CN107586861A - 用于检测血清型产气肠杆菌分型的悬液芯片及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了用于检测产气肠杆菌血清型1‑8型的特异寡核苷酸序列，该寡核苷酸包括：（1）产气肠杆菌1型、2型、3型、5型、6型、7型和8型的wzy基因中选取的一种DNA片段；（2）产气肠杆菌4型的orf8基因中选取的一种DNA片段。本发明结合Bio‑Rad公司的Bio‑Plex 200悬液芯片系统，建立了一套用于检测产气肠杆菌血清型1‑8型的悬液芯片检测系统及其检测方法，填补了关于产气肠杆菌的血清学分型技术的空白，对于这一重要致病菌的临床检测和流行病学监测具有重要意义。

Description

用于检测血清型产气肠杆菌分型的悬液芯片及应用

技术领域

本发明属于细菌检测方法技术领域，涉及用于我国常见血清型产气肠杆菌分型的悬液芯片及应用。

背景技术

血清学分型自上世纪30年代开始被广泛使用，至今已有超过80年的历史，可在种/属内将细菌进一步分类，是一种重要的细菌鉴定方法，目前，血清学鉴定方法是使用最为普遍的致病菌鉴定和溯源方法。例如：我国针对志贺氏菌（GB/T 4789.5-2012）、致泻性大肠肝菌（GB/T 4789.6-2003）、大肠肝菌O157：H7（GB/T 4789.36-2008）、副溶血狐菌（GB/T4789.7-2013）、沙门氏菌（GB/T 4789.4-2010）和小肠结肠耶尔森菌（GB/T 4789.8-2008）等致病菌检验的国家标准中均采用了血清学鉴定的方法。血清学鉴定主要是基于细菌表面多糖抗原和鞭毛抗原的免疫原性进行。表面抗原位于细菌最外层，长期受到宿主免疫系统和其它环境因素的强大选择压力，而细菌表面抗原在这一压力下形成的高度多样性也为细菌的血清学分型提供了重要基础。

传统血清学鉴定方法虽被广泛使用，但仍存在诸多缺陷。主要包括：

1）建立血清学分型系统的工作繁琐、周期长，例如：建立一个较为全面的大肠杆菌血清学分型系统经历了30余年的时间（约1944-1977)；因此，一些重要致病菌的血清学分型系统尚未建立，给这些致病菌的鉴定、监测和溯源工作带来了巨大困难；

2）抗血清的生产和质控较为困难，为了避免交叉反应，抗血清生产中需进行大量吸附反应；

3）很多抗血清国际上只有少数几家单位生产和保存，且用于鉴定的抗血清严重不全，国际上生产细菌抗血清的主要公司美国的Difco公司、日本的Denka Seiken公司、泰国S&A公司等提供不到实际需要种类的20%；4）血清学鉴定的实验过程耗时较长，以沙门氏菌为例，自获得纯培养物至完成血清型鉴定需要2-6天。上述缺陷严重限制了致病菌早期诊断的效率，为传染病的流行和暴发埋下了隐患。

建立与传统血清学方法相对应的高通量分子甄别技术，不但可大幅度提高细菌血清型鉴定的速度、准确性和通量，而且可使基于传统血清学鉴定和分子生物学鉴定的各种流行病学数据之间能够有效整合、协调，并可让使用不同细菌鉴定技术的实验室之间能够进行数据交流，从而有利于传染病多层次防控体系的建立。悬液芯片是芯片技术与流式细胞术相结合的新技术。即将DNA、抗体等附着于微球表面作为探针，在悬液中与待测物结合，再加入荧光标记的报道分子，借助流式细胞仪检测微球表面荧光标记物。除了具有高通量、特异性高和灵敏度高等特点外，与传统的固相芯片比较，其还具有信号收集和处理快速、操作简便、成本相对低廉等特点。近年来，随着悬液芯片技术的逐渐成熟，其正逐步用于科研和多个分子生物学诊断实验室，并逐渐商业化，显示了较好的应用前景。

细菌表面多糖抗原在细菌和外部环境的相互作用中扮演着非常重要角色。特别是他们常常是免疫系统对入侵的致病菌的首要识别及攻击目标，同时也在致病性细菌黏附，侵染宿主细胞以及躲避宿主细胞的免疫攻击的过程中起着重要的作用。细菌表面多糖抗原的多样性是构成细菌血清学分类的基础。参与细菌表面多糖抗原合成的基因一般以基因簇的形式存在于染色体上一个特定位点。上述多糖抗原基因簇中，其内部基因按照行使功能的不同可分为3类：单糖合成酶基因，糖基转移酶基因和寡糖单位处理酶基因。1998年，Wang和Reeves提出了O抗原基因簇中的寡糖单位处理酶基因（wzx和wzy）最具血清型特异性的这一理论，对于细菌的可靠的分子分型体系的建立具有重要意义。

