CN107674922A - 黄瓜抗黄瓜花叶病毒病基因cmv的InDel标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明“黄瓜抗黄瓜花叶病毒病基因cmv的InDel标记及其应用”，涉及生物技术辅助育种领域。黄瓜抗黄瓜花叶病毒病基因cmv紧密连锁的InDel标记，其中所述标记的引物的核苷酸序列为：InDel‑cmv3‑F/InDel‑cmv3‑R,所述InDel标记扩增的与黄瓜抗黄瓜花叶病毒病基因cmv连锁的特征条带223bp；所述InDel标记扩增的与黄瓜感黄瓜花叶病毒病基因CMV连锁的特征条带为245bp；本发明获得的标记具有高效、限制少的优点，对选育抗黄瓜花叶病毒病的黄瓜材料提高了效率，缩短了育种周期。

Description

黄瓜抗黄瓜花叶病毒病基因cmv的InDel标记及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术辅助育种技术领域，特别涉及一种黄瓜抗黄瓜花叶病毒病基因cmv的InDel标记及其在黄瓜育种材料选择中的应用。

背景技术

黄瓜是重要的蔬菜作物之一，病毒病是影响黄瓜生产的主要病害，黄瓜花叶病毒(CMV)是引起病毒病的一种主要病原。黄瓜受到病毒病侵染后，初期新叶会出现明脉，后期叶片上有形状不规则的淡绿色或黄色斑点，即花叶症状，绿色部分极不平整，叶缘向外翻，叶片变窄，新叶上有疱斑，严重时叶片呈现皱缩畸形，植株矮化直至死亡。果实感病后，会出现螺旋状扭曲，瓜表面瘤状凸凹不平、畸形，果肉僵硬且味苦涩，产量和品质急剧下降。

目前，国内外学者对黄瓜CMV抗性遗传规律研究较多，但由于所用试验材料、试验设计不同而对遗传规律有不同的观点。1961年，Wasuwat等研究发现黄瓜对CMV的抗性是由显性单基因控制的。1969年，Kooistra等在试验中得到了相互独立的3对抗CMV基因且都为显性。1997年，Wang等经过试验得到单一隐性基因对CMV的抗性起决定作用。黄焕焕(2007)等以抗CMV黄瓜材料‘F-3’和感CMV的材料‘HZL04-1’为亲本，构建F2群体，研究发现黄瓜对CMV的抗性是由细胞核基因决定的,受单一隐性基因控制。王军辉(2010)等利用F2群体研究表明黄瓜对CMV的抗性是由3个基因控制的。迄今为止，关于黄瓜CMV抗性QTL研究很少，仅王军辉对黄瓜CMV进行定位，共检测到17个控制CMV抗性的QTL位点，位于黄瓜第3，4，5，6染色体上。其中主效QTL cmv17位于SSRc68和SSR20218两个标记之间，遗传距离分别为5cM和0.5cM。由此可见，目前报道的与黄瓜花叶病毒病抗性连锁的标记只有SSR标记，并未见其他类型标记(如InDel、SNP等)的研究。

发明内容

基于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供了一种与黄瓜抗黄瓜花叶病毒基因cmv紧密连锁的InDel标记，并提供了该标记在筛选对黄瓜花叶病毒病抗病或感病的黄瓜种质资源上的应用。

本发明的技术方案如下：

一种与黄瓜抗黄瓜花叶病毒病基因cmv连锁的InDel标记，其特征在于：所述标记的引物核苷酸序列如下：

InDel-cmv3-F/InDel-cmv3-R:ATCCGTCGTGATTGTGAA/ATTTCGCTCCCAACACTC

所述引物扩增的与黄瓜抗黄瓜花叶病毒病基因cmv连锁的特征条带为223bp，其核苷酸序列如Seq ID No.1所示；

所述引物扩增的与黄瓜感黄瓜花叶病毒病基因CMV连锁的特征条带为245bp，其核苷酸序列如Seq ID No.2所示。

上述InDel标记在筛选具有抗黄瓜花叶病毒病基因cmv的黄瓜种质资源中的应用，其特征在于，包括如下步骤：

(1)采用所述InDel标记的引物对待选黄瓜材料的基因组DNA进行PCR扩增；所述标记的引物核苷酸序列如下：

InDel-cmv3-F/InDel-cmv3-R:ATCCGTCGTGATTGTGAA/ATTTCGCTCCCAACACTC

(2)对扩增结果进行凝胶电泳检测；

(3)从检测结果中筛选出与抗黄瓜花叶病毒病基因cmv连锁的InDel标记特征条带一致的材料，所述与抗黄瓜花叶病毒病基因cmv连锁的InDel标记特征条带为223bp，其核苷酸序列如Seq ID No.1所示。

