CN107789631A - 抗人ErbB2双表位抗体‑药物偶联物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抗人ErbB2双表位抗体‑药物偶联物及其用途。本发明提供的抗人ErbB2双表位抗体‑药物偶联物包含双特异性抗HER2抗体以及与所述双特异性抗HER2抗体相偶联的药物部分；所述药物部分中含有一种、两种或两种以上药物。本发明所提供的抗人ErbB2双特异性抗体‑药物偶联物具有良好的抗肿瘤作用，体外实验结果表明，与已经上市的用于治疗HER‑2阳性晚期转移性乳腺癌的T‑DM1(商品名Kadcyla)相比，在乳腺癌细胞株中，本发明所提供的抗人ErbB2双特异性抗体‑药物偶联物，在抑制肿瘤细胞生长方面的效果均优于Kadcyla，因而具有良好的医药运用前景。

Description

抗人ErbB2双表位抗体-药物偶联物及其应用

技术领域

本发明属于生物技术与化学技术领域，涉及抗人ErbB2双表位抗体-药物偶联物及其应用，具体涉及抗HER2结合分子(例如，抗体及其抗原结合片段)、衍生的HER2结合分子(例如，双特异性抗HER2抗体)以及结合HER2受体的细胞外结构域的抗体药物轭合物(ADC)。另外，本发明还涉及该抗体-小分子药物偶联物的制备方法以及用于治疗与HER2介导的信号转导相关联的疾病的用途。

背景技术

ErbB2受体又称HER2或P185，是一种糖蛋白，属于I型受体酪氨酸激酶家族中的表皮生长因子受体(ErbB/HER)家族，该家族还拥有以下成员：ErbB1/HER1/EGFR、ErbB3/HER3和ErbB4/HER4。HER家族成员在细胞生理过程中发挥重要调节作用，通过配体结合或相互之间形成二聚体介导信号转导。ErbB2受体与肿瘤的发生发展密切相关，在乳腺癌、肺癌、胰腺癌、卵巢癌等多数癌症中都可以检测到ErbB2原癌基因扩增或者蛋白过表达的现象。同时，ErbB2还经常被用来作为一些肿瘤重要的预后判定指标，例如乳腺癌，ErbB2过表达的肿瘤往往预后效果差。因此，ErbB2已经成为肿瘤靶向治疗的一个重要靶点。

靶向ErbB2治疗的药物主要包括小分子酪氨酸蛋白激酶抑制剂如Lapatinib等和各种形式的抗体药物，其中抗体药物以其高特异性、高亲和力、低体内代谢速率、低毒性以及抑制机制多样等优点，成为抗肿瘤生物药研发的热点。随着人源化抗体技术的出现以及发展，近年来已经出现了商品化的抗人ErbB2的人源化抗体，其中较成功的是曲妥珠单抗(商品名Herceptin，英文名Trastuzumab/Herceptin)和帕妥珠单抗(商品名Perjeta，英文名Pertuzumab)这两种人源化抗。尽管如此，由于原发性或者继发性肿瘤耐药性以及肿瘤异质性，依靠单一表位抗体以及抗体自身的生理作用来达到抑制肿瘤生长的已经越来越困难。

抗体偶联药物(antibody-drug conjugate，ADC)是一种新型的靶向性药物治疗方法，是将抗体与具有强细胞毒性的小分子化药偶联而成，兼具小分子药物强大的杀伤力和单抗高度的靶向性，因而成为肿瘤靶向治疗的研究和发展热点。ADC一般包括采用一定方式连接的三个部分：抗体、连接子(Linker)和小分子化药。ADC的靶向性来自其中抗体部分，毒性主要来自小分子化药，抗体部分也可以带有毒性。抗体部分与肿瘤细胞表面抗原结合后，被内吞进入细胞，之后ADC药物会在溶酶体中分解，释放出有活性的化药毒物，破坏DNA或阻止肿瘤细胞分裂，最终杀死肿瘤细胞。ADC相对其他治疗方式具有以下特点：治疗效力强；肿瘤细胞特异度高，误杀率低，治疗安全窗口更大；免疫原性弱，不容易产生抗药性；血清中循环时间长(短于裸抗)；对非靶点细胞毒性弱。

ADC的概念最早始于德国化学家、诺贝尔医学奖得主Paul Erlich在1913年的Magic Bullet设想。最早获FDA审批的ADC药物为辉瑞Mylotarg，于2000年上市用于治疗急性髓细胞样白血病(AML)，于2016年6月由于临床试验显示该药反而增加了死亡率而退市。目前在市的ADC药物仅有两款，罗氏旗下Genentech的Kadcyla(Ado-曲妥珠单抗-emtansine；T-DM1)和Seattle Genetics的Adcetris(brentuximab vedutin)。以Kadcyla为例，Kadcyla(Ado-曲妥珠单抗-emtansine；T-DM1)是曲妥珠单抗(商品名Herceptin，英文名Trastuzumab/Herceptin)与DM1(一种美坦辛衍生物，微管抑制剂)通过一硫醚连接子(MCC)连接，主要用于治疗HER2阳性的晚期乳腺癌患者。临床研究结果表明，偶联上化药的T-DM1相对于原裸抗Herceptin使病人的生存期几乎翻倍，尽管二者的临床条件并不一样。但是T-DM1在被FDA批准时有一个黑框警告，提醒患者与卫生保健专业人员该药物可导致肝毒性、心脏毒性和死亡。这主要是脱落的DM1以及T-DM1进入体内降解释放出DM1小分子引起的。

因此，本领域的技术人员一直在致力于寻找新的、更有效的抗体-药物偶联物。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种新的抗体-药物偶联物。

本发明所提供的抗体-药物偶联物，包含双特异性抗HER2抗体以及与所述双特异性抗HER2抗体相偶联的药物部分；所述药物部分中含有一种、两种或两种以上药物。

其中，所述双特异性抗HER2抗体含有第一免疫球蛋白抗原结合结构域和第二免疫球蛋白抗原结合结构域。所述第一免疫球蛋白抗原结合结构域和第二免疫球蛋白抗原结合结构域能够结合到HER2抗原上的不同HER2抗体结合位点。所述第一免疫球蛋白抗原结合结构域能够结合到HER2抗原上的第一HER2抗体结合位点，所述第一HER2抗体结合位点为HER2抗原上位于结构域I的表位，且所述第一HER2抗体结合位点与帕妥珠单抗的抗体结合位点不同。

