L75)、43μl(250μmol)N，N-二异丙基乙胺和62.2mg(164μmol)HATU并将混合物在RT下搅拌1小时。将反应混合物在RT下搅拌1h，用乙酸淬灭并通过制备型RP-HPLC(色谱柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)直接纯化。将溶剂在减压下蒸发并将残余物在真空下干燥。这得到52.4mg(理论值的63％)化合物N-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}-2，2-二甲基-6，12，17-三氧代-5-氧杂-14-硫代-7，11-二氮杂-2-硅杂十七烷-17-基)-3-{[(苄氧基)羰基]氨基}-D-丙氨酸2-(三甲基硅烷基)乙酯。
LC-MS(方法1)：Rt＝1.64min；MS(ESIpos)：m/z＝1022[M]+。
在氩气下，首先将6.23mg(27.7μmol)乙酸钯(II)加入3.0ml二氯甲烷中，加入12μl(83μmol)三乙胺和89μl(550μmol)三乙基硅烷并将混合物搅拌5分钟。并加入于3.0ml二氯甲烷中的56.7mg(55.5μmol)N-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}-2，2-二甲基-6，12，17-三氧代-5-氧杂-14-硫代-7，11-二氮杂-2-硅杂十七烷-17-基)-3-{[(苄氧基)羰基]氨基}-D-丙氨酸2-(三甲基硅烷基)乙基酯，然后将混合物在RT下搅拌过夜。将混合物浓缩至近乎干燥，加入乙腈/水，将混合物过滤并通过制备型RP-HPLC纯化(色谱柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)。将溶剂在减压下蒸发将残余物在真空下干燥。这得到37.4mg(理论值的67％)标题化合物。
LC-MS(方法12)：Rt＝2.15min；MS(ESIpos)：m/z＝888[M+H]+。
中间体C80
S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}-2，2-二甲基-6，12-二氧代-5-氧杂-7，11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-N-[15-(甘氨酰基氨基)-4，7，10，13-四氧杂十五烷-1-酰基]-L-半胱氨酸三氟乙酸(1∶1)
在氩气下，首先将43.4mg(95.1μmol)1-({N-[(苄氧基)羰基]甘氨酰基}氨基)-3，6，9，12-四氧杂十五烷-15-酸(中间体L90)加入2.5ml DMF中，加入14.6mg(95.1μmol)1-羟基-1H-苯并三唑水合物、30.5mg(95.1μmol)(苯并三唑-1-基氧基)双二甲基氨基甲基鎓氟硼酸盐和16.5μl(95.1μmol)N，N-二异丙基乙胺并将混合物搅拌10分钟。将79.0mg(95.1μmol)S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}-2，2-二甲基-6，12-二氧代-5-氧杂-7，11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-L-半胱氨酸三氟乙酸(1∶1)(中间体C71)溶于2.5ml DMF中，加入49.5μl(285.3μmol)N，N-二异丙基乙胺并将混合物加入反应物中。将反应混合物在RT下搅拌2小时并通过制备型RP-HPLC(色谱柱：Reprosil125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)直接纯化。将溶剂在减压下蒸发并将残余物在真空下干燥。这得到44.2mg(理论值的40％)化合物S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}-2，2-二甲基-6，12-二氧代-5-氧杂-7，11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-N-[15-({N-[(苄氧基)羰基]甘氨酰基}氨基)-4，7，10，13-四氧杂十五烷-1-酰基]-L-半胱氨酸。
LC-MS(方法12)：Rt＝2.57min；MS(ESIpos)：m/z＝1156[M+H]+。
将60.2mg(52.1μmol)S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}-2，2-二甲基-6，12-二氧代-5-氧杂-7，11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-N-[15-({N-[(苄氧基)羰基]甘氨酰基}氨基)-4，7，10，13-四氧杂十五烷-1-酰基]-L-半胱氨酸悬浮于3.0ml乙醇中，加入6.0mg钯活性炭(10％)并将混合物在RT下和标准压力下用氢氢化1小时。两次，加入6.0mg钯活性炭(10％)并将混合物在RT下和标准压力用氢氢化1小时。将催化剂滤出并将反应混合物在减压下除去溶剂并在高真空下干燥。将残余物通过制备型RP-HPLC纯化(色谱柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)。将溶剂在减压下蒸发并将残余物在真空下干燥。这得到29.4mg(理论值的50％)标题化合物。
LC-MS(方法5)：Rt＝3.77min；MS(ESIpos)：m/z＝1021[M+H]+。
中间体C81
(R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-1-环己基甲胺
在氩气下及在-78℃下，将于二乙醚(2M)中的18.7ml(37.45mmol)环己基氯化镁加入3.12ml(6.24mmol)二甲基锌于甲苯(2.0M)中的溶液中，并将混合物在-78℃下搅拌30分钟。然后在-78℃下加入5.0g(12.48mmol)(R)-N-{(E/Z)-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]亚甲基}-2-甲基丙烷-2-亚磺酰胺于THF中的溶液，并将反应混合物在此温度下搅拌1小时然后在RT下搅拌4小时。随后在-78℃下加入饱和氯化铵溶液并使反应混合物升温至RT。将该混合物用乙酸乙酯稀释并用水洗涤。将有机相经硫酸镁干燥并将溶剂在减压下蒸发。将残余物使用Biotage Isolera(硅胶，乙酸乙酯/环己烷25∶75)纯化。这得到1.59g(理论值的26％)中间体。
LC-MS(方法12)：Rt＝2.76min；MS(ESIneg)：m/z＝483[M-H]-。
在氩气下，首先将264.0mg(0.54mmol)该中间体加入0.5ml 1，4-二噁烷中，然后加入1.36ml HCl于1，4-二噁烷中的溶液(4.0M)。将反应混合物在RT下搅拌1小时。加入二氯甲烷，并将反应混合物用1M氢氧化钠水溶液洗涤。将有机相用硫酸镁干燥并将溶剂在减压下蒸发。将残余物使用Biotage Isolera(硅胶，甲醇/二氯甲烷98∶2)纯化。将溶剂在减压下蒸发并将残余物溶于二氯甲烷，用碳酸氢钠溶液洗涤并经硫酸钠干燥。将溶剂在减压下蒸发并将残余物在真空下干燥。这得到148mg(理论值的72％)标题化合物。
LC-MS(方法13)：Rt＝2.07min；MS(ESIpos)：m/z＝364[M-NH2]+。
中间体C82
(3-{[(R)-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基](环己基)甲基]氨基}丙基)氨基甲酸2-(三甲基硅烷基)乙酯
在氩气下，将392.2mg(1.85mmol)三乙酰氧基硼氢化钠和91.29mg(1.52mmol)乙酸加入503.0mg(1.32mmol)1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-1-环己基甲胺(中间体C81)于1.4ml二氯甲烷中的溶液中，并将反应混合物在RT下搅拌10分钟。然后加入574.6(2.38mmol)(3-氧代丙基)氨基甲酸2-(三甲基硅烷基)乙酯于二氯甲烷中的溶液，并将该混合物在RT下搅拌过夜。在加入143mg(0.66mmol)(3-氧代丙基)氨基甲酸2-(三甲基硅烷基)乙酯后，将混合物再搅拌2小时。将反应混合物用二氯甲烷稀释并将有机相在每种情况下都用饱和碳酸钠溶液洗涤两次并用饱和NaCl溶液洗涤，经硫酸钠干燥并浓缩。将残余物通过制备型HPLC纯化。将溶剂在减压下蒸发并将残余物在真空下干燥。这得到488g(理论值的63％)标题化合物。
LC-MS(方法12)：Rt＝1.89min；MS(ESIpos)：m/z＝582(M+H)+。
中间体C83
(3-{[(R)-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基](环己基)甲基](氯乙酰基)氨基}丙基)氨基甲酸2-(三甲基硅烷基)乙酯
将280.0mg(2.77mmol)三乙胺和397.8mg(3.52mmol)氯乙酰氯加入487.9mg(0.84mmol)(3-{[(R)-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基](环己基)甲基]氨基}丙基)氨基甲酸2-(三甲基硅烷基)乙酯(中间体C82)于8.40ml含分子筛的二氯甲烷中的溶液中，并将该反应混合物在RT下搅拌6小时。将反应混合物用二氯甲烷稀释并将有机相用饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化铵溶液洗涤。将有机相经硫酸钠干燥并浓缩。残余物不经纯化即进一步使用。这得到470mg(理论值的85％)标题化合物。
LC-MS(方法12)：Rt＝2.88min；MS(ESIpos)：m/z＝680(M+Na)+。
中间体C84
S-{11-[(R)-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基](环己基)甲基]-2，2-二甲基-6，12-二氧代-5-氧杂-7，11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基}-L-半胱氨酸
将322.1mg(2.66mmol)L-半胱氨酸与319.0mg(3.80mmol)碳酸氢钠一起悬浮于0.19ml水中。加入溶于1.90ml异丙醇的250.0mg(0.38mmol)(3-{[(R)-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基](环己基)甲基](氯乙酰基)氨基}丙基)氨基甲酸2-(三甲基硅烷基)乙酯(中间体C83)和693.8g(4.56mmol)1，8-二氮杂二环[5.4.0]十一碳-7-烯。将反应混合物在50℃下搅拌3.5小时。将乙酸乙酯加入反应混合物中并将有机相用饱和碳酸氢钠溶液反复洗涤并用饱和NaCl溶液洗涤一次。将有机相经硫酸钠干燥并将溶剂在减压下蒸发。残余物不经进一步纯化即进一步使用。这得到276mg(理论值的97％)标题化合物。
LC-MS(方法12)：Rt＝2.34min；MS(ESIpos)：m/z＝744(M+H)+。
中间体C85
S-{11-[(R)-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基](环己基)甲基]-2，2-二甲基-6，12-二氧代-5-氧杂-7，11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基}-N-[6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-半胱氨酸
将34.8mg(0.27mmol)N，N-二异丙基乙胺加入100mg(0.13mmol)S-{11-[(R)-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基](环己基)甲基]-2，2-二甲基-6，12-二氧代-5-氧杂-7，11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基}-L-半胱氨酸(1∶1)(中间体C84)和41.5mg(0.13mmol)1-{6-[(2，5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-6-氧代己基}-1H-吡咯-2，5-二酮于4.0ml DMF中的混合物中，并将反应混合物在RT下搅拌3小时。不进行后处理，将混合物通过制备型HPLC纯化。这得到88mg(理论值的70％)标题化合物。
LC-MS(方法12)：Rt＝2.71min；MS(ESIpos)：m/z＝936(M+H)+。
中间体C86
11-[(R)-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基](环己基)甲基]-2，2-二甲基-6，12-二氧代-5-氧杂-14-硫代-7，11-二氮杂-2-硅杂十七烷-17-酸
将161.65mg(1.17mmol)碳酸钾加入220.0mg(0.33mmol)(3-{[(R)-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基](环己基)甲基](氯乙酰基)氨基}丙基)氨基甲酸2-(三甲基硅烷基)乙酯(中间体C83)和39.02mg(0.37mmol)3-巯基丙酸于7.45ml甲醇和几滴水中的混合物中。将反应混合物在50℃下搅拌4小时。将乙酸乙酯加入反应混合物中并将有机相用水和用饱和NaCl溶液反复洗涤。将有机相经硫酸钠干燥和将溶剂在减压下蒸发。残余物不经后处理即进一步使用。这得到201mg(理论值的83％)标题化合物。
LC-MS(方法12)：Rt＝2.72min；MS(ESIneg)：m/z＝726(M-H)-。
中间体C87
{13-[(R)-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基](环己基)甲基]-1-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-2，7，12-三氧代-10-硫代-3，6，13-三氮杂十六烷-16-基}氨基甲酸2-(三甲基硅烷基)乙酯
将54.18mg(0.28mmol)N-(2-氨基乙基)-2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰胺(中间体L1)、71.01mg(0.50mmol)N，N-二异丙基乙胺、104.46mg(0.27mmol)HATU和0.23ml于DMF中的0.5M(0.14mmol)1-羟基-7-氮杂苯并三唑加入100mg(0.14mmol)11-[(R)-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基](环己基)甲基]-2，2-二甲基-6，12-二氧代-5-氧杂-14-硫代-7，11-二氮杂-2-硅杂十七烷-17-酸(中间体C86)于1.37mlDMF中的溶液中。将反应混合物在RT下搅拌5小时。不进行进一步的后处理，将混合物通过制备型HPLC纯化。这得到41mg(理论值的33％)标题化合物。
LC-MS(方法12)：Rt＝2.61min；MS(ESIpos)：m/z＝907(M+H)+。
中间体C88
3-[({(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}氨基)甲基]吡咯烷-1-甲酸叔丁酯三氟乙酸(1∶1)
立体异构体的混合物
将1.71g(8.05mmol)三乙酰氧基硼氢化钠和0.40g(6.61mmol)乙酸加入2.04mg(5.75mmol)(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙-1-胺(中间体C52)于51ml二氯甲烷中的溶液中，并将反应混合物在RT下搅拌5分钟。然后加入1.32g(6.61mmol)3-甲酰基吡咯烷-1-甲酸叔丁酯于20ml二氯甲烷中的溶液，并将混合物在RT下搅拌过夜。将反应混合物用乙酸乙酯稀释并将有机相在每种情况下用饱和碳酸钠溶液和用饱和NaCl溶液洗涤两次，经硫酸镁干燥并浓缩。将残余物通过制备型HPLC纯化。将溶剂在减压下蒸发并将残余物在真空下干燥。这得到1.86g(理论值的50％)标题化合物。
LC-MS(方法1)：Rt＝0.99min；MS(ESIpos)：m/z＝538(M+H-CF3CO2H)+。
中间体C89
3-{[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}(氯乙酰基)氨基]甲基}吡咯烷-1-甲酸叔丁酯
1.36g(13.42mmol)三乙胺和2.13g(18.87mmol)氯乙酰氯加入2.89g(4.19mmol，纯度80％)3-[({(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}氨基)甲基]吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(中间体C88)于42ml含分子筛的二氯甲烷中的溶液中。将反应混合物在RT下搅拌5小时。将混合物在旋转蒸发仪上浓缩并将残余物通过制备型HPLC纯化。这得到449mg(理论值的17％)标题化合物的异构体1和442mg(理论值的17％)标题化合物的异构体2。
异构体1 LC-MS(方法1)：Rt＝2.74min；MS(ESIpos)：m/z＝614(M+H)+。
异构体2 LC-MS(方法1)：Rt＝2.78min；MS(ESIpos)：m/z＝614(M+H)+。
中间体C90
S-[2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}{[1-(叔丁氧基羰基)吡咯烷-3-基]甲基}氨基)-2-氧代乙基]-L-半胱氨酸(异构体1)
将357.3mg(0.58mmol)L-半胱氨酸与488.7mg(4.07mmol)碳酸氢钠一起悬浮于2.3ml水中。加入溶于23.0ml异丙醇中的357.0mg(0.58mmol)3-{[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}(氯乙酰基)氨基]甲基}吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(异构体1)(中间体C89，异构体1)并加入1.06g(6.98mmol)1，8-二氮杂二环[5.4.0]十一碳-7-烯。将反应混合物在50℃下搅拌3小时。将乙酸乙酯加入反应混合物中并将有机相用饱和碳酸氢钠溶液反复洗涤并用饱和NaCl溶液洗涤一次。将有机相经硫酸镁干燥并将溶剂在减压下蒸发。残余物不经纯化即进一步使用。这得到255.0mg(理论值的62％)标题化合物。
LC-MS(方法1)：Rt＝1.09min；MS(ESIpos)：m/z＝699(M+H)+。
中间体C91
S-[2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}{[1-(叔丁氧基羰基)吡咯烷-3-基]甲基}氨基)-2-氧代乙基]-L-半胱氨酸(异构体2)
将453.5mg(3.74mmol)L-半胱氨酸与449.2mg(5.35mmol)碳酸氢钠一起悬浮于2.1ml水中。加入溶于21.1ml异丙醇中的3287.4mg(0.54mmol)3-{[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}(氯乙酰基)氨基]甲基}吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(中间体C89，异构体2)并加入0.98g(6.42mmol)1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯。将反应混合物在50℃下搅拌3小时。将乙酸乙酯加入反应混合物中并将有机相用饱和碳酸氢钠溶液反复洗涤并用饱和NaCl溶液洗涤一次。将有机相经硫酸镁干燥并将溶剂在减压下蒸发。残余物不经纯化即进一步使用。这得到221.0mg(理论值的59％)标题化合物。
LC-MS(方法1)：Rt＝1.12min；MS(ESIpos)：m/z＝699(M+H)+。
中间体C92
S-[2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}{[1-(叔丁氧基羰基)吡咯烷-3-基]甲基}氨基)-2-氧代乙基]-N-[6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-半胱氨酸(异构体1)
将18.49mg(0.14mmol)N，N-二异丙基乙胺加入50mg(0.07mmol)S-[2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}{[1-(叔丁氧基羰基)吡咯烷-3-基]甲基}氨基)-2-氧代乙基]-L-半胱氨酸(中间体C90)和22.06mg(0.07mmol)1-{6-[(2，5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-6-氧代己基}-1H-吡咯-2，5-二酮于3.3ml DMF中的混合物中，并将反应混合物在RT下搅拌45分钟。不进行后处理，将混合物通过制备型HPLC纯化。这得到65mg(理论值的100％，纯度71％)标题化合物。
LC-MS(方法1)：Rt＝1.31min；MS(ESIpos)：m/z＝892(M+H)+。
中间体C93
S-[2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}{[1-(叔丁氧基羰基)吡咯烷-3-基]甲基}氨基)-2-氧代乙基]-N-[6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-半胱氨酸(异构体2)
将18.49mg(0.14mmol)N，N-二异丙基乙胺加入50.0mg(0.07mmol)S-[2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}{[1-(叔丁氧基羰基)吡咯烷-3-基]甲基}氨基)-2-氧代乙基]-L-半胱氨酸(中间体C91)和22.06mg(0.07mmol)1-{6-[(2，5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-6-氧代己基}-1H-吡咯-2，5-二酮于3.0ml DMF中的混合物中，并将反应混合物在RT下搅拌90分钟。不进行后处理，将混合物通过制备型HPLC纯化。这得到63mg(理论值的98％，纯度73％)标题化合物。
LC-MS(方法1)：Rt＝1.34min；MS(ESIpos)：m/z＝892(M+H)+。
中间体C94
S-[2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}{[1-(叔丁氧基羰基)吡咯烷-3-基]甲基}氨基)-2-氧代乙基]-N-[(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]-L-半胱氨酸(异构体1)
将18.5mg(0.14mmol)N，N-二异丙基乙胺加入50.0mg(0.07mmol)S-[2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}{[-1-(叔丁氧基羰基)吡咯烷-3-基]甲基}氨基)-2-氧代乙基]-L-半胱氨酸(中间体C90)和18.0mg(0.07mmol)1-{2-[(2，5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-2-氧代乙基}-1H-吡咯-2，5-二酮于3.3ml DMF中的混合物中，并将反应混合物在RT下搅拌30分钟。将乙酸乙酯加入反应混合物中并将有机相用饱和NH4Cl溶液反复洗涤并用饱和NaCl溶液洗涤一次。将有机相经硫酸镁干燥并将溶剂在减压下蒸发。残余物不经进一步纯化即使用。这得到57mg(理论值的81％，纯度85％)标题化合物。
LC-MS(方法1)：Rt＝0.96min；MS(ESIpos)：m/z＝836(M+H)+。
中间体C95
3-{[2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}{[1-(叔丁氧基羰基)吡咯烷-3-基]甲基}氨基)-2-氧代乙基]硫烷基}丙酸(异构体1)
将302.5mg(2.19mmol)碳酸钾加入384.0mg(0.62mmol)3-{[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}(氯乙酰基)氨基]甲基}吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(中间体C89，异构体1)和73.0mg(0.69mmol)3-巯基丙酸于14ml甲醇和几滴水中的混合物中。将反应混合物在50℃下搅拌2.5小时。将乙酸乙酯加入反应混合物中并将有机相用水并用饱和NaCl溶液反复洗涤。将有机相经硫酸镁干燥，将溶剂在减压下蒸发并将残余物在真空下干燥。残余物不经后处理即进一步使用。这得到358.0mg(理论值的84％)标题化合物。
LC-MS(方法1)：Rt＝1.33min；MS(ESIpos)：m/z＝684(M+H)+。
中间体C96
3-{[2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}{[1-(叔丁氧基羰基)吡咯烷-3-基]甲基}氨基)-2-氧代乙基]硫烷基}丙酸(异构体2)
将226.0mg(1.64mmol)碳酸钾加入287.0mg(0.45mmol)3-{[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}(氯乙酰基)氨基]甲基}吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(中间体C89，异构体2)和54.6mg(0.51mmol)3-巯基丙酸于14ml甲醇和几滴水中的混合物中。将反应混合物在50℃下搅拌2.5小时。将乙酸乙酯加入反应混合物中并将有机相用水和饱和NaCl溶液反复洗涤。将有机相经硫酸镁干燥，将溶剂在减压下蒸发并将残余物在真空下干燥。残余物不经后处理即进一步使用。这得到318.7mg(理论值的88％，纯度88％)标题化合物。
LC-MS(方法1)：Rt＝1.36min；MS(ESIpos)：m/z＝684(M+H)+。
中间体C97
3-[2-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}-14-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-3，8，13-三氧代-5-硫代-2，9，12-三氮杂十四烷-1-基]吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(异构体2)
在氩气下，将14.17mg(0.11mmol)N，N-二异丙基乙胺和27.80mg(0.07mmol)HATU加入25.0mg(0.04mmol)3-{[2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}{[1-(叔丁氧基羰基)吡咯烷-3-基]甲基}氨基)-2-氧代乙基]硫烷基}丙酸(中间体C96)于2.81ml DMF中的溶液中。将反应混合物在RT下搅拌10分钟。然后加入22.75mg(0.07mmol)N-(2-氨基乙基)-2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰胺-乙烷(1∶1)三氟乙酸(中间体L1)于1.4ml DMF中的溶液和5mg(0.04mmol)N，N-二异丙基乙胺，并将混合物在RT下搅拌过夜。加入水并将混合物用二氯甲烷萃取。将有机相经硫酸镁干燥并将溶剂在减压下蒸发。残余物不经后处理即进一步使用。这得到26mg(理论值的84％)标题化合物。
LC-MS(方法5)：Rt＝4.39min；MS(ESIpos)：m/z＝863(M+H)+。
中间体C98
3-[2-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}-18-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-3，8，13-三氧代-5-硫代-2，9，12-三氮杂十八烷-1-基]吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(异构体2)
在氩气下，将14.17mg(0.11mmol)N，N-二异丙基乙胺和27.80mg(0.07mmol)HATU加入25.0mg(0.04mmol)3-{[2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}{[1-(叔丁氧基羰基)吡咯烷-3-基]甲基}氨基)-2-氧代乙基]硫烷基}丙酸(中间体C96)于2.81ml DMF中的溶液中。将反应混合物在RT下搅拌10分钟。然后加入37.30mg(0.07mmol)N-(2-氨基乙基)-6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺-乙烷(1∶1)三氟乙酸于1.4ml DMF中的溶液和5mg(0.04mmol)N，N-二异丙基乙胺，并将混合物在RT下搅拌过夜。加入水并用二氯甲烷萃取混合物。将有机相经硫酸镁干燥并将溶剂在减压下蒸发。残余物不经进一步纯化即使用。这得到22mg(理论值的63％)标题化合物。
LC-MS(方法5)：Rt＝4.54min；MS(ESIpos)：m/z＝919(M+H)+。
中间体C99
3-[2-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}-24-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-3，8，19-三氧代-12，15-二氧杂-5-硫代-2，9，18-三氮杂二十四烷-1-基]吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(异构体2)
在氩气下，将14.17mg(0.11mmol)N，N-二异丙基乙胺和27.80mg(0.07mmol)HATU加入25.0mg(0.04mmol)3-{[2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}{[1-(叔丁氧基羰基)吡咯烷-3-基]甲基}氨基)-2-氧代乙基]硫烷基}丙酸(中间体C96)于2.81ml DMF中的溶液中。将反应混合物在RT下搅拌10分钟。并加入35.05mg(0.07mmol)N-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙基}-6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺-乙烷(1∶1)三氟乙酸(中间体L82)于1.4ml DMF中的溶液和5mg(0.04mmol)N，N-二异丙基乙胺，并将混合物在RT下搅拌过夜。加入水并用二氯甲烷萃取混合物。将有机相经硫酸镁干燥，将溶剂在减压下蒸发并将残余物在真空下干燥。将残余物通过制备型HPLC纯化。这得到25mg(理论值的60％)标题化合物。
LC-MS(方法1)：Rt＝4.52min；MS(ESIpos)：m/z＝1007(M+H)+。
中间体C100
{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-1-[(2-{[(2R)-2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)丙酰基]氨基}乙基)氨基]-1-氧代丁-2-基}氨基甲酸2-(三甲基硅烷基)乙酯
将22.2mg(0.068mmol)(2R)-N-(2-氨基乙基)-2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)丙酰胺(1∶1)三氟乙酸加入45mg(0.068mmol)(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-2-({[2-(三甲基硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)丁酸(中间体C58)于5.8ml DMF中的溶液中。在RT下搅拌30分钟后，将39mg(0.10mmol)HATU和36mg(0.27mmol)N，N-二异丙基乙胺加入混合物中。将反应混合物在RT下搅拌1小时。不进行后处理，将混合物通过制备型HPLC纯化。这得到7mg(理论值的12％)标题化合物。
LC-MS(方法1)：Rt＝1.41min；MS(ESIpos)：m/z 851(M+H)+。
中间体C101
三氟乙酸/(2S)-4-[(乙酰氧基乙酰基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}氨基]-2-氨基丁酸甲酯(1∶1)
将4.3g(12.2mmol)中间体C52溶于525ml DCM中，并加入3.63g(17.12mmol)三乙酰氧基硼氢化钠和8.4ml乙酸。在RT下搅拌5分钟后，加入溶于175ml DCM中的3.23g(11.85mmol)(2S)-4-氧代-2-({[2-(三甲基硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)丁酸甲酯(由(3S)-3-氨基-4-甲氧基-4-氧代丁酸使用经典方法制备)，并将混合物在RT下再搅拌45分钟。然后将混合物用DCM稀释并用100ml饱和碳酸氢钠溶液萃取两次然后用饱和氯化钠溶液萃取。将有机相经硫酸镁干燥、过滤然后浓缩。将残余物通过制备型HPLC纯化。将适当流份合并、浓缩并将残余物在高真空下干燥得到4.6g(理论值的61％)所述中间体。
LC-MS(方法12)：Rt＝1.97min；MS(ESIpos)：m/z＝614.32(M+H)+。
首先将2.06g(3.36mmol)该中间体加入76ml DCM中，然后在2.1ml三乙胺的存在下使用0.81ml(7.17mmol)乙酸2-氯-2-氧代乙基酯酰化。在RT下搅拌20小时后，再加入0.36ml乙酸2-氯-2-氧代乙基酯并加入0.94ml三乙胺，并将混合物在RT下再搅拌15分钟。然后将混合物用500ml乙酸乙酯稀释并连续地用300ml 5％浓度的柠檬酸萃取两次、用300ml饱和碳酸氢钠溶液萃取两次并用100ml饱和氯化钠溶液萃取一次，然后经硫酸镁干燥并浓缩。在高真空下干燥得到2.17g(理论值的79％)被保护的中间体。
LC-MS(方法1)：Rt＝1.48min；MS(ESIpos)：m/z＝714(M+H)+。
将321mg(0.342mmol)该中间体溶于7ml 2，2，2-三氟乙醇中。加入279.5mg(2.05mmol)氯化锌，并将混合物在50℃下搅拌2小时。并加入599mg(2.05mmol)乙二胺-N，N，N′，N′-四乙酸和2ml 0.1％浓度的三氟乙酸于水中的溶液，随后将混合物在减压下浓缩。将残余物通过制备型HPLC纯化。将适当流份浓缩并将残余物从乙腈/水中冻干得到60mg(理论值的26％)标题化合物，其仍含有一些脱乙酰基的化合物。
LC-MS(方法1)：Rt＝0.91min和0.95min；MS(ESIpos)：m/z＝528和570(M+H)+。
中间体C102
(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-2-{[(苄氧基)羰基]氨基}丁酸
首先，与中间体C2类似，使用(2S)-2-{[(苄氧基)羰基]氨基}-4-氧代丁酸苄酯对中间体C52进行还原烷基化。随后，使用乙酸2-氯-2-氧代乙基酯将仲氨基酰化，最后使用氢氧化锂于甲醇中的2M溶液将两个酯基团水解。
LC-MS(方法1)：Rt＝1.31min；MS(ESIpos)：m/z＝646(M-H)-。
中间体C103
N-[2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}氨基)乙基]-N2-{[2-(三甲基硅烷基)乙氧基]羰基}-L-谷氨酸2-(三甲基硅烷基)乙酯
通过首先在HATU和N，N-二异丙基乙胺的存在下在DMF中使151mg(0.23mmol)中间体C102与128mg(0.234mmol)中间体L98偶联而制备标题化合物。然后在RT下在标准氢压下在10％钯活性炭上氢化30分钟将Z保护基除去，从而得到标题化合物。
收率：理论值的30％，经2个步骤。
LC-MS(方法1)：Rt＝1.14min；MS(ESIpos)：m/z＝929(M+H)+。
中间体C104
(3R，4R)-3-[({(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}氨基)甲基]-4-氟吡咯烷-1-甲酸2-(三甲基硅烷基)乙酯
将1.87g(8.84mmol)三乙酰氧基硼氢化钠加入2.24g(6.31mmol)(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙-1-胺于56.0ml含有分子筛的二氯甲烷中的溶液中，并将反应混合物在室温下搅拌15分钟。并加入2.20g(7.58mmol)(3R，4S)-3-氟-4-甲酰基吡咯烷-1-甲酸2-(三甲基硅烷基)乙酯(文献：WO 2014/151030A1)，并将反应混合物在室温下搅拌3.5h。将混合物用二氯甲烷稀释并将有机相用饱和碳酸氢钠溶液和水洗涤。将有机相经硫酸钠干燥并浓缩。将残余物通过制备型HPLC纯化。这得到1.39g(理论值的24％)标题化合物。
LC-MS(方法1)：Rt＝1.15min；MS(ESIpos)：m/z＝600(M+H)+。
中间体C105
(3R，4R)-3-{[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}(氯乙酰基)氨基]甲基}-4-氟吡咯烷-1-甲酸2-(三甲基硅烷基)乙酯
将295.0mg(2.91mmol)三乙胺和418.9mg(3.71mmol)氯乙酰氯加入692.8mg(0.88mmol)(3R，4R)-3-[({(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}氨基)甲基]-4-氟吡咯烷-1-甲酸2-(三甲基硅烷基)乙酯(中间体C104)于8.7ml含有分子筛的二氯甲烷中的溶液，并将反应混合物在RT下搅拌2.5h。将反应混合物用二氯甲烷稀释并将有机相用饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化铵溶液洗涤。将有机相经硫酸镁干燥并浓缩。再一次地，将295.0mg(2.91mmol)三乙胺和418.9mg(3.71mmol)氯乙酰氯加入于8.7ml含有分子筛的二氯甲烷中的残余物中，然后将反应混合物在RT下搅拌3h。将反应混合物用二氯甲烷稀释并将有机相用饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化铵溶液洗涤。将有机相经硫酸钠干燥并浓缩。将有机相经硫酸钠干燥、浓缩并不经进一步纯化即使用。这得到691mg(理论值的74％，纯度64％)标题化合物。
LC-MS(方法1)：Rt＝1.78min；MS(ESIpos)：m/z＝676(M+H)+。
中间体C106
3-{[2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}{[(3R，4R)-4-氟-1-{[2-(三甲基硅烷基)乙氧基]羰基}吡咯烷-3-基]甲基}氨基)-2-氧代乙基]硫烷基}丙酸
将316mg(2.29mmol)碳酸钾加入691.0mg(0.65mmol)(3R，4R)-3-{[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}(氯乙酰基)氨基]甲基}-4-氟吡咯烷-1-甲酸2-(三甲基硅烷基)乙酯(中间体C105)和76.3mg(0.72mmol)3-巯基丙酸于15ml甲醇和几滴水中的混合物中。将反应混合物在50℃下搅拌1.5h。将乙酸乙酯加入反应混合物中，并将有机相用水和饱和NaCl溶液反复洗涤。将有机相经硫酸镁干燥并将溶剂在减压下蒸发，然后将残余物在真空下干燥。残余物不经后处理即进一步使用。这得到502mg(理论值的67％，纯度65％)标题化合物。
LC-MS(方法1)：Rt＝1.48min；MS(ESIneg)：m/z＝744(M-H)-。
中间体C107
S-[2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}{[(3R，4R)-4-氟-1-{[2-(三甲基硅烷基)乙氧基]羰基}吡咯烷-3-基]甲基}氨基)-2-氧代乙基]-L-半胱氨酸
将203.6mg(1.68mmol)L-半胱氨酸与201.7mg(2.40mmol)碳酸氢钠一起悬浮于0.95ml水中。加入溶于9.5ml异丙醇中的170.0mg(0.24mmol)(3R，4R)-3-{[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}(氯乙酰基)氨基]甲基}-4-氟吡咯烷-1-甲酸2-(三甲基硅烷基)乙酯(中间体105)并加入438.5mg(2.40mmol)1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯。将反应混合物在50℃下搅拌3小时。将乙酸乙酯加入混合物中并将有机相用饱和碳酸钠溶液并用饱和NaCl溶液反复洗涤。将有机相经硫酸钠干燥并将溶剂在减压下蒸发。残余物不经进一步纯化即进一步使用。这得到152mg(理论值的83％)标题化合物。
LC-MS(方法1)：Rt＝1.26min；MS(ESIpos)：m/z＝762(M+H)+。
中间体C115
N-[6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-N-[3-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}{[(2-羧乙基)硫烷基]乙酰基}氨基)丙基]-L-丙氨酰胺
将11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}-2，2-二甲基-6，12-二氧代-5-氧杂-14-硫代-7，11-二氮杂-2-硅杂十七烷-17-酸(200mg，285μmol)(中间体C69)溶于10ml三氟乙醇中。加入氯化锌(233mg，1.71mmol)并将反应混合物在50℃下搅拌1小时。再加入两次氯化锌(233mg，1.71mmol)并将反应混合物在50℃下搅拌1小时。加入乙二胺-N，N，N′，N′-四乙酸(1.50g，5.13mmol)，随后加入水(0.1％TFA)，然后将混合物在减压下浓缩。残余物通过制备型RP-HPLC(色谱柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)纯化。将溶剂在减压下蒸发并将残余物在真空下干燥。这得到162mg(理论值的85％)化合物3-({2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}硫烷基)丙酸/三氟乙酸(1∶1)。
LC-MS(方法1)：Rt＝0.94min；MS(ESIneg)：m/z＝556[M-H]-。
将3-({2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}硫烷基)丙酸/三氟乙酸(1∶1)(80.0mg，119μmol)溶于5.0ml DMF中，并加入2，5-二氧代吡咯烷-1-基N-[6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酸酯(69.4mg，纯度82％，119μmol)(中间体L88)和N，N-二异丙基乙胺(41μl，240μmol)。将反应混合物在RT下搅拌2小时30分钟，并加入水(0.1％TFA)。将混合物浓缩并通过制备型RP-HPLC(色谱柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)直接纯化。将溶剂在减压下蒸发并将残余物在真空下干燥。这得到82.2mg(理论值的75％)标题化合物。
LC-MS(方法1)：Rt＝1.17min；MS(ESIpos)：m/z＝921[M+H]+。
中间体C116
N-[6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-N-[3-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}[({3-[(2-羧乙基)氨基]-3-氧代丙基}硫烷基)乙酰基]氨基)丙基]-L-丙氨酰胺
在氩气下，首先将N-[6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-N-[3-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}{[(2-羧乙基)硫烷基]乙酰基}氨基)丙基]-L-丙氨酰胺(56.7mg，61.6μmol)(中间体C115)和β-丙氨酸叔丁酯盐酸盐(1∶1)(13.4mg，73.9μmol)加入3.0ml DMF中，并加入HATU(28.1mg，73.9μmol)和N，N-二异丙基乙胺(32μl，180μmol)。将反应混合物在RT下搅拌10分钟然后通过制备型RP-HPLC(色谱柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水)直接纯化。将溶剂在减压下蒸发并将残余物在真空下干燥。这得到41.4mg(理论值的64％)化合物N-[6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-N-(14-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}-2，2-二甲基-4，8，13-三氧代-3-氧杂-11-硫代-7，14-二氮杂十七烷-17-基)-L-丙氨酰胺。
LC-MS(方法1)：Rt＝1.28min；MS(ESIpos)：m/z＝1048[M+H]+。
将N-[6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-N-(14-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}-2，2-二甲基-4，8，13-三氧代-3-氧杂-11-硫代-7，14-二氮杂十七烷-17-基)-L-丙氨酰胺(39.3mg，37.5μmol)溶于2.5ml三氟乙醇中。加入氯化锌(30.7mg，225μmol)并将反应混合物在50℃下搅拌1小时。再一次加入氯化锌(30.7mg，225μmol)并将反应混合物在50℃下搅拌1小时。加入乙二胺-N，N，N′，N′-四乙酸(131mg，450μmol)，随后加入水(0.1％TFA)，然后将混合物在减压下浓缩。将残余物通过制备型RP-HPLC(色谱柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)纯化。将溶剂在减压下蒸发并将残余物用少量水吸收并冻干。这得到30mg(理论值的81％)标题化合物。
LC-MS(方法1)：Rt＝1.12min；MS(ESIpos)：m/z＝992[M+H]+。
中间体L1
三氟乙酸/N-(2-氨基乙基)-2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰胺(1∶1)
通过肽化学的经典方法由市售的(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酸和(2-氨基乙基)氨基甲酸叔丁酯制得标题化合物。
HPLC(方法11)：Rt＝0.19min；
LC-MS(方法1)：Rt＝0.17min；MS(ESIpos)：m/z＝198(M+H)+。
中间体L2
三氟乙酸/rel-(1R，2S)-2-氨基-N-[2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]环戊烷甲酰胺(1∶1)
由50mg(0.214mmol)市售的顺式-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-1-环戊烷甲酸和60mg(0.235mmol)同样市售的三氟乙酸/1-(2-氨基乙基)-1H-吡咯-2，5-二酮(1∶1)通过与EDC/HOBT偶联并随后使用TFA脱保护而制得标题化合物。这得到36mg(理论值的38％，经2个步骤)标题化合物。
HPLC(方法11)：Rt＝0.2min；
LC-MS(方法1)：Rt＝0.17min；MS(ESIpos)：m/z＝252(M+H)+。
中间体L3
三氟乙酸/(1S，2R)-2-氨基-N-[2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]环戊烷甲酰胺(1∶1)
由50mg(0.214mmol)市售的(1S，2R)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]环戊烷甲酸与72mg(0.283mmol)同样市售的三氟乙酸/1-(2-氨基乙基)-1H-吡咯-2，5-二酮(1∶1)通过与EDC/HOBT偶联并随后使用TFA脱保护而制得标题化合物。这得到13mg(理论值的16％，经2个步骤)标题化合物。
HPLC(方法11)：Rt＝0.2min；
LC-MS(方法1)：Rt＝0.2min；MS(ESIpos)：m/z＝252(M+H)+。
中间体L4
三氟乙酸/N-(2-氨基乙基)-4-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)环己烷甲酰胺(1∶1)
通过肽化学的经典方法由市售的1-[(4-{[(2，5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]羰基}环己基)甲基]-1H-吡咯-2，5-二酮和(2-氨基乙基)氨基甲酸叔丁酯而制得标题化合物。
HPLC(方法11)：Rt＝0.26min；
LC-MS(方法1)：Rt＝0.25min；MS(ESIpos)：m/z＝280(M+H)+。
中间体L5
三氟乙酸/N-[4-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)苯基]-β-丙氨酰胺(1∶1)
通过肽化学的经典方法由市售的1-(4-氨基苯基)-1H-吡咯-2，5-二酮和N-(叔丁氧基羰基)-β-丙氨酸而制得标题化合物。
HPLC(方法11)：Rt＝0.22min；
LC-MS(方法1)：Rt＝0.22min；MS(ESIpos)：m/z＝260(M+H)+。
中间体L6
三氟乙酸/N-[6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酰基-L-赖氨酸叔丁酯(1∶1)
通过以下方法制备标题化合物：首先在EDC/HOBT的存在下使市售的6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酸与通过肽化学的经典方法制备的部分被保护的肽L-缬氨酰基-L-丙氨酰基-N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸叔丁酯偶联。随后在缓和条件下通过在RT下在5％浓度的三氟乙酸的DCM溶液中搅拌对氨基基团进行脱保护，这得到标题化合物，收率为37％。
HPLC(方法11)：Rt＝1.29min；
LC-MS(方法1)：Rt＝0.62min；MS(ESIpos)：m/z＝566(M+H)+。
中间体L7
三氟乙酸/β-丙氨酰基-L-缬氨酰基-N5-氨甲酰基-N-[4-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)苯基]-L-鸟氨酰胺(ornithinamide)(1∶1)
根据肽化学的经典方法由市售的1-(4-氨基苯基)-1H-吡咯-2，5-二酮通过以下顺序偶联而制得标题化合物：在HATU的存在下与N2-(叔丁氧基羰基)-N5-氨甲酰基-L-鸟氨酸偶联，用TFA脱保护；与N-(叔丁氧基羰基)-L-缬氨酸2，5-二氧代吡咯烷-1-基酯偶联，用TFA脱保护；与N-(叔丁氧基羰基)-β-丙氨酸2，5-二氧代吡咯烷-1-基酯偶联并再次用TFA脱保护。获得32mg标题化合物。
HPLC(方法11)：Rt＝0.31min；
LC-MS(方法1)：Rt＝0.47min；MS(ESIpos)：m/z＝516(M+H)+。
中间体L8
三氟乙酸/L-丙氨酰基-N5-氨甲酰基-N-[4-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)苯基]-L-鸟氨酰胺(1∶1)
根据肽化学的经典方法由市售的1-(4-氨基苯基)-1H-吡咯-2，5-二酮通过以下顺序偶联而制得标题化合物：在HATU的存在下与N2-(叔丁氧基羰基)-N5-氨甲酰基-L-鸟氨酸偶联，用TFA脱保护；与N-(叔丁氧基羰基)-L-丙氨酸2，5-二氧代吡咯烷-1-基酯偶联并再次用TFA脱保护。获得171mg标题化合物。
HPLC(方法11)：Rt＝0.23min；
LC-MS(方法7)：Rt＝0.3min；MS(ESIpos)：m/z＝417(M+H)+。
中间体L9
三氟乙酸/β-丙氨酰基-L-缬氨酰基-N5-氨甲酰基-N-[4-(2-甲氧基-2-氧代乙基)苯基]-L-鸟氨酰胺(1∶1)
类似于中间体L7，由市售的(4-氨基苯基)乙酸甲酯制得标题化合物。获得320mg标题化合物。
HPLC(方法11)：Rt＝0.45min；
LC-MS(方法1)：Rt＝0.48min；MS(ESIpos)：m/z＝493(M+H)+。
中间体L10
N-[6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酰基-rel-N6-{[(1R，2S)-2-氨基环戊基]羰基}-L-赖氨酸/三氟乙酸(1∶2)
由中间体L6通过在EDC/HOBT的存在下与顺式-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-1-环戊烷甲酸偶联并随后使用TFA脱保护而制得标题化合物。这得到12mg(理论值的52％，经2个步骤)标题化合物。
HPLC(方法11)：Rt＝1.45min；
LC-MS(方法1)：Rt＝0.73min；MS(ESIpos)：m/z＝677(M+H)+。
中间体L11
N-[6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酰基-N6-{[(1S，2R)-2-氨基环戊基]羰基}-L-赖氨酸/三氟乙酸(1∶2)
由中间体L6通过在EDC/HOBT的存在下与(1S，2R)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]环戊烷甲酸偶联并随后使用TFA脱保护而制得标题化合物。这得到11mg(理论值的39％，经2个步骤)标题化合物。
HPLC(方法11)：Rt＝1.45min；
LC-MS(方法1)：Rt＝0.74min；MS(ESIpos)：m/z＝677(M+H)+。
中间体L12
三氟乙酸/1-[2-(2-氨基乙氧基)乙基]-1H-吡咯-2，5-二酮(1∶1)
将381mg(2.46mmol)2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-甲酸甲酯加入溶于7ml二噁烷/水1∶1中的228mg(1.12mmol)[2-(2-氨基乙氧基)乙基]氨基甲酸叔丁酯。并加入1.2ml饱和碳酸氢钠溶液并在RT下搅拌反应物。在共计5天的搅拌并另外2次添加同样量的碳酸氢钠溶液后，通过用三氟乙酸酸化、在旋转蒸发仪上浓缩并通过制备型HPLC纯化残余物而对反应物进行后处理。将适当的流份合并，在减压下除去溶剂并将残余物从乙腈/水1∶1中冻干。
将残余物用3ml二氯甲烷吸收，并加入1ml三氟乙酸。在RT下搅拌15分钟后，在减压下除去溶剂并将残余物从乙腈/水1∶1中冻干。这得到70mg(理论值的67％，经2个步骤)标题化合物，其为树脂样残余物。
HPLC(方法11)：Rt＝0.2min；
LC-MS(方法1)：Rt＝0.18min；MS(ESIpos)：m/z＝185(M+H)+。
中间体L13
三氟乙酸/N2-[(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]-L-赖氨酸叔丁酯(1∶1)
类似于中间体L6，通过在EDC/HOBT的存在下使(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酸与N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸叔丁酯盐酸盐(1∶1)偶联并随后缓和地除去叔丁氧基羰基保护基而制得标题化合物。
HPLC(方法11)：Rt＝0.42min；
LC-MS(方法1)：Rt＝0.43min；MS(ESIpos)：m/z＝340(M+H)+。
中间体L14
三氟乙酸/1-[2-(4-氨基哌嗪-1-基)-2-氧代乙基]-1H-吡咯-2，5-二酮(1∶1)
类似于中间体L2，经2个步骤由哌嗪-1-基氨基甲酸叔丁酯和(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酸制得标题化合物。
HPLC(方法11)：Rt＝0.2min；
LC-MS(方法3)：Rt＝0.25min；MS(ESIpos)：m/z＝239(M+H)+。
中间体L15
三氟乙酸/N-(2-氨基乙基)-3-(2-{2-[2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)丙酰胺(1∶1)
将2.93g(10.58mmol)3-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙氧基}丙酸叔丁酯溶于100ml二噁烷/水1∶1，并加入3.28g(21.15mmol)2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-甲酸甲酯和饱和碳酸氢钠溶液直到已达到pH6-7。将溶液在RT下搅拌30分钟，然后将1，4-二噁烷在减压下蒸发。然后加入200ml水，并将混合物在每种情况下用300ml乙酸乙酯萃取三次。合并有机萃取物，经硫酸镁干燥并过滤。浓缩得到3-(2-{2-[2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)丙酸叔丁酯，其为棕色油状物，然后将其在真空下干燥。
HPLC(方法11)：Rt＝1.5min；
LC-MS(方法3)：Rt＝0.88min；MS(ESIpos)：m/z＝375(M+NH4)+.
将该中间体通过标准方法(用TFA脱保护，与(2-氨基乙基)氨基甲酸叔丁酯偶联并再次用TFA脱保护)转化成标题化合物。
HPLC(方法11)：Rt＝0.2min；
LC-MS(方法3)：Rt＝0.25min；MS(ESIpos)：m/z＝344(M+H)+。
中间体L16
N-[6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-N5-氨甲酰基-L-鸟氨酸
将535mg(1.73mmol)市售的1-{6-[(2，5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-6-氧代己基}-1H-吡咯-2，5-二酮和930ml N，N-二异丙基乙胺加入266mg(1.33mmol)L-缬氨酰基-N5-氨甲酰基-L-鸟氨酸于24ml DMF中的溶液中。将反应物在超声浴中处理24小时，然后在减压下浓缩至干。将留下的残余物通过制备型HPLC纯化，在将适当的流份浓缩并将残余物在高真空下干燥后得到337mg(理论值的50％)标题化合物。
HPLC(方法11)：Rt＝0.4min；
LC-MS(方法3)：Rt＝0.58min；MS(ESIpos)：m/z＝468(M+H)+。
中间体L17
三氟乙酸/N-[6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-N5-氨甲酰基-L-鸟氨酰基-L-赖氨酸叔丁酯(1∶1)
通过以下方法制备标题化合物：首先在EDC/HOBT和N，N-二异丙基乙胺的存在下将172mg(0.37mmol)中间体L16与125mg(0.37mmol)N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸叔丁酯盐酸盐(1∶1)偶联，然后在缓和条件下通过在RT下在10％浓度的三氟乙酸的DCM溶液中搅拌2小时将氨基基团脱保护。从乙腈/水中冷冻干燥经2个步骤得到194mg(理论值的49％)标题化合物。
HPLC(方法11)：Rt＝1.1min；
LC-MS(方法1)：Rt＝0.58min；MS(ESIpos)：m/z＝652(M+H)+。
中间体L18
三氟乙酸/β-丙氨酰基-L-丙氨酰基-N5-氨甲酰基-N-[4-(2-甲氧基-2-氧代乙基)苯基]-L-鸟氨酰胺(1∶1)
类似于中间体L7，根据肽化学的经典方法，由(4-氨基苯基)乙酸甲酯通过以下方法顺序地制备标题化合物：在HATU的存在下连接N2-(叔丁氧基羰基)-N5-氨甲酰基-L-鸟氨酸，用TFA脱保护，与N-(叔丁氧基羰基)-L-丙氨酸2，5-二氧代吡咯烷-1-基酯偶联，用TFA脱保护，与N-(叔丁氧基羰基)-β-丙氨酸2，5-二氧代吡咯烷-1-基酯偶联，再次用TFA脱保护。获得330mg标题化合物。
HPLC(方法11)：Rt＝0.29min；
LC-MS(方法1)：Rt＝0.41min；MS(ESIpos)：m/z＝465(M+H)+。
中间体L19
三氟乙酸/L-丙氨酰基-N5-氨甲酰基-N-(4-{[(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}苯基)-L-鸟氨酰胺(1∶1)
根据肽化学的经典方法，由1，4-亚苯基二胺顺序地制备标题化合物。在第一步骤中，在HATU和N，N-二异丙基乙胺的存在下将942mg(8.72mmol)1，4-亚苯基二胺用0.8g(2.9mmol)N2-(叔丁氧基羰基)-N5-氨甲酰基-L-鸟氨酸单酰化。在第二步骤中，以类似的方式，在HATU和N，N-二异丙基乙胺的存在下将二级苯胺的氨基基团用(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酸酰化。用TFA脱保护，与N-(叔丁氧基羰基)-L-丙氨酸2，5-二氧代吡咯烷-1-基酯偶联，并再次用TFA脱保护，然后在3个进一步的合成步骤中，得到标题化合物，通过该路线获得148mg标题化合物。
LC-MS(方法1)：Rt＝0.21min；MS(ESIpos)：m/z＝474(M+H)+。
LC-MS(方法4)：Rt＝0.2min；MS(ESIpos)：m/z＝474(M+H)+。
中间体L20
三氟乙酸/L-缬氨酰基-N5-氨甲酰基-N-[4-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)苯基]-L-鸟氨酰胺(1∶1)
类似于中间体L8，根据肽化学的经典方法由市售的1-(4-氨基苯基)-1H-吡咯-2，5-二酮通过以下顺序的偶联制备标题化合物：在HATU的存在下与N2-(叔丁氧基羰基)-N5-氨甲酰基-L-鸟氨酸偶联，用TFA脱保护，与N-(叔丁氧基羰基)-L-缬氨酸2，5-二氧代吡咯烷-1-基酯并再次用TFA脱保护。获得171mg标题化合物。
HPLC(方法11)：Rt＝0.28min；
LC-MS(方法1)：Rt＝0.39min；MS(ESIpos)：m/z＝445(M+H)+。
中间体L21
L-缬氨酰基-N6-(叔丁氧基羰基)-N-[4-(2-甲氧基-2-氧代乙基)苯基]-L-赖氨酰胺
根据肽化学的经典方法，由0.42g(2.56mmol)市售的(4-氨基苯基)乙酸甲酯通过以下顺序的偶联制备标题化合物：在HATU和N，N-二异丙基乙胺的存在下与N6-(叔丁氧基羰基)-N2-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-L-赖氨酸偶联，用哌啶脱保护，在N，N-二异丙基乙胺的存在下与N-[(苄氧基)羰基]-L-缬氨酸2，5-二氧代吡咯烷-1-基酯偶联并随后在10％钯活性炭上氢化除去苄氧基羰基保护基。这得到360mg(理论值的32％，经4个步骤)标题化合物。
HPLC(方法11)：Rt＝1.5min；
LC-MS(方法1)：Rt＝0.73min；MS(ESIpos)：m/z＝493(M+H)+。
中间体L22
三氟乙酸/N-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-L-缬氨酰基-N-{4-[(2S)-2-氨基-3-甲氧基-3-氧代丙基]苯基}-N5-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺(1∶1)
根据肽化学的经典方法，由N-(叔丁氧基羰基)-4-硝基-L-苯丙氨酸顺序地制备标题化合物。首先在第一步骤中将2.5g(8.06mmol)该原料转化成铯盐，然后在DMF中用碘甲烷转化成甲基酯。
在甲醇中在10％钯活性炭上氢化，然后将硝基基团转化成氨基基团。
然后将以此方式产生的氨基基团在HATU和N，N-二异丙基乙胺的存在下在DMF中用N5-氨甲酰基-N2-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-L-鸟氨酸酰化。在下一步骤中，在DMF中用哌啶除去Fmoc基团。
然后在DMF中在1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、1-羟基-1H-苯并三唑水合物和N，N-二异丙基乙胺的存在下与N-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-L-缬氨酸偶联，最终用三氟乙酸除去叔丁氧基羰基基团。
HPLC(方法11)：Rt＝1.6min；
LC-MS(方法1)：Rt＝0.77min；MS(ESIpos)：m/z＝673(M+H)+。
中间体L23
三氟乙酸/N-[2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]-β-丙氨酰胺(1∶1)
由市售的三氟乙酸/1-(2-氨基乙基)-1H-吡咯-2，5-二酮(1∶1)通过在EDCI/HOBT和N，N-二异丙基乙胺的存在下与N-(叔丁氧基羰基)-β-丙氨酸偶联并随后用三氟乙酸脱保护而制得标题化合物。
HPLC(方法11)：Rt＝0.19min。
中间体L24
三氟乙酸/1-氨基-N-[2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]环丙烷甲酰胺(1∶1)
将114mg(0.67mmol)市售的1-[(叔丁氧基羰基)氨基]环丙烷-甲酸溶于25ml DCM，加入110mg(0.623mmol)市售的三氟乙酸/1-(2-氨基乙基)-1H-吡咯-2，5-二酮(1∶1)和395μl N，N-二异丙基乙胺并将混合物冷却至-10℃。然后加入217mg(0.793mmol)2-溴-1-乙基吡啶鎓四氟硼酸盐，并将混合物在RT下搅拌2小时。然后将混合物用乙酸乙酯稀释并用10％浓度的柠檬酸、饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化钠溶液连续地萃取，然后经硫酸镁干燥并浓缩。在高真空下干燥得到152mg被保护的中间体。
然后将它们用10ml DCM吸收并用1ml三氟乙酸脱保护。从乙腈/水中冻干得到158mg(理论值的71％，经2个步骤)标题化合物。
HPLC(方法11)：Rt＝0.19min.
