CN107699957B - 基于dna的融合基因定量测序建库、检测方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于DNA的融合基因定量测序建库方法，步骤包括：1)基因组DNA片段化；2)DNA片段分选；3)单向特异性PCR扩增，获得带融合位点的扩增产物；4)在扩增产物序列的3’端连接单链通用文库接头序列；5)通用PCR扩增，富集融合基因区域片段，经纯化、定量，获得测序文库。本发明还公开了通过上述方法构建DNA文库进行融合基因测序检测的方法、该方法的用途，以及用于上述建库方法的融合基因单向特异性引物组。本发明通过单向特异性扩增DNA片段，捕获融合序列，再通过富集获得NGS测序用DNA文库，不仅提高了捕获的有效数据的比例，而且加快了建库和检测的速度，适合用于FFPE样本或液态活检。
Description
技术领域
本发明涉及基因检测领域，特别是涉及融合基因的测序检测，更具体地说，是涉及融合基因的DNA测序文库的制备，以及使用该DNA测序文库进行融合基因的高通量测序检测的方法。
背景技术
自20世纪80年代早期第一个融合基因(BCR/ABL1)被检测证实，融合基因已成为多个癌种的重要标志，例如：BCR/ABL1用于检测慢性骨髓性白血病；EML4/ALK用于检测恶性肺腺癌；TMPRSS2/ERG用于检测前列腺癌，等等。
21世纪开始，随着靶向药物的兴起，癌症治疗药物，尤其非小细胞肺癌(NSCLC)的治疗药物，也开始使用融合基因所在的代谢通路。例如，2011年克唑替尼获得FDA许可用于ALK和ROS1基因融合的治疗；2015年艾乐替尼获得FDA许可用于ALK基因融合的治疗；索拉非尼和舒尼替尼获得RET基因融合的治疗许可。
在恶性肿瘤精准检测及个性化治疗概念被提出的今天，为了避免药物禁忌和耐受引起无效治疗，耽误宝贵的治疗时间，对于融合基因的有效特异检测成为临床医师给药的重要依据。早期的融合基因检测是在传统组织活检的基础上，采用荧光原位杂交、染色体条带分析以及RT-PCR分析技术来确认患者的肿瘤细胞是否发生了特定基因的基因融合。但是这些早期的细胞学及分子生物学技术对于融合基因的检测存在以下缺陷：1)检测时间久；2)假阳性率偏高；3)检测技术要求高，需要熟练有经验的检测人员，不利于标准化；4)在融合基因基因型细胞在癌组织中含量少的情况下，无法有效检出。随着NGS(高通量测序)技术的日益成熟，并全面进入临床基因检测领域，上述问题得到了有效解决。NGS检测技术具有灵敏度、特异性高，检测样本DNA需要量少，以及技术成熟、操作简便快速等一系列优点，在技术应用成本降低和通量不断增高的发展背景下，NGS技术成为融合基因检测的主流平台。
对于用测序或PCR方法检测融合基因，最为直接的方式是提取组织样本的RNA，通过反转录技术合成cDNA，捕获发生融合的外显子来分析完成。这样的方式是基于在基因组DNA层次，两个基因的融合点都发生融合的外显子序列间的内含子序列区域，而这个区域可能>1kb，即使是读长较长的一代测序技术，也无法有效覆盖(NGS测序技术的读长一般在100-400bp)，无法直接分析融合的内含子区域；有些基因融合的融合点的位置仅仅在COSMIC数据库中有报导的就超过20个，无法确认融合位置的位置样本，也不可能通过特异PCR来富集融合位置的序列用于测序，而发生剪切后的成熟融合基因RNA的两侧序列则是已知的，可以通过PCR扩增富集长度小于200bp的序列，用于NGS高通量测序。基于以上原因，目前主流的融合基因测序检测技术是基于RNA的。但是，随着液态活检概念的引入及其优势性，基于RNA的融合基因检测方法突显了其局限性。
液态活检技术，是指仅提取患者的血浆或尿液中游离的肿瘤DNA(ctDNA，circulating tumor DNA)，通过基因捕获技术来快速检测肿瘤细胞基因型。在肿瘤细胞的生活周期中，会发生细胞死亡(发生的多种原因，此处不再赘述)，从而将内部核酸物质释放出来，并进入循环系统或排泄系统，当然这里也存在健康细胞的核酸，常规情况下每毫升血浆中游离DNA的得率是5-20ng，这样少量的游离DNA中，ctDNA的含量可能只有0.1-5％，而正因为高灵敏的NGS技术的应用，使检测ctDNA成为可能。可以看到液态活检技术相比传统组织活检具有多种优势：1)对患者侵害小；2)可多次取样监测；3)无需对取样进行病理区分。因此，各种肿瘤细胞的检测技术都纷纷改进，以适用于液态活检。
然而，相比于ctDNA，ctRNA的碎片化程度更为严重，一般在10-25bp(ctDNA的碎片化程度一般在150-200bp)，因此，ctRNA在现有技术下并不适合用于融合基因的检测，这使得基于RNA的融合基因检测很难在液态活检中应用。
此外，基于RNA的融合基因检测还面临着大部分患者很难接受多次穿刺取样，只能取得病理检测剩余的FFPE(福尔马林固定石蜡包埋)样本的问题。FFPE样本由于甲醛固定的原因，其中的RNA已经发生了严重的降解，很难提供检测需要的足够长度的RNA片段。
