进行本发明的最佳实施方案
通过以下实施例和实验对本发明进行更详细的描述,但权利要求并不仅限于这些实施例和实验。实施例1:制备3-吗啉基-1-(2′-硝基苯基)丙酮-1
吗啉(2.27g,0.026mol)在乙醇(10ml)中的溶液,用浓盐酸(3ml)处理10分钟,减压浓缩,制得吗啉盐酸盐。向该混合物中加入2′-硝基乙酰苯(3.3g,0.02mol)、仲甲醛(0.8g,0.029mol)、浓盐酸(0.1ml)和无水乙醇(10ml)。反应混合物在搅拌下回流30小时。然后将反应混合物冷却至室温,用10%碳酸钠溶液碱化,再用二氯甲烷(3×50ml)萃取。有机层用无水硫酸钠干燥,然后减压浓缩,得到粗产物。该粗产物通过闪柱色谱用在二氯甲烷中的5%乙醇纯制,得到油状的所需产物(1.5g,35%)。
1H-NMR(CDCl3)δ
3.1(m,3H),3.5(m,4H),3.75(m,3H),3.99(m,2H),7.85(m,3H),8.15(d,1H,J=8Hz)实施例2:制备3-哌啶子基-1-(2′-硝基苯基)丙酮-1
按与实施例1相同的方法,使用哌啶(515mg,6.06mmol)、2′-硝基乙酰苯(1g,6.06mmol)、仲甲醛(260mg,8.67mmol),浓盐酸(1ml)和无水乙醇制得所需产物(458mg,29%)。
1H-NMR(CDCl3)δ
1.5(m,6H),2.38(t,4H,J=5Hz),2.76(t,2H,J=6Hz),3.00(t,2H,J=6Hz),3.99(m,2H),7.40-7.75(m,3H),8.13(d,1H,J=8Hz)实施例3:制备3—吡咯烷基—1—(2′—硝基苯基)丙酮—1
按与实施例1相同的方法,使用吡咯烷(560mg,7.88mmol)、2′—硝基乙酰苯(1g,6.06mmol)、仲甲醛(260mg,8.67mmol)、浓盐酸(1ml)和无水乙醇(5ml)制得所需产物(347mg,23%)。实施例4:制备3—(N—苄基—N—苄氧羰基氨基)—1—(2′—硝基苯基)丙酮—1
苄胺(2.79g,0.026mol)在乙醇(10ml)中的溶液用浓盐酸(3ml)处理10分钟,减压浓缩,制得苄胺盐酸盐。
向该溶液中加入2′—硝基乙酰苯(3.3g,0.02mol)、仲甲醛(0.8g,0.029mol)、浓盐酸(0.1ml)和无水乙醇(10ml)。
反应混合物在搅拌下回流30小时。然后将反应混合物冷却至室温,用10%碳酸钠溶液碱化,再用二氯甲烷(3×50ml)萃取。有机层用无水硫酸镁干燥,然后减压浓缩,得到粗产物。将该粗产物溶解在二氯甲烷中,然后冷却至0℃。向该混合物中加入三乙胺(1.2g,0.012mol),然后再滴加氯甲酸苄基酯(2ml)。反应混合物在氮气流下于0℃搅拌1小时,加热至室温,然后再搅拌5小时。
在减压下除去溶剂后,混合物溶解在乙酸乙酯(100ml)中。有机层用水(3×30ml)和盐水(30ml)洗涤,然后用无水硫酸钠干燥。过滤后,通过除去溶剂得到粗产物。残留物通过闪柱色谱用正己烷—乙酸乙酯(1∶10)纯制,得到所需产物(1.5g,36%)。
1H-NMR(CDCl3)δ
3.0(m,2H),3.70(t,2H,J=7Hz),4.60(s,2H),5.17(s,2H),7.10-7.70(m,13H),8.10(d,1H,J=8Hz)
按与实施例4相同的方法制备实施例5-8的化合物,结果如下:
实施例 |
R |
1H-NMR:δ |
5 |
CH2CH3 |
8.102(d,1H,J=1.2Hz),7.596-7.135(m,8H),5.125(s,2H),3.762-3.61(m,4H),1.853(t,2H,J=6.4Hz),1.159(t,3H,J=7.2Hz) |
6 |
CH2CH2CH3 |
8.124(d,1H,J=1.2Hz),7.700-7.272(m,8H),5.125(s,2H),3.717(t,2H,J=3.6Hz),3.322-3.279(m,2H),1.624-1.546(m,4H),0.894(t,3H) |
7 |
CH(CH3)2 |
8.115(d,1H),7.613-7.261(m,8H),5.135(s,2H),4.488-4.210(m,1H),3.693(t,2H,J=7.2Hz),1.260(t,2H,J=7.2Hz),1.165(d,6H,J=6.4Hz) |
8 |
CH2CH2OH |
8.119(d,1H,J=8.0Hz),7.623-7.261(m,8H),5.127(s,2H),3.802-3.719(m,2H),3.557(t,2H,J=5.2Hz),3.992-3.353(m,2H),3.068-3.051(m,2H) |
实施例9:制备3-(N-2′-乙酰氧基乙基-N-苄氧羰基氨基)-1-(2′-硝基苯基)丙酮-1
将3-[(N-2′-羟乙基-N-苄氧羰基氨基)]-1-(2′-硝基苯基)丙酮-1(40mg,0.107mmol)和4-二甲基氨基吡啶(1.2mg,0.01mmol)的混合物溶解在无水二氯甲烷(2ml)中,然后加入三乙胺(0.02ml,0.160mmol)和醋酐(0.02ml,0.214mmol)。反应混合物在室温下搅拌30分钟,然后相继用饱和氯化铵水溶液、水和盐水洗涤。接着,有机层用无水硫酸镁干燥,然后减压浓缩。如此得到的残留物通过闪柱色谱用正己烷-乙酸乙酯(3∶1)纯制,得到黄色油状的所需产物(40mg,90%)。
1H-NMR(CDCl3)δ
8.123(d,1H,J=8.4Hz),7.607-7.261(m,8H),5,136(s,2H),4.194(m,H),3.784-3.754(m,2H),3.660-3.646(m,2H),3.172(m,2H),2.047(s,3H)实施例10:制备3—吗啉基—1—(2′—氨基苯基)丙酮—1
向溶解在10ml95%乙醇中的3—吗啉基—1—(2′—硝基苯基)丙酮—1(200mg,0.785mmol)溶液中加入连二亚硫酸钠(660mg,3.79mmol),反应混合物在搅拌下回流3小时。反应混合物减压浓缩。残留物通过闪柱色谱用乙醇—二氯甲烷—三乙胺纯制,得到油状的所需产物(174mg,89%)。
1H-NMR(CDCl3)δ
3.20(m,3H),3.50(m,3H),3.5(m,4H),3.99(m,2H),7.5-7.8(m,3H),8.08(d,1H,J=8Hz)实施例11:制备3—哌啶子基—1—(2′—氨基苯基)丙酮—1
将与实施例10相同的方法应用于实施例2的化合物(200mg,0.758mmol)和连二亚硫酸钠(660mg,0.758mmol)中,得到所需产物(174mg,89%)。实施例12:制备3—吡咯烷基—1—(2′—氨基苯基)丙酮—1
将与实施例10相同的方法应用于实施例3的化合物(400mg)和连二亚硫酸钠(1.052g,6.05mmol)中,得到所需产物(235mg)。
按与实施例10相同的方法,制备实施例13—17的化合物,结果如下:
实施例 |
R2 |
R1 |
1H-NMR:δ |
13 |
CH2CH3 |
Cbz |
7.365-7.262(m,9H),5.144(s,2H),3.764-3.71(m,4H),1.871-1.838(m,2H),1.253(t,3H,J=7.2Hz) |
14 |
CH2CH2CH3 |
Cbz |
7.885-7.230(m,9H),5.142(s,2H),3.668-3.613(m,2H),3.265(t,2H,J=6.4Hz),1.616-1.513(m,4H),0.895(t,3H) |
15 |
CH(CH3)2 |
Cbz |
7.946(d,1H,J=7.28Hz),7.377-7.349(m,3H),7.299-2.227(m,5H),5.1 72(s,2H),4.376-4.216(m,1H),3.534-3.371(m,4H),1.240-1.044(m,6H) |
16 |
CH2Ph |
Cbz |
3.17(m,2H),3.65(m,2H),4.55(s,2H),5.10(s,2H),6.20(brs,NH2),7.10-7.70(m,13H),8.10(d,1H,J=8Hz) |
17 |
CH2CH2OAc |
Cbz |
7.771(d,1H,J=7.6Hz),7.574-7.262(m,8H),6.641(d,2H,J=7.6Hz),5.114(s,2H),4.186(m,2H),3.773-3.169(m,6H),2.042(m,3H) |
实施例18:制备dl-7-[2-(N-苄基-N-苄氧羰基氨基)乙基]喜树碱