LC-MS(方法3)：Rt＝0.98min；MS(ESIpos)：m/z＝224(M+H)+。
中间体L25
N-[31-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-29-氧代-4，7，10，13，16，19，22，25-八氧杂-28-氮杂三十一烷-1-酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酸
将31.4mg(0.17mmol)缬氨酰基-L-丙氨酸溶于3.0ml DMF中，并加入115.0mg(0.17mmol)3-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-{27-[(2，5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-27-氧代-3，6，9，12，15，18，21，24-八氧杂二十七烷-1-基}丙酰胺和33.7mg(0.33mmol)三乙胺。将混合物在RT下搅拌过夜。将反应混合物通过制备型RP-HPLC(色谱柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水)直接纯化。将溶剂在减压下蒸发并将残余物在真空下干燥。这得到74.1mg(理论值的58％)标题化合物。
LC-MS(方法1)：Rt＝0.61min；MS(ESIpos)：m/z＝763[M+H]+。
中间体L26
L-缬氨酰基-N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸
将600.0mg(1.58mmol)N2-[(苄氧基)羰基]-N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸悬浮于25.0ml水/乙醇/THF(1∶1∶0.5)中，加入钯活性炭(10％)并将混合物在RT下在标准压力下用氢氢化5小时。将催化剂滤出并将溶剂在减压下蒸发。将获得的化合物不经进一步纯化即用于下一步骤。
LC-MS(方法1)：Rt＝0.42min；MS(ESIpos)：m/z＝247[M+H]+。
将180mg(0.73mmol)N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸溶于5.0ml DMF中，并加入74.0mg(0.73mmol)三乙胺。然加入254.6mg(0.73mmol)N-[(苄氧基)羰基]-L-缬氨酸2，5-二氧代吡咯烷-1-基酯和74.0mg(0.73mmol)三乙胺。将反应混合物在RT下搅拌3.5小时。将反应溶液通过制备型RP-HPLC(色谱柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％ TFA)直接纯化。将溶剂在减压下蒸发并将残余物在真空下干燥。这得到294.1mg(理论值的76％)N-[(苄氧基)羰基]-L-缬氨酰基-N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸。
LC-MS(方法1)：Rt＝0.97min；MS(ESIpos)：m/z＝480[M+H]+。
首先将272.2mg(0.57mmol)N-[(苄氧基)羰基]-L-缬氨酰基-N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸加入20.0ml乙酸乙酯/乙醇/THF(1∶1∶1)中，并加入27.2mg钯活性炭。将混合物在RT下在标准压力下用氢氢化5小时。借助Celite(R)将混合物过滤并将滤饼用乙酸乙酯/乙醇/THF(1∶1∶1)洗涤。将溶剂在减压下蒸发并将残余物在真空下干燥。将标题化合物(182mg，理论值的72％)不经进一步纯化即用于下一反应步骤。
LC-MS(方法1)：Rt＝0.53min；MS(ESIpos)：m/z＝346[M+H]+。
中间体L27
N-[31-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-29-氧代-4，7，10，13，16，19，22，25-八氧杂-28-氮杂三十一烷-1-酰基]-L-缬氨酰基-N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸
首先将30mg(0.07mmol)L-缬氨酰基-N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸(中间体L26)和46.1mg((0.07mmol)3-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-{27-[(2，5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-27-氧代-3，6，9，12，15，18，21，24-八氧杂二十七烷-1-基}丙酰胺加入1.5ml DMF中，并加入6.8mg(0.07mmol)4-甲基吗啉。将反应溶液在RT下搅拌过夜。将反应混合物通过制备型RP-HPLC(色谱柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水)直接纯化。将溶剂在减压下蒸发并将残余物在真空下干燥。这得到55.6mg(理论值的90％)标题化合物。
LC-MS(方法1)：Rt＝0.77min；MS(ESIpos)：m/z＝920[M+H]+。
中间体L28
3-甲酰基-4-({[2-(三甲基硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯
首先将461.7mg(1.15mmol)3-乙基-4-({[2-(三甲基硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)吡咯烷-1，3-二甲酸1-叔丁酯(该化合物根据WO 2006/066896的文献方法制备)加入5.0ml无水二氯甲烷中并将混合物冷却至-78℃。然后缓慢滴加326.2mg(2.29mmol)二异丁基氢化铝溶液(1M于THF中)，并将混合物在-78℃下搅拌2小时(通过薄层色谱法(石油醚/乙酸乙酯＝3∶1)监测)。逐滴加入溶于60ml水中的1.3g(4.59mmol)酒石酸钾钠并使反应混合物升温至RT。将乙酸乙酯加入反应混合物中并将水相用乙酸乙酯萃取三次。将合并的有机相用饱和NaCl溶液洗涤一次并经硫酸镁干燥。将溶剂在减压下蒸发并将残余物在真空下干燥。这得到629.0mg作为粗产物的标题化合物，其不经进一步纯化即直接用于下一反应步骤。
中间体L29
3-甲酰基-4-[({[2-(三甲基硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)甲基]吡咯烷-1-甲酸叔丁酯
非对映异构体的混合物。
首先将807.1mg(2.34mmol)3-({[叔丁基(二甲基)硅烷基]氧基}甲基)-4-(羟基甲基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(根据WO 2006/100036的文献方法制备)加入8.0ml二氯甲烷中，并加入236.4mg(2.34mmol)三乙胺。在0℃下，逐滴加入267.6mg(2.34mmol)甲磺酰氯，并将反应混合物在RT下搅拌过夜。再加入133.8mg(1.17mmol)甲磺酰氯并加入118.2mg(1.17mmol)三乙胺。将反应混合物在RT下搅拌过夜。将混合物用二氯甲烷稀释并将有机相在每种情况下用饱和碳酸氢钠溶液、5％浓度的硫酸氢钾溶液和饱和NaCl溶液洗涤一次。经硫酸镁干燥后，将溶剂在减压下蒸发并将残余物在Biotage Isolera(硅胶，色谱柱50gSNAP，流速66ml/min，环己烷/乙酸乙酯)上纯化。将溶剂在减压下蒸发并将残余物在真空下干燥。这得到402.0mg(理论值的41％)化合物3-({[叔丁基(二甲基)硅烷基]氧基}甲基)-4-{[(甲基磺酰基)氧基]甲基}吡咯烷-1-甲酸叔丁酯。
LC-MS(方法1)：Rt＝1.38min；MS(ESIpos)：m/z＝424[M+H]+。
首先将400.0mg(0.94mmol)3-({[叔丁基(二甲基)硅烷基]氧基}甲基)-4-{[(甲基磺酰基)氧基]甲基}吡咯烷-1-甲酸叔丁酯加入5.0ml DMF中，并加入98.2mg(1.51mmol)叠氮化钠。将反应混合物在40℃下搅拌10小时。然后再加入30.7mg(0.47mmol)叠氮化钠，并将混合物在40℃下再搅拌10小时。加入乙酸乙酯并将有机相用水反复洗涤。将有机相经硫酸镁干燥后，将溶剂在减压下蒸发并将残余物在真空下干燥。这得到309.5mg(理论值的89％)化合物3-(叠氮基甲基)-4-({[叔丁基(二甲基)硅烷基]氧基}甲基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯。该化合物不经进一步纯化即用于下一合成步骤。
LC-MS(方法1)：Rt＝1.50min；MS(ESIpos)：m/z＝371[M+H]+。
将250mg(0.68mmol)3-(叠氮基甲基)-4-({[叔丁基(二甲基)硅烷基]氧基}甲基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯溶于10.0ml乙酸乙酯/乙醇(1∶1)中，并加入25.0mg钯活性炭(10％)。将混合物在RT下在标准压力下用氢氢化8小时。通过硅藻土(Celite(R))过滤反应物并用乙酸乙酯充分地洗涤滤饼。将溶剂在减压下蒸发并将残余物在真空下干燥。这得到226.2mg(理论值的82％)化合物3-(氨基甲基)-4-({[叔丁基(二甲基)硅烷基]氧基}甲基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯。该化合物不经进一步纯化即用于下一合成步骤。
LC-MS(方法1)：Rt＝0.89min；MS(ESIpos)：m/z＝345[M+H]+。
将715.0mg(2.08mmol)3-(氨基甲基)-4-({[叔丁基(二甲基)硅烷基]氧基}甲基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯溶于15.0ml THF中，并加入2.28ml(2.28mmol)TBAF溶液(1M于THF中)。将反应混合物在RT下搅拌过夜。将溶剂在减压下蒸发并将残余物(1.54g)不经进一步纯化即用于下一合成步骤。
LC-MS(方法1)：Rt＝0.41min；MS(ESIpos)：m/z＝231[M+H]+。
首先将1.54g(4.88mmol)3-(氨基甲基)-4-(羟基甲基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯加入1，4-二噁烷中，并加入541.8mg(4.88mmol)氯化钙(无水)和488.6mg(4.88mmol)碳酸钙并剧烈地搅拌混合物。然后加入592.8mg(5.86mmol)三乙胺和1.52g(5.86mmol)1-({[2-(三甲基硅烷基)乙氧基]羰基}氧基)吡咯烷-2，5-二酮并将反应混合物在RT下搅拌过夜。加入644.9mg(10.7mmol)HOAc和乙酸乙酯。将有机相用水洗涤两次并用饱和NaCl溶液洗涤一次。经硫酸镁干燥后，将溶剂在减压下蒸发并将残余物在硅胶上纯化(流动相∶二氯甲烷/甲醇＝100∶1)。将溶剂在减压下蒸发并将残余物在真空下干燥。这得到346.9mg(理论值的19％)化合物3-(羟基甲基)-4-[({[2-(三甲基硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)甲基]吡咯烷-1-甲酸叔丁酯。
LC-MS(方法1)：Rt＝1.08min；MS(ESIpos)：m/z＝375[M+H]+。
首先将804.0mg(2.15mmol)3-(羟基甲基)-4-[({[2-(三甲基硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)甲基]吡咯烷-1-甲酸叔丁酯加入20.0ml氯仿和20.0ml 0.05N碳酸钾/0.05N碳酸氢钠溶液(1∶1)中。然后加入59.7mg(0.22mmol)四正丁基氯化铵、429.9mg(3.22mmol)N-氯代琥珀酰亚胺和33.5mg(0.22mmol)TEMPO并将反应混合物在RT下剧烈地搅拌过夜。分离出有机相并在减压下除去溶剂。将残余物通过硅胶色谱法(流动相∶环己烷/乙酸乙酯＝3∶1)纯化。这得到517.0mg(理论值的46％)标题化合物。
LC-MS(方法1)：Rt＝1.13min；MS(ESIpos)：m/z＝373[M+H]+。
中间体L30
3-({[叔丁基(二甲基)硅烷基]氧基}甲基)-4-甲酰基吡咯烷-1-甲酸叔丁酯
立体异构体的混合物
首先将250.0mg(0.72mmol)3-({[叔丁基(二甲基)硅烷基]氧基}甲基)-4-(羟基甲基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(该化合物根据WO2006/100036的文献方法制备)加入12.5ml二氯甲烷/DMSO(4∶1)中，并加入219.6mg(2.17mmol)三乙胺。在2℃下，每次少许地加入345.5mg(2.17mmol)三氧化硫-吡啶络合物并将混合物在2℃下搅拌3小时。再次每次少许地加入345.5mg(2.17mmol)三氧化硫-吡啶络合物并将混合物在RT下搅拌17小时。将反应混合物在二氯甲烷和水之间分配。将水相用二氯甲烷萃取三次并将合并的有机相用水洗涤一次并经硫酸镁干燥。将溶剂在减压下蒸发并将残余物在真空下干燥。残余物不经进一步纯化即用于下一合成步骤(薄层色谱法∶石油醚/乙酸乙酯7∶3)。
中间体L31
{[(叔丁氧基羰基)氨基]甲基}丙二酸二-叔丁酯
将57.2g(488.27mmol)氨基甲酸叔丁酯、51.2ml(683.57mmol)37％浓度的甲醛于水中的溶液和25.9g(244.13mmol)碳酸钠加入600ml水中。将混合物升温直到形成溶液，然后在RT下搅拌16小时。将形成的悬浮液用500ml二氯甲烷萃取，并分离出有机相，用饱和氯化钠溶液洗涤并经硫酸钠干燥。将混合物在旋转蒸发仪上浓缩并将残余物在真空下干燥，从而得到结晶体。将残余物用1000ml无水THF吸收，并在RT下逐滴加入322ml(3.414mol)乙酸酐和138ml(1.707mol)吡啶的混合物。将反应混合物在RT下搅拌16小时，然后在室温下使用水浴在旋转蒸发仪上浓缩。将残余物用二乙醚吸收并用饱和碳酸氢钠溶液洗涤三次并用饱和氯化钠溶液洗涤一次。将有机相经硫酸钠干燥并在旋转蒸发仪上浓缩并将残余物在真空下干燥2天。将残余物用2000ml无水THF吸收，并在冰冷却下加入456ml(456.52mmol)叔丁醇钠于THF中的1M溶液。将混合物在0℃下搅拌20分钟，然后逐滴加入溶于200ml无水THF中的100.8g(456.52mmol)丙二酸二-叔丁酯。将混合物在RT下搅拌48小时，然后加入水。将反应混合物在旋转蒸发仪上浓缩并用500ml乙酸乙酯吸收。将混合物用500ml水和100ml饱和氯化钠溶液洗涤并将有机相经硫酸钠干燥。将有机相在旋转蒸发仪上浓缩并将残余物在真空下干燥。残余物通过在硅胶上过滤纯化(流动相：环己烷/乙酸乙酯，梯度＝30∶1→5∶1)。这得到37.07g(理论值的22％)目标化合物。
LC-MS(方法6)：Rt＝2.87min；MS(ESIpos)：m/z＝346[M+H]+。
中间体L32
[3-羟基-2-(羟基甲基)丙基]氨基甲酸叔丁酯
将37.0g(107.11mmol)(乙酰氧基甲基)丙二酸二-叔丁酯溶于1000ml无水THF中，并在冰冷却下加入535.5ml(1071.10mmol)硼氢化锂于THF中的2M溶液。逐滴加入19.3ml(1071.10mmol)水并将混合物在RT下搅拌4.5小时。将反应混合物在旋转蒸发仪上浓缩并在高真空下干燥。将残余物用1500ml乙酸乙酯吸收，加入100ml水并将混合物在水冷却下搅拌(轻微放热)30分钟。分离出有机相并将水相用500ml乙酸乙酯萃取两次。将有机相在旋转蒸发仪上浓缩并将残余物在真空下干燥。这得到20.7g(理论值的94％)目标化合物。
LC-MS(方法6)：Rt＝1.49min；MS(EIpos)：m/z＝106[M-C5H8O2]+。
中间体L33
[3-{[叔丁基(二甲基)硅烷基]氧基}-2-(羟基甲基)丙基]氨基甲酸叔丁酯
将20.00g(97.44mmol)[3-羟基-2-(羟基甲基)丙基]氨基甲酸叔丁酯溶于1000ml无水二氯甲烷中，然后在RT下加入6.63g(97.44mmol)咪唑和16.16g(107.18mmol)叔丁基(氯)二甲基硅烷。将反应混合物在RT下搅拌16小时并用半浓缩氯化钠溶液洗涤。将水相用乙酸乙酯萃取，并将合并的有机相经硫酸钠干燥，在旋转蒸发仪上浓缩，并在高真空下干燥。这得到28.50g(理论值的92％)目标化合物。
1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ[ppm]＝0.02(s，6H)，0.86(s，9H)，1.37(s，9H)，1.58-1.73(m，1H)，2.91(q，2H)，3.33-3.36[m，(2H，hidden)]，3.53-3.58(m，2H)，6.65-6.72(m，1H)。
中间体L34
(3-{[叔丁基(二甲基)硅烷基]氧基}-2-甲酰基丙基)氨基甲酸叔丁酯
将12.65g(39.591mmol)[3-{[叔丁基(二甲基)硅烷基]氧基}-2-(羟基-甲基)丙基]氨基甲酸叔丁酯溶于200ml二氯甲烷中，然后在RT下逐滴加入溶于150ml二氯甲烷中的19.31g(45.53mmol)戴斯-马丁过碘烷。将混合物在室温下搅拌2小时，并加入250ml半浓缩的碳酸氢钠溶液和250ml 10％浓度的硫代硫酸钠溶液并将混合物搅拌20分钟。分离出有机相并将水相用乙酸乙酯萃取。将合并的有机相用300ml水洗涤，经硫酸钠干燥，在旋转蒸发仪上浓缩并在高真空下干燥。这得到11.35g(理论值的90％)目标化合物。
1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ[ppm]＝0.02(s，6H)，0.84(s，9H)，1.36(s，9H)，1.48-1.51(m，1H)，3.08-3.32[m，(1H，hidden)]，3.50-3.58(m，2H)，3.81-3.91(m，1H)，6.71(t，1H)，9.60(d，1H)。
中间体L35
(3-氧代丙基)氨基甲酸叔丁酯
根据从文献中已知的方法(例如Jean Bastide等人，J.Med.Chem.2003，46(16)，3536-3545)来制备标题化合物。
中间体L36
N-[(苄氧基)羰基]-L-缬氨酰基-N5-氨甲酰基-L-鸟氨酸
将100mg(0.57mmol)N5-氨甲酰基-L-鸟氨酸用4.0ml DMF吸收，并加入0.08ml(0.57mmol)三乙胺。然后加入199.0mg(0.57mmol)2，5-二氧代吡咯烷-1-基-N-[(苄氧基)羰基]-L-缬氨酸和0.08ml(0.57mmol)三乙胺。将混合物在RT下搅拌48小时。将反应混合物通过制备型RP-HPLC(色谱柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，含0.1％TFA的MeCN/水)直接纯化。将溶剂在减压下蒸发并将残余物在真空下干燥。这得到75.7mg(理论值的33％)标题化合物。
LC-MS(方法1)：Rt＝0.69min；MS(ESIpos)：m/z＝409[M+H]+。
中间体L37
L-缬氨酰基-N5-氨甲酰基-L-鸟氨酸
将75.7mg(0.19mmol)中间体L36悬浮于25ml水/乙醇/THF中，并加入7.5mg钯活性炭(10％)并在RT下在标准压力下将混合物用氢氢化4.5小时。滤掉催化剂，并将反应混合物在减压下除去溶剂并在高真空下干燥。残余物不经进一步纯化即用于下一步骤。这得到64.9mg(理论值的93％)标题化合物。
LC-MS(方法6)：Rt＝0.25min；MS(ESIpos)：m/z＝275[M+H]+。
中间体L38
N-[31-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-29-氧代-4，7，10，13，16，19，22，25-八氧杂-28-氮杂三十一烷-1-酰基]-L-缬氨酰基-N5-氨甲酰基-L-鸟氨酸
首先将38.3mg(0.14mmol)中间体L37加入3.0ml DMF中，并加入96.4mg(0.14mmol)3-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-{27-[(2，5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-27-氧代-3，6，9，12，15，18，21，24-八氧杂二十七烷-1-基}丙酰胺和39.0μl(0.28mmol)三乙胺。将混合物在RT下搅拌过夜。并加入16.0μl(0.28mmol)HOAc，并将反应混合物通过制备型RP-HPLC(色谱柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水)直接纯化。将溶剂在减压下蒸发并将残余物在真空下干燥。这得到58.9mg(理论值的45％)标题化合物。
LC-MS(方法1)：Rt＝0.61min；MS(ESIpos)：m/z＝849[M+H]+。
中间体L39
(2-巯基乙基)氨基甲酸2-(三甲基硅烷基)乙酯
首先将300mg(2.64mmol)2-氨基乙硫醇盐酸盐(1∶1)加入3.0ml二氯甲烷中，并加入668.0mg(6.60mmol)三乙胺和719.1mg(2.77mmol)1-({[2-(三甲基硅烷基)乙氧基]羰基}氧基)吡咯烷-2，5-二酮。将混合物在RT下搅拌2天(通过薄层色谱检测∶二氯甲烷/甲醇＝100∶1.5)。加入乙酸乙酯并将反应混合物用水洗涤三次。将有机相用饱和NaCl溶液洗涤两次并经硫酸镁干燥。将溶剂在减压下蒸发并将残余物在真空下干燥。该化合物不经进一步纯化即用于下一合成步骤。
中间体L40
N-[31-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-29-氧代-4，7，10，13，16，19，22，25-八氧杂-28-氮杂三十一烷-1-酰基]-L-缬氨酰基-N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸
在RT下，在标准压力下，使用钯活性炭(10％)，在25.0ml水/乙醇/THF(1∶1∶0.5)中用氢将600mg(1.58mmol)N2-[(苄氧基)羰基]-N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸氢化。化合物N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸不经进一步纯化即用于下一合成步骤。
LC-MS(方法1)：Rt＝0.99min；MS(ESIpos)：m/z＝247[M+H]+。
将180.0mg(0.73mmol)N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸溶于5.0ml DMF中，并加入74.0mg(0.73mmol)三乙胺。加入254.6mg(0.73mmol)N-[(苄氧基)羰基]-L-缬氨酸2，5-二氧代吡咯烷-1-基酯和74.0mg(0.73mmol)三乙胺。将反应混合物在RT下搅拌3.5小时。将反应混合物通过制备型RP-HPLC(色谱柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)直接纯化。将溶剂在减压下蒸发并将残余物在真空下干燥。这得到294.1mg(理论值的76％)化合物N-[(苄氧基)羰基]-L-缬氨酰基-N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸。
LC-MS(方法1)：Rt＝0.97min；MS(ESIpos)：m/z＝480[M+H]+。
将272.2mg(0.57mmol)N-[(苄氧基)羰基]-L-缬氨酰基-N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸溶于20ml乙酸乙酯/乙醇/THF(1∶1∶1)，加入27.2mg钯活性炭，并使用氢气将混合物在标准压力和RT下氢化。将混合物通过硅藻土(Celite(R))过滤，并将滤饼用乙酸乙酯/乙醇/THF(1∶1∶1)充分洗涤。将溶剂在减压下蒸发并将残余物在真空下干燥。这得到182.0mg(理论值的72％)化合物L-缬氨酰基-N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸。
LC-MS(方法1)：Rt＝0.53min；MS(ESIpos)：m/z＝346[M+H]+。
将30.0mg(0.07mmol)L-缬氨酰基-N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸和46.1mg(0.07mmol)3-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-{27-[(2，5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-27-氧代-3，6，9，12，15，18，21，24-八氧杂二十七烷-1-基}丙酰胺溶于1.5ml DMF中，并加入6.8mg(0.07mmol)4-甲基吗啉。将反应混合物在RT下搅拌过夜。将反应混合物通过制备型RP-HPLC(色谱柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水)纯化。将溶剂在减压下蒸发并将残余物在真空下干燥。这得到55.6mg(理论值的90％)标题化合物。
LC-MS(方法1)：Rt＝0.77min；MS(ESIpos)：m/z＝920[M+H]+。
中间体L41
N-[19-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4，7，10，13-四氧杂-16-氮杂十九烷-1-酰基]-L-缬氨酰基-N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸
将600mg(1.58mmol)N2-[(苄氧基)羰基]-N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸在25.0ml水/乙醇/THF(1∶1∶0.5)中使用钯碳(10％)在RT下在标准压力下用氢来氢化。化合物N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸不经进一步纯化即用于下一合成步骤中。
LC-MS(方法1)：Rt＝0.99min；MS(ESIpos)：m/z＝247[M+H]+。
将180.0mg(0.73mmol)N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸溶解于5.0mlDMF中，并加入74.0mg(0.73mmol)三乙胺。加入254.6mg(0.73mmol)N-[(苄氧基)羰基]-L-缬氨酸2，5-二氧代吡咯烷-1-基酯和74.0mg(0.73mmol)三乙胺。将反应混合物在RT下搅拌3.5h。将反应混合物直接通过制备型RP-HPLC纯化(柱：Reprosil 250×30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)。然后将溶剂在减压下蒸发并将残余物在高真空下干燥。得到294.1mg(理论值的76％)化合物N-[(苄氧基)羰基]-L-缬氨酰基-N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸。
LC-MS(方法1)：Rt＝0.97min；MS(ESIpos)：m/z＝480[M+H]+。
将272.2mg(0.57mmol)N-[(苄氧基)羰基]-L-缬氨酰基-N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸溶解于20.0ml乙酸乙酯/乙醇/THF(1∶1∶1)中，加入27.2mg钯活性炭并将混合物在标准压力下在RT下用氢来氢化。将混合物通过硅藻土(Celite(R))过滤并将滤饼用乙酸乙酯/乙醇/THF(1∶1∶1)仔细地洗涤。将溶剂在减压下蒸发并将残余物在高真空下干燥。得到182.0mg(理论值的72％)化合物L-缬氨酰基-N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸。
LC-MS(方法1)：Rt＝0.53min；MS(ESIpos)：m/z＝346[M+H]+。
将30.0mg(0.07mmol)L-缬氨酰基-N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸和34.3mg(0.07mmol)3-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-{15-[(2，5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-15-氧代-3，6，9，12-四氧杂十五烷-1-基}丙酰胺溶解于1.5ml DMF中，并加入6.8mg(0.07mmol)4-甲基吗啉。将反应混合物在RT下搅拌过夜。将反应混合物通过制备型RP-HPLC直接纯化(柱：Reprosil 250×30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水)。将溶剂在减压下蒸发并将残余物在高真空下干燥。得到40.6mg(理论值的82％)标题化合物。
LC-MS(方法1)：Rt＝0.73min；MS(ESIpos)：m/z＝744[M+H]+。
中间体L42
N-[19-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4，7，10，13-四氧杂-16-氮杂十九烷-1-酰基]-L-缬氨酰基-N5-氨基甲酰基-L-鸟氨酸
首先将50.0mg(0.18mmol)L-缬氨酰基-N5-氨基甲酰基-L-鸟氨酸(中间体L37)加入DMF中，并加入93.6mg(0.18mmol)3-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-{15-[(2，5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-15-氧代-3，6，9，12-四氧杂十五烷-1-基}丙酰胺和36.9mg(0.37mmol)三乙胺。将反应混合物在RT下搅拌过夜。加入21.9mg(0.37mmol)HOAc并将反应混合物通过制备型RP-HPLC直接纯化(柱：Reprosil 250×30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水)。将溶剂在减压下蒸发并将残余物在高真空下干燥。得到20.6mg(理论值的14％)标题化合物。
LC-MS(方法1)：Rt＝0.55min；MS(ESIpos)：m/z＝673[M+H]+。
中间体L43
N-[67-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-65-氧代-4，7，10，13，16，19，22，25，28，31，34，37，40，43，46，49，52，55，58，61-二十烷氧杂-64-氮杂六十七烷-1-酰基]-L-缬氨酰基-N5-氨基甲酰基-L-鸟氨酸
首先将11.3mg(0.04mmol)L-缬氨酰基-N5-氨基甲酰基-L-鸟氨酸(中间体L37)加入DMF中，并加入50.0mg(0.04mmol)3-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-{63-[(2，5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-63-氧代-3，6，9，12，15，18，21，24，27，30，33，36，39，42，45，48，51，54，57，60-二十烷氧杂六十三烷-1-基}丙酰胺和8.3mg(0.08mmol)三乙胺。将反应混合物在RT下搅拌过夜。加入4.9mg(0.08mmol)HOAc并将反应混合物通过制备型RP-HPLC直接纯化(柱：Reprosil 250×30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水)。将溶剂在减压下蒸发并将残余物在高真空下干燥。得到15.8mg(理论值的20％)标题化合物。
LC-MS(方法4)：Rt＝0.94min；MS(ESIpos)：m/z＝1377[M+H]+。
中间体L44
N-[19-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4，7，10，13-四氧杂-16-氮杂十九烷-1-酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酸
将73.3mg(0.39mmol)L-缬氨酰基-L-丙氨酸溶解于7.0ml DMF中，并加入200.0mg(0.39mmol)3-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-{15-[(2，5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-15-氧代-3，6，9，12-四氧杂十五烷-1-基}丙酰胺和78.8mg(0.78mmol)三乙胺。将反应混合物在RT下搅拌过夜。将反应混合物通过制备型RP-HPLC直接纯化(柱：Reprosil 250×30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水)。将溶剂在减压下蒸发并将残余物在高真空下干燥。得到103.3mg(理论值的45％)标题化合物。
LC-MS(方法1)：Rt＝0.58min；MS(ESIpos)：m/z＝587[M+H]+。
中间体L45
(2S)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-4-氧代丁酸叔丁酯
将2.00g(7.26mmol)N-(叔丁氧基羰基)-L-高丝氨酸叔丁酯溶解于90ml二氯甲烷中，然后加入1.76ml吡啶和4.62g(10.90mmol)1，1，1-三乙酰氧基-1λ5，2-苯碘酰-3(1H)-酮(戴斯-马丁过碘烷)。将反应物在RT下搅拌2h，然后用200ml二氯甲烷稀释，并用10％浓度的硫代硫酸钠溶液萃取两次，然后依次用5％浓度的柠檬酸萃取两次并用饱和碳酸氢钠溶液萃取两次。将有机相分离出，经硫酸钠干燥，然后在减压下浓缩。将100ml二乙醚和环己烷(v/v＝1∶1)加入残余物中并将混合物稍微浓缩，使得形成白色沉淀物。将其通过抽吸滤出。将滤液在旋转蒸发仪上浓缩并在高真空下干燥，得到1.74g(理论值的88％)目标化合物，其为淡黄色油状物。
LC-MS(方法1)：Rt＝0.85min；MS(ESIpos)：m/z＝274[M+H]+。
1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ[ppm]＝1.38(s，18H)，2.64-2.81(m，2H)，4.31-4.36(m，1H)，7.23(d，1H)，9.59(s，1H)。
中间体L46
三氟乙酸/N-[2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]-L-谷氨酰胺叔丁酯(1∶1)
通过以下步骤制备标题化合物：首先将200mg(0.79mmol)三氟乙酸/1-(2-氨基乙基)-1H-吡咯-2，5-二酮(1∶1)与263mg(0.87mmol)(4S)-5-叔丁氧基-4-[(叔丁氧基羰基)氨基]-5-氧代戊酸/三氟乙酸(1∶1)在EDC/HOBT和N，N-二异丙基乙胺的存在下偶联，然后通过在于DCM中的10％浓度的三氟乙酸中在RT下搅拌1h而在温和条件下将氨基脱保护。从乙腈/水中冷冻干燥经2个步骤得到85mg(理论值的20％)标题化合物。
LC-MS(方法1)：Rt＝0.37min；MS(ESIpos)：m/z＝326[M+H]+。
中间体L47
三氟乙酸/β-丙氨酰基-L-丙氨酰基-N5-氨基甲酰基-N-[4-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)苯基]-L-鸟氨酰胺(1∶1)
通过将中间体L8与N-(叔丁氧基羰基)-β-丙氨酸2，5-二氧代吡咯烷-1-基酯偶联，随后用TFA脱保护来制备标题化合物。
LC-MS(方法3)：Rt＝1.36min；MS(ESIpos)：m/z＝488(M+H)+。
中间体L48
三氟乙酸/(1R，2S)-2-氨基-N-[2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]环戊烷甲酰胺(1∶1)
以类似于中间体L2的方法，由市售的(1R，2S)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]环戊烷甲酸来制备标题化合物。
LC-MS(方法3)：Rt＝1.22min；MS(ESIpos)：m/z＝252(M+H)+。
中间体L49
三氟乙酸/N-(溴乙酰基)-L-缬氨酰基-L-丙氨酰基-L-赖氨酸叔丁酯(1∶1)
通过以下步骤来制备标题化合物：首先将市售的溴代乙酸酐与根据肽化学的经典方法制备的部分受保护的肽L-缬氨酰基-L-丙氨酰基-N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸叔丁酯在N，N-二异丙基乙胺的存在下在二氯甲烷中偶联。然后通过在于DCM中的10％浓度的三氟乙酸中在RT下搅拌而在温和条件下在氨基处脱保护，经2个步骤得到标题化合物，收率49％。
LC-MS(方法1)：Rt＝1.09min；MS(ESIpos)：m/z＝593和595(M+H)+。
中间体L50
三氟乙酸/(1S，3R)-3-氨基-N-[2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]环戊烷甲酰胺(1∶1)
由市售的(1S，3R)-3-[(叔丁氧基羰基)氨基]环戊烷甲酸和同样市售的三氟乙酸/1-(2-氨基乙基)-1H-吡咯-2，5-二酮(1∶1)通过与HATU在N，N-二异丙基乙胺的存在下偶联，随后用TFA脱保护来制备标题化合物。
HPLC(方法11)：Rt＝0.2min；
LC-MS(方法3)：Rt＝0.88min；MS(ESIpos)：m/z＝252(M+H)+。
中间体L51
三氟乙酸/(1R，3R)-3-氨基-N-[2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]环戊烷甲酰胺(1∶1)
由市售的(1R，3R)-3-[(叔丁氧基羰基)氨基]环戊烷甲酸和同样市售的三氟乙酸/1-(2-氨基乙基)-1H-吡咯-2，5-二酮(1∶1)通过与HATU在N，N-二异丙基乙胺的存在下偶联，随后用TFA脱保护来制备标题化合物。
LC-MS(方法3)：Rt＝0.98min；MS(ESIpos)：m/z＝250(M-H)-。
中间体L52
三氟乙酸/N-(2-氨基乙基)-2-溴乙酰胺(1∶1)
将420mg(2.62mmol)(2-氨基乙基)氨基甲酸叔丁酯用50ml二氯甲烷吸收，并加入817mg(3.15mmol)溴代乙酸酐和913μl(5.24mmol)N，N-二异丙基乙胺。将反应物在RT下搅拌1h，然后在减压下浓缩。将残余物通过制备型HPLC纯化。
得到577mg受保护的中间体，然后将其用50ml二氯甲烷吸收，并加入10ml三氟乙酸。在RT下搅拌1h后，将反应物在减压下浓缩并将残余物从乙腈/水中冻干。得到705mg(理论值的65％)标题化合物。
LC-MS(方法3)：Rt＝0.34min；MS(ESIpos)：m/z＝181和183(M+H)+。
中间体L53
三氟乙酸/(1S，3S)-3-氨基-N-[2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]环戊烷甲酰胺(1∶1)
由市售的(1S，3S)-3-[(叔丁氧基羰基)氨基]环戊烷甲酸和同样市售的三氟乙酸/1-(2-氨基乙基)-1H-吡咯-2，5-二酮(1∶1)通过与HATU在N，N-二异丙基乙胺的存在下偶联，随后用TFA脱保护来制备标题化合物。
HPLC(方法11)：Rt＝0.19min；
LC-MS(方法3)：Rt＝0.88min；MS(ESIpos)：m/z＝250(M-H)-。
中间体L54
三氟乙酸/(1R，3S)-3-氨基-N-[2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]环戊烷甲酰胺(1∶1)
由市售的(1R，3S)-3-[(叔丁氧基羰基)氨基]环戊烷甲酸和同样市售的三氟乙酸/1-(2-氨基乙基)-1H-吡咯-2，5-二酮(1∶1)通过与HATU在N，N-二异丙基乙胺的存在下偶联，随后用TFA脱保护来制备标题化合物。
LC-MS(方法3)：Rt＝0.89min；MS(ESIpos)：m/z＝252(M+H)+。
中间体L55
三氟乙酸/N6-D-丙氨酰基-N2-{N-[6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-己酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酰基}-L-赖氨酸叔丁酯(1∶1)
通过以下步骤来制备标题化合物：首先将中间体L6与N-(叔丁氧基羰基)-D-丙氨酸在HATU的存在下偶联，然后通过在于DCM中的5％浓度的三氟乙酸中在RT下搅拌90分钟而在温和条件下在氨基处脱保护。
HPLC(方法11)：Rt＝1.35min；
LC-MS(方法1)：Rt＝0.67min；MS(ESIpos)：m/z＝637(M+H)+。
中间体L56
三氟乙酸/N-[6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酰基-N6-{[(1R，3S)-3-氨基环戊基]羰基}-L-赖氨酸叔丁酯(1∶1)
通过以下步骤来制备标题化合物：首先将中间体L6与(1R，3S)-3-[(叔丁氧基羰基)氨基]环戊烷甲酸在HATU的存在下偶联，然后通过在于DCM中的25％浓度三氟乙酸中在RT下搅拌15分钟而在温和条件下在氨基处脱保护。
HPLC(方法11)：Rt＝1.4min；
LC-MS(方法1)：Rt＝0.7min；MS(ESIpos)：m/z＝677(M+H)+。
中间体L57
(2S)-4-氧代-2-({[2-(三甲基硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)丁酸甲酯
首先将500.0mg(2.72mmol)L-天冬酰胺甲酯盐酸盐和706.3mg(2.72mmol)2，5-二氧代吡咯烷-1-甲酸2-(三甲基硅烷基)乙酯加入5.0ml 1，4-二噁烷中，并加入826.8mg(8.17mmol)三乙胺。将反应混合物在RT下搅拌过夜。将反应混合物通过制备型RP-HPLC直接纯化(柱：Reprosil 250×40；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)。然后将溶剂在减压下蒸发并将残余物在高真空下干燥。得到583.9mg(理论值的74％)化合物(3S)-4-甲氧基-4-氧代-3-({[2-(三甲基硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)丁酸。
LC-MS(方法1)：Rt＝0.89min；MS(ESIneg)：m/z＝290(M-H)-。
首先将592.9mg(3S)-4-甲氧基-4-氧代-3-({[2-(三甲基硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)丁酸加入10.0ml 1，2-二甲氧基乙烷中，将混合物冷却至-15℃，并加入205.8mg(2.04mmol)4-甲基吗啉和277.9mg(2.04mmol)氯甲酸异丁酯。15min后将沉淀物通过抽吸滤出，并用1，2-二甲氧基乙烷洗涤两次，每次10.0ml。将滤液冷却至-10℃，在剧烈搅拌下加入115.5mg(3.05mmol)溶解于10ml水中的硼氢化钠。分离各相，将有机相用饱和碳酸氢钠溶液和饱和NaCl溶液各洗涤一次。将有机相经硫酸镁干燥，将溶剂在减压下蒸发，并将残余物在高真空下干燥。得到515.9mg(理论值的91％)化合物N-{[2-(三甲基硅烷基)乙氧基]羰基}-L-高丝氨酸甲酯。
LC-MS(方法1)：Rt＝0.87min；MS(ESIpos)：m/z＝278(M+H)+。
首先将554.9mg(2.00mmol)N-{[2-(三甲基硅烷基)乙氧基]羰基}-L-高丝氨酸甲酯加入30.0ml二氯甲烷中，并加入1.27g(3.0mmol)戴斯-马丁过碘烷和474.7mg(6.00mmol)吡啶。将混合物在RT下搅拌过夜。4h后，将反应物用二氯甲烷稀释，并将有机相在每种情况下用10％浓度的Na2S2O3溶液、10％浓度的柠檬酸溶液和饱和碳酸氢钠溶液洗涤三次。将有机相经硫酸镁干燥，并将溶剂在减压下蒸发。得到565.7mg(理论值的97％)标题化合物。
1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ[ppm]＝0.03(s，9H)，0.91(m，2H)，2.70-2.79(m，1H)，2.88(dd，1H)，3.63(s，3H)，4.04(m，2H)，4.55(m，1H)，7.54(d，1H)，9.60(t，1H)。
中间体L58
(3-氧代丙基)氨基甲酸2-(三甲基硅烷基)乙酯
将434.4mg(5.78mmol)3-氨基-1-丙醇和1.50g(5.78mmol)2，5-二氧代吡咯烷-1-甲酸2-(三甲基硅烷基)乙酯溶解于10.0ml二氯甲烷中，加入585.3mg(5.78mmol)三乙胺，并将混合物在RT下搅拌过夜。将反应混合物用二氯甲烷稀释，并将有机相用水和饱和碳酸氢钠溶液洗涤，然后经硫酸镁干燥。将溶剂在减压下蒸发。将残余物(3-羟丙基)氨基甲酸2-(三甲基硅烷基)乙酯(996.4mg，理论值的79％)在高真空下干燥，并不经进一步纯化即用于下一合成步骤中。
首先将807.0mg(3.68mmol)(3-羟丙基)氨基甲酸2-(三甲基硅烷基)乙酯加入15.0ml氯仿和15.0ml 0.05N碳酸钾/0.05N碳酸氢钠溶液(1∶1)中。然后加入102.2mg(0.37mmol)四正丁基氯化铵、736.9mg(5.52mmol)N-氯代琥珀酰亚胺和57.5mg(0.37mmol)TEMPO，并将反应混合物在RT下剧烈搅拌过夜。将反应混合物用二氯甲烷稀释，并将有机相用水和饱和NaCl溶液洗涤。将有机相经硫酸镁干燥，并将溶剂在减压下蒸发。将残余物在高真空下干燥，并不经进一步纯化即用于下一合成步骤中(890.3mg)。
中间体L59
三氟乙酸/1-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙基}-1H-吡咯-2，5-二酮(1∶1)
首先将300.0mg(0.91mmol)(2-{2-[2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基]乙氧基}乙基)氨基甲酸叔丁酯加入二氯甲烷中，加入4.2g(36.54mmol)TFA，并将混合物在RT下搅拌1h(通过TLC监测：二氯甲烷/甲醇10∶1)。将挥发性组分在减压下蒸发，并将残余物与二氯甲烷共蒸馏四次。将残余物在高真空下干燥，并不经进一步纯化即用于下一合成步骤中。
LC-MS(方法1)：Rt＝0.19min；MS(ESIpos)：m/z＝229(M+H)+。
中间体L60
6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰氯
将200.0mg(0.95mmol)6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酸溶解于4.0ml二氯甲烷中，并加入338.0mg(2.84mmol)亚硫酰氯。将反应混合物在RT下搅拌3h，然后加入1滴DMF。将混合物再搅拌1h。将溶剂在减压下蒸发，将残余物与二氯甲烷共蒸馏三次。将粗产物不经进一步纯化即用于下一合成步骤中。
中间体L61
三氟乙酸/N-[6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酰基-L-赖氨酸2-(三甲基硅烷基)乙酯(1∶1)
首先，根据肽化学的经典方法，由N2-[(苄氧基)羰基]-N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸(使用EDCI/DMAP采用2-(三甲基硅烷基)乙醇酯化、氢解、与N-[(苄氧基)羰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酸在HATU的存在下偶联、并再一次氢解)来制备三肽衍生物L-缬氨酰基-L-丙氨酰基-N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸2-(三甲基硅烷基)乙酯。将该部分受保护的肽衍生物与市售的6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酸在HATU和N，N-二异丙基乙胺的存在下偶联来制备标题化合物。然后通过在于DCM中的5％浓度三氟乙酸中在RT下搅拌2.5小时而在温和条件下在氨基处脱保护，而保留酯保护基团。通过制备型HPLC进行后处理和纯化得到438mg标题化合物。
HPLC(方法11)：Rt＝1.69min；
LC-MS(方法1)：Rt＝0.78min；MS(ESIpos)：m/z＝610(M+H)+。
中间体L62
三氟乙酸/N-[6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-N5-氨基甲酰基-L-鸟氨酰基-L-赖氨酸2-(三甲基硅烷基)乙酯(1∶1)
首先，根据肽化学的经典方法，由N2-[(苄氧基)羰基]-N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸制备N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸2-(三甲基硅烷基)乙酯。然后将148mg(0.43mmol)该中间体在195mg(0.51mmol)HATU和149μl N，N-二异丙基乙胺的存在下与200mg(0.43mmol)中间体L16偶联。将残余物浓缩并通过制备型HPLC纯化后，将受保护的中间体用20ml DCM吸收，通过加入2ml三氟乙酸并在RT下搅拌1h来除去叔丁氧基羰基保护基团。将残余物从乙腈/水中浓缩并冻干得到254mg(理论值的63％，经2个步骤)。
HPLC(方法11)：Rt＝1.51min；
LC-MS(方法1)：Rt＝0.68min；MS(ESIpos)：m/z＝696(M+H)+。
中间体L63
(4S)-4-{[(2S)-2-{[(2S)-2-{[6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]氨基}-3-甲基丁酰基]氨基}丙酰基]氨基}-5-氧代-5-[2-(三甲基硅烷基)乙氧基]戊酸
首先，根据肽化学的经典方法，由(2S)-5-(苄氧基)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-5-氧代戊酸制备三肽衍生物(4S)-4-{[(2S)-2-{[(2S)-2-氨基-3-甲基丁酰基]氨基}丙酰基]氨基}-5-氧代-5-[2-(三甲基硅烷基)乙氧基]戊酸(使用EDCI/DMAP采用2-(三甲基硅烷基)乙醇酯化、用三氟乙酸除去Boc保护基团、与N-[(苄氧基)羰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酸在HATU的存在下偶联、并在10％钯活性炭上在甲醇中氢解)。通过将该部分受保护的肽衍生物与市售的1-{6-[(2，5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-6-氧代己基}-1H-吡咯-2，5-二酮偶联来制备标题化合物。通过制备型HPLC进行后处理和纯化得到601mg标题化合物。
LC-MS(方法1)：Rt＝0.96min；MS(ESIpos)：m/z＝611(M+H)+。
中间体L64
(4S)-4-{[(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}-5-氧代-5-[2-(三甲基硅烷基)乙氧基]戊酸
通过以下方法制备标题化合物：根据肽化学的经典方法，由(2S)-5-(苄氧基)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-5-氧代戊酸(使用EDCI/DMAP用2-(三甲基硅烷基)乙醇酯化、用三氟乙酸除去Boc保护基团、在10％钯活性炭上在甲醇中氢解裂解苄基酯、并与1-{2-[(2，5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-2-氧代乙基}-1H-吡咯-2，5-二酮在N，N-二异丙基乙胺的存在下偶联)。
LC-MS(方法1)：Rt＝0.84min；MS(ESIpos)：m/z＝385(M+H)+。
中间体L65
三氟乙酸/3-{[(苄氧基)羰基]氨基}-L-丙氨酸2-(三甲基硅烷基)乙酯(1∶1)
根据肽化学的经典方法，由3-{[(苄氧基)羰基]氨基}-N-(叔丁氧基羰基)-L-丙氨酸(使用EDCI/DMAP用2-(三甲基硅烷基)乙醇酯化、并用三氟乙酸除去Boc保护基团)来制备标题化合物。得到373mg(理论值的79％，经2个步骤)标题化合物。
LC-MS(方法1)：Rt＝0.72min；MS(ESIpos)：m/z＝339(M+H)+。
中间体L66
(8S)-8-(2-羟乙基)-2，2-二甲基-6，11-二氧代-5-氧杂-7，10-二氮杂-2-硅杂十四烷-14-酸甲酯
首先将1000mg(2.84mmol)(3S)-3-{[(苄氧基)羰基]氨基}-4-[(叔丁氧基羰基)氨基]丁酸加入10.0ml 1，2-二甲氧基乙烷中，并加入344.4mg(3.4mmol)4-甲基吗啉和504mg(3.69mmol)氯甲酸异丁酯。在RT下搅拌10min后，将反应物冷却至5℃，并在剧烈搅拌下每次少许地加入溶解于3ml水中的161mg(4.26mmol)硼氢化钠。1h后，再加入相同量的硼氢化钠，然后将反应物缓慢温热至RT。加入170ml水，然后将反应物萃取四次，每次用200ml乙酸乙酯。分离各相并将有机相用柠檬酸洗涤一次然后用饱和碳酸氢钠溶液洗涤一次。将有机相经硫酸镁干燥，将溶剂在减压下蒸发并将残余物在高真空下干燥。得到760mg(理论值的78％)化合物[(2S)-4-羟基丁烷-1，2-二基]二氨基甲酸苄基叔丁酯。
LC-MS(方法1)：Rt＝0.84min；MS(ESIpos)：m/z＝339(M+H)+。
将溶解于13ml氯化氢/二噁烷中的760mg(2.16mmol)该中间体在RT下搅拌20min。然后将反应物浓缩至5ml，并加入二乙醚。将沉淀物滤出并从乙腈/水1∶1中冻干。
将以这种方式获得的产物溶解于132ml DMF中，加入345.5mg(2.35mmol)4-甲氧基-4-氧代丁酸、970mg(2.55mmol)HATU和1025μlN，N-二异丙基乙胺。将混合物在RT下搅拌5min。将溶剂在减压下去除，并将留下的残余物通过制备型HPLC纯化。将适当的流份合并，并将乙腈在减压下蒸发。将留下的水相用乙酸乙酯萃取两次，然后将有机相在高真空下浓缩并干燥。
将以这种方式获得的中间体用甲醇吸收，并在10％钯活性炭上在RT下在氢标准压力下氢化1h。然后将催化剂滤出，并将溶剂在减压下去除。
将247mg该脱保护的化合物用20ml DMF吸收，并加入352mg(1.36mmol)1-({[2-(三甲基硅烷基)乙氧基]羰基}氧基)吡咯烷-2，5-二酮和592μl N，N-二异丙基乙胺。将反应混合物在RT下搅拌1h，然后浓缩，并将残余物通过制备型HPLC纯化。然后将溶剂在减压下蒸发，并将残余物在高真空下干燥。经这5个反应步骤，得到218mg标题化合物，总收率21％。
LC-MS(方法1)：Rt＝0.74min；MS(ESIpos)：m/z＝363(M+H)+。
中间体L67
三氟乙酸/2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基-β-丙氨酸酯(1∶1)
由50mg(0.354mmol)市售的1-(2-羟乙基)-1H-吡咯-2，5-二酮通过与134mg(0.71mmol)N-(叔丁氧基羰基)-β-丙氨酸在10ml二氯甲烷中在1.5当量EDCI和0.1当量4-N，N-二甲基氨基吡啶的存在下偶联，随后用三氟乙酸脱保护来制备标题化合物。
收率：56mg(理论值的48％，经2个步骤)
LC-MS(方法3)：Rt＝1.15min；MS(ESIpos)：m/z＝213(M+H)+。
中间体L68
三氟乙酸/N-(2-氨基乙基)-2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)丙酰胺(1∶1)
以类似于中间体L1的方法，根据肽化学的经典方法，由市售的(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)丙酸和(2-氨基乙基)氨基甲酸叔丁酯来制备标题化合物。
LC-MS(方法1)：Rt＝0.17min；MS(ESIpos)：m/z＝212(M+H)+。
中间体L69
三氟乙酸/1-[(苄氧基)羰基]哌啶-4-基-L-缬氨酰基-N5-氨基甲酰基-L-鸟氨酸酯(1∶1)
通过肽化学的经典方法，由市售的4-羟基哌啶-1-甲酸苄基酯通过使用EDCI/DMAP用N2-(叔丁氧基羰基)-N5-氨基甲酰基-L-鸟氨酸酯化、随后用TFA除去Boc、然后与N-[(叔丁氧基)羰基]-L-缬氨酸在HATU和N，N-二异丙基乙胺的存在下偶联、最后用TFA除去另一个Boc来制备标题化合物。
LC-MS(方法1)：Rt＝0.62min；MS(ESIpos)：m/z＝492(M+H)+。
中间体L70
(3-氧代丙基)氨基甲酸9H-芴-9-基甲酯
首先将1000.0mg(3.36mmol)(3-羟丙基)氨基甲酸9H-芴-9-基甲酯加入15.0ml氯仿和15.0ml 0.05N碳酸钾/0.05N碳酸氢钠溶液(1∶1)中。然后加入93.5mg(0.34mmol)四正丁基氯化铵、673.6mg(5.04mmol)N-氯代琥珀酰亚胺和52.5mg(0.34mmol)TEMPO，并将反应混合物在RT下剧烈搅拌过夜。将反应混合物用二氯甲烷稀释，并将有机相用水和饱和NaCl溶液洗涤。将有机相经硫酸镁干燥，并将溶剂在减压下蒸发。将残余物在高真空下干燥，并通过硅胶色谱纯化(流动相：环己烷/乙酸乙酯3∶1-1∶1)。将溶剂在减压下蒸发，并将残余物在高真空下干燥。得到589.4mg(理论值的58％)标题化合物。
LC-MS(方法6)：Rt＝2.15min；MS(ESIpos)：m/z＝296(M-H)+。
中间体L71
[4-(氯羰基)苯基]氨基甲酸叔丁酯
首先将100.0mg(0.42mmol)4-[(叔丁氧基羰基)氨基]苯甲酸加入2.0ml二氯甲烷中，并加入64.2mg(0.51mmol)草酰氯。将反应混合物在RT下搅拌30min(通过TLC监测：二氯甲烷/甲醇)。然后再加入192.6mg(1.53mmol)草酰氯和1滴DMF，并将混合物在RT下搅拌1h。将溶剂在减压下蒸发，并将残余物与二氯甲烷反复地共蒸馏。将残余物不经进一步纯化即用于下一合成步骤中。
中间体L72
(9S)-9-(羟甲基)-2，2-二甲基-6，11-二氧代-5-氧杂-7，10-二氮杂-2-硅杂十四烷-14-酸苄基酯
通过以下方法来制备标题化合物：根据肽化学的经典方法由市售的[(2S)-3-羟基丙烷-1，2-二基]二氨基甲酸苄基叔丁酯通过氢解除去Z保护基团、随后与4-(苄氧基)-4-氧代丁酸在EDCI/HOBT的存在下偶联、然后用TFA除去Boc保护基团、最后与1-({[2-(三甲基硅烷基)乙氧基]羰基}氧基)吡咯烷-2，5-二酮在三乙胺的存在下反应。
LC-MS(方法1)：Rt＝0.94min；MS(ESIpos)：m/z＝425[M+H]+。
中间体L73
N-(2-氨基乙基)-6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯1-基)己酰胺
将395.5mg(1.87mmol)6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酸、1.21g(9.36mmol)N，N-二异丙基乙胺和854.3mg(2.25mmol)HATU加入于20ml二甲基甲酰胺中的300mg(1.87mmol)(2-氨基乙基)氨基甲酸叔丁酯的溶液中。将反应混合物在RT下搅拌5分钟。将混合物浓缩后，将残余物用DCM吸收并用水洗涤。将有机相用饱和盐水洗涤，经硫酸镁干燥，滤出并浓缩。得到408mg(33％，纯度53％)标题化合物，将其不经进一步纯化而使用。
LC-MS(方法1)：Rt＝0.75min；MS(ESIpos)：m/z＝354(M+H)+。
将1ml TFA加入(2-{[6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]氨基}乙基)氨基甲酸叔丁酯(408mg，0.365mmol)于7ml二氯甲烷中的溶液中。将反应混合物在RT下搅拌0.5h。将反应混合物在减压下浓缩，并将残余物与二氯甲烷共蒸馏两次。将残余物不经进一步纯化而使用。得到384mg(94％，纯度57％)标题化合物。
LC-MS(方法1)：Rt＝0.26min；MS(ESIpos)：m/z＝254(M+H)+。
中间体L74
3-[2-[2-[2-[2-[[2-(2，5-二氧代吡咯-1-基)乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸
将107mg(0.335mmol)3-[2-[2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸叔丁酯和93mg(0.369mmol)2-(2，5-二氧代吡咯-1-基)乙酸2，5-二氧代吡咯烷-1-基酯溶解于5ml二甲基甲酰胺中，并加入0.074ml(0.671mmol)N-甲基吗啉。将反应混合物在RT下搅拌过夜。加入0.048ml(0.838mmol)乙酸，并将反应混合物通过制备型RP-HPLC直接纯化(柱：Reprosil 125×30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水/0.1％TFA)。将溶剂在减压下蒸发并将残余物在高真空下干燥。得到133mg(86％，纯度100％)3-[2-[2-[2-[2-[[2-(2，5-二氧代吡咯1-基)乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸叔丁酯。
LC-MS(方法1)：Rt＝0.82min；MS(ESIpos)：m/z＝459(M+H)+。
将0.5ml TFA加入3-[2-[2-[2-[2-[[2-(2，5-二氧代吡咯-1-基)乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸叔丁酯(130mg，0.284mmol)于5ml二氯甲烷中的溶液中。将反应混合物在RT下搅拌过夜。将反应混合物在减压下浓缩，并将残余物用水吸收并冻干。将残余物不经进一步纯化而使用。得到102mg(90％，纯度100％)标题化合物。
LC-MS(方法1)：Rt＝0.52min；MS(ESIpos)：m/z＝402(M+H)+。
中间体L75
三氟乙酸/3-{[(苄氧基)羰基]氨基}-D-丙氨酸2-(三甲基硅烷基)乙酯(1∶1)
根据肽化学的经典方法，由3-{[(苄氧基)羰基]氨基}-N-(叔丁氧基羰基)-D-丙氨酸(使用EDCI/DMAP用2-三甲基硅烷基乙醇酯化、并用三氟乙酸除去Boc保护基团)来制备标题化合物。得到405mg(理论值的58％，经2个步骤)标题化合物。
LC-MS(方法1)：Rt＝0.75min；MS(ESIpos)：m/z＝339(M+H)+。
中间体L76
(2S)-2-溴-4-氧代-4-[2-(三甲基硅烷基)乙氧基]丁酸
首先，根据肽化学的经典方法，由(3S)-4-(苄氧基)-3-{[(苄氧基)羰基]氨基}-4-氧代丁酸(使用EDCI/DMAP用2-三甲基硅烷基乙醇酯化、并氢解除去Z保护基团和苄基酯)来制备经适当保护的天冬氨酸衍生物。
将以这种方式获得的470mg(1.8mmol)(2S)-2-氨基-4-氧代-4-[2-(三甲基硅烷基)乙氧基]丁酸悬浮于10ml水中，加入1.8ml 1摩尔盐酸和0.5ml浓硫酸，然后加入863mg(7.25mmol)溴化钾。然后，在10℃下，历时30min逐滴加入150mg(2.175mmol)亚硝酸钠于1ml水中的溶液，并将混合物在10-15℃下搅拌2h。然后将混合物用50ml乙酸乙酯萃取。将有机相用饱和氯化钠溶液洗涤并经硫酸镁干燥。将溶剂蒸发并将产物通过制备型HPLC纯化得到260mg(理论值的48％)标题化合物。
LC-MS(方法1)：Rt＝1.03min；MS(ESIneg)：m/z＝295和297(M-H)-。
1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ[ppm]＝0.03(s，9H)，0.95(t，2H)，2.94和3.2(2dd，2H)，4.18(t，2H)，4.57(t，1H)。
中间体L77
三氟乙酸/N-[2-(2-氨基乙氧基)乙基]-2-溴乙酰胺(1∶1)
首先将418mg(2.05mmol)[2-(2-氨基乙氧基)乙基]氨基甲酸叔丁酯与638mg(2.46mmol)溴代乙酸酐反应，然后用三氟乙酸除去Boc保护基团。得到551mg(理论值的63％，经2个步骤)标题化合物。
LC-MS(方法)：Rt＝0.32min；MS(ESIpos)：m/z＝227和225(M+H)+。
中间体L78
N-[(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]-β-丙氨酸
由市售的(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酸通过与β-丙氨酸叔丁酯盐酸盐(1∶1)在EDCI/HOBt和N，N-二异丙基乙胺的存在下偶联，随后用三氟乙酸脱保护来制备标题化合物。
LC-MS(方法1)：Rt＝0.32min；MS(ESIpos)：m/z＝227(M+H)+。
中间体L79
N-[(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-β-丙氨酸
将64.8mg(0.357mmol)β-丙氨酸叔丁酯盐酸盐(1∶1)和100mg(0.324mmol)1-{6-[(2，5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-6-氧代己基}-1H-吡咯-2，5-二酮溶解于4ml二甲基甲酰胺中，并加入65.6mg(0.649mmol)N-甲基吗啉。将反应混合物在RT下搅拌过夜。加入0.048ml(0.838mmol)乙酸，并将反应混合物通过制备型RP-HPLC直接纯化(柱：Reprosil 250×30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水/0.1％TFA)。将溶剂在减压下蒸发，并将残余物在高真空下干燥。得到84.5mg(77％，纯度100％)N-[6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-β-丙氨酸叔丁酯。
LC-MS(方法1)：Rt＝0.78min；MS(ESIpos)：m/z＝339(M+H)+。
将1.62ml TFA加入N-[6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-β-丙氨酸叔丁酯(82.8mg，0.244mmol)于8ml二氯甲烷中的溶液中。将反应混合物在RT下搅拌2小时。将反应混合物在减压下浓缩，并将残余物用水吸收并冻干。将残余物不经进一步纯化而使用。得到62.7mg(87％，纯度95％)标题化合物。
LC-MS(方法1)：Rt＝0.75mi0；MS(ESIpos)：m/z＝283(M+H)+。
中间体L80
3-[(15-氨基-4，7，10，13-四氧杂十五烷-1-酰基)氨基]-N-(叔丁氧基羰基)-D-丙氨酸2-(三甲基硅烷基)乙酯
根据肽化学的经典方法，由市售的3-{[(苄氧基)羰基]氨基}-N-(叔丁氧基羰基)-D-丙氨酸/N-环己基环己胺(1∶1)(从盐中释放并使用EDCI/DMAP用2-(三甲基硅烷基)乙醇酯化、氢解除去Z保护基团、与市售的3-氧代-1-苯基-2，7，10，13，16-五氧杂-4-氮杂十九烷-19-酸在HATU和N，N-二异丙基乙胺的存在下偶联、并再一次氢解除去Z保护基团)来制备标题化合物。
LC-MS(方法1)：Rt＝0.70min；MS(ESIpos)：m/z＝552(M+H)+。
中间体L81
三氟乙酸/{2-[(2-氨基乙基)磺酰基]乙基}氨基甲酸苄基酯(1∶1)
将250mg(1.11mmol)2，2′-磺酰基二乙胺与92.3mg(0.37mmol)1-{[(苄氧基)羰基]氧基}吡咯烷-2，5-二酮在N，N-二异丙基乙胺的存在下在DMF中偶联。随后通过HPLC纯化得到70mg(理论值的47％)标题化合物。
LC-MS(方法12)：Rt＝0.64min；MS(ESIpos)：m/z＝257.11(M+H)+。
中间体L82
三氟乙酸/N-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙基}-6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺(1∶1)
将88.6mg(0.357mmol)N-Boc-2，2′-(乙烯二氧基)二乙胺和100mg(0.324mmol)6-马来酰亚胺基己酸N-琥珀酰亚胺酯溶解于4.0ml二甲基甲酰胺中，并加入0.071ml(0.650mmol)N-甲基吗啉。将反应混合物在RT下搅拌过夜。加入0.048ml(0.838mmol)乙酸，并将反应混合物通过制备型RP-HPLC直接纯化(柱：Reprosil 125×30；10μ，流速：75ml/min，MeCN/水/0.1％TFA)。将溶剂在减压下蒸发，并将残余物在高真空下干燥。得到127mg(理论值的81％){2-[2-(2-{[6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]氨基}乙氧基)乙氧基]乙基}氨基甲酸叔丁酯。
LC-MS(方法1)：Rt＝0.78min；MS(ESIpos)：m/z＝442(M+H)+。
将2.0ml TFA加入123mg(225μmol){2-[2-(2-{[6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]氨基}乙氧基)乙氧基]乙基}氨基甲酸叔丁酯于7.5ml二氯甲烷中的溶液中。将反应混合物在RT下搅拌2h。将反应混合物在减压下浓缩，并将残余物用水吸收并冻干。将残余物不经进一步纯化而使用。得到111mg(理论值的100％)标题化合物。
LC-MS(方法1)：Rt＝0.31min；MS(ESIpos)：m/z＝342(M+H)+。
1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ[ppm]＝1.17(m，2H)，1.47(m，4H)，2.04(m，2H)，2.98(m，2H)，3.19(m，2H)，3.39(m，4H)，3，56(m，6H)，7.01(s，2H)，7.72(bs，3H)，7.80(m，1H)。
中间体L83
三氟乙酸/N-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙基}-2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰胺(1∶1)
将200mg(0.805mmol){2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙基}氨基甲酸叔丁酯、150mg(0.966mmol)(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酸和560μl(3.2mmol)N，N-二异丙基乙胺溶解于10ml二甲基甲酰胺中，并加入459mg(1.21mmol)HATU。将反应混合物在RT下搅拌30分钟。将溶剂在减压下蒸发，并将残余物溶解于二氯甲烷中。将有机相用5％浓度的柠檬酸溶液洗涤两次并经硫酸镁干燥，并将溶剂在减压下蒸发。将残余物使用BiotageIsolera纯化(硅胶，柱25g SNAP，二氯甲烷∶甲醇98∶2)。得到276mg(理论值的89％){2-[2-(2-{[(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙氧基)乙氧基]乙基}氨基甲酸叔丁酯。
LC-MS(方法1)：Rt＝0.67min；MS(ESIpos)：m/z＝386(M+H)+。
将4ml TFA加入{2-[2-(2-{[(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙氧基)乙氧基]乙基}氨基甲酸叔丁酯(275mg，714μmol)于15ml二氯甲烷中的溶液中。将反应混合物在RT下搅拌30分钟。将反应混合物在减压下浓缩，并将残余物用水吸收并冻干。得到281mg(理论值的99％)标题化合物。
LC-MS(方法1)：Rt＝0.17min；MS(ESIpos)：m/z＝286(M+H)+。
中间体L84
三氟乙酸/N-(14-氨基-3，6，9，12-四氧杂十四烷-1-基)-6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺(1∶1)