目前，基于DNA的融合基因测序方法是通过在基因组文库中用探针捕获融合基因区域来进行鉴定的，这种方法的优点是目的性强，可以节约数据量和成本；缺点是容易脱靶，尤其是在液态活检中检测游离DNA时，有效数据比例低，需要提高起始DNA量和测序数据量，从而导致成本高，操作时间长，操作难度高，甚至影响检测。
发明内容
本发明要解决的技术问题之一是提供一种基于DNA的融合基因定量测序建库方法，它建库时间短，成本低，可应用于液态活检。
为解决上述技术问题，本发明的基于DNA的融合基因定量测序建库方法，包括以下步骤：
1)样本基因组DNA片段化，并对片段化产物进行纯化；
2)对纯化后的DNA片段进行分选，获取所需长度的DNA片段；
3)对分选所得DNA片段进行单向特异性PCR扩增，获得带有融合位点的扩增产物，对该扩增产物进行纯化；
4)在步骤3)所得扩增产物的序列的3’端上连接单链的通用文库接头序列，并对连接产物进行纯化；
5)进行通用PCR扩增，富集融合基因区域片段，并对扩增产物进行纯化、定量，获得融合基因测序DNA文库。
所述步骤2)可以用2％琼脂糖凝胶电泳分选350bp纯化后的DNA片段。
所述步骤3)，PCR扩增反应体系包括：2×Phusion HF PCR混合溶液25μl，Taq聚合酶1μl，DMSO 1μl，融合基因特异性引物混合物2μl，DNA片段分选产物15μl，无核酸酶水6μl，总体积50μl；PCR扩增反应条件为：99℃保持2min；99℃15s，60℃2min，共30个循环；10℃保持。所述融合基因特异性引物混合物中包含有序列为SEQ ID NO:1～20的引物。
所述步骤4)，通用文库接头序列如SEQ ID NO:21所示。
所述步骤5)，PCR扩增反应体系包括：2×Phusion HF PCR混合溶液25μl，FB引物1μl，P1B amp 1μl，连接纯化产物23μl，总体积50μl；PCR扩增反应条件为：94℃保持2min；94℃30s，50℃30s，68℃30s，共2个循环；98℃30s，62℃30s，68℃30s，共14个循环；68℃保持5min。其中，FB引物选自SEQ ID NO:22～30所示的序列；P1B amp的序列如SEQ ID NO:31所示。
本发明要解决的技术问题之二是提供一组用于上述建库方法的特异性扩增融合基因发生区域的引物，该引物组包含有SEQ ID NO:1～20所示的序列。
本发明要解决的技术问题之三是提供一种基于DNA的融合基因定量测序建库试剂盒，该试剂盒包含有用上述建库方法制备的DNA文库。
本发明要解决的技术问题之四是提供一种基于DNA的融合基因的检测方法，该方法使用上述建库方法制备的DNA文库进行融合基因的高通量测序检测。
本发明要解决的技术问题之五是提供上述基于DNA的融合基因的检测方法在液态活检中的应用。
本发明的基于DNA的融合基因测序文库构建方法，在将样本基因组DNA片段化后，通过单向特异性扩增，获得融合序列，再连接通用接头序列，通过该通用接头序列和特异性单向扩增引物上的通用序列，富集目的区域片段，扩增获得NGS测序用DNA文库，相比现有的DNA建库方法，具有以下优点和有益效果：
1.采用单引物延伸捕获目的区域，上游无需随机引物或通用接头序列，在捕获开始就可以避免通用引物造成的背景影响，基本能够满足大于50％有效数据的要求，最高可达读数的70％，解决了现有的基于RNA的融合基因检测难以获得适当质量的RNA的问题，可应用于FFPE样本或液态活检。
2.检测快速，成本低，两步PCR就可以获得测序文库，不需要繁杂的探针捕获过程，整个建库流程可以从3天缩短至6-8小时，成本降低50％，适合临床快速检测的需要。
3.适用范围广，可适合于所有ALK融合型基因，可检测位置融合型或已知融合型的位置断点。
4.由于肿瘤细胞的其他类型突变检测需要使用的也是DNA，因此无需分别提取RNA和DNA，从而可以节约时间和成本。
附图说明
图1为本发明实施例的基因融合reads分布图。
具体实施方式
为对本发明的技术内容、特点与功效有更具体的了解，现结合具体实施例，对本发明的技术方案做进一步详细的说明。
实施例中所用仪器设备、实验材料和试剂如下：
一、仪器
AB ProFlex PCR仪、IKA MS3Digital漩涡振荡器、IVGN Qubit 3.0荧光光度计、IKA Mini G掌上离心机；
二、材料
Rainin移液器(规格10、20、200、1000μl)、AXYGEN通用过滤接头(Universal FitFilter Tips，规格10、20、200、1000μl)、DYNAL DynaMagTM-2magnet磁力架、AmbionMagnetic Stand-96、AXYGEN 0.2ml透明平盖低吸附PCR薄壁管、AXYGEN无色低吸附离心管(1.5ml、2.0ml)；
三、试剂
分析纯无水乙醇、IVGN