进一步地，所述第一免疫球蛋白抗原结合结构域包含轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)；所述轻链可变区(VL)可为HuA21抗体的轻链可变区(VL)，所述重链可变区(VH)可为HuA21抗体的重链可变区(VH)。

具体的，所述HuA21抗体的轻链可变区(VL)的氨基酸序列如SEQ ID No.1的第21-134位所示，所述HuA21抗体的重链可变区(VH)的氨基酸序列如SEQ ID No.1的第155-274位所示。

进一步地，所述第一免疫球蛋白抗原结合结构域和所述第二免疫球蛋白抗原结合结构域均可包含以下各项或由其组成：(a)重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)；；(b)单链抗体(scFv)；(c)双体抗体；(d)小抗体；(e)F(ab’)2；(f)F(ab)。

进一步地，所述第一免疫球蛋白抗原结合结构域和所述第二免疫球蛋白抗原结合结构域均可为单克隆抗体、人源化抗体、人抗体、嵌合抗体、或亲和力优化的抗体。

进一步的，所述第一免疫球蛋白抗原结合结构域和所述第二免疫球蛋白抗原结合结构域特异性结合至不同HER2表位。

进一步地，所述第二免疫球蛋白抗原结合结构域能够结合到HER2抗原上与曲妥珠单抗的抗体结合位点相同的表位。

进一步地，所述双特异性抗HER2抗体中，所述第一免疫球蛋白抗原结合结构域和所述第二免疫球蛋白抗原结合结构域的连接关系为如下(a1)或(a2)：

(a1)所述第一免疫球蛋白抗原结合结构域被共价连接至所述第二免疫球蛋白抗原结合结构域的重链的氨基末端；

(a2)所述第二免疫球蛋白抗原结合结构域被共价连接至所述第一免疫球蛋白抗原结合结构域的重链的氨基末端。

在(a1)中，所述第二免疫球蛋白抗原结合结构域的重链包含恒定区，该恒定区包含Fc结构域；在(a2)中，所述第一免疫球蛋白抗原结合结构域的重链包含恒定区，该恒定区包含Fc结构域。

再进一步地，所述双特异性抗HER2抗体由彼此相关联的第一多肽链和第二多肽链组成。

其中，所述第一多肽链(重链)的结构可选自如下(b1)-(b6)中任一：

(b1)[AscFv]-[L]-[BVH]-[BCH]-[Fcx]

(b2)[AscFv]-[L]-[L]-[BVH]-[BCH]-[Fcx]

(b3)[AscFv]-[L]-[L]-[L]-[BVH]-[BCH]-[Fcx]

(b4)[BscFv]-[L]-[AVH]-[ACH]-[Fcx]

(b5)[BscFv]-[L]-[L]-[AVH]-[ACH]-[Fcx]

(b6)[BscFv]-[L]-[L]-[L]-[AVH]-[ACH]-[Fcx]

[AscFv]表示以scFv形式存在的所述第一免疫球蛋白抗原结合结构域；

[BscFv]表示以scFv形式存在的所述第二免疫球蛋白抗原结合结构域；

[AVH]和[ACH]分别表示所述第一免疫球蛋白抗原结合结构域的重链可变区(VH)和重链恒定区1(CH1)；

[BVH]和[BCH]分别表示所述第二免疫球蛋白抗原结合结构域的重链可变区(VH)和重链恒定区1(CH1)；

[L]表示连接肽；

[Fcx]表示Fc结构域。

所述第二多肽链(轻链)的结构可选自如下(c1)或(c2)：

(c1)[AVL]-[CL]；

(c2)[BVL]-[CL]；

[AVL]-[CL]表示所述第一免疫球蛋白抗原结合结构域的轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)；

[BVL]-[CL]表示所述第二免疫球蛋白抗原结合结构域的轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)。

轻链恒定区(CL)选自：人κ恒定区、人λ恒定区。

所述第一多肽链(重链)和所述第二多肽链(轻链)之间通过二硫键连接。

更进一步地，所述第一免疫球蛋白抗原结合结构域是scFv，包含：SEQ ID No.1的第21-134位所示的HuA21抗体的轻链可变区(VH区)和SEQ ID No.1的第155-274位所示的HuA21抗体的重链可变区(VL区)。所述第二免疫球蛋白抗原结合结构域能够特异性结合至与曲妥珠单抗相同的HER2表位。

在本发明第一个实施例中，所述双特异性抗HER2抗体具体是通过在曲妥珠单抗的重链N端通过连接肽连接上抗HER2的单链抗体后得到的；

所述单链抗体中的重链可变区为HuA21抗体的重链可变区；所述单链抗体中的轻链可变区为HuA21抗体的轻链可变区；所述连接肽的氨基酸序列为SEQ ID No.1的第275-289位。

更加具体的，所述双特异性抗HER2抗体的重链的氨基酸序列具体如SEQ ID No.1所示，轻链的氨基酸序列具体如SEQ ID No.2所示。

所述双特异性抗HER2抗体可按照包括如下步骤的方法制备获得：

(1)将所述双特异性抗HER2抗体的重链的编码基因(SEQ ID No.3)和所述抗人ErbB2双特异性抗体的轻链的编码基因(SEQ ID No.4)分别克隆到pcDNA3.4载体中后得到的两个重组质粒(即前文所述的两个重组质粒pcDNA3.4(A_3LHVHCH)和pcDNA3.4(A_3LHVLCL))。

(2)将步骤(1)所得的两个重组质粒共转染受体细胞，得到重组细胞，培养所述重组细胞，获得所述双特异性抗HER2抗体。

所述方法中，可以用亲和层析的方法对所述双特异性抗HER2抗体进行分离和纯化，利用此方法可以将双特异性抗体纯化为基本均一的物质，例如在SDS-PAGE电泳上为单一条带。

在本发明中，以上所述受体细胞可为哺乳动物细胞或昆虫细胞。所述哺乳动物细胞具体如人肾上皮细胞系HEK293F。

在所述抗体-药物偶联物中，所述药物可选自如下：细胞毒素、放射性同位素、免疫调节剂、细胞因子、淋巴因子、趋化因子、生长因子、肿瘤坏死因子、激素、激素拮抗剂、酶、寡核苷酸、DNA、RNA、siRNA、RNAi、微小RNA、光敏治疗剂、抗血管生成剂、促凋亡剂、肽、脂质、碳水化合物、螯合剂或其组合；