将200mg(0.594mmol)(14-氨基-3，6，9，12-四氧杂十四烷-1-基)氨基甲酸叔丁酯和202mg(0.654mmol)1-{6-[(2，5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-6-氧代己基}-1H-吡咯-2，5-二酮溶解于4.0ml二甲基甲酰胺中，加入0.130ml(1.2mmol)N-甲基吗啉。将反应混合物在RT下搅拌过夜。加入0.085ml(1.5mmol)乙酸，并将反应混合物通过制备型RP-HPLC直接纯化(柱：Reprosil 125×30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水/0.1％TFA)。将溶剂在减压下蒸发，并将残余物在高真空下干燥。得到275mg(理论值的73％)[21-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-16-氧代-3，6，9，12-四氧杂-15-氮杂二十一碳-1-基]氨基甲酸叔丁酯。
LC-MS(方法1)：Rt＝0.81min；MS(ESIpos)：m/z＝530(M+H)+。
将780μl(10mmol)TFA加入[21-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-16-氧代-3，6，9，12-四氧杂-15-氮杂二十一碳-1-基]氨基甲酸叔丁酯(268mg，505μmol)于5.0ml二氯甲烷中的溶液中。将反应混合物在RT下搅拌过夜。将反应混合物在减压下浓缩，并将残余物用水吸收并冻干。将残余物不经进一步纯化而使用。得到266mg(理论值的97％)标题化合物。
LC-MS(方法1)：Rt＝0.46min；MS(ESIpos)：m/z＝430(M+H)+。
1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ[ppm]＝1.17(m，2H)，1.47(m，4H)，2.03(m，2H)，2.99(m，2H)，3.18(m，2H)，3.38(m，4H)，3，52(m，8H)，3，58(m，6H)，7.01(s，2H)，7.73(bs，3H)，7.80(m，1H)。
中间体L85
三氟乙酸/N-(14-氨基-3，6，9，12-四氧杂十四烷-1-基)-2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰胺(1∶1)
将200mg(0.594mmol)(14-氨基-3，6，9，12-四氧杂十四烷-1-基)氨基甲酸叔丁酯、111mg(0.713mmol)(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酸和410μl(2.4mmol)N，N-二异丙基乙胺溶解于6ml二甲基甲酰胺中，并加入339mg(0.892mmol)HATU。将反应混合物在RT下搅拌1h并通过制备型RP-HPLC直接纯化(柱：Reprosil 250×30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水/0.1％TFA)。将溶剂在减压下蒸发，并将残余物在高真空下干燥。得到130mg(理论值的43％)[17-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-16-氧代-3，6，9，12-四氧杂-15-氮杂十七烷-1-基]氨基甲酸叔丁酯。
LC-MS(方法1)：Rt＝0.71min；MS(ESIpos)：m/z＝474(M+H)+。
将410μl(5.3mmol)TFA加入[17-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-16-氧代-3，6，9，12-四氧杂-15-氮杂十七烷-1-基]氨基甲酸叔丁酯(126mg，267μmol)于4.0ml二氯甲烷中的溶液中。将反应混合物在RT下搅拌过夜。将反应混合物在减压下浓缩，并将残余物在高真空下干燥。得到124mg(理论值的95％)标题化合物。
LC-MS(方法13)：Rt＝0.74min；MS(ESIpos)：m/z＝374(M+H)+。
1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ[ppm]＝2.99(m，2H)，3.22(m，2H)，3.41(m，2H)，3，53(m，8H)，3，58(m，6H)，4.02(s，2H)，7.09(s，2H)，7.73(bs，3H)，8.21(m，1H)。
中间体L86
N-[(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酸
将100mg(0.531mmol)L-缬氨酰基-L-丙氨酸和134mg(0.531mmol)1-{2-[(2，5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-2-氧代乙基}-1H-吡咯-2，5-二酮溶解于3ml二甲基甲酰胺中，并加入0.150ml(1.1mmol)三乙胺。将反应混合物在RT下搅拌8h。将反应混合物通过制备型RP-HPLC直接纯化(柱：Reprosil 250×30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水)。将溶剂在减压下蒸发，并将残余物在高真空下干燥。得到71.5mg(理论值的41％)标题化合物。
LC-MS(方法1)：Rt＝0.42min；MS(ESIpos)：m/z＝326(M+H)+。
中间体L87
3-[2-(2-{[(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙氧基)乙氧基]丙酸
将250mg(1.07mmol)3-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]丙酸叔丁酯、151mg(0.974mmol)2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酸、224mg(1.46mmol)1-羟基-1H-苯并三唑水合物和224mg(1.17mmol)1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐溶解于5.0ml二甲基甲酰胺中。将反应混合物在RT下搅拌1h。加入乙酸乙酯，并将混合物用5％浓度的柠檬酸溶液萃取两次并用饱和碳酸氢钠溶液萃取两次。将有机相用饱和氯化钠溶液洗涤两次并经硫酸镁干燥，并将溶剂在减压下蒸发。将残余物通过制备型RP-HPLC纯化(柱：Reprosil 250×40；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水/0.1％TFA)。将溶剂在减压下蒸发并将残余物在高真空下干燥。得到267mg(理论值的64％)3-[2-(2-{[(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙氧基)乙氧基]丙酸叔丁酯。
LC-MS(方法1)：Rt＝0.73min；MS(ESIpos)：m/z＝371(M+H)+。
将1.1ml(14mmol)TFA加入3-[2-(2-{[(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙氧基)乙氧基]丙酸叔丁酯(263mg，710μmol)于10ml二氯甲烷中的溶液中。将反应混合物在RT下搅拌过夜。将反应混合物在减压下浓缩并将残余物在高真空下干燥。得到240mg(理论值的94％)标题化合物。
LC-MS(方法12)：Rt＝0.57min；MS(ESIpos)：m/z＝315(M+H)+。
中间体L88
N-[6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酸2，5-二氧代吡咯烷-1-基酯
将150mg(0.797mmol)L-缬氨酰基-L-丙氨酸和246mg(0.797mmol)1-{6-[(2，5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-6-氧代己基}-1H-吡咯-2，5-二酮溶解于4.0ml二甲基甲酰胺中，并加入0.220ml(1.6mmol)三乙胺。将反应混合物在RT下搅拌过夜。将反应混合物通过制备型RP-HPLC直接纯化(柱：Reprosil 250×30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水)。将溶剂在减压下蒸发，并将残余物在高真空下干燥。得到302mg(理论值的97％)N-[6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酸。
LC-MS(方法12)：Rt＝1.02min；MS(ESIpos)：m/z＝382(M+H)+。
1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ[ppm]＝0.82(dd，6H)，1.17(m，2H)，1.27(d，3H)，1.48(m，4H)，1.94(m，1H)，2.13(m，2H)，3.38(t，2H)，4.17(m，2H)，7.00(s，2H)，7.75(d，1H)，8.19(d，1H)。
将130mg(0.531mmol)N-[6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酸溶解于6.5ml二氯甲烷中，并加入58.8mg(0.511mmol)1-羟基吡咯烷-2，5-二酮和78.4mg(0.409mmol)1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐。再加入58.8mg(0.511mmol)1-羟基吡咯烷-2，5-二酮和78.4mg(0.409mmol)1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐。加入二氯甲烷，并将混合物用水洗涤三次。将有机相经硫酸镁干燥，将溶剂在减压下蒸发，并将残余物在高真空下干燥。得到172mg(理论值的87％)标题化合物。
LC-MS(方法12)：Rt＝1.28min；MS(ESIpos)：m/z＝479(M+H)+。
中间体L89
5-[2-(三甲基硅烷基)乙基]-L-谷氨酸1-苄基酯盐酸盐(1∶1)
首先将1.00g(2.96mmol)(4S)-5-(苄氧基)-4-[(叔丁氧基羰基)氨基]-5-氧代戊酸加入13.0ml THF中，并加入510μl(3.6mmol)2-(三甲基硅烷基)乙醇和109mg(889μmol)4-二甲基氨基吡啶。将反应混合物冷却至0℃，并加入682mg(3.56mmol)N-乙基-N′-3-(二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐。将反应混合物在RT下搅拌过夜。将溶剂在减压下蒸发，并将残余物溶解于乙酸乙酯中。将有机相用0.1N HCl溶液和饱和氯化钠溶液洗涤两次并经硫酸镁干燥，并将溶剂在减压下蒸发。将残余物使用Biotage Isolera纯化(硅胶，柱25g SNAP，环己烷：乙酸乙酯80∶20)。得到649mg(理论值的50％)化合物5-[2-(三甲基硅烷基)乙基]-N-(叔丁氧基羰基)-L-谷氨酸1-苄基酯。
LC-MS(方法1)：Rt＝4.6min；MS(ESIpos)：m/z＝438(M+H)+。
将649mg(1.48mmol)5-[2-(三甲基硅烷基)乙基]-N-(叔丁氧基羰基)-L-谷氨酸1-苄基酯溶解于7.0ml二噁烷中，并在冰浴冷却下加入于二噁烷中的14ml(59mmol)4N HCl中。将反应混合物在RT下搅拌过夜。将反应混合物在减压下浓缩，并将残余物在高真空下干燥并通过Biotage Isolera纯化(硅胶，柱：25g SNAP，二氯甲烷∶甲醇90∶10)。得到320mg(理论值的57％)标题化合物。
LC-MS(方法1)：Rt＝0.79min；MS(ESIpos)：m/z＝338(M+H)+。
中间体L90
1-({N-[(苄氧基)羰基]甘氨酰基}氨基)-3，6，9，12-四氧杂十五烷-15-酸
首先将118mg(566μmol)N-[(苄氧基)羰基]甘氨酸加入5.0ml DMF中，加入200mg(622μmol)1-氨基-3，6，9，12-四氧杂十五烷-15-酸叔丁酯、130mg(849μmol)1-羟基-1H-苯并三唑水合物和130mg(679μmol)1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐，并将混合物在RT下搅拌1h。加入乙酸乙酯，并将混合物用5％浓度的柠檬酸溶液萃取两次并用饱和碳酸氢钠溶液萃取两次。将有机相用饱和氯化钠溶液洗涤两次并经硫酸镁干燥。将溶剂在减压下蒸发，并将残余物在高真空下干燥。得到274mg(理论值的95％)1-({N-[(苄氧基)羰基]甘氨酰基}氨基)-3，6，9，12-四氧杂十五烷-15-酸叔丁酯。
LC-MS(方法12)：Rt＝1.69min；MS(ESIpos)：m/z＝513(M+H)+。
将820μl(11mmol)TFA加入274mg(535μmol)1-({N-[(苄氧基)羰基]甘氨酰基}氨基)-3，6，9，12-四氧杂十五烷-15-酸叔丁酯于5.0ml二氯甲烷中的溶液中。将反应混合物在RT下搅拌3h。将反应混合物在减压下浓缩，并将残余物用水吸收并冻干。得到262mg(理论值的100％)标题化合物。
LC-MS(方法12)：Rt＝1.12min；MS(ESIpos)：m/z＝457(M+H)+。
中间体L91
三氟乙酸/1-{[3-氨基-N-(叔丁氧基羰基)-D-丙氨酰基]氨基}-3，6，9，12-四氧杂十五烷-15-酸2-(三甲基硅烷基)乙酯(1∶1)
通过肽化学的经典方法，由市售的3-氧代-1-苯基-2，7，10，13，16-五氧杂-4-氮杂十九烷-19-酸(使用EDCI/DMAP用2-三甲基硅烷基乙醇酯化、氢解除去z保护基团、与市售的N-(叔丁氧基羰基)-3-{[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基}-D-丙氨酸偶联、并除去Fmoc保护基团)来制备标题化合物。
LC-MS(方法1)：Rt＝0.74min；MS(ESIpos)：m/z＝552(M+H)+。
中间体L95
N-[(苄氧基)羰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酸
使用肽化学的经典方法，由N-[(苄氧基)羰基]-L-缬氨酸和L-丙氨酸叔丁酯盐酸盐(1∶1)来制备该中间体。
LC-MS(方法12)：Rt＝1.34min；MS(ESIpos)：m/z＝323.16(M+H)+。
中间体L96
N-乙酰基-L-缬氨酰基-N5-氨基甲酰基-L-鸟氨酰胺
通过肽化学的经典方法，由N-[(苄氧基)羰基]-L-缬氨酸2，5-二氧代吡咯烷-1-基酯与N5-氨基甲酰基-L-鸟氨酸的偶联起始、然后经10％钯/活性炭在乙醇中氢解除去z保护基团、最后将所得二肽与1-乙酰氧基吡咯烷-2，5-二酮反应来制备该中间体。
LC-MS(方法1)：Rt＝0.25min；MS(ESIpos)：m/z＝317(M+H)+。
中间体L97
1-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-2-氧代-6，9，12，15，18，21，24，27-八氧杂-3-氮杂三十烷-30-酸
首先将1-氨基-3，6，9，12，15，18，21，24-八氧杂二十七烷-27-酸叔丁酯(100mg，201μmol)加入1.0ml DMF中，并加入(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酸(46.8mg，301μmol)、1-羟基-1H-苯并三唑水合物(76.9mg，502μmol)和1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐(77.0mg，402μmol)。将反应混合物在RT下搅拌过夜，然后加入乙酸乙酯。将有机相用5％浓度的柠檬酸溶液洗涤两次、用饱和碳酸氢钠溶液洗涤两次然后用饱和氯化钠溶液洗涤两次。将有机相经硫酸镁干燥。将溶剂在减压下蒸发，并将残余物通过制备型RP-HPLC纯化(柱：Reprosil 125×30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水/0.1％TFA)。将溶剂在减压下蒸发，并将残余物在高真空下干燥。得到19.1mg(理论值的13％)化合物1-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-2-氧代-6，9，12，15，18，21，24，27-八氧杂-3-氮杂三十烷-30-酸叔丁酯。
LC-MS(方法1)：Rt＝0.87min；MS(ESIpos)：m/z＝635[M+H]+。
将TFA(62μl，600μmol)加入1-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-2-氧代-6，9，12，15，18，21，24，27-八氧杂-3-氮杂三十烷-30-酸叔丁酯(19.1mg，30.1μmol)于1.0mlDCM中的溶液中。将反应混合物在RT下搅拌3h。将反应混合物在减压下浓缩，并将残余物用水吸收并冻干。将残余物不经进一步纯化而使用。得到10.8mg(理论值的46％)标题化合物。
LC-MS(方法1)：Rt＝0.55min；MS(ESIneg)：m/z＝577[M-H]-。
中间体L98
2，2-二甲基丙酸/N-(2-氨基乙基)-N2-{[2-(三甲基硅烷基)乙氧基]羰基}-L-谷氨酰胺2-(三甲基硅烷基)乙酯(1∶1)
首先，将(4S)-5-叔丁氧基-4-[(叔丁氧基羰基)氨基]-5-氧代戊酸在HATU和N，N-二异丙基乙胺的存在下与(2-氨基乙基)氨基甲酸苄基酯偶联。然后，使用三氟乙酸在DCM中将Boc保护基团和叔丁基酯裂解。随后，首先通过与1-({[2-(三甲基硅烷基)乙氧基]羰基}氧基)吡咯烷-2，5-二酮在DMF/水中在N，N-二异丙基乙胺的存在下反应而将氨基再次保护，然后通过与2-(三甲基硅烷基)乙醇在DCM中在EDCI/DMAP的存在下反应而将羧基保护。在最后的步骤中，通过在乙醇中在标准压力下在10％钯活性炭上的氢解而将末端氨基脱保护。将催化剂通过过滤去除，将残余物浓缩、通过制备型HPLC纯化并从乙腈/水中冷冻干燥得到标题化合物。
LC-MS(方法1)：Rt＝0.82min；MS(ESIpos)：m/z＝434(M+H)+。
中间体L99
三氟乙酸/N-[(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酰基-β-丙氨酰基-L-赖氨酸2-(三甲基硅烷基)乙酯(1∶1)
首先，由N2-[(苄氧基)羰基]-N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸起始，通过肽化学的经典方法来制备N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸2-(三甲基硅烷基)乙酯。然后，在HATU和N，N-二异丙基乙胺的存在下使用经标准方法制备的三肽结构单元(building block)N-[(苄氧基)羰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酰基-β-丙氨酸来偶联该中间体。随后，通过氢解和甲醇除去z保护基团，并将所得中间体与(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酸在HATU和N，N-二异丙基乙胺的存在下偶联。在最后的步骤中，通过在于DCM中的10％浓度的三氟乙酸中在RT下搅拌1h而在温和条件下将侧链氨基脱保护。浓缩并从乙腈/水中冷冻干燥得到标题化合物。
LC-MS(方法1)：Rt＝0.64min；MS(ESIpos)：m/z＝625(M+H)+。
中间体1100
3-[5-(2-{[(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙基)-1，2，4- 噁二唑-3-基]丙酸
将461mg(6.60mmol)羟胺盐酸盐和1341.86mg(13.26mmol)三乙胺加入3-氰基丙酸甲酯(500mg，4.42mmol)于40ml乙醇中的溶液中。将反应混合物在50℃下搅拌3h。将混合物浓缩，并将残余物溶解于乙酸乙酯中，然后用水和盐水洗涤。将有机相经硫酸镁干燥并浓缩。将残余物不经进一步纯化而使用。得到400mg(理论值的62％)标题化合物。
将6.91g(36.50mmol)N-(叔丁氧基羰基)-β-丙氨酸和8.22g(39.82mmol)1，3-二环己基碳化二亚胺加入(4E)-4-{[N-(叔丁氧基羰基)-β-丙氨酰基]氨基}-4-(肟基)丁酸甲酯(4.85g，33.19mmol)于120.0ml二噁烷中的溶液中。将反应混合物在室温下搅拌3h。将混合物浓缩，并将残余物溶解于水中并用乙酸乙酯萃取。将有机相经硫酸钠干燥并浓缩。将残余物通过快速色谱纯化。得到6.0g(理论值的57％)标题化合物。
将(4E)-4-{[N-(叔丁氧基羰基)-β-丙氨酰基]氨基}-4-(肟基)丁酸甲酯(6.0g，18.91mmol)于100ml DMF中的溶液在120℃下搅拌5h。加入水，并将混合物用乙酸乙酯萃取。将有机相经硫酸钠干燥并浓缩。将残余物通过制备型HPLC纯化。得到4g(理论值的71％)标题化合物。
将2.96g(25.96mmol)三氟乙酸加入3-(5-{2-[(叔丁氧基羰基)氢基]乙基}-1，2，4-噁二唑-3-基)丙酸(2.0g，7.01mmol)于30ml二氯甲烷中的溶液中。将反应混合物在室温下搅拌1h。加入水，并将混合物用二氯甲烷萃取。将有机相经硫酸钠干燥并浓缩。将残余物不经进一步纯化而使用。得到1.50g(理论值的72％)标题化合物。
将1.30g(5.52mmol)1-[2-(2，5-二氧代吡咯烷-1-基)-2-氧代乙基]-1-吡咯-2，5-二酮和1.52g(15.04mmol)三乙胺加入3-[5-(2-氨基乙基)-1，2，4-噁二唑-3-基]丙酸(1.5g，5.01mmol)于25ml DMF中的溶液中。将反应混合物在RT下搅拌1h。加入水，并将混合物用二氯甲烷萃取。将有机相经硫酸钠干燥并浓缩。将残余物通过制备型HPLC纯化。得到774mg(理论值的47％)标题化合物。
1H-NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ[ppm]＝2.67(t，2H)，2.91(t，2H)，3.03(t，2H)，3.46(q，2H)，4.28(s，2H)，7.01(s，2H)，8.37(t，1H)，12.28(bs，1H)。
中间体L123
[1-氟-4-氧代丁-2-基]氨基甲酸叔丁酯
在氩气下，首先将3-[(叔丁氧基羰基)氨基]-4-氟丁酸乙酯(150mg，602μmol)(Synth.Com.，1985，15(5)，377)加入12.0ml DCM中。将反应混合物冷却至-78℃，加入于甲苯中的1M二异丁基氢化铝(1.2ml，1.0M，1.2mmol)，并将混合物搅拌2小时。将混合物小心地用甲醇淬灭，再搅拌10min并用乙酸乙酯稀释。将有机相用饱和酒石酸钠溶液萃取三次。将有机相用饱和NaCl溶液洗涤一次并经硫酸镁干燥。将溶剂在减压下蒸发并将残余物在高真空下干燥。得到86.1mg(理论值的67％)标题化合物。
1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)δ[ppm]：1.37(s，9H)，2.58(m，2H)，4.18(m，1H)，4.31(dd，2H)，7.05(d，1H)，9.60(s，1H)。
中间体L124
N-{(2R)-2-氨基-3-氧代-3-[2-(三甲基硅烷基)乙氧基]丙基}-N2-(叔丁氧基羰基)-L-天冬氨酸叔丁酯
将4.0g(13.8mmol)Boc-Asp-OtBu和1.8g(15.2mmol)N-羟基琥珀酰亚胺溶解于100ml乙酸乙酯中，并在0℃下加入3.1g(15.2mmol)1，3-二环己基碳化二亚胺。将反应混合物在0℃下搅拌2小时，然后在RT下搅拌过夜。随后将反应混合物过滤并在减压下浓缩。得到4.1g(理论值的77％)化合物4-(2，5-二氧代吡咯烷-1-基)-N-(叔丁氧基羰基)-L-天冬氨酸1-叔丁酯。
将3-氨基-N-[(苄氧基)羰基]-D-丙氨酸(2.53g，10.6mmol)溶解于30ml DMF中，并加入N，N-二异丙基乙胺(2.74g，21.2mmol)和4-(2，5-二氧代吡咯烷-1-基)-N-(叔丁氧基羰基)-L-天冬氨酸1-叔丁酯(4.10g，10.6mmol)。将反应混合物在RT下搅拌过夜并在减压下浓缩。得到4.9g(理论值的90％)化合物(2R)-2-{[(苄氧基)羰基]氨基}-3-({(3S)-4-叔丁氧基-3-[(叔丁氧基羰基)氨基]-4-氧代丁酰基}氨基)丙酸。
将(2R)-2-{[(苄氧基)羰基]氨基}-3-({(3S)-4-叔丁氧基-3-[(叔丁氧基羰基)氨基]-4-氧代丁酰基}氨基)丙酸(4.90g，9.62mmol)溶解于100ml乙腈中，并在RT下加入吡啶(1.6ml，19mmol)、2-(三甲基硅烷基)乙醇(1.7ml，12mmol)和二环己基碳化二亚胺(2.38g，11.5mmol)。将反应混合物在0℃下搅拌1小时，然后在RT下搅拌过夜。随后将反应混合物在减压下过滤并浓缩。将残余物通过制备型RP-HPLC纯化。将溶剂在减压下蒸发，并将残余物在高真空下干燥。得到3.9g(理论值的66％)化合物N-{(2R)-2-{[(苄氧基)羰基]氨基}-3-氧代-3-[2-(三甲基硅烷基)乙氧基]丙基}-N2-(叔丁氧基羰基)-L-天冬氨酸叔丁酯。
将N-{(2R)-2-{[(苄氧基)羰基]氨基}-3-氧代-3-[2-(三甲基硅烷基)乙氧基]丙基}-N2-(叔丁氧基羰基)-L-天冬氨酸叔丁酯(3.80g，6.23mmol)溶解于120ml甲醇中，并加入380mg钯碳(10％)。将反应混合物在RT下在标准压力下用氢来氢化2小时，然后过滤。将溶剂在减压下除去。得到2.9g(理论值的84％)标题化合物。
1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ[ppm]＝0.04(s，9H)，0.97(m，2H)，1.38(s，9H)，1.39(s，9H)，1.89(bs，2H)，2.43(m，1H)，3.18(m，3H)，3.38(m，1H)，4.11(m，3H)，6.93(d，1H)，7.91(bt，1H)。
中间体L125
三氟乙酸/N-(2-氨基乙基)-N2-(溴乙酰基)-D-α-谷氨酸叔丁酯(1∶1)
通过肽化学的经典方法，由(2R)-2-{[(苄氧基)羰基]氨基}-5-叔丁氧基-5-氧代戊酸和(2-氨基乙基)氨基甲酸叔丁酯起始来制备该中间体。
LC-MS(方法1)：Rt＝0.49min；MS(ESIpos)：m/z＝366和368(M+H)+。
中间体F104
三氟乙酸/(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-N-(2-{[(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙基)丁酰胺(1∶1)
将10mg(0.014mmol)中间体C53溶解于3.3ml DMF中，并加入8.5mg(0.027mmol)中间体L1、7.8mg(0.02mmol)HATU和12μl N，N-二异丙基乙胺。将反应物在RT下搅拌15min，然后浓缩。将残余物通过制备型HPLC纯化，冻干后得到5.6mg(理论值的38％)受保护的中间体。
LC-MS(方法1)：Rt＝1.32min；MS(ESIpos)：m/z＝915(M+H)+。
将5.6mg(0.006mmol)该中间体用2ml DMF吸收，并加入69mg(0.61mmol)1，4-二氮杂二环[2.2.2]辛烷。将反应物在超声波浴中处理2h。然后加入35μl乙酸，并将反应物在高真空下浓缩。将残余物通过制备型HPLC纯化。得到2.4mg(理论值的48％)标题化合物。
LC-MS(方法1)：Rt＝0.84min；MS(EIpos)：m/z＝693[M+H]+。
HPLC(方法11)：Rt＝1.91min；
或者，也可由中间体C58制备标题化合物。首先将15mg(0.023mmol)中间体C58与11mg(0.036mmol)中间体L1在13mg(0.034mmol)HATU和10μl N，N-二异丙基乙胺的存在下反应。在RT下搅拌60min后，将混合物浓缩，并将残余物通过制备型HPLC纯化。得到12.3mg(理论值的63％)受保护的中间体。
LC-MS(方法1)：Rt＝1.3min；MS(EIpos)：m/z＝837[M+H]+。
在第二步中，将该中间体溶解于3ml 2，2，2-三氟乙醇中。加入12mg(0.088mmol)氯化锌，并将反应物在50℃下搅拌2h。然后加入26mg(0.088mmol)乙二胺-N，N，N′，N′-四乙酸和2ml 0.1％浓度三氟乙酸水溶液。将反应物通过制备型HPLC纯化。将适当的流份浓缩并将残余物从乙腈/水中冻干得到8.1mg(理论值的68％)标题化合物。
LC-MS(方法1)：Rt＝0.89min；MS(ESIpos)：m/z＝693(M+H)+。
中间体F119
三氟乙酸/(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-N-{2-[(溴乙酰基)氨基]乙基}丁酰胺(1∶1)
将29mg(0.044mmol)中间体C58用3.4ml DMF吸收，并加入36mg(0.087mmol)中间体L52、25mg(0.065mmol)HATU和19μl N，N-二二异丙基乙胺。在RT下搅拌60min后，将混合物浓缩，并将残余物通过制备型HPLC纯化。得到26.4mg(理论值的73％)该中间体。
LC-MS(方法1)：Rt＝1.34min；MS(ESIpos)：m/z＝820和822(M+H)+。
将该中间体溶解于3ml 2，2，2-三氟乙醇中。加入6.5mg(0.048mmol)氯化锌，并将反应物在50℃下搅拌4h。加入13.9mg(0.048mmol)乙二胺-N，N，N′，N′-四乙酸和2ml 0.1％浓度的三氟乙酸水溶液。将反应通过制备型HPLC纯化。将适当的流份浓缩并将残余物从乙腈/水中冻干得到14.4mg(理论值的58％)标题化合物。
LC-MS(方法1)：Rt＝0.88min；MS(ESIpos)：m/z＝676和678(M+H)+。
中间体F127
三氟乙酸/(2S)-2-氨基-4-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}[(2S)-2-甲氧基丙酰基]氨基)-N-(2-{[(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙基)丁酰胺(1∶1)
将12mg(0.015mmol)中间体C59溶解于2.4ml DMF中，并加入14.6mg(0.046mmol)中间体L1、6mg(0.031mmol)1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐、5.9mg(0.039mmol)1-羟基-1H-苯并三唑水合物和8μl N，N-二异丙基乙胺。在RT下搅拌1h后，将混合物浓缩，并将残余物通过制备型HPLC纯化。得到11mg(理论值的70％)该中间体。
LC-MS(方法1)：Rt＝1.34min；MS(ESIpos)：m/z＝942(M+H)+。
将11mg(0.011mmol)该中间体用2ml DMF吸收，并加入123mg(1.1mmol)1，4-二氮杂二环[2.2.2]辛烷。将反应物在超声波浴中处理2h。然后加入63μl乙酸，并将反应物在高真空下浓缩。将残余物通过制备型HPLC纯化。得到2mg(理论值的22％)标题化合物。
LC-MS(方法1)：Rt＝0.89min；MS(EIpos)：m/z＝721[M+H]+。
HPLC(方法11)：Rt＝1.95min；
中间体F153
三氟乙酸/(2S)-2-氨基-4-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}[(2S)-2-羟基丙酰基]氨基)-N-(2-{[(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙基)丁酰胺(1∶1)
以类似于中间体F104的方法由中间体C60进行合成。
LC-MS(方法1)：Rt＝1.1min；MS(ESIpos)：m/z＝707(M+H)+。
中间体F155
N6-(N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}-β-丙氨酰基)-N2-{N-[6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酰基}-L-赖氨酸/三氟乙酸(1∶1)
通过将14mg(0.019mmol)中间体C61与15mg(0.021mmol)中间体L61在8.7mg(0.023mmol)HATU和17μl N，N-二异丙基乙胺的存在下偶联、随后在三氟乙醇中用氯化锌脱保护(如对中间体F119所述)来制备标题化合物。通过制备型HPLC纯化得到13mg(理论值的59％，经2个步骤)标题化合物。
LC-MS(方法1)：Rt＝0.86min；MS(ESIpos)：m/z＝1076(M+H)+。
中间体F173
N-[6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酰基-N-[2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}氨基)乙基]-L-谷氨酰胺/三氟乙酸(1∶1)
由15mg(0.018mmol)中间体C64通过与12mg(0.02mmol)中间体L63在7.7mg(0.02mmol)HATU和16μl N，N-二异丙基乙胺的存在下偶联、随后在三氟乙醇中用氯化锌脱保护(如对中间体F119所述)来制备标题化合物。通过制备型HPLC纯化得到12mg(理论值的58％，经2个步骤)标题化合物。
LC-MS(方法1)：Rt＝0.91min；MS(EIpos)：m/z＝1048[M+H]+。
中间体F178
三氟乙酸/(1R，2S)-2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}氨基)-N-{2-[(溴乙酰基)氨基]乙基}环戊烷甲酰胺(1∶1)
以类似于中间体F177的方法，使用中间体L52代替中间体L1来制备标题化合物。
LC-MS(方法1)：Rt＝0.89min；MS(EIpos)：m/z＝787和789[M+H]+。
中间体F180
N-[2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}氨基)乙基]-N2-[(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]-L-谷氨酰胺/三氟乙酸(1∶1)
通过将9.6mg(0.012mmol)中间体C64与5mg(0.013mmol)中间体L64在7mg(0.018mmol)HATU和6μl N，N-二异丙基乙胺的存在下偶联、随后在三氟乙醇中用氯化锌脱保护(如对中间体F119所述)来制备标题化合物。通过制备型HPLC纯化得到3.1mg(理论值的28％，经2个步骤)标题化合物。
LC-MS(方法1)：Rt＝0.85min；MS(EIpos)：m/z＝822[M+H]+。
中间体F192
N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}-3-{[(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}-L-丙氨酸/三氟乙酸(1∶1)
将60mg(0.091mmol)中间体C58用8ml DMF吸收并与45mg(0.100mmol)中间体L65在42mg(0.11mmol)HATU和64μl N，N-二异丙基乙胺的存在下偶联。通过制备型HPLC纯化后，将中间体用10ml乙醇吸收并在10％钯活性炭上在RT下在氢标准压力下氢化45min。然后将催化剂滤出，将溶剂在减压下去除，并将产物通过制备型HPLC纯化。从乙腈/水1∶1中冻干得到24.5mg(理论值的31％，经2个步骤)3-氨基-N-[(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-2-({[2-(三甲基硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)丁酰基]-L-丙氨酸2-(三甲基硅烷基)乙酯。
LC-MS(方法1)：Rt＝1.17min；MS(EIpos)：m/z＝844[M+H]+。
然后通过将10mg(0.012mmol)该中间体与2mg(0.013mmol)市售的(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酸中间体在5.4mg(0.014mmol)HATU和8μl N，N-二异丙基乙胺的存在下偶联、随后在三氟乙醇中用氯化锌脱保护(如对中间体F119所述)来制备标题化合物。通过制备型HPLC纯化得到3.5mg(理论值的33％，经2个步骤)标题化合物。
LC-MS(方法1)：Rt＝0.81min；MS(ESIpos)：m/z＝737(M+H)+。
中间体F193
N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}-3-{[(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯1-基)乙酰基]氨基}-D-丙氨酸/三氟乙酸(1∶1)
以类似于中间体F192的方法由3-{[(苄氧基)羰基]氨基}-N-(叔丁氧基羰基)-D-丙氨酸/N-环己基环己胺(1∶1)进行标题化合物的合成。
LC-MS(方法1)：Rt＝0.87min；MS(ESIpos)：m/z＝737(M+H)+。
中间体F194
N-{5-[(2，5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-5-氧代戊酰基}-L-缬氨酰基-N-{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丙基}-L-丙氨酰胺
首先由实施例M9通过与N-[(苄氧基)羰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酸在HATU和N，N-二异丙基乙胺的存在下偶联来制备标题化合物。在下一步骤中，通过在10％钯活性炭上在RT下在氢标准压力下氢化1小时来除去z保护基团，然后将脱保护的中间体通过与1，1′-[(1，5-二氧代戊烷-1，5-二基)二(氧基)]二吡咯烷-2，5-二酮反应而转化为标题化合物。
LC-MS(方法1)：Rt＝1.19min；MS(ESIpos)：m/z＝851[M+H]+。
中间体F207
N6-(N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}-β-丙氨酰基)-N2-{N-[(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酰基}-L-赖氨酸/三氟乙酸(1∶1)
以类似于中间体F155的方法来制备标题化合物。
LC-MS(方法1)：Rt＝0.81min；MS(ESIpos)：m/z＝1020(M+H)+。
中间体F216
S-{2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}-N-[19-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4，7，10，13-四氧杂-16-氮杂十九烷-1-酰基]-L-半胱氨酰基-β-丙氨酸/三氟乙酸(1∶1)
在氩气下，首先将30.2mg(0.06mmol)N，N′-二[(苄氧基)羰基]-L-胱氨酸加入2.0ml水和2.0ml异丙醇中，并加入56.7mg(0.20mmol)TCEP。将反应混合物在RT下搅拌30min。然后加入50.0mg(0.08mmol)溶解于2.0ml异丙醇中的{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}(氯乙酰基)氨基]丙基}氨基甲酸2-(三甲基硅烷基)乙酯(中间体C70)、和122.2mg(0.48mmol)1，8-二氮杂二环[5.4.0]十四-7-烯，并将反应混合物在50℃下搅拌7h。然后再加入122.2mg(0.48mmol)1，8-二氮杂二环[5.4.0]十四-7-烯，并将反应混合物在50℃下搅拌1h。将混合物用乙酸乙酯稀释，将有机相用水和饱和碳酸氢钠溶液萃取并用饱和NaCl溶液洗涤。将有机相经硫酸镁干燥，并将溶剂在减压下蒸发。将残余物通过制备型RP-HPLC纯化(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)。将溶剂在减压下蒸发并将残余物在高真空下干燥。得到43.1mg(理论值的64％)化合物S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}-2，2-二甲基-6，12-二氧代-5-氧杂-7，11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-N-[(苄氧基)羰基]-L-半胱氨酸。
LC-MS(方法1)：Rt＝1.46min；MS(ESIpos)：m/z＝851(M+H)+。
首先将16.5mg(0.05mmol)4-甲苯磺酸/β-丙氨酸苄基酯(1∶1)与14.0mg(0.11mmol)N，N-二异丙基乙胺一起加入1.5ml乙腈中。将反应混合物在RT下搅拌3min，然后加入30.8mg(0.04mmol)溶解于1.5ml乙腈中的S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}-2，2-二甲基-6，12-二氧代-5-氧杂-7，11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-N-[(苄氧基)羰基]-L-半胱氨酸、23.4mg(0.18mmol)N，N-二异丙基乙胺和29.9mg(0.05mmol)T3P(50％于乙酸乙酯中)。将反应混合物在RT下搅拌过夜。加入水，并将反应混合物通过制备型RP-HPLC直接纯化(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)。将溶剂在减压下蒸发并将残余物在高真空下干燥。获得的化合物是S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}-2，2-二甲基-6，12-二氧代-5-氧杂-7，11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-N-[(苄氧基)羰基]-L-半胱氨酰基-β-丙氨酸苄基酯。
LC-MS(方法1)：Rt＝1.59min；MS(ESIpos)：m/z＝1012(M+H)+。
将43.8mg(43.3μmol)S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}-2，2-二甲基-6，12-二氧代-5-氧杂-7，11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-N-[(苄氧基)羰基]-L-半胱氨酰基-β-丙氨酸苄基酯溶解于8.0ml乙醇中，加入4.4mg钯活性炭(10％)并将混合物在RT和标准压力下氢化过夜。将反应混合物通过纸板过滤器过滤，并将滤饼用乙醇洗涤。将溶剂在减压下蒸发。将残余物如上所述再处理两次。将残余物通过制备型RP-HPLC纯化(柱：Reprosil 250×30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)。将溶剂在减压下蒸发，并将残余物在高真空下干燥。得到14.5mg(理论值的37％)化合物S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}-2，2-二甲基-6，12-二氧代-5-氧杂-7，11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-L-半胱氨酰基-β-丙氨酸/三氟乙酸(1∶1)。
LC-MS(方法1)：Rt＝1.08min；MS(ESIpos)：m/z＝788(M+H)+。
首先将14.5mg(16.1μmol)S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}-2，2-二甲基-6，12-二氧代-5-氧杂-7，11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-L-半胱氨酰基-β-丙氨酸/三氟乙酸(1∶1)与9.1mg(17.7μmol)3-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-{15-[(2，5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-15-氧代-3，6，9，12-四氧杂十五烷-1-基}丙酰胺一起加入1.0ml DMF中，并加入4.9mg(48.2μmol)4-甲基吗啉。将反应混合物在RT下搅拌过夜，然后加入3.4mg(0.06mmol)乙酸。将反应混合物通过制备型RP-HPLC直接纯化(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)。将溶剂在减压下蒸发，并将残余物在高真空下干燥。得到4.9mg(理论值的50％)化合物S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}-2，2-二甲基-6，12-二氧代-5-氧杂-7，11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-L-半胱氨酰基-β-丙氨酸/三氟乙酸(1∶1)。
LC-MS(方法1)：Rt＝1.28min；MS(ESIpos)：m/z＝1186(M+H)+。
将14.1mg(11.9μmol)S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}-2，2-二甲基-6，12-二氧代-5-氧杂-7，11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-N-[19-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4，7，10，13-四氧杂-16-氮杂十九烷-1-酰基]-L-半胱氨酰基-β-丙氨酸/三氟乙酸(1∶1)溶解于1.5ml三氟乙醇中，并加入9.7mg(71.3μmol)氯化锌。将反应混合物在50℃下搅拌3h。再加入9.7mg(71.3μmol)氯化锌，并将反应混合物在50℃下搅拌3h。再加入9.7mg(71.3μmol)氯化锌，将反应混合物在70℃下搅拌4h。加入20.8mg(0.07mmol)乙二胺-N，N，N′，N′-四乙酸，并加反应混合物搅拌10min，然后加入水(0.1％TFA)。直接通过RP-HPLC进行纯化(柱：Reprosil 125×30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)。将溶剂在减压下蒸发，并将残余物冻干。得到6.2mg(理论值的44％)标题化合物。
LC-MS(方法1)：Rt＝0.82min；MS(ESIpos)：m/z＝1042(M+H)+。
中间体F239
S-{2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2--二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}-N-[(2，5--二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1∶1)
在氩气下，首先将7.5mg(0.05mmol)(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酸加入1.5ml DMF中，并加入7.5mg(0.05mmol)HOBt、15.5mg(0.05mmol)TBTU和6.2mg(0.05mmol)N，N-二异丙基乙胺。将反应混合物在RT下搅拌10min。然后加入40.0mg(0.05mmol)溶解于1.5ml DMF中的S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯2-基]-2，2-二甲基丙基}-2，2-二甲基-6，12-二氧代-5-氧杂-7，11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1∶1)(中间体C71)、和18.7mg(0.14mmol)N，N-二异丙基乙胺，并将反应混合物在RT下搅拌过夜。将反应混合物通过制备型RP-HPLC直接纯化(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)。将溶剂在减压下蒸发，并将残余物在高真空下干燥。得到11.2mg(理论值的25％)化合物S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}-2，2-二甲基-6，12-二氧代-5-氧杂-7，11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-N-[(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]-L-半胱氨酸。
LC-MS(方法1)：Rt＝1.37min；MS(ESIpos)：m/z＝854(M+H)+。
将10.9mg(12.8μmol)S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}-2，2-二甲基-6，12-二氧代-5-氧杂-7，11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-N-[(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]-L-半胱氨酸溶解于2.0ml三氟乙醇中，并加入10.4mg(76.6μmol)氯化锌。将反应混合物在50℃下搅拌4h。加入22.4mg(0.08mmol)乙二胺-N，N，N′，N′-四乙酸，将反应混合物搅拌10min，然后加入水(0.1％TFA。直接通过RP-HPLC进行纯化(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)。将溶剂在减压下蒸发，并将残余物冻干。得到7.5mg(理论值的65％)标题化合物。
LC-MS(方法1)：Rt＝0.92min；MS(ESIpos)：m/z＝710(M+H)+。
中间体F240
三氟乙酸/3-({2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}硫烷基)-N-(2-{[(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙基)丙酰胺(1∶1)
首先将27.5mg(0.04mmol)11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}-2，2-二甲基-6，12-二氧代-5-氧杂-14-硫杂-7，11-二氮杂-2-硅杂十七烷-17-酸(中间体C69)与15.9mg(0.05mmol)三氟乙酸/N-(2-氨基乙基)-2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰胺(1∶1)(中间体L1)一起加入1.8ml乙腈中。然后加入32.4mg(0.31mmol)N，N-二异丙基乙胺，并逐滴加入32.4mg(0.05mmol)T3P(50％于乙酸乙酯中)。将反应混合物在RT下搅拌过夜。将反应混合物通过制备型RP-HPLC直接纯化(柱：Reprosil 125×30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水)。将溶剂在减压下蒸发，并将残余物在高真空下干燥。得到11.9mg(理论值的35％)化合物[13-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}-1-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-2，7，12-三氧代-10-硫杂-3，6，13-三氮杂十六烷-16-基]氨基甲酸2-(三甲基硅烷基)乙酯。
LC-MS(方法1)：Rt＝1.39min；MS(ES1pos)：m/z＝881(M+H)+。
将11.9mg(0.01mol)[13-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}-1-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-2，7，12-三氧代-10-硫杂-3，6，13-三氮杂十六烷-16-基]氨基甲酸2-(三甲基硅烷基)乙酯溶解于1.0ml三氟乙醇中，并加入5.5mg(0.04mmol)氯化锌。将反应混合物在50℃下搅拌过夜。加入11.8mg(0.04mmol)乙二胺-N，N，N′，N′-四乙酸，将反应混合物搅拌10min，然后加入水(0.1％TFA)。直接通过RP-HPLC进行纯化(柱：Reprosil 125×30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)。将溶剂在减压下蒸发，并将残余物在高真空下干燥。得到7.4mg(理论值的60％)标题化合物。
LC-MS(方法5)：Rt＝2.75min；MS(ESIpos)：m/z＝737(M+H)+。
中间体F241
三氟乙酸/(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-N-(2-{[N-(溴乙酰基)甘氨酰基]氨基}乙基)丁酰胺(1∶1)
由中间体C66通过与市售的1-(2-溴乙酰氧基)吡咯烷-2，5-二酮偶联、随后用氯化锌脱保护来制备标题化合物。
LC-MS(方法1)：Rt＝0.84min；MS(EIpos)：m/z＝733和735[M+H]+。
中间体F242
三氟乙酸/(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-N-(3-{[(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}丙基)丁酰胺(1∶1)
以类似于中间体F104的方法进行标题化合物的合成。
LC-MS(方法1)：Rt＝0.84min；MS(ESIpos)：m/z＝707(M+H)+。
中间体F243
三氟乙酸/(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-N-[2-(2-{[(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯1-基)乙酰基]氨基}乙氧基)乙基]丁酰胺(1∶1)
以类似于中间体F242的方法进行标题化合物的合成。
LC-MS(方法1)：Rt＝0.81min；MS(ESIpos)：m/z＝737(M+H)+。
中间体F245
三氟乙酸/N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁基}-N′-(2-{[(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙基)琥珀酰胺(1∶1)
通过将10mg(0.0135mmol)中间体C65与8mg(0.027mmol)中间体L1在8ml DMF中在15mg(0.04mmol)HATU和9μl N，N-二异丙基乙胺的存在下偶联、随后在三氟乙醇中用氯化锌脱保护(如对中间体F119所述)来制备标题化合物。通过制备型HPLC纯化得到8.8mg(理论值的58％，经2个步骤)标题化合物。
LC-MS(方法1)：Rt＝0.84min；MS(ESIpos)：m/z＝778(M+H)+。
中间体F247
三氟乙酸/4-[(2-{[2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}氨基)乙基]氨基}-2-氧代乙基)氨基]-2-溴-4-氧代丁酸甲酯(1∶1)
将14mg(0.018mmol)中间体C66溶解于14ml DCM中，并加入10.1mg(0.037mmol)2-溴-1-乙基吡啶鎓四氟硼酸盐(BEP)，并每次少许地加入共250μl吡啶，将pH维持在5和6之间。然后用乙酸将pH调节至4，将反应物浓缩，并将残余物通过制备型HPLC纯化。将适当的流份合并、冻干并干燥得到4mg(理论值的21％)受保护的中间体，将其用氯化锌在氨基官能团处脱保护。HPLC纯化并冻干得到3mg(理论值的72％)标题化合物，其为无色泡沫状物。
LC-MS(方法1)：Rt＝0.88min；MS(ESIpos)：m/z＝805和807(M+H)+。
中间体F248
三氟乙酸/(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-N-{2-[2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基]乙基}丁酰胺(1∶1)
通过将10mg(0.015mmol)中间体C58与5mg(0.017mmol)中间体L12在HATU的存在下偶联、随后用氯化锌脱保护来制备标题化合物。得到6.5mg(理论值的52％，经2个步骤)标题化合物。
LC-MS(方法1)：Rt＝0.91min；MS(ESIpos)：m/z＝680(M+H)+。
中间体F254
三氟乙酸/(3S)-4-[(2-{[2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}氨基)乙基]氨基}-2-氧代乙基)氨基]-3-溴-4-氧代丁酸甲酯(1∶1)
以类似于中间体247的方法，通过将15mg(0.02mmol)中间体C66与21mg(0.099mmol)(2S)-2-溴-4-甲氧基-4-氧代丁酸(其如J.Org.Chem.200，65，517-522中所述由(2S)-2-氨基-4-甲氧基-4-氧代丁酸盐酸盐(1∶1)合成)偶联来制备标题化合物。
LC-MS(方法1)：Rt＝0.89min；MS(ESIpos)：m/z＝805和807(M+H)+。
中间体F255
R/S-(N-[19-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4，7，10，13-四氧杂-16-氮杂十九烷-1-酰基]-L-α-谷氨酰基-S-{2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基})高半胱氨酸/三氟乙酸(1∶1)
首先将13.1mg(0.04mmol)(2S)-5-(苄氧基)-2-{[(苄氧基)羰基]氨基}-5-氧代戊酸加入1.0ml DMF中，并加入5.4mg(0.04mmol)HOBt、11.4mg(0.04mmol)TBTU和4.6mg(0.04mmol)N，N-二异丙基乙胺。将反应混合物在RT下搅拌10min。然后加入溶解于12.9mg(0.1mmol)N，N-二异丙基乙胺和1ml DMF中的30.0mg(0.04mmol)R/S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}-2，2-二甲基-6，12-二氧代-5-氧杂-7，11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)高半胱氨酸/三氟乙酸(1∶1)(中间体c11)。将反应混合物在RT下搅拌过夜。将反应混合物通过制备型RP-HPLC直接纯化(柱：Reprosil 250×30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)。将溶剂在减压下蒸发，并将残余物在高真空下干燥。得到32mg(73％)化合物4-[2-[[(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基]-[3-(2-三甲基硅烷基乙氧基羰基氨基)丙基]氨基]-2-氧代乙基]硫烷基-2-[[(2S)-5-苄氧基-2-(苄氧基羰基氨基)-5-氧代-戊酰基]氨基]丁酸。
LC-MS(方法1)：Rt＝1.53min；MS(ESIpos)：m/z＝1084(M+H)+。
将41.4mg(0.038mmol)4-[2-[[(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基]-[3-(2-三甲基硅烷基乙氧基羰基氨基)丙基]氨基]-2-氧代乙基]硫烷基-2-[[(2S)-5-苄氧基-2-(苄氧基羰基氨基)-5-氧代-戊酰基]氨基]丁酸溶解于10ml乙醇中，加入4.2mg Pd/C，并将混合物在标准压力下氢化。将反应混合物通过纸板过滤器过滤，并将滤饼用乙醇洗涤。将溶剂在不加热的情况下减压蒸发。将残余物通过制备型RP-HPLC纯化(柱：Reprosil 250x40；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)。将溶剂在减压下蒸发，并将残余物在高真空下干燥。得到21.1mg(56％)化合物R/S-(L-α-谷氨酰基-S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}-2，2-二甲基-6，12-二氧代-5-氧杂-7，11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)高半胱氨酸/三氟乙酸(1∶1)。
LC-MS(方法1)：Rt＝1.11min；MS(ESIpos)：m/z＝860(M+H)+。
首先将20.4mg(20.94μmol)R/S-(L-α-谷氨酰基-S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}-2，2-二甲基-6，12-二氧代-5-氧杂-7，11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基))高半胱氨酸/三氟乙酸(1∶1)与11.8mg(23.04μmol)3-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-{15-[(2，5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-15-氧代-3，6，9，12-四氧杂十五烷-1-基}丙酰胺一起加入1.0ml DMF中，并加入4.2mg(41.88μmol)4-甲基吗啉。将反应混合物在RT下搅拌过夜，然后加入3.1mg(0.05mmol)乙酸。将反应混合物通过制备型RP-HPLC直接纯化(柱：Reprosil 250×30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)。将溶剂在减压下蒸发，并将残余物在高真空下干燥。得到9.5mg(36％)化合物R/S-(N-[19-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4，7，10，13-四氧杂-16-氮杂十九烷-1-酰基]-L-α-谷氨酰基-S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}-2，2-二甲基-6，12-二氧代-5-氧杂-7，11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基))高半胱氨酸。
LC-MS(方法1)：Rt＝1.66min；MS(ESIpos)：m/z＝1259(M+H)+。
将9.4mg(7.47μmol)R/S-(N-[19-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4，7，10，13-四氧杂-16-氮杂十九烷-1-酰基]-L-α-谷氨酰基-S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}-2，2-二甲基-6，12-二氧代-5-氧杂-7，11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基))高半胱氨酸溶解于1.5ml三氟乙醇中，并加入6.1mg(44.81μmol)氯化锌。将反应混合物在50℃下搅拌3h。加入13.1mg(0.05mmol)乙二胺-N，N，N′，N′-四乙酸，将反应混合物搅拌10min，然后加入水(0.1％TFA)。直接通过RP-HPLC进行纯化(柱：Reprosil 125×30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)。将溶剂在减压下蒸发，并将残余物在高真空下干燥。得到6.9mg(75％)标题化合物。
LC-MS(方法1)：Rt＝0.87min；MS(ESIpos)：m/z＝1114(M+H)+。
中间体F256
三氟乙酸/N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁基}-N′-[2-(2-{[(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙氧基)乙基]琥珀酰胺(1∶1)
通过将10mg(0.014mmol)中间体C65与9.6mg(0.027mmol)三氟乙酸N-[2-(2-氨基乙氧基)乙基]-2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰胺(1∶1)在HATU和N，N-二异丙基乙胺的存在下偶联、随后在三氟乙醇中用氯化锌脱保护(如对中间体F119所述)来制备标题化合物。通过制备型HPLC纯化得到8mg(理论值的64％，经2个步骤)标题化合物。
LC-MS(方法1)：Rt＝0.84min；MS(ESIpos)：m/z＝822(M+H)+。
中间体F257
R-{2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}-N-[18-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4，7，10，13-四氧杂-16-氮杂十八烷-1-酰基]-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1∶1)
将50.0mg(0.06mmol)R-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}-2，2-二甲基-6，12-二氧代-5-氧杂-7，11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1∶1)(中间体C71)和29mg(0.07mmol)3-[2-[2-[2-[2-[[2-(2，5-二氧代吡咯-1-基)乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸(中间体L74)溶解于3.0ml DMF中，并加入27.3mg(0.07mmol)HATU和23.3mg(0.18mmol)N，N-二异丙基乙胺。将反应混合物在RT下搅拌2小时。将反应混合物通过制备型RP-HPLC直接纯化(柱：Reprosil 125×30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水/0.1％TFA)。将溶剂在减压下蒸发，并将残余物在高真空下干燥。得到17.4mg(26％)化合物R-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}-2，2-二甲基-6，12-二氧代-5-氧杂-7，11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-N-[18-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4，7，10，13-四氧杂-16-氮杂十八烷-1-酰基]-L-半胱氨酸。
LC-MS(方法6)：Rt＝1.34min；MS(ESIpos)：m/z＝1101(M+H)+。
将17mg(0.02mmol)R-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}-2，2-二甲基-6，12-二氧代-5-氧杂-7，11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-N-[18-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4，7，10，13-四氧杂-16-氮杂十八烷-1-酰基]-L-半胱氨酸溶解于1.0ml三氟乙醇中，并加入6.3mg(0.05mmol)氯化锌。将反应混合物在50℃下搅拌过夜。加入13.5mg(0.05mmol)乙二胺-N，N，N′，N′-四乙酸，将反应混合物搅拌10min，然后加入水(0.1％TFA)。直接通过RP-HPLC进行纯化(柱：Reprosil 125×30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)。将溶剂在减压下蒸发，并将残余物在高真空下干燥。得到7.6mg(46％)标题化合物。
LC-MS(方法1)：Rt＝0.91min；MS(ESIpos)：m/z＝957(M+H)+。
中间体F258
三氟乙酸/(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-N-[3-{2-[(溴乙酰基)氨基]乙基}氨基)-3-氧代丙基]丁酰胺(1∶1)
通过使用HATU将中间体C58与三氟乙酸/[2-(β-丙氨酰基氨基)乙基]氨基甲酸苄基酯(1∶1)偶联、随后氢解、然后与1-(2-溴乙酰氧基)吡咯烷-2，5-二酮偶联、最后用氯化锌脱保护来制备标题化合物。
LC-MS(方法1)：Rt＝0.86min；MS(ESIpos)：m/z＝747和749(M+H)+。
中间体F259
N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}-3-{[N-(溴乙酰基)甘氨酰基]氨基}-D-丙氨酸/三氟乙酸(1∶1)
将75mg(0.114mmol)中间体C58用12.5ml DMF吸收并与78mg(0.171mmol)中间体L75在65mg(0.11mmol)HATU和79μl N，N-二异丙基乙胺的存在下偶联。通过制备型HPLC纯化后，将中间体用20ml乙醇吸收并在10％钯活性炭上在RT下在氢标准压力下氢化1h。然后将催化剂滤出，将溶剂在减压下去除，并将产物通过制备型HPLC纯化。从乙腈/水1∶1中冻干得到63mg(理论值的64％，经2个步骤)3-氨基-N-[(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-2-({[2-(三甲基硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)丁酰基]-D-丙氨酸2-(三甲基硅烷基)乙酯。
LC-MS(方法1)：Rt＝1.16min；MS(EIpos)：m/z＝844[M+H]+。
然后如上文所述，将40mg(0.047mmol)该中间体与N-[(苄氧基)羰基]甘氨酸在HATU的存在下偶联，然后再次经氢化脱保护。
然后通过将10mg(0.012mmol)该中间体与7.7mg(0.032mmol)市售的1-(2-溴乙酰氧基)吡咯烷-2，5-二酮在4μl N，N-二异丙基乙胺的存在下偶联、随后在三氟乙醇中用氯化锌脱保护(如对中间体F119所述)来制备标题化合物。通过制备型HPLC纯化得到1.3mg标题化合物。
LC-MS(方法1)：Rt＝0.83min；MS(ESIpos)：m/z＝777和779(M+H)+。
中间体F260
N6-(N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}-β-丙氨酰基)-N2-{N-[(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酰基}-L-赖氨酸/三氟乙酸(1∶1)
以类似于中间体F155的方法来制备标题化合物。
LC-MS(方法1)：Rt＝0.81min；MS(ESIpos)：m/z＝1020(M+H)+。
中间体F261
三氟乙酸/(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-N-(2-{2-[(溴乙酰基)氨基]乙氧基}乙基)丁酰胺(1∶1)
通过将20mg(0.03mmol)中间体C58与25.8mg(0.061mmol)中间体L77在HATU的存在下偶联、随后用氯化锌脱保护来制备标题化合物。得到11.9mg(理论值的47％，经2个步骤)标题化合物。
LC-MS(方法1)：Rt＝0.84min；MS(ESIpos)：m/z＝722和720(M+H)+。
中间体F262
S-{2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}-N-{3-[2-(2-{[3-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)丙酰基]氨基}乙氧基)乙氧基]丙酰基}-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1∶1)
首先将30mg(36μmol)S-{2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1∶1)(中间体C71)与16.9mg(40μmol)3-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-[2-(2-{3-[(2，5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-3-氧代丙氧基}乙氧基)乙基]丙酰胺加入1.5ml DMF中，并加入10.9mg(108μmol)4-甲基吗啉。将反应混合物在RT下搅拌过夜，然后加入7.58mg(0.13mmol)乙酸。将反应混合物通过制备型RP-HPLC直接纯化(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)。将溶剂在减压下蒸发，并将残余物在高真空下干燥。得到33.4mg(理论值的80％)化合物S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}-2，2-二甲基-6，12-二氧代-5-氧杂-7，11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-N-{3-[2-(2-{[3-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)丙酰基]氨基}乙氧基)乙氧基]丙酰基}-L-半胱氨酸。