优选地，所述PCR扩增的反应试剂按以下10μl反应体系的比例添加：

1.5ng/μl DNA模板，所述引物正向和反向各5ng/μl，0.5μl/μl GoGreenMaster Mix，其余为双蒸水。

优选地，所述PCR扩增的反应程序为：94℃预变性4分钟；94℃变性15秒，55℃退火15秒，72℃延伸30秒，35个循环；72℃保温5分钟，16℃保存。

上述任一应用中，其特征在于，其中所述凝胶电泳检测，指采用6％的非变性聚丙烯酰胺凝胶，于150V恒功率电泳分离，最后银染显色。

一种用于筛选具有抗黄瓜花叶病毒病基因cmv的黄瓜种质资源的试剂盒，其特征在于：包含具有如下核苷酸序列的引物：

InDel-cmv3-F/InDel-cmv3-R:ATCCGTCGTGATTGTGAA/ATTTCGCTCCCAACACTC。

优选地，所述引物包含于PCR扩增预混试剂中，所述PCR扩增预混试剂中还含有Taq酶、dNTPs。

本发明以黄瓜感CMV高代自交系‘65G’和黄瓜抗CMV高代自交系‘02245’为亲本构建的含140个株系的F₉代RIL群体和含115个株系的DH群体为试验材料,通过苗期人工摩擦接种抗病鉴定技术,对黄瓜抗黄瓜花叶病毒病基因cmv进行了遗传分析。以RIL群体为作图群体，利用SSR及InDel标记技术，进行遗传图谱构建,并结合构建的遗传图谱进行cmv基因定位研究，并获得与主效QTL cmv紧密连锁的InDel标记InDel-cmv3，与cmv的遗传距离为1.9CM。所述InDel标记特异性引物扩增的与黄瓜抗黄瓜花叶病毒病基因cmv连锁的特征条带为223bp，核苷酸序列如Seq ID No.1；所述InDel标记特异性引物扩增的与黄瓜感黄瓜花叶病毒病基因CMV连锁的特征条带为245bp，核苷酸序列如Seq ID No.2所示。

本发明通过利用中国农业科学院蔬菜花卉研究所黄瓜课题组选育的不同遗传背景的76份自交系和杂交种材料进行验证，结果表明InDel-cmv3验证的正确率为92.10％.

本试验不仅为黄瓜抗黄瓜花叶病毒病基因cmv的精细定位和分子克隆奠定了基础，同时也为利用分子标记辅助选育具有抗黄瓜花叶病毒病基因的黄瓜新品种提供了高效的途径。本发明基于开发的InDel标记引物提供用于辅助筛选具有特定黄瓜花叶病毒病抗性的黄瓜新品种的方法，该方法中，采用所述InDel标记的特异性引物扩增待测材料的DNA，然后对扩增产物进行电泳检测，扩增产物可能出现三种情况：第一种是仅仅出现一条223bp条带，这种为隐型纯合材料(抗黄瓜花叶病毒病)；另一种是223bp条带和245bp条带都出现，这种是显性杂合材料(感黄瓜花叶病毒病)；第三种是仅仅出现245bp条带，这种为显性纯合材料(感黄瓜花叶病毒病)。通过本发明提供的方法，可以在黄瓜候选材料的任何阶段对其进行黄瓜花叶病毒病抗性鉴定和筛选，具有高效、限制少、准确的优点。

附图说明

图1.采用本发明所述的InDel-cmv3标记的特异性引物验证不同黄瓜材料的电泳检测结果；

红色字体对应的泳道为表型与标记条带验证不一致的单株。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明作进一步的详细说明，但并不限制本发明的范围。如无特殊说明，下述实施例中使用的操作均为常规方法，所采用的试剂均可以商购获得。