将3-(N-苄基-N-苄氧羰基氨基)-1-(2′-硝基苯基)丙酮-1(543mg,1.4mmol)和4-乙基-6-氧-1,4,7,8-四氢-4-羟基-吡喃基[3,4-f]中氮茚-3,10(6H)-二酮(263mg,1.0mmol)的混合物溶解在甲苯(50ml)中。反应混合物在搅拌下回流30分钟,然后在混合物中加人对甲苯磺酸(25mg,0.13mmol)。反应混合物在Dean-Stark trap中搅拌回流9小时。减压除去溶剂,残留物通过闪柱色谱用乙酸乙酯-二氯甲烷(1∶1)纯制,得到黄色粉末状的所需产物(507mg,59%)。
1H-NMR(CDCl3)δ
1.04(t,2H,J=8Hz),1.90(m,2H),3.10-3.90(m,4H),4.53(s,1/2×2H),4.61(s,1/2×2H),4.95(s,1/2×2H),5.07(s,1/2×2H),5.30(s,2H),5.31(d,1H,J=16Hz),5.75(d,1H,J=16Hz),7.20-8.20(m,15H)
按与实施例18相同的方法,制备实施例19—24的化合物,结果如下:
实施例 |
R2 |
R1 |
1H-NMR(CDCl3)δ |
19 |
CH2CH2CH3 |
Cbz |
8.236-7.261(m,10H),5.757,5.324(Abq,2H,J=16Hz),5.293(s,2H),5.193(s,2H),3.593-3.199(m,4H),1.942-1.863(m,2H),1.634-1.516(m,4H),1.047(t,3H,J=7.2Hz),0.944-0.842(m,3H) |
20 |
CH(CH3)2 |
Cbz |
8.197(d,1H),7.926-7.628(m,3H),7.485-7.365(m,6H),5.694(d,1H,J=13.08Hz),5.552-5.270(m,3H),5.246(s,2H),4.476-4.310(m,1H),3.514-3.456(m,4H),1.997-1.910(m,2H),1.248-1.208(m,6H),1.044(t,3H,J=5.92Hz) |
21 |
CH2CH2OAc |
Cbz |
8.344-7.261(m,10H),5.748(d,1H,J=16.8Hz),5.308(d,1H,J=16.8Hz),5.298(s,2H),5.113(s,2H),4.255-4.126(m,2H),3.791-3.371(m,6H),2.041(s,3H),1.954-1.610(m,2H),1.042(t,3H,J=7.2Hz), |
实施例 |
R1 R2 |
1H-NMR(CDCl3)δ |
22 |
哌啶子基 | 1H-NMR(200MHz,DMSO-d6)δ0.92(t,J=6Hz,3H),1.32(m,6H),1.90(m,2H),2.34(s,3H),2.90(m,2H),3.30(m,6H),5.48(s,2H),5.49(s,2H),6.58(s,1H),7.1 6(d,J=8Hz,2H),7.52(d,J=8Hz,2H),7.77-8.30(m,4H) |
23 |
吡咯烷基 | 1H-NMR(200MHz,DMSO-d6)δ0.94(t,J=6Hz,3H),1.25(m,4H),1.87(m,2H),2.33(s,3H),2.90(m,2H),3.11(m,6H),3.53(s,1H),5.52(s,2H),5.53(s,2H),6.60(s,1H),7.15(d,J=8Hz,2H),7.51(d,J=8Hz,2H),7.77-8.30(m,4H) |
24 |
吗啉基 | 1H-NMR(200MHz,CDCl3)δ0.86(t,J=6Hz,3H),1.89(m,2H),2.25(s,3H),2.85(m,2H),3.05(m,2H),3.51(m,4H),3.71(m,4H),5.39(s,2H),5.40(s,2H),6.49(s,1H),7.08(d,J=8Hz,2H),7.44(d,J=8Hz,2H),7.77-8.30(m,4H) |
实施例25:制备dl-7-[2-(N-羟乙基-N-苄氧羰基氨基)乙基]喜树碱
将dl-7-[2-(N-乙酰氧基乙基-N-苄氧羰基氨基)乙基]喜树碱(28.2mg,0.05mmol)和碳酸钾(25mg,0.15mmol)溶解在甲醇与水(1∶1,1.5ml)的混合溶剂中,反应混合物溶液在室温下搅拌3小时。反应混合物用1N盐酸溶液酸化,再用二氯甲烷萃取,然后用盐水洗涤。有机层用无水硫酸钠干燥,过滤,然后减压浓缩。残留物通过闪柱色谱用二氯甲烷-甲醇(20∶1)纯制,得到黄色固体的所需产物(17mg,60%)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ
8.171-7.762(m,10H),5.710(d,2H,J=16.8Hz),5.308(d,2H,J=16.8Hz),5.301(s,2H),5.207(s,2H),3.868-3.466(m,8H),1.926-1.832(m,2H),1.033(t,3H,J=7.6Hz)实施例26:制备dl-7-[2-(N-苄基氨基)乙基]喜树碱
将dl-7-[2-(N-苄基-N-苄氧羰基氨基)乙基]喜树碱(50mg,0.08mmol)溶解在冰醋酸(20ml)中,然后用10%Pd/C(25mg)处理。反应混合物在40psi的氢气流下搅拌9小时,然后通过cellite pad过滤除去催化剂。滤液减压浓缩。残留物通过闪柱色谱用10%甲醇-二氯甲烷纯制,得到黄色粉末状的所需产物(24mg,63%)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ
0.89(t,3H,J=8Hz),1.87(m,2H),2.90(m,2H),3.5(m,4H),3.73(s,1H),5.33(s,2H),5.43(s,2H),6.52(s,1H),7.25(m,6H),7.70-8.30(m,4H)实施例27:制备dl-7-[2-(N-乙酰氧基乙基氨基)乙基]喜树碱
进行与实施例26相同的步骤。
1H-NMR(400MHz,CDCl3+MeOH-d4)δ
8.323(d,1H,J=8.8Hz),8.18(d,1H,J=8.4Hz),7.812(t,1H,J=6.8Hz),7.675(t,1H,J=6.8Hz),7.647(s,1H),5.742(d,1H,J=16.4Hz),5.324-5.284(m,2H),4.169-4.122(m,2H),3.373(t,2H,J=7.6Hz),3.108-3.040(m,4H),2.090(s,3H),2.024(s,3H),1.955-1.803(m,2H),1.033(t,3H,J=7.6Hz)实施例28:制备dl-7-[2-(N-羟乙基氨基)乙基]喜树碱
进行与实施例26相同的步骤。
1H-NMR(400MHz,CDCl3+MeOH-d4)δ
8.284(d,1H,J=8.0Hz),8.226(d,1H,J=8.8Hz),7.863(t,1H,J=6.8Hz),7.756(t,1H,J=6.8Hz),7.730(s,1H),5.682(d,1H,J=13.6Hz),5.641(d,1H,J=13.6Hz),5.130(s,2H),3.800-3.190(m,8H),1.962-1.898(m,2H),1.031(t,3H,J=4.4Hz),2.035(s,3H)实施例29:制备dl-7-[2-(N-乙基氨基)乙基]喜树碱
将2′-氨基-2-(N-苄氧羰基-N-乙基氨基)苯丙酮(34mg,0.11mmol)和4-乙基-6-氧-1,4,7,8-四氢-4-羟基-吡喃基[3,4-f]中氮茚-3,10(6H)-二酮(34mg,0.1mmol)的混合物溶解在甲苯中,并回流30分钟。在加入对甲苯磺酸(19.2mg,0.1mmol)后,反应混合物在Dean-Stark trap中搅拌回流3小时。减压浓缩反应混合物,残留物通过闪柱色谱用二氯甲烷—甲醇(10∶1)纯制,得到固体的所需产物(40mg,67%)。
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ
8.280(d,1H,J=8.6Hz),8.184(d,1H,J=7.4Hz),7.873-7.753(m,2H),7.471(d,2H,J=7.2Hz),7.111(d,2H,J=7.2Hz),7.356(s,1H),6.523(s,1 H),5.439(s,2H),3.534-2.753(m,6H),2.217(s,3H),1.671-1.643(m,2H),1.230(t,3H,J=6.8Hz),0.743(t,3H,J=7.2Hz)实施例30:制备dl—7—[2—(N—异丙基氨基)乙基]喜树碱