dsDNA HS试剂盒、NEB T4DNA连接酶、NEB Phusion超保真PCR反应混合物、BECKMAN
XP、NEB
dsDNA片段化试剂。
实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
本实施例的ALK(间变性淋巴瘤激酶)融合基因测序文库的构建方法，具体流程为：
1.基因组DNA片段化
1)在冰上的离心管中混合下列组分：DNA(DNA提取自患者FFPE、血浆或活组织，用量为1-16μl，总量200-500ng)，10X片段化反应缓冲液2μl，加水补足18μl。
2)涡旋震荡3秒，短暂离心，置于冰上。
3)漩涡震荡小瓶的NEB
dsDNA片段化试剂3秒钟，短暂离心，取2μl加入到上述步骤1)的离心管中，漩涡震荡3秒并短暂离心。
4)进行片段化反应，反应程序为：37℃20分(FFPE样本为15分钟)，4℃保持。
5)短暂离心，放置冰上。
2.DNA片段化产物纯化
1)在DNA片段化产物中加入80μl无核酸酶水，然后转入1.5ml低吸附管中，加120μl(1.2倍体积)
AMPure XP磁珠，吸打混匀5次，室温放置5分钟。
2)将反应管置于磁力架上5分钟或直至溶液澄清，弃去上清。
3)加入500μl新鲜配制的70％乙醇，贴着磁力架轻轻上下移动反应管，以清洗磁珠，然后吸去上清。重复本步骤一次，以保证乙醇被充分吸去。
4)将反应管保持在磁力架上，室温干燥5分钟，从磁力架上取下，加入20μl无核酸酶水，旋涡振荡3s。
5)将反应管放置在磁力架上，静置2min，吸取上清到新的反应管，用于后续DNA片段分选。
3.DNA片段分选
用2％琼脂糖凝胶电泳分选350bp纯化后的DNA片段。
4.PCR扩增
PCR扩增反应体系包括：2×Phusion HF PCR混合溶液25μl，Taq聚合酶1μl，DMSO(二甲基亚砜)1μl，融合基因特异性引物混合物2μl，DNA片段分选产物15μl，无核酸酶水6μl，总体积50μl。
所述融合基因特异性引物混合物中包含有以下引物：
(1)GGCCAAGGCGGGCTCTGTGCACTCACCAATCATGA(SEQ ID NO:1)
(2)GGCCAAGGCGGGAGCTTCCGTTTTGGCTTGGCCTG(SEQ ID NO:2)
(3)GGCCAAGGCGCACCATCGTGATGGACACTGAAGGA(SEQ ID NO:3)
(4)GGCCAAGGCGCTATCTCTCTGCCTGGAGGGTGGTG(SEQ ID NO:4)
(5)GGCCAAGGCGGCAGTAAGAGCTGGTTGGGACCACA(SEQ ID NO:5)
(6)GGCCAAGGCGCTACCGGCAGATCCCTTTGCCTGCA(SEQ ID NO:6)
(7)GGCCAAGGCGGCCGAGCACGTAGTAACCATGCAAC(SEQ ID NO:7)
(8)GGCCAAGGCGCGCTATGTGCTCAGTTCCCTCCTCT(SEQ ID NO:8)
(9)GGCCAAGGCGGCAAACTCCATGGAAGCCAGAACAA(SEQ ID NO:9)
(10)GGCCAAGGCGCCCACCCTCTAGGGTTGTCAATGAA(SEQ ID NO:10)
(11)GGCCAAGGCGACAGGACCTCTTTGGACTGCAGTTT(SEQ ID NO:11)
(12)GGCCAAGGCGCCAAGCCACAGAGTTGGAGAAGAGC(SEQ ID NO:12)
(13)GGCCAAGGCGCTGTGCTCAGCCATTGGGTAGGGCA(SEQ ID NO:13)
(14)GGCCAAGGCGGTGCCATGGAGCCTAAGGAAGTTTC(SEQ ID NO:14)
(15)GGCCAAGGCGCAGGGAAGGCTGGGTGAACCAGCAG(SEQ ID NO:15)
(16)GGCCAAGGCGGGCAGAGTCATGTTAGTCTGGTTCC(SEQ ID NO:16)
(17)GGCCAAGGCGTCCTCCCCTGAGCTCTGAACCTTTC(SEQ ID NO:17)
(18)GGCCAAGGCGAGCTCCATCTGCATGGCTTGCAGCT(SEQ ID NO:18)
(19)GGCCAAGGCGAGGGCGCTCACCGAATGAGGGTGAT(SEQ ID NO:19)
(20)GGCCAAGGCGTTTGTGGCTAGAGGAGTCTGCGGTG(SEQ ID NO:20)
PCR扩增反应条件为：99℃保持2min；99℃15s，60℃2min，共30个循环；10℃保持。
5.PCR扩增产物纯化
1)在PCR扩增产物中加入60μl(1.2倍体积)
AMPure XP磁珠，旋涡振荡3s，室温放置5分钟。
2)将反应管置于磁力架上5分钟或直至溶液澄清，弃去上清。