进一步地，所述细胞毒素可为美登素衍生物(如DM1，DM4)、奥瑞他汀、多拉司他汀、微管溶素或吡咯并苯并二氮杂(PBD)。

在本发明的实施例中，所述药物具体为如下三种中的任一种：单甲基澳瑞他汀D(Monomethyl Dolastatin D，MMAD)、单甲基澳瑞他汀E(Monomethyl auristatin E，MMAE)和美登素衍生物DM1。

在本发明中，所述双特异性抗HER2抗体通过PY-VC-PAB偶联MMAD。

在本发明中，所述双特异性抗HER2抗体通过MC-VC-PAB偶联MMAE。

在本发明中，所述双特异性抗HER2抗体通过MAL-EBE-MAL偶联DM1。

更加具体的，在本发明中，所述抗体-药物偶联物是按照包括如下步骤的方法制备获得的：先采用三(2-羧乙基)膦(TCEP)对所述双特异性抗HER2抗体进行还原处理；然后向处理过的所述双特异性抗HER2抗体中加入MAL-EBE-MAL-DM1、MC-VC-PAB-MMAE或PY-VC-PAB-MMAD进行反应(如在25℃搅拌反应2h)。

本发明所提供的所述抗体-药物偶联物在制备抗肿瘤药物或肿瘤细胞增殖抑制剂中的应用也属于本发明的保护范围。

其中，所述肿瘤细胞具体可为乳腺癌细胞、卵巢癌细胞或胃癌细胞等。

进一步地，所述肿瘤细胞不仅包括HER2高表达的细胞株如NCI-N87，还包括HER2中低表达的细胞株例如MDA-MB-453，尤其是在JIMT-1这一类Herceptin耐药性细胞株里面也表现出很好的抑制肿瘤细胞生长的效果。

更加具体的，在本发明的一个实施例中，所述肿瘤细胞选自如下：SKBR3、SKOV3、NCI-N87、MDA-MB-361、MDA-MB-453、JIMT-1。

本发明所提供的抗人ErbB2双特异性抗体-药物偶联物能够在结合至HER2靶标时诱导内化，在内化之后促进有效的溶酶体运输，诱导HER2靶标降解，阻断低HER2表达癌症细胞中的配体诱导的AKT磷酸化，破坏配体诱导的HER2:HER3二聚化。

本发明所提供的抗人ErbB2双特异性抗体-药物偶联物具有良好的抗肿瘤作用，体外实验结果表明，与已经上市的用于治疗HER-2阳性晚期转移性乳腺癌的T-DM1(商品名Kadcyla)相比，在乳腺癌细胞株中，本发明所提供的抗人ErbB2双特异性抗体-药物偶联物，在抑制肿瘤细胞生长方面的效果均优于Kadcyla，因而具有良好的医药运用前景。

附图说明

图1为双特异性抗体结构示意图。

图2为双特异性抗体SDS-PAGE图。左图为还原条件下的SDS-PAGE图，右图为非还原条件下的SDS-PAGE图。

图3为ELISA方法测定双特异性抗体与抗原结合特性。

图4为免疫荧光方法检测双特异性抗体与肿瘤细胞结合和内吞。

图5为ELISA法测定抗体-小分子药物偶联物对抗原的结合特性。

图6为抗体-小分子药物偶联物对抗原的竞争性试验结果。左图为A_3LH、A_3LH-DM1、A_3LH-MMAE、A_3LH-MMAD对Herceptin结合位点的竞争实验结果；右图为A_3LH、A_3LH-DM1、A_3LH-MMAE、A_3LH-MMAD对HuA21结合位点的竞争实验结果。

图7为流式细胞术检测细胞表面抗原的内化效率。图中的ADC-DM1、ADC-MMAE、ADC-MMAD分别表示A_3LH-DM1、A_3LH-MMAE、A_3LH-MMAD。

图8为CCK-8方法测定抗体-小分子药物偶联物抑制肿瘤细胞增殖作用。A：A_3LH-DM1、A_3LH-MMAE、A_3LH-MMAD对SKBR3乳腺癌细胞株的增殖抑制实验结果；B：A_3LH-DM1、A_3LH-MMAE、A_3LH-MMAD对SKOV3卵巢癌细胞株的增殖抑制实验结果；C：A_3LH-DM1、A_3LH-MMAE、A_3LH-MMAD对NCI-N87胃癌细胞株的增殖抑制实验结果；D：A_3LH-DM1、A_3LH-MMAE、A_3LH-MMAD对MDA-MB-361乳腺癌细胞株的增殖抑制实验结果；E：A_3LH-DM1、A_3LH-MMAE、A_3LH-MMAD乳腺癌细胞株的增殖抑制实验结果；F：A_3LH-DM1、A_3LH-MMAE、A_3LH-MMAD对JIMT-1乳腺癌细胞株的增殖抑制实验结果。图中的ADC-DM1、ADC-MMAE、ADC-MMAD分别表示A_3LH-DM1、A_3LH-MMAE、A_3LH-MMAD。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

在描述本发明之前，应当理解本发明不限于所述的具体方法和实验条件，因为这类方法和条件可以变动。还应当理解本文所用的术语其目的仅在于描述所述的具体实施方案，并且不意图是限制性的。

除非另外定义，否则本文中所使用的全部技术和科学术语均具有与本领域普通技术人员通常理解的相同含义，相关的定义和术语可参见例如Current Protocols inMolecular Biology(Ausubel)。其中所用到的氨基酸残基的缩写都是文献中标准的三字母或者单字母表示法，代表着20中普通L型-氨基酸中的一个。

如本文所用，术语“抗体药物偶联物”“抗体偶联物”“抗体-药物偶联物”“免疫偶联物”“抗体-小分子药物偶联物”可互换，指抗体或其活性片段与药物形成的偶联物。

如本文所用，术语“本发明的抗体药物偶联物”“本发明的抗体与药物偶联物”或者“本发明的ADC”可互换使用，指靶向人HER2的本发明抗体或其活性片段与药物形成的偶联物。

在本文中，ErbB2和HER2可以互相使用，二者均表示天然序列的人HER2蛋白(Genebank登录号：X03363，参见例如Semba等人，1985，PNAS，82:6497-6501；和Yamamoto等人，1986，Nature,319:230-234)及其功能衍生物，例如氨基酸序列变体。