生物材料的来源和记载出处

本研究所用的试验材料为黄瓜感CMV高代自交系‘65G’和黄瓜抗CMV高代自交系‘02245’。以‘65G’为母本，‘02245’为父本杂交，获得F₁，通过单粒传的方法获得包含140个株系的F₉代RIL群体，通过大孢子培养技术获得包含115个株系的DH群体。

65G(P₁)：欧洲温室型黄瓜，雌性系，抗黑星病，霜霉病，白粉病，枯萎病，感病毒病：黄瓜花叶病毒，西瓜花叶病毒，番木瓜环斑病毒，小西葫芦黄化花叶病毒，为现有已知品种。在Walters和Wehner等人于1998年在《Hortscience》第33卷第6期第1050-1052页上发表的文章《Independence of the mj nematode resistance gene from 17gene loci incucumber》中也有记载。本实验室有保存，保证自申请日起二十年内向公众发放用于验证实验。

02245(P₂)：华北类型黄瓜，耐热，抗霜霉病，白粉病，枯萎病，抗病毒病：黄瓜花叶病毒，西瓜花叶病毒，番木瓜环斑病毒，小西葫芦黄化花叶病毒，分枝能力强，为现有已知品种。在Walters和Wehner等人于1998年在《Hortscience》第33卷第6期第1050-1052页上发表的文章《Independence of the mj nematode resistance gene from 17gene loci incucumber》中也有记载。本实验室有保存，保证自申请日起二十年内向公众发放用于验证实验。

本研究所用的验证群体是76份黄瓜自交系和杂交种材料：包括华北类型，欧洲温室类型，以及华北类型和欧洲温室类型的杂交种等。本实验室有保存，保证自申请日起二十年内向公众发放用于验证实验。

主要试剂

SSR引物来自国际黄瓜基因组计划(ICUGI)；

PCR实验使用Shanghai PromeGa公司的GoTaq Green Master Mix；

凝胶电泳使用康润公司的40％非变性聚丙烯酰胺，将其稀释至6％后使用。

实施例1.黄瓜抗黄瓜花叶病毒基因cmv的InDel标记InDel-cmv3的获得

步骤1.黄瓜抗黄瓜花叶病毒抗病性鉴定

本试验以黄瓜高代自交系‘65G’(感病)和‘02245’(抗病)为母本和父本，自交获得F₁群体，通过单粒传法获得RIL群体和通过大孢子培养获得DH群体。

2016年秋季，栽培试验在中国农业科学院蔬菜花卉研究所北圃场玻璃温室内进行，采用完全随机区组设计，将亲本65G、02245、F₁、RIL群体、DH群体种植于21孔的穴盘中，3次重复，每重复7株，田间常规栽培管理。在黄瓜第一片真叶充分展开时，进行人工摩擦接种。在接种20天后，进行抗病性调查。

本试验将病情划分为6个等级，分别为：0级，无症状：1级，心叶明脉或轻花叶；3级，心叶及中部叶片花叶；5级，心叶及中部叶片花叶，少数叶片畸形、皱缩；7级，重花叶，多数叶片畸形、皱缩；9级，重花叶，叶片明显畸形，植株矮化，甚至死亡。

根据调查的病情级数计算病情指数(DI)，计算公式如下：病情指数(DI)＝∑(病级数x各级株数)/(最高病级数x调查总株数)x100，然后进行抗病性评价，标准为：0＜DI≤5，高抗；5＜DI≤20，抗病；20＜DI≤40，中抗；40＜DI≤60，感病；DI＞60，高感。

使用Excel 2007软件进行数据统计分析，绘制频率分布柱形图进行遗传分析。

结果显示：对鉴定数据进行分析，发现两亲本的病情指数存在较大差异，感病亲本“65G”的病情指数为50.43，表现为感病；抗病亲本“02245”的病情指数为15.75，显著低于感病亲本，表现为抗病；F₁病情指数均值为35.80，介于两亲本之间，且偏向感病；RIL和DH群体各株系病情指数的平均值分别为38.43和25.63。从RIL和DH群体的病情指数分布图可以看出，均表现为连续分布，且接近正态分布，表明在RIL和DH群体中该抗性是受数量性状控制的。