LC-MS(方法1)：Rt＝1.34min；MS(ESIpos)：m/z＝1027(M+H)+。
将32.8mg(32μmol)S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}-2，2-二甲基-6，12-二氧代-5-氧杂-7，11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-N-{3-[2-(2-{[3-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)丙酰基]氨基}乙氧基)乙氧基]丙酰基}-L-半胱氨酸溶解于3.0ml三氟乙醇中，并加入26.1mg(192μmol)氯化锌。将反应混合物在50℃下搅拌2h。加入56.0mg(0.192mmol)乙二胺-N，N，N′，N′-四乙酸，将反应混合物搅拌10min，然后加入水(0.1％TFA)。直接通过RP-HPLC进行纯化(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)。将溶剂在减压下蒸发，并将残余物冻干。得到22.9mg(理论值的71％)标题化合物。
LC-MS(方法1)：Rt＝0.88min；MS(ESIpos)：m/z＝883(M+H)+。
中间体F263
N-[(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]-β-丙氨酰基-S-{2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1∶1)
将30.0mg(0.036mmol)R-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}-2，2-二甲基-6，12-二氧代-5-氧杂-7，11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1∶1)(中间体C71)和9.8mg(0.04mmol)N-[(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]-β-丙氨酸(中间体L78)溶解于1.0ml DMF中，并加入16.4mg(0.04mmol)HATU和14.0mg(0.11mmol)N，N-二异丙基乙胺。将反应混合物在RT下搅拌2小时。将反应混合物通过制备型RP-HPLC直接纯化(柱：Reprosil125×30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水/0.1％TFA)。将溶剂在减压下蒸发，并将残余物在高真空下干燥。得到4.2mg(13％)化合物N-[(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]-β-丙氨酰基-S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}-2，2-二甲基-6，12-二氧代-5-氧杂-7，11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-L-半胱氨酸。
LC-MS(方法6)：Rt＝1.31min；MS(ESIpos)：m/z＝925(M+H)+。
将113mg(0.011mmol)N-[(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]-β-丙氨酰基-S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}-2，2-二甲基-6，12-二氧代-5-氧杂-7，11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-L-半胱氨酸溶解于2.0ml三氟乙醇中，并加入5.0mg(0.04mmol)氯化锌。将反应混合物在50℃下搅拌2小时。加入10.7mg(0.04mmol)乙二胺-N，N，N′，N′-四乙酸，将反应混合物搅拌10min，然后加入水(0.1％TFA)。直接通过RP-HPLC进行纯化(柱：Reprosil 125×30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)。将溶剂在减压下蒸发，并将残余物在高真空下干燥。得到4.4mg(40％)标题化合物。
LC-MS(方法1)：Rt＝0.91min；MS(ESIpos)：m/z＝781(M+H)+。
中间体F264
N-[6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-β-丙氨酰基-S-{2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1∶1)
将30.0mg(0.036mmol)R-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}-2，2-二甲基-6，12-二氧代-5-氧杂-7，11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1∶1)(中间体C71)和12.2mg(0.04mmol)N-[6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-β-丙氨酸(中间体L79)溶解于1.0ml DMF中，并加入16.4mg(0.04mmol)HATU和14.0mg(0.11mmol)N，N-二异丙基乙胺。将反应混合物在RT下搅拌2小时。将反应混合物通过制备型RP-HPLC直接纯化(柱：Reprosil 125×30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水/0.1％TFA)。将溶剂在减压下蒸发，并将残余物在高真空下干燥。得到8.9mg(24％)化合物N-[6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-β-丙氨酰基-S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}-2，2-二甲基-6，12-二氧代-5-氧杂-7，11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-L-半胱氨酸。
LC-MS(方法6)：Rt＝1.38min；MS(ESIpos)：m/z＝981(M+H)+。
将15.3mg(0.015mmol)N-[6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-β-丙氨酰基-S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}-2，2-二甲基-6，12-二氧代-5-氧杂-7，11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-L-半胱氨酸溶解于2.0ml三氟乙醇中，并加入6.3mg(0.045mmol)氯化锌。将反应混合物在50℃下搅拌2小时。加入13.5mg(0.045mmol)乙二胺-N，N，N′，N′-四乙酸，将反应混合物搅拌10min，然后加入水(0.1％TFA)。直接通过RP-HPLC进行纯化(柱：Reprosil 125×30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)。将溶剂在减压下蒸发，并将残余物在高真空下干燥。得到9.1mg(62％)标题化合物。
LC-MS(方法1)：Rt＝0.92min；MS(ESIpos)：m/z＝837(M+H)+。
中间体F265
三氟乙酸/N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}-22-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-6，17-二氧代-10，13-二氧杂-3-硫杂-7，16-二氮杂二十二烷-1-酰胺(1∶1)
首先将30.0mg(42.7μmol)11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}-2，2-二甲基-6，12-二氧代-5-氧杂-14-硫杂-7，11-二氮杂-2-硅杂十七烷-17-酸(中间体C69)和25.3mg(55.6μmol)三氟乙酸/N-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙基}-6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺(1∶1)(中间体L82)加入1.9ml乙腈中，并加入于乙酸乙酯中的60μl(340μmol)N，N-二异丙基乙胺和33μl(56μmol)2，4，6-三丙基-1，3，5，2，4，6-三氧杂三次膦烷2，4，6-三氧化物50％。将反应混合物在RT下搅拌过夜。加入水(2.0ml)，并直接通过RP-HPLC进行纯化(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)。将溶剂在减压下蒸发，并将残余物在高真空下干燥。得到26.7mg(理论值的60％)化合物[4-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}-26-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-5，10，21-三氧代-14，17-二氧杂-7-硫杂-4，11，20-三氮杂二十六烷-1-基]氨基甲酸2-(三甲基硅烷基)乙酯。
LC-MS(方法1)：Rt＝1.40min；MS(ESIpos)：m/z＝1025(M+H)+。
将25.3mg(24.7μmol)[4-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}-26-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-5，10，21-三氧代-14，17-二氧杂-7-硫杂-4，11，20-三氮杂二十六烷-1-基]氨基甲酸2-(三甲基硅烷基)乙酯溶解于2.0三氟乙醇中，并加入20.2mg(148μmol)氯化锌。将反应混合物在50℃下搅拌1h。加入43.3mg(148μmol)乙二胺-N，N，N′，N′-四乙酸，将反应混合物搅拌10min，然后加入水(0.1％TFA)。直接通过RP-HPLC进行纯化(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)。将溶剂在减压下蒸发，并将残余物在高真空下干燥。得到23.4mg(理论值的95％)标题化合物。
LC-MS(方法1)：Rt＝0.89min；MS(ESIpos)：m/z＝881(M+H)+。
中间体F266
三氟乙酸/N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}-1-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-2，13-二氧代-6，9-二氧杂-16-硫杂-3，12-二氮杂十八烷-18-酰胺(1∶1)
首先将30.0mg(0.043mmol)11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}-2，2-二甲基-6，12-二氧代-5-氧杂-14-硫杂-7，11-二氮杂-2-硅杂十七烷-17-酸(中间体C69)与22.2mg(0.056mmol)三氟乙酸/N-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙基}-2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰胺(1∶1)(中间体L83)一起加入1.9ml乙腈中。然后加入60μl(0.34mmol)N，N-二异丙基乙胺，并逐滴加入33μl(0.056mmol)T3P(50％于乙酸乙酯中)。将反应混合物在RT下搅拌过夜。加入水(2.0ml)。将反应混合物通过制备型RP-HPLC直接纯化(柱：Reprosil 125×30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)。将溶剂在减压下蒸发，并将残余物在高真空下干燥。得到20.5mg(理论值的49％)化合物[19-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}-1-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-2，13，18-三氧代-6，9-二氧杂-16-硫杂-3，12，19-三氮杂二十二烷-22-基]氨基甲酸2-(三甲基硅烷基)乙酯。
LC-MS(方法1)：Rt＝1.38min；MS(ESIpos)：m/z＝969(M+H)+。
将19.1mg(19.7μmol)[19-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}-1-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-2，13，18-三氧代-6，9-二氧杂-16-硫杂-3，12，19-三氮杂二十二烷-22-基]氨基甲酸2-(三甲基硅烷基)乙酯溶解于2.0ml三氟乙醇中，并加入16.1mg(118μmol)氯化锌。将反应混合物在50℃下搅拌1h。加入34.6mg(118μmol)乙二胺-N，N，N′，N′-四乙酸，将反应混合物搅拌10min，然后加入水(0.1％TFA)。直接通过RP-HPLC进行纯化(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)。将溶剂在减压下蒸发，并将残余物在高真空下干燥。得到13.9mg(理论值的75％)标题化合物。
LC-MS(方法1)：Rt＝0.86min；MS(ESIpos)：m/z＝825(M+H)+。
中间体F267
S-{2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}-N-[1-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-2，18-二氧代-6，9，12，15-四氧杂-3-氮杂十八烷-18-基]-L-半胱氨酰基-β-丙氨酸/三氟乙酸(1∶1)
在氩气下，首先将13.4mg(33.3μmol)1-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-2-氧代-6，9，12，15-四氧杂-3-氮杂十八烷-18-酸(中间体L74)加入1.0ml DMF中，并加入9.3μl(54.4μmol)N，N-二异丙基乙胺和12.6mg(33.3μmol)HATU。将反应混合物在RT下搅拌10min。然后加入溶解于4.7μl(27.7μmol)N，N-二异丙基乙胺和1.0ml DMF中的25.0mg(27.7μmol)S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}-2，2-二甲基-6，12-二氧代-5-氧杂-7，11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-L-半胱氨酰基-β-丙氨酸/三氟乙酸(1∶1)(参见中间体F216的合成)。将反应混合物在RT下搅拌90分钟。将反应混合物通过制备型RP-HPLC直接纯化(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)。将溶剂在减压下蒸发，并将残余物在高真空下干燥。得到6.90mg(理论值的19％)化合物S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}-2，2-二甲基-6，12-二氧代-5-氧杂-7，11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-N-[1-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-2，18-二氧代-6，9，12，15-四氧杂-3-氮杂十八烷-18-基]-L-半胱氨酰基-β-丙氨酸。
LC-MS(方法5)：Rt＝4.44min；MS(ESIpos)：m/z＝1172(M+H)+。
将6.70mg(5.71μmol)S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}-2，2-二甲基-6，12-二氧代-5-氧杂-7，11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-N-[1-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-2，18-二氧代-6，9，12，15-四氧杂-3-氮杂十八烷-18-基]-L-半胱氨酰基-β-丙氨酸溶解于1.0ml三氟乙醇中，并加入4.67mg(34.3μmol)氯化锌。将反应混合物在50℃下搅拌1h。加入10mg(34.3μmol)乙二胺-N，N，N′，N′-四乙酸，将反应混合物搅拌10min，然后加入水(0.1％TFA)。直接通过RP-HPLC进行纯化(柱：Reprosil 250×30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)。将溶剂在减压下蒸发，并将残余物在高真空下干燥。得到4.4mg(理论值的67％)标题化合物。
LC-MS(方法1)：Rt＝0.85min；MS(ESIpos)：m/z＝1028(M+H)+。
中间体F268
三氟乙酸/N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}-28-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-6，23-二氧代-10，13，16，19-四氧杂-3-硫杂-7，22-二氮杂二十八烷-1-酰胺(1∶1)
首先将30.0mg(0.043mmol)11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}-2，2-二甲基-6，12-二氧代-5-氧杂-14-硫杂-7，11-二氮杂-2-硅杂十七烷-17-酸(中间体C69)与30.2mg(0.056mmol)三氟乙酸/N-(14-氨基-3，6，9，12-四氧杂十四烷-1-基)-6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺(1∶1)(中间体L84)一起加入2.0ml乙腈中。然后加入60μl(0.34mmol)N，N-二异丙基乙胺，并逐滴加入(0.056mmol)T3P(50％于乙酸乙酯中)。将反应混合物在RT下搅拌过夜。加入水(2.0ml)。将反应混合物通过制备型RP-HPLC直接纯化(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)。将溶剂在减压下蒸发，并将残余物在高真空下干燥。得到27.9mg(理论值的59％)化合物14-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}-32-(2，5-2氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-5，10，27-三氧代-14，17，20，23-四氧杂-7-硫杂-4，11，26-三氮杂三十二烷-1-基]氨基甲酸2-(三甲基硅烷基)乙酯。
LC-MS(方法1)：Rt＝1.41min；MS(ESIpos)：m/z＝1114(M+H)+。
将25.6mg(23.0μmol)[4-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}-32-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-5，10，27-三氧代-14，17，20，23-四氧杂-7-硫杂-4，11，26-三氮杂三十二烷-1-基]氨基甲酸2-(三甲基硅烷基)乙酯溶解于2.5ml三氟乙醇中，并加入18.8mg(138μmol)氯化锌。将反应混合物在50℃下搅拌1h。加入40.3mg(138μmol)乙二胺-N，N，N′，N′-四乙酸，将反应混合物搅拌10min，然后加入水(0.1％TFA)。直接通过RP-HPLC进行纯化(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)。将溶剂在减压下蒸发，并将残余物在高真空下干燥。得到22.2mg(理论值的88％)标题化合物。
LC-MS(方法1)：Rt＝0.94min；MS(ESIpos)：m/z＝969(M+H)+。
中间体F269
4-{[(8R，14R)-13-(3-氨基丙基)-14-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-1-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-15，15-二甲基-2，7，12-三氧代-10-硫杂-3，6，13-三氮杂十六烷-8-基]氨基}-4-氧代丁酸/三氟乙酸(1∶1)
首先将17.0mg(0.0195mmol)S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}-2，2-二甲基-6，12-二氧代-5-氧杂-7，11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-N-(4-叔丁氧基-4-氧代丁酰基)-L-半胱氨酸(中间体C77)与4.99mg(0.0253mmol)N-(2-氨基乙基)-2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰胺(中间体L1)一起加入1.0ml乙腈中。然后加入27μl(0.16mmol)N，N-二异丙基乙胺，并逐滴加入15μl(0.025mmol)T3P(50％于乙酸乙酯中)。将反应混合物在RT下搅拌过夜。加入水(2.0ml)。将反应混合物通过制备型RP-HPLC直接纯化(柱：Reprosil 125×30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)。将溶剂在减压下蒸发，并将残余物在高真空下干燥。得到9.5mg(理论值的46％)化合物4-{[(16R)-11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}-23-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-2，2-二甲基-6，12，17，22-四氧代-5-氧杂-14-硫杂-7，11，18，21-四氮杂-2-硅杂二十三烷-16-基]氨基}-4-氧代丁酸叔丁酯。
LC-MS(方法1)：Rt＝1.47min；MS(ESIpos)：m/z＝1052(M+H)+。
将8.3mg(7.89μmol)4-{[(16R)-11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}-23-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-2，2-二甲基-6，12，17，22-四氧代-5-氧杂-14-硫杂-7，11，18，21-四氮杂-2-硅杂二十三烷-16-基]氨基}-4-氧代丁酸叔丁酯溶解于1.0ml三氟乙醇中，并加入6.45mg(47.3μmol)氯化锌。将反应混合物在50℃下搅拌6h。加入6.45mg(47.3μmol)氯化锌，并将反应混合物在50℃下搅拌过夜。加入27.7mg(94.6μmol)乙二胺-N，N，N′，N′-四乙酸，并将反应混合物搅拌10min，然后加入水(0.1％TFA)。直接通过RP-HPLC进行纯化(柱：Reprosil 125×30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)。将溶剂在减压下蒸发，并将残余物在高真空下干燥。得到1.10mg(理论值的14％)标题化合物。
LC-MS(方法1)：Rt＝0.89min；MS(ESIpos)：m/z＝852(M+H)+。
中间体F270
三氟乙酸/N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}-N′-(2-{[(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙基)琥珀酰胺(1∶1)
在氩气下，首先将15.0mg(22.9μmol)11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}-2，2-二甲基-6，12-二氧代-5-氧杂-7，11-二氮杂-2-硅杂十五烷-15-酸(中间体C78)加入1.0ml DMF中，并加入8.0μl(45.8μmol)N，N-二异丙基乙胺和10.4mg(27.4μmol)HATU。将反应混合物在RT下搅拌10min。然后加入溶解于4.0μl(22.9μmol)N，N-二异丙基乙胺和1.0ml DMF中的8.54mg(27.4μmol)三氟乙酸/N-(2-氨基乙基)-2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯1-基)乙酰胺(1∶1)(中间体L1)。将反应混合物在RT下搅拌1h。将反应混合物通过制备型RP-HPLC直接纯化(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)。将溶剂在减压下蒸发并将残余物在高真空下干燥。得到14.7mg(理论值的77％)化合物[3-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}{4-[(2-{[(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙基)氨基]-4-氧代丁酰基}氨基)丙基]氨基甲酸2-(三甲基硅烷基)乙酯。
LC-MS(方法5)：Rt＝1.33min；MS(ESIpos)：m/z＝835(M+H)+。
将13.2mg(15.8μmol)[3-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}{4-[(2-{[(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙基)氨基]-4-氧代丁酰基}氨基)丙基]氨基甲酸2-(三甲基硅烷基)乙酯溶解于2.0ml三氟乙醇中，并加入12.9mg(94.8μmol)氯化锌。将反应混合物在50℃下搅拌1h。加入27.7mg(94.6μmol)乙二胺-N，N，N′，N′-四乙酸，将反应混合物搅拌10min，然后加入水(0.1％TFA)。直接通过RP-HPLC进行纯化(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)。将溶剂在减压下蒸发，并将残余物在高真空下干燥。得到10.9mg(理论值的83％)标题化合物。
LC-MS(方法1)：Rt＝0.83min；MS(ESIpos)：m/z＝691(M+H)+。
中间体F271
4-{[(20R，26R)-25-(3-氨基丙基)-26-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-1-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-27，27-二甲基-2，19，24-三氧代-6，9，12，15-四氧杂-22-硫杂-3，18，25-三氮杂二十八烷-20-基]氨基}-4-氧代丁酸/三氟乙酸(1∶1)
在氩气下，首先将19.4mg(22.2μmol)S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}-2，2-二甲基-6，12-二氧代-5-氧杂-7，11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-N-(4-叔丁氧基-4-氧代丁酰基)-L-半胱氨酸(中间体C77)加入2.0ml DMF中，并加入21.7mg(44.4μmol)三氟乙酸/N-(14-氨基-3，6，9，12-四氧杂十四烷-1-基)-2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰胺(1∶1)(中间体L74)、12μl(67μmol)N，N-二异丙基乙胺和16.9mg(44.4μmol)HATU。将反应混合物在RT下搅拌1h。将反应混合物通过制备型RP-HPLC直接纯化(柱：Reprosil 125×30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)。将溶剂在减压下蒸发，并将残余物在高真空下干燥。得到18.1mg(理论值的66％)化合物4-{[(16R)-11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}-35-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-2，2-二甲基-6，12，17，34-四氧代-5，21，24，27，30-五氧杂-14-硫杂-7，11，18，33-四氮杂-2-硅杂三十五烷-16-基]氨基}-4-氧代丁酸叔丁酯。
LC-MS(方法4)：Rt＝1.79min；MS(ESIpos)：m/z＝1250(M+Na)+。
将18.1mg(14.7μmol)4-{[(16R)-11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}-35-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-2，2-二甲基-6，12，17，34-四氧代-5，21，24，27，30-五氧杂-14-硫杂-7，11，18，33-四氮杂-2-硅杂三十五烷-16-基]氨基}-4-氧代丁酸叔丁酯溶解于2.0ml三氟乙醇中，加入12.0mg(88.4μmol)氯化锌。将反应混合物在50℃下搅拌4h。加入25.8mg(88.4μmol)乙二胺-N，N，N′，N′-四乙酸，将反应混合物搅拌10min，然后加入水(0.1％TFA)。直接通过RP-HPLC进行纯化(柱：Reprosil125×30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)。将溶剂在减压下蒸发，并将残余物在高真空下干燥。得到12.3mg(理论值的73％)标题化合物。
LC-MS(方法1)：Rt＝0.87min；MS(ESIpos)：m/z＝1028(M+H)+。
中间体F272
三氟乙酸/N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}-N′-[17-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-16-氧代-3，6，9，12-四氧杂-15-氮杂十七烷-1-基]琥珀酰胺(1∶1)
在氩气下，首先将15.0mg(22.9μmol)11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}-2，2-二甲基-6，12-二氧代-5-氧杂-7，11-二氮杂-2-硅杂十五烷-15-酸(中间体C78)加入1.0ml DMF中，并加入8.0μl(45.8μmol)N，N-二异丙基乙胺和10.4mg(27.4μmol)HATU。将反应混合物在RT下搅拌10min。然后加入溶解于4.0μl(22.9μmol)N，N-二异丙基乙胺和1.0ml DMF中的13.4mg(27.4μmol)三氟乙酸/N-(14-氨基-3，6，9，12-四氧杂十四烷-1-基)-2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰胺(1∶1)(中间体L85)。将反应混合物在RT下搅拌1h。将反应混合物通过制备型RP-HPLC直接纯化(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)。将溶剂在减压下蒸发，并将残余物在高真空下干燥。得到15.8mg(理论值的68％)化合物[23-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}-1-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-2，19，22-三氧代-6，9，12，15-四氧杂-3，18，23-三氮杂二十六烷-26-基]氨基甲酸2-(三甲基硅烷基)乙酯。
LC-MS(方法1)：Rt＝1.35min；MS(ESIpos)：m/z＝1011(M+H)+。
将15.1mg(14.9μmol)[23-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}-1-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-2，19，22-三氧代-6，9，12，15-四氧杂-3，18，23-三氮杂二十六烷-26-基]氨基甲酸2-(三甲基硅烷基)乙酯溶解于2.0ml三氟乙醇中，并加入12.2mg(89.6μmol)氯化锌。将反应混合物在50℃下搅拌1h。加入26.2mg(89.6μmol)乙二胺-N，N，N′，N′-四乙酸，将反应混合物搅拌10min，然后加入水(0.1％TFA)。直接通过RP-HPLC进行纯化(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)。将溶剂在减压下蒸发，并将残余物在高真空下干燥。得到10.3mg(理论值的70％)标题化合物。
LC-MS(方法1)：Rt＝0.88min；MS(ESIpos)：m/z＝867(M+H)+。
中间体F273
三氟乙酸/N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}-1-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-2，19-二氧代-6，9，12，15-四氧杂-22-硫杂-3，18-二氮杂二十四烷-24-酰胺(1∶1)
在氩气下，首先将20.0mg(28.5μmol)11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}-2，2-二甲基-6，12-二氧代-5-氧杂-14-硫杂-7，11-二氮杂-2-硅杂十七烷-17-酸(中间体C69)加入1.0mlDMF中，并加入10.0μl(57.0μmol)N，N-二异丙基乙胺和13.0mg(34.2μmol)HATU。将反应混合物在RT下搅拌10min。然后加入溶解于5.0μl(28.5μmol)N，N-二异丙基乙胺和1.0ml DMF中的16.7mg(34.2μmol)三氟乙酸/N-(14-氨基-3，6，9，12-四氧杂十四烷-1-基)-2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰胺(1∶1)(中间体L85)。将反应混合物在RT下搅拌1h。将反应混合物通过制备型RP-HPLC直接纯化(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)。将溶剂在减压下蒸发，并将残余物在高真空下干燥。得到18.6mg(理论值的62％)化合物[25-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}-1-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-2，19，24-三氧代-6，9，12，15-四氧杂-22-硫杂-3，18，25-三氮杂二十八烷-28-基]氨基甲酸2-(三甲基硅烷基)乙酯。
LC-MS(方法1)：Rt＝1.37min；MS(ESIpos)：m/z＝1057(M+H)+。
将17.1mg(16.2μmol)[25-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}-1-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-2，19，24-三氧代-6，9，12，15-四氧杂-22-硫杂-3，18，25-三氮杂二十八烷-28-基]氨基甲酸2-(三甲基硅烷基)乙酯溶解于2.0ml三氟乙醇中，并加入13.2mg(97.0μmol)氯化锌。将反应混合物在50℃下搅拌1h。加入28.4mg(97.0μmol)乙二胺-N，N，N′，N′-四乙酸，将反应混合物搅拌10min，然后加入水(0.1％TFA)。直接通过RP-HPLC进行纯化(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)。将溶剂在减压下蒸发，并将残余物在高真空下干燥。得到9.80mg(理论值的59％)标题化合物。
LC-MS(方法1)：Rt＝0.88min；MS(ESIpos)：m/z＝913(M+H)+。
中间体F274
N-[(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酰基-S-{2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1∶1)
首先将13.9mg(0.0167mmol)S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}-2，2-二甲基-6，12-二氧代-5-氧杂-7，11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1∶1)(中间体C71)与7.07mg(0.0217mmol)N-[(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酸(中间体L86)一起加入2.0ml乙腈中。然后加入23μl(0.13mmol)N，N-二异丙基乙胺，并逐滴加入13μl(0.022mmol)T3P(50％于乙酸乙酯中)。将反应混合物在RT下搅拌过夜。将反应混合物通过制备型RP-HPLC直接纯化(柱：Reprosil 125×30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)。将溶剂在减压下蒸发，并将残余物在高真空下干燥。得到3.70mg(理论值的19％)化合物N-[(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酰基-S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}-2，2-二甲基-6，12-二氧代-5-氧杂-7，11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-L-半胱氨酸。
LC-MS(方法1)：Rt＝1.34min；MS(ESIpos)：m/z＝1024(M+H)+。
将10.6mg(10.3μmol)N-[(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酰基-S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}-2，2-二甲基-6，12-二氧代-5-氧杂-7，11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-L-半胱氨酸溶解于2.0ml三氟乙醇中，并加入8.46mg(62.1μmol)氯化锌。将反应混合物在50℃下搅拌1h。加入18.1mg(62.1μmol)乙二胺-N，N，N′，N′-四乙酸，将反应混合物搅拌10min，然后加入水(0.1％TFA)。直接通过RP-HPLC进行纯化(柱：Reprosil125×30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)。将溶剂在减压下蒸发，并将残余物在高真空下干燥。得到5.60mg(理论值的54％)标题化合物。
LC-MS(方法12)：Rt＝1.69min；MS(ESIpos)：m/z＝880(M+H)+。
中间体F275
N-[3-({2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}硫烷基)丙酰基]-N-(2-{[(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙基)-L-α-谷氨酰胺/三氟乙酸(1∶1)
首先将39.0mg(55.6μmol)11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}-2，2-二甲基-6，12-二氧代-5-氧杂-14-硫杂-7，11-二氮杂-2-硅杂十七烷-17-酸(中间体C69)加入4.0ml DMF中，加入41.6mg(111μmol)5-[2-(三甲基硅烷基)乙基]-L-谷氨酸1-苄基酯盐酸盐(1∶1)(中间体L89)、29μl(170μmol)N，N-二异丙基乙胺和42.3mg(111μmol)HATU，并将混合物在RT下搅拌1小时。将反应混合物在RT下搅拌1小时，用乙酸淬灭并通过制备型RP-HPLC直接纯化(柱：Reprosil250×30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)。将溶剂在减压下蒸发，并将残余物在高真空下干燥。得到53.1mg(理论值的93％)化合物5-[2-(三甲基硅烷基)乙基]-N-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}-2，2-二甲基-6，12，17-三氧代-5-氧杂-14-硫杂-7，11-二氮杂-2-硅杂十七烷-17-基)-L-谷氨酸1-苄基酯。
LC-MS(方法1)：Rt＝1.71min；MS(ESIpos)：m/z＝1021[M+H]+。
在氩气下，首先将7.60mg(33.9μmol)乙酸钯(II)加入3.0ml二氯甲烷中，并加入14μl(100μmol)三乙胺和110μl(680μmol)三乙基硅烷。将反应混合物在RT下搅拌5min，并加入溶解于3.0ml二氯甲烷中的69.2mg(67.7μmol)5-[2-(三甲基硅烷基)乙基]-N-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}-2，2-二甲基-6，12，17-三氧代-5-氧杂-14-硫杂-7，11-二氮杂-2-硅杂十七烷-17-基)-L-谷氨酸1-苄基酯。将反应混合物在RT下搅拌过夜。将反应混合物通过纸板过滤器过滤，并将滤饼用二氯甲烷洗涤。将溶剂在减压下蒸发。将残余物通过制备型RP-HPLC纯化(柱：Reprosil 250×30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)。将溶剂在减压下蒸发，并将残余物在高真空下干燥。得到38.4mg(理论值的61％)化合物(19S)-11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}-2，2-二甲基-6，12，17-三氧代-19-{3-氧代-3-[2-(三甲基硅烷基)乙氧基]丙基}-5-氧杂-14-硫杂-7，11，18-三氮杂-2-硅杂二十烷-20-酸。
LC-MS(方法1)：Rt＝1.53min；MS(ESIpos)：m/z＝931(M+H)+。
首先将10.0mg(10.7μmol)(19S)-11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}-2，2-二甲基-6，12，17-三氧代-19-{3-氧代-3-[2-(三甲基硅烷基)乙氧基]丙基}-5-氧杂-14-硫杂-7，11，18-三氮杂-2-硅杂二十烷-20-酸(中间体C69)加入1.0ml DMF中，加入6.73mg(21.5μmol)N-(2-氨基乙基)-2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰胺/2，2，2-三氟乙烷-1，1-二醇(1∶1)(中间体L1)、5.6μl(32μmol)N，N-二异丙基乙胺和8.17mg(21.5μmol)HATU，并将混合物在RT下搅拌1小时。将反应混合物在RT下搅拌3小时，用乙酸淬灭并通过制备型RP-HPLC直接纯化(柱：Reprosil 125×30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)。将溶剂在减压下蒸发，并将残余物在高真空下干燥。得到6.90mg(理论值的58％)化合物N2-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}-2，2-二甲基-6，12，17-三氧代-5-氧杂-14-硫杂-7，11-二氮杂-2-硅杂十七烷-17-基)-N-(2-{[(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙基)-L-α-谷氨酸2-(三甲基硅烷基)乙酯。
LC-MS(方法1)：Rt＝1.57min；MS(ESIpos)：m/z＝1110[M+H]+。
将6.90mg(6.21μmol)N2-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}-2，2-二甲基-6，12，17-三氧代-5-氧杂-14-硫杂-7，11-二氮杂-2-硅杂十七烷-17-基)-N-(2-{[(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙基)-L-α-谷氨酸2-(三甲基硅烷基)乙酯溶解于2.0ml三氟乙醇中，并加入5.1mg(37.2μmol)氯化锌。将反应混合物在50℃下搅拌3h。加入5.1mg(37.2μmol)氯化锌，并将反应混合物在50℃下搅拌3h。加入5.1mg(37.2μmol)氯化锌，并将反应混合物在50℃下搅拌3h。加入10.1mg(74.4μmol)氯化锌，并将反应混合物在50℃下搅拌过夜并在RT下搅拌72h。加入54.5mg(186μmol)乙二胺-N，N，N′，N′-四乙酸，将反应混合物搅拌10min，然后加入水(0.1％TFA)。直接通过RP-HPLC进行纯化(柱：Reprosil 125×30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)。将溶剂在减压下蒸发，并将残余物在高真空下干燥。得到2.4mg(理论值的39％)标题化合物。
LC-MS(方法1)：Rt＝0.86min；MS(ESIpos)：m/z＝866(M+H)+。
中间体F276
S-{2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}-N-{3-[2-(2-{[(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙氧基)乙氧基]丙酰基}-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1∶1)
在氩气下，首先将9.08mg(28.9μmol)3-[2-(2-{[(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙氧基)乙氧基]丙酸(中间体L87)加入1.0ml DMF中，并加入8.33μl(48.2μmol)N，N-二异丙基乙胺和11.0mg(28.9μmol)HATU。将反应混合物在RT下搅拌10min。然后加入溶解于4.67μl(24.1μmol)N，N-二异丙基乙胺和1.0ml DMF中的20.0mg(27.7μmol)S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}-2，2-二甲基-6，12-二氧代-5-氧杂-7，11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1∶1)(中间体C71)。将反应混合物在RT下搅拌1h。将反应混合物通过制备型RP-HPLC直接纯化(柱：Reprosil 250×30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)。将溶剂在减压下蒸发，并将残余物在高真空下干燥。得到4.70mg(理论值的19％)化合物S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}-2，2-二甲基-6，12-二氧代-5-氧杂-7，11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-N-{3-[2-(2-{[(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙氧基)乙氧基]丙酰基}-L-半胱氨酸。
LC-MS(方法12)：Rt＝2.47min；MS(ESIpos)：m/z＝1013(M+H)+。
将13.9mg(13.7μmol)S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}-2，2-二甲基-6，12-二氧代-5-氧杂-7，11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-N-{3-[2-(2-{[(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙氧基)乙氧基]丙酰基}-L-半胱氨酸溶解于2.0ml三氟乙醇中，并加入5.6mg(41.2μmol)氯化锌。将反应混合物在50℃下搅拌1h。加入5.6mg(41.2μmol)氯化锌，并将反应混合物在50℃下搅拌30分钟。加入24.1mg(82.4μmol)乙二胺-N，N，N′，N′-四乙酸，并将反应混合物搅拌10min，然后加入水(0.1％TFA)。直接通过RP-HPLC进行纯化(柱：Reprosil 250×30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)。将溶剂在减压下蒸发，并将残余物在高真空下干燥。得到10.8mg(理论值的80％)标题化合物。
LC-MS(方法12)：Rt＝1.58min；MS(ESIpos)：m/z＝869(M+H)+。
中间体F277
N-[3-({2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}硫烷基)丙酰基]-3-[(溴乙酰基)氨基]-D-丙氨酸/三氟乙酸(1∶1)
将8.90mg(8.88μmol)三氟乙酸/3-氨基-N-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}-2，2-二甲基-6，12，17-三氧代-5-氧杂-14-硫杂-7，11-二氮杂-2-硅杂十七烷-17-基)-D-丙氨酸2-(三甲基硅烷基)乙酯(1∶1)(中间体C80)和2.31mg(9.77μmol)1-(2-溴乙酰氧基)吡咯烷-2，5-二酮溶解于1ml二甲基甲酰胺中，并加入2.9μl(27μmol)N-甲基吗啉。将反应混合物在RT下搅拌1h。将反应混合物通过制备型RP-HPLC直接纯化(柱：Reprosil 125×30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水/0.1％TFA)。将溶剂在减压下蒸发，并将残余物在高真空下干燥。得到5.80mg(理论值的65％)化合物N-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}-2，2-二甲基-6，12，17-三氧代-5-氧杂-14-硫杂-7，11-二氮杂-2-硅杂十七烷-17-基)-3-[(溴乙酰基)氨基]-D-丙氨酸2-(三甲基硅烷基)乙酯。
LC-MS(方法1)：Rt＝1.57min；MS(ESIpos)：m/z＝1008(M+H)+。
将5.80mg(5.75μmol)N-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}-2，2-二甲基-6，12，17-三氧代-5-氧杂-14-硫杂-7，11-二氮杂-2-硅杂十七烷-17-基)-3-[(溴乙酰基)氨基]-D-丙氨酸2-(三甲基硅烷基)乙酯溶解于2.0ml三氟乙醇中，并加入4.70mg(34.5μmol)氯化锌。将反应混合物在50℃下搅拌3h。加入4.70mg(34.5μmol)氯化锌，并将反应混合物在50℃下搅拌5h。加入20.2mg(69.0μmol)乙二胺-N，N，N′，N′-四乙酸，并将反应混合物搅拌10min，然后加入水(0.1％TFA)。直接通过RP-HPLC进行纯化(柱：Reprosil 125×30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)。将溶剂在减压下蒸发，并将残余物在高真空下干燥。得到1.70mg(理论值的34％)标题化合物。
LC-MS(方法1)：Rt＝0.90min；MS(ESIpos)：m/z＝764(M+H)+。
中间体F278
N-[3-({2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}硫烷基)丙酰基]-3-{[(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}-D-丙氨酸/三氟乙酸(1∶1)
将10.0mg(9.98μmol)三氟乙酸/3-氨基-N-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}-2，2-二甲基-6，12，17-三氧代-5-氧杂-14-硫杂-7，11-二氮杂-2-硅杂十七烷-17-基)-D-丙氨酸2-(三甲基硅烷基)乙酯(1∶1)(中间体C80)和2.77mg(11.0μmol)1-{2-[(2，5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-2-氧代乙基}-1H-吡咯-2，5-二酮溶解于1ml二甲基甲酰胺中，并加入3.3μl(30μmol)N-甲基吗啉。将反应混合物在RT下搅拌过夜。加入2.0μl(35μmol)乙酸，并将反应混合物通过制备型RP-HPLC直接纯化(柱：Reprosil 125×30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水/0.1％TFA)。将溶剂在减压下蒸发，并将残余物在高真空下干燥。得到5.50mg(理论值的54％)化合物N-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}-2，2-二甲基-6，12，17-三氧代-5-氧杂-14-硫杂-7，11-二氮杂-2-硅杂十七烷-17-基)-3-{[(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}-D-丙氨酸2-(三甲基硅烷基)乙酯。
LC-MS(方法1)：Rt＝1.51min；MS(ESIpos)：m/z＝1024(M+H)+。
将5.50mg(5.36μmol)N-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}-2，2-二甲基-6，12，17-三氧代-5-氧杂-14-硫杂-7，11-二氮杂-2-硅杂十七烷-17-基)-3-{[(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}-D-丙氨酸2-(三甲基硅烷基)乙酯溶解于1.0ml三氟乙醇中，并加入4.39mg(32.2μmol)氯化锌。将反应混合物在50℃下搅拌1h。加入4.39mg(32.2μmol)氯化锌，并将反应混合物在50℃下搅拌1h。加入4.39mg(32.2μmol)氯化锌，并将反应混合物在50℃下搅拌4h。加入28.2mg(96.5μmol)乙二胺-N，N，N′，N′-四乙酸，并将反应混合物搅拌10min，然后加入水(0.1％TFA)。直接通过RP-HPLC进行纯化(柱：Reprosil 125×30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)。将溶剂在减压下蒸发，并将残余物在高真空下干燥。得到2.70mg(理论值的56％)标题化合物。
LC-MS(方法1)：Rt＝0.89min；MS(ESIpos)：m/z＝781(M+H)+。
中间体F279
N-[6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-N-[3-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}[({(2R)-2-羧基-2-[(3-羧基丙酰基)氨基]乙基}硫烷基)乙酰基]氨基)丙基]-L-丙氨酰胺
将12.2mg(14μmol)S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}-2，2-二甲基-6，12-二氧代-5-氧杂-7，11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-N-(4-叔丁氧基-4-氧代丁酰基)-L-半胱氨酸(中间体C77)溶解于2.0ml三氟乙醇中，并加入11.4mg(83.8μmol)氯化锌。将反应混合物在50℃下搅拌3h。加入24.5mg(83.8μmol)乙二胺-N，N，N′，N′-四乙酸，将反应混合物搅拌10min，然后加入水(0.1％TFA)。直接通过RP-HPLC进行纯化(柱：Reprosil 125×30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)。将溶剂在减压下蒸发，并将残余物在高真空下干燥。得到4.60mg(理论值的42％)化合物4-{[(1R)-2-({2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}硫烷基)-1-羧基乙基]氨基}-4-氧代丁酸/三氟乙酸(1∶1)。
LC-MS(方法1)：Rt＝0.88min；MS(ESIpos)：m/z＝673(M+H)+。
将10.0mg(12.7μmol)4-{[(1R)-2-({2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}硫烷基)-1-羧基乙基]氨基}-4-氧代丁酸/三氟乙酸(1∶1)和7.41mg(12.7μmol)N-[6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酸2，5-二氧代吡咯烷-1-基酯(中间体L88)溶解于1.5ml二甲基甲酰胺中，并加入4.4μl(25μmol)N，N-二异丙基乙胺。将反应混合物在RT下搅拌2h。加入2.0μl(35μmol)乙酸，并将反应混合物通过制备型RP-HPLC直接纯化(柱：Reprosil 250×30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水/0.1％TFA)。将溶剂在减压下蒸发，并将残余物在高真空下干燥。得到5.20mg(理论值的39％)标题化合物。
LC-MS(方法1)：Rt＝1。11min；MS(ESIpos)：m/z＝1036(M+H)+。
中间体F280
三氟乙酸/N-[2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}氨基)乙基]-3-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)苯甲酰胺(1∶1)
由中间体C64通过与市售的1-(3-{[(2，5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]羰基}苯基)-1H-吡咯-2，5-二酮偶联、随后用氯化锌脱保护来制备标题化合物。
LC-MS(方法1)：Rt＝0.88min；MS(ESIpos)：m/z＝755(M+H)+。
中间体F281
N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}-3-{[N-(溴乙酰基)-β-丙氨酰基]氨基}-D-丙氨酸/三氟乙酸(1∶1)
首先，通过肽化学的经典方法制备经修饰的氨基酸结构单元N-(溴乙酰基)-β-丙氨酸和3-氨基-N-(叔丁氧基羰基)-D-丙氨酸2-(三甲基硅烷基)乙基酯。然后将它们在HATU和吗啉的存在下偶联。然后使用10％浓度的三氟乙酸在二氯甲烷中除去叔丁氧基羰基保护基团，得到中间体3-{[N-(溴乙酰基)-β-丙氨酰基]氨基}-D-丙氨酸2-(三甲基硅烷基)乙酯。
最后，通过将该中间体与中间体C58在HATU和4-甲基吗啉的存在下偶联、随后用氯化锌脱保护来制备标题化合物。
LC-MS(方法1)：Rt＝0.87min；MS(ESIpos)：m/z＝791和793(M+H)+。
中间体F282
三氟乙酸/(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-N-(3-{[N-(溴乙酰基)甘氨酰基]氨基}丙基)丁酰胺(1∶1)
首先，通过肽化学的经典方法，由甘氨酸叔丁酯和溴代乙酸酐来制备中间体三氟乙酸/N-(3-氨基丙基)-N2-(溴乙酰基)甘氨酰胺(1∶1)。
最后，通过将该中间体与中间体C58在HATU和4-甲基吗啉的存在下偶联、随后用氯化锌脱保护来制备标题化合物。
LC-MS(方法1)：Rt＝0.83min；MS(ESIpos)：m/z＝747和749(M+H)+。
中间体F283
N-[(2R)-2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}氨基)-2-羧基乙基]-N2-(溴乙酰基)-L-α-天冬酰胺/三氟乙酸(1∶1)
首先，由(2S)-2-氨基-4-氧代-4-[2-(三甲基硅烷基)乙氧基]丁酸和溴代乙酸酐制备经修饰的氨基酸结构单元(2S)-2-[(溴乙酰基)氨基]-4-氧代-4-[2-(三甲基硅烷基)乙氧基]丁酸和溴代乙酸酐，并由市售的3-{[(苄氧基)羰基]氨基}-N-(叔丁氧基羰基)-D-丙氨酸/N-环己基环己胺(1∶1)制备氨基酸结构单元3-氨基-N-(叔丁氧基羰基)-D-丙氨酸2-(三甲基硅烷基)乙基酯。将两种结构单元在HATU和吗啉的存在下偶联，然后使用5％浓度的三氟乙酸在二氯甲烷中除去叔丁氧基羰基保护基团，得到甲硅烷基乙基酯保护基团，因而得到中间体三氟乙酸/2-(三甲基硅烷基)乙基-N-{(2R)-2-氨基-3-氧代-3-[2-(三甲基硅烷基)乙氧基]丙基}-N2-(溴乙酰基)-L-α-天冬酰胺(1∶1)。
最后，通过将该中间体与中间体C58在HATU和4-甲基吗啉的存在下偶联、随后用氯化锌脱保护来制备标题化合物。
LC-MS(方法1)：Rt＝0.84min；MS(ESIpos)：m/z＝835和837(M+H)+。
中间体F284
N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}-3-{[1-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-2，18-二氧代-6，9，12，15-四氧杂-3-氮杂十八烷-18-基]氨基}-D-丙氨酸/三氟乙酸(1∶1)
首先，将中间体L80与市售的(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酸在HATU和N，N-二异丙基乙胺的存在下偶联，然后使用16％浓度的三氟乙酸在二氯甲烷中除去叔丁氧基羰基保护基团，得到甲硅烷基乙基酯保护基团。
最后，通过将该中间体与中间体C58在HATU和N，N-二异丙基乙胺的存在下偶联、随后用氯化锌脱保护来制备标题化合物。
LC-MS(方法12)：Rt＝1.46min；MS(ESIpos)：m/z＝984.45(M+H)+。
中间体F285
N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}-3-[(18-溴-17-氧代-4，7，10，13-四氧杂-16-氮杂十八烷-1-酰基)氨基]-D-丙氨酸/三氟乙酸(1∶1)
首先，将中间体L80用市售的溴代乙酸酐酰化，然后使用20％浓度的三氟乙酸在二氯甲烷中除去叔丁氧基羰基保护基团，得到甲硅烷基乙基酯保护基团。
最后，通过将该中间体与中间体C58在HATU和N，N-二异丙基乙胺的存在下偶联、随后用氯化锌脱保护来制备标题化合物。
LC-MS(方法1)：Rt＝0.85min；MS(ESIpos)：m/z＝967和969(M+H)+。
中间体F286
1-[(N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}-3-{[(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}-D-丙氨酰基)氨基]-3，6，9，12-四氧杂十五烷-15-酸/三氟乙酸(1∶1)
首先，将中间体L91与(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酸在HATU和N，N-二异丙基乙胺的存在下偶联，然后使用12.5％浓度的TFA在DCM中去除Boc保护基团。将所得中间体与中间体C58在HATU和N，N-二异丙基乙胺的存在下偶联，然后通过用氯化锌脱保护而转化为标题化合物。
LC-MS(方法1)：Rt＝0.84min；MS(ESIpos)：m/z＝984(M+H)+。
中间体F288
N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}-3-({N-[(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]-L-丝氨酰基}氨基)-D-丙氨酸/三氟乙酸(1∶1)
将35mg(39μmol)中间体C74在HATU和N，N-二异丙基乙胺的存在下与N-[(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]-L-丝氨酸(其已由O-叔丁基-L-丝氨酸叔丁酯和(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酸提前制备)偶联。用氯化锌脱保护并通过HPLC纯化得到14mg(理论值的38％)标题化合物。
LC-MS(方法12)：Rt＝1.43min；MS(ESIpos)：m/z＝824.34(M+H)+。
中间体F289
N2-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}-N6-[(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]-D-赖氨酸/三氟乙酸盐(1∶1)
首先，通过肽化学的经典方法由N6-[(苄氧基)羰基]-N2-(叔丁氧基羰基)-D-赖氨酸来制备三氟乙酸/N6-[(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]-D-赖氨酸2-(三甲基硅烷基)乙基酯(1∶1)。
然后将12.5mg(25μmol)该中间体在HATU和4-甲基吗啉的存在下与15mg(23μmol)中间体C58偶联。用氯化锌脱保护并通过HPLC纯化得到14mg(理论值的53％)标题化合物。
LC-MS(方法1)：Rt＝0.83min；MS(ESIpos)：m/z＝779(M+H)+。
中间体F290
N2-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}-N6-(溴乙酰基)-D-赖氨酸/三氟乙酸(1∶1)
首先，通过肽化学的经典方法由N6-[(苄氧基)羰基]-N2-(叔丁氧基羰基)-D-赖氨酸来制备三氟乙酸/N6-(溴乙酰基)-D-赖氨酸2-(三甲基硅烷基)乙基酯(1∶1)。
然后将12mg(25μmol)该中间体在HATU和4-甲基吗啉的存在下与15mg(23μmol)中间体C58偶联。用氯化锌脱保护并通过HPLC纯化得到7mg(理论值的36％)标题化合物。
LC-MS(方法1)：Rt＝0.86min；MS(ESIpos)：m/z＝762和764(M+H)+。
中间体F291
N-[(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]-L-缬氨酰基-N-{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丙基}-L-丙氨酰胺
首先由实施例M9通过与N-[(苄氧基)羰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酸在HATU和N，N-二异丙基乙胺的存在下偶联来制备标题化合物。在下一步骤中，通过在10％钯活性炭上在RT下在氢标准压力下氢化1小时来去除z保护基团，然后通过与(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酸在HATU和N，N-二异丙基乙胺的存在下偶联而将脱保护的中间体转化为标题化合物。
LC-MS(方法1)：Rt＝1.21min；MS(ESIpos)：m/z＝777(M+H)+。
中间体F293
N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}-3-{[(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)苯甲酰基]氨基}-D-丙氨酸/三氟乙酸(1∶1)
将35mg(39μmol)中间体C74溶解于4ml DMF中，并在N，N-二异丙基乙胺的存在下与13.5mg(43μmol)市售的1-(3-{[(2，5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]羰基}苯基)-1H-吡咯-2，5-二酮偶联。用氯化锌脱保护并通过HPLC纯化得到12mg(理论值的34％)标题化合物。
LC-MS(方法12)：Rt＝0.93min；MS(ESIpos)：m/z＝799(M+H)+。
中间体F294
N-{5-[(2，5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-5-氧代戊酰基}-L-缬氨酰基-N-{(1S)-3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-1-羧基丙基}-L-丙氨酰胺
将溶解于12ml甲醇中的41mg(0.05mmol)中间体C76在10mg的10％钯活性炭上在RT下在氢标准压力下氢化1h。然后将催化剂滤出。并将溶剂在减压下去除。得到32mg(理论值的92％)脱保护的中间体。
将15mg(0.022mmol)该中间体溶解于DMF中，并加入13mg(0.039mmol)1，1′-[(1，5-二氧代戊烷-1，5-二基)二(氧基)]二吡咯烷-2，5-二酮和7μl的N，N-二异丙基乙胺。在RT下搅拌1h后，将反应物浓缩，并将残余物通过HPLC纯化。得到9mg(理论值的45％)标题化合物。
LC-MS(方法1)：Rt＝1.08min；MS(ESIpos)：m/z＝895(M+H)+。
中间体F295
N-[(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]-L-缬氨酰基-N-{(1S)-3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-1-羧基丙基}-L-丙氨酰胺
将溶解于12ml甲醇中的41mg(0.05mmol)中间体C76在10mg10％钯活性炭上在RT下在氢标准压力下氢化1h。然后将催化剂滤出，并将溶剂在减压下去除。得到32mg(理论值的92％)脱保护的中间体。
将15mg(0.022mmol)该中间体溶解于4ml DMF中，并加入10mg(0.039mmol)1-{2-[(2，5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-2-氧代乙基}-1H-吡咯-2，5-二酮和7μl N，N-二异丙基乙胺。在RT下搅拌2h后，将反应物浓缩，并将残余物通过HPLC纯化。得到10mg(理论值的56％)标题化合物。
LC-MS(方法1)：Rt＝1.08min；MS(ESIpos)：m/z＝821(M+H)+。
中间体F296
三氟乙酸/(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-N-{2-[(2-{[(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙基)磺酰基]乙基}丁酰胺(1∶1)
由中间体L81通过与中间体C58在HATU和N，N-二异丙基乙胺的存在下偶联来制备标题化合物。在下一步骤中，通过在10％钯活性炭上在DCM/甲醇1∶1中在RT下在氢标准压力下氢化30min来除去z保护基团。然后将脱保护的中间体通过与(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酸在HATU和N，N-二异丙基乙胺的存在下偶联、最后用氯化锌脱保护而转化为标题化合物。
LC-MS(方法1)：Rt＝0.83min；MS(ESIpos)：m/z＝785(M+H)+。
中间体F297