本发明中优选的HER2是天然来源的人HER2。

术语“双特异性抗体”和“双表位抗体”可互换使用，是由第一个抗体(片段)和第二个抗体(片段)通过偶联臂所形成的偶联物，该偶联物保留了各自抗体的活性和抗原识别表位，故具有双功能和双特异性。

实施例1、用于表达抗人ErbB2双特异性抗体的重组载体的构建

抗人ErbB2单克隆抗体Trastuzumab(IgG1,κ)的序列来自于Genentech公司的专利US5821337，抗人ErbB2单克隆抗体HuA21是由合肥瀚科迈博生物技术有限公司自行创建，其序列来自专利ZL201410489895X，根据两个抗体之间串联顺序以及连接短肽氨基酸数目的不同，分别构建了如下六个双特异性抗体：A_1LH，A_2LH，A_3LH以及H_1LA，H_2LA和H_3LA。

A_1LH，A_2LH，A_3LH是将HuA21的轻重链可变区连接形成的ScFv通过不同长度的linker串联到Herceptin的重链的N端。同理，H_1LA，H_2LA和H_3LA是将Herceptin的轻重链可变区连接形成的ScFv通过不同长度的linker串联到的HuA21的重链的N端。简单来讲，就是讲X抗体的轻重链可变区连接形成的ScFv通过不同长度的linker串联到Y抗体的重链的N端，这里的X，Y抗体指的就是Herceptin和HuA21，其ScFv中连接轻重链可变区的氨基酸序列为GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS，连接ScFv和另一个抗体重链之间的linker的氨基酸序列为GGGGS(记为1L)、GGGGSGGGGS(记为2L)或GGGGSGGGGSGGGGS(记为3L)。双特异性抗体结构示意图如图1所示。

下面以A_3LH为例，详细说明用于表达双特异性抗体的重组载体构建过程：

根据文献中的报道，直接合成Herceptin的重链的核苷酸序列(如SEQ ID No.3的第868-2223位所示)(通用生物)，另外根据HuA21的核苷酸序列直接合成HuA21轻重链可变区连接而成的ScFv的核苷酸序列(如SEQ ID No.3的第61-822位所示(通用生物))。根据Herceptin重链的5’和3’端的核苷酸序列，设计正向引物5’-GAGGTGCAGCTGGTCGAGAG-3’和反向引物5’-CCGAAGCTTTCACTTCCCGGGGCTCAGGCTCAGG-3’，在反向引物中引入了HindⅢ酶切位点(通用生物)。根据HuA21-ScFv的5’和3’端的核苷酸序列设计正向引物5’-AATGGATCCACTGGTGACATCGTTTTGACTCAATCTCC-3’和反向引物5’-GCTCTCGACCAGCTGCACCTCGCTTCCTCCTCCTCCGCTTCCTCCTCCTCCGCTTCCTCCTCCTCCTGAAGAAACAGTAACCAAAGTAC-3’，在正向引物中引入了BamHⅠ酶切位点(通用生物)。另外，前者的正向引物和后者的反向引物中引入一段互补序列，通过这段互补序列，经Overlap PCR将HuA21-ScFv和Herceptin的重链串联到一起，得到A_3LHVH，再经BamHⅠ和HindⅢ双酶切后连接到经同样酶切的pcDNA3.4(Life公司)载体上，经测序验证正确后获得pcDNA3.4(A_3LHVHCH)。PCR反应条件为：94℃5min；94℃30s；59℃30s；72℃2min1 0s，30个循环；72℃10min。

人工合成Herceptin的轻链基因并在两端添加BamHⅠ和HindⅢ识别序列，具体序列为“GGATCC+SEQ ID No.4+AAGCTT”(通用生物)，经BamHⅠ和HindⅢ双酶切后，克隆到经同样双酶切pcDNA3.4载体(Life公司)上，经测序验证正确后获得pcDNA3.4(A_3LHVLCL)。

SEQ ID No.3编码SEQ ID No.1所示的双特异性抗HER2抗体的重链，SEQ ID No.4编码SEQ ID No.2所示的双特异性抗HER2抗体的轻链。

用于表达其他五种双特异性抗体的重组载体构建方法同A_3LH。

实施例2、双特异性抗体的表达和纯化

以A_3LH为例，将pcDNA3.4(A_3LHVHCH)和pcDNA3.4(A_3LHVLCL)同时瞬转到人肾上皮细胞系HEK293F(ATCC美国细胞库)，培养三天后，利用Protein A亲和层析柱从培养上清中纯化抗体蛋白。通过BCA方法对纯化的抗体蛋白进行定量。纯化的抗体分别在还原和非还原条件下利用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测其分子量和纯度。另外，通过毛细管电泳检测了A_3LH的等电点。

结果显示，在还原条件下(10％)，六个双特异性抗体的重链均在75-80KD，轻链大小略有差异，但是也在25-30KD的范围内(图2)。毛细管电泳测等电点的结果显示，A_3LH的等电点在8.5左右(表1)。

表1 A_3LH的等电点结果结果

实施例3、ELISA方法测定双特异性抗体与抗原结合特性

T6-17细胞(美国宾夕法尼亚大学医学院Mark I Greene教授赠予，记载于“王弦,谢小强,曹亮等.T6-17细胞培养上清中肿瘤蛋白P185的表达.细胞与分子免疫学杂志,2008,24(10):1018-1019”一文，公众可从申请人处获得，仅可用于重复本发明实验使用)为小鼠上皮成纤维细胞NIH3T3转入人Her2/ErbB2基因后的稳转细胞株，其细胞膜表面高表达HER2蛋白。将对数生长期的T6-17细胞经胰酶消化培养基重悬以后，1000rpm/min离心5min，取上清，按照1×10⁷个细胞/mL的比例加入细胞裂解液(配方：50mM Tris-HCl pH7.5，150mMNaCl，体积分数1％Triton-100，4mM蛋白酶抑制剂Complete(Roche))重悬，冰上裂解20min，然后，12000rpm/min，离心15min，取上清。裂解液用50mM NaHCO₃pH9.6溶液按照1:1000的体积比进行稀释，每孔100μl包被ELISA板(Nunc公司)，置于4℃孵育过夜；加入含有1％(10g/L)BSA的PBST(PBS+0.1％Tween 20，％表示体积百分含量)置于37℃封闭1h；将待测抗体(前文制备的六种双特异性抗体)及对照抗体(HuA21和Herceptin)，均稀释至1、0.25、0.0625、0.015625、0.003906、0.000977、0.000244、0.000061μg/mL，共8个梯度，每个梯度2个平行孔，每孔100μl加到ELISA板中，室温振荡孵育1h；加入1:8000(体积比)稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗人-IgG(Thermo公司)，每孔100μl，室温振荡温育1h；加入OPD底物显色3-5分钟，最后用1M H₂SO₄终止反应，用BIO-TEK ELX-800酶标仪测量测量OD 490值。根据抗体和抗原反应曲线，采用4参数Logistic拟合方法作图。