步骤2.DNA提取和分子标记分析

取黄瓜植株的嫩叶，用改良的CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)法提取亲本及F1、RIL、DH群体各单株的基因组DNA。

PCR反应体系为：总反应体系10μL，3μL DNA(5.0ng·μL^-1)，正向和反向引物(50ng/μL^-1)各1μL，5μL GoGreen Master Mix(Promega公司产品)。

引物使用黄瓜全基因测序开发的SSR引物(Ren et al.，2009；Cavagnaro et al.，2010)。

PCR扩增程序为：94℃预变性4min；94℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸30s，35个循环；72℃保温5min，16℃forever。

扩增产物用6％非变性聚丙烯酰胺凝胶分离，电泳缓冲液为0.5×TBE，150V恒功率电泳分离1h 5min，电泳后银染显色，统计带型。

步骤3.初步定位的SSR分子标记筛选、数据统计及连锁图构建

共显性标记的统计方法：与母本(65G)一致的带型记为a，与父本(02245)一致的带型记为b，杂合的带型记为h。显性标记的统计方法：若母本为显性标记，则分离群体中和母本带型一致的单株记为d，和父本带型一致的记为b；若父本为显性标记，则分离群体中和母本带型一致的单株记为a，和父本带型一致的记为c，未扩增出的或模糊不清的记为u。

结果显示：

利用两个亲本“65G”和“02245”筛选多态性引物，从102245对SSR引物中筛选出了296对有多态的，多态率为22.98％，根据其物理位置，挑选出97对均匀分布在各个染色体上的SSR引物对RIL群体进行分析，构建了包含7个连锁群的黄瓜遗传图谱,分别对应黄瓜7条染色体。图谱总长度分别是730.0cM，标记的平均距离为7.5cM，每条连锁群的标记数为6—32个。

利用65G×02245构建的遗传连锁图，结合病情鉴定结果对黄瓜花叶病毒病抗性进行QTL分析。对RIL群体病情指数进行统计分析，在黄瓜第6染色体32.7cM处检测到1个与CMV抗性有关的QTL位点cmv，介于SSR9-56和SSR11-1标记之间，LOD值为11.58，贡献率为31.7％。步骤4.InDel标记开发及cmv连锁群分子标记加密

针对初定位的染色体区段，结合黄瓜基因组序列的数据，利用primer3.0软件在目标区段共设计了3对InDel标记引物，对连锁群进行分析标记加密。最终得到一个总长度为12.0cM包含8个标记的连锁群，获得与黄瓜抗黄瓜花叶病毒病基因cmv连锁距离为1.9cM的InDel标记InDel-cmv3。

步骤5.PCR扩增所得差异片段的回收纯化及测序

(1)目的片段的回收

采用煮沸法。具体操作为：先从胶上将目标条带挖下来装入1.5mL的Eppendorf管内，向管内加入100μL超纯水，加水量视胶带颜色深浅而定；常温下浸泡24h，转入95℃水浴锅(或PCR仪)中煮30min后，5000rpm离心3min。产物即可取上清3μL做模板进行PCR扩增，剩余产物置-20℃保存备用。

(2)目的片段的纯化

用PCR产物直接纯化方法。在PCR产物中加入2倍体积的无水乙醇，-20℃过夜放置，1,2000rpm离心5min就可以得到纯化产物。

(3)目的片段与载体的连接

反应体系为10μL：PMD18-T Vector1.0μL；Ligation bufferⅠ5.0μL；目的片段4.0μL。

在超净工作台上加样，混匀反应物，短暂离心，16℃连接约1h，过夜也不影响连接效率。

(4)连接产物的转化

1)取出感受态细胞，SolutionA，SolutionB，置于冰上融化；

2)感受态(50μL)+5μLSolutionA+4μLSolutionB+46μL预冷去离子水；

3)用冷却的无菌枪头将上述悬浮液分装到1.5mL离心管，每管加入105μL，再加入5μL的目的DNA，轻旋混匀；

4)42℃水浴热激90s，注意不要晃动离心管；

5)快速将管转移到冰浴器中，使细胞冷却3～5min；

6)加入500μL LB液体培养基。在37℃，150rpm摇床上预培养1h；

7)将菌液涂布到含有100μg·mL^-1Amp、25μg·mL^-1IPTG和40μg·mL^-1X-GAL的LB固体培养基上，用无菌的弯头玻璃棒轻轻的将菌液均匀涂开，置于室温直至液体被吸收；