进行与实施例29相同的步骤。
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ
8.870-8.567(m,2H),8.298-8.155(m,2H),7.867(d,2H,J=7.6Hz),7.741(s,1H),7.500(d,2H,J=7.6Hz),5.828(s,2H),5.795(s,2H),3.958-3.820(m,2H),2.666(s,3H),2.320-2.200(m,2H),1.61 4(d,6H,J=6.4Hz),1.533(t,2H),1.267(t,3H)实施例31:制备dl—7—[2—(吗啉基)乙基]喜树碱三氟乙酸盐
进行与实施例24相同的步骤,不同之处在于:用三氟乙酸代替对甲苯磺酸。
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ
0.92(t,J=6Hz,3H),1.94(m,2H),2.90(m,4H),3.30-3.65(m,8H),5.47(s,2H),5.48(s,2H),6.56(s,1H),7.70-8.30(m,4H)实施例32:制备6—氰基—1,1—(亚乙二氧基)—7—[1′—(乙氧基羰基)—3′—(甲氧基甲基氧丙基)]—5—氧—Δ6(8)—四氢中氮茚
将6—氰基—1,1—(亚乙二氧基)—7—[(乙氧基羰基)甲基]—5—氧—Δ6(8)—四氢中氮茚(608.6mg,2mmol)溶解在无水二甲基甲酰胺(3ml)中,冷却至5℃,加入KOtBu(258.1mg,2.3mmol),然后在相同的温度下搅拌反应混合物30分钟。向该混合物中加入2—溴乙醇甲氧基—甲基醚(1.352g,8mmol),反应混合物在45—50℃下搅拌20小时。反应混合物用水(50ml)稀释,用二氯甲烷(100ml)萃取。有机层用水(80ml)和盐水(80ml)洗涤,用无水硫酸镁干燥,再减压浓缩。残留物通过闪柱色谱用乙酸乙酯-正己烷(2∶1)纯制,得到淡黄色固体的所需产物(734.8mg,95%)。
IR(净)2224,1734,1656cm-1
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ
1.254(t,3H,J=6.8Hz),1.987-2.020(m,1H),2.410(t,2H,J=6.8Hz),2.43-2.449(m,1H),3.447-3.485(m,1H),3.564-3.603(m,1H),4.117-4.201(m,7H),4.225(q,2H,J=7.6Hz),4.584,4.609(Abq,2H,J=6.8Hz),6.367(s,1H)
MS(EI)m/e
392(M+),377(M+-CH3),361(M+-OCH3),347(M+-C2H5O)实施例33:制备6-(乙酰胺基甲基)-1,1-(亚乙二氧基)-7-[1′-(乙氧基羰基)-3′-(甲氧基甲基氧丙基)]-5-氧-Δ6(8)-四氢中氮茚
250滴Raney镍(50%水浆)用水(5ml)和乙酸(10ml)分别洗涤10次,然后放入parr瓶中。
在上述溶液中添加实施例32中得到的化合物(743.8mg,1.9mmol)、醋酐(30ml)和乙酸(10ml),反应化合物在45psi的压力、45-50℃下氢化3小时。过滤除去催化剂,滤液减压浓缩。残留物通过闪柱色谱用二氯甲烷-甲醇(20∶1)纯制,得到黄色油状的所需产物(789.5mg,95%)。
IR(净)1733,1660,1635cm-1
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ
1.214(t,3H,J=6.8Hz),1.924(s,3H),1.939-1.98(m,1H),2.382(t,2H,J=6.8Hz),2.399-2.40(m,1H),3.343(s,3H),3.44-3.58(m,2H),4.075-4.131(m,7H),4.145(q,2H),4.34,4.39(d,d,2H),4.571,4.592(Abq,2H,J=6.8Hz),6.306(s,1H),6.61(brs,1H)
MS(EI)m/e
438(M+),423(M+-CH3),407(M+-OCH3),395(M+-COCH3),393(M+-C2H5O)实施例34:制备6-(乙酰氧基甲基)-1,1-(亚乙二氧基)-7-[1′-(乙氧基羰基)-3′-(甲氧基甲基氧丙基)]-5-氧-Δ6(8)-四氢中氮茚
在实施例33中制得的化合物(789.5mg,1.8mmol)中加入醋酐(15ml)、乙酸(5ml)和亚硝酸钠(621.2mg,9mmol),反应混合物在5-10℃下搅拌6小时。在通过过滤除去所形成的无机物质后,减压浓缩滤液形成亚硝基化合物。添加四氯化碳(50ml),混合物加热回流18小时。反应混合物用水(10ml)和盐水(10ml)洗涤,用无水硫酸镁干燥,然后减压浓缩。残留物通过闪柱色谱用二氯甲烷-甲醇(20∶1)纯制,得到无色油状的所需产物(720mg,90%)。
IR(净)1740,1733,1654cm-1
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ
1.217(t,3H,J=6.8Hz),1.86-1.95(m,1H),2.056(s,3H),2.368(t,2H),2.38-2.43(m,1H),3.333(s,3H),3.41-3.57(m,2H),4.087-4.119(m,9H),4.569(s,2H),5.259(s,2H),6.304(s,1H)
MS(EI)m/e439(M+),408(M+-OCH3),396(M+-COCH3)实施例35:制备1,1-(亚乙二氧基)-(5′-甲氧基甲基氧乙基-2′H,5′H,6′H-6-氧吡喃基)[3′,4′-f]-5-氧-Δ6(8)-四氢中氮茚
将实施例34中得到的化合物(720mg,1.64mmol)与甲醇(15ml)的混合物加入到溶解在水(5ml)中的LiOH.H2O(172mg,4.1mmol)中,然后在25-30℃下搅拌2小时。减压浓缩反应混合物,以除去甲醇,然后添加水(15ml)、二氯甲烷(50ml)和乙酸(5ml),反应混合物在25-30℃下搅拌10小时。从反应混合物中分离有机层,该有机层用水(10ml)和盐水(10ml)洗涤,然后用无水硫酸镁干燥。减压浓缩有机层。残留物通过闪柱色谱用二氯甲烷-甲醇(30∶1)纯制,得到白色固体的所需产物(720mg,91%)。
IR(净)1747,1662cm-1
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ
2.178-2.216(m 2H),2.404(t,2H,J=6.8Hz),3.371(s,3H),3.599-3.643(m,2H),3.701(t,1H,J=6.8Hz),4.109-4.192(m,6H),4.618(s,2H),5.278,5.43(Abq,2H,J=16.4Hz),6.169(s,1H)
MS(EI)m/e351(M+),320(M+-OCH3),307(M+-CO2)实施例36:制备1,1-(亚乙二氧基)-(5′-甲氧基甲基氧乙基-5′-2′H,5′H,6′H-6-氧吡喃基)[3′,4′-f]-5-氧-Δ6(8)-四氢中氮茚
将在实施例35中制得的化合物(570.3mg,1.63mmol)溶解在无水DMF(20ml)中,在该混合物中添加KOtBu(273mg,2.43mmol),然后在0-5℃下搅拌30分钟。反应混合物冷却至-10到-5℃,添加三乙基亚磷酸酯(974μl,5.68mmol),混合物搅拌2.5小时,同时向其中吹入氧气泡。在混合物中加入水(10ml),用1N盐酸将pH值调节至3.5。然后用二氯甲烷(30mlX2次)萃取反应混合物,用水(20ml)和盐水(20ml)洗涤,用无水硫酸镁干燥。有机层减压浓缩。残留物通过闪柱色谱用二氯甲烷-甲醇(25∶1)纯制,得到白色固体的所需产物(416.4mg,69.8%)。
IR(净)3503,1749,1654cm-1
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ
1.919-1.974(m,1H),2.010-2.063(m,1H),2.348(t,2H,J=6.8Hz),3.30(s,3H),3.542-3.597(m,1H),3.639-3.684(m,1H),4.002-4.1541(m,7H),4.516,4.494(Abq,2H,J=6.4Hz),5.111,5.557(Abq,2H,J=16Hz),6.541(s,1H)
MS(EI)m/e367(M+),336(M+-OCH3),323(M+-CO2)实施例37:制备1,5-二氧-(5′-羟乙基-5′-羟基-2′H,5′H,6′H-6-氧吡喃基)[3′,4′-f]-5-氧-Δ6(8)-四氢中氮茚
在实施例36中制得的化合物(146.1mg,0.4mmol)中加入THF(200ml)、水(1ml)和6N盐酸(2.5ml)的混合物,在50-55℃下搅拌1小时。反应混合物减压浓缩。残留物通过DianionR HP-20(Mitsubishi)用乙腈-水(4∶1)纯制,然后减压浓缩,得到黑色树脂状的所需产物(93.2mg,84%)。
IR(KBr)3470,1749,1654cm-1
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ
1.92-2.11(m,2H),2.962(t,2H,J=6.0Hz),3.674-3.86(m,2H),4.326(t,2H,J=6.0Hz),5.259,5.627(Abq,2H,J=16.8Hz),5.287(s,1H),7.284(s,1H)
MS(EI)m/e279(M+),261(M+-H2O),235(M+-C2H5OH)实施例38:制备dl-18-羟基喜树碱
将2-氨基苯甲醛缩乙二醇(75.6mg,0.46mmol)和甲苯(8ml)的溶液加至实施例37中制得的化合物(85.2mg,0.31mmol)中,在Dean-Stark装置中回流1小时。将对甲苯磺酸(催化剂量)加入至反应混合物中,再回流3小时。过滤所形成的固体,并通过闪柱色谱用二氯甲烷-甲醇(15∶1)纯制,得到淡棕色固体的所需产物(57.8mg,52%)。
IR(净)3400,1743,1658cm-1
1H-NMR(400MHz,CDCl3∶DMSO-d6=3∶1)δ
2.01-2.20(m,2H),3.51-3.86(m,2H),5.315(s,2H),5.34,5.55(Abq,2H),6.418(s,1H),7.557(s,1H),7.676(t,1H),7.83(t,1H),8.03(d,1H),8.18(d,1H),8.570(s,1H)
MS(EI)m/e364(M+),320(M+-CO2)实施例39:制备dl-18-甲氧基甲基氧喜树碱
将甲氧基甲基氯(6μl,0.08mmol)和二异丙基乙胺(12μl,0.07mmol)加至d1-18-羟基喜树碱在二氯甲烷(2ml)中的悬浮液中,然后在25-30℃下搅拌48小时。
添加二氯甲烷(25ml),反应混合物相继用饱和氯化铵(10ml)、水(10ml)、10%硫酸氢钾(10ml)、水(10ml)和盐水(10ml)洗涤。有机层用无水硫酸镁干燥,然后减压浓缩。残留物通过闪柱色谱用二氯甲烷-甲醇(30∶1)以及通过PTLC用二氯甲烷-乙醇(20∶1)纯制,得到黄色固体的所需产物(5mg,23%)。
IR(KBr)3566,1733,1652cm-1
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ
2.15-2.34(m,2H),3.387(s,3H),4.08-4.22(m,2H),4.604(d,d,2H),5.313(s,2H),5.62,5.78(Abq,2H),6.6(s,1H),7.68(t,1H),7.726(s,1H),7.84(t,1H),7.96(d,1H),8.24(d,1H),8.41(s,1H)
MS(EI)m/e408(M+)
HRMS m/e M+计算:408.1321;观察到的:408.1336
按与实施例39相同的方法,制备实施例40-46之通式(I)表示的化合物(R=H,n=2)。
实施例 |
R3 |
1H-NMR(CDCl3或CDCl3+CD3OD)δ |
40 |
OCOCH3 |
1.970(s,3H),2.26-2.37(m,2H),4.126-4.216(m,2H),5.32(s,2H),5.66,5.79(Aq,2H),6.36(s,1H),7.65(s,1H),7.69(t,1H),7.86(t,1H),7.95(d,1H),8.25(d,1H),8.41(s,1H) |
41 |
OCOCH2OCH3 |
8.3975(s,1H),8.2429(d,1H,J=8.5Hz),7.9401(d,1H,J=8.3Hz),7.8358(t,1H),7.6936(s,1H),7.6845(t,1H),5.7928,5.3225(Abq,2H,J=1 6.2Hz),5.3064(s,2H),4.2762-4.2991(m,1H),4.18-4.22(m,1H),3.9794(d,2H,J=2.4Hz),3.4106(s,3H),2.2333-2.2444(m,2H) |
42 |
OCH2OCH2CH3 |
8.4035(s,1H),8.2411(d,1H,J=8.4Hz),7.945(d,1H,J=7.4Hz),7.8409(t,1H,J=7.0Hz),7.7274(s,1H),7.6744(t,1H,J=7.0Hz),5.7673,5.3189(Abq,2H,J=16.2Hz),5.3132(s,2H),4.6547(Abq,2H),4.3373(s,1H),4.2345(q,2H),3.81(m,1H),3.7144(m,1H),2.22(m,1H),2.11(m,1H),1.2186(t,3H) |
43 |
OCH2OCH2CH2OCH3 |
8.4018(s,1H),8.2391(d,1H,J=8.4Hz),7.9423(d,1H,J=7.6Hz),7.8388(t,1H),7.7236(s,1H),7.6925(t,1H),5.7629,5.3223(Abq,2H,J=16.3Hz),5.3111(s,2H),4.6934(d,d,2H),3.8514(m,1H),3.7011-3.7435(m,2H),3.65(m,1H),3.5602-3.5828(m,2H),3.3976(s,3H),2.01-2.22(m,2H) |
44 |
OCONHPh |
2.074-2.188(m,1H),2.308-2.361(m,1H),4.122-4.163(m,1H),4.279-4.303(m,1H),5.153,5.263(Abq,2H,J=19.2Hz),5.464(s,2H),6.707(t,1H,J=7.2Hz),7.013(t,2H,J=8.0Hz),7.202(d,2H,J=8.0Hz),7.350(s,1H),7.693(t,1H,J=7.2Hz),7.842(t,1H,J=8.4Hz),8.086(d,1H,J=8.4Hz),8.122(d,1H,J=8.0Hz),8.611(s,1H),9.337(brs,1H) |
45 |
OCHONHCH2CH2Cl |
9.19(brs,1H),8.3989(s,1H),8.2469(d,1H,J=8.4Hz),7.9399(d,1H,J=7.9Hz),7.8384(t,1H),7.7171(s,1H),7.6727(t,1H),5.7667,5.3430(Abq,2H),5.2748(q,2H),3.8914(m,1H),3.78(m,1H),3.5472-3.5995(m,2H),3.4507-3.4833(m,2H),2.22(m,2H) |
46 |
OCONH i-Pr. |
8.3909(s,1H),8.2033(d,1H,J=8.7Hz),7.9206(d,1H,J=7.5Hz),7.8150(t,1H),7.7022(s,1H),7.6551(t,1H),5.7112,5.2815(ABq,2H,J=16.2Hz),5.2778(s,2H),4.2720(m,1H),4.1706-4.1982(m,1H),3.6538(m,1H),2.2597(m,2H),1.1270(d,6H) |
实施例47:制备6-氰基-1,1-(亚乙二氧基)-7-[1′-(乙氧基羰基)-2′-羟乙基]-5-氧-Δ
6(8)-四氢中氮茚