3)加入500μl新鲜制备的70％乙醇，贴着磁力架轻轻上下移动反应管，以清洗磁珠，然后吸去上清。重复本步骤一次，以保证乙醇被充分吸去。
4)将反应管保持在磁力架上，室温干燥5分钟，从磁力架上取下，加入23μl无核酸酶水，旋涡振荡3s。
5)将反应管置于磁力架上，静置2min，吸取22μl上清到新的反应管，用于接头连接反应。
6.接头连接
在上述含有22μl纯化后的PCR扩增产物的反应管中加入T4连接酶缓冲液5μl、P1B-ADP2μl、T4连接酶1μl、无核酸酶水20μl，总计50μl。用移液器吸打混匀5次，室温孵育30min。产物可在-20℃保存。
P1B-ADP序列为：phos-ATCACCGACTGCCCATAGAGAGGCTGAGAC-NH2C6(SEQ ID NO:21)
7.接头连接产物纯化
1)在接头连接产物中加入60μl(1.2倍体积)
AMPure XP磁珠，旋涡振荡3s，室温放置5分钟。
2)将反应管置于磁力架上5分钟或直至溶液澄清，弃去上清。
3)加入500μl新鲜制备的70％乙醇，贴着磁力架轻轻上下移动反应管，以清洗磁珠，然后吸去上清。重复本步骤一次，以保证乙醇被充分吸去。
4)将反应管保持在磁力架上，室温干燥5分钟，从磁力架上取下，加入24μl无核酸酶水，旋涡振荡3s。
5)将反应管放置在磁力架上，静置2min，吸取23μl上清到新的0.2ml PCR管中，用于后续扩增反应。
8.PCR扩增
PCR扩增反应体系包括：2×Phusion HF PCR混合溶液25μl，FB X(X为选用的barcode的代码1～8、13)1μl，P1B amp 1μl，连接纯化产物23μl，总体积50μl。
FB X序列如下(加下划线的为barcode序列)：
FB1:CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGCTAAGGTAACGGCCAAGGCG(SEQ ID NO:22)
FB2:CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTAAGGAGAACGGCCAAGGCG(SEQ ID NO:23)
FB3:CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGAAGAGGATTCGGCCAAGGCG(SEQ ID NO:24)
FB4:CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTACCAAGATCGGCCAAGGCG(SEQ ID NO:25)
FB5:CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGCAGAAGGAACGGCCAAGGCG(SEQ ID NO:26)
FB6:CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGCTGCAAGTTCGGCCAAGGCG(SEQ ID NO:27)
FB7:CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTTCGTGATTCGGCCAAGGCG(SEQ ID NO:28)
FB8:CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTTCCGATAACGGCCAAGGCG(SEQ ID NO:29)
FB13:CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTCTAACGGACGGCCAAGGCG(SEQ ID NO:30)
P1B amp序列为:GTCTCAGCCTCTCTATGGGCAGT(SEQ ID NO:31)
PCR扩增反应条件为：94℃保持2min；94℃30s，50℃30s，68℃30s，共2个循环；98℃30s，62℃30s，68℃30s，共14个循环；68℃保持5min。
9.PCR扩增产物纯化
1)在PCR扩增反应结束后的体系中加入25μl
AMPure XP磁珠，旋涡振荡3s，室温放置5min。
2)将反应管置于磁力架上5分钟或直至溶液澄清，将上清(上清是需要的文库片段)吸入新的反应管中。
3)在吸取的上清中加入25μl
AMPure XP磁珠，旋涡振荡3s，室温放置5min。
4)将反应管置于磁力架上5分钟或直至溶液澄清，弃去上清。
5)加入500μl新鲜配制的70％乙醇，贴着磁力架轻轻上下移动反应管来清洗磁珠，然后吸去上清。重复本步骤一次，以保证乙醇被充分吸去。
6)将反应管保持在磁力架上，室温干燥5分钟，从磁力架上取下，加入50μl无核酸酶水，旋涡振荡3s，离心2s。
5)将反应管放置在磁力架上，静置2min，吸取上清到新的反应管，用于QUBIT定量。
10.QUBIT定量文库
1)用
dsDNA HS试剂盒在Qubit荧光光度计上定量样本DNA。