产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)能引起机会感染和医院内感染，可在患者的呼吸道、泌尿生殖道、脓液和血液等标本中检出，是肠杆菌科肠杆菌属中最常见的临床分离菌之一。近年来，产气肠杆菌的分离率明显增多，特别是在ICU、烧伤科、呼吸内科、泌尿外科等，表明其广泛存在于病区环境，已成为医院感染的重要致病菌之一。且由于该菌耐药性较强，给临床抗感染治疗带来困难。与其他一些重要致病菌，例如大肠杆菌、沙门氏菌、副溶血弧菌等不同，目前，关于产气肠杆菌的血清学分型体系还未见报道。在前期研究中，我们收集了54株国内不同来源的产气肠杆菌临床分离株。运用第二代Illumina/Solexa 基因组分析仪的进行测序，并通过比较基因组学和生物信息学技术，定位了该菌表面多糖抗原基因簇在基因组上的位置，鉴定了8种多糖抗原基因簇类型，即8种不同血清型的产气肠杆菌。

发明内容

本发明提供了用于检测产气肠杆菌血清型1-8型的特异寡核苷酸序列，结合Bio-Rad公司的Bio-Plex 200悬液芯片系统，建立了一套用于检测产气肠杆菌血清型1-8型的悬液芯片检测系统及其检测方法，填补了关于产气肠杆菌的血清学分型技术的空白，对于产气肠杆菌的临床检测和流行病学监测具有重要意义。

为实现上述目的，本发明公开了如下的技术内容：

连接在标记有不同荧光染料磁性微球上的寡核苷酸探针，其特征在于该寡核苷酸包括下述DNA片段：

（1）产气肠杆菌1型、2型、3型、5型、6型、7型和8型的wzy基因中选取的一种DNA片段；

（2）产气肠杆菌4型的orf8基因中选取的一种DNA片段；

上述的寡核苷酸DNA片段为SEQ ID NO: 1-8所示的核苷酸序列如下：

SEQ ID (5'-3')

NO: 1 GATGGCTTCAAATCAAGTAGT 用于检测产气肠杆菌1型

NO: 2 AGCACTATACATACCGATTAAA 用于检测产气肠杆菌2型

NO: 3 GCTATTACCAAATGCGAGTAG 用于检测产气肠杆菌3型

NO: 4 ACTGGGATACATGGTTGCG 用于检测产气肠杆菌4型

NO: 5 ATACGCAGCATTTAAGAGAGA 用于检测产气肠杆菌5型

NO: 6 AAGGTTCAGTTGGGTTACGC 用于检测产气肠杆菌6型

NO: 7 ACCAGGTTTGGCAAGACA 用于检测产气肠杆菌7型

NO: 8 TTTCGTGGGACAAACGTAGA 用于检测产气肠杆菌8型。

本发明进一步公开了所述连接在标记有不同荧光染料磁性微球上的寡核苷酸探针在制备用于检测产气肠杆菌1-8型中至少一种血清型的悬液芯片方面的应用。检测的实验结果显示该悬液芯片可以完成产气肠杆菌1-8型中至少一种血清型的检测。

本发明更进一步公开了连接在标记有不同荧光染料磁性微球上的寡核苷酸探针悬液芯片的制备方法，主要包含以下步骤：

（1）在产气肠杆菌1-3型和5-8型的wzy基因内部，以及产气肠杆菌4型的orf8基因内部设计并制备用于多重PCR的DNA引物，每个血清型的引物包含上、下游引物个1对，且下游引物利用生物素基团进行标记；

（2）在产气肠杆菌1-3型和5-8型的wzy基因内部，以及产气肠杆菌4型的orf8基因内部设计并制备用DNA探针，每个血清型的探针在基因上的位置均位于对应的上、下游引物之间，每条DNA探针在5'末端均加入15个胸腺嘧啶核苷酸（dT）作为连接臂，并在连接臂末端加入氨基基团进行修饰，以便与带有羟基基团的磁性微球进行偶联；