将35%甲醛(30ml)、二氧六环(50ml)、水(20ml)和乙醇(20ml)的混合物加入到6-氰基-1,1-(亚乙二氧基)-7-[(乙氧基羰基)甲基]-5-氧-Δ6(8)-四氢中氮茚(500mg,1.64mmol)中,在25-30℃下搅拌15小时。添加二氯甲烷(120ml),反应混合物用水(120ml×3次)和盐水(120ml)洗涤。分离的有机层用无水硫酸镁干燥,然后减压浓缩。残留物通过闪柱色谱用二氯甲烷-甲醇(25∶1)纯制,得到白色固体的所需产物(318mg,58%)。
IR(KBr)3310,2224,1735,1647cm-1
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ
1.275(t,3H,J=7.2Hz),2.407(t,2H,J=6.8Hz),4.029-4.221(m,9H),4.239(q,2H),6.383(s,1H)
MS(EI)m/e
334(M+),316(M+-H2O),304(M+-CH3OH)实施例48:制备6-氰基-1,1-(亚乙二氧基)-7-[ 1′-(乙氧基羰基)-2′-(甲氧基乙氧基甲基氧乙基)]-5-氧-Δ6(8)-四氢中氮茚
将二氯甲烷(0.7ml)加至实施例47中制得的化合物(51.6mg,0.15mmol)中,在冰浴中冷却。然后缓慢加入二异丙基乙胺(30μl,0.17mmol)和MEM-Cl(35μl,0.31mmol),所得溶液在25-30℃下搅拌20小时。向反应混合物中添加二氯甲烷(15ml),然后用饱和碳酸氢钠水溶液(10ml×2次)、水(10ml)和盐水(10ml)洗涤。分离的有机层用无水硫酸镁干燥,然后减压浓缩。残留物通过闪柱色谱用二氯甲烷-甲醇(25∶1)纯制,得到白色固体的所需产物(41mg,62%)。
IR(净)2224,1734,1661cm-1
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ
1.289(t,3H,J=6.8Hz),2.422(t,2H,J=6.8Hz),3.410(s,3H),3.548-3.598(m 2H),3.653-3.680(m,1H),3.725-3.748(m,1H),3.912(dd,1H,J=10Hz,J=6.8Hz),4.098(dd,1H,J=10Hz,J=6.8Hz),4.129-4.216(m,6H),4.236(q,2H),4.336(t,1H,J=6.8Hz),4.706,4.742(Abq,2H,J=6.8Hz),6.441(s,1H)
MS(EI)m/e
423(M++H),422(M+),392(M+-OCH3),378(M+-C2H5O)实施例49:制备6-(乙酰氨基甲基)-1,1-(亚乙二氧基)-7-[1′-(乙氧基羰基)-2′-(甲氧基乙氧基甲基氧乙基)1-5-氧-Δ6(8)-四氢中氮茚
使用实施例48中制得的化合物(39.6mg,0.09mmol),按与实施例33相同的方法进行反应,而残留物通过闪柱色谱用二氯甲烷-甲醇(20∶1)纯制,得到无色油状的所需产物(42mg,96%)。
IR(净)1733,1661,1656cm-1
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ
1.247(t,3H,J=7.2Hz),1.934(s,3H),2.393(t,2H,J=6.8Hz),3.405(s,3H),3.546-3,569(m,2H),3.660-3.686(m,2H),3.809(dd,1H,J=6.4Hz,J=9.2Hz),4.093-4.192(m,7H),4.205(q,2H),4.467(dq,2H,J=6.4Hz),4.652(t,2H,J=6.8Hz),4.719,4.750(Abq,2H,J=6.8Hz),6.349(s,1H),6.658(s,1H)
MS(EI)m/e
468(M+),453(M+-CH3),425(M+-C2H5O)实施例50:制备6-(乙酰氧基甲基)-1,1-(亚乙二氧基)-7-[1′-(乙氧基羰基)-2′-(甲氧基乙氧基甲基氧乙基)]-5-氧-Δ6(8))-四氢中氮茚
使用实施例49中制得的化合物(359mg,0.76mmol),按与实施例34相同的方法进行反应,而残留物通过柱色谱用二氯甲烷-甲醇(30∶1)纯制,得到无色油状的所需产物(234mg,65%)。
IR(净)1733,1740,1661cm-1
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ
1.230(t,3H,J=7.2Hz),2.057(s,3H),2.361(t,2H,J=6.8Hz),3.381(s,3H),3.521-3,542(m,2H),3.620-3.653(m,2H),3.723(dd,1H,J=6.0Hz,J=9.2Hz),4.082-4.209(m,8H),4.225(s,2H),4.716-4.675(Abq,2H,J=6.8Hz),5.259(s,2H),6.313(s,1H)
MS(EI)m/e
469(M+),426(M+-COCH3)实施例51:制备6-(乙酰氧基甲基)-1,1-(亚乙二氧基)-7-[1′-(乙氧基羰基)乙烯基]-5-氧-Δ6(8)-四氢中氮茚
将干苯(8ml)和DBU(416μl)加至在实施例50中制得的化合物(522mg,1.1mmol)中,然后在室温下搅拌3小时。加入二氯甲烷(20ml),然后用饱和氯化铵水溶液(15mlX2次)和水(15ml)洗涤。分离的有机层用无水硫酸镁干燥,然后减压浓缩。残留物通过柱色谱用二氯甲烷-甲醇(30∶1)纯制,得到黄白色固体的所需产物(363mg,90%)。
IR(净)1729,1719,1655cm-1
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ
6.551(s,1H),6.109,5.773(s,s,1H×2),5.008(s,2H),4.243(q,2H,J=7.2Hz),4.104-4.161(m,6H),2.398(t,2H,J=6.8Hz),2.021(s,3H),1.293(t,3H,J=7.2Hz)
MS(EI)m/e363(M+),320实施例52:制备6-(乙酰氧基甲基)-1,1-(亚乙二氧基)-7-[1′-(乙氧基羰基)-1′-(羟基)-2′-(羟基)乙基]-5-氧-Δ6(8)-四氢中氮茚
将吡啶(3.9ml)加至实施例51中制得的化合物(285mg,1.79mmol)中,注射加入OsO4(240mg,0.94mmol)(0.08M甲苯,11.8ml),在黑暗中于室温下搅拌4小时。反应结束后,在反应混合物中添加亚硫酸氢钠(480mg)与水(7ml)的溶液,然后搅拌1小时。反应混合物用二氯甲烷(30ml×5)萃取,合并的有机层用盐水洗涤,然后用无水硫酸镁干燥。
有机层然后减压浓缩。残留物通过柱色谱用二氯甲烷-甲醇(20∶1)纯制,得到白色固体的所需产物(280mg,90%)。
IR(净)3307,1735,1654cm-1
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ
6.455(s,1H),5.303(Abq,2H,J=11.7Hz),4.611(s,1H),4.085-4.611(m,9H),3.855,3.826(dd,1H,J=6.8,11.2Hz),2.641(brt,1H,J=6.8Hz),2.384(t,2H,J=6.8Hz),2.063(s,3H),1.290(t,3H,J=6.8Hz)
MS(EI)m/e397(M+),354实施例53:制备1,1-(亚乙二氧基)-(5′-羟甲基-5′-羟基-2′H,5′H,6′H-6-氧吡喃基)[3′,4′-f]-5-氧-Δ6(8)-四氢中氮茚
使用实施例52中制得的化合物(325mg,0.82mmol),按与实施例35相同的方法进行反应,而残留物通过柱色谱用二氯甲烷-甲醇(20∶1)纯制,得到白色固体的所需产物(211mg,84%)。
IR(净)3421,1750,1654cm-1
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ
6.599(s,1H),5,564,5.255(Abq,2H,J=16.0Hz),4.072-4.238(m,7H),3.772,3.733(dd,2H,J=11.6Hz),2.418(t,2H,J=6.8Hz)
MS(EI)m/e
309(M+),293,280,279,265