2)在一个1.5ml离心管中，合并597μl Qubit dsDNA HS缓冲液和3μl Qubit dsDNAHS试剂，漩涡振荡混匀，制备成Qubit工作溶液。
3)分别标记3个Qubit试管：#1标准品管、#2标准品管、#3样品管；在#1标准品管和#2标准品管中，加入190μl Qubit工作溶液，然后分别将Qubit standard HS#1和#2标准品10μl加入相应的#1标准品管和#2标准品管中，漩涡振荡混匀；在#3样品管中加入199μl Qubit工作溶液和1μl经分级分离纯化回收到的样品DNA(即前述用于QUBIT定量的经纯化后的PCR扩增产物)，漩涡振荡混匀。
4)静置2分钟后，打开Qubit，选择DNA测定，重新校正#1标准品管和#2标准品管中的标准品。
5)将#3样品管放入Qubit中读数定量，并计算使用1μl样品的定量值。
6)将产物稀释至22ng/ml(100pM)，获得可用于Ion Torrent平台高通量测序的DNA文库。
将上述DNA文库送入Ion Torrent高通量测序仪进行测序检测。
基因融合检测方法的原理是：利用二代测序的单分子reads(每个read来自于一个单分子DNA序列)，如果同一个reads(包含双端和单端)的两部分分别比对到基因组的不同位置，且不为repeat(重复)区域，那么这个read就可能是潜在的发生融合的reads。最后根据cutoff>100，筛选出阳性的融合基因及其配对基因。具体步骤如下：
1)使用fastqc对所有原始测序的reads进行质量控制，然后去除接头序列。
2)取质量合格的序列，用BWA比对软件，与hg19基因组染色体进行比对。
3)筛选出目的基因(ALK)上的非正常比对的reads。
4)将非正常比对的reads，转化成fasta格式，利用blat软件比对到基因组上，找出所有可能的匹配位置，与hg19中基因的位置做maping，并计算个数。
5)根据reads个数>100个，并去掉几个基因组经常出现的重复区间，用IGV查看基因融合reads分布，筛选出阳性的融合基因及其配对基因。
检测结果显示EML4与ALK基因发生融合(参见图1所示)。
序列表
<110> 领星生物科技（上海）有限公司
<120> 基于DNA的融合基因定量测序建库、检测方法及其应用
<130> CPC-NP-17-100462
<160> 31
<170> PatentIn version 3.3
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<212> DNA
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<221> misc_feature
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<211> 35
<212> DNA
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<220>
<221> misc_feature
<223> 引物
<400> 6
ggccaaggcg ctaccggcag atccctttgc ctgca 35
<210> 7
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物
<400> 7
ggccaaggcg gccgagcacg tagtaaccat gcaac 35
<210> 8
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物
<400> 8
ggccaaggcg cgctatgtgc tcagttccct cctct 35
<210> 9
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物
<400> 9
ggccaaggcg gcaaactcca tggaagccag aacaa 35
<210> 10
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物
<400> 10
ggccaaggcg cccaccctct agggttgtca atgaa 35
<210> 11
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<212> DNA
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<220>
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<223> 引物
<400> 11
ggccaaggcg acaggacctc tttggactgc agttt 35