S-{2-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}(吡咯烷-3-基甲基)氨基]-2-氧代乙基}-N-[6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1∶1)(异构体1)
在氩气下，将15mg(0.11mmol)氯化锌加入36mg(0.03mmol，纯度68％)S-[2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}{[1-(叔丁氧基羰基)吡咯烷-3-基]甲基}氨基)-2-氧代乙基]-N-[6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡-1-基)己酰基]-L-半胱氨酸(中间体C92)于0.74ml 2，2，2-三氟乙醇中的溶液中，并将反应混合物在50℃下搅拌7h。然后加入32mg(0.11mmol)EDTA，并将混合物搅拌15分钟。将乙酸乙酯加入反应混合物中，并将有机相用水和饱和NaCl溶液反复洗涤。将有机相经硫酸镁干燥，并将溶剂在减压下蒸发。将残余物通过制备型HPLC纯化。得到6.4mg(理论值的25％)标题化合物。
LC-MS(方法1)：Rt＝0.95min；MS(ESIpos)：m/z＝792(M+H-CF3CO2H)+。
中间体F298
S-{2-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}(吡咯烷-3-基甲基)氨基]-2-氧代乙基}-N-[6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1∶1)(异构体2)
在氩气下，将19mg(0.14mmol)氯化锌加入45mg(0.04mmol，纯度71％)S-[2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}{[1-(叔丁氧基羰基)吡咯烷-3-基]甲基}氨基)-2-氧代乙基]-N-[6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-半胱氨酸(中间体C91)于0.94ml 2，2，2-三氟乙醇中的溶液中，并将反应混合物在50℃下搅拌3h。然后加入42mg(0.14mmol)EDTA，并将混合物搅拌15分钟。将乙酸乙酯加入反应混合物中，并将有机相用水和饱和NaCl溶液反复洗涤。将有机相经硫酸镁干燥，并将溶剂在减压下蒸发。将残余物通过制备型HPLC纯化。得到5.7mg(理论值的18％)标题化合物。
LC-MS(方法1)：Rt＝0.96min；MS(ESIpos)：m/z＝791(M+H-CF3CO2H)+。
中间体F299
S-(2-{(3-氨基丙基)[(R)-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基](环己基)甲基]氨基}-2-氧代乙基)-N-[6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1∶1)
将76.8mg(0.57mmol)氯化锌加入88.0mg(0.09mmol)S-{11-[(R)-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基](环己基)甲基]-2，2-二甲基-6，12-二氧代-5-氧杂-7，11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基}-N-[6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-半胱氨酸(中间体C84)于1.88ml 2，2，2-三氟乙醇中的溶液中，并将反应混合物在50℃下搅拌3h。然后加入164.6mg(0.57mmol)EDTA，并将混合物搅拌15分钟。将乙酸乙酯加入反应混合物中，并将有机相用水和饱和NaCl溶液反复洗涤。将有机相经硫酸钠干燥，并将溶剂在减压下蒸发。将残余物通过制备型HPLC纯化。得到31mg(理论值的35％)标题化合物。
LC-MS(方法12)：Rt＝1.82min；MS(ESIpos)：m/z＝792(M+H)+。
中间体F300
(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-N-(2-{[(2R)-2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)丙酰基]氨基}乙基)丁酰胺
在氩气下，将11mg(0.08mmol)氯化锌加入7mg(0.08mmol){(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-1-[(2-{[(2R)-2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)丙酰基]氨基}乙基)氨基]-1-氧代丁-2-基}氨基甲酸2-(三甲基硅烷基)乙基酯(中间体C100)于0.2ml 2，2，2-三氟乙醇中的溶液中，并将反应混合物在50℃下搅拌8h。然后加入14mg(0.05mmol)EDTA，并将混合物搅拌15分钟。将乙酸乙酯加入反应混合物中，并将有机相用水和饱和NaCl溶液反复洗涤。将有机相经硫酸镁干燥，并将溶剂在减压下蒸发。将残余物通过制备型HPLC纯化。得到1.6mg(理论值的27％)标题化合物。
LC-MS(方法1)：Rt＝0.88min；MS(ESIpos)：m/z＝707(M+H-CF3CO2H)+。
中间体F302
S-{2-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}(吡咯烷-3-基甲基)氨基]-2-氧代乙基}-N-[(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]-L-半胱氨酸/三氟乙酸盐(1∶1)(异构体1)
在氩气下，将31.7mg(0.23mmol)氯化锌加入56.9mg(58.2mmol，纯度85％)S-[2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}{[(1-(叔丁氧基羰基)吡咯烷-3-基]甲基}氨基)-2-氧代乙基]-N-[(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]-L-半胱氨酸(中间体C94)于1.4ml2，2，2-三氟乙醇中的混合物中，并将反应混合物在50℃下搅拌3h。然后加入68.0mg(0.23mmol)EDTA，并将混合物搅拌15分钟。将乙酸乙酯加入反应混合物中，并将有机相用水和饱和NaCl溶液反复洗涤。将有机相经硫酸镁干燥，并将溶剂在减压下蒸发。将残余物通过制备型HPLC纯化。得到7mg(理论值的13％)标题化合物。
LC-MS(方法1)：Rt＝0.91min；MS(ESIpos)：m/z＝736(M+H-CF3CO2H)+。
中间体F304
N-(2-{[3-({2-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}(吡咯烷-3-基甲基)氨基]-2-氧代乙基}硫烷基)丙酰基]氨基}乙基)-6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺(1∶1)三氟乙酸(异构体2)
将13.2mg(0.10mmol)氯化锌加入22.3mg(0.02mmol)3-[2-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}-18-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-3，8，13-三氧代-5-硫杂-2，9，12-三氮杂十八烷-1-基]吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(中间体98)于0.64ml 2，2，2-三氟乙醇中的溶液中，并将反应混合物在50℃下搅拌8h。然后加入28.36mg(0.10mmol)EDTA，并将混合物搅拌15分钟。将乙酸乙酯加入反应混合物中，并将有机相用水和饱和NaCl溶液反复洗涤。将有机相经硫酸镁干燥，并将溶剂在减压下蒸发。将残余物通过制备型HPLC纯化。得到5mg(理论值的24％)标题化合物。
LC-MS(方法5)：Rt 3.05min；MS(ESIpos)：m/z＝819(M+H-CF3CO2H)+。
中间体F305
N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}-22-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-6，17-二氧代-N-(吡咯烷-3-基甲基)-10，13-二氧杂-3-硫杂-7，16-二氮杂二十二烷-1-酰胺(1∶1)三氟乙酸(异构体2)
将13.42mg(0.10mmol)氯化锌加入24.80mg(0.02mmol)3-[2-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}-24-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-3，8，19-三氧代-12，15-二氧杂-5-硫杂-2，9，18-三氮杂二十四烷-1-基]吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(中间体C99)于0.65ml 2，2，2-三氟乙醇中的溶液中，并将反应混合物在50℃下搅拌8h。然后加入28.78mg(0.10mmol)EDTA，并将混合物搅拌15分钟。将乙酸乙酯加入反应混合物中，并将有机相用水和饱和NaCl溶液反复洗涤。将有机相经硫酸镁干燥，并将溶剂在减压下蒸发。将残余物通过制备型HPLC纯化。得到10mg(理论值的44％)标题化合物。
LC-MS(方法5)：Rt＝3.11min；MS(ESIpos)：m/z＝907(M+H-CF3CO2H)+。
中间体F306
N6-(N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}-β-丙氨酰基)-N2-{N-[(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酰基-β-丙氨酰基}-L-赖氨酸/三氟乙酸(1∶1)
通过将24mg(0.029mmol)中间体C61与30mg(0.035mmol)中间体L99在16.7mg(0.044mmol)HATU和15μl N，N-二异丙基乙胺的存在下偶联、随后在三氟乙醇中用氯化锌脱保护(如对中间体F119所述)来制备标题化合物。通过制备型HPLC纯化得到19mg(理论值的52％，经2个步骤)标题化合物。
LC-MS(方法1)：Rt＝0.84min；MS(ESIpos)：m/z＝1091(M+H)+。
中间体F307
N-[6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酰基-S-{(5R，14R)-13-(3-氨基丙基)-14-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-5-羧基-15，15-二甲基-2，7，12-三氧代-10-硫杂-3，6，13-三氮杂十六烷-1-基}-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1∶1)
将8.90mg(8.88μmol)三氟乙酸/3-氨基-N-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}-2，2-二甲基-6，12，17-三氧代-5-氧杂-14-硫杂-7，11-二氮杂-2-硅杂十七烷-17-基)-D-丙氨酸2-(三甲基硅烷基)乙酯(1∶1)(中间体C80)和2.31mg(9.77μmol)1-(2-溴乙酰氧基)吡咯烷-2，5-二酮溶解于1ml二甲基甲酰胺中，加入2.9μl(27μmol)N-甲基吗啉。将反应混合物在RT下搅拌1h。将反应混合物通过制备型RP-HPLC直接纯化(柱：Reprosil 125×30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水/0.1％TFA)。将溶剂在减压下蒸发，并将残余物在高真空下干燥。得到5.80mg(理论值的65％)化合物N-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}-2，2-二甲基-6，12，17-三氧代-5-氧杂-14-硫杂-7，11-二氮杂-2-硅杂十七烷-17-基)-3-[(溴乙酰基)氨基]-D-丙氨酸2-(三甲基硅烷基)乙酯。
LC-MS(方法1)：Rt＝1.57min；MS(ESIpos)：m/z＝1008(M+H)+。
将N-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}-2，2-二甲基-6，12，17-三氧代-5-氧杂-14-硫杂-7，11-二氮杂-2-硅杂十七烷-17-基)-3-[(溴乙酰基)氨基]-D-丙氨酸2-(三甲基硅烷基)乙酯(31.9mg，31.6μmol)和L-半胱氨酸(7.66mg，63.2μmol)溶解于3.0ml DMF中并在RT下搅拌过夜。将反应混合物通过制备型RP-HPLC直接纯化(柱：Reprosil 250×30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水/0.1％TFA)。将溶剂在减压下蒸发，并将残余物在高真空下干燥。得到28.1mg(理论值的76％)化合物S-[(19R)-11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}-2，2-二甲基-6，12，17，22-四氧代-19-{[2-(三甲基硅烷基)乙氧基]羰基}-5-氧杂-14-硫杂-7，11，18，21-四氮杂-2-硅杂二十三烷-23-基]-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1∶1)。
LC-MS(方法12)：Rt＝2.52min；MS(ESIpos)：m/z＝1049[M+H]+。
将S-[(19R)-11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}-2，2-二甲基-6，12，17，22-四氧代-19-{[2-(三甲基硅烷基)乙氧基]羰基}-5-氧杂-14-硫杂-7，11，18，21-四氮杂-2-硅杂二十三烷-23-基]-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1∶1)(13.5mg，11.6μmol)溶解于1.0ml DMF中，加入N-[6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酸2，5-二氧代吡咯烷-1-基酯(6.76mg，11.6μmol)(中间体L88)和N，N-二异丙基乙胺(4.0μl，23μmol)，并将混合物在RT下搅拌1h。将反应混合物通过制备型RP-HPLC直接纯化(柱：Reprosil 250×30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水/0.1％TFA)。将溶剂在减压下蒸发，并将残余物在高真空下干燥。得到11.1mg(理论值的68％)化合物N-[6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酰基-S-[(19R)-11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}-2，2-二甲基-6，12，17，22-四氧代-19-{[2-(三甲基硅烷基)乙氧基]羰基}-5-氧杂-14-硫杂-7，11，18，21-四氮杂-2-硅杂二十三烷-23-基]-L-半胱氨酸。
LC-MS(方法14)：Rt＝7.38min；MS(ESIpos)：m/z＝1412[M+H]+。
将N-[6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酰基-S-[(19R)-11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}-2，2-二甲基-6，12，17，22-四氧代-19-{[2-(三甲基硅烷基)乙氧基]羰基}-5-氧杂-14-硫杂-7，11，18，21-四氮杂-2-硅杂二十三烷-23-基]-L-半胱氨酸(9.40mg，6.65μmol)溶解于2.0ml三氟乙醇中，并加入氯化锌(5.44mg，39.9μmol)。将反应混合物在50℃下搅拌1h。加入氯化锌(5.44mg，39.9μmol)，并将反应混合物在50℃下搅拌1h。加入乙二胺-N，N，N′，N′-四乙酸(23.4mg，79.8μmol)，将反应混合物搅拌10min，然后加入水(0.1％TFA)。直接通过制备型RP-HPLC进行纯化(柱：Reprosil 250×30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)。将溶剂在减压下蒸发，并将残余物在高真空下干燥。得到5.60mg(理论值的66％)标题化合物。
LC-MS(方法1)：Rt＝0.93min；MS(ESIpos)：m/z＝1168(M+H)+。
中间体F308
N-[6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-N-[(12R，19R)-19-氨基-4-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}-12，19-二羧基-5，10，15-三氧代-7，17-二硫杂-4，11，14-三氮杂十九烷-1-基]-L-丙氨酰胺/三氟乙酸(1∶1)
将N-[3-({2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}硫烷基)丙酰基]-3-[(溴乙酰基)氨基]-D-丙氨酸/三氟乙酸(1∶1)(12.7mg，14.5μmol)和N-{[2-(三甲基硅烷基)乙氧基]羰基}-L-半胱氨酸(3.84mg，14.5μmol)溶解于1.5ml的DMF中，并将混合物在RT下搅拌过夜。
然后加入N，N-二异丙基乙胺(2.5μl，14μmol)。将反应混合物在RT下搅拌3h，然后加入水(0.1％TFA)。直接通过制备型RP-HPLC进行纯化(柱：Reprosil 250×30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)。将溶剂在减压下蒸发，并将残余物在高真空下干燥。得到7.40mg(理论值的48％)化合物S-{(5R，14R)-13-(3-氨基丙基)-14-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-5-羧基-15，15-二甲基-2，7，12-三氧代-10-硫杂-3，6，13-三氮杂十六烷-1-基}-N-{[2-(三甲基硅烷基)乙氧基]羰基}-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1∶1)。
LC-MS(方法1)：Rt＝1.03min；MS(ESIpos)：m/z＝949[M+H]+。
将S-{(5R，14R)-13-(3-氨基丙基)-14-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-5-羧基-15，15-二甲基-2，7，12-三氧代-10-硫杂-3，6，13-三氮杂十六烷-1-基}-N-{[2-(三甲基硅烷基)乙氧基]羰基}-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1∶1)(7.50mg，7.05μmol)溶解于1.0ml DMF中，并加入N-[6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酸2，5-二氧代吡咯烷-1-基酯(4.11mg，纯度82％，7.05μmol)(中间体L88)和N，N-二异丙基乙胺(2.5μl，14μmol)。将反应混合物在RT下搅拌1h，然后通过制备型RP-HPLC直接纯化(柱：Reprosil 250×30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水/0.1％TFA)。将溶剂在减压下蒸发，并将残余物在高真空下干燥。得到4.30mg(46％)化合物N-[6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-N-[(8R，15R)-23-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}-8，15-二羧基-2，2-二甲基-6，12，17，22-四氧代-5-氧杂-10，20-二硫杂-7，13，16，23-四氮杂-2-硅杂二十六烷-26-基]-L-丙氨酰胺。
LC-MS(方法14)：Rt＝6.47min；MS(ESIpos)：m/z＝1312[M+H]+。
将N-[6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-N-[(8R，15R)-23-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}-8，15-二羧基-2，2-二甲基-6，12，17，22-四氧代-5-氧杂-10，20-二硫杂-7，13，16，23-四氮杂-2-硅杂二十六烷-26-基]-L-丙氨酰胺(4.00mg，3.05μmol)溶解于1.0ml三氟乙醇中，并加入氯化锌(2.49mg，18.3μmol)。将反应混合物在50℃下搅拌1h，然后加入乙二胺-N，N，N′，N′-四乙酸(5.34mg，18.3μmol)，将混合物搅拌10min，然后加入水(0.1％TFA)。直接通过制备型RP-HPLC进行纯化(柱：Reprosil 250×30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)。将溶剂在减压下蒸发，并将残余物在高真空下干燥。得到2.50mg(理论值的64％)标题化合物。
LC-MS(方法1)：Rt＝1.00min；MS(ESIpos)：m/z＝1168[M+H]+。
中间体F309
4-{[(11R，17R)-16-(3-氨基丙基)-17-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-1-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-18，18-二甲基-6，6-二氧代-2，10，15-三氧代-6入6，13-二硫杂-3，9，16-三氮杂十九烷-11-基]氨基}-4-氧代丁酸/三氟乙酸(1∶1)
首先将S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}-2，2-二甲基-6，12-二氧代-5-氧杂-7，11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-N-(4-叔丁氧基-4-氧代丁酰基)-L-半胱氨酸(50.0mg，57.3μmol)(中间体C77)和三氟乙酸/{2-[(2-氨基乙基)磺酰基]乙基}氨基甲酸苄基酯(1∶1)(27.5mg，68.7μmol)(中间体L81)加入4.0mlDMF中，并加入HATU(26.1mg，68.7μmol)和N，N-二异丙基乙胺(30μl，170μmol)。将反应混合物在RT下搅拌10min，然后通过制备型RP-HPLC直接纯化(柱：Reprosil 250×30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水/0.1％TFA)。将溶剂在减压下蒸发，并将残余物在高真空下干燥。得到53.9mg(81％)化合物4-{[(12R)-17-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}-26，26-二甲基-7，7-二氧代-3，11，16，22-四氧代-1-苯基-2，23-二氧杂-7入6，14-二硫杂-4，10，17，21-四氮杂-26-硅杂二十七烷-12-基]氨基}-4-氧代丁酸叔丁酯。
LC-MS(方法1)：Rt＝1.54min；MS(ESIpos)：m/z＝1141[M+H]+。
在氩气下，首先将乙酸钯(II)(5.12mg，22.8μmol)加入3.0ml DCM中，加入三乙胺(9.5μl，68μmol)和三乙基硅烷(73μl，460μmol)，并将混合物搅拌5min。然后加入于2.0mlDCM中的4-{[(12R)-17-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}-26，26-二甲基-7，7-二氧代-3，11，16，22-四氧代-1-苯基-2，23-二氧杂-7λ6，14-二硫杂-4，10，17，21-四氮杂-26-硅杂二十七烷-12-基]氨基}-4-氧代丁酸叔丁酯(52.1mg，45.6μmol)。将反应混合物在RT下搅拌过夜，并加入2.0ml水。将溶剂在减压下蒸发。将乙腈加入残余物中，将混合物过滤，并将产物通过制备型RP-HPLC纯化(柱：Reprosil 125×30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水/0.1％TFA)。将溶剂在减压下蒸发，并将残余物在高真空下干燥。得到43.4mg(85％)化合物三氟乙酸/4-{[(16R)-23-氨基-11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}-2，2-二甲基-21，21-二氧代-6，12，17-三氧代-5-氧杂-14，21λ6-二硫杂-7，11，18-三氮杂-2-硅杂二十三烷-16-基]氨基}-4-氧代丁酸叔丁酯(1∶1)。
LC-MS(方法1)：Rt＝1.21min；MS(ESIpos)：m/z＝1007[M+H]+。
首先将三氟乙酸/4-{[(16R)-23-氨基-11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}-2，2-二甲基-21，21-二氧代-6，12，17-三氧代-5-氧杂-14，21λ6-二硫杂-7，11，18-三氮杂-2-硅杂二十三烷-16-基]氨基}-4-氧代丁酸叔丁酯(1∶1)(20.0mg，17.8μmol)和(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酸(3.32mg，21.4μmol)加入2.0ml DMF中，并加入HATU(8.14mg，21.4μmol)和N，N-二异丙基乙胺(9.3μl，54μmol)。
将反应混合物在RT下搅拌10min。将反应混合物通过制备型RP-HPLC直接纯化(柱：Reprosil 250×30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水/0.1％TFA)。将溶剂在减压下蒸发，并将残余物在高真空下干燥。得到17.4mg(85％)化合物4-{[(16R)-11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}-26-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-2，2-二甲基-21，21-二氧代-6，12，17，25-四氧代-5-氧杂-14，21λ6-二硫杂-7，11，18，24-四氮杂-2-硅杂二十六烷-16-基]氨基}-4-氧代丁酸叔丁酯。
LC-MS(方法1)：Rt＝1.46min；MS(ESIpos)：m/z＝1144[M+H]+。
将4-{[(16R)-11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}-26-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-2，2-二甲基-21，21-二氧代-6，12，17，25-四氧代-5-氧杂-14，21λ6-二硫杂-7，11，18，24-四氮杂-2-硅杂二十六烷-16-基]氨基}-4-氧代丁酸叔丁酯(15.9mg，13.9μmol)溶解于2.0ml三氟乙醇中，并加入氯化锌(11.4mg，83.4μmol)。将反应混合物在50℃下搅拌1h。加入氯化锌(11.4mg，83.4μmol)，并将反应混合物在50℃下搅拌1h。加入氯化锌(11.4mg，83.4μmol)，并将反应混合物在50℃下搅拌1h。加入乙二胺-N，N，N′，N′-四乙酸(73.2mg，250μmol)，将反应混合物搅拌10min，然后加入水(0.1％TFA)。直接通过制备型RP-HPLC进行纯化(柱：Reprosil 250×30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)。将溶剂在减压下蒸发，并将残余物在高真空下干燥。得到10mg(理论值的68％)标题化合物。
LC-MS(方法12)：Rt＝1.45min；MS(ESIpos)：m/z＝944[M+H]+。
中间体F310
三氟乙酸/N-[(8R，14R)-13-(3-氨基丙基)-14-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-1-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-15，15-二甲基-2，7，12-三氧代-10-硫杂-3，6，13-三氮杂十六烷-8-基]-2，5，8，11-四氧杂十四烷-14-酰胺(1∶1)
首先将S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}-2，2-二甲基-6，12-二氧代-5-氧杂-7，11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1∶1)(100mg，120μmol)(中间体C70)和1-[(14-氧代-2，5，8，11-四氧杂十四烷-14-基)氧基]吡咯烷-2，5-二酮(44.1mg，132μmol)加入3.0ml DMF中，并加入4-甲基吗啉(40μl，360μmol)。将反应混合物在RT下搅拌过夜，用乙酸(420μmol)淬灭，并通过制备型RP-HPLC直接纯化(柱：Reprosil 125×30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水/0.1％TFA)。将溶剂在减压下蒸发，并将残余物在高真空下干燥。得到69.4mg(理论值的62％)化合物S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}-2，2-二甲基-6，12-二氧代-5-氧杂-7，11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-N-(14-氧代-2，5，8，11-四氧杂十四烷-14-基)-L-半胱氨酸。
LC-MS(方法12)：Rt＝2.61min；MS(ESIneg)：m/z＝933[M-H]-。
首先将S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}-2，2-二甲基-6，12-二氧代-5-氧杂-7，11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-N-(14-氧代-2，5，8，11-四氧杂十四烷-14-基)-L-半胱氨酸(27.0mg，28.9μmol)加入2.0ml DMF中，并加入N-(2-氨基乙基)-2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯1-基)乙酰胺(11.4mg，57.7μmol)(中间体L1)、N，N-二异丙基乙胺(15μl，87μmol)和HATU(22.0mg，57.7μmol)。将反应混合物在RT下搅拌3h，并通过制备型RP-HPLC直接纯化(柱：Reprosil250×30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水/0.1％TFA)。将溶剂在减压下蒸发，并将残余物在高真空下干燥。得到13.7mg(理论值的43％)化合物{(16R)-21-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}-16-[(2-{[(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙基)氨基甲酰基]-14，20-二氧代-2，5，8，11-四氧杂-18-硫杂-15，21-二氮杂二十四烷-24-基}氨基甲酸2-(三甲基硅烷基)乙酯。
LC-MS(方法12)：Rt＝2.54min；MS(ESIpos)：m/z＝1114[M+H]+。
将{(16R)-21-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}-16-[(2-{[(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙基)氨基甲酰基]-14，20-二氧代-2，5，8，11-四氧杂-18-硫杂-15，21-二氮杂二十四烷-24-基}氨基甲酸2-(三甲基硅烷基)乙酯(13.7mg，12.3μmol)溶解于2.0ml三氟乙醇中，并加入氯化锌(10.1mg，73.8μmol)。将反应混合物在50℃下搅拌4h。加入乙二胺-N，N，N′，N′-四乙酸(21.6mg，73.8μmol)，将反应混合物搅拌10min，然后加入水(0.1％TFA)。直接通过制备型RP-HPLC进行纯化(柱：Reprosil 250×30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)。将溶剂在减压下蒸发，并将残余物在高真空下干燥。得到7.30mg(理论值的47％)标题化合物。
LC-MS(方法1)：Rt＝1.01min；MS(ESIpos)：m/z＝970[M+H]+。
中间体F311
S-{2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}-N-[1-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-2，30-二氧代-6，9，12，15，18，21，24，27-八氧杂-3-氮杂三十烷-30-基]-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1：1)
首先将1-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-2-氧代-6，9，12，15，18，21，24，27-八氧杂-3-氮杂三十烷-30-酸(10.8mg，18.7μmol)(中间体L97)加入1.0ml DMF中，加入N，N-二异丙基乙胺(5.4μl，31.2μmol)和HATU(7.10mg，18.7μmol)，并将混合物搅拌10min。然后加入溶解于1.0ml DMF和N，N-二异丙基乙胺(2.7μl，15.6μmol)中的S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}-2，2-二甲基-6，12-二氧代-5-氧杂-7，11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1∶1)(12.9mg，15.6μmol)(中间体C71)。将反应混合物在RT下搅拌2h，然后通过制备型RP-HPLC直接纯化(柱：Reprosil 125×30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水/0.1％TFA)。将溶剂在减压下蒸发，并将残余物在高真空下干燥。得到3.5mg(18％)化合物S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}-2，2-二甲基-6，12-二氧代-5-氧杂-7，11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-N-[1-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-2，30-二氧代-6，9，12，15，18，21，24，27-八氧杂-3-氮杂三十烷-30-基]-L-半胱氨酸。
LC-MS(方法1)：Rt＝1.30min；MS(ESIneg)：m/z＝1276[M-H]-。
将S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}-2，2-二甲基-6，12-二氧代-5-氧杂-7，11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-N-[1-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-2，30-二氧代-6，9，12，15，18，21，24，27-八氧杂-3-氮杂三十烷-30-基]-L-半胱氨酸(3.50mg，2.74μmol)溶解于1.0ml三氟乙醇中，并加入氯化锌(6.25mg，16.4μmol)。将反应混合物在50℃下搅拌4h。加入乙二胺-N，N，N′，N′-四乙酸(47μl，16μmol)，将反应混合物搅拌10min，然后加入水(0.1％TFA)。直接通过制备型RP-HPLC进行纯化(柱：Reprosil 125×30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)。将溶剂在减压下蒸发，并将残余物在高真空下干燥。得到2.0mg(理论值的59％)标题化合物。
LC-MS(方法1)：Rt＝0.94min；MS(ESIpos)：m/z＝1133(M+H)+。
中间体F312
N-[(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]-L-缬氨酰基-N-[(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-1-{[2-(L-γ-谷氨酰基氨基)乙基]氨基}-1-氧代丁-2-基]-L-丙氨酰胺/三氟乙酸(1∶1)
由中间体C103通过与N-[(苄氧基)羰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酸在HATU和N，N-二异丙基乙胺的存在下偶联来制备标题化合物。在下一步骤中，通过在10％钯活性炭上在DCM/甲醇1∶1中在RT下在标准氢压力下氢化1小时除去Z保护基团。然后将脱保护的中间体通过与(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酸在HATU和N，N-二异丙基乙胺的存在下偶联、最后用氯化锌脱保护并通过制备型HPLC纯化而转化为标题化合物。
LC-MS(方法1)：Rt＝0.9min；MS(ESIpos)：m/z＝992(M+H)+。
中间体F313
S-[2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}{[(3R，4R)-4-氟吡咯烷-3-基]甲基}氨基)-2-氧代乙基]-N-[1-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-2，18-二氧代-6，9，12，15-四氧杂-3-氮杂十八烷-18-基]-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1∶1)
在氩气下，将16.9mg(0.13mmol)N，N-二异丙基乙胺和50.0mg(0.13mmol)HATU加入55.0mg(0.14mmol)1-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-2-氧代-6，9，12，15-四氧杂-3-氮杂十八烷-18-酸于2.60ml DMF中的溶液中。将反应混合物在RT下搅拌10分钟。然后加入40.0mg(0.05mmol)S-[2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}{[(3R，4R)-4-氟-1-{[2-(三甲基硅烷基)乙氧基]羰基}吡咯烷-3-基]甲基}氨基)-2-氧代乙基]-L-半胱氨酸(中间体C107)的溶液，并将混合物在RT下搅拌过夜。加入水，将混合物用二氯甲烷萃取。将有机相经硫酸镁干燥，将溶剂在减压下蒸发，并将残余物在高真空下干燥。将残余物通过制备型HPLC纯化。得到10mg(理论值的13％，纯度82％)标题化合物。
LC-MS(方法1)：Rt＝1.36min；MS(ESIpos)：m/z＝1145(M+H)+。
将4.3mg(0.03mmol)氯化锌加入10.9mg(7.8mmol，纯度82％)S-[2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}{[(3R，4R)-4-氟-1-{[2-(三甲基硅烷基)乙氧基]羰基}吡咯烷-3-基]甲基}氨基)-2-氧代乙基]-N-[1-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-2，18-二氧代-6，9，12，15-四氧杂-3-氮杂十八烷-18-基]-L-半胱氨酸于0.85ml 2，2，2-三氟乙醇中的溶液中，并将反应混合物在50℃下搅拌2.5h。然后加入9.1mg(0.03mmol)EDTA，并将混合物搅拌15分钟。将反应混合物通过制备型HPLC纯化。得到2.3mg(理论值的26％)标题化合物。
LC-MS(方法1)：Rt 0.89min；MS(ESIpos)：m/z＝781(M+H-CF3CO2H)+。
中间体F314
三氟乙酸/3-{[2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}{[(3S，4R)-4-氟吡咯烷-3-基]甲基}氨基)-2-氧代乙基]硫烷基}-N-(2-{[(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙基)丙酰胺
在氩气下，将16.89mg(0.13mmol)N，N-二异丙基乙胺和33.13mg(0.087mmol)HATU加入50.0mg(0.04mmol)3-{[2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}{[(3R，4R)-4-氟-1-{[2-(三甲基硅烷基)乙氧基]羰基}吡咯烷-3-基]甲基}氨基)-2-氧代乙基]硫烷基}丙酸(中间体C106)于3.14ml DMF中的溶液中。将反应混合物在RT下搅拌10分钟。然后加入27.29mg(0.09mmol)N-(2-氨基乙基)-2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰胺(1∶1)三氟乙酸(中间体L1)的溶液，并将混合物在RT下搅拌15分钟。加入水，并将混合物用二氯甲烷萃取。将有机相经硫酸镁干燥，将溶剂在减压下蒸发，并将残余物在高真空下干燥。将残余物通过制备型HPLC纯化。得到41mg(理论值的68％，纯度66％)标题化合物。
LC-MS(方法12)：Rt＝2.55min；MS(ESIneg)：m/z＝959(M-H+Na)-。
将24.7mg(0.18mmol)氯化锌加入41.1mg(0.03mmol，纯度66％)(3R，4R)-3-[2-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}-14-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-3，8，13-三氧代-5-硫杂-2，9，12-三氮杂十四烷-1-基]-4-氟吡咯烷-1-甲酸2-(三甲基硅烷基)乙基酯于2.54ml 2，2，2-三氟乙醇中的溶液中，并将反应混合物在50℃下搅拌2.5h。然后加入53.0mg(0.18mmol)EDTA，并将混合物搅拌15分钟。将反应混合物通过制备型HPLC纯化。得到10mg(理论值的36％)标题化合物。
LC-MS(方法1)：Rt0.89min；MS(ESIpos)：m/z＝781(M+H-CF3CO2H)+。
中间体F315
S-{2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}-N-{3-[5-(2-{[(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙基)-1，2，4-噁二唑-3-基]丙酰基}-L-半胱氨酸
在氩气下，将18.02mg(0.14mmol)N，N-二异丙基乙胺和31.82mg(0.09mmol)HATU加入50.0mg(0.07mmol)3-[5-(2-{[(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙基)-1，2，4-噁二唑-3-基]丙酸(中间体L100)于3.5ml DMF中的溶液中。将反应混合物在RT下搅拌10分钟。然后加入50.0mg(0.07mmol)N-(2-氨基乙基)-6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺乙酸盐(1：1)(中间体C107)的溶液，并将混合物在RT下搅拌2h。加入水，并将混合物用二氯甲烷萃取。将有机相经硫酸镁干燥，将溶剂在减压下蒸发，并将残余物在高真空下干燥。将残余物不经纯化即进一步使用。得到49mg(理论值的21％，纯度31％)标题化合物。
LC-MS(方法1)：Rt＝1.30min；MS(ESIpos)：m/z＝1022(M+H)+。
将8.0mg(0.06mmol)氯化锌加入49.0mg(0.015mmol，纯度31％)S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}-2，2-二甲基-6，12-二氧代-5-氧杂-7，11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-N-{3-[5-(2-{[(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙基)-1，2，4-噁二唑-3-基]丙酰基}-L-半胱氨酸于0.5ml 2，2，2-三氟乙醇中的溶液中，并将反应混合物在50℃下搅拌2h。然后加入17.2mg(0.06mmol)EDTA，并将混合物搅拌15分钟。将反应混合物通过制备型HPLC纯化。得到3mg(理论值的21％)标题化合物。
LC-MS(方法1)：Rt＝0.91min；MS(ESIpos)：m/z＝877(M+H-CF3CO2H)+。
中间体F316
三氟乙酸/N-{2-[(3-{[2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}{[(3S，4R)-4-氟吡咯烷-3-基]甲基}氨基)-2-氧代乙基]硫烷基}丙酰基)氨基]乙基}-6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺(1∶1)
在氩气下，将16.89mg(0.13mmol)N，N-二异丙基乙胺和33.13mg(0.087mmol)HATU加入50.0mg(0.04mmol，65％纯度)3-{[2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}{[(3R，4R)-4-氟-1-{[2-(三甲基硅烷基)乙氧基]羰基}吡咯烷-3-基]甲基}氨基)-2-氧代乙基]硫烷基}丙酸(中间体106)于3.0ml DMF中的溶液中。将反应混合物在RT下搅拌10分钟。然后加入37.2mg(0.09mmol，纯度70％)N-(2-氨基乙基)-6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺乙酸盐(1∶1)(中间体L73)的溶液，并将混合物在RT下搅拌7分钟。加入水，并将混合物用二氯甲烷萃取。将有机相经硫酸镁干燥，将溶剂在减压下蒸发，并将残余物在高真空下干燥。将残余物不经纯化即进一步使用。得到57mg(理论值的77％，纯度59％)标题化合物。
LC-MS(方法12)：Rt＝2.60min；MS(ESIpos)：m/z＝981(M+H)+。
将36.0mg(0.27mmol)氯化锌加入56.0mg(0.03mmol，纯度59％)(3R，4R)-3-[2-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}-18-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-3，8，13-三氧代-5-硫杂-2，9，12-三氮杂十八烷-1-基]-4-氟吡咯烷-1-甲酸2-(三甲基硅烷基)乙基酯于2.8ml 2，2，2-三氟乙醇中的溶液中，并将反应混合物在50℃下搅拌2h。然后加入78.3mg(0.27mmol)EDTA，并将混合物搅拌15分钟。将反应混合物通过制备型HPLC纯化。得到16mg(理论值的44％，纯度85％)标题化合物。
LC-MS(方法1)：Rt＝0.89min；MS(ESIpos)：m/z＝837(M+H-AcOH)+。
中间体F317
1-[(S-{2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}-N-[1-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-2，18-二氧代-6，9，12，15-四氧杂-3-氮杂十八烷-18-基]-L-半胱氨酰基)氢基]-3，6，9，12-四氧杂十五烷-15-酸/三氟乙酸(1∶1)
在氩气下，首先将30.2mg(0.06mmol)N，N′-双[(苄氧基)羰基]-L-胱氨酸加入2.0ml水和2.0ml异丙醇中，并加入56.7mg(0.20mmol)TCEP。将反应混合物在RT下搅拌30min。然后加入50.0mg(0.08mmol)溶解于2.0ml异丙醇中的{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯2-基]-2，2-二甲基丙基}(氯乙酰基)氨基]丙基}氨基甲酸2-(三甲基硅烷基)乙酯(中间体C70)、和122.2mg(0.48mmol)1，8-二氮杂二环[5.4.0]十一碳-7-烯，并将反应混合物在50℃下搅拌7h。然后再加入122.2mg(0.48mmol)1，8-二氮杂二环[5.4.0]十一碳-7-烯，并将反应混合物在50℃下搅拌1h。将混合物用乙酸乙酯稀释，并将有机相用水和饱和碳酸氢钠溶液萃取，并用饱和NaCl溶液洗涤。将有机相经硫酸镁干燥，并将溶剂在减压下蒸发。将残余物通过制备型RP-HPLC纯化(柱：Reprosil 250×30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)。将溶剂在减压下蒸发，并将残余物在高真空下干燥。得到43.1mg(理论值的64％)化合物S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}-2，2-二甲基-6，12-二氧代-5-氧杂-7，11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-N-[(苄氧基)羰基]-L-半胱氨酸。
LC-MS(方法1)：Rt＝1.46min；MS(ESIpos)：m/z＝851(M+H)+。
在氩气下，将S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}-2，2-二甲基-6，12-二氧代-5-氧杂-7，11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-N-[(苄氧基)羰基]-L-半胱氨酸(50.0mg，59μmol)溶解于1.0ml DMF中，并加入N，N-二异丙基乙胺(20.5μl，117μmol)和HATU(26.8mg，70μmol)。将反应混合物搅拌10min。然后加入1-氨基-3，6，9，12-四氧杂十五烷-15-酸叔丁酯(22.6mg，70μmol)。将反应混合物搅拌1小时，然后通过制备型RP-HPLC直接纯化(柱：Reprosil 250×30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水)。将溶剂在减压下蒸发，并将残余物在高真空下干燥。得到59.3mg(理论值的87.5％)化合物1-({S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}-2，2-二甲基-6，12-二氧代-5-氧杂-7，11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-N-[(苄氧基)羰基]-L-半胱氨酰基}氨基)-3，6，9，12-四氧杂十五烷-15-酸叔丁酯。
LC-MS(方法12)：Rt＝2.97min；MS(ESIpos)：m/z＝1154[M+H]+。
在氩气下，首先将乙酸钯(II)(6.74mg，30.0μmol)加入3.0ml二氯甲烷中，并加入三乙胺(13μl，90μmol)和三乙基硅烷(96μl，600μmol)。将反应混合物搅拌5min，然后加入于1.0ml二氯甲烷中的1-({S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}-2，2-二甲基-6，12-二氧代-5-氧杂-7，11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-N-[(苄氧基)羰基]-L-半胱氨酰基}氨基)-3，6，9，12-四氧杂十五烷-15-酸叔丁酯(69.3mg，60.0μmol)。将反应混合物在RT下搅拌2小时，然后加入三乙基硅烷(48μl，300μmol)。将反应混合物在RT下搅拌2小时，并加入2.0ml水(0.1％TFA)。将溶剂在不加热的情况下在减压下蒸发。将残余物用乙腈吸收，通过注射器式滤器过滤并通过制备型RP-HPLC纯化(柱：Reprosil 250×30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)。将溶剂在减压下蒸发，并将残余物在高真空下干燥。得到65.9mg(理论值的97％)化合物三氟乙酸/1-{[S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}-2，2-二甲基-6，12-二氧代-5-氧杂-7，11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-L-半胱氨酰基]氨基}-3，6，9，12-四氧杂十五烷-15-酸叔丁酯(1∶1)。
LC-MS(方法1)：Rt＝1.22min；MS(ESIpos)：m/z＝1020[M+H]+。
在氩气下，首先将1-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-2-氧代-6，9，12，15-四氧杂-3-氮杂十八烷-18-酸(4.26mg，10.6μmol)加入1.0ml DMF中，并加入N，N-二异丙基乙胺(3.2μl，18μmol)和HATU(4.02mg，10.6μmol)。将反应混合物搅拌10min，然后加入溶解于1.0ml DMF和N，N-二异丙基乙胺(1.5μl，8.8μmol)中的三氟乙酸/1-{[S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}-2，2-二甲基-6，12-二氧代-5-氧杂-7，11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-L-半胱氨酰基]氨基}-3，6，9，12-四氧杂十五烷-15-酸叔丁酯(1∶1)(10.0mg，8.82μmol)。将反应混合物在RT下搅拌1小时，并通过制备型RP-HPLC直接纯化(柱：Reprosil 250×30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)。将溶剂在减压下蒸发，并将残余物在高真空下干燥。得到10.9mg(理论值的93％)化合物1-({S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}-2，2-二甲基-6，12-二氧代-5-氧杂-7，11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-N-[1-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-2，18-二氧代-6，9，12，15-四氧杂-3-氮杂十八烷-18-基]-L-半胱氨酰基}氨基)-3，6，9，12-四氧杂十五烷-15-酸叔丁酯。
LC-MS(方法1)：Rt＝1.44min；MS(ESIpos)：m/z＝1404[M+H]+。
将1-({S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}-2，2-二甲基-6，12-二氧代-5-氧杂-7，11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-N-[1-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-2，18-二氧代-6，9，12，15-四氧杂-3-氮杂十八烷-18-基]-L-半胱氨酰基}氨基)-3，6，9，12-四氧杂十五烷-15-酸叔丁酯(8.20mg，5.84μmol)溶解于2.0三氟乙醇中，并加入氯化锌(4.77mg，35.0μmol)。将反应混合物在50℃下搅拌1小时。
加入氯化锌(4.77mg，35.0μmol)，并将反应混合物在50℃下搅拌1小时。加入乙二胺-N，N，N′，N′-四乙酸(10.2mg，35.0μmol)，将反应混合物搅拌10min，然后加入水(0.1％TFA)。直接通过制备型RP-HPLC进行纯化(柱：Reprosil 250×30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)。将溶剂在减压下蒸发，并将残余物在高真空下干燥。得到4.1mg(理论值的53％)标题化合物。
LC-MS(方法1)：Rt＝0.90min；MS(ESIpos)：m/z＝1204[M+H]+。
中间体F318
三氟乙酸/3-{[2-([3-氨基-4-氟丁基]{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}氨基)-2-氧代乙基]硫烷基}-N-(2-{[(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙基)丙酰胺(1∶1)
首先将(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙烷-1-酰胺(124mg，350μmol)(中间体C52)加入5.0ml二氯甲烷中，并加入三乙酰氧基硼氢化钠(104mg，491μmol)和乙酸(23μl，400μmol)。将反应混合物在RT下搅拌5min，然后加入溶解于3.0ml二氯甲烷中的[1-氟-4-氧代丁-2-基]氨基甲酸叔丁酯(82.7mg，403μmol)(中间体L123)。将反应混合物在RT下搅拌过夜，然后加入乙酸乙酯。将混合物用饱和碳酸氢钠溶液洗涤两次然后用饱和氯化钠溶液洗涤两次。将有机相经硫酸镁干燥，然后浓缩。将残余物通过柱色谱在Biotage/Isolera(SNAP 25g)上使用流动相环己烷/乙酸乙酯95∶5来纯化。将溶剂在减压下蒸发，并将残余物在高真空下干燥。得到146mg(理论值的77％)化合物[4-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}氨基)-1-氟丁-2-基]氨基甲酸叔丁酯。
LC-MS(方法13)：Rt＝2.57min；MS(ESIneg)：m/z＝588[M+CHOOH-H]-。
将[4-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}氨基)-1-氟丁-2-基]氨基甲酸叔丁酯(100mg，184μmol)溶解于6.0ml DCM中，并在0℃下加入三乙胺(85μl，610μmol)和氯乙酰氯(47μl，590μmol)。将反应混合物在RT下搅拌过夜。将溶剂在减压下蒸发。将残余物用乙腈吸收/水并通过制备型RP-HPLC纯化(柱：Reprosil 250×30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)。将溶剂在减压下蒸发，并将残余物在高真空下干燥。得到80mg(理论值的70％)化合物{4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}(氯乙酰基)氨基]-1-氟丁-2-基}氨基甲酸叔丁基酯。
LC-MS(方法12)：Rt＝2.67min；MS(ESIneg)：m/z＝664[M-H+COOH]-。
首先将{4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}(氯乙酰基)氨基]-1-氟丁-2-基}氨基甲酸叔丁酯(79.2mg，128μmol)和3-巯基丙酸(12μl，140μmol)与一滴水加入3.0ml甲醇中。加入碳酸钾(61.8mg，447μmol)，并将反应混合物在50℃下搅拌4h。加入乙酸乙酯，并将混合物用水反复洗涤。将有机相用饱和氯化钠溶液洗涤，经硫酸镁干燥，然后浓缩。将残余物通过制备型RP-HPLC纯化(柱：Reprosil 250×30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)。将溶剂在减压下蒸发，并将残余物在高真空下干燥。得到68.6mg(理论值的78％)化合物9-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}-6-(氟甲基)-2，2-二甲基-4，10-二氧代-3-氧杂-12-硫杂-5，9-二氮杂十五烷-15-酸。
LC-MS(方法12)：Rt＝2.46min；MS(ESIneg)：m/z＝688[M-H]-。
首先将9-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}-6-(氟甲基)-2，2-二甲基-4，10-二氧代-3-氧杂-12-硫杂-5，9-二氮杂十五烷-15-酸(15.0mg，21.7μmol)和三氟乙酸/N-(2-氨基乙基)-2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰胺(1∶1)(8.12mg，26.1μmol)(中间体L1)加入1.6ml DMF中。加入HATU(9.92mg，26.1μmol)和N，N-二异丙基乙胺(11μl，65μmol)，并将反应混合物在RT下搅拌5min。加入水(0.1％TFA)，并将反应混合物通过制备型RP-HPLC直接纯化(柱：Reprosil 250×30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水)。将溶剂在减压下蒸发，并将残余物在高真空下干燥。得到18.6mg(理论值的98％)化合物[13-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}-1-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-17-氟-2，7，12-三氧代-10-硫杂-3，6，13-三氮杂十七烷-16-基]氨基甲酸叔丁酯。
LC-MS(方法12)：Rt＝2.36min；MS(ESIpos)：m/z＝869[M+H]+。
将[13-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}-1-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-17-氟-2，7，12-三氧代-10-硫杂-3，6，13-三氮杂十七烷-16-基]氨基甲酸叔丁酯(17.0mg，19.6μmol)溶解于2.0ml三氟乙醇中。加入氯化锌(16.0mg，117μmol)，并将反应混合物在50℃下搅拌1小时。再次地，加入氯化锌(16.0mg，117μmol)，并将反应混合物在50℃下搅拌1小时。将乙二胺-N，N，N′，N′-四乙酸(68.6mg，234μmol)加入混合物中，然后加入水(0.1％TFA)，随后将混合物在减压下浓缩。将残余物通过制备型RP-HPLC纯化(柱：Reprosil 250×30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)。将溶剂在减压下蒸发，将残余物用少许水吸收并冻干。得到10.7mg(理论值的60％)标题化合物。
LC-MS(方法14)：Rt＝5.51min；MS(ESIpos)：m/z＝769[M+H]+。
中间体F319
N-(3-{[2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}[3-({N-[6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酰基}氨基)丙基]氨基)-2-氧代乙基]硫烷基}丙酰基)-β-丙氨酰基-L-天冬氨酸
在氩气下，首先将N-[6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-N-[3-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}[({3-[(2-羧基乙基)氨基]-3-氧代丙基}硫烷基)乙酰基]氨基)丙基]-L-丙氨酰胺(9.80mg，9.88μmol)(中间体C116)和L-天冬氨酸二叔丁酯盐酸盐(1∶1)(3.34mg，11.9μmol)加入1.0ml DMF中，并加入HATU(4.51mg，11.9μmol)和N，N-二异丙基乙胺(5.2μl，30μmol)。将反应混合物在RT下搅拌10min，并通过制备型RP-HPLC直接纯化(柱：Reprosil 250×30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)。将溶剂在减压下蒸发，并将残余物在高真空下干燥。得到10.5mg(理论值的87％)化合物N-(3-{[2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}[3-({N-[6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酰基}氨基)丙基]氨基)-2-氧代乙基]硫烷基}丙酰基)-β-丙氨酰基-L-天冬氨酸二叔丁酯。
LC-MS(方法1)：Rt＝1.33min；MS(ESIpos)：m/z＝1219[M+H]+。
将N-(3-{[2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}[3-({N-[6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酰基}氨基)丙基]氨基)-2-氧代乙基]硫烷基}丙酰基)-β-丙氨酰基-L-天冬氨酸二叔丁酯(9.70mg，7.95μmol)溶解于1.5ml三氟乙醇中。加入氯化锌(6.50mg，47.7μmol)，并将反应混合物在50℃下搅拌1小时。再次地，加入氯化锌(6.50mg，47.7μmol)，并将反应混合物在50℃下搅拌1小时。将乙二胺-N，N，N′，N′-四乙酸(27.9mg，55.4μmol)加入混合物中，然后加入水(0.1％TFA)，随后将混合物在减压下浓缩。将残余物通过制备型RP-HPLC纯化(柱：Reprosil250×30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)。将溶剂在减压下蒸发，并将残余物用少许水吸收并冻干。得到4.10mg(理论值的47％)标题化合物。
LC-MS(方法1)：Rt＝1.07min；MS(ESIpos)：m/z＝1107[M+H]+。
中间体F320
N-[6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-N-[3-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}{[(3-{[(1S)-1，3-二羧基丙基]氨基}-3-氧代丙基)硫烷基]乙酰基}氨基)丙基]-L-丙氨酰胺
在氩气下，首先将N-[6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-N-[3-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}{[(2-羧基乙基)硫烷基]乙酰基}氨基)丙基]-L-丙氨酰胺(20.0mg，21.7μmol)(中间体C115)和L-谷氨酸二叔丁酯盐酸盐(1∶1)(7.71mg，26.1μmol)加入2.0ml DMF中，并加入HATU(9.91mg，26.1μmol)和N，N-二异丙基乙胺(11μl，65μmol)。将反应混合物在RT下搅拌10min，然后通过制备型RP-HPLC直接纯化(柱：Reprosil 250×30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)。将溶剂在减压下蒸发，并将残余物在高真空下干燥。得到16.4mg(理论值的65％)化合物(2S)-2-{[(13S，16S)-7-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}-23-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-16-异丙基-13-甲基-6，12，15，18-四氧代-4-硫杂-7，11，14，17-四氮杂二十三烷-1-酰基]氨基}戊烷二酸二叔丁酯。
LC-MS(方法1)：Rt＝1.40min；MS(ESIpos)：m/z＝1162[M+H]+。
将(2S)-2-{[(13S，16S)-7-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}-23-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-16-异丙基-13-甲基-6，12，15，18-四氧代-4-硫杂-7，11，14，17-四氮杂二十三烷-1-酰基]氨基}戊烷二酸二叔丁酯(14.7mg，12.6μmol)溶解于1.5ml三氟乙醇中。加入氯化锌(10.3mg，75.9μmol)，并将反应混合物在50℃下搅拌1小时。再次地，加入氯化锌(10.3mg，75.9μmol)，并将反应混合物在50℃下搅拌1小时。将乙二胺-N，N，N′，N′-四乙酸(44.4mg，152μmol)加入混合物中，然后加入水(0.1％TFA)，随后将混合物在减压下浓缩。将残余物通过制备型RP-HPLC纯化(柱：Reprosil 250×30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)。将溶剂在减压下蒸发，并将残余物用少许水吸收并冻干。得到6.0mg(理论值的45％)标题化合物。
LC-MS(方法1)：Rt＝1.10min；MS(ESIneg)：m/z＝1048[M-H]-。
中间体F321
N-(3-{[2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}[3-({N-[6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酰基}氨基)丙基]氨基)-2-氧代乙基]硫烷基}丙酰基)-β-丙氨酰基-D-谷氨酸
在氩气下，首先将N-[6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-N-[3-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}[({3-[(2-羧基乙基)氨基]-3-氧代丙基}硫烷基)乙酰基]氨基)丙基]-L-丙氨酰胺(9.80mg，9.88μmol)(中间体C116)和D-谷氨酸二叔丁酯盐酸盐(1∶1)(3.51mg，11.9μmol)加入1.0ml DMF中，并加入HATU(4.51mg，11.9μmol)和N，N-二异丙基乙胺(5.2μl，30μmol)。将反应混合物在RT下搅拌10min，并通过制备型RP-HPLC直接纯化(柱：Reprosil 250×30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)。将溶剂在减压下蒸发，并将残余物在高真空下干燥。得到11.7mg(理论值的96％)化合物N-(3-{[2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}[3-({N-[6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酰基}氨基)丙基]氨基)-2-氧代乙基]硫烷基}丙酰基)-β-丙氨酰基-D-谷氨酸二叔丁酯。
LC-MS(方法1)：Rt＝1.34min；MS(ESIpos)：m/z＝1233[M+H]+。
将N-(3-{[2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}[3-({N-[6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酰基}氨基)丙基]氨基)-2-氧代乙基]硫烷基}丙酰基)-β-丙氨酰基-D-谷氨酸二叔丁酯(11.5mg，9.32μmol)溶解于1.5ml三氟乙醇中。加入(7.62mg，55.9μmol)，并将反应混合物在50℃下搅拌1小时。再次地，加入氯化锌(7.62mg，55.9μmol)，并将反应混合物在50℃下搅拌1小时。将乙二胺-N，N，N′，N′-四乙酸(32.6mg，112μmol)加入混合物中，然后加入水(0.1％TFA)，随后将混合物在减压下浓缩。将残余物通过制备型RP-HPLC纯化(柱：Reprosil 250×30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)。将溶剂在减压下蒸发，并将残余物用少许水吸收并冻干。得到6.5mg(理论值的62％)标题化合物。