HRMS m/e(M+)计算:309.0849;观察到的:309.0847实施例54:制备1,1-(亚乙二氧基)-(5′-乙酰氧基甲基-5′-羟基-2′H,5′H,6′H-6-氧吡喃基)[3′,4′-f]-5-氧-Δ6(8)-四氢中氮茚
将在实施例53中制得的化合物(119mg,0.38mmol)溶解在无水二氯甲烷(10ml)中,然后添加吡啶(93μl,1.15mmol)和醋酐(47μl,0.50mmol),反应混合物在室温下搅拌20小时。反应混合物用二氯甲烷(20ml)稀释,用35%硫酸氢钾水溶液(20ml)、水(20ml)和盐水(20ml)洗涤,然后用无水硫酸镁干燥。
有机层减压浓缩。残留物通过柱色谱用二氯甲烷-甲醇(20∶1)纯制,得到白色固体的所需产物(127mg,94%)。
IR(净)3437,1751,1657cm-1
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ
6.586(s,1H),5.6336,5.295(Abq,2H,J=16.4Hz),4.302(d,1H,J=11.2Hz),4.116-4.215(m,7H),4.004(s,1H),2.427(t,2H,J=6.8Hz),2.084(s,3H)
按与实施例54相同的方法,制备实施例55-57的化合物,结果如下:
实施例58:制备1,5—二氧—(5′—乙酰氧基甲基—5′—羟基—2′H,5′H,6′H—6—氧吡喃基)[3′,4′—f]—5—氧—Δ
6(8)—四氢中氮茚
将80%三氟乙酸(1.3ml)加至在实施例54中制得的化合物(127mg,0.36mmol)中,然后在室温下搅拌2小时。反应混合物减压浓缩,添加盐水,反应混合物用二氯甲烷(20ml×3)萃取,然后用无水硫酸镁干燥。有机层减压浓缩。残留物通过柱色谱用二氯甲烷—甲醇(20∶1)纯制,得到黄色固体的所需产物(理论产率)。
IR(KBr)3412,1746,1660cm-1
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ
7.318(s,1H),5.687,5.388(Abq,2H,J=17.1Hz),4.405(t,2H),4.370(d,1H,J=11.7Hz),4.155(d,1H,J=11.7Hz),3.007(t,2H,J=6.8Hz),2.080(s,3H)
MS(EI)m/e307(M+)
按与实施例58相同的方法,分别由实施例55、56和57的化合物制备实施例59—61之通式(III)表示的化合物(n=1)。实施例62:制备dl-20-去乙基-20-乙酰氧基甲基喜树碱
使用实施例58中制得的化合物(19mg,0.06mmol)和N-(2-氨基苯亚甲基)-对甲苯胺(20mg,0.09mmol),按与实施例38相同的步骤进行反应,而残留物通过PTLC用二氯甲烷-甲醇(20∶1)纯制,得到棕色固体的所需产物(9mg,36%)。
IR(CHCl3)3400,1749,1740,1654cm-1
1H-NMR(400MHz,CDCl3+CD3OD=4∶1)δ
8.493(s,1H),8.223(d,1H,J=8.4Hz),7.988(d,1H,J=8.0Hz),7.867(t,1H,J=7.2Hz),7.767(s,1H),7.703(t,1H,J=7.2Hz),5.697,5.433(Abq,2H,J=1 6.4Hz),5.334(s,2H),4.460(d,1H,J=11.2Hz),4.330(d,1H,J=11.2Hz),2.087(s,3H)
LRMS(EI)m/e
392(M+),331,320,305
HRMSm/e(M+)计算:392.1008;观察到的:392.1006
按与实施例38相同的方法制备实施例63-65之通式(I)表示的化合物(R=H,n=1)。
实施例 |
R3 |
1H-NMR(CDCl3或CDCl3+CD3OD)δ |
63 |
OCONHPh |
8.501(s,1H),8.228(d,1H,J=8.0Hz),8.000(d,1H,J=8.0Hz),7.879(t,1H,J=7.8Hz),7.381(s,1H),7.714(t,1H,J=7.8Hz),7.361(d,2H,J=8.0Hz),7.244(t,2H,J=7.2Hz),7.017(t,1H,J=7.2Hz),5.705,5.561(Abq,2H,J=16.8Hz),5.328(s,2H),4.518(d,1H,J=11.2Hz),4.395(d,1H,J=11.2Hz) |
64 |
OCONH i-Pr. |
9.8022(d,1H),8.4071(s,1H),8.2465(d,1H,J=8.4Hz),7.9457(d,1H,J=8.0Hz),7.8480(t,1H,J=7.0Hz),7.7197(s,1H),7.6783(t,1H,J=7.0Hz),5.7705,5.4392,(Abq,2H,J=16.4Hz),5.4598(s,2H),4.4212(d,1H,J=11.8Hz),4.2169(d,1H,J=11.8Hz),3.7709-3.8068(m,1H),1.2605(d,6H) |
实施例66:制备dl-20-去乙基-20-羟甲基喜树碱
在dl-20-去乙基-20-乙酰氧基甲基喜树碱中加入甲醇(6ml)、水(2ml)和LiOH.H2O(33mg,0.78mmol)的混合物,然后在室温下搅拌反应混合物1.5小时。
减压浓缩反应混合物,以除去甲醇,然后在冰浴中搅拌30分钟,直到溶液的pH值用1N盐酸控制在3.5。过滤所形成的固体,然后相继用水、异丙醇和乙醚洗涤,在P2O5下,真空干燥3小时,制得黄白色固体的所需产物(83mg,66%)。
IR(KBr)3436,1743,1657cm-1
1H-NMR(400MHz,CDCl3+DMSO-d6=1∶1)δ
8.608(s,1H),8.157(d,1H,J=8.0Hz),8.106(s,1H),8.050(d,1H,J=8.0Hz),7.829(t,1H,J=7.3Hz),7.673(t,1H,J=7.3Hz),6.714(s,1H),5.441,5.360(Abq,2H,J=16.1Hz),5.304(s,2H),3.850-3.89(m,1H),3.681-3.722(m,1H)
LRMS(EI)m/e350(M+),320,306
HRMS m/e(M+)计算:350.0903,观察到的:350.0917
按与实施例39相同的方法,制备实施例67-69之通式(I)表示的混合物(R=H,n=1)。
实施例 |
R3 |
1H-NMR(CDCl3)δ |
67 |
OCH2OCH3 |
8.397(s,1H),8.240(d,1H,J=8.0Hz),7.939(d,1H,J=80Hz),7.838(t,1H,J=8.0Hz),7.700(s,1H),7.670(t,1H,J=8.0Hz),5.713,5.410(Abq,2H,J=16.4Hz),5.313(s,2H),4.626,4.587(Abq,2H,J=6.8Hz),4.187(s,1H),3.839(d,d,2H,J=10.4Hz),3.315(s,3H) |
68 |
OCH2OEt |
8.4192(s,1H),8.2621(d,1H,J=8.4Hz),7.9602(d,1H,J=8.4Hz),7.8588(t,1H),7.7240(s,1H),7.6917(t,1H,J=8.0Hz),5.7287,5.4221(Abq,2H,J=1 6.3Hz),5.3344(s,2H),4.7030,4.6508(Abq,2H,J=6.9Hz),4.2620(s,1H),3.8727(q,2H,J=7.0Hz),3.6212-3.6628(m,1H),3.5079-3.5554(m,1H),1.2136(t,3H,J=7.0Hz) |
69 |
OCH2OCH2CH2OCH3 |
8.3955(s,1H),8.1848(d,1H,J=8.4Hz),7.9156(d,1H,J=7.6Hz),7.8082(t,1H),7.7868(s,1H),7.6908(t,1H),5.6227,5.3642(Abq,2H,J=16.4Hz),5.2757(s,2H),4.6619(d,1H,J=16.4Hz),4.6218(d,1H,J=6.9Hz),3.8422(dd,2H,J=2.3,10.0Hz),3.6112-3.6380(m,1H),3.5719-3.5952(m,1H),3.4664-3.4924(m,2H),3.3192(s,3H) |