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<212> DNA
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<223> 引物
<400> 12
ggccaaggcg ccaagccaca gagttggaga agagc 35
<210> 13
<211> 35
<212> DNA
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<220>
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<223> 引物
<400> 13
ggccaaggcg ctgtgctcag ccattgggta gggca 35
<210> 14
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物
<400> 14
ggccaaggcg gtgccatgga gcctaaggaa gtttc 35
<210> 15
<211> 35
<212> DNA
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<220>
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<223> 引物
<400> 15
ggccaaggcg cagggaaggc tgggtgaacc agcag 35
<210> 16
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<212> DNA
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<220>
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<223> 引物
<400> 16
ggccaaggcg ggcagagtca tgttagtctg gttcc 35
<210> 17
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<212> DNA
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<220>
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<223> 引物
<400> 17
ggccaaggcg tcctcccctg agctctgaac ctttc 35
<210> 18
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物
<400> 18
ggccaaggcg agctccatct gcatggcttg cagct 35
<210> 19
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物
<400> 19
ggccaaggcg agggcgctca ccgaatgagg gtgat 35
<210> 20
<211> 35
<212> DNA
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<220>
<221> misc_feature
<223> 引物
<400> 20
ggccaaggcg tttgtggcta gaggagtctg cggtg 35
<210> 21
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<223> 接头
<400> 21
atcaccgact gcccatagag aggctgagac 30
<210> 22
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物
<400> 22
ccatctcatc cctgcgtgtc tccgactcag ctaaggtaac ggccaaggcg 50
<210> 23
<211> 50
<212> DNA
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<220>
<221> misc_feature
<223> 引物
<400> 23
ccatctcatc cctgcgtgtc tccgactcag taaggagaac ggccaaggcg 50
<210> 24
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物
<400> 24
ccatctcatc cctgcgtgtc tccgactcag aagaggattc ggccaaggcg 50