LC-MS(方法1)：Rt＝1.07min；MS(ESIpos)：m/z＝1121[M+H]+。
中间体F322
N-(3-{[2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}[3-({N-[6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酰基}氨基)丙基]氨基)-2-氧代乙基]硫烷基}丙酰基)-β-丙氨酰基-L-谷氨酸
在氩气下，首先将N-[6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-N-[3-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}[({3-[(2-羧基乙基)氨基]-3-氧代丙基}硫烷基)乙酰基]氨基)丙基]-L-丙氨酰胺(9.80mg，9.88μmol)(中间体C116)和L-谷氨酸二叔丁酯盐酸盐(1∶1)(3.51mg，11.9μmol)加入1.0ml DMF中，并加入HATU(4.51mg，11.9μmol)和N，N-二异丙基乙胺(5.2μl，30μmol)。将反应混合物在RT下搅拌10min，并通过制备型RP-HPLC直接纯化(柱：Reprosil 250×30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)。将溶剂在减压下蒸发，并将残余物在高真空下干燥。得到11.3mg(理论值的93％)化合物N-(3-{[2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}[3-({N-[6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酰基}氨基)丙基]氨基)-2-氧代乙基]硫烷基}丙酰基)-β-丙氨酰基-L-谷氨酸二叔丁酯。
LC-MS(方法1)：Rt＝1.34min；MS(ESIpos)：m/z＝1233[M+H]+。
将N-(3-{[2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}[3-({N-[6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酰基}氨基)丙基]氨基)-2-氧代乙基]硫烷基}丙酰基)-β-丙氨酰基-L-谷氨酸二叔丁酯(11.0mg，8.92μmol)溶解于1.5ml三氟乙醇中。加入氯化锌(7.29mg，53.5μmol)，并将反应混合物在50℃下搅拌1小时。再次地，加入氯化锌(7.29mg，53.5μmol)，并将反应混合物在50℃下搅拌1小时。将乙二胺-N，N，N′，N′-四乙酸(31.2mg，107μmol)加入混合物中，然后加入水(0.1％TFA)，随后将混合物在减压下浓缩。将残余物通过制备型RP-HPLC纯化(柱：Reprosil250×30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)。将溶剂在减压下蒸发，并将残余物用少许水吸收并冻干。得到5.10mg(理论值的51％)标题化合物。
LC-MS(方法1)：Rt＝1.07min；MS(ESIpos)：m/z＝1121[M+H]+。
中间体F323
N-[6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-N-[3-({[(3-{[(1R)-2-(L-β-天冬胺酰基氨基)-1-羧基乙基]氨基}-3-氧代丙基)硫烷基]乙酰基}{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}氨基)丙基]-L-丙氨酰胺/三氟乙酸(1∶1)
在氩气下，首先将N-[6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-N-[3-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}{[(2-羧基乙基)硫烷基]乙酰基}氨基)丙基]-L-丙氨酰胺(10.0mg，7.05μmol)(中间体C115)和N-{(2R)-2-氨基-3-氧代-3-[2-(三甲基硅烷基)乙氧基]丙基}-N2-(叔丁氧基羰基)-L-天冬氨酸叔丁酯(4.02mg，8.46μmol)(中间体L124)加入2.0ml DMF中，并加入HATU(3.22mg，8.46μmol)和N，N-二异丙基乙胺(3.7μl，21μmol)。将反应混合物在RT下搅拌10min，并通过制备型RP-HPLC直接纯化(柱：Reprosil250×30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)。将溶剂在减压下蒸发，并将残余物用少许水吸收并冻干。得到4.3mg(理论值的32％)化合物(6S，11R，25S，28S)-19-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}-35-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-28-异丙基-2，2，25-三甲基-4，8，13，18，24，27，30-七氧代-3-氧杂-16-硫杂-5，9，12，19，23，26，29-七氮杂三十五烷-6，11-二甲酸6-叔丁基11-[2-(三甲基硅烷基)乙基]酯。
LC-MS(方法5)：Rt＝5.32min；MS(ESIpos)：m/z＝1379[M+H]+。
将(6S，11R，25S，28S)-19-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}-35-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-28-异丙基-2，2，25-三甲基-4，8，13，18，24，27，30-七氧代-3-氧杂-16-硫杂-5，9，12，19，23，26，29-七氮杂三十五烷-6，11-二甲酸6-叔丁基11-[2-(三甲基硅烷基)乙基]酯(4.10mg，纯度73％，2.17μmol)溶解于2.0ml三氟乙醇中。加入氯化锌(1.77mg，13.0μmol)，并将反应混合物在50℃下搅拌1小时。再五次地，加入氯化锌(1.77mg，13.0μmol)，并将反应混合物在50℃下搅拌1小时。将乙二胺-N，N，N′，N′-四乙酸(22.0mg，78μmol)加入混合物中，然后加入水(0.1％TFA)，随后将混合物在减压下浓缩。将残余物通过制备型RP-HPLC纯化(柱：Reprosil 250×30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)。将溶剂在减压下蒸发，并将残余物用少许水吸收并冻干。得到2.1mg(理论值的69％)标题化合物。
LC-MS(方法1)：Rt＝0.98min；MS(ESIpos)：m/z＝1122[M+H]+。
中间体F324
S-[2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}[吡咯烷-3-基甲基]氨基)-2-氧代乙基]-N-[1-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-2，18-二氧代-6，9，12，15-四氧杂-3-氮杂十八烷-18-基]-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1∶1)(异构体1)
在氩气下，首先将1-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-2-氧代-6，9，12，15-四氧杂-3-氮杂十八烷-18-酸(99.6mg，247μmol)(中间体L74)加入1.4ml DMF中，并加入HATU(90.4mg，238μmol)和N，N-二异丙基乙胺(41μl，240μmol)。将反应混合物在RT下搅拌10min，并加入溶解于1.4ml DMF中的S-[2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}{[1-(叔丁氧基羰基)吡咯烷-3-基]甲基}氨基)-2-氧代乙基]-L-半胱氨酸(70.0mg，95.2μmol)(中间体C90)。将反应混合物在RT下搅拌过夜，并通过制备型RP-HPLC直接纯化(柱：Reprosil250×30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)。将溶剂在减压下蒸发，并将残余物用少许水吸收并冻干。得到19.0mg(理论值的18.4％)化合物S-[2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}{[(3R)-1-(叔丁氧基羰基)吡咯烷-3-基]甲基}氨基)-2-氧代乙基]-N-[1-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-2，18-二氧代-6，9，12，15-四氧杂-3-氮杂十八烷-18-基]-L-半胱氨酸。
LC-MS(方法12)：Rt＝2.29min；MS(ESIpos)：m/z＝1082[M+H]+。
将S-[2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}{[1-(叔丁氧基羰基)吡咯烷-3-基]甲基}氨基)-2-氧代乙基]-N-[1-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-2，18-二氧代-6，9，12，15-四氧杂-3-氮杂十八烷-18-基]-L-半胱氨酸(17.0mg，15.7μmol)溶解于2.0ml三氟乙醇中。加入氯化锌(8.56mg，62.8μmol)，并将反应混合物在50℃下搅拌1小时。再次地，加入氯化锌(8.56mg，62.8μmol)，并将反应混合物在50℃下搅拌2小时。将乙二胺-N，N，N′，N′-四乙酸(36.7mg，126μmol)加入混合物中，然后加入水(0.1％TFA)，随后将混合物在减压下浓缩。将残余物通过制备型RP-HPLC纯化(柱：Reprosil 250×30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)。将溶剂在减压下蒸发，并将残余物在高真空下干燥。得到3.90mg(理论值的22％)标题化合物。
LC-MS(方法1)：Rt＝0.89min；MS(ESIpos)：m/z＝983[M+H]+。
中间体F325
N-[2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}氨基)乙基]-N2-[(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]-D-α-谷氨酰胺/三氟乙酸(1∶1)
将30mg(0.046mmol)中间体C58与29mg(0.055mmol)三氟乙酸/N-(2-氨基乙基)-N2-[(苄氧基)羰基]-D-α-谷氨酸苄基酯(1∶1)在1.5当量HATU和3当量N，N-二异丙基乙胺的存在下偶联。通过制备型HPLC纯化得到39.5mg(理论值的82％)受保护的中间体。首先，经氢化除去该中间体的苄基酯基团。随后与1-{2-[(2，5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-2-氧代乙基}-1H-吡咯-2，5-二酮在DMF中在3当量N，N-二异丙基乙胺的存在下偶联、随后用氯化锌在三氟乙醇中除去Teoc保护基团(如对中间体F119)，然后在2个进一步的步骤中得到标题化合物。
LC-MS(方法12)：Rt＝1.44min；MS(ESIpos)：m/z＝822(M+H)+。
中间体F326
N-[2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}氨基)乙基]-N2-(溴乙酰基)-D-α-谷氨酰胺/三氟乙酸(1∶1)
将43mg(0.066mmol)中间体C58与57mg(0.077mmol)中间体L125在1.5当量HATU和4当量4-甲基吗啉的存在下偶联。通过制备型HPLC纯化得到27mg(理论值的34％)受保护的中间体。然后使用氯化锌在三氟乙醇中(如对中间体F119所述)将其转化为标题化合物。
LC-MS(方法1)：Rt＝0.83min；MS(ESIpos)：m/z＝805和807(M+H)+。
B：抗体药物缀合物(ADC)的制备
B-1.产生ITEM-4和ITEM-4的嵌合及人源化变体的一般方法
ITEM-4是Nakayama等人(Nakayama等人，2003，Biochem Biophy Res Comm，306：819-825)描述的抗-TWEAKR抗体。ITEM-4的可变区(VH和VL)的序列公开于Zhou等人(Zhou等人，2013，J Invest Dermatol.133(4)：1052-62)中。基于人框架区中的CDR移植的该抗体的人源化变体由Zhou等人(Zhou等人，2013，J Invest Dermatol.133(4)：1052-62)和在WO2009/020933中描述。
基于Zhou等人(Zhou等人，2013，J Invest Dermatol.133(4)：1052-62)中ITEM-4的可变区(VH和VL)的序列的公开出版物并基于Zhou等人(Zhou等人，2013，J InvestDermatol.133(4)：1052-62)和WO2009/020933中人框架区中CDR移植的该抗体的人源化变体的公开出版物，获得了以下抗体序列：“TPP-7007”、“TPP-7053”、“TPP-7005”、“TPP-7073”、“TPP-7075”和“TPP-7076”。
将ITEM-4的可变区VH和VL与κ亚型的人IgG1的恒定区(CL、CH1、CH2、CH3)连接，获得嵌合抗体“TPP-7006”和“TPP-7074”的序列。
修饰ITEM-4的L-CDR1中潜在的脱酰胺基作用位点得到抗体“TPP-7073”、“TPP-7074”、“TPP-7075”和“TPP-7076”。
ITEM-4抗体的其他人源化变体可通过本领域已知的人源化方法来产生。
商购获得ITEM-4(尤其来自作为13-9018(Ref7016-9018M010))。
B-2.在哺乳动物细胞中表达抗-TWEAKR抗体的一般方法
在哺乳动物细胞的瞬时培养物中产生抗体，如Tom等人，Methods Express：Expression Systems中的第12章，Micheal R.Dyson和Yves Durocher编辑，ScionPublishing Ltd，2007(参见AK-实施例1)所述。
B-3.从细胞上清液中纯化抗体的一般方法
可从细胞培养物上清液中获得抗体。为此，通过细胞离心使细胞上清液澄清。然后将细胞上清液通过MabSelect Sure(GE Healthcare)色谱柱上的亲和色谱法纯化。为此，将柱在pH为7.4的DPBS(Sigma/Aldrich)中平衡，加载细胞上清液并用约10个柱体积的DPBSpH 7.4+500mM氯化钠洗涤柱。将抗体在50mM乙酸钠pH 3.5+500mM氯化钠中洗脱，然后在pH为7.4的DPBS中在Superdex 200柱(GE Healthcare)上通过凝胶过滤色谱法纯化。
B-4.偶联至半胱氨酸侧链的一般方法
将以下抗体用于偶联反应：
抗-TWEAKR AK1A(ITEM-4)
抗-TWEAKR AK1B(TPP-7005)
抗-TWEAKR AK1C(TPP-7006)
抗-TWEAKR AKiD(TPP-7007)
将2至5当量溶解于PBS缓冲液中的三(2-羧基乙基)膦盐酸盐(TCEP)加入于PBS缓冲液中的浓度范围为1mg/ml至20mg/ml(优选约5mg/ml至15mg/ml)的适当的抗体溶液中，并将混合物在RT下搅拌1h。为此，所用的相应抗体的溶液可以以工作实施例中指定的浓度使用，或其还可任选地用PBS缓冲液稀释至指定起始浓度的约一半以达到优选的浓度范围。随后，取决于预期的载量，加入2至12当量(优选约5-10当量)的待偶联的马来酰亚胺前体化合物或卤化物前体化合物在DMSO中的溶液。在此，DMSO的量不应超过总体积的10％。在马来酰亚胺前体的情况下，将反应物在RT下搅拌60-240min，且在卤化物前体的情况下，在RT下搅拌8至24h，然后加载至经PBS平衡的PD 10柱(G-25，GE Healthcare)上并用PBS缓冲液洗脱。通常，除非另有说明，否则将5mg于PBS缓冲液中的所讨论的抗体用于还原和随后的偶联。因此，在PD10柱上的纯化在每种情况下提供于3.5ml PBS缓冲液中的相应ADC溶液。然后将该样品通过超速离心浓缩并任选地用PBS缓冲液再稀释。如果需要，为了更好的除去低分子量组分，在用PBS缓冲液再稀释后反复通过超滤进行浓缩。对于生物学试验，如果需要，将最终ADC样品的浓度任选地通过再稀释调节至0.5-15mg/ml的范围。测定在工作实施例中指定的ADC溶液的相应的蛋白质浓度。此外，使用B-7下所述的方法测定抗体载量(药物/mAb比例)。
取决于接头，实施例中所示的ADC也可以在更低或更高的程度上以连接到抗体上的经水解的开链琥珀酰胺的形式存在。
特别地，经接头亚结构
连接到抗体的硫醇基团上的KSP-I-ADC也可任选地经由开链琥珀酰胺连接的ADC根据方案26通过在偶联后再缓冲并在pH 8下搅拌约20-24h而以靶向方式来制备。
#1代表与抗体连接的硫桥，以及#2是与改性KSP抑制剂连接的点。
其中接头经由经水解的开链琥珀酰胺连接到抗体上的这类ADC也可任选地通过如下示例性方法而以靶向方式来制备：
小规模偶联：
将2至5当量溶解于PBS缓冲液中的三(2-羧基乙基)膦盐酸盐(TCEP)加入于PBS缓冲液中的浓度范围为1mg/ml至20mg/ml(优选约5mg/ml至15mg/ml)的2-5mg所讨论的抗体的溶液中，并将混合物在RT下搅拌30min至1h。为此，所用的相应抗体的溶液可以以工作实施例中给定的浓度使用，或其还可任选地用PBS缓冲液稀释至指定起始浓度的约一半以达到优选的浓度范围。随后，取决于预期的载量，加入2至12当量(优选约5-10当量)的待偶联的马来酰亚胺前体化合物在DMSO中的溶液。在此，DMSO的量不应超过总体积的10％。将混合物在RT下搅拌60-240min，然后用pH已被提前调节为8的PBS缓冲液稀释至体积为3-7ml，并在氩气下在RT下搅拌过夜。将该溶液通过用pH为7.2的PBS缓冲液平衡的PD 10柱(G-25，GE Healthcare)并用pH 7.2的PBS缓冲液洗脱。随后将洗脱液通过超速离心浓缩并用PBS缓冲液(pH 7.2)后稀释。
中规模偶联：
在氩气下，将0.344mg TCEP于100μl PBS缓冲液中的溶液加入60mg于5ml PBS缓冲液中的所讨论的抗体(c～12mg/ml)中。将反应物在RT下搅拌30min，然后加入0.003mmol溶解于600μl DMSO中的马来酰亚胺前体化合物。在RT下再搅拌1.5h-2h后，将反应物用1075μl已被提前调节至pH 8的PBS缓冲液稀释。
然后将该溶液加载至已用pH 8的PBS缓冲液平衡的PD 10柱(G-25，GEHealthcare)上，并用pH 8的PBS缓冲液洗脱。将洗脱液用PH 8的PBS缓冲液稀释至总体积为14ml。将该溶液在RT下在氩气下搅拌过夜。如果需要，随后将该溶液再缓冲至pH 7.2。将ADC溶液通过超速离心浓缩，用PBS缓冲液(pH 7.2)再稀释，然后任选地再次浓缩至浓度为约10mg/ml。
在工作实施例中与抗体连接的其他潜在的水解敏感性噻烷基琥珀酰亚胺(thianylsuccinimide)桥含有以下接头亚结构，其中#1表示与抗体连接的硫醚键且#2表示与改性KSP抑制剂连接的点：
这些接头亚结构代表与抗体连接的连接单元并且(除接头组成外)对肿瘤细胞中所形成的代谢物的结构和特性具有显著影响。
在所示结构式中，AK1A、AK1B、AK1C和AK1D具有下列含义：
AK1A＝抗-TWEAKR AK1A(ITEM-4)(部分还原的)-S§1
AK1B＝抗-TWEAKR AK1B(TPP-7005)(部分还原的)-S§1
AK1C＝抗-TWEAKR AK1C(TPP-7006)(部分还原的)-S§1
AK1D＝抗-TWEAKR AK1D(TPP-7007)(部分还原的)-S§1
其中
§1表示与琥珀酰亚胺基团连接或与由其产生的任何异构的经水解的开链琥珀酰胺或亚烷基连接的键，
并且
S表示部分还原的抗体的半胱氨酸残基的硫原子。
B-5.偶联至赖氨酸侧链的一般方法
这些偶联描述于例如工作实施例194k和294k中。与抗体的这种连接可用于ADC与KSP抑制剂中、特别是与2-8个体内可裂解的寡肽基团SG1(其与R4经CO连接)的连接中。
以下抗体用于偶联反应：
抗-TWEAKR AK1A(ITEM-4)
抗-TWEAKR AK1B(TPP-7005)
抗-TWEAKR AK1C(TPP-7006)
抗-TWEAKR AK1D(TPP-7007)
将2至8当量的待偶联的前体化合物于DMSO中的溶液加入于PBS缓冲液中的浓度范围为1mg/ml至20mg/ml(优选约10mg/ml)(取决于预期载量)的所讨论的抗体的溶液中。在RT下搅拌30min至6h后，再加入相同量的于DMSO中的前体化合物。在此，DMSO的量不应超过总体积的10％。在RT下再搅拌30min至6h后，将反应物加载至用PBS平衡的PD 10柱(G-25，GE Healthcare)上并用PBS缓冲液洗脱。通常，除非另有说明，将于PBS缓冲液中的5mg所讨论的抗体用于还原和随后的偶联。因此，在PD10柱上的纯化在每种情况下提供于3.5ml PBS缓冲液中的相应ADC溶液。然后将该样品通过超速离心浓缩并任选地用PBS缓冲液再稀释。如果需要，为了更好的除去低分子量组分，在用PBS缓冲液再稀释后反复通过超滤来浓缩。对于生物学试验，如果需要，将最终ADC样品的浓度任选地通过再稀释调节至0.5-15mg/ml的范围。
测定在工作实施例中指定的ADC溶液的相应的蛋白质浓度。此外，使用B-7下所述的方法测定抗体载量(药物/mAb比例)。
在所示结构式中，AK2A、AK2B、AK2C和AK2D具有以下含义：
AK2A＝抗-TWEAKR AK1A(ITEM-4)-NH§2
AK2B＝抗-TWEAKR AK1B(TPP-7005)-NH§2
AK2C＝抗-TWEAKR AK1C(TPP-7006)-NH§2
AK2D＝抗-TWEAKR AK1D(TPP-7007)-NH§2
其中
§2表示与羰基基团连接的键，
并且
NH表示该抗体的赖氨酸残基的侧链氨基。
B-6a.制备封闭的琥珀酰亚胺-半胱氨酸加合物的一般方法：
在一个示例性实施方案中，将10μmol上述马来酰亚胺前体化合物用3-5ml DMF吸收，并加入2.1mg(20μmol)L-半胱氨酸。将反应混合物在RT下搅拌2h至24h，然后在减压下浓缩，然后通过制备型HPLC纯化。
B-6aa.制备异构的开环的琥珀酰胺-半胱氨酸加合物的一般方法：
在一个示例性实施方案中，将68μmol上述马来酰亚胺前体化合物用15ml DMF吸收，并加入36mg(136μmol)N-{[2-(三甲基硅烷基)乙氧基]羰基}-L-半胱氨酸。将反应混合物在RT下搅拌～20h，然后在减压下浓缩，然后通过制备型HPLC纯化。将适当的流份合并，将溶剂在减压下蒸发，然后将残余物溶解于15ml THF/水1：1中。加入131μl2M氢氧化锂水溶液，并将反应物在RT下搅拌1h。然后将反应物用1M盐酸中和，将溶剂在减压下蒸发，并将残余物通过制备型HPLC纯化。得到理论值的～50％的区域异构的受保护的中间体，其为无色泡沫状物。
在最后的步骤中，将0.023mmol这些区域异构的水解产物溶解于3ml2，2，2-三氟乙醇中。加入12.5mg(0.092mmol)氯化锌，并将反应物在50℃下搅拌4h。然后加入27mg(0.092mmol)乙二胺-N，N，N′，N′-四乙酸，并将溶剂在减压下蒸发。将残余物通过制备型HPLC纯化。浓缩适当的流份，并将残余物从乙腈/水中冻干，得到作为区域异构体混合物的水解的开环的硫烷基琥珀酰胺。
本发明的缀合物的进一步纯化和表征
反应后，在一些实例中，将反应混合物浓缩(例如通过超滤)，然后通过色谱法(例如使用G-25柱)脱盐并纯化。例如用磷酸盐缓冲盐水(PBS)进行洗脱。然后将溶液无菌过滤并冷冻。或者，可将缀合物冻干。
B-7.抗体、毒簇载量以及开链的半胱氨酸加合物的比例的测定
在去糖基化和/或变性后，除分子量测定外，为了蛋白质鉴定，进行胰蛋白酶消化，这在变性、还原和衍生化后经由发现的胰蛋白酶肽证实蛋白质的身份。
工作实施例中所述缀合物的所得的PBS缓冲溶液的毒簇载量如下测定：
通过各缀合物种类的分子量的质谱测定来进行连接了赖氨酸的ADC的毒簇载量的测定。在此，首先将该抗体缀合物用PNGaseF去糖基化，并将样品酸化，并在HPLC分离/脱盐后，使用ESI-MicroTofQ(Bruker Daltonik)通过质谱法进行分析。将TIC(总离子色谱图)中的信号的所有波谱相加，并基于MaxEnt去卷积来计算不同缀合物种类的分子量。然后在将不同种类的信号积分后计算DAR(＝药物/抗体比例)。
通过还原的和变性的ADC的反相色谱法测定连接了半胱氨酸的缀合物的毒簇载量。将盐酸胍(GuHCl)(28.6mg)和DL-二硫苏糖醇(DTT)溶液(500mM，3μl)加入ADC溶液(1mg/ml，50μl)中。将该混合物在55℃下培养1小时并通过HPLC分析。
在Agilent 1260 HPLC系统上进行HPLC分析，在220nm处检测。使用PolymerLaboratories PLRP-S聚合反相柱(目录号PL1912-3802)(2.1×150mm，8μm粒度，)在1ml/min的流速和以下梯度下：0min，25％B；3min，25％B；28min，50％B。流动相A由0.05％于水中的三氟乙酸(TFA)构成，流动相B由0.05％于乙腈中的三氟乙酸构成。
通过与非缀合的抗体的轻链(L0)和重链(H0)的保留时间比较，对检测出的峰进行指定。将仅在缀合的样品中检出的峰指定为具有一个毒簇的轻链(L1)和具有一个、两个和三个毒簇的重链(H1、H2、H3)。
由通过积分确定的峰面积而计算出的含毒簇的抗体的平均载量为HC载量和LC载量之和的两倍，其中由所有LC峰的毒簇数均加权积分结果的总和除以所有LC峰的单加权积分结果的总和而计算LC载量，并且其中由所有HC峰的毒簇数均加权积分结果的总和除以所有HC峰的单加权积分结果的总和而计算HC载量。在个别情况下，由于一些峰的共洗脱，可能无法精确测定毒簇载量。
在通过HPLC无法充分地分离轻链和重链的情况下，通过轻链和重链处的各缀合物种类的分子量的质谱测定来进行连接了半胱氨酸的缀合物的毒簇载量的测定。
将盐酸胍(GuHCl)(28.6mg)以及DL-二硫苏糖醇(DTT)的溶液(500mM，3μl)加入ADC溶液(1mg/ml，50μl)中。将混合物在55℃下培养1小时并在使用ESI-MicroTofQ(BrukerDaltonik)在线脱盐后通过质谱法分析。
对于DAR测定，将TIC(总离子色谱图)中的信号的所有波谱相加，并基于MaxEnt去卷积来计算轻链和重链处的不同缀合物种类的分子量。由通过积分确定的峰面积而计算出的含毒簇的抗体的平均载量为HC载量和LC载量之和的两倍，其中由所有LC峰的毒簇数均加权积分结果的总和除以所有LC峰的单加权积分结果的总和而计算LC载量，并且其中由所有HC峰的毒簇数均加权积分结果的总和除以所有HC峰的单加权积分结果的总和而计算HC载量。
为了测定开链的半胱氨酸加合物的比例，测定所有单缀合的轻链和重链变体的封闭的与开链的半胱氨酸加合物(分子量Δ18道尔顿)的分子量面积比。所有变体的平均值得出开环的半胱氨酸加合物的比例。
B-8.检验ADC的抗原结合
在已偶联后，检验结合体结合到靶分子上的能力。本领域技术人员熟知可用于此目的的各种方法；例如，可使用ELISA技术或表面等离子体共振分析(BIAcoreTM测量)检查缀合物的亲和力。本领域技术人员可使用常规方法测量缀合物浓度，例如对抗体缀合物而言通过蛋白质测定法(还参见Doronina等人；Nature Biotechnol.2003；21：778-784以及Polson等人，Blood 2007；1102：616-623)来测量。
代谢物实施方案
实施例M1
S-[1-(2-{[2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}氨基)乙基]氨基}-2-氧代乙基)-2，5-二氧代吡咯烷-3-基]-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1∶1)
将1.8mg(2μmol)中间体F104用1ml DMF吸收，并加入2.7mg(22μmol)L-半胱氨酸。将反应混合物在RT下搅拌20h，然后在减压下浓缩，然后通过制备型HPLC纯化。留下0.6mg(理论值的26％)标题化合物，其为无色泡沫状物。
LC-MS(方法1)：Rt＝0.80min；MS(EIpos)：m/z＝814[M+H]+。
实施例M2
4-[(2-{[2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}氨基)乙基]氨基}-2-氧代乙基)氨基]-3-{[(2R)-2-氨基-2-羧基乙基]硫烷基}-4-氧代丁酸/三氟乙酸(1∶1)
和
4-[(2-{[2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}氨基)乙基]氨基}-2-氧代乙基)氨基]-2-{[(2R)-2-氨基-2-羧基乙基]硫烷基}-4-氧代丁酸/三氟乙酸(1∶1)
LC-MS(方法1)：Rt＝0.80min；MS(EIpos)：m/z＝814[M+H]+。
首先，将L-半胱氨酸与1-({[2-(三甲基硅烷基)乙氧基]羰基}氧基)吡咯烷-2，5-二酮在DMF中在N，N-二异丙基乙胺的存在下转化为N-{[2-(三甲基硅烷基)乙氧基]羰基}-L-半胱氨酸。
将406mg(1.53mmol)N-{[2-(三甲基硅烷基)乙氧基]羰基}-L-半胱氨酸溶解于10ml DMF中，加入157.5mg(1.606mmol)马来酸酐，并将反应物在RT下搅拌1小时。将7.5mg(0.01mmol)中间体C66加入130μl该溶液中，并将反应物在RT下搅拌5min。然后将混合物在减压下浓缩，并将残余物通过制备型HPLC纯化。将溶剂在减压下蒸发，并将残余物在高真空下干燥。得到10mg(89％)受保护的中间体；通过HPLC或通过LC-MS都不能分离所述区域异构体。
LC-MS(方法1)：Rt＝1.38min；MS(EIpos)：m/z＝1120[M+H]+。
在最后的步骤中，将10mg该中间体溶解于2ml 2，2，2-三氟乙醇中。加入12mg(0.088mmol)氯化锌，并将反应物在50℃下搅拌30min。然后加入26mg(0.088mmol)乙二胺-N，N，N′，N′-四乙酸，并将溶剂在减压下蒸发。将残余物通过制备型HPLC纯化。将适当的流份浓缩并将残余物从乙腈/水中冻干得到8.3mg(理论值的99％)标题化合物，其为比例为87∶13的区域异构体混合物。
LC-MS(方法5)：Rt＝2.3min和2.43min；MS(ESIpos)：m/z＝832(M+H)+。
1H-NMR主要的区域异构体：(500MHz，DMSO-d6)：δ＝8.7(m，1H)，8.5(m，2H)，8.1(m，1H)，7.6(m，1H)，7.5(s，1H)7.4-7.15(m，6H)，6.9-7.0(m，1H)，6.85(s，1H)，5.61(s，1H)，4.9和5.2(2d，2H)，4.26和4.06(2d，2H)，3.5-3.8(m，5H)，3.0-3.4(m，5H)，2.75-3.0(m，3H)，2.58和2.57(dd，1H)，0.77和1，5(2m，2H)，0.81(s，9H)。
或者，如下制备该区域异构的标题化合物：
为此，首先将L-半胱氨酸与1-({[2-(三甲基硅烷基)乙氧基]羰基}氧基)吡咯烷-2，5-二酮在DMF中在N，N-二异丙基乙胺的存在下转化为N-{[2-(三甲基硅烷基)乙氧基]羰基}-L-半胱氨酸。
将55mg(0.068mmol)中间体F104和36mg(0.136mmol)N-{[2-(三甲基硅烷基)乙氧基]羰基}-L-半胱氨酸溶解于15ml DMF中，并将混合物在RT下搅拌20h。然后将混合物浓缩，并将残余物通过制备型HPLC纯化。将适当的流份合并，并将溶剂在减压下蒸发，然后将残余物溶解于15ml THF/水1∶1中。加入131μl 2M氢氧化锂水溶液，并将反应物在RT下搅拌1h。然后将反应物用1M盐酸中和，将溶剂在减压下蒸发，并将残余物通过制备型HPLC纯化。得到37mg(理论值的50％)区域异构的受保护的中间体，其为无色泡沫状物。
LC-MS(方法5)：Rt＝3.33min和3.36min；MS(ESIpos)：m/z＝976(M+H)+。
在最后的步骤中，将25mg(0.023mmol)该中间体溶解于3ml 2，2，2-三氟乙醇中。加入12.5mg(0.092mmol)氯化锌，并将反应物在50℃下搅拌4h。然后加入27mg(0.092mmol)乙二胺-N，N，N′，N′-四乙酸，并将溶剂在减压下蒸发。将残余物通过制备型HPLC纯化。将适当的流份浓缩并将残余物从乙腈/水中冻干得到18.5mg(理论值的85％)标题化合物，其为比例为21∶79的区域异构体混合物。
LC-MS(方法5)：Rt＝2.37min和3.44min；MS(ESIpos)：m/z＝832(M+H)+。
实施例M3
4-[(2-{[(2R)-2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}氨基)-2-羧基乙基]氨基}-2-氧代乙基)氨基]-3-{[(2R)-2-氨基-2-羧基乙基]硫烷基}-4-氧代丁酸/三氟乙酸(1∶1)
和
4-[(2-{[(2R)-2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}氨基)-2-羧基乙基]氨基}-2-氧代乙基)氨基]-2-{[(2R)-2-氨基-2-羧基乙基]硫烷基}-4-氧代丁酸/三氟乙酸(1∶1)
首先，将L-半胱氨酸与1-({[2-(三甲基硅烷基)乙氧基]羰基}氧基)吡咯烷-2，5-二酮在DMF中在N，N-二异丙基乙胺的存在下转化为N-{[2-(三甲基硅烷基)乙氧基]羰基}-L-半胱氨酸。
将11mg(0.013mmol)中间体F193和8mg(0.016mmol)N-{[2-(三甲基硅烷基)乙氧基]羰基}-L-半胱氨酸溶解于3ml DMF中，并将混合物在RT下搅拌20h。然后将混合物浓缩，并将残余物通过制备型HPLC纯化。
将适当的流份合并，将溶剂在减压下蒸发，然后将残余物溶解于2mlTHF/水1∶1中。加入19μl 2M氢氧化锂水溶液，并将反应物在RT下搅拌1h。然后再加入19μl 2M氢氧化锂水溶液，并将反应物在RT下搅拌过夜。然后将混合物用1M盐酸中和，将溶剂在减压下蒸发，并将残余物通过制备型HPLC纯化。得到4.1mg(理论值的38％)区域异构的受保护的中间体，其为无色泡沫状物。
LC-MS(方法1)：Rt＝1.03min(breit)；MS(ESIpos)：m/z＝1020(M+H)+。
在最后的步骤中，将4.1mg(0.004mmol)该中间体溶解于3ml 2，2，2-三氟乙醇中。加入3mg(0.022mmol)氯化锌，并将反应物在50℃下搅拌1h。然后加入6mg(0.022mmol)乙二胺-N，N，N′，N′-四乙酸和2ml 0.1％浓度的三氟乙酸水溶液，并将溶剂在减压下蒸发。将残余物通过制备型HPLC纯化。将适当的流份浓缩并将残余物从乙腈/水中冻干得到5mg(定量的)标题化合物，其为比例为20∶80的区域异构体混合物。
LC-MS(方法1)：Rt＝0.78min(breit)；MS(ESIpos)：m/z＝876(M+H)+。
LC-MS(方法5)：Rt＝2.36min和2.39min；MS(ESIpos)：m/z＝876(M+H)+。
实施例M4
S-(1-{2-[2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}氨基)乙氧基]乙基}-2，5-二氧代吡咯烷-3-基)-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1∶1)
将3mg(4μmol)中间体F248用2ml DMF吸收，加入0.9mg(8μmol)L-半胱氨酸。将反应混合物在RT下搅拌18h，然后在减压下浓缩。将残余物通过制备型HPLC纯化。将适当的流份浓缩，将残余物从乙腈/水中冻干后，得到1.1mg(理论值的32％)标题化合物，其为白色固体。
LC-MS(方法1)：Rt＝0.78min；MS(EIpos)：m/z＝801[M+H]+。
实施例M5
(3R，7S)-7-氨基-17-{[(2R)-2-氨基-2-羧基乙基]硫烷基}-3-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-4-乙醇酰基-2，2-二甲基-8，16-二氧代-12-氧杂-4，9，15-三氮杂十九烷-19-酸/三氟乙酸(1∶1)
和
(3R，7S)-7-氨基-18-{[(2R)-2-氨基-2-羧基乙基]硫烷基}-3-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-4-乙醇酰基-2，2-二甲基-8，16-二氧代-12-氧杂-4，9，15-三氮杂十九烷-19-酸/三氟乙酸(1∶1)
将8mg(0.010mmol)中间体F248的受保护的中间体和5.1mg(0.02mmol)N-{[2-(三甲基硅烷基)乙氧基]羰基}-L-半胱氨酸溶解于3ml DMF中，将混合物在RT下搅拌18h，然后在超声波浴中处理2h。然后将混合物浓缩，并将残余物通过制备型HPLC纯化。将适当的流份合并，将溶剂在减压下蒸发，然后将残余物溶解于2ml THF/水1∶1中。加入15μl 2M氢氧化锂水溶液，并将反应物在RT下搅拌15min。然后将反应物用1M盐酸调节至pH～3，用20ml氯化钠溶液稀释并用20ml乙酸乙酯萃取两次。将有机相经硫酸镁干燥并浓缩，将残余物从乙腈/水中冻干。得到8.4mg(理论值的78％，经2个步骤)区域异构的受保护的中间体，其为无色泡沫状物。
LC-MS(方法1)：Rt＝1.44min和3.43min；MS(ESIpos)：m/z＝1107(M+H)+。
在最后的步骤中，将8mg(0.007mmol)该中间体溶解于5ml 2，2，2-三氟乙醇中。加入9.8mg(0.072mmol)氯化锌，并将反应物在50℃下搅拌1.5h。然后加入乙二胺-N，N，N′，N′-四乙酸，并将溶剂在减压下蒸发。将残余物通过制备型HPLC纯化。将适当的流份浓缩，并将残余物从乙腈/水中冻干得到4mg(理论值的59％)标题化合物，其为比例为31∶67的区域异构体混合物。
LC-MS(方法1)：Rt＝0.79min和0.81min；MS(ESIpos)：m/z＝819(M+H)+。
实施例M6
2-{[(2R)-2-氨基-2-羧基乙基]硫烷基}-4-({(14R)-13-(3-氨基丙基)-14-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-15，15-二甲基-2，7，12-三氧代-10-硫杂-3，6，13-三氮杂十六烷-1-基}氨基)-4-氧代丁酸/三氟乙酸(1∶2)
和
3-{[(2R)-2-氨基-2-羧基乙基]硫烷基}-4-({(14R)-13-(3-氨基丙基)-14-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-15，15-二甲基-2，7，12-三氧代-10-硫杂-3，6，13-三氮杂十六烷-1-基}氨基)-4-氧代丁酸/三氟乙酸(1∶2)
将18mg(0.021mmol)中间体F213和11.2mg(0.04mmol)N-{[2-(三甲基硅烷基)乙氧基]羰基}-L-半胱氨酸溶解于2ml DMF中，并将混合物在RT下搅拌18h。将反应混合物在减压下浓缩。将残余物(21.2mg)溶解于3ml THF/水1∶1中。加入0.04ml 2M氢氧化锂水溶液，并将反应物在RT下搅拌3小时。加入0.02ml 2M氢氧化锂水溶液，并将反应物在RT下搅拌1小时。使用7.2mg(0.12mmol)乙酸将反应物调节至pH～7。将反应混合物通过制备型RP-HPLC直接纯化(柱：Reprosil 125×30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/water；0.1％TFA)。将溶剂在减压下蒸发，并将残余物在高真空下干燥。得到13mg(57％，经2个步骤)区域异构的受保护的中间体。
LC-MS(方法1)：Rt＝1.03min；MS(ESIpos)：m/z＝1020(M+H)+。
在最后的步骤中，将13mg(0.01mmol)该中间体溶解于2ml 2，2，2-三氟乙醇中。加入6.2mg(0.05mmol)氯化锌，并将反应物在50℃下搅拌7h。然后加入13.3mg(0.05mmol)乙二胺-N，N，N′，N′-四乙酸，并将产物通过制备型HPLC纯化。将适当的流份浓缩，并将残余物从乙腈/水中冻干得到10.3mg(81.4％)标题化合物，其为区域异构体混合物。
LC-MS(方法1)：Rt＝1.03min；MS(ESIpos)：m/z＝875(M+H)+。
实施例M7
S-(2-{[2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}氨基)乙基]氨基}-2-氧代乙基)-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1∶1)
将6mg(8μmol)中间体F119用3ml DMF吸收，并加入1.8mg(15μmol)L-半胱氨酸。将反应混合物在RT下搅拌6h，然后使其在RT下静置3天。然后将反应物在减压下浓缩，并将产物通过制备型HPLC纯化。
LC-MS(方法1)：Rt＝0.81min；MS(ESIpos)：m/z＝717(M+H)+。
实施例M8
(3R)-6-{(11S，15R)-11-氨基-15-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-14-乙醇酰基-16，16-二甲基-2，5，10-三氧代-3，6，9，14-四氮杂十七烷-1-基}-5-氧代硫代吗啉-3-甲酸/三氟乙酸(1∶1)
将4mg(0.004mmol)实施例135中的化合物溶解于4ml THF/水中，加入48μl 2摩尔氢氧化锂水溶液。将反应物在RT下搅拌1h，然后浓缩并通过制备型HPLC纯化。将适当的流份合并、浓缩并从乙腈/水中冻干得到2.4mg(理论值的60％)标题化合物。
LC-MS(方法1)：Rt＝0.86min；MS(EIpos)：m/z＝814[M+H]+。
实施例M9
N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}-2-羟基乙酰胺
首先将150.0mg(0.42mmol)(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙-1-胺(中间体C52)加入2.0ml二氯甲烷中，加入29.2mg(0.49mmol)HOAc和125.6mg(0.59mmol)三乙酰氧基硼氢化钠，并将混合物在RT下搅拌5min。加入98.9mg(0.49mmol)3-(1，3-二氧代-1，3-二氢-2H-异吲哚-2-基)丙醛。将反应混合物在RT下搅拌过夜。将反应混合物用乙酸乙酯稀释，并将有机相用饱和碳酸钠溶液洗涤两次并用饱和NaCl溶液洗涤一次。经硫酸镁干燥后，将溶剂在减压下蒸发，并将残余物在硅胶上纯化(流动相：二氯甲烷/甲醇100∶1)。将溶剂在减压下蒸发，并将残余物在高真空下干燥。得到188.6mg(74％)化合物2-[3-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}氨基)丙基]-1H-异吲哚-1，3(2H)-二酮。
LC-MS(方法1)：Rt＝1.00min；MS(ESIpos)：m/z＝541[M+H]+。
首先将171.2mg(0.32mmol)2-[3-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}氨基)丙基]-1H-异吲哚-1，3(2H)-二酮加入5.0ml二氯甲烷中，并加入73.6mg(0.73mmol)三乙胺。在0℃下，加入94.9mg(0.70mmol)乙酰氧基乙酰氯，并将反应混合物在RT下搅拌过夜。将反应混合物用乙酸乙酯稀释，并将有机相用饱和碳酸氢钠溶液洗涤两次并用饱和NaCl溶液洗涤一次。经硫酸镁干燥后，将溶剂在减压下蒸发，并将残余物使用Biotage Isolera纯化(硅胶，柱10g SNAP，流速12ml/min，乙酸乙酯/环己烷1∶3)。将溶剂在减压下蒸发，并将残余物在高真空下干燥。得到159.0mg(77％)化合物2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}[3-(1，3-二氧代-1，3-二氢-2H-异吲哚-2-基)丙基]氨基)-2-氧代乙酸乙酯。
LC-MS(方法1)：Rt＝1.35min；MS(ESIpos)：m/z＝642[M+H]+。
首先将147.2mg(0.23mmol)2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}[3-(1，3-二氧代-1，3-二氢-2H-异吲哚-2-基)丙基]氨基)-2-氧代乙酸乙酯加入4.0ml乙醇中，并加入356.2mg(4.59mmol)甲胺(40％于水中)。将反应混合物在50℃下搅拌过夜。将溶剂在减压下蒸发，并将残余物与甲苯共蒸馏三次。将残余物在硅胶上纯化(流动相：二氯甲烷/甲醇＝10∶1)。将溶剂在减压下蒸发，并将残余物在高真空下干燥。得到67.4mg(63％)标题化合物。
LC-MS(方法1)：Rt＝0.91min；MS(ESIpos)：m/z＝470[M+H]+。
实施例M10
(2R，28R)-28-氨基-2-[({2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}硫烷基)甲基]-25-(羧基甲基)-4，20，24-三氧代-7，10，13，16-四氧杂-26-硫杂-3，19，23-三氮杂二十九烷-1，29-二酸/三氟乙酸(1∶2)
和
(1R，28R，34R)-1-氨基-33-(3-氨基丙基)-34-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-35，35-二甲基-6，10，26，32-四氧代-14，17，20，23-四氧杂-3，30-二硫杂-7，11，27，33-四氮杂三十六烷-1，4，28-三甲酸/三氟乙酸(1∶2)
将20mg(0.018mmol)R-{2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}-N-[19-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4，7，10，13-四氧杂-16-氮杂十九烷-1-酰基]-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1∶1)(中间体F209)和9.78mg(0.036mmol)N-{[2-(三甲基硅烷基)乙氧基]羰基}-L-半胱氨酸溶解于2ml DMF中，并将混合物在RT下搅拌18h。将反应混合物在减压下浓缩。将残余物(47.7mg)溶解于3ml THF/水1∶1中。加入0.08ml 2M氢氧化锂水溶液，并将反应物在RT下搅拌1小时。然后使用9.26mg(0.15mmol)乙酸将反应物调节至pH～7。将反应混合物通过制备型RP-HPLC直接纯化(柱：Reprosil 125×30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水；0.1％TFA)。将溶剂在减压下蒸发，并将残余物在高真空下干燥。得到15.3mg(29％，经2个步骤)区域异构的受保护的中间体。
LC-MS(方法6)：Rt＝12.26min和12.30min；MS(ESIpos)：m/z＝1254(M+H)+。
在最后的步骤中，将15.3mg(0.01mmol)该中间体溶解于2ml 2，2，2-三氟乙醇中。加入6.1mg(0.05mmol)氯化锌，并将反应物在50℃下搅拌2h。然后加入13.1mg(0.05mmol)乙二胺-N，N，N′，N′-四乙酸，并将产物通过制备型HPLC纯化。将适当的流份浓缩，并将残余物从乙腈/水中冻干得到11.9mg(79.5％)标题化合物，其为区域异构体混合物。
LC-MS(方法1)：Rt＝0.85min；MS(ESIpos)：m/z＝1110(M+H)+。
实施例M11
S-{2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1∶2)
将15.0mg(0.018mmol)S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}-2，2-二甲基-6，12-二氧代-5-氧杂-7，11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1∶1)(中间体C71)溶解于1.0ml三氟乙醇中，并加入7.4mg(0.054mmol)氯化锌。将反应混合物在50℃下搅拌过夜。加入15.8mg(0.054mmol)乙二胺-N，N，N′，N′-四乙酸，将反应混合物搅拌10min，然后加入水(0.1％TFA)。直接通过RP-HPLC进行纯化(柱：Reprosil 125×30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)。将溶剂在减压下蒸发，并将残余物在高真空下干燥。得到11.1mg(77％)标题化合物。
LC-MS(方法1)：Rt＝0.83min；MS(ESIpos)：m/z＝573(M+H)+。
实施例M12
4-{[(1R)-2-({2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}硫烷基)-1-羧基乙基]氨基}-4-氧代丁酸/三氟乙酸(1∶1)
将12.2mg(0.014mmol)S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}-2，2-二甲基-6，12-二氧代-5-氧杂-7，11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-N-(4-叔丁氧基-4-氧代丁酰基)-L-半胱氨酸(中间体C77)溶解于2.0ml三氟乙醇中，并加入11.4mg(0.084mmol)氯化锌。将反应混合物在50℃下搅拌3h。加入24.5mg(0.084mmol)乙二胺-N，N，N′，N′-四乙酸，将反应混合物搅拌10min，然后加入水(0.1％TFA)。直接通过RP-HPLC进行纯化(柱：Reprosil 125×30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)。将溶剂在减压下蒸发，并将残余物在高真空下干燥。得到4.6mg(42％)标题化合物。
LC-MS(方法1)：Rt＝0.88min；MS(ESIpos)：m/z＝673(M+H)+。
实施例M13
4-[(2-{[2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}氨基)乙基]氨基}-2-氧代乙基)氨基]-2-{[(2R)-2-氨基-2-羧基乙基]硫烷基}-4-氧代丁酸/三氟乙酸(1∶1)
区域异构体1，差向异构体(2R)或(2S)
LC-MS(方法5)：Rt＝2.44min；MS(ESIpos)：m/z＝832[M+H]+。
首先，将L-半胱氨酸甲酯盐酸盐(1∶1)与1-({[2-(三甲基硅烷基)乙氧基]羰基}氧基)吡咯烷-2，5-二酮在DMF中在N，N-二异丙基乙胺的存在下转化为N-{[2-(三甲基硅烷基)乙氧基]羰基}-L-半胱氨酸甲酯。
将408mg(1.93mmol)市售的3-溴-4-甲氧基-4-氧代丁酸和180mg(0.644mmol)N-{[2-(三甲基硅烷基)乙氧基]羰基}-L-半胱氨酸甲酯溶解于8ml DMF中，并加入147mg(0.97mmol)1，8-二氮杂二环[5.4.0]十一碳-7-烯。在RT下搅拌18h后，再加入136mg(0.64mmol)3-溴-4-甲氧基-4-氧代丁酸和147mg(0.97mmol)1，8-二氮杂二环[5.4.0]十一碳-7-烯，并将混合物在RT下再搅拌12h，然后在减压下浓缩。将残余物通过制备型HPLC纯化。将适当的流份合并，并将溶剂在减压下蒸发得到151mg(理论值的57％)4-甲氧基-3-{[(2R)-3-甲氧基-3-氧代-2-({[2-(三甲基硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)丙基]硫烷基}-4-氧代丁酸。
LC-MS(方法12)：Rt＝1.74min；MS(ESIneg)：m/z＝408(M-H)-。
将145mg该中间体通过超临界流体色谱法经手性柱分离为单个的非对映异构体(SFC；柱：DAICEL，AD-H 5u 250×20mm；流速：80ml/min；方法：AD-25％ETOH-80ml；压力：100巴；波长：210nM)，得到63mg(43％)差向异构体1和58mg(40％)差向异构体2。
差向异构体1的表征如下：
LC-MS(方法5)：Rt＝2.94min；MS(ESIneg)：m/z＝408(M-H)-。
1H-NMR：(400MHz，DMSO-d6)：δ＝7.57(d，1H)，4.24(m，1H)，4.05(t，2H)，3.67(t，1H)，3.65(s，3H)，3.62(s，3H)，3.05(dd，1H)，2.70-2.88(m，2H)，2.59(dd，1H)，0.93(t，2H)，0.02(s，9H)。
差向异构体2的表征如下：
LC-MS(方法5)：Rt＝2.95min；MS(ESIneg)：m/z＝408(M-H)-。
1H-NMR：(400MHz，DMSO-d6)：δ＝7.58(d，1H)，4.16-4.23(m，1H)，4.05(t，2H)，3.67(dd，1H)，3.65(s，3H)，3.64(s，3H)，3.04(dd，1H)，2.88(dd，1H)，2.77(dd，1H)，2.61(dd，1H)，0.92(t，2H)，0.02(s，9H)。
将32.5mg(0.079mmol)差向异构体1在30mg(0.079mmol)HATU和13.4mg(0.132mmol)4-甲基吗啉的存在下与50mg(0.066mmol)中间体C66偶联，HPLC纯化后，得到43mg(理论值的57％)完全受保护的中间体4-{[(8S)-8-{2-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]乙基}-2，2-二甲基-6，9，14-三氧代-5-氧杂-7，10，13-三氮杂-2-硅杂十五烷-15-基]氨基}-2-{[(2R)-3-甲氧基-3-氧代-2-({[2-(三甲基硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)丙基]硫烷基}-4-氧代丁酸甲酯。
然后将40mg(0.035mmol)该中间体与0.9ml 2摩尔氢氧化锂溶液在11ml甲醇中在RT下搅拌20min，使得两个甲基酯基团裂解。通过HPLC纯化得到12mg(理论值的31％)二羧酸衍生物。
LC-MS(方法5)：Rt＝4.74min；MS(ESIpos)：m/z＝1120[M+H]+。
最后，将10mg(0.009mmol)该中间体用氯化锌在三氟乙醇中完全脱保护，如上所述。将残余物通过制备型HPLC纯化。将适当的流份浓缩并将残余物从乙腈/水中冻干得到2.6mg(理论值的30％)标题化合物。
LC-MS(方法5)：Rt＝2.44min；MS(ESIpos)：m/z＝832[M+H]+。
实施例M14
4-[(2-{[2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}氨基)乙基]氨基}-2-氧代乙基)氨基]-2-{[(2R)-2-氨基-2-羧基乙基]硫烷基}-4-氧代丁酸/三氟乙酸(1∶1)
区域异构体1，差向异构体2(2R或2S)
LC-MS(方法5)：Rt＝2.44min；MS(EIpos)：m/z＝832[M+H]+。
将实施例M13中所述的中间体差向异构体2以类似于实施例M13中的描述来进行反应：
将32.5mg(0.079mmol)差向异构体2在30mg(0.079mmol)HATU和13.4mg(0.132mmol)4-甲基吗啉的存在下与50mg(0.066mmol)中间体C66偶联，HPLC纯化后，得到43mg(理论值的57％)完全受保护的中间体4-{[(8S)-8-{2-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]乙基}-2，2-二甲基-6，9，14-三氧代-5-氧杂-7，10，13-三氮杂-2-硅杂十五烷-15-基]氨基}-2-{[(2R)-3-甲氧基-3-氧代-2-({[2-(三甲基硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)丙基]硫烷基}-4-氧代丁酸甲酯。
然后将40mg(0.035mmol)该中间体与0.9ml 2摩尔氢氧化锂溶液在11ml甲醇中在RT下搅拌20min，使得两个甲基酯基团裂解。通过HPLC纯化得到11mg(理论值的28％)二羧酸衍生物。
LC-MS(方法5)：Rt＝4.74min；MS(ESIpos)：m/z＝1120[M+H]+。
最后，将10mg(0.009mmol)该中间体用氯化锌在三氟乙醇中完全脱保护，如上所述。将残余物通过制备型HPLC纯化。将适当的流份浓缩并将残余物从乙腈/水中冻干得到4.4mg(理论值的52％)标题化合物。
LC-MS(方法5)：Rt＝2.44min；MS(ESIpos)：m/z＝832[M+H]+。
实施例M15
4-[(2-{[2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}氨基)乙基]氨基}-2-氧代乙基)氨基]-3-{[(2R)-2-氨基-2-羧基乙基]硫烷基}-4-氧代丁酸/三氟乙酸(1∶1)
区域异构体2，差向异构体1(3R或3S)
LC-MS(方法5)：Rt＝2.45min；MS(EIpos)：m/z＝832[M+H]+。
将742.8mg(3.3mmol)市售的2-溴-4-乙氧基-4-氧代丁酸和802mg(2.87mmol)N-{[2-(三甲基硅烷基)乙氧基]羰基}-L-半胱氨酸甲酯溶解于32ml DMF中，并加入655.4mg(4.31mmol)1，8-二氮杂二环[5.4.0]十一碳-7-烯。在RT下搅拌20h后，将反应物在减压下浓缩，并将残余物通过制备型HPLC纯化。将适当的流份合并并将溶剂在减压下蒸发得到521mg(理论值的43％)4-乙氧基-2-{[(2R)-3-甲氧基-3-氧代-2-({[2-(三甲基硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)丙基]硫烷基}-4-氧代丁酸。
LC-MS(方法5)：Rt＝3.13min；MS(ESIpos)：m/z＝424(M+H)+。
将510mg该中间体通过超临界流体色谱法经手性柱分离为单个的非对映异构体(SFC；柱：DAICEL，AD-H 5u 250×20mm；流速：80ml/min；方法：AD-10％ETOH-80ml；压力：100巴；波长：210nM)，得到100mg(20％)差向异构体1和141mg(28％)差向异构体2。
差向异构体1的表征如下：
LC-MS(方法1)：Rt＝0.99min；MS(ESIneg)：m/z＝422(M-H)-。
1H-NMR：(400MHz，DMSO-d6)：δ＝7.60(d，1H)，4.18-4.26(m，1H)，4.01-4.08(m，4H)，3.63(s，3H)，3.59(dd，1H)，3.04(dd，1H)，2.92(dd，1H)，2.80(dd，1H)，2.63(dd，1H)，1.17(t，3H)，0.92(t，2H)，0.02(s，9H)。
差向异构体2的表征如下：
LC-MS(方法5)：Rt＝2.95min；MS(ESIneg)：m/z＝408(M-H)-。
1H-NMR：(400MHz，DMSO-d6)：δ＝7.56(d，1H)，4.21-4.29(m，1H)，4.01-4.1(m，4H)，3.64(s，3H)，3.58(dd，1H)，3.08(dd，1H)，2.85(dd，1H)，2.78(dd，1H)，2.60(dd，1H)，1.17(t，3H)，0.93(t，2H)，0.02(s，9H)。
将33.6mg(0.079mmol)差向异构体1在30mg(0.079mmol)HATU和13.4mg(0.132mmol)4-甲基吗啉的存在下与50mg(0.066mmol)中间体C66偶联，HPLC纯化后，得到51mg(理论值的63％)完全受保护的中间体4-{[(8S)-8-{2-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]乙基}-2，2-二甲基-6，9，14-三氧代-5-氧杂-7，10，13-三氮杂-2-硅杂十五烷-15-基]氨基}-3-{[(2R)-3-甲氧基-3-氧代-2-({[2-(三甲基硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)丙基]硫烷基}-4-氧代丁酸乙酯。
然后将49mg(0.042mmol)该中间体在RT下与0.5ml 2摩尔氢氧化锂溶液在12mlTHF/水1∶1中搅拌30min，使得两个甲基酯基团裂解。酸化并通过HPLC纯化得到11mg(理论值的24％)二羧酸衍生物。
LC-MS(方法5)：Rt＝4.68min；MS(ESIpos)：m/z＝1120[M+H]+。
最后，将11mg(0.01mmol)该中间体用氯化锌在三氟乙醇中完全脱保护，如上所述。将残余物通过制备型HPLC纯化。将适当的流份浓缩，并将残余物从乙腈/水中冻干得到3.7mg(理论值的39％)标题化合物。
LC-MS(方法5)：Rt＝2.45min；MS(ESIpos)：m/z＝832[M+H]+。
实施例M16
4-[(2-{[2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}氨基)乙基]氨基}-2-氧代乙基)氨基]-3-{[(2R)-2-氨基-2-羧基乙基]硫烷基}-4-氧代丁酸/三氟乙酸(1∶1)
区域异构体2，差向异构体2(3R或3S)
LC-MS(方法5)：Rt＝2.44min；MS(EIpos)：m/z＝832[M+H]+。
将实施例M15中所述的中间体差向异构体2以类似于实施例M15中的描述来进行反应：
将33.6mg(0.079mmol)差向异构体2在30mg(0.079mmol)HATU和13.4mg(0.132mmol)4-甲基吗啉的存在下与50mg(0.066mmol)中间体C66偶联，HPLC纯化后，得到51mg(理论值的63％)完全受保护的中间体4-{[(8S)-8-{2-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]乙基}-2，2-二甲基-6，9，14-三氧代-5-氧杂-7，10，13-三氮杂-2-硅杂十五烷-15-基]氨基}-3-{[(2R)-3-甲氧基-3-氧代-2-({[2-(三甲基硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)丙基]硫烷基}-4-氧代丁酸乙酯。
然后将49mg(0.042mmol)该中间体在RT下与0.5ml 2摩尔氢氧化锂溶液在12mlTHF/水1∶1中搅拌30min，使得两个甲基酯基团裂解。酸化并通过HPLC纯化得到13.4mg(理论值的28％)二羧酸衍生物。
LC-MS(方法5)：Rt＝4.66min；MS(ESIpos)：m/z＝1120[M+H]+。
最后，将13.4mg(0.012mmol)该中间体用氯化锌在三氟乙醇中完全脱保护，如上所述。将残余物通过制备型HPLC纯化。将适当的流份浓缩，并将残余物从乙腈/水中冻干得到7.5mg(理论值的66％)标题化合物。
LC-MS(方法5)：Rt＝2.44min；MS(ESIpos)：m/z＝832[M+H]+。
实施例M17
(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酸盐酸盐(1∶1)
将150mg(0.2mmol)中间体C53溶解于15ml DMF、和2.29g(20.39mmol)DABCO中。将反应物在超声波浴中处理30min。然后通过加入1.17ml乙酸，将反应物调节至pH 3-4，并将混合物在减压下浓缩。将残余物通过制备型HPLC纯化，并将适当的流份在RT下在减压下浓缩。将残余物用乙腈/水(1∶1)吸收，加入5ml 4N盐酸，然后将混合物冻干。得到81mg(理论值的68％)标题化合物。
LC-MS(方法5)：Rt＝2.69min；MS(EIpos)：m/z＝514[M+H]+。
实施例M18
N-[2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}氨基)乙基]-L-谷氨酰胺/三氟乙酸(1∶1)
首先，使用肽化学的经典方法制备三氟乙酸/N-(2-氨基乙基)-N2-[(苄氧基)羰基]-L-谷氨酸苄基酯(1∶1)。然后在HATU的存在下，将该中间体与中间体C58偶联。随后，首先通过氢化裂解除去苄氧基羰基保护基团和苄基酯，然后使用氯化锌除去2-(三甲基硅烷基)乙氧基羰基保护基团。
LC-MS(方法6)：Rt＝1.91min；MS(EIpos)：m/z＝685[M+H]+。
实施例M19
N6-(N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}-β-丙氨酰基)-L-赖氨酸/三氟乙酸(1∶1)
首先，使用肽化学中已知的经典保护基团操作来制备三氟乙酸/N2-[(苄氧基)羰基]-L-赖氨酸2-(三甲基硅烷基)乙基酯(1∶1)。然后在HATU的存在下，将该中间体与中间体C61偶联。随后，首先使用氯化锌裂解2-(三甲基硅烷基)乙氧基羰基保护基团和2-(三甲基硅烷基)乙基酯。最后，通过氢化裂解苄氧基羰基保护基团并通过制备型HPLC纯化获得标题化合物。
HPLC(方法11)：Rt＝1.65min；
实施例M20
(1R，4R，27R，33R)-1-氨基-32-(3-氨基丙基)-33-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-34，34-二甲基-6，9，25，31-四氧代-13，16，19，22-四氧杂-3，29-二硫杂-7，10，26，32-四氮杂三十五烷-1，4，27-三甲酸/三氟乙酸(1∶2)
首先，将L-半胱氨酸甲酯盐酸盐(1∶1)与1-({[2-(三甲基硅烷基)乙氧基]羰基}氧基)吡咯烷-2，5-二酮在DMF中在N，N-二异丙基乙胺的存在下转化为N-{[2-(三甲基硅烷基)乙氧基]羰基}-L-半胱氨酸甲酯。
将408mg(1.93mmol)市售的3-溴-4-甲氧基-4-氧代丁酸和180mg(0.644mmol)N-{[2-(三甲基硅烷基)乙氧基]羰基}-L-半胱氨酸甲酯溶解于8ml DMF中，并加入147mg(0.97mmol)1，8-二氮杂二环[5.4.0]十一碳-7-烯。在RT下搅拌18h后，再加入136mg(0.64mmol)3-溴-4-甲氧基-4-氧代丁酸和147mg(0.97mmol)1，8-二氮杂二环[5.4.0]十一碳-7-烯，并将混合物在RT下再搅拌12h，然后在减压下浓缩。将残余物通过制备型HPLC纯化。将适当的流份合并并将溶剂在减压下蒸发得到151mg(理论值的57％)4-甲氧基-3-{[(2R)-3-甲氧基-3-氧代-2-({[2-(三甲基硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)丙基]硫烷基}-4-氧代丁酸。
LC-MS(方法12)：Rt＝1.74min；MS(ESIneg)：m/z＝408(M-H)-。
将3.66mg(8.93μmol)4-甲氧基-3-{[(2R)-3-甲氧基-3-氧代-2-({[2-(三甲基硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)丙基]硫烷基}-4-氧代丁酸在3.66mg(8.93μmol)HATU和1.6μl(15μmol)4-甲基吗啉的存在下与13.0mg(7.44μmol)S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}-2，2-二甲基-6，12-二氧代-5-氧杂-7，11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-N-[15-(甘氨酰基氨基)-4，7，10，13-四氧杂十五烷-1-酰基]-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1∶1)(中间体C80)偶联，HPLC纯化后，得到3.9mg(理论值的37％)完全受保护的中间体S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}-2，2-二甲基-6，12-二氧代-5-氧杂-7，11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-N-[15-({N-[(8R，11R)-8，11-双(甲氧基羰基)-2，2-二甲基-6，13-二氧代-5-氧杂-10-硫杂-7-氮杂-2-硅杂十三烷-13-基]甘氨酰基}氨基)-4，7，10，13-四氧杂十五烷-1-酰基]-L-半胱氨酸。
然后将3.90mg(2.76μmol)该中间体在RT下与35μl 2摩尔氢氧化锂溶液在1.0mlTHF/水3∶1中搅拌15min，使得两个甲基酯基团裂解。通过HPLC纯化得到3.60mg(理论值的94％)二羧酸衍生物。
LC-MS(方法5)：Rt＝4.83min；MS(ESIpos)：m/z＝1385[M+H]+。
最后，将3.6mg(2.6μmol)该中间体用氯化锌在三氟乙醇中完全脱保护，如上所述。将残余物通过制备型HPLC纯化。将适当的流份浓缩，并将残余物从乙腈/水中冻干得到1.92mg(理论值的55％)标题化合物。
LC-MS(方法5)：Rt＝2.72min；MS(ESIneg)：m/z＝1094[M-H]-。
实施例M21
(2R，24S，27R)-27-氨基-2-[({2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}硫烷基)甲基]-24-(羧基甲基)-4，20，23-三氧代-7，10，13，16-四氧杂-25-硫杂-3，19，22-三氮杂二十八烷-1，28-二酸/三氟乙酸(1∶2)
将742.8mg(3.3mmol)市售的2-溴-4-乙氧基-4-氧代丁酸和802mg(2.87mmol)N-{[2-(三甲基硅烷基)乙氧基]羰基}-L-半胱氨酸甲酯溶解于32ml DMF中，加入655.4mg(4.31mmol)1，8-二氮杂二环[5.4.0]十一碳-7-烯。在RT下搅拌20h后，将反应物在减压下浓缩，并将残余物通过制备型HPLC纯化。将适当的流份合并，并将溶剂在减压下蒸发得到521mg(理论值的43％)4-乙氧基-2-{[(2R)-3-甲氧基-3-氧代-2-({[2-(三甲基硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)丙基]硫烷基}-4-氧代丁酸。
LC-MS(方法5)：Rt＝3.13min；MS(ESIpos)：m/z＝424(M+H)+。
将4.36mg(10.3μmol)4-乙氧基-2-{[(2R)-3-甲氧基-3-氧代-2-({[2-(三甲基硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)丙基]硫烷基}-4-氧代丁酸在3.92mg(10.3μmol)HATU和1.9μl(17μmol)4-甲基吗啉的存在下与15.0mg(8.59μmol)S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}-2，2-二甲基-6，12-二氧代-5-氧杂-7，11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-N-[15-(甘氨酰基氨基)-4，7，10，13-四氧杂十五烷-1-酰基]-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1∶1)(中间体C80)偶联，HPLC纯化后，得到3.6mg(理论值的26％)完全受保护的中间体S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}-2，2-二甲基-6，12-二氧代-5-氧杂-7，11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-N-[15-({N-[(8R，11S)-11-(2-乙氧基-2-氧代乙基)-8-(甲氧基羰基)-2，2-二甲基-6，12-二氧代-5-氧杂-10-硫杂-7-氮杂-2-硅杂十二烷-12-基]甘氨酰基}氨基)-4，7，10，13-四氧杂十五烷-1-酰基]-L-半胱氨酸。
然后将6.20mg(2.82μmol)该中间体在RT下与35μl 2摩尔氢氧化锂溶液在1.0mlTHF/水1∶1中搅拌15min，使得两个酯基团裂解。酸化并通过HPLC纯化后得到3.60mg(理论值的92％)二羧酸衍生物。
LC-MS(方法5)：Rt＝4.71min；MS(ESIpos)：m/z＝1385[M+H]+。
最后，将3.60mg(1.69μmol)该中间体用氯化锌在三氟乙醇中完全脱保护，如上所述。将残余物通过制备型HPLC纯化。将适当的流份浓缩并将残余物从乙腈/水中冻干得到0.88mg(理论值的39％)标题化合物。
LC-MS(方法5)：Rt＝2.72min；MS(ESIneg)：m/z＝1094[M-H]-。
实施例M22
(2R，27R)-27-氨基-2-[({2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}硫烷基)甲基]-24-(羧基甲基)-4，20，23-三氧代-7，10，13，16-四氧杂-25-硫杂-3，19，22-三氮杂二十八烷-1，28-二酸/三氟乙酸(1∶2)