8)倒置平板，37℃培养12～16h。

(5)重组质粒的蓝白斑筛选

经37℃培养后，在涂布X-Gal/IPTG的LB平板上出现少量蓝色菌落和较多的白色菌落，其中白色菌落为重组克隆子。挑取白色单菌落涂抹在划好方格的LB液体培养基中，37℃，150rpm过夜培养。

(6)菌落PCR的检测

吸取1μL菌液作为模板进行PCR扩增。取4μL PCR产物，经1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，与PCR Marker标准分子量相比较检测插入片段的大小，与插入目的片段大小一致的克隆即为阳性克隆。

(7)克隆后载体的测序与分析

取3个阳性克隆菌液在甘油(330μL甘油中加入1000μL菌液)中各保存两份，一份-20℃保藏，一份送去测序。

其中InDel-cmv3标记引物InDel-cmv3-F/InDel-cmv3-R扩增出的与黄瓜抗黄瓜花叶病毒病基因cmv连锁的特征片段的核苷酸序列如Seq ID No.1所示；与黄瓜感黄瓜花叶病毒病基因CMV连锁的特征片段的核苷酸序Seq ID No.2所示。

实施例2.与黄瓜cmv基因连锁的InDel-cmv3标记的验证

用对实施例1获得的与cmv基因连锁的InDel标记InDel-cmv3对76份黄瓜自交系和杂交种进行验证，以确定该标记用于分子标记辅助选择的准确性。验证采用实施例1中步骤2中的PCR扩增和检测方法。

结果发现，在这76份黄瓜材料中共有70份的带型反映的表型数据与田间调查结果一致，经计算准确率为92.10％，见图1。

Claims (7)

1.一种与黄瓜抗黄瓜花叶病毒病基因cmv连锁的InDel标记，其特征在于：所述标记的引物核苷酸序列如下：

InDel-cmv3-F/InDel-cmv3-R:ATCCGTCGTGATTGTGAA/ATTTCGCTCCCAACACTC

所述引物扩增的与黄瓜抗黄瓜花叶病毒病基因cmv连锁的特征条带为223bp，其核苷酸序列如Seq ID No.1所示；

所述引物扩增的与黄瓜感黄瓜花叶病毒病基因CMV连锁的特征条带为245bp，其核苷酸序列如Seq ID No.2所示。

2.权利要求1所述InDel标记在筛选具有抗黄瓜花叶病毒病基因cmv的黄瓜种质资源中的应用，其特征在于，包括如下步骤：

(1)采用所述InDel标记的引物对待选黄瓜材料的基因组DNA进行PCR扩增；

(2)对扩增结果进行凝胶电泳检测；

(3)从检测结果中筛选出与抗黄瓜花叶病毒病基因cmv连锁的InDel标记特征条带一致的材料，所述与抗黄瓜花叶病毒病基因cmv连锁的InDel标记特征条带为223bp，其核苷酸序列如Seq ID No.1所示。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述PCR扩增的反应试剂按以下10μl反应体系的比例添加：

1.5ng/μl DNA模板，所述引物正向和反向各5ng/μl，0.5μl/μl GoGreen MasterMix，其余为双蒸水。

4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于，所述PCR扩增的反应程序为：94℃预变性4分钟；94℃变性15秒，55℃退火15秒，72℃延伸30秒，35个循环；72℃保温5分钟，16℃保存。

5.根据权利要求2-4任一所述的应用，其特征在于，其中所述凝胶电泳检测，指采用6％的非变性聚丙烯酰胺凝胶，于150V恒功率电泳分离，最后银染显色。

6.一种用于筛选具有抗黄瓜花叶病毒病基因cmv的黄瓜种质资源的试剂盒，其特征在于：

包含具有如下核苷酸序列的引物：

InDel-cmv3-F/InDel-cmv3-R:ATCCGTCGTGATTGTGAA/ATTTCGCTCCCAACACTC。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述引物包含于PCR扩增预混试剂中，所述PCR扩增预混试剂中还含有Taq酶、dNTPs。