<210> 25
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物
<400> 25
ccatctcatc cctgcgtgtc tccgactcag taccaagatc ggccaaggcg 50
<210> 26
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物
<400> 26
ccatctcatc cctgcgtgtc tccgactcag cagaaggaac ggccaaggcg 50
<210> 27
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物
<400> 27
ccatctcatc cctgcgtgtc tccgactcag ctgcaagttc ggccaaggcg 50
<210> 28
<211> 50
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<223> 引物
<400> 28
ccatctcatc cctgcgtgtc tccgactcag ttcgtgattc ggccaaggcg 50
<210> 29
<211> 50
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<223> 引物
<400> 29
ccatctcatc cctgcgtgtc tccgactcag ttccgataac ggccaaggcg 50
<210> 30
<211> 50
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<221> misc_feature
<223> 引物
<400> 30
ccatctcatc cctgcgtgtc tccgactcag tctaacggac ggccaaggcg 50
<210> 31
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物
<400> 31
gtctcagcct ctctatgggc agt 23
Claims (7)
1.基于DNA的融合基因定量测序建库方法，所述方法用于非疾病诊断和治疗目的，其特征在于，包括以下步骤：
1)样本基因组DNA片段化，并对片段化产物进行纯化；
2)对纯化后的DNA片段进行分选，获取所需长度的DNA片段；
3)对分选所得DNA片段进行单向特异性PCR扩增，获得带有融合位点的扩增产物，对该扩增产物进行纯化；所述PCR扩增的引物组序列如SEQ ID NO:1～20所示；
4)在步骤3)所得扩增产物的序列的3’端上连接单链的通用文库接头序列，并对连接产物进行纯化；
5)进行通用PCR扩增，富集融合基因区域片段，并对扩增产物进行纯化、定量，获得融合基因测序DNA文库。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)，用2％琼脂糖凝胶电泳分选出350bp纯化后的DNA片段。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)，PCR扩增反应体系包括：2×Phusion HFPCR混合溶液25μl，Taq聚合酶1μl，DMSO 1μl，融合基因特异性引物混合物2μl，DNA片段分选产物15μl，无核酸酶水6μl，总体积50μl；PCR扩增反应条件为：99℃保持2min；99℃15s，60℃2min，共30个循环；10℃保持。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)，所述通用文库接头序列如SEQ IDNO:21所示。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤5)，PCR扩增反应体系包括：2×Phusion HFPCR混合溶液25μl，FB引物1μl，P1B amp 1μl，连接纯化产物23μl，总体积50μl；所述FB引物选自SEQ ID NO:22～30所示的序列；所述P1B amp的序列如SEQ ID NO:31所示；PCR扩增反应条件为：94℃保持2min；94℃30s，50℃30s，68℃30s，共2个循环；98℃30s，62℃30s，68℃30s，共14个循环；68℃保持5min。
6.用于权利要求1-5任一项所述方法的特异性扩增融合基因发生区域的引物组，其特征在于，所述引物组的序列如SEQ ID NO:1～20所示。
7.基于DNA的融合基因定量测序建库试剂盒，其特征在于，该试剂盒包含有权利要求1-5任一项所述方法制备的DNA文库。
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