结果显示，相对于HuA21，六个双特异性抗体的亲和力均有所减弱，其中H_2LA的减弱较为明显，其他双特异性抗体之间没有太明显的区别。而相对于Herceptin，除H_2LA外，其他抗体对抗原的亲和力均未有明显变化。具体参见图3。

实施例4、免疫荧光方法检测双特异性抗体与肿瘤细胞结合和内吞

体外培养SKBR3或BT474乳腺癌细胞(上海细胞库)至对数生长期，胰酶消化后传至24孔板(Nunc公司)中过夜培养，孔中预先铺有圆形的细胞培养板。次日，将原培养基吸走，分别加入含有10μg/mL的待测抗体(前文制备的六种双特异性抗体)或对照抗体(HuA21、Herceptin和Pertuzumab)的培养基，并处理4小时，之后，再按照以下步骤对细胞进行处理：冰冷PBS洗2次，每遍5min；3.7％甲醛的PTEM(配方：100mM Pipes，pH 6.8，10mM EGTA，1mMMgCl₂，0.2％Triton X-100)处理10min；PBS洗两遍，每遍5min；用含有1％(10g/L)BSA的PBST(配方：PBS+0.1％Tween 20，％表示体积百分含量)4℃封闭过夜；加入10μg/mL FITC标记的羊抗人IgG，室温反应40min-1h，之后，用PBS洗四遍，每遍5min；加入DAPI反应5min，之后，用PBS洗三遍，每遍5min；将细胞培养板从24孔板中取出倒置到加有抗淬灭剂的载玻片上，指甲油封片，最后置于荧光显微镜拍照(Zeiss公司)。

免疫荧光实验结果如图4所示。H_3LA和A_3LH均能与肿瘤细胞表面的ErbB2受体很好的结合，而且在4h时，大量抗体进入到细胞内部，形成吞噬小体，细胞膜上仅存在有少量抗体。然而，HuA21，Herceptin以及Pertuzumab的内吞能力相对来说就比较弱，在4h时，大量抗体仍然只是位于细胞表面，只有极少被内吞到细胞内。以上实验结果表明，本发明中的双特异性抗体在抗体靶向药物(比如抗体-化药偶联物ADC)的研究开发中将会有很好的应用价值。

实施例5、抗体-药物偶联物的制备

首先配制还原剂和保护剂，将还原剂和保护剂用PBS缓冲液进行稀释，配方如下：1-20mmol/L TCEP(三(2-羧乙基)膦)，1-20mmol/L DTPA(二乙基三胺五乙酸)储备液。根据所需要的药物-抗体比，将一定量的上述储备液以一定的浓度(例如5-30mg/ml)和一定的体积比(例如1:1)与抗体进行混合，使得最终反应体系中TCEP与抗体的摩尔比在(0.5-6.0)：1之间。然后将反应体系至于25℃边搅拌边反应2h。反应借宿后，用Ellman试剂DTNB(2-硝基苯甲酸)在波长412nm处检测游离的巯基的浓度，并且计算游离的巯基与抗体之间的摩尔比。用TCEP进行的还原反应具有很好的可再生性，并且生成的游离的巯基的数量可以达到1.0-8.0。

经过TCEP的还原处理以后，抗体可以直接用于接下来的偶联反应。一定浓度的(10mM)小分子药物(MAL-EBE-MAL-DM1、MC-VC-PAB-MMAE、PY-VC-PAB-MMAD)(上海皓源化学科技有限公司)用25％的DMSO(二甲基亚砜)进行稀释，然后按照药物与巯基的摩尔比(0.3-2.8)：1缓慢的加入到前面制备的A_3LH抗体中去，然后在25℃反应2h，反应过程中要注意搅拌。反应结束后，同样用Ellman试剂DTNB(2-硝基苯甲酸)在波长412nm处检测游离的巯基的浓度(接近于零)，残留的未反应的药物以及其他的小分子(如DMSO)通过葡聚糖凝胶柱G-25纯化的方法去除，偶联情况通过SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)、R-HPLC(反相高效液相色谱法)以及疏水作用色谱柱(HIC-HPLC)来确定。

实施例6、抗体-药物偶联物亲和力的测定

将T6-17细胞裂解液(同实施例3)用50mM NaHCO₃pH9.6溶液按照1:1000的体积比进行稀释，每孔100μl包被ELISA板(Nunc公司)，置于4℃孵育过夜；加入含有1％(10g/L)BSA的PBST(PBS+0.1％Tween 20，％表示体积百分含量)置于37℃封闭1h；将待测抗体-药物偶联物【前面制备的3种抗体-药物偶联物，分别为A_3LH-MAL-EBE-MAL-DM1(简称A_3LH-DM1)，A_3LH-MC-VC-PAB-MMAE(简称A_3LH-MMAE)，A_3LH-PY-VC-PAB-MMAD(简称A_3LH-MMAD)】及对照抗体(A_3LH)均稀释至10、2.5、0.625、0.15625、0.03906、0.00977、0.00244、0.00061、0.00015、0.000038μg/mL，共10个梯度，每个梯度2个平行孔，每孔100μl加到ELISA板中，室温振荡孵育1h；加入1:8000(体积比)稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗人-IgG(Thermo公司)，每孔100μl，室温振荡温育1h；加入OPD底物显色3-5分钟，最后用1M H₂SO₄终止反应，用BIO-TEKELX-800酶标仪测量测量OD 490值。根据抗体和抗原反应曲线，采用4参数Logistic拟合方法作图，计算EC50，如图5和表2所示。该结果表明，药物偶联之后并未明显影响到抗体本身与抗原之间的结合活性。