实验1:本发明化合物的细胞毒性1)材料癌细胞株
在确定细胞毒性时,使用购自ATCC(USA)的下列细胞株作为实验中的靶生物体:L1210(ATCCCCL219)、A172(ATCCCRL1620)、A427(ATCCHTB53)、A549(ATCCCCL185)、SK-NEP-1(ATCCHTB48)、CAOV-3(ATCCHTB75)、HEC-1-B(ATCCHTB113)、DLD-1(ATCCCCL221)和KATO-III(ATCCHTB103)、CAKI-2(ATCCHTB47)。癌细胞培养基的制备
使用蒸馏水来制备培养基。将1升的RPMI1640粉末培养基溶解在蒸馏水中,然后添加碳酸氢钠(2.0g),搅拌所得溶液。在将溶液的pH值调节至6.8-7.4后,用0.22μm的过滤器过滤培养基。在使用前将胎牛血清于56℃下热处理30分钟。试剂
从Gibco Co.购买用于癌细胞株的RPMI1640培养基、胎牛血清、碳酸氢钠和胰蛋白酶-EDTA缓冲液。由Sigma Co.购得MTT[(3,4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基双偶氮溴],而其他的试剂都是GR级的。测试材料
将购自Sigma Co.的喜树碱溶解在二甲基亚砜中,添加购自Dulbec Co的磷酸盐缓冲盐水(DPBS),在使用前将二甲基亚砜的浓度调节至10%。如果是将合成的测试物质溶解在二甲基亚砜中,二甲基亚砜的浓度也要调节到10%,而其他的添加DPBS。给予癌细胞的二甲基亚砜的最终浓度调节至低于1%,这对癌细胞的生长不产生影响。2)方法
使癌细胞在37℃、5%CO2下,于包含10%(V/V)胎牛血清(FBS)、50μg/ml艮地霉素和2g/L碳酸氢钠的RPMI 1640培养基中生长。(为除去支持物依赖性细胞株通过附着在培养烧瓶上的生长)除去培养基,用PBS洗涤一次,然后添加2-30ml的胰蛋白酶-EDTA缓冲液,单层癌细胞全部覆盖住,并静止一段时间。然后制备经培养的癌细胞的悬浮液,用培养基稀释,然后接种在96孔板中,使细胞的数量与表1中所述的相同。
将20μl样品(在对照孔中为PBS溶液)接种在96孔微板中,并培养3天。在培养后,通过SRB测定法(测试方法1)测定抗肿瘤活性。
对于如L1210的非支持物依赖性细胞,也接种细胞,使细胞的数量与下表1中所述的相同。在培养2天后,通过MMT测定法(测试方法2)测定对细胞的细胞毒性。
使用自动微板读数器测定光密度。计算细胞抑制率为50%的浓度作为GI50(计算机PCS,4.1版,用Probit法)。对于每一次的实验,在约2-3个孔中的光密度用于计算之中。
表1:接种细胞的数量
细胞株 |
来源 |
接种细胞的数量(每孔) |
性质 |
(人)A427或A549A172DLD-1HEC-1-bCAOV-3SK-NEP-1或CAKi-2KATO-III(鼠)L1210 | 肺CNS克隆子宫内膜卵巢肾胃白血病 | 500050005000500020000200001000014000 | 单层悬浮液 |
测定方法1:SRB测定法
细胞在培养基中的悬浮液180μl+样品或PBS20μl
在37℃、5%CO2下培养3天
用TCA沉淀
用蒸馏水洗涤5次,然后干燥
用0.4%SRB溶液染色30分钟
用1%HAc溶液洗涤5次
溶解在10mMTris缓冲液中
在520nm处测量光密度
计算GI50测定方法2:MTT测定法
细胞在培养基中的悬浮液180μl+样品或PBS20μl
在37℃、5%CO2下培养2天
添加50μlMTT溶液(2mg/ml在PBS溶液中)
培养4小时
在2000rpm下离心10分钟
去除上清液
将formazan溶解在DMSO中
在570nm处测量光密度
计算GI503)结果
各细胞株的细胞毒性结果见表2和3:表2
实施例 |
A427 |
A172 |
DLD-1 |
HEC-1-B |
CAOV-3 |
SK-NEP-1 |
KATO-III |
L1210 |
平均 |
18 |
0.14 |
0.73 |
0.65 |
1.8 |
1.21 |
0.0077 |
8.6 |
0.43 |
1.83 |
19 |
0.31 |
1.32 |
0.31 |
4.7 |
0.08 |
0.013 |
0.29 |
0.62 |
1 |
26 |
0.23 |
0.15 |
0.17 |
1.37 |
0.09 |
0.0031 |
0.46 |
2.18 |
0.35 |
29 |
0.07 |
0.05 |
0.26 |
7.68 |
0.12 |
0.015 |
0.21 |
0.38 |
1.19 |
30 |
0.057 |
0.065 |
0.064 |
1.65 |
0.025 |
0.00077 |
0.024 |
0.08 |
0.27 |
38 |
0.83 |
1.63 |
0.91 |
20.5 |
2.3 |
0.17 |
3.54 |
2.3 |
4.27 |
39 |
0.45 |
1.07 |
0.76 |
1.34 |
0.23 |
0.018 |
0.13 |
0.18 |
0.57 |
40 |
2.4 |
1.62 |
2.86 |
2.57 |
1.72 |
0.12 |
0.4 |
2.07 |
1.67 |
44 |
2.6 |
0.028 |
0.58 |
10.3 |
1.8 |
3.1 |
2.6 |
3.32 |
3 |
喜树碱 |
0.032 |
0.017 |
0.047 |
0.081 |
0.02 |
0.00019 |
0.092 |
0.024 |
0.041 |
表3
实施例 |
A549 |
A172 |
DLD-1 |
HEC-1-B |
CAOV-3 |
SK-NEP-1 |
TATO-III |
L1210 |
平均 |
20 |
0.08 |
0.54 |
1.04 |
4.22 |
0.023 |
0.061 |
1.05 |
0.73 |
0.968 |
21 |
2.51 |
11.34 |
9.68 |
10.16 |
2.74 |
25.16 |
10.17 |
5.55 |
9.66 |
25 |
0.94 |
1.09 |
5.53 |
11.44 |
0.65 |
7.55 |
7.86 |
1.65 |
4.59 |
27 |
3.43 |
0.4 |
1.87 |
7.54 |
0.47 |
0.17 |
0.44 |
2.34 |
2.08 |
28 |
0.98 |
11.54 |
4.35 |
12.33 |
2.29 |
8.89 |
23.64 |
6.45 |
8.81 |
41 |
1.15 |
3.05 |
13.88 |
16.23 |
2.79 |
1.90 |
1.33 |
10.71 |
6.38 |
42 |
0.092 |
0.58 |
0.45 |
1.99 |
0.78 |
0.82 |
8.08 |
0.6 |
1.674 |
43 |
0.25 |
1.83 |
6.84 |
8.88 |
0.87 |
0.99 |
23.98 |
2.25 |
5.74 |
46 |
0.56 |
2.36 |
4.92 |
25.27 |
0.64 |
3.11 |
20.88 |
4.23 |
7.75 |
62 |
0.05 |
0.6 |
0.48 |
5.15 |
0.32 |
2.45 |
3.7 |
0.67 |
1.68 |
63 |
0.34 |
1.3 |
1.99 |
7.95 |
0.74 |
6.17 |
6.13 |
1.3 |
3.24 |
64 |
3.28 |
4.89 |
10.2 |
39.75 |
9.79 |
51.3 |
31.48 |
2.6 |
19.16 |
65 |
2.06 |
7.43 |
19.91 |
20.2 |
5.45 |
7.66 |
53.69 |
5.75 |
15.27 |
66 |
0.88 |
2.52 |
6.24 |
6.43 |
0.76 |
10.79 |
4.04 |
1.39 |
4.13 |
67 |
0.2 |
3.31 |
0.95 |
5.4 |
1.58 |
2.78 |
9.17 |
0.65 |
3.01 |
68 |
1.72 |
4.55 |
6.98 |
14.23 |
7.18 |
16.3 |
16.64 |
1.39 |
8.62 |
69 |
1.55 |
1.92 |
11.32 |
19.78 |
2.63 |
2.13 |