和
(1R，27R，33R)-1-氨基-32-(3-氨基丙基)-33-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-34，34-二甲基-6，9，25，31-四氧代-13，16，19，22-四氧杂-3，29-二硫杂-7，10，26，32-四氮杂三十五烷-1，4，27-三甲酸/三氟乙酸(1∶2)
将16.5mg(0.015mmol)S-{2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}-N-[1-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-2，18-二氧代-6，9，12，15-四氧杂-3-氮杂十八烷-18-基]-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1∶1)(中间体F257)和8.18mg(0.031mmol)N-{[2-(三甲基硅烷基)乙氧基]羰基}-L-半胱氨酸溶解于2ml DMF中，并将混合物在RT下搅拌18h。将反应混合物在减压下浓缩。将残余物(28.9mg)溶解于3ml THF/水1∶1中。加入0.046ml 2M氢氧化锂水溶液，并将混合物在RT下搅拌3小时。然后使用5.2μl(0.092mmol)乙酸将混合物调节至pH～7。将反应混合物通过制备型RP-HPLC直接纯化(柱：Reprosil 125×30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水；0.1％TFA)。将溶剂在减压下蒸发，并将残余物在高真空下干燥。得到12.1mg(58％，经2个步骤)区域异构的受保护的中间体。
LC-MS(方法12)：Rt＝1.82min；MS(ESIpos)：m/z＝1240(M+H)+。
在最后的步骤中，将12.1mg(0.009mmol)该中间体溶解于2ml 2，2，2-三氟乙醇中。加入7.3mg(0.054mmol)氯化锌，并将混合物在50℃下搅拌2h。然后加入15.7mg(0.054mmol)乙二胺-N，N，N′，N′-四乙酸，并将溶剂通过制备型HPLC纯化。将适当的流份浓缩，并将残余物从乙腈/水中冻干得到6.4mg(59％)标题化合物，其为区域异构体混合物。
LC-MS(方法1)：Rt＝0.86min；MS(ESIpos)：m/z＝1096(M+H)+。
实施例M23
N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}-β-丙氨酰基-L-谷氨酸/三氟乙酸(1∶1)
首先，将L-谷氨酸二叔丁酯盐酸盐(1∶1)与中间体C61在HATU和N，N-二异丙基乙胺的存在下偶联。然后将受保护的中间体用三氟乙醇吸收，并通过在50℃下在氯化锌存在下搅拌过夜来完全脱保护。加入EDTA后，通过制备型HPLC纯化来进行后处理。
LC-MS(方法12)：Rt＝1.45min；MS(ESIpos)：m/z＝714[M+H]+。
实施例M24
N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}-β-丙氨酰基-D-谷氨酸/三氟乙酸(1∶1)
首先，将D-谷氨酸二叔丁酯盐酸盐(1∶1)与中间体C61在HATU和N，N-二异丙基乙胺的存在下偶联。将受保护的中间体用三氟乙醇吸收，并通过在50℃下在氯化锌存在下搅拌来完全脱保护。加入EDTA后通过制备型HPLC纯化来进行后处理。
LC-MS(方法12)：Rt＝1.41min；MS(ESIpos)：m/z＝714[M+H]+。
实施例M25
N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}-L-谷氨酸/三氟乙酸(1∶1)
首先，将L-谷氨酸叔丁酯盐酸盐(1∶1)与中间体C61在HATU和N，N-二异丙基乙胺的存在下偶联。在下一步骤中，在10％钯活性炭上在甲醇中在RT下在标准氢压力下氢化45分钟除去Z保护基团。然后将部分受保护的中间体用三氟乙醇吸收并通过在50℃下在氯化锌存在下搅拌7小时来完全脱保护。加入EDTA后通过制备型HPLC纯化来进行后处理。
LC-MS(方法12)：Rt＝1.44min；MS(ESIpos)：m/z＝643[M+H]+。
实施例M26
4-[(2-{[2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}氨基)乙基]氨基}-2-氧代乙基)氨基]-2-{[(2R)-2-氨基-2-羧基乙基]硫烷基}-4-氧代丁酸/三氟乙酸(1∶1)
区域异构体1，差向异构体的混合物
该实施例描述了实施例13和实施例14的化合物的差向异构体混合物。以类似于实施例13的方法进行合成，其中省去通过超临界流体色谱法分离两种差向异构体的步骤，并将标题化合物作为差向异构体的混合物来制备。
LC-MS(方法5)：Rt＝2.43min；MS(ESIpos)：m/z＝832[M+H]+。
实施例M27
4-[(2-{[2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}氨基)乙基]氨基}-2-氧代乙基)氨基]-3-{[(2R)-2-氨基-2-羧基乙基]硫烷基}-4-氧代丁酸/三氟乙酸(1∶1)
区域异构体2，差向异构体的混合物
该实施例描述了实施例15和实施例16的化合物的差向异构体混合物。以类似于实施例15的方法进行合成，其中省去通过超临界流体色谱法分离两种差向异构体的步骤，并将标题化合物作为差向异构体的混合物来制备。
LC-MS(方法5)：Rt＝2.45min；MS(EIpos)：m/z＝832[M+H]+。
工作实施例ADC
取决于接头和偶联方法，在工作实施例的结构式中所示的ADC——其经马来酰亚胺基团偶联至抗体的半胱氨酸侧链上——主要以各自所示的开环或闭环形式存在。然而，该制备可包括小部分各自的其他形式。
实施例194n
在此，将2.5mg于PBS(c＝10mg/ml)中的抗-TWEAKR AK1A(ITEM-4)用于与中间体F194偶联。首先，加入4当量于25μl DMSO中的中间体F194，在RT下搅拌1h后，再加入相同量，并将反应物在RT下再搅拌一小时。随后将反应物在Sephadex柱上纯化，然后通过超速离心来浓缩并用PBS再稀释。
蛋白质浓度：1.22mg/ml
药物/mAb比例：2.8
实施例208n
在氩气下，将0.029mg TCEP于50μl PBS缓冲液中的溶液加入于0.450ml PBS(c＝11.1mg/ml)中的5mg抗-TWEAKR AK1A(ITEM-4)中。将反应物在RT下搅拌30min，然后加入溶解于50μl DMSO中的0.19mg(0.00023mmol)中间体F104。在RT下再搅拌90min后，将反应物用pH8的PBS缓冲液制成2.5ml并加载于已经用pH 8的PBS缓冲液平衡的PD 10柱(G-25，GE Healthcare)上，用pH 8的PBS缓冲液洗脱，然后在氩气下在RT下搅拌过夜。然后将洗脱液通过超速离心来浓缩并用PBS缓冲液再稀释(pH 7.2)。获得的ADC批次的表征如下：
蛋白质浓度：1.78mg/ml
药物/mAb比例：1.7
在氩气下，将0.287mg TCEP于0.5ml PBS缓冲液中的溶液加入于5ml PBS(c＝10mg/ml)中的50mg抗-TWEAKR AK1A(ITEM-4)中。将反应物在RT下搅拌30min，然后加入溶解于500μl DMSO中的2.15mg(0.00267mmol)中间体F104。在RT下再搅拌90min后，将反应物用4ml已被提前调节至pH 8的PBS缓冲液稀释，并在氩气下在RT下搅拌过夜。
然后使用PD-10柱用PBS缓冲液将溶液再缓冲至pH 7.2。然后将洗脱液通过超速离心来浓缩，用PBS缓冲液(pH 7.2)再稀释，并再浓缩。获得的ADC批次的表征如下：
蛋白质浓度：16.2mg/ml
药物/mAb比例：1.4
实施例208o
在氩气下，将0.4mg TCEP于0.6ml PBS缓冲液中的溶液加入于7.4ml PBS(c＝9.5mg/ml)中的70mg抗-TWEAKR AK1C(TPP-7006)中。将混合物在RT下搅拌30min，然后加入溶解于800μl DMSO中的2.64mg(0.00327mmol)中间体F104。在RT下再搅拌90min后，将混合物用1.2ml已被提前调节至pH 8的PBS缓冲液稀释，然后使用PD-10柱再缓冲至pH8。将合并的洗脱液用PBS缓冲液(pH 8)稀释至总体积为15ml，然后在氩气下在RT下搅拌过夜。
然后使用PD-10柱用PBS缓冲液将混合物再缓冲至pH 7.2。然后将洗脱液通过超速离心来浓缩，用PBS缓冲液(pH 7.2)再稀释，并再浓缩。获得的ADC批次的表征如下：
蛋白质浓度：12.2mg/ml
药物/mAb比例：2.7
对于该ADC制剂，开环琥珀酰胺形式的比例被确定为84.1％。
实施例208p
在氩气下，将0.4mg TCEP于0.6ml PBS缓冲液中的溶液加入于7.4ml PBS(c＝9.5mg/ml)中的70mg抗-TWEAKR AK1B(TPP-7005)中。将混合物在RT下搅拌30min，然后加入溶解于800μl DMSO中的2.64mg(0.00327mmol)中间体F104。在RT下再搅拌90min后，将混合物用1.2ml已被提前调节至pH 8的PBS缓冲液稀释，然后使用PD-10柱再缓冲至pH8。将合并的洗脱液用PBS缓冲液(pH 8)稀释至总体积为15ml，然后在氩气下在RT下搅拌过夜。
然后使用PD-10柱用PBS缓冲液将混合物再缓冲至pH 7.2。然后将洗脱液通过超速离心来浓缩，用PBS缓冲液(pH 7.2)再稀释，并再浓缩。获得的ADC批次的表征如下：
蛋白质浓度：10.99mg/ml
药物/mAb比例：2.4
对于该ADC制剂，开环琥珀酰胺形式的比例被确定为84.4％。
实施例208q
在氩气下，将0.4mg TCEP于0.6ml PBS缓冲液中的溶液加入于7.4ml PBS(c＝9.5mg/ml)中的70mg抗-TWEAKR AK1D(TPP-7007)中。将混合物在RT下搅拌30min，然后加入溶解于800μl DMSO中的2.64mg(0.00327mmol)中间体F104。在RT下再搅拌90min后，将混合物用1.2ml已被提前调节至pH 8的PBS缓冲液稀释，然后使用PD-10柱再缓冲至pH8。将合并的洗脱液用PBS缓冲液(pH 8)稀释至总体积为15ml，然后在氩气下在RT下搅拌过夜。
然后使用PD-10柱用PBS缓冲液将混合物再缓冲至pH 7.2。然后将洗脱液通过超速离心来浓缩，用PBS缓冲液(pH 7.2)再稀释，并再浓缩。获得的ADC批次的表征如下：
蛋白质浓度：12.01mg/ml
药物/mAb比例：2.8
对于该ADC制剂，开环琥珀酰胺形式的比例被确定为85.2％。
实施例240o
在此，将于450μl PBS中的5mg抗-TWEAKR AK1C(TPP-7006)用于与中间体F240在pH7.2(c＝11.1mg/ml)下偶联。在0.029mg TCEP的存在下，抗体的还原时间为30min。然后加入于50μl DMSO中的0.20mg(0.23μmol)F240，并将混合物在RT下再搅拌90min。然后使用PBS缓冲液(pH 8)将混合物制成2.5ml并加载于用PH 8的PBS缓冲液平衡的PD10柱(G-25，GE Healthcare)上，用PH 8的PBS缓冲液洗脱，然后在氩气下在RT下搅拌过夜。随后将洗脱液通过超速离心来浓缩，并用PBS缓冲液(pH 7.2)再稀释。获得的ADC批次的表征如下：
蛋白质浓度：1.55mg/ml
药物/mAb比例：3.8
实施例257n
在氩气下，将0.029mg TCEP于50μl PBS缓冲液中的溶液加入于319μl PBS(c＝15.7mg/ml)中的5mg抗-TWEAKR AK1A(ITEM-4)中。将反应物用2031μl已被提前调节为pH 8的PBS缓冲液稀释并在RT下搅拌1h。然后加入溶解于100μl DMSO中的0.250mg(0.00023mmol)中间体F257。在RT下再搅拌90min后，将反应物加载于已用PH 8的PBS缓冲液平衡的PD 10柱(G-25，GE Healthcare)上，并用PH 8的PBS缓冲液洗脱。将洗脱液在氩气下在RT下搅拌过夜，然后通过超速离心来浓缩，并用PBS缓冲液(pH 7.2)再稀释。在这些条件下，一些ADC也可能以闭环形式存在。获得的ADC批次的表征如下：
蛋白质浓度：1.44mg/ml
药物/mAb比例：1.0
实施例257p
在此，于450μl PBS中的5mg抗-TWEAKR AK1B(TPP-7005)用于在pH 7.2(c＝11.1mg/ml)下与中间体F257偶联。在0.029mg TCEP的存在下，抗体的还原时间是30min。然后加入于50μl DMSO中的0.20mg(0.23μmol)F257，并将混合物在RT下再搅拌90min。然后使用PBS缓冲液(pH 8)将混合物制成2.5ml，并加载于用PH 8的PBS缓冲液平衡的PD10柱(G-25，GE Healthcare)上，用PH 8的PBS缓冲液洗脱，然后在氩气下在RT下搅拌过夜。随后将洗脱液通过超速离心来浓缩，并用PBS缓冲液(pH 7.2)再稀释。获得的ADC批次的表征如下：
蛋白质浓度：1.67mg/ml
药物/mAb比例：4.7
实施例260n
在氩气下，将0.014mg TCEP于25μl PBS缓冲液中的溶液加入于250μl PBS(c＝10mg/ml)中的2.5mg抗-TWEAKR AK1A(ITEM-4)中。将反应物在RT下搅拌30min，然后加入溶解于25μl DMSO中的0.151mg(0.00013mmol)中间体F260。在RT下再搅拌90min后，将反应物用2200μl已被提前调节为pH 8的PBS缓冲液稀释。
然后将该溶液加载于已用PH 8的PBS缓冲液平衡的PD 10柱(G-25，GEHealthcare)上。将洗脱液在氩气下在RT下搅拌过夜，然后通过超速离心来浓缩，并用PBS缓冲液(pH 7.2)再稀释。在这些条件下，一些ADC也可能以闭环形式存在。获得的ADC批次的表征如下：
蛋白质浓度：1.49mg/ml
药物/mAb比例：2.2
实施例274n
在氩气下，将0.014mg TCEP于25μl PBS缓冲液中的溶液加入于208μl PBS(c＝12.0mg/ml)中的2.5mg抗-TWEAKR AK1A(ITEM-4)中。将反应物用967μl已被提前调节为pH 8的PBS缓冲液稀释，并在RT下搅拌1h。然后加入溶解于50μl DMSO中的0.116mg(0.00012mmol)中间体F274。在RT下再搅拌90min后，将反应物加载于已用PH 8的PBS缓冲液平衡的PD 10柱(G-25，GE Healthcare)上，并用PH 8的PBS缓冲液洗脱。将洗脱液在氩气下在RT下搅拌过夜，然后通过超速离心来浓缩，并用PBS缓冲液(pH 7.2)再稀释。在这些条件下，一些ADC也可能以闭环形式存在。获得的ADC批次的表征如下：
蛋白质浓度：1.31mg/ml
药物/mAb比例：1.5
实施例275n
在氩气下，将0.014mg TCEP于25μl PBS缓冲液中的溶液加入于208μl PBS(c＝12.0mg/ml)中的2.5mg抗-TWEAKR AK1A(ITEM-4)中。将反应物用967μl已被提前调节为pH 8的PBS缓冲液稀释，并在RT下搅拌1h。然后加入溶解于50μl DMSO中的0.116mg(0.00012mmol)中间体F275。在RT下再搅拌90min后，将反应物加载于已用PH 8的PBS缓冲液平衡的PD 10柱(G-25，GE Healthcare)上，并用PH 8的PBS缓冲液洗脱。将洗脱液在氩气下在RT下搅拌过夜，然后通过超速离心来浓缩，并用PBS缓冲液(pH 7.2)再稀释。在这些条件下，一些ADC也可能以闭环形式存在。获得的ADC批次的表征如下：
蛋白质浓度：1.29mg/ml
药物/mAb比例：1.8
实施例281n
在此，将于208μl PBS中的2.5mg抗-TWEAKR AK1A(ITEM-4)在pH 7.2(c＝12mg/ml)下用于与中间体F281偶联。在0.014mg TCEP的存在下，抗体的还原时间是30min。加入于25μl DMSO中的0.11mg(0.12μmol)F281后，然后将反应物在RT下搅拌20h，随后在Sephadex上纯化。最后将洗脱液通过超速离心来浓缩并用PBS再稀释。
蛋白质浓度：0.59mg/ml
药物/mAb比例：1.3
实施例281p
在此，将于500μl PBS中的5mg抗-TWEAKR AK1B(TPP-7005)在pH 7.2(c＝10mg/ml)下用于与中间体F281偶联。在0.029mg TCEP的存在下，抗体的还原时间是30min。加入于50μl DMSO中的0.25mg(0.27μmol)F281后，然后将混合物在RT下搅拌20h，随后在Sephadex上纯化。最后，将混合物通过超速离心来浓缩并用PBS再稀释。
蛋白质浓度：1.9mg/ml
药物/mAb比例：3.4
实施例281q
在此，将于500μl PBS中的5mg抗-TWEAKR AK1D(TPP-7007)在pH 7.2(c＝10mg/ml)下用于与中间体F281偶联。在0.029mg TCEP的存在下，抗体的还原时间是30min。加入于50μl DMSO中的0.25mg(0.27μmol)F281后，然后将混合物在RT下搅拌20h，随后在Sephadex上纯化。最后，将反应物通过超速离心来浓缩并用PBS再稀释。
蛋白质浓度：2.55mg/ml
药物/mAb比例：2.8
实施例284n
在氩气下，将0.029mg TCEP于50μl PBS缓冲液中的溶液加入于417μl PBS(c＝12mg/ml)中的5mg抗-TWEAKR AK1A(ITEM-4)中，并将混合物在RT下搅拌45min。然后加入溶解于50μl DMSO中的0.29mg(0.7μmol)中间体F284。在RT下再搅拌90min后，将混合物用PH8的PBS缓冲液制成2.5ml并使其穿过已用PH 8的PBS缓冲液平衡的PD 10柱(G-25，GE Healthcare)，用PH 8的PBS缓冲液洗脱，然后在氩气下在RT下搅拌过夜。然后将洗脱液通过超速离心来浓缩，并用PBS缓冲液(pH 7.2)再稀释。获得的ADC批次的表征如下：
蛋白质浓度：1.81mg/ml
药物/mAb比例：2.0
实施例284o
在此，将于400μl PBS中的5mg抗-TWEAKR AK1C(TPP-7006)用于在pH 7.2(c＝12.5mg/ml)下与中间体F284偶联。在0.029mg TCEP的存在下，抗体的还原时间是30min。然后加入于50μl DMSO中的0.26mg(0.23μmol)F284，并将反应物在RT下再搅拌90min。然后将混合物用PBS缓冲液(pH 8)制成2.5ml，并加载于已用PH 8的PBS缓冲液平衡的PD-10柱(G-25，GE Healthcare)上，并用PH 8的PBS缓冲液洗脱，然后在氩气下在RT下搅拌过夜。然后将洗脱液通过超速离心来浓缩，并用PBS缓冲液(pH 7.2)再稀释。获得的ADC批次的表征如下：
蛋白质浓度：1.88mg/ml
药物/mAb比例：3.1
实施例284p
在此，将于450μl PBS中的5mg抗-TWEAKR AK1B(TPP-7005)在pH 7.2(c＝11.1mg/ml)下用于与中间体F284偶联。在0.029mg TCEP的存在下，抗体的还原时间是30min。然后加入于50μl DMSO中的0.26mg(0.23μmol)F284，并将混合物在RT下再搅拌90min。然后将混合物用PBS缓冲液(pH 8)制成2.5ml，并加载于用PH 8的PBS缓冲液平衡的PD-10柱(G-25，GE Healthcare)上，并用PH 8的PBS缓冲液洗脱，然后在氩气下在RT下搅拌过夜。然后将洗脱液通过超速离心来浓缩，并用PBS缓冲液(pH 7.2)再稀释。获得的ADC批次的表征如下：
蛋白质浓度：2.11mg/ml
药物/mAb比例：2.5
实施例294n
在此，将于PBS(c＝10mg/ml)中的2.5mg抗-TWEAKR AK1A(ITEM-4)用于与中间体F294偶联。首先，加入溶解于25μl DMSO中的4当量中间体F294，在RT下搅拌1h后，再加入相同的量，并将反应物在RT下再搅拌1h。随后将反应物用PBS缓冲液(pH 7.2)稀释至2.5ml，在Sephadex柱上纯化，然后通过超速离心来浓缩，并用PBS再稀释。
蛋白质浓度：1.52mg/ml
药物/mAb比例：4.0
实施例296n
在氩气下，将0.014mg TCEP于25μl PBS缓冲液中的溶液加入于250μl PBS(c＝10mg/ml)中的2.5mg抗-TWEAKR AK1A(ITEM-4)中，并将混合物在RT下搅拌30min。然后加入溶解于25μl DMSO中的0.105mg(0.12μmol)中间体F296。在RT下再搅拌90min后，将混合物用PH8的PBS缓冲液制成2.5ml并使其穿过用PH 8的PBS缓冲液平衡的PD 10柱(G-25，GE Healthcare)，用PH 8的PBS缓冲液洗脱，然后在氩气下在RT下搅拌过夜。然后将洗脱液通过超速离心来浓缩，并用PBS缓冲液(pH 7.2)再稀释。获得的ADC批次的表征如下：
蛋白质浓度：0.74mg/ml
药物/mAb比例：1.4
实施例296o
在此，将于500μl PBS中的5mg抗-TWEAKR AK1C(TPP-7006)在pH 7.2(c＝10mg/ml)下用于与中间体F296偶联。在0.029mg TCEP的存在下，抗体的还原时间是30min。然后加入于50μl DMSO中的0.21mg(0.23μmol)F296，并将混合物在RT下再搅拌90min。然后将混合物用PBS缓冲液(pH 8)制成2.5ml，并加载于用PH 8的PBS缓冲液平衡的PD-10柱(G-25，GE Healthcare)上，用PH 8的PBS缓冲液洗脱，然后在氩气下在RT下搅拌过夜。然后将洗脱液通过超速离心来浓缩，并用PBS缓冲液(pH 7.2)再稀释。获得的ADC批次的表征如下：
蛋白质浓度：1.74mg/ml
药物/mAb比例：3.0
实施例296p
在此，将于500μl PBS中的5mg抗-TWEAKR AK1B(TPP-7005)在pH 7.2(c＝10mg/ml)下用于与中间体F296偶联。在0.029mg TCEP的存在下，抗体的还原时间是30min。然后加入于50μl DMSO中的0.21mg(0.23μmol)F296，并将混合物在RT下再搅拌90min。然后将混合物用PBS缓冲液(pH 8)制成2.5ml并加载于用PH 8的PBS缓冲液平衡的PD-10柱(G-25，GE Healthcare)上，用PH 8的PBS缓冲液洗脱，然后在氩气下在RT下搅拌过夜。然后将洗脱液通过超速离心来浓缩，并用PBS缓冲液(pH 7.2)再稀释。获得的ADC批次的表征如下：
蛋白质浓度：1.92mg/ml
药物/mAb比例：2.6
实施例297n
在此，将于500μl PBS中的2.5mg抗-TWEAKR AK1A(ITEM-4)在pH 7.2(c＝12.0mg/ml)下用于与中间体F297偶联。在0.014mg TCEP的存在下，抗体的还原时间是30min。加入于25μl DMSO中的0.12mg(0.13μmol)F297后，然后将反应物在RT下搅拌90分钟，随后在Sephadex上纯化。最后将洗脱液通过超速离心来浓缩并用PBS再稀释。
蛋白质浓度：0.79mg/ml
药物/mAb比例：1.6
实施例322q
在此，将于450μl PBS中的5mg抗-TWEAKR AK1D(TPP-7007)在pH 7.2(c＝11.1mg/ml)下用于与中间体F322偶联。在0.029mg TCEP的存在下，抗体的还原时间是30min。加入于50μl DMSO中的0.262mg(0.23μmol)F322后，然后将混合物在RT下搅拌90min，随后在Sephadex上纯化。然后将通过超速离心来浓缩，并用PBS再稀释。
蛋白质浓度：2.14mg/ml
药物/mAb比例：4.2
实施例325p
在氩气下，将0.029mg TCEP于50μl PBS缓冲液中的溶液加入于0.450ml PBS(c＝11.1mg/ml)中的5mg抗-TWEAKR AK1B(TPP-7005)中。将混合物在RT下搅拌30min，然后加入溶解于50μl DMSO中的0.22mg(0.00023mmol)中间体F325。在RT下再搅拌90min后，将混合物用pH 8的PBS缓冲液制成2.5ml并加载于用pH 8的PBS缓冲液平衡的PD-10柱(G-25，GE Healthcare)上，用pH 8的PBS缓冲液洗脱，然后在氩气下在RT下搅拌过夜。然后将洗脱液通过超速离心来浓缩，并用PBS缓冲液(pH 7.2)再稀释。获得的ADC批次的表征如下：
蛋白质浓度：2.09mg/ml
药物/mAb比例：3.3
实施例326p
在氩气下，将0.029mg TCEP于50μl PBS缓冲液中的溶液加入于0.450ml PBS(c＝11.1mg/ml)中的5mg抗-TWEAKR AK1B(TPP-7005)中。将混合物在RT下搅拌30min，然后加入溶解于50μl DMSO中的0.22mg(0.00023mmol)中间体F326。然后将混合物在氩气下在RT下搅拌过夜，用PBS缓冲液(pH 7.2)制成2.5ml并使其穿过用pH 7.2的PBS缓冲液平衡的PD-10柱(G-25，GE Healthcare)。然后将洗脱液通过超速离心来浓缩，并用PBS缓冲液(pH 7.2)再稀释。获得的ADC批次的表征如下：
蛋白质浓度：1.88mg/ml
药物/mAb比例：4.4
C：生物学效力的评估
可以在下述试验中显示本发明的化合物的生物学活性：
a.C-1a针对TWEAKR的ADC的细胞毒性作用的测定
用多种细胞系进行ITEM-4ADC的细胞毒性作用的分析：
NCI-H292：人粘液表皮样肺癌细胞，ATCC-CRL-1848，标准培养基：RPMI 1640(Biochrom；#FG1215，稳定化的(stab.)谷氨酰胺)+10％FCS(Sigma；#F2442)，TWEAKR-阳性，EGFR-阳性。LoVo人结直肠癌细胞，ATCC编号CCL-229，用于MTT检测的培养：标准培养基：Kaighn′s+L-谷氨酰胺(Invitrogen 21127)+10％热灭活的FCS(来自Gibco，编号10500-064)。用于CTG检测的培养：RPMI 1640(Biochrom；#FG1215，稳定化的谷氨酰胺)+10％FCS(Sigma#F2442)。TWEAKR-阳性。
BxPC3：人胰腺癌细胞，ATCC-CRL-1687，标准培养基：RPMI 1640(Biochrom；#FG1215，稳定化的谷氨酰胺)+10％FCS(Sigma#F2442)，TWEAKR-阳性。
KPL4：人乳腺癌细胞系，Bayer Pharma AG(于19.7.2012在DSMZ检查特性并确认)，标准培养基：RPMI 1640(来自Gibco；#21875-059，稳定化的L-谷氨酰胺)+10％热灭活的FCS(来自Gibco，编号10500-064)；HER2-阳性。
A498：人肾癌细胞，ATCC编号HTB-44，标准培养基：MEM与Earle盐+Glutamax I(Invitrogen 41090)+10％热灭活的FCS(来自Gibco，编号10500-064)，TWEAKR-阳性。
786-O：人肾癌细胞，ATCC编号CRL-1932，标准培养基：RPMI 1640+Glutamax I(Invitrogen 61870)+10％热灭活的FCS(来自Gibco，编号10500-064)，TWEAKR-阳性。
SK-HEP-1：人肝癌细胞系，ATCC编号HTB-52，标准培养基MEM与Earle盐+GlutamaxI(Invitrogen 41090)+10％热灭活的FCS(来自Gibco，编号10500-064)；TWEAKR-阳性。
细胞通过如American Tissue Culture Collection(ATCC)对所述细胞系所示的标准方法进行培养。
MTT测定法
根据标准方法使用C-1中所列的生长培养基培养细胞。通过采用Accutase于PBS中的溶液(Biochrom AG#L2143)将细胞分离、沉淀、再悬浮于培养基中、计数并接种到白底96孔培养板(Costar#3610)中(在100μl的总体积中，NCI H292：2500个细胞/孔；KPL-4：1200个细胞/孔；SK-HEP-1：1500个细胞/孔)进行试验。然后将细胞在培养器中在37℃和5％二氧化碳下培养。48小时后更换培养基。然后将在10μl培养基中浓度为10-5M至10-13M的代谢物用移液管转移至细胞中(平行三份)，随后将试验物在培养箱中在37℃和5％二氧化碳下培养。96小时后，使用MTT测定法(ATCC，Manassas，Virginia，USA，目录号30-1010K)检测细胞增殖。为此，将MTT试剂用细胞培养4h，然后通过加入洗涤剂使细胞溶胞过夜。在570nm(InfiniteM1000pro，Tecan)下检测所形成的染料。利用所测量的数据使用DRC(剂量响应曲线)计算出生长抑制的IC50。未用试验物质处理但原本应同样处理的细胞的增殖被定义为100％数值。
CTG测定法
根据标准方法使用C-1中所列的生长培养基培养细胞。通过采用胰蛋白酶(0.05％)和EDTA(0.02％)于PBS中的溶液(BiochromAG#L2143)将细胞分离、沉淀、再悬浮于培养基中、计数并接种到白底96孔培养板(Costar#3610)中(75μl/孔，每孔为下列细胞数：NCI-H292：2500个细胞/孔，BxPC3：2500个细胞/孔)，并在培养箱中在37℃和5％二氧化碳下培养来进行该试验。在24小时后，将于25μl培养基中的抗体药物缀合物(四倍浓缩的)加入细胞中以使得细胞上的抗体药物缀合物的最终浓度达到3×10-7M至3×10-11M(平行三份)。然后将细胞在培养箱中在37℃和5％二氧化碳下培养。在平行板中，使用Cell Titer Glow(CTG)发光细胞活力测定法(Promega#G7573和#G7571)测定药物处理开始时(第0天)的细胞活力。为此，将100μl底物加入各细胞批次中，然后将该板用铝箔覆盖，在板振荡仪上以180rpm振荡2分钟，使其在实验工作台上静置8分钟，然后使用光度计(Victor X2，PerkinElmer)测量。该底物检测产生发光信号的活细胞的ATP含量，该发光信号的强度与细胞的活力直接成正比。在采用抗体药物缀合物培养72h后，也使用如上所述的Cell Titer Glow发光细胞活力测定法测定这些细胞的活力。从所测得的数据，使用DRC(剂量响应曲线)分析电子表格经4参数拟合而计算出与第0天相比的生长抑制的IC50。该DRC分析电子表格是BayerPharma AG和Bayer Business Services在IDBS E-WorkBook Suite平台上开发的Biobook电子表格(IDBS：ID Business Solutions Ltd.，Guildford，UK)。
下表1a和1b列出了抗-TWEAKR抗体的代表性工作实施例的IC50值：
表1a
表1b
所报道的活性数据涉及本实验部分中所述的工作实施例，示出了药物/mAb比例。对于不同的药物/mAb比例而言，这些数值可能会偏离。IC50值是几个独立实验的平均值或独立值。该TWEAKR抗体药物缀合物的作用对包含各自的接头和毒簇的各自同种型对照物是选择性的。
C-1b通过所选的实施例测定纺锤体驱动蛋白KSP/Eg5的抑制
将人纺锤体驱动蛋白KSP/Eg5(tebu-bio/Cytoskeleton Inc，编号027EG01-XL)的马达结构域在RT下在15mM PIPES，pH 6.8(5mM MgCl2和10mM DTT，Sigma)中用50μg/ml紫杉醇(Sigma No.T7191-5MG)稳定的微管蛋白(牛或猪，tebu-bio/CytoskeletonInc)以10nM的浓度培养5min。将新鲜制备的混合物等分到384MTP中(粒化)。然后加入1.0×10-6M至1.0×10-13M浓度的待检测的抑制剂和ATP(最终浓度500μM，Sigma)。在RT下培养2h。通过检测使用孔雀绿(Biomol)形成的无机磷酸盐来检测ATP酶活性。加入该试剂后，将试验物在RT下培养50min，然后在620nm的波长下检测吸收。所用的阳性对照为monastrol(Sigma，M8515-1mg)和ispinesib(AdooQ Bioscience A10486)。剂量-活性曲线的各数据是八重测定。IC50值是两个独立实验的平均值。100％对照是未用抑制剂处理的样品。
下表2列出了来自所述测定法的代表性工作实施例的IC50值和相应的细胞毒性数据(MTT测定法)：
表2
所报道的活性数据涉及本实验部分中所述的工作实施例。
C-2内化测定法
内化是能够经由抗体药物缀合物(ADC)在表达抗原的癌细胞中特异性且有效地提供细胞毒性有效荷载的关键过程。该过程经由特异性抗-TWEAKR抗体的荧光标记和同种型对照抗体来监测。首先，将荧光染料缀合到抗体的赖氨酸上。使用过量两倍摩尔的CypHer5E单NHS酯(Batch 357392，GE Healthcare)在pH8.3下进行缀合。偶联后，将反应混合物通过凝胶色谱法(Zeba Spin脱盐柱，40K，Thermo Scientific，编号87768；洗脱缓冲液：DULBECCO′S PBS，Sigma-Aldrich，编号D8537)纯化以除去过量染料并调节pH。使用VIVASPIN 500柱(Sartorius stedim biotec)浓缩蛋白质溶液。通过分光光度分析(NanoDrop)以及随后的计算(D∶P＝A染料ε蛋白质∶(A280-0.16A染料)ε染料)来测定抗体的染料荷载。
在此所检查的抗-TWEAKR抗体和同种型对照物的染料荷载处于相当的量级水平。在细胞结合测定法中，证实该缀合不会造成抗体亲和力的变化。
将该标记的抗体用于内化测定法。
在处理开始前，将细胞(2×104/孔)接种在96-MTP(厚，黑色，透明底编号4308776，购自Applied Biosystems)中的100μl培养基中。在37℃/5％CO2下培养18小时后，更换培养基并以不同浓度(10、5、2.5、1、0.1μg/ml)加入标记的抗-TWEAKR抗体。对标记的同种型对照物(阴性对照物)采用相同的处理方案。所选的培养时间是0h、0.25h、0.5h、1h、1.5h、2h、3h、6h和24h。使用InCellanalyser 1000(来自GE Healthcare)测量荧光。然后，经由参数颗粒计数/细胞和总颗粒强度/细胞的测量进行动力学评估。
在结合到TWEAKR后，检验抗-TWEAKR抗体的内化能力。为此，选择具有不同TWEAKR表达水平的人肿瘤细胞(例如NCI-H292、786-0、A498)。可在不同细胞系中观察到抗-TWEAKR抗体的靶标介导的特异性内化，而同种型对照物未显示出内化。
C-3测定细胞渗透性的体外试验
可借助使用Caco-2细胞的通量测定中的体外试验研究物质的细胞渗透性[M.D.Troutman和D.R.Thakker，Pharm.Res.20(8)，1210-1224(2003)]。为此，将细胞在24孔过滤板上培养15-16天。为了测定渗透，将各试验物质在HEPES缓冲液中加载到顶部(A)或基部(B)的细胞上并培养2小时。在0小时后和在2小时后，从顺式和反式隔室中取样。使用反相柱通过HPLC(Agilent 1200，德国)分离样品。将HPLC系统经Turbo Ion SprayInterface与三重四极杆质谱仪API 4000(AB SCIEX Deutschland GmbH，Darmstadt，德国)联用。基于使用Schwab等人[D.Schwab等人，J.Med.Chem.46，1716-1725(2003)]所公开的公式计算出的Papp值评估渗透性。当Papp(B-A)与Papp(A-B)的比率(外排率)＞2或＜0.5时，物质被归类为主动转运。
对细胞内释放的毒簇而言至关重要的是从B到A的渗透性[Papp(B-A)]以及Papp(B-A)与Papp(A-B)的比率(外排率)：该渗透性越低，则该物质穿过Caco-2细胞单层的主动和被动转运过程越慢。如果外排率没有另外显示任何主动转运，则该物质在细胞内释放后可在细胞中停留更久。因此，也有更多时间可供与生物化学靶标(在这种情况下：纺锤体驱动蛋白，KSP/Eg5)相互作用。
下表3列出了来自该测定法的代表性工作实施例的渗透性数据：
表3
C-4测定P-糖蛋白(P-gp)的底物性质的体外试验
许多肿瘤细胞表达针对药物的转运蛋白，这通常伴随着对细胞抑制剂的抗性发展。因此，不是此类转运蛋白的底物的物质(如P-糖蛋白(P-gp)或BCRP)可表现出改善的活性特性。
借助使用过表达P-gp的LLC-PK1细胞(L-MDR1细胞)的通量测定法测定物质对于P-gp(ABCB1)的底物性质[A.H.Schinkel等人，J.Clin.Invest.96，1698-1705(1995)]。为此，将LLC-PK1细胞或L-MDR1细胞在96孔过滤板上培养3-4天。为了测定渗透，将各试验物质单独或在抑制剂(例如伊维菌素或维拉帕米)存在下在HEPES缓冲液中加载到顶部(A)或基部(B)的细胞上并培养2小时。在0小时后和在2小时后，从顺式和反式隔室中取样。使用反相柱通过HPLC分离样品。将HPLC系统经Turbo Ion Spray Interface与三重四极杆质谱仪API3000(Applied Biosystems Applera，Darmstadt，德国)联用。基于使用Schwab等人[D.Schwab等人，J.Med.Chem.46，1716-1725(2003)]所公开的公式而计算出的Papp值评估渗透性。当Papp(B-A)与Papp(A-B)的外排率＞2时，物质被归类为P-gp底物。
作为用于评估P-gp底物性质的其他标准，可比较L-MDR1和LLC-PK1细胞中的外排率或在存在或不存在抑制剂的情况下的外排率。如果这些值相差大于2倍，则所述物质是P-gp底物。
C-5药代动力学
在静脉给予3-30mg/kg不同的ADC后，可借助ELISA(参见部分：抗体的定量分析)测量ADC的抗体部分的血浆和肿瘤浓度，并可计算药代动力学参数，如清除率(CL)、曲线下面积(AUC)和半衰期(t1/2)。以类似的方式，可测量血浆、肿瘤和组织中ADC的可能存在的代谢物浓度。
在雄性大鼠中，在静脉给予5mg/kg实施例208o的ADC后，能够测定ADC的以下参数：
所使用的抗体的定量分析
使用配体结合测定法(ELISA)测定ADC的抗体部分作为血浆样品和肿瘤裂解产物中的总IgG浓度。在此，使用夹心ELISA格式。这种ELISA已被确认和验证用于血浆和肿瘤样品中的测定。用抗人山羊IgG Fc抗体包覆ELISA板。用样品培养后，洗涤该板并将该板用猿抗人IgG(H+L)抗体和辣根过氧化物酶(HRP)的检测缀合物来培养。在进一步的洗涤步骤后，将HRP底物加入OPD中并通过在490nm处的吸收来监测显色。使用4参数方程拟合具有已知IgG浓度的标准样品。在下定量限(LLOQ)和上定量限(ULOQ)内，通过内插法确定未知浓度。
C5a：体外内化后的ADC代谢物的鉴定
方法的说明：
采用免疫缀合物进行内化研究以分析在细胞内形成的代谢物。为此，将人肺肿瘤细胞NCI H292(3×105/孔)接种在6孔板中并培养过夜(37℃，5％CO2)。将细胞用10μg/ml(66nM)待检验的ADC处理。在37℃和5％CO2下进行内化。在多个时间点(0、4、24、48、72h)，取细胞样品用于进一步分析。首先，收集上清液(约5ml)，并在离心(2min，RT，1000rpmHeraeus Variofuge 3.0R)后，储存在-80℃下。将细胞用PBS洗涤并用Accutase分离，并测定细胞数。再次洗涤后，将确定数量的细胞(2×105)用100ml裂解缓冲液(Mammalian CellLysis Kit(SigmaMCL1))处理，并在Protein LoBind试管(Eppendorf目录号0030 108.116)中在连续振荡(Thermomixer，15min，4℃，650rpm)下培养。培养后，将该裂解产物离心(10min，4℃，12000g，Eppendorf 5415R)并收集上清液。将所得的上清液储存在-80℃下。然后如下分析所有样品。
在采用甲醇或乙腈沉淀蛋白质后，通过与三重四极杆质谱仪(MS)联用的高压液相色谱法(HPLC)进行培养物上清液或细胞裂解产物中的化合物的测量。
对于50μl培养物上清液/细胞裂解产物的后处理，加入150μl沉淀试剂(通常为乙腈)并将混合物振荡10秒。沉淀试剂含有合适浓度(通常为20-100ng/ml)的内标物(ISTD)。在以16000g离心3分钟后，将上清液转移到自动采样瓶中，用500μl适用于该流动相的缓冲液配制并再次振荡。
然后使用与HPLC联用的三重四极杆质谱仪API6500(来自AB SCIEX DeutschlandGmbH)测量这两种基质样品。
为了校准，将0.5-2000μg/l的浓度加入到血浆样品中。检测限(LOQ)为约2μg/l。线性范围从2延伸至1000μg/l。
为了校准肿瘤样品，将0.5-200μg/l的浓度加入到未处理的肿瘤的上清液中。检测限为4μg/l。线性范围从4延伸至200μg/l。
用于测试有效性的质量对照物含有5和50μg/l。
C5b：体内ADC代谢物的鉴定
作为参比实施例(R10k)，制备含有激动性抗体TPP-2658的ADC：
参比实施例R10k
在氩气下，将0.86mg TCEP于2ml PBS缓冲液中的溶液加入于10.5ml PBS(c＝14.28mg/ml)中的150mg抗-TWEAKR抗体TPP-2658中。抗体TPP-2658及其制剂详细描述于WO2015/189143 A1中。
将该混合物在RT下搅拌30min，然后加入溶解于1250μl DMSO中的6.63mg(0.008mmol)中间体F104。在RT下再搅拌90min后，将该混合物用1250μl已被提前调节为pH8的PBS缓冲液稀释。
然后将该溶液加载于用pH 8的PBS缓冲液平衡的PD-10柱(G-25，GEHealthcare)上，并用pH 8的PBS缓冲液洗脱。将洗脱液用pH 8的PBS缓冲液稀释至总体积为22.5ml。将该溶液在氩气下在RT下搅拌过夜，然后再次使用PD-10柱再缓冲至pH 7.2。然后将混合物通过超速离心来浓缩，用PBS缓冲液(pH 7.2)再稀释，并再浓缩。获得的ADC批次的表征如下：
蛋白质浓度：14.06mg/ml
药物/mAb比例：3.4
出现的任何代谢物的定量分析
在采用甲醇或乙腈沉淀蛋白质后，通过与三重四极杆质谱仪(MS)联用的高压液相色谱(HPLC)进行血浆、肿瘤和组织中的化合物的测量。
对于50μl血浆的后处理，加入250μl沉淀试剂(通常为乙腈)，并将混合物振荡10秒。沉淀试剂含有合适浓度(通常为20-100ng/ml)的内标物(ISTD)。在以16000g离心3分钟后，将上清液转移到自动采样瓶中，用500μl适用于流动相的缓冲液配制并再次振荡。
在肿瘤或组织的后处理过程中，将其用3倍量的提取缓冲液处理。该提取缓冲液含有50ml组织蛋白提取剂(Pierce，Rockford，IL)、完全蛋白酶抑制剂混合物(Complete-Protease-Inhibitor-Cocktail)的两个丸粒(Roche Diagnostics GmbH，Mannheim，德国)和最终浓度为1mm的苯基甲基磺酰氟(Sigma，St.Louis，MO)。将该样品在组织破碎仪II(Qiagen)中在最大冲程数下均质化两次，持续20分钟。将50μl匀浆转移到自动采样瓶中并用150μl包含ISTD的甲醇配制。以16000g离心3分钟后，将10μl上清液用180μl适用于流动相的缓冲液配制并再次振荡。然后该肿瘤或组织样品即可用于测量。
使用与HPLC联用的三重四极杆质谱仪API6500(来自AB SCIEX DeutschlandGmbH)测量这两种基质样品。
为了校准，将0.5-2000μg/l的浓度加入到血浆样品中。检测限(LOQ)为约2μg/l。线性范围从2延伸至1000μg/l。
为了校准肿瘤和组织样品，将0.5-200μg/l的浓度加入到未处理的肿瘤或组织的上清液中。检测限为3-6μg/l。线性范围从3延伸至200μg/l。
用于测试有效性的质量对照物含有5和50μg/l，另外在血浆中为500μg/l。
表：给予10mg/kg实施例208o的ADC或10mg/kg参比实施例R10k的ADC 24h后，NCIH292异种移植小鼠肿瘤、肝和肾中分解代谢物的浓度(在两种情况中测量的分解代谢物：M26)。
给予具有适度激动性抗体的本发明的ADC实施例208o后，在肿瘤中测得的活性分解代谢物M26的浓度与给予具有相同荷载和高激动性抗体的ADC R10k(抗体TPP-2658的激动性活性详细描述于WO 2015/189143 A1中)后的浓度相当。相比之下，给予实施例208o的ADC后，在肝和肾中测得的活性代谢物的浓度显著低于给予参比ADC R10k后的浓度。当在缀合物中所使用的具有非激动性或仅具有适度激动性作用的抗-TWEAKR抗体时，相比其他器官，药物显著地更有选择性地释放于靶组织(肿瘤)。
C-6体内功效试验
本发明的缀合物的功效可使用例如异种移植模型在体内进行测试。本领域技术人员熟悉可用于测试本发明的化合物的功效的现有技术方法(参见例如WO 2005/081711；Polson等人，Cancer Res.2009，三月，15；69(6)：2358-64)。为此，例如，将表达结合体的靶分子的肿瘤细胞系植入到啮齿动物(例如小鼠)中。然后将本发明的缀合物、同种型抗体对照缀合物或对照抗体或等渗盐水给予至植入动物。给药进行一次或更多次。在几天的培养时间后，通过比较经缀合物处理的动物和对照组来测定肿瘤尺寸。经缀合物处理的动物表现出较小的肿瘤尺寸。
C-6a.小鼠中的实验肿瘤的生长抑制/消退
将表达针对抗体药物缀合物的抗原的人肿瘤细胞皮下接种到免疫抑制的小鼠如NMRi裸鼠或SCID小鼠的侧腹中。从细胞培养物中分离1-10百万个细胞，离心并再悬浮于培养基或培养基/基质胶中。在小鼠的皮肤下注射该细胞悬浮液。
肿瘤生长数天。一旦肿瘤已建立，在肿瘤尺寸为约40mm2时，即开始治疗。如果要检验对更大的肿瘤的作用，则还可以在肿瘤尺寸为50-100mm2时才开始治疗。
通过经由小鼠尾静脉的静脉内(i.v.)途径进行采用ADC的小鼠治疗。ADC以5ml/kg的体积给药。
治疗方案取决于抗体的药代动力学。作为标准，治疗为每七天依次进行三次治疗。为了快速评估，也可以使用单次治疗方案。然而，也可以继续该治疗，或可在稍后时间点接着进行三个治疗日的第二循环。
作为标准，每个治疗组使用8只动物。除接受活性物质的组外，一个仅用缓冲液处理然后进行相同方案的组作为对照组。
在实验过程中，使用卡尺在两个维度(长度/宽度)上定期测量肿瘤面积。测定肿瘤面积为长度×宽度。将治疗组与对照组的平均肿瘤面积比表示为T/C面积。
如果在治疗结束时同时终止所有实验组，则可将肿瘤摘除并称重。将治疗组与对照组的平均肿瘤重量比表示为T/C重量。
C-6b.人肿瘤异种移植模型中的功效
将所讨论的肿瘤细胞经皮下接种到雌性NMRI裸小鼠(Janvier)的侧腹中。在肿瘤尺寸～40mm2时，用抗体药物缀合物经静脉治疗动物。在治疗后，任选地进一步监测肿瘤生长。
与对照组和同种型药物缀合物(已在之前的实验中证明后者的无活性)相比，抗-TWEAKR抗体药物缀合物的治疗产生显著的且长效的肿瘤生长抑制。表8示出了在培养后计算的，基于对照组在最后测量值的当天的肿瘤面积而确定的T/C值。
表8：
实施例 肿瘤模型 剂量 剂量方案 T/C面积
208-p KU-19-19(人膀胱癌) 5mg/kg Q7dx3 0.26(第15天)
208-p NCI-H292(人肺癌) 5mg/kg Q7dx3 0.22(第19天)
208-o KU-19-19(人膀胱癌) 5mg/kg Q7dx3 0.27(第15天)
208-o NCI-H292(人肺癌) 5mg/kg Q7dx3 0.25(第19天)
抗-TWEAKR抗体的工作实施例
通过表面等离子体共振测定抗体的结合亲和力：
使用Biacore T200仪器(GE Healthcare Biacore，Inc.)进行用于定量结合分析的表面等离子体共振实验。在此，借助胺偶联至传感器芯片表面的抗人Fc抗体(“HumanAntibody Capture Kit”，BR-1008-39，GE Healthcare Biacore，Inc.)固定待检验的抗体。根据生产商的说明书使用1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和pH 8.5的乙醇胺HCl进行胺偶联(“Amine Coupling Kit”BR-1000-50，GE Healthcare Biacore，Inc.)。为了分析，采用流动缓冲液HBS-EP+(10mM HEPES pH 7.4，150mM NaCl，3mM EDTA，0.05％表面活性剂P20)使用系列S传感器芯片CM5(GE HealthcareBiacore，Inc.)。在25℃下进行所有实验步骤。将待检验的抗-TWEAKR抗体固定后，以3.9至500nM的浓度范围进行TWEAKR(Analyt，30R-AT080，Fitzgerald)的细胞外结构域的注入，注入各抗原后，用pH 2.0的甘氨酸HCl对传感器表面进行再生。在每种情况中，将抗体如上固定后，在相同条件下注入另一种分析物。对于所有测量，使用仅含有固定化的胺偶联的抗人Fc抗体的上游流动细胞作为参比细胞。双重参比(减去参比流动细胞信号和缓冲液注入)后，通过Biacore T200评估软件(GE Healthcare Biacore，Inc.)中的“稳态”亲和力评估对所获得的传感图进行评估。
表5a：用于亲和力测定的重组抗原
表5b：市售的抗体
表5c：借助Biacore分析的抗-TWEAKR抗体的单价KD值
Ka(1/Ms) kd(1/s) KD(nM)
ITEM-4 2.80E+06 2.00E-03 7.0E-10
TPP-7005 6.8E+06 1.8E-03 2.6E-10
TPP-7006 7.4E+06 2.4E-03 3.3E-10
TPP-7007 5.3E+06 7.5E-03 1.4E-09
TPP-7075 4.7E+06 2.8E-02 6.0E-09
借助FACS分析测定抗体与表达TWEAKR的癌细胞的结合亲和力
使用不同的人肿瘤细胞系通过流式细胞术检测抗-TWEAKR抗体的结合。为此，将细胞(5×105个细胞/孔)在FACS缓冲液(不含Ca/Mg的PBS，3％FCS，Biochrom)中用10μg/ml一抗溶液(起始浓度)在冰上避光培养30-45min。绘制剂量活性曲线(1∶5稀释)。培养后，使用移液管加入200μl冰冷却的FACS缓冲液，将细胞悬浮液在4℃、400g下离心4min。将细胞沉淀物用300μl冰冷却的FACS缓冲液洗涤然后将获得的沉淀物重悬于100μl FACS缓冲液中并用二抗(单克隆抗-κ轻链-FITC抗体，Sigma，编号SAB4700605)以1∶10稀释在冰上再培养30min。然后将细胞用冰冷却的FACS缓冲液洗涤并调节细胞浓度至0.5×106个细胞/ml，然后使用Guava流式细胞仪(Millipore)进行流式细胞术。将碘化丙啶(终浓度1μg/ml)用于活染色。将结果作为待检验的抗体的荧光性的背景校准的几何平均值来测定(表6a)或借助剂量/作用曲线来测定EC50值(表6b)。
表6a：FACS分析：抗-TWEAKR抗体与不同癌细胞系的结合
细胞系 来源 ITEM-4
NCI-H292 ATCC编号CRL-1848 ++
786-O ATCC编号CRL-1932 +++(+)
A498 ATCC编号HTB-44 +++
SK-Hep1 ATCC编号HTB-52 ++(+)
(几何平均值-二抗的几何平均值＞5：+，＞50：++，＞500：+++，＞5000：++++)
表6b：FACS分析：人源化的抗-TWEAKR抗体与肺癌细胞系NCI-H292和肝癌细胞SK-HEP-1的结合力
借助NFkappaB报告基因测定法测定抗-TWEAKR抗体的激动/拮抗活性
进行NF-kappaB报告基因测定法以测定抗体(人IgG1)的激动活性。根据制造商的说明书使用293fectin采用NF-kappaB报告因子构建体(BioCat，目录号LR-0051-PA)瞬时转染HEK293细胞。在37℃、5％CO2下用在F17培养基(无血清；Invitrogen)中的经转染的细胞接种经多聚赖氨酸包覆的白色384孔板(BD)。次日，将细胞用不同浓度的经纯化的抗体刺激6h，随后根据标准方法进行荧光素酶测定法。测量例如ITEM-4的适度激动活性，其显示天然配体(在200ng/ml)TWEAK的激动作用的14％。为检验拮抗活性，在天然配体Tweak(200ng/ml)的存在下进行测定。在该测定设计中，证明了ITEM-4的有效的拮抗活性。
表7：抗-TWEAKR抗体的激动活性和拮抗活性
序列表
<110> 拜耳医药股份有限公司
<120> KSP抑制剂与抗-TWEAKR抗体的抗体药物缀合物（ADC）
<130> BHC 15 1 033
<160> 102
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Phe
20 25 30
Ile Ile Ala Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Tyr Pro Gly Thr Gly Arg Thr Tyr Tyr Ser Glu Lys Phe
50 55 60
Arg Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Thr Ile Tyr Tyr Asp Tyr Asp Gly Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 2
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Asp Phe Ile Ile Ala
1 5
<210> 3
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Glu Ile Tyr Pro Gly Thr Gly Arg Thr Tyr Tyr Ser Glu Lys Phe Arg
1 5 10 15
Gly
<210> 4
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Arg Thr Ile Tyr Tyr Asp Tyr Asp Gly Asp Tyr
1 5 10
<210> 5
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Ser Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala His Asn
85 90 95
Leu Glu Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 6
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr
1 5 10 15
<210> 7
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Gln Met Ser Asn Leu Ala Ser
1 5
<210> 8
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Ala His Asn Leu Glu Leu Pro Trp Thr
1 5
<210> 9
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Phe
20 25 30
Ile Ile Ala Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Tyr Pro Gly Thr Gly Arg Thr Tyr Tyr Ser Glu Lys Phe
50 55 60
Arg Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Thr Ile Tyr Tyr Asp Tyr Asp Gly Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly
<210> 10
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Ser Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala His Asn
85 90 95
Leu Glu Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 11
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Phe
20 25 30
Ile Ile Ala Trp Val Lys Gln Arg Thr Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Tyr Pro Gly Thr Gly Arg Thr Tyr Tyr Ser Glu Lys Phe
50 55 60
Arg Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Val Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Thr Ile Tyr Tyr Asp Tyr Asp Gly Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 12
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
Asp Phe Ile Ile Ala
1 5
<210> 13
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
Glu Ile Tyr Pro Gly Thr Gly Arg Thr Tyr Tyr Ser Glu Lys Phe Arg
1 5 10 15
Gly
<210> 14
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
Arg Thr Ile Tyr Tyr Asp Tyr Asp Gly Asp Tyr
1 5 10
<210> 15
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Phe Ser Asn Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Thr Ser Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Ser Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala His Asn
85 90 95
Leu Glu Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105 110
<210> 16
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr
1 5 10 15
<210> 17
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
Gln Met Ser Asn Leu Ala Ser
1 5
<210> 18
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
Ala His Asn Leu Glu Leu Pro Trp Thr
1 5
<210> 19
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Phe
20 25 30
Ile Ile Ala Trp Val Lys Gln Arg Thr Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Tyr Pro Gly Thr Gly Arg Thr Tyr Tyr Ser Glu Lys Phe
50 55 60
Arg Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Val Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Thr Ile Tyr Tyr Asp Tyr Asp Gly Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly
<210> 20
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Phe Ser Asn Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Thr Ser Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Ser Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala His Asn
85 90 95
Leu Glu Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 21
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Phe
20 25 30
Ile Ile Ala Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Tyr Pro Gly Thr Gly Arg Thr Tyr Tyr Ser Glu Lys Phe
50 55 60
Arg Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Thr Ile Tyr Tyr Asp Tyr Asp Gly Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 22
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
Asp Phe Ile Ile Ala
1 5
<210> 23
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
Glu Ile Tyr Pro Gly Thr Gly Arg Thr Tyr Tyr Ser Glu Lys Phe Arg
1 5 10 15
Gly
<210> 24
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
Arg Thr Ile Tyr Tyr Asp Tyr Asp Gly Asp Tyr
1 5 10
<210> 25
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala His Asn
85 90 95
Leu Glu Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 26
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr
1 5 10 15
<210> 27
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
Gln Met Ser Asn Leu Ala Ser
1 5
<210> 28
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
Ala His Asn Leu Glu Leu Pro Trp Thr
1 5
<210> 29
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Phe
20 25 30
Ile Ile Ala Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Tyr Pro Gly Thr Gly Arg Thr Tyr Tyr Ser Glu Lys Phe
50 55 60
Arg Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Thr Ile Tyr Tyr Asp Tyr Asp Gly Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
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225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly
<210> 30
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
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Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala His Asn
85 90 95
Leu Glu Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
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<210> 31
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Phe
20 25 30
Ile Ile Ala Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Lys
35 40 45
Gly Glu Ile Tyr Pro Gly Thr Gly Ile Thr Tyr Tyr Ser Glu Lys Phe
50 55 60
Arg Gly Lys Ala Thr Lys Ala Ala Leu Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Thr Phe Tyr Tyr Asp Tyr Asp Gly Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
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<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
Asp Phe Ile Ile Ala
1 5
<210> 33
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
Glu Ile Tyr Pro Gly Thr Gly Ile Thr Tyr Tyr Ser Glu Lys Phe Arg
1 5 10 15
Gly
<210> 34
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
Arg Thr Phe Tyr Tyr Asp Tyr Asp Gly Asp Tyr
1 5 10
<210> 35
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala His Asn
85 90 95
Leu Glu Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 36
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr
1 5 10 15
<210> 37
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
Gln Met Ser Asn Leu Ala Leu
1 5
<210> 38
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
Ala His Asn Leu Glu Leu Pro Trp Thr
1 5
<210> 39
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Phe
20 25 30
Ile Ile Ala Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Lys
35 40 45
Gly Glu Ile Tyr Pro Gly Thr Gly Ile Thr Tyr Tyr Ser Glu Lys Phe
50 55 60
Arg Gly Lys Ala Thr Lys Ala Ala Leu Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Thr Phe Tyr Tyr Asp Tyr Asp Gly Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly
<210> 40
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Tyr Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Ala Leu Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala His Asn
85 90 95
Leu Glu Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 41
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Phe
20 25 30
Ile Ile Ala Trp Val Lys Gln Arg Thr Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
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Gly Glu Ile Tyr Pro Gly Thr Gly Arg Thr Tyr Tyr Ser Glu Lys Phe
50 55 60
Arg Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Val Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Thr Ile Tyr Tyr Asp Tyr Asp Gly Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 42
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
Asp Phe Ile Ile Ala
1 5
<210> 43
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
Glu Ile Tyr Pro Gly Thr Gly Arg Thr Tyr Tyr Ser Glu Lys Phe Arg
1 5 10 15
Gly
<210> 44
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
Arg Thr Ile Tyr Tyr Asp Tyr Asp Gly Asp Tyr
1 5 10
<210> 45
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Phe Ser Asn Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Thr Ser Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser
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Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala His Asn
85 90 95
Leu Glu Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105 110
<210> 46
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr
1 5 10 15
<210> 47
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
Gln Met Ser Asn Leu Ala Ser
1 5
<210> 48
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
Ala His Asn Leu Glu Leu Pro Trp Thr
1 5
<210> 49
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
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115 120 125
Tyr Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu Thr
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Thr Ser
180 185 190
Ser Thr Trp Pro Ser Gln Ser Ile Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala
195 200 205
Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile
210 215 220
Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile
245 250 255
Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp
260 265 270
Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His
275 280 285
Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg
290 295 300
Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys
305 310 315 320
Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu
355 360 365
Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp
370 375 380
Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu
405 410 415
Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His
420 425 430
Glu Gly Leu His Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro
435 440 445
Gly Lys
450
<210> 50
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 50
Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Phe Ser Asn Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Thr Ser Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Ser Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala His Asn
85 90 95
Leu Glu Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105 110
Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu
115 120 125
Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg
145 150 155 160
Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu
180 185 190
Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser
195 200 205
Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
210 215
<210> 51
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 51
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Phe
20 25 30
Ile Ile Ala Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Tyr Pro Gly Thr Gly Arg Thr Tyr Tyr Ser Glu Lys Phe
50 55 60
Arg Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
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100 105 110
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115 120
<210> 52
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 52
Asp Phe Ile Ile Ala
1 5
<210> 53
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 53
Glu Ile Tyr Pro Gly Thr Gly Arg Thr Tyr Tyr Ser Glu Lys Phe Arg
1 5 10 15
Gly
<210> 54
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 54
Arg Thr Ile Tyr Tyr Asp Tyr Asp Gly Asp Tyr
1 5 10
<210> 55
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 55
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Ser Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Ser Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala His Asn
85 90 95
Leu Glu Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 56
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 56
Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser Ser Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr
1 5 10 15
<210> 57
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 57
Gln Met Ser Asn Leu Ala Ser
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 58
Ala His Asn Leu Glu Leu Pro Trp Thr
1 5
<210> 59
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 59
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Phe
20 25 30
Ile Ile Ala Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Tyr Pro Gly Thr Gly Arg Thr Tyr Tyr Ser Glu Lys Phe
50 55 60
Arg Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Thr Ile Tyr Tyr Asp Tyr Asp Gly Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly
<210> 60
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 60
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Ser Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
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Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala His Asn
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115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
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195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
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<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 61
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Phe
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Ile Ile Ala Trp Val Lys Gln Arg Thr Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
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Gly Glu Ile Tyr Pro Gly Thr Gly Arg Thr Tyr Tyr Ser Glu Lys Phe
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Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Val Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
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Ala Arg Arg Thr Ile Tyr Tyr Asp Tyr Asp Gly Asp Tyr Trp Gly Gln
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Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
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<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Asp Phe Ile Ile Ala
1 5
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<211> 17
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 63
Glu Ile Tyr Pro Gly Thr Gly Arg Thr Tyr Tyr Ser Glu Lys Phe Arg
1 5 10 15
Gly
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 64
Arg Thr Ile Tyr Tyr Asp Tyr Asp Gly Asp Tyr
1 5 10
<210> 65
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 65
Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Phe Ser Asn Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Thr Ser Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 66
Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser Ser Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Gln Met Ser Asn Leu Ala Ser
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 68
Ala His Asn Leu Glu Leu Pro Trp Thr
1 5
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<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 69
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
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Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Phe
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Ile Ile Ala Trp Val Lys Gln Arg Thr Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
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Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
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225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
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275 280 285
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Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
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Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly
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<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 70
Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Phe Ser Asn Pro Val Thr Leu Gly
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Thr Ser Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Ser Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
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Asp Arg Phe Ser Ser Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala His Asn
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Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
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Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
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180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 71
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 71
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Phe
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Ile Ile Ala Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
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Gly Glu Ile Tyr Pro Gly Thr Gly Arg Thr Tyr Tyr Ser Glu Lys Phe
50 55 60
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65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Thr Ile Tyr Tyr Asp Tyr Asp Gly Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
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<210> 72
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 72
Asp Phe Ile Ile Ala
1 5
<210> 73
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 73
Glu Ile Tyr Pro Gly Thr Gly Arg Thr Tyr Tyr Ser Glu Lys Phe Arg
1 5 10 15
Gly
<210> 74
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 74
Arg Thr Ile Tyr Tyr Asp Tyr Asp Gly Asp Tyr
1 5 10
<210> 75
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 75
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser
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Ser Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
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Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
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Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
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Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala His Asn
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100 105 110
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<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 76
Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser Ser Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr
1 5 10 15
<210> 77
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 77
Gln Met Ser Asn Leu Ala Ser
1 5
<210> 78
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 78
Ala His Asn Leu Glu Leu Pro Trp Thr
1 5
<210> 79
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 79
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Phe
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Gly Glu Ile Tyr Pro Gly Thr Gly Arg Thr Tyr Tyr Ser Glu Lys Phe
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Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
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Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
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Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
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Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
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Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
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Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
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Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
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Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly
<210> 80
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 80
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Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
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Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
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Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
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180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
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<210> 81
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 81
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
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<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 82
Asp Phe Ile Ile Ala
1 5
<210> 83
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 83
Glu Ile Tyr Pro Gly Thr Gly Ile Thr Tyr Tyr Ser Glu Lys Phe Arg
1 5 10 15
Gly
<210> 84
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 84
Arg Thr Phe Tyr Tyr Asp Tyr Asp Gly Asp Tyr
1 5 10
<210> 85
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 85
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Ser Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Tyr Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Ala Leu Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala His Asn
85 90 95
Leu Glu Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 86
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 86
Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser Ser Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr
1 5 10 15
<210> 87
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 87
Gln Met Ser Asn Leu Ala Leu
1 5
<210> 88
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 88
Ala His Asn Leu Glu Leu Pro Trp Thr
1 5
<210> 89
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 89
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Phe
20 25 30
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100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly
<210> 90
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 90
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Ser Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Tyr Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Ala Leu Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala His Asn
85 90 95
Leu Glu Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 91
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 91
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Phe
20 25 30
Ile Ile Ala Trp Val Lys Gln Arg Thr Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Tyr Pro Gly Thr Gly Arg Thr Tyr Tyr Ser Glu Lys Phe
50 55 60
Arg Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Val Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Thr Ile Tyr Tyr Asp Tyr Asp Gly Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 92
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 92
Asp Phe Ile Ile Ala
1 5
<210> 93
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 93
Glu Ile Tyr Pro Gly Thr Gly Arg Thr Tyr Tyr Ser Glu Lys Phe Arg
1 5 10 15
Gly
<210> 94
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 94
Arg Thr Ile Tyr Tyr Asp Tyr Asp Gly Asp Tyr
1 5 10
<210> 95
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 95
Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Phe Ser Asn Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Thr Ser Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Ser Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Ser Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala His Asn
85 90 95
Leu Glu Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105 110
<210> 96
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 96
Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser Ser Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr
1 5 10 15
<210> 97
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 97
Gln Met Ser Asn Leu Ala Ser
1 5
<210> 98
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 98
Ala His Asn Leu Glu Leu Pro Trp Thr
1 5
<210> 99
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 99
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Phe
20 25 30
Ile Ile Ala Trp Val Lys Gln Arg Thr Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Tyr Pro Gly Thr Gly Arg Thr Tyr Tyr Ser Glu Lys Phe
50 55 60
Arg Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Val Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Thr Ile Tyr Tyr Asp Tyr Asp Gly Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val
115 120 125
Tyr Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu Thr
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Thr Ser
180 185 190
Ser Thr Trp Pro Ser Gln Ser Ile Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala
195 200 205
Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile
210 215 220
Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile
245 250 255
Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp
260 265 270
Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His
275 280 285
Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg
290 295 300
Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys
305 310 315 320
Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu
355 360 365
Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp
370 375 380
Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu
405 410 415
Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His
420 425 430
Glu Gly Leu His Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro
435 440 445
Gly Lys
450
<210> 100
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 100
Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Phe Ser Asn Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Thr Ser Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Ser Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Ser Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala His Asn
85 90 95
Leu Glu Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105 110
Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu
115 120 125
Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg
145 150 155 160
Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu
180 185 190
Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser
195 200 205
Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
210 215
<210> 101
<211> 129
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 101
Met Ala Arg Gly Ser Leu Arg Arg Leu Leu Arg Leu Leu Val Leu Gly
1 5 10 15
Leu Trp Leu Ala Leu Leu Arg Ser Val Ala Gly Glu Gln Ala Pro Gly
20 25 30
Thr Ala Pro Cys Ser Arg Gly Ser Ser Trp Ser Ala Asp Leu Asp Lys
35 40 45
Cys Met Asp Cys Ala Ser Cys Arg Ala Arg Pro His Ser Asp Phe Cys
50 55 60
Leu Gly Cys Ala Ala Ala Pro Pro Ala Pro Phe Arg Leu Leu Trp Pro
65 70 75 80
Ile Leu Gly Gly Ala Leu Ser Leu Thr Phe Val Leu Gly Leu Leu Ser
85 90 95
Gly Phe Leu Val Trp Arg Arg Cys Arg Arg Arg Glu Lys Phe Thr Thr
100 105 110
Pro Ile Glu Glu Thr Gly Gly Glu Gly Cys Pro Ala Val Ala Leu Ile
115 120 125
Gln
<210> 102
<211> 959
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 102
atggctcggg gctcgctgcg ccggttgctg cggctcctcg tgctggggct ctggctggcg 60
ttgctgcgct ccgtggccgg ggagcaagcg ccaggcaccg ccccctgctc ccgcggcagc 120
tcctggagcg cggacctgga caagtgcatg gactgcgcgt cttgcagggc gcgaccgcac 180
agcgacttct gcctgggctg cgctgcagca cctcctgccc ccttccggct gctttggccc 240
atccttgggg gcgctctgag cctgaccttc gtgctggggc tgctttctgg ctttttggtc 300
tggagacgat gccgcaggag agagaagttc accaccccca tagaggagac cggcggagag 360
ggctgcccag ctgtggcgct gatccagtga caatgtgccc cctgccagcc ggggctcgcc 420
cactcatcat tcattcatcc attctagagc cagtctctgc ctcccagacg cggcgggagc 480
caagctcctc caaccacaag gggggtgggg ggcggtgaat cacctctgag gcctgggccc 540
agggttcagg ggaaccttcc aaggtgtctg gttgccctgc ctctggctcc agaacagaaa 600
gggagcctca cgctggctca cacaaaacag ctgacactga ctaaggaact gcagcatttg 660
cacaggggag gggggtgccc tccttcctta ggacctgggg gccaggctga cttggggggc 720
agacttgaca ctaggcccca ctcactcaga tgtcctgaaa ttccaccacg ggggtcaccc 780
tggggggtta gggacctatt tttaacacta ggggctggcc cactaggagg gctggcccta 840
agatacagac ccccccaact ccccaaagcg gggaggagat atttattttg gggagagttt 900
ggaggggagg gagaatttat taataaaaga atctttaact ttaaaaaaaa aaaaaaaaa 959

Claims (29)

1.抗体与一个或更多个下式的药物分子的缀合物：
其中
结合体 代表发挥适度的激动作用或非激动作用的抗-TWEAKR抗体或其抗原结合片段，
L代表接头，
n代表1至50的数，优选1.2至20，特别优选2至8，以及
KSP代表下式(I)的化合物及其盐、溶剂合物、溶剂合物的盐和差向异构体：
式(I)：
其中
R1代表-H、-L-#1、-MOD或-(CH2)0-3Z，
其中
Z代表-H、-NHY3、-OY3、-SY3、卤素、-C(＝O)-NY1Y2或-C(＝O)-OY3，
Y1和Y2各自独立地代表-H、-NH2、-(CH2CH2O)0-3-(CH2)0-3Z‘(例如-(CH2)0-3Z‘)或-CH(CH2W)Z‘，
Y3代表-H或-(CH2)0-3Z‘，
Z‘代表-H、-NH2、-SO3H、-COOH、-NH-C(＝O)-CH2-CH2-CH(NH2)COOH或-(CO-NH-CHY4)1- 3COOH；
W代表H或OH，
Y4代表任选地被-NH-C(＝O)-NH2取代的直链或支链C1-6烷基，或代表任选地被-NH2取代的芳基或苄基；
R2代表H、-MOD、-C(＝O)-CHY4-NHY5或-(CH2)0-3Z，
其中
Z代表-H、卤素、-OY3、-SY3、-NHY3、-C(＝O)-NY1Y2或-C(＝O)-OY3，
Y1和Y2各自独立地代表-H、-NH2或-(CH2)0-3Z‘，
Y3代表-H或-(CH2)0-3Z‘，
Z‘代表-H、-SO3H、-NH2或-COOH；
Y4代表任选地被-NH-C(＝O)-NH2取代的直链或支链C1-6-烷基，或任选地被-NH2取代的芳基或苄基，以及
Y5代表-H或-C(＝O)-CHY6-NH2，
Y6代表直链或支链C1-6-烷基；
R4代表-H、-L-#1、-SGlys-(C＝O)0-1-R4’、-C(＝O)-CHY4-NHY5或-(CH2)0-3Z，
其中SGlys代表可被溶酶体酶裂解的基团，特别是由二肽或三肽组成的基团，
其中R4′代表可被-NH2、-NH-烷基、-N(烷基)2、-NH-C(＝O)-烷基、-N(烷基)-C(＝O)-烷基、-SO3H、-S(＝O)2-NH2、-S(＝O)2-N(烷基)2、-COOH、-C(＝O)-NH2、-C(＝O)-N(烷基)2、或-OH单取代或多取代的C1-10-烷基、C5-10-芳基或C6-10-芳烷基、C5-10-杂烷基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳基、C5-10-杂环烷基、杂芳基、杂芳基烷基、杂芳基烷氧基、C1-10-烷氧基、C6-10-芳氧基或C6-10-芳烷氧基、C5-10-杂芳烷氧基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳氧基、C5-10-杂环烷氧基基团，或代表-H或基团-Ox-(CH2CH2O)y-R4″，
其中x代表0或1，
其中v代表1至10的数，
其中R4″代表-H、-烷基(优选C1-12-烷基)、-CH2-COOH、-CH2-CH2-COOH、或-CH2-CH2-NH2；
其中Z代表-H、卤素、-OY3、-SY3、NHY3、-C(＝O)-NY1Y2或-C(＝O)-OY3，
其中Y1和Y2各自独立地代表-H、-NH2或-(CH2)0-3Z‘，
其中Y3代表-H或-(CH2)0-3Z‘，
其中Z‘代表-H、-SO3H、-NH2或-COOH；
其中Y4代表任选地被-NH-C(＝O)-NH2取代的直链或支链C1-6-烷基，或代表任选地被-NH2取代的芳基或苄基，
其中Y5代表-H或-C(＝O)-CHY6-NH2，
其中Y6代表直链或支链C1-6-烷基；
或
R2和R4一起(其中形成吡咯烷环)代表-CH2-CHR11-或-CHR11-CH2-，
其中
R11代表-H、-NH2、-SO3H、-COOH、-SH、卤素(特别是F或Cl)、C1-4-烷基、C1-4-卤代烷基、C1-4-烷氧基、羟基取代的C1-4-烷基、COO(C1-4-烷基)或-OH；
A代表-C(＝O)-、-S(＝O)-、-S(＝O)2-、-S(＝O)2-NH-或-C(＝N-NH2)-；
R3代表-L-#1，-MOD或任选地被取代的烷基、环烷基、芳基、杂芳基、杂烷基、杂环烷基，优选-L-#1或各自可被以下基团取代的C1-10-烷基、C6-10-芳基或C6-10-芳烷基、C5-10-杂烷基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳基或C5-10-杂环烷基基团：1-3个-OH基团、1-3个卤素原子、1-3个卤代烷基基团(各自具有1-3个卤素原子)、1-3个O-烷基基团、1-3个-SH基团、1-3个-S-烷基基团、1-3个-O-C(＝O)-烷基基团、1-3个-O-C(＝O)-NH-烷基基团、1-3个-NH-C(＝O)-烷基基团、1-3个-NH-C(＝O)-NH-烷基基团、1-3个-S(＝O)n-烷基基团、1-3个-S(＝O)2-NH-烷基基团、1-3个-NH-烷基基团、1-3个-N(烷基)2基团、1-3个-NH2基团或1-3个-(CH2)0-3Z基团，
其中
n代表0、1或2，
Z代表-H、卤素、-OY3、-SY3、-NHY3、-C(＝O)-NY1Y2或-C(＝O)-OY3，
Y1和Y2各自独立地代表-H、-NH2或-(CH2)0-3Z‘，
Y3代表-H、-(CH2)0-3-CH(NH-C(＝O)-CH3)Z‘、-(CH2)0-3-CH(NH2)Z‘或-(CH2)0-3Z‘，
Z‘代表-H、-SO3H、-NH2或-COOH，
R5代表-H、-NH2、-NO2、卤素(特别是F、Cl、Br)、-CN、CF3、-OCF3、-CH2F、-CH2F、SH或-(CH2)0-3Z，
其中
Z代表-H、-OY3、-SY3、卤素、-NHY3、-C(＝O)-NY1Y2或-CO-OY3，
Y1和Y2各自独立地代表-H、-NH2或-(CH2)0-3Z‘，
Y3代表-H或-(CH2)0-3Z‘，
Z‘代表-H、-SO3H、-NH2或-COOH；
R6和R7各自独立地代表-H、氰基、C1-10-烷基、氟-C1-10-烯基、C2-10-烯基、氟-C2-10-烯基、C2-10-炔基、氟-C2-10-烯基、羟基、-NO2、NH2、-COOH或卤素，
R8代表C1-10-烷基、氟-C1-10-烯基、C2-10-烯基、氟-C2-10-烯基、C2-10-炔基、氟-C2-10-烯基、C4-10-环烷基、氟-C4-10-环烷基或-(CH2)0-2-(HZ2)，其可被相同或不同的-OH、-COOH或-NH2单取代或二取代，以及
其中
HZ2代表具有选自N、O和S的最多达两个杂原子的4至7元杂环，
R9代表-H、-F、-CH3、-CF3、-CH2F或-CHF2；
其中
取代基R1、R3和R4中的一个代表-L-#1，
L代表接头且#1代表与抗体连接的键，
-MOD代表-(NR10)n-(G1)o-G2-G3，
其中
R10代表H或C1-C3-烷基；
G1代表-NHC(＝O)-、-C(＝O)NH-(其中，如果G1代表-NHC(＝O)-，则R10不代表NH2)；
n代表0或1；
o代表0或1；以及
G2代表直链或支链烃链，所述烃链具有1至10个碳原子且可被一个或更多个下述基团中断一次或更多次：-O-、-S-、-S(＝O)-、S(＝O)2、-NRy-、-NRyC(＝O)-、C(＝O)-NRy-、-NRyNRy-、-S(＝O)2-NRyNRy-、-C(＝O)-NRyNRy-，
其中
Ry代表-H、苯基、C1-C10-烷基、C2-C10-烯基或C2-C10-炔基，其各自可被相同或不同的-NH-C(＝O)-NH2、-COOH、-OH、-NH2、-NH-CNNH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸单取代或多取代，和/或其可被相同或不同的-C(＝O)-、-CRx＝N-O-中断一次或更多次，
其中
Rx代表-H、C1-C3-烷基或苯基，以及
其中
所述烃链包括任选地在侧链烃基上被取代的C1-C10-烷基基团，且所述烃链可被-NH-C(＝O)-NH2、-COOH、-OH、-NH2、-NH-CNNH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代，
G3代表-H或-COOH，以及
其中基团-MOD优选地具有至少一个基团-COOH。
2.权利要求1的缀合物，其中A代表-C(＝O)-。
3.权利要求1或2的缀合物，其中R1代表-H、-L-#1、-COOH、-C(＝O)-NHNH2、-(CH2)1-3NH2、-C(＝O)-NZ“(CH2)1-3NH2或-C(＝O)-NZ“CH2COOH，其中Z“代表-H或-NH2。
4.前述权利要求中一项或多项的缀合物，其中R2和R4代表-H或R2和R4一起(其中形成吡咯烷环)代表-CHR11-CH2-或-CH2-CHR11-；其中R11代表H、COOH、F、Me、CH2F、OMe、CH2OH、COO(C1-4-烷基)或OH。
5.前述权利要求中一项或多项的缀合物，其中R3代表-L-#1或代表可被卤素、C1-3-烷基或氟-C1-3-烷基单取代或多取代的苯基基团，或代表可任选地被-OY4、-SY4、-O-C(＝O)-Y4、-O-C(＝O)-NH-Y4、-NH-C(＝O)-Y4、-NH-C(＝O)-NH-Y4、-S(O)n-Y4、-S(＝O)2-NH-Y4、-NH-Y4或-N(Y4)2取代的C1-10-烷基基团或氟-C1-10-烷基基团，
其中
n代表0、1或2，
Y4代表-H，任选地被卤素、C1-3-烷基或氟-C1-3-烷基单取代或多取代的苯基，或代表可被-OH、-COOH、和/或-NH-C(＝O)-C1-3-烷基取代的烷基。
6.权利要求5的缀合物，其中所述缀合物具有下式(IIj)：
其中
R3代表-L-#1；
A代表-C(＝O)-；以及
R6、R7、R8和R9具有与权利要求1中的式(I)中相同的含义。
7.权利要求1至5中一项或多项的缀合物，其中取代基R1代表-L-#1。
8.权利要求7的缀合物，其中所述缀合物具有式(IIk)：
其中
R1代表-L-#1；
A代表-C(＝O)-；以及
R3代表-CH2OH-；
R6、R7、R8和R9具有与权利要求1中的式(I)中相同的含义。
9.前述权利要求中一项或多项的缀合物，其中R5代表-H或-F。
10.前述权利要求中一项或多项的缀合物，其中R6和R7各自独立地代表-H、C1-3-烷基、氟-C1-3-烷基、C2-4-烯基、氟-C2-4-烯基、C2-4-炔基、氟-C2-4-炔基、羟基或卤素。
11.前述权利要求中一项或多项的缀合物，其中R8代表支链C1-5-烷基基团或环己基。
12.前述权利要求中一项或多项的缀合物，其中R9代表-H或氟。
13.前述权利要求中一项或多项的缀合物，其中接头-L-具有以下基本结构(i)至(iv)中的一种：
(i)-(CO)m-SG1-L1-L2-
(ii)-(CO)m-L1-SG-L1-L2-
(iii)-(CO)m-L1-L2-
(iv)-(CO)m-L1-SG-L2
其中m代表0或1，SG和SG1代表体内可裂解基团，L1各自独立地代表体内不可裂解的有机基团，以及L2代表与结合体偶联的偶联基团。
14.权利要求13的缀合物，其中体内可裂解基团SG是2-8寡肽基团，优选三肽或二肽基团或二硫化物、腙、缩醛或缩醛胺以及SG1是2-8寡肽基团，优选二肽基团。
15.前述权利要求中一项或多项的缀合物，其中接头L连接至半胱氨酸侧链或半胱氨酸残基并具有下式：
§-(C(＝O)-)m-L1-L2-§§
其中
m代表0或1；
§代表与活性化合物分子连接的键；以及
§§代表与抗体连接的键，以及
-L2-代表
#1-S-#2、
其中
#1表示与抗体的硫原子连接的点，
#2表示与基团L1连接的点，
L1代表-(NR10)n-(G1)o-G2-，
其中
R10代表-H、-NH2或C1-C3-烷基；
G1代表-NH-C(＝O)-；
n代表0或1；
o代表0或1；以及
G2代表直链或支链烃链，其具有1至100个(优选1至25个)来自芳基基团、和/或直链和/或支链烷基基团、和/或环烷基基团的碳原子且可被相同或不同的以下基团中断一次或更多次：-O-、-S-、-S(＝O)-、-S(＝O)2-、-NH-、-C(＝O)-、-N-CH3-、-NHNH-、-S(＝O)2-NHNH-、-NH-C(＝O)-、-C(＝O)-NH-、-C(＝O)-NHNH-和具有1至4个相同或不同的选自N、O和S、-SO-或-SO2-的杂原子和/或杂基团的5至10元芳族或非芳族杂环，
其中直链或支链烃链可任选地被-NH-C(＝O)-NH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代，或代表以下基团中的一个：
其中Rx代表-H、C1-C3-烷基或苯基。
16.权利要求15的缀合物，其中L2代表下式的一个或更多个基团：
其中
#1表示与结合体的硫原子连接的点，
#2表示与基团L1连接的点，
R22表示-COOH，以及
大于80％(基于接头与结合体连接的键的总数计)的与结合体的硫原子连接的键存在于这两种结构中的一种。
17.权利要求15和16中一项或多项的缀合物，其中L1具有下式：
其中
r代表0至8的数。
18.前述权利要求中一项或多项的缀合物，其中接头-L-连接至半胱氨酸侧链或半胱氨酸残基并具有下式：
其中
§代表与活性化合物分子连接的键，以及
§§代表与抗体连接的键，
m代表0、1、2或3；
n代表0、1或2；
p代表0至20；以及
L3代表
其中
o代表0或1；以及
G3代表直链或支链烃链，其具有1至100个(优选1至25个)来自芳基基团、和/或直链和/或支链烷基基团、和/或环烷基基团的碳原子且可被相同或不同的以下基团中断一次或更多次：-O-、-S-、-S(＝O)-、-S(＝O)2-、-NH-、-C(＝O)-、-N-CH3-、-NHNH-、-S(＝O)2-NHNH-、-NH-C(＝O)-、-C(＝O)-NH-、-C(＝O)-NHNH-和具有1至4个相同或不同的选自N、O和S、-SO-或-SO2-的杂原子和/或杂基团的5至10元芳族或非芳族杂环，其中所述直链或支链烃链可任选地被-NH-C(＝O)NH2、-COOH、-OH、-NH2、-NH-CNNH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代。
19.前述权利要求中一项或多项的缀合物，其中所述缀合物具有下式中的一种及其盐、溶剂合物、溶剂合物的盐和差向异构体：
其中
AK1代表经胱氨酸连接的发挥适度的激动作用或非激动作用的抗-TWEAKR抗体，以及AK2代表经赖氨酸连接的发挥适度的激动作用或非激动作用的抗-TWEAKR抗体，
n代表1至20的数；以及
L1代表直链或支链烃链，其具有1至30个碳原子并可被相同或不同的-O-、-S-、-C(＝O)-、-S(＝O)2-、-NH-、环苯基、哌啶基、苯基中断一次或更多次，
其中所述直链或支链烃链可被-COOH或-NH2取代。
20.权利要求19的缀合物，其中接头L1代表基团：
§-NH-(CH2)2-§§；
§-NH-(CH2)6-§§；
§-NH-(CH2)2-O-(CH2)2-§§；
§-NH-CH(COOH)-(CH2)4-§§
§-NH-NH-C(＝O)-(CH2)5-§§；
§-NH-(CH2)2-C(＝O)-O-(CH2)2-§§；
§-NH-(CH2)2-C(＝O)-NH-(CH2)2-§§；
§-NH-(CH2)2-NH-C(＝O)-CH2-§§；
§-NH-(CH2)3-NH-C(＝O)-CH2-§§；
§-NH-(CH2)2-NH-C(＝O)-(CH2)2-§§；
§-NH-(CH2)2-NH-C(＝O)-(CH2)5-§§；
§-NH-(CH2)2-NH-C(＝O)-CH(CH3)-§§；
§-NH-(CH2)2-O-(CH2)2-NH-C(＝O)-CH2-§§；
§-NH-CH(COOH)-CH2-NH-C(＝O)-CH2-§§；
§-NH-CH(COOH)-(CH2)2-NH-C(＝O)-CH2-§§；
§-NH-CH(COOH)-(CH2)4-NH-C(＝O)-CH2-§§；
§-NH-CH(COOH)-CH2-NH-C(＝O)-(CH2)2-§§；
§-NH-(CH2)2-NH-C(＝O)-CH(C2H4COOH)-§§；
§-NH-(CH2)2-NH-C(＝O)-((CH2)2-O)3-(CH2)2-§§；
§-NH-(CH2)2-S(＝O)2-(CH2)2-NH-C(＝O)-CH2-§§；
§-NH-(CH2)2-NH-C(＝O)-CH2-NH-C(＝O)-CH2-§§；
§-NH-(CH2)3-NH-C(＝O)-CH2-NH-C(＝O)-CH2-§§；
§-NH-CH(COOH)-CH2-NH-C(＝O)-CH(CH2COOH)-§§；
§-NH-(CH2)2-NH-C(＝O)-CH(C2H4COOH)-NH-C(＝O)-CH2-§§；
§-NH-CH(COOH)-CH2-NH-C(＝O)-(CH2)2-NH-C(＝O)-CH2-§§；
§-NH-(CH2)2-NH-C(＝O)-(CH2)2-CH(COOH)-NH-C(＝O)-CH2-§§；
§-NH-CH(COOH)-CH2-NH-C(＝O)-CH(CH2OH)-NH-C(＝O)-CH2-§§；
§-NH-CH[C(＝O)-NH-(CH2)2-O)4-(CH2)2COOH]-CH2-NH-C(＝O)-CH2-§§；
§-NH-CH(COOH)-CH2-NH-C(＝O)-((CH2)2-O)4-(CH2)2-NH-C(＝O)-CH2-§§；
§-NH-(CH2)4-CH(COOH)-NH-C(＝O)-CH(CH3)-NH-C(＝O)-CH(异C3H7)-§§；
§-NH-(CH2)4-CH(COOH)-NH-C(＝O)-CH(CH3)-NH-C(＝O)-CH(异C3H7)-NH-C(＝O)-(CH2)5-§§；
§-NH-(CH2)2-C(＝O)-NH-(CH2)4-CH(COOH)-NH-C(＝O)-CH(CH3)-NH-C(＝O)-CH(异C3H7)-NH-C(＝O)-CH2-§§；
§-NH-(CH2)2-C(＝O)-NH-(CH2)4-CH(COOH)-NH-C(＝O)-CH(CH3)-NH-C(＝O)-CH(异C3H7)-NH-C(＝O)-(CH2)5-§§；
§-NH-(CH2)4-CH(COOH)-NH-C(＝O)-CH[(CH2)3-NH-C(＝O)-NH2]-NH-C(＝O)-CH(异C3H7)-NH-C(＝O)-(CH2)5-§§；
§-NH-(CH2)2-NH-C(＝O)-(CH2)2-CH(COOH)-NH-C(＝O)-CH(CH3)-NH-C(＝O)-CH(异C3H7)-NH-C(＝O)-(CH2)5-§§；
§-NH-CH(CH3)-C(＝O)-NH-(CH2)4-CH(COOH)-NH-C(＝O)-CH(CH3)-NH-C(＝O)-CH(异C3H7)-NH-C(＝O)-(CH2)5-§§；
§-NH-(CH2)2-C(＝O)-NH-(CH2)4-CH(COOH)-NH-C(＝O)-CH[(CH2)3-NH-C(＝O)-NH2]-NH-C(＝O)-CH(异C3H7)-NH-C(＝O)-(CH2)5-§§；
§-NHC(＝O)-NH-(CH2)2-§§；
§-NHC(＝O)-NH-(CH2)2-NH-C(＝O)-CH2-§§；
§-NHC(＝O)-NH-(CH2)4-CH(COOH)-NH-C(＝O)-CH[(CH2)3-NH-C(＝O)-NH2]-NH-C(＝O)-CH(异C3H7)-NH-C(＝O)-(CH2)5-§§；
§-NHC(＝O)-NH-(CH2)4-CH(COOH)-NH-C(＝O)-CH[(CH2)3-NH-C(＝O)-NH2]-NH-C(＝O)-CH(异C3H7)-NH-C(＝O)-(CH2)5-§§；
§-NHC(＝O)-NH-(CH2)4-CH(COOH)-NH-C(＝O)-CH(CH3)-NH-C(＝O)-CH(异C3H7)-NH-C(＝O)-(CH2)5-§§；
§-NH-(CH2)2-C(＝O)-NH-CH(异C3H7)-C(＝O)-NH-CH[(CH2)3-NH-C(＝O)-NH2]-C(＝O)-OC(＝O)-CH2-§§；
§-NH-(CH2)2-C(＝O)-NH-CH(异C3H7)-C(＝O)-NH-CH(CH3)-C(＝O)-OC(＝O)-CH2-§§；
§-NH-(CH2)2-NH-C(＝O)§§；
§-NH-CH(COOH)-CH2-NH-C(＝O)§§；
§-NH-(CH2)2-C(＝O)-NH-CH(CH3)-C(＝O)-NH-CH[(CH2)3-NH-C(＝O)-NH2]-C(＝O)-NH§§；
§-(CH2)2-C(＝O)-NH-(CH2)2-§§；
§-(CH2)2-C(＝O)-NH-(CH2)2-NH-C(＝O)-CH2-§§；
§-CH(CH3)-NH-C(＝O)-CH(异C3H7)-§§；
§-CH(CH3)-NH-C(＝O)-CH(异C3H7)-NH-C(＝O)-CH2-§§；
§-CH(CH3)-NH-C(＝O)-CH(异C3H7)-NH-C(＝O)-(CH2)5-§§；
§-(CH2)2-C(＝O)-NH-((CH2)2-O)4-(CH2)2-NH-C(＝O)-CH2-§§；
§-CH(CH3)-NH-C(＝O)-CH(异C3H7)-NH-C(＝O)-((CH2)2-O)4-(CH2)2-NH-C(＝O)-(CH2)2-§§；
§NH-C(＝O)-CH(CH3)-NH-C(＝O)-CH(异C3H7)-NH-C(＝O)-((CH2)2-O)4-(CH2)2-NH-C(＝O)-(CH2)2-§§；
§-CH2-S-(CH2)2-C(＝O)-NH-(CH2)2-§§；
§-CH2-S-(CH2)5-C(＝O)-NH-(CH2)2-§§；
§-CH2-S-CH2CH(COOH)-NH-C(＝O)-CH2-§§；
§-CH2-S-CH2CH(COOH)-NH-C(＝O)-(CH2)5-§§；
§-CH2-S-(CH2)2-C(＝O)-NH-((CH2)2-O)2-(CH2)2-§§；
§-CH2-S-(CH2)2-C(＝O)-NH-((CH2)2-O)2-(CH2)5-§§；
§-CH2-S-(CH2)2-C(＝O)-NH-(CH2)2-NH-C(＝O)-CH2-§§；
§-CH2-S-(CH2)2-C(＝O)-NH-(CH2)2-NH-C(＝O)-CH5-§§；
§-CH2-S-(CH2)2-C(＝O)-NH-CH(COOH)-CH2-NH-C(＝O)-CH2-§§；
§-CH2-S-CH2CH(NH2)-C(＝O)-NH-(CH2)2-NH-C(＝O)-(CH2)5-§§；
§-CH2-S-(CH2)2-C(＝O)-NH-((CH2)2-O)2-(CH2)2-NH-C(＝O)-CH2-§§；
§-CH2-S-(CH2)2-C(＝O)-NH-((CH2)2-O)4-(CH2)2-NH-C(＝O)-CH2-§§；
§-CH2-S-(CH2)2-C(＝O)-NH-((CH2)2-O)2-(CH2)2-NH-C(＝O)-(CH2)5-§§；
§-CH2-S-(CH2)2-C(＝O)-NH-((CH2)2-O)4-(CH2)2-NH-C(＝O)-(CH2)5-§§；
§-CH2-S-CH2CH(COOH)-NH-C(＝O)-((CH2)2-O)2-(CH2)2-NH-C(＝O)-CH2-§§；
§-CH2-S-CH2CH(COOH)-NH-C(＝O)-((CH2)2-O)4-(CH2)2-NH-C(＝O)-CH2-§§；
§-CH2-S-CH2CH(COOH)-NH-C(＝O)-((CH2)2-O)4-(CH2)2-NH-C(＝O)-(CH2)2-§§；
§-CH2-S-(CH2)2-CH(COOH)-NH-C(＝O)-((CH2)2-O)4-(CH2)2-NH-C(＝O)-(CH2)2-§§；
§-CH2-S-(CH2)2-C(＝O)-NH-CH(C2H4COOH)-C(＝O)-NH-(CH2)2-NH-C(＝O)-CH2-§§；
§-CH2-S-CH2CH[NH-C(＝O)-(CH2)2-COOH]-C(＝O)-NH-(CH2)2-NH-C(＝O)-CH2-§§；
§-CH2-S-CH2CH[NH-C(＝O)-((CH2)2-O)4-CH3]-C(＝O)-NH-(CH2)2-NH-C(＝O)-CH2-§§；
§-CH2-S-CH2CH(COOH)-NH-C(＝O)-CH(CH3)-NH-C(＝O)-CH(异C3H7)-NH-C(＝O)-CH2-§§；
§-CH2-S-CH2CH[NH-C(＝O)-(CH2)2-COOH]-C(＝O)-NH-(CH2)2-S(＝O)2-(CH2)2-NH-C(＝O)-CH2-§§；
§-CH2-S-CH2CH[NH-C(＝O)-(CH2)2-COOH]-C(＝O)-NH-((CH2)2-O)4-(CH2)2-NH-C(＝O)-CH2-§§；
§-CH2-S-CH2CH[C(＝O)-NH-(CH2)2-COOH]-NH-C(＝O)-((CH2)2-O)4-(CH2)2-NH-C(＝O)-CH2-§§；
§-CH2-S-CH2CH[C(＝O)-NH-(CH2)2-COOH]-NH-C(＝O)-((CH2)2-O)4-(CH2)2-NH-C(＝O)-(CH2)2-§§；
§-CH2-S-CH2CH(COOH)-NH-C(＝O)-(CH2)2CH(COOH)-NH-C(＝O)-((CH2)2-O)4-(CH2)2-NH-C(＝O)-CH2-§§
或
§-CH2-S-CH2CH(COOH)-NH-C(＝O)-CH[(CH2)2-COOH]-NH-C(＝O)-((CH2)2-O)4-(CH2)2-NH-C(＝O)-(CH2)2-§§，
其中
§代表与活性化合物分子连接的键，以及
§§代表与抗体连接的键，以及
异C3H7代表异丙基基团；
及其盐、溶剂合物、溶剂合物的盐和差向异构体。
21.权利要求1至18中一项或多项的缀合物，其中所述缀合物具有下式中的一种：
其中
AK1代表经胱氨酸连接的发挥适度的激动作用或非激动作用的抗-TWEAKR抗体，以及AK2代表经赖氨酸连接的发挥适度的激动作用或非激动作用的抗-TWEAKR抗体，以及
n代表1至20的数。
22.前述权利要求中一项或多项的缀合物，其中发挥适度的激动作用或非激动作用的抗-TWEAKR抗体是ITEM-4或ITEM-4抗体的嵌合或人源化变体或其抗原结合片段。
23.前述权利要求中一项或多项的缀合物，其中发挥适度的激动作用或非激动作用的抗-TWEAKR抗体或其抗原结合片段包括：
可变重链，其包含如SEQ ID NO：2所示的重链的可变CDR1序列、如SEQ ID NO：3所示的重链的可变CDR2序列、如SEQ ID NO：4所示的重链的可变CDR3序列，和
可变轻链，其包含如SEQ ID NO：6所示的轻链的可变CDR1序列、如SEQ ID NO：7所示的轻链的可变CDR2序列、如SEQ ID NO：8所示的轻链的可变CDR3序列，或
可变重链，其包含如SEQ ID NO：12所示的重链的可变CDR1序列、如SEQ ID NO：13所示的重链的可变CDR2序列、如SEQ ID NO：14所示的重链的可变CDR3序列，和
可变轻链，其包含如SEQ ID NO：16所示的轻链的可变CDR1序列、如SEQ ID NO：17所示的轻链的可变CDR2序列、如SEQ ID NO：18所示的轻链的可变CDR3序列，或
可变重链，其包含如SEQ ID NO：22所示的重链的可变CDR1序列、如SEQ ID NO：23所示的重链的可变CDR2序列、如SEQ ID NO：24所示的重链的可变CDR3序列，和
可变轻链，其包含如SEQ ID NO：26所示的轻链的可变CDR1序列、如SEQ ID NO：27所示的轻链的可变CDR2序列、如SEQ ID NO：28所示的轻链的可变CDR3序列，或
可变重链，其包含如SEQ ID NO：32所示的重链的可变CDR1序列、如SEQ ID NO：33所示的重链的可变CDR2序列、如SEQ ID NO：34所示的重链的可变CDR3序列，和
可变轻链，其包含如SEQ ID NO：36所示的轻链的可变CDR1序列、如SEQ ID NO：37所示的轻链的可变CDR2序列、如SEQ ID NO：38所示的轻链的可变CDR3序列，或
可变重链，其包含如SEQ ID NO：52所示的重链的可变CDR1序列、如SEQ ID NO：53所示的重链的可变CDR2序列、如SEQ ID NO：54所示的重链的可变CDR3序列，和
可变轻链，其包含如SEQ ID NO：56所示的轻链的可变CDR1序列、如SEQ ID NO：57所示的轻链的可变CDR2序列、如SEQ ID NO：58所示的轻链的可变CDR3序列，或
可变重链，其包含如SEQ ID NO：62所示的重链的可变CDR1序列、如SEQ ID NO：63所示的重链的可变CDR2序列、如SEQ ID NO：64所示的重链的可变CDR3序列，和
可变轻链，其包含如SEQ ID NO：66所示的轻链的可变CDR1序列、如SEQ ID NO：67所示的轻链的可变CDR2序列、如SEQ ID NO：68所示的轻链的可变CDR3序列，或
可变重链，其包含如SEQ ID NO：72所示的重链的可变CDR1序列、如SEQ ID NO：73所示的重链的可变CDR2序列、如SEQ ID NO：74所示的重链的可变CDR3序列，和
可变轻链，其包含如SEQ ID NO：76所示的轻链的可变CDR1序列、如SEQ ID NO：77所示的轻链的可变CDR2序列、如SEQ ID NO：78所示的轻链的可变CDR3序列，或
可变重链，其包含如SEQ ID NO：82所示的重链的可变CDR1序列、如SEQ ID NO：83所示的重链的可变CDR2序列、如SEQ ID NO：84所示的重链的可变CDR3序列，和
可变轻链，其包含如SEQ ID NO：86所示的轻链的可变CDR1序列、如SEQ ID NO：87所示的轻链的可变CDR2序列、如SEQ ID NO：88所示的轻链的可变CDR3序列。
24.前述权利要求中一项或多项的缀合物，其中发挥适度的激动作用或非激动作用的抗-TWEAKR抗体或其抗原结合片段包括：
如SEQ ID NO：1所示的重链的可变序列和如SEQ ID NO：5所示的轻链的可变序列，或
如SEQ ID NO：11所示的重链的可变序列和如SEQ ID NO：15所示的轻链的可变序列，或
如SEQ ID NO：21所示的重链的可变序列和如SEQ ID NO：25所示的轻链的可变序列，或
如SEQ ID NO：31所示的重链的可变序列和如SEQ ID NO：35所示的轻链的可变序列，或
如SEQ ID NO：51所示的重链的可变序列和如SEQ ID NO：55所示的轻链的可变序列，或
如SEQ ID NO：61所示的重链的可变序列和如SEQ ID NO：65所示的轻链的可变序列，或
如SEQ ID NO：71所示的重链的可变序列和如SEQ ID NO：75所示的轻链的可变序列，或
如SEQ ID NO：81所示的重链的可变序列和如SEQ ID NO：85所示的轻链的可变序列。
25.前述权利要求中的一项的缀合物，其中发挥适度的激动作用或非激动作用的抗-TWEAKR抗体是IgG抗体。
26.前述权利要求中一项或多项的缀合物，其中发挥适度的激动作用或非激动作用的抗-TWEAKR抗体包括：
如SEQ ID NO：9所示的重链的序列和如SEQ ID NO：10所示的轻链的序列，或
如SEQ ID NO：19所示的重链的序列和如SEQ ID NO：20所示的轻链的序列，或
如SEQ ID NO：29所示的重链的序列和如SEQ ID NO：30所示的轻链的序列，或
如SEQ ID NO：39所示的重链的序列和如SEQ ID NO：40所示的轻链的序列，或
如SEQ ID NO：59所示的重链的序列和如SEQ ID NO：60所示的轻链的序列，或
如SEQ ID NO：69所示的重链的序列和如SEQ ID NO：70所示的轻链的序列，或
如SEQ ID NO：79所示的重链的序列和如SEQ ID NO：80所示的轻链的序列，或
如SEQ ID NO：89所示的重链的序列和如SEQ ID NO：90所示的轻链的序列。
27.药物组合物，其包含与惰性无毒的药学上合适的助剂结合的权利要求1至26中一项或多项的缀合物。
28.权利要求1至26中一项或多项的缀合物，其用于治疗和/或预防疾病的方法中。
29.权利要求1至26中一项或多项的缀合物，其用于治疗过度增殖和/或血管生成病症的方法中。
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