表2各抗体-药物偶联物对抗原的相对亲和力的EC50值

	A3LH	A3LH-DM1	A3LH-MMAE	A3LH-MMAD
					EC5(μg/mL)	0.05092	0.08477	0.06095	0.07664

实施例7、抗体-药物偶联物的竞争结合实验

将T6-17细胞裂解液(同实施例3)用50mM NaHCO₃pH9.6溶液按照1:1000的体积比进行稀释，每孔100μl包被ELISA板(Nunc公司)；置于4℃孵育过夜，加入含有1％(10g/L)BSA的PBST(PBS+0.1％Tween 20，％表示体积百分含量)置于37℃封闭1h；将待测抗体-药物偶联物【前面制备的3种抗体-药物偶联物，分别为A_3LH-MAL-EBE-MAL-DM1(简称A_3LH-DM1)，A_3LH-MC-VC-PAB-MMAE(简称A_3LH-MMAE)，A_3LH-PY-VC-PAB-MMAD(简称A_3LH-MMAD)】及对照抗体(A_3LH)均稀释至均稀释至200、66.6667、22.2222、7.4074、2.4691、0.8230、0.2743、0.0914、0.03048、0.01016μg/ml，共10个梯度，每个梯度2个平行孔，同时在其中加一定浓度的生物素标记的竞争性抗体(生物素标记的HuA21 0.25μg/ml或者生物素标记的Herceptin 2μg/ml)，充分混合以后每孔100μl加到ELISA板中，室温振荡孵育1h；辣根过氧化物酶标记亲和素(ThermoFisher公司)按照1:8000的体积比进行稀释，然后每孔加入100μl，室温振荡温育1h；加入OPD底物显色3-5min，最后用1M H₂SO₄终止反应，用BIO-TEK ELX-800酶标仪测量OD490值。根据抗体和抗原反应曲线，采用4参数Logistic拟合方法作图。

实验结果如图6所示，结果表明，小分子化药标记并没有明显影响原双表位抗体A3LH对人HER2各抗体结合位点的亲和力。

实施例8、流式细胞术检测细胞表面抗原的内化效率

对数生长期的BT474乳腺癌细胞(上海细胞库)经胰酶消化培养基重悬后，收集于锥形底离心管中。4℃、1000rpm离心5min沉淀细胞，加入培养基重悬细胞，使重悬后的细胞浓度为2×10⁷细胞/ml，将细胞悬液以50μl每管分装至各离心管中。

将用培养基稀释的100μg/ml的待测抗体-药物偶联物【前面制备的3种抗体-药物偶联物，分别为A_3LH-MAL-EBE-MAL-DM1(简称A_3LH-DM1)，A_3LH-MC-VC-PAB-MMAE(简称A_3LH-MMAE)，A_3LH-PY-VC-PAB-MMAD(简称A_3LH-MMAD)】及对照抗体(A_3LH)和细胞悬液混合至终体积100μl(50μl抗体样品和50μl细胞悬液)。混匀后，冰浴60min，期间每隔一段时间轻弹几次，防止细胞长时间沉淀，然后4℃、1000rpm离心5min沉淀细胞，去上清，用1ml的RPMI1640培养基洗涤两次，以去除残留的抗体，对于每组抗体其中一管加入500μl固定液(1％的多聚甲醛溶液：多聚甲醛5g，1mol/L氢氧化钠溶液250μl，加10×PBS 50ml，用水定容至500ml)冰上固定20min，离心1000rpm 5min，弃上清。

每管加入200μl培养基，于37℃孵育30min至4h不同时间(30min、60min、120min、240min)，使结合于细胞表面的抗体内化。在每个时间点，将该时间点对应的37℃孵育试管立即移至冰浴，并4℃、1000rpm离心5min沉淀细胞，加入500μl固定液冰上固定20min，离心1000rpm，5min，弃上清。在各离心管中加入100μl 10μg/ml FITC标记的羊抗人IgG，4℃避光孵育30min后，加入1ml的PBS洗涤细胞，重复此过程两次，最后将细胞重悬于500μl PBS中，流式观察。

实验结果如图7所示，从结果可以看出，对于这三个抗体-药物偶联物A_3LH-DM1，A_3LH-MMAE和A_3LH-MMAD，小分子化药的标记并没有影响其内吞效果，仍然具有与裸抗A_3LH相当的内吞作用，这正好满足ADC药物对内吞作用的要求，也正说明了A3LH作为载体偶联小分子化药来制作ADC药物的潜力是巨大的。

实施例9、CCK-8方法测定抗体-药物偶联物抑制肿瘤细胞增殖作用

此次试验共涉及到以下细胞株，但是不限于以下细胞株：

表3实验所用各肿瘤细胞株情况表

体外培养的各细胞株经胰酶消化培养基重悬后，接种于96孔细胞培养板，100μl/孔，在CO₂培养箱培养24h后，加入含有待测抗体-药物偶联物【前面制备的3种抗体-药物偶联物，分别为A_3LH-MAL-EBE-MAL-DM1(简称A_3LH-DM1)，A_3LH-MC-VC-PAB-MMAE(简称A_3LH-MMAE)，A_3LH-PY-VC-PAB-MMAD(简称A_3LH-MMAD)】及对照抗体-药物偶联物(T-DM1，商品名Kadcyla，Roche)的新鲜培养基，最高浓度20μg/ml，3倍梯度稀释，共10个浓度，每个浓度取3个平行孔，继续培养72h后，弃去培养基，每孔加入100μl的含有CCK-8试剂(东仁化学)(CCK-8显色试剂是按照1:10的体积比进行稀释的)的培养基，在37℃、5％CO₂的条件下进行显色，BIO-TEK ELX-800酶标仪在490nm的波长下测定OD值，以下列公式计算细胞生长抑制率：

抑制率＝(OD值对照孔-OD值给药孔)/OD值对照孔×100％

利用GraphPad软件，采用四参数回归法对数据进行处理。

实验结果如图8和表4所示，对于SKBR3、NCI-N87、MDA-MB-361和MDA-MB-453这四个细胞株，A_3LH-DM1对肿瘤细胞生长的抑制效果较T-DM1差，表现为半有效抑制浓度(IC50)比T-DM1略高。但是，除NCI-N87和MDA-MB-453外，对于其他细胞株，A_3LH-MMAE均表现出非劣于T-DM1，而A_3LH-MMAD则明显的优于T-DM1，尤其是对于JIMT-1这种Herceptin耐药性细胞株，这表明A_3LH-MMAD在制备抗肿瘤药物方面具有很好的应用前景。

表4各抗体-药物偶联物对各HER2表达细胞株的IC50值

<110> 合肥瀚科迈博生物技术有限公司

<120> 抗人ErbB2双表位抗体-药物偶联物及其应用

<130> GNCLN171978

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 740

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 1

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala

20 25 30

Val Ser Leu Gly Glu Arg Val Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Pro