36.61 |
9.73 |
10.71 |
喜树碱 |
0.02 |
0.05 |
0.07 |
0.4 |
0.01 |
0.2 |
0.4 |
0.06 |
0.2 |
实验2:根据本发明之化合物的抗肿瘤活性
抗肿瘤活性通常是通过测定对固形肿瘤的肿瘤生长抑制作用以及对人为肿瘤携带动物的寿命延长作用来证明的。
抗肿瘤活性是通过对L1210携带小鼠的寿命延长作用以及对B16携带小鼠的肿瘤生长抑制作用之实验来测定的。为估测对L1210白血病的抗肿瘤活性,腹膜内接种一定数量的L1210细胞(体外)以使其繁殖,在移植肿瘤后的第7天将宿主动物拉颈处死,从腹水中获得L1210细胞。
为调查对B16黑色素瘤的肿瘤生长抑制作用,将一定数量的B16细胞(体外)进行皮下接种以使其繁殖,在肿瘤移植后的第14天将宿主动物拉颈处死,重新切下肿瘤细胞。
以下将详细描述抗肿瘤活性的实验。实验动物
使用重约20克的雄性BDF1小鼠。动物室控制在23±2℃和60±5%的相对湿度,使用HEPA过滤器,并维持无特定的病原体(SPF)。实验2-1:根据本发明的化合物对L1210携带小鼠的寿命延长作用
将在体外得到的5×105个L1210白血病细胞腹膜内接种在BDF1小鼠中以使其繁殖。在移植肿瘤后的第7天将BDF1小鼠拉颈处死,从腹水中获得L1210肿瘤细胞。
在使用于测试之前,将肿瘤细胞至少传代3次。
在第0天将5X105个细胞腹膜内接种于BDF1小鼠,在第1、3和5天将样品腹膜内给药。每个实验组使用6只小鼠。
通过每组小鼠的平均存活时间估测抗肿瘤活性,并用ILS(%)值和第1和5天时的平均动物重量来表示。增加的寿命(ILS)
ILS(%)=[(样品处理组的平均存活时间/溶剂组的平均存活时间)-1]×100结果
在接种肿瘤后的第1、3和5天给以实施例18的化合物,总剂量为10mg/kg和50mg/kg时,分别增加L1210携带小鼠的寿命33%和64%(表4)。
表4:实施例18化合物对L1210的寿命延长作用
化合物 |
剂量(mg/kg) |
存活天数 |
30天存活数 |
体重变化(g) |
MST |
ILS(%) |
对照 | |
9.75 |
0 |
0/6 |
0 |
实施例18的化合物 |
10 |
13.00 |
33 |
0/6 |
-0.25 |
实施例18的化合物 |
50 |
16.00 |
64 |
0/6 |
-0.80 |
在接种肿瘤后的第1、3和5天给以实施例26的化合物,总剂量为10mg/kg和50mg/kg时,分别增加L1210携带小鼠的寿命72%和75%(表5)。
表5:实施例26化合物对L1210的寿命延长作用
化合物 |
剂量(mg/kg) |
存活天数 |
30天存活数 |
体重变化(g) |
MST |
ILS(%) |
对照 | |
9.125 |
0 |
0/6 |
+1.77 |
实施例26的化合物 |
10 |
15.67 |
72 |
0/6 |
-0.09 |
实施例26的化合物 |
50 |
16.00 |
75 |
0/6 |
-0.57 |
在接种肿瘤后的第1、3和5天给以实施例30的化合物,总剂量为10mg/kg和50mg/kg时,分别增加L1210携带小鼠的寿命(ILS)42%和119%(表6)。
表6:实施例30化合物对L1210的寿命延长作用
化合物 |
剂量(mg/kg) |
存活天数 |
30天存活数 |
体重变化(g) |
MST |
ILS(%) |
对照 | |
9.125 |
0 |
0/6 |
+1.77 |
实施例30的化合物 |
10 |
13.00 |
42 |
0/6 |
+0.74 |
实施例30的化合物 |
50 |
20.00 |
119 |
0/6 |
-0.57 |
因为实施例30的化合物比其他化合物表现出更好的剂量依赖性和ILS(%),本发明者等人尝试对实验动物给予高剂量的药物,来阐明更高剂量和抗肿瘤活性的关系。
如果在肿瘤接种后的第1、3和5天给予实施例30的化合物总剂量为8.75、17.5、35、70和140mg/kg,则ILS(%)分别为58.7、79.7、92.4、143和110%。
表7:各种剂量的实施例30化合物对L1210的寿命延长作用
化合物 |
剂量(mg/kg) |
存活天数 |
30天存活数 |
体重变化(g) |
MST |
ILS(%) |
对照 | |
9.875 |
0 |
0/6 |
+1.44 |
实施例30化合物 |
8.75 |
15.67 |
58.7 |
0/6 |
+0.7 |
实施例30化合物 |
17.5 |
17.75 |
79.7 |
0/6 |
+0.45 |
实施例30化合物 |
35 |
19.00 |
92.4 |
0/6 |
-0.12 |
实施例30化合物 |
70 |
24.00 |
143 |
0/6 |
-0.79 |
实施例30化合物 |
140 |
20.75 |
110 |
0/6 |
-0.93 |
如果在肿瘤接种后的第1、3和5天给予实施例30的化合物,在总剂量为70mg/kg时得到最大ILS为143%。
如图1所示,实施例30化合物对于腹膜内移植的L1210之抗肿瘤活性与喜树碱的抗肿瘤活性平行地进行估测。实施例30化合物的ILS(%)更高而且其范围更宽,表明作用更明显。实验2-2:本发明化合物对B16携带小鼠的肿瘤生长抑制作用
将体外得到的106个B16黑色素瘤细胞皮下移植在BDF1小鼠内以使其繁殖。在第14天B16黑色素瘤转移。将肿瘤携带小鼠拉颈处死,从其上重新切下除坏死中心的新鲜肿瘤。
在使用于测试之前,肿瘤细胞至少注射传代3次。
将1g待皮下接种的皮下宿主肿瘤在冷的灭菌盐水中均化,最终浓度为1g/10ml。将1∶10的肿瘤悬浮液皮下注射在所有的BDF1小鼠中,剂量为0.2ml/鼠。
用如此均化的溶液对小鼠进行皮下移植,在肿瘤移植7和8天时,选择具有一定大小肿瘤的小鼠进行实验。在接种肿瘤后的第8、12和16天时各实验组给予样品(0.1ml/10g)。每实验组使用8只小鼠。
通过直接测量肿瘤的直径使用下式计算肿瘤尺寸。
肿瘤尺寸=(a2b)/2
其中,b是最大的直径,a是垂直于b的直径,由此得到生长曲线。(图2)
以肿瘤尺寸为基础,根据下式计算肿瘤生长抑制率
IR(%)=(1-Twt/TWc)×100
其中,TWt是样品处理组的平均肿瘤体积(重量)。
TWc是对照组的平均肿瘤体积(肿瘤)。测试结果
如果在肿瘤接种后的第8、12和16天时,所给实施例30化合物的总剂量为35、70和140mg/kg,则IR(%)分别为27、54.8和67.72%(表8)。
表8:实施例30制备的化合物对B16黑色素瘤的肿瘤生长抑制作用
肿瘤尺寸 |
对照 |
1.喜树碱10mg/kg |
2.实施例30化合物35mg/kg |
3.实施例30化合物70mg/kg |
4.实施例30化合物140mg/kg |
第8天 |
87.69±13.58 |
85.95±13.15 |
86.93±11.34 |
86.21±10.12 |
86.94±9.34 |
第12天 |
598.50±93.59 |
458.56±53.87 |
411.88±71.52 |
320.06±71.79 |
328.98±76.57 |
第16天 |
2492.75±437.80 |
1035.98±129.36 |
1234.65±182.64 |
870.46±77.27 |
695.75±82.77 |
第20天 |
4194.83±285.66 |
1775.50±300.91 |
3061.34±752.34 |
1897.88±256.22 |
1353.91±134.36 |
IR(%) | |
57.8% |
27% |
54.8% |
67.72% |
肿瘤尺寸 |
对照 |
1.喜树碱10mg/kg |
2.实施例30化合物35mg/kg |
3.实施例30化合物70mg/kg |
4.实施例30化合物140mg/kg |
第20天 |
3.92±0.32 |
1.61±0.30 |
2.34±0.44 |
1.71±0.18 |
1.11±0.21 |
IR(%) | |
59% |
40% |
56% |
71.6% |
而且,在给予实施例30化合物后的第20天,切下的肿瘤重量之IR百分数分别为40、56和71.6%。
在总剂量为140mg/kg时得到最大IR为67.72%。肿瘤体积的变化概述于图2之中。如此的结果明确地说明,与喜树碱相比,实施例30的化合物不仅对腹水肿瘤具有非常好的抗肿瘤活性,而且毒性还非常小,安全范围较宽。