35 40 45

Leu Glu Tyr Ser Asn Asn Gln Trp Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln

50 55 60

Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Ser Trp Ala Ser Thr Arg

65 70 75 80

Lys Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp

85 90 95

Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr

100 105 110

Tyr Cys Gly Gln Tyr Ser Asp Tyr Pro Asn Thr Phe Gly Ala Gly Thr

115 120 125

Lys Leu Glu Ile Lys Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

130 135 140

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Gln

145 150 155 160

Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys

165 170 175

Lys Ala Ser Gly Tyr Pro Phe Thr Gln Tyr Phe Ile His Trp Val Lys

180 185 190

Gln Asn Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile Gly Gln Ile Ser Ser Ser

195 200 205

Tyr Ala Thr Val Thr Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu

210 215 220

Thr Val Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu

225 230 235 240

Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg Ser Gly Asn Tyr

245 250 255

Glu Glu Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val

260 265 270

Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

275 280 285

Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly

290 295 300

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp

305 310 315 320

Thr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp

325 330 335

Val Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser

340 345 350

Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala

355 360 365

Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

370 375 380

Cys Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly

385 390 395 400

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

405 410 415

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

420 425 430

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

435 440 445

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

450 455 460

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

465 470 475 480

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

485 490 495

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Pro Lys Ser

500 505 510

Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu

515 520 525

Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

530 535 540

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

545 550 555 560

His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

565 570 575

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr

580 585 590

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn

595 600 605

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro

610 615 620

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

625 630 635 640

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val

645 650 655

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

660 665 670

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

675 680 685

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr

690 695 700

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

705 710 715 720

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

725 730 735

Ser Pro Gly Lys

740

<210> 2

<211> 211

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 2

Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val

1 5 10 15

Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala Val Ala Trp

20 25 30

Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala

35 40 45

Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser

50 55 60

Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe

65 70 75 80

Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly

85 90 95

Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val

100 105 110

Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser

115 120 125

Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln

130 135 140

Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val

145 150 155 160

Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu

165 170 175

Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu

180 185 190

Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg

195 200 205

Gly Glu Cys

210

<210> 3

<211> 2223

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 3

atggagacag acacactcct gctatgggta ctgctgctct gggttccagg atccactggt 60

gacatcgttt tgactcaatc tccagactct ttggctgttt ctttgggtga aagagttact 120

attaactgta agtcttctca accgttggaa tactctaaca accaatggaa ctacttggct 180

tggtatcaac aaaagccagg tcaatctcca aagttgttga tctcttgggc ttccactaga 240

aagtctggtg ttccagacag attctctggt tctggttctg gtactgactt cactttgact 300

atctcttctg ttcaagctga agacgttgct gtttactact gtgggcaata ctctgactac 360

ccaaacactt tcggtgctgg tactaagttg gaaattaaga gaggtggtgg tggttctggt 420

ggtggtggtt ctggtggtgg tggttccggt ggtggtggtt ccgaagttca attggttcaa 480

tctggtgctg aagttgttaa gccaggtgct tctgttaaga tcagttgtaa ggcttctggt 540

tacccgttca ctcagtactt catccactgg gttaagcaaa acccaggtca aagattggaa 600

tggatcggtc agatctcttc gtcttacgct actgtgacct acaaccaaaa attcaagggt 660

aaggctactt tgactgttga cacttctgct tctactgctt acatggaatt gtcttctttg 720

agatcggaag acactgctgt ttactactgt gttagatcgg gtaactacga agaatacgct 780

atggactact ggggtcaagg tactttggtt actgtttctt caggaggagg aggaagcgga 840

ggaggaggaa gcggaggagg aggaagcgag gtgcagctgg tcgagagcgg cgggggcctc 900

gtgcagccgg gcgggtcgct gcggctgagc tgcgccgcga gcgggttcaa catcaaggac 960

acctacatcc actgggtgcg ccaggccccc ggcaagggcc tcgagtgggt cgcccggatc 1020

taccccacga acgggtacac ccgctacgcc gacagcgtga agggccggtt caccatcagc 1080

gcggacacct cgaagaacac ggcctacctg cagatgaaca gcctgcgcgc cgaggacacc 1140

gccgtgtact actgcagccg gtggggcggc gacgggttct acgccatgga ctactggggg 1200

cagggcaccc tcgtcaccgt gagcagcgcg tcgacgaagg ggcccagcgt gttcccgctg 1260

gcccccagca gcaagagcac cagcggcggg accgccgccc tgggctgcct cgtcaaggac 1320

tacttccccg agcccgtgac cgtgtcgtgg aacagcggcg cgctgacgag cggggtccac 1380

accttcccgg ccgtgctgca gagcagcggc ctctactcgc tgagcagcgt ggtcaccgtg 1440

cccagcagca gcctggggac ccagacgtac atctgcaacg tgaaccacaa gccctcgaac 1500

accaaggtcg acaagaaggt ggagcccccg aagagctgcg acaagaccca cacctgcccg 1560

ccctgccccg cccccgagct cctgggcggg cccagcgtgt tcctgttccc gcccaagccc 1620

aaggacacgc tcatgatcag ccgcaccccc gaggtcacct gcgtggtggt cgacgtgagc 1680

cacgaggacc ccgaggtgaa gttcaactgg tacgtcgacg gcgtggaggt gcacaacgcc 1740

aagaccaagc cgcgggagga gcagtacaac tcgacgtacc gcgtcgtgag cgtgctgacc 1800

gtcctgcacc aggactggct caacggcaag gagtacaagt gcaaggtgag caacaaggcc 1860

ctgcccgcgc ccatcgagaa gaccatcagc aaggccaagg ggcagccccg ggagccgcag 1920

gtgtacaccc tgccccccag ccgcgacgag ctcacgaaga accaggtcag cctgacctgc 1980

ctggtgaagg gcttctaccc ctcggacatc gccgtggagt gggagagcaa cgggcagccg 2040

gagaacaact acaagaccac cccgcccgtc ctcgacagcg acggcagctt cttcctgtac 2100

agcaagctga cggtggacaa gtcgcggtgg cagcagggca acgtgttcag ctgcagcgtc 2160

atgcacgagg ccctccacaa ccactacacc cagaagagcc tgagcctgag ccccgggaag 2220

tga 2223

<210> 4

<211> 633

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 4

atgacccaga gcccgtcgag cctgagcgcc agcgtgggcg accgggtcac gatcacctgc 60

cgcgcgagcc aggacgtgaa caccgccgtg gcctggtacc agcagaagcc cgggaaggcc 120

cccaagctcc tgatctactc ggcgagcttc ctgtacagcg gcgtccccag ccggttcagc 180

gggtcgcgca gcggcaccga cttcacgctc accatcagca gcctgcagcc ggaggacttc 240

gccacctact actgccagca gcactacacc acgcccccca ccttcgggca gggcaccaag 300

gtggagatca agcggaccgt ggccgccccc agcgtcttca tcttcccgcc cagcgacgag 360

cagctgaagt cgggcacggc cagcgtggtg tgcctcctga acaacttcta cccccgcgag 420

gcgaaggtcc agtggaaggt ggacaacgcc ctgcagagcg ggaacagcca ggagagcgtg 480

accgagcagg actcgaagga cagcacctac agcctcagca gcaccctgac gctgagcaag 540

gccgactacg agaagcacaa ggtctacgcc tgcgaggtga cccaccaggg gctctcgagc 600

cccgtgacca agagcttcaa ccggggcgag tgctga 633

Claims (10)

1.一种抗体-药物偶联物，包含双特异性抗HER2抗体以及与所述双特异性抗HER2抗体相偶联的药物部分；所述药物部分中含有一种、两种或两种以上药物；

所述双特异性抗HER2抗体含有第一免疫球蛋白抗原结合结构域和第二免疫球蛋白抗原结合结构域；所述第一免疫球蛋白抗原结合结构域和第二免疫球蛋白抗原结合结构域能够结合到HER2抗原上的不同HER2抗体结合位点；所述第一免疫球蛋白抗原结合结构域能够结合到HER2抗原上的第一HER2抗体结合位点，所述第一HER2抗体结合位点为HER2抗原上位于结构域I的表位，且所述第一HER2抗体结合位点与帕妥珠单抗的抗体结合位点不同。

2.根据权利要求1所述的抗体-药物偶联物，其特征在于：所述第一免疫球蛋白抗原结合结构域包含轻链可变区和重链可变区；所述轻链可变区为HuA21抗体的轻链可变区，所述重链可变区为HuA21抗体的重链可变区；

具体的，所述HuA21抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.1的第21-134位所示，所述HuA21抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.1的第155-274位所示。

3.根据权利要求1或2所述的抗体-药物偶联物，其特征在于：所述第二免疫球蛋白抗原结合结构域能够结合到HER2抗原上与曲妥珠单抗的抗体结合位点相同的表位。

4.根据权利要求1-3中任一所述的抗体-药物偶联物，其特征在于：所述双特异性抗HER2抗体中，所述第一免疫球蛋白抗原结合结构域和所述第二免疫球蛋白抗原结合结构域的连接关系为如下(a1)或(a2)：

(a1)所述第一免疫球蛋白抗原结合结构域被共价连接至所述第二免疫球蛋白抗原结合结构域的重链的氨基末端；

(a2)所述第二免疫球蛋白抗原结合结构域被共价连接至所述第一免疫球蛋白抗原结合结构域的重链的氨基末端。

5.根据权利要求1-4中任一所述的抗体-药物偶联物，其特征在于：所述双特异性抗HER2抗体由彼此相关联的第一多肽链和第二多肽链组成；

所述第一多肽链的结构选自如下(b1)-(b6)中任一：

(b1)[AscFv]-[L]-[BVH]-[BCH]-[Fcx]

(b2)[AscFv]-[L]-[L]-[BVH]-[BCH]-[Fcx]

(b3)[AscFv]-[L]-[L]-[L]-[BVH]-[BCH]-[Fcx]

(b4)[BscFv]-[L]-[AVH]-[ACH]-[Fcx]

(b5)[BscFv]-[L]-[L]-[AVH]-[ACH]-[Fcx]

(b6)[BscFv]-[L]-[L]-[L]-[AVH]-[ACH]-[Fcx]

其中，[AscFv]表示以scFv形式存在的所述第一免疫球蛋白抗原结合结构域；

[BscFv]表示以scFv形式存在的所述第二免疫球蛋白抗原结合结构域；

[AVH]和[ACH]分别表示所述第一免疫球蛋白抗原结合结构域的重链可变区和重链恒定区1；

[BVH]和[BCH]分别表示所述第二免疫球蛋白抗原结合结构域的重链可变区和重链恒定区1；

[L]表示连接肽；

[Fcx]表示Fc结构域；

所述第二多肽链的结构选自如下(c1)或(c2)：

(c1)[AVL]-[CL]；

(c2)[BVL]-[CL]；

其中，[AVL]-[CL]表示所述第一免疫球蛋白抗原结合结构域的轻链可变区和轻链恒定区；

[BVL]-[CL]表示所述第二免疫球蛋白抗原结合结构域的轻链可变区和轻链恒定区。

6.根据权利要求5所述的抗体-药物偶联物，其特征在于：所述双特异性抗HER2抗体是通过在曲妥珠单抗的重链N端通过连接肽连接上抗HER2的单链抗体后得到的；

所述单链抗体中的重链可变区为HuA21抗体的重链可变区；所述单链抗体中的轻链可变区为HuA21抗体的轻链可变区；所述连接肽的氨基酸序列为SEQ ID No.1的第275-289位。

7.根据权利要求6所述的抗体-药物偶联物，其特征在于：所述双特异性抗HER2抗体的重链的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，轻链的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

8.根据权利要求1-7中任一所述的抗体-药物偶联物，其特征在于：所述药物选自如下：细胞毒素、放射性同位素、免疫调节剂、细胞因子、淋巴因子、趋化因子、生长因子、肿瘤坏死因子、激素、激素拮抗剂、酶、寡核苷酸、DNA、RNA、siRNA、RNAi、微小RNA、光敏治疗剂、抗血管生成剂、促凋亡剂、肽、脂质、碳水化合物、螯合剂或其组合；

具体的，所述细胞毒素为美登素衍生物、奥瑞他汀、多拉司他汀、微管溶素或吡咯并苯并二氮杂。

9.根据权利要求8所述的抗体-药物偶联物，其特征在于：所述药物为单甲基澳瑞他汀D、单甲基澳瑞他汀E或美登素衍生物DM1。

10.权利要求1-9中任一所述抗体-药物偶联物在制备抗肿瘤药物或肿瘤细胞增殖抑制剂中的应用。