（3）利用步骤（2）特异探针与不同荧光染料磁性微球上的寡核苷酸探针微球的偶联；

（4）制备待检测样品的基因组DNA，利用步骤（1）制备的引物，进行多重PCR扩增；

（5）利用步骤（4）获得扩增产物与步骤（3）获得的偶联微球的探针进行杂交和染色；

（6）将步骤（5）获得的染色后的杂交产物利用Bio-Plex 200悬液芯片系统进行检测。

其中，步骤（1）所述的引物包括SEQ ID NO: 9-24所示的核苷酸序列，各条序列(5'-3')及其对应的作用如下：

P1 （SEQ ID NO: 9）TTGATTACTGGCGTTGGC 扩增产气肠杆菌1型wzy基因的上游引物

P2 （SEQ ID NO: 10）TTCACCCACAGACTGTTCC 扩增产气肠杆菌1型wzy基因的下游引物

P3 （SEQ ID NO: 11）TTGTTCTGGAATCTGGGTT 扩增产气肠杆菌2型wzy基因的上游引物

P4 （SEQ ID NO: 12）CGCATCTTGAAGGGTTGTA 扩增产气肠杆菌2型wzy基因的下游引物

P5 （SEQ ID NO: 13）TTTGGTCGTACTGGTTAGG 扩增产气肠杆菌3型wzy基因的上游引物

P6 （SEQ ID NO: 14）AATCCCACCATTCAAACG 扩增产气肠杆菌3型wzy基因的下游引物

P7 （SEQ ID NO: 15）ATAGAGACGGTAAAGAAAGTAA 扩增产气肠杆菌4型orf8基因的上游引物

P8 （SEQ ID NO: 16）TCCCGATTTCTGTCCTTC 扩增产气肠杆菌4型orf8基因的下游引物

P9 （SEQ ID NO: 17）ATACTGGTGAGATGGAGGAA 扩增产气肠杆菌5型wzy基因的上游引物

P10 （SEQ ID NO: 18）CCCGCCATTTAGTCTTCC 扩增产气肠杆菌5型wzy基因的下游引物

P11 （SEQ ID NO: 19）TTTCATCGCCCATTACCT 扩增产气肠杆菌6型wzy基因的上游引物

P12 （SEQ ID NO: 20）TTGAACAGCCAAGGAAAT 扩增产气肠杆菌6型wzy基因的下游引物

P13 （SEQ ID NO: 21）TTATTTGTTGGACTGGCTAT 扩增产气肠杆菌7型wzy基因的上游引物

P14 （SEQ ID NO: 22）CAGGCGAATCAATAAAGG 扩增产气肠杆菌7型wzy基因的下游引物

P15 （SEQ ID NO: 23）TTCAGGCTTGGGAATAGA 扩增产气肠杆菌8型wzy基因的上游引物

P16 （SEQ ID NO: 24）TGAGGCTTGCTATTCTACG 扩增产气肠杆菌8型wzy基因的下游引物。

本发明公开的用于检测血清型产气肠杆菌分型的悬液芯片及应用所具有的积极效果在于：

（1）本发明首次公开了用于重要院内致病菌-产气肠杆菌血清学分子分型的技术手段，填补了产气肠杆菌血清型分型的技术空白，可用于产气肠杆菌不同血清型的临床检测和流行病学监测。

（2）该悬液芯片检测体系可在24小时内完成对临床样品的检测，可同时检测全部8个血清型的产气肠杆菌，具有检测时间短和检测通量高的优点。

说明书附图

图1为本发明中多重PCR体系对于产气肠杆菌1-8型各自的检测琼脂糖凝胶电泳示意图（由左至右分别为：DL2000 DNA分子标准；以及编号1-8的产气肠杆菌1-8型各自的多重PCR扩增产物）；

图2为本发明的悬液芯片对于产气肠杆菌1型的结果输出柱状图；

图3为本发明的悬液芯片对于产气肠杆菌2型的结果输出柱状图；

图4为本发明的悬液芯片对于产气肠杆菌3型的结果输出柱状图；

图5为本发明的悬液芯片对于产气肠杆菌4型的结果输出柱状图；

图6为本发明的悬液芯片对于产气肠杆菌5型的结果输出柱状图；

图7为本发明的悬液芯片对于产气肠杆菌6型的结果输出柱状图；

图8为本发明的悬液芯片对于产气肠杆菌7型的结果输出柱状图；

图9为本发明的悬液芯片对于产气肠杆菌8型的结果输出柱状图。

具体实施方式

下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。本发明所用原料及试剂均有市售。

表1 用于特异性检测的菌株来源

实施例1

产气肠杆菌血清型1-8特异引物的设计和制备

（1）产气肠杆菌血清型1-3和5-8均选取wzy基因为靶基因序列，血清型4选取糖基转移酶基因orf8为靶基因序列。

（2）将选取的针对产气肠杆菌血清型1-8各自的靶基因序列导入引物设计软件Primer Primier 5.0中，设定参数。其中，选择正义链和互补链输出模式；序列扩增长度150-350bp；Haripin：无；Dimer：无：False Priming：无；Cross Dimer：无。运行程序，得到针对每个血清型的正义链和反义链各1对特异引物序列。

（3）将设计好的引物序列发送至赛默飞世尔科技（中国）有限公司，进行DNA合成，并利用PAGE纯化，备用。其中，反义链引物的合成，需要在DNA序列的5’端连接生物素基团进行标记。

实施例2

产气肠杆菌血清型1-8特异探针的设计和制备

（1）产气肠杆菌血清型1-3和5-8均选取wzy基因为靶基因序列，血清型4选取糖基转移酶基因orf8为靶基因序列。

（2）将选取的针对产气肠杆菌血清型1-8各自的靶基因序列导入引物设计软件Primer Primier 5.0中，设定参数。其中，只选择正义链输出模式；Haripin：无；Dimer：无：False Priming：无；Cross Dimer：无，序列的位置位于实施例1中正义链和反义链引物位置以内。运行程序，得到针对每个血清型的1条特异探针。

（3）将设计好的探针序列发送至赛默飞世尔科技（中国）有限公司，进行DNA合成，同时在序列的5’末端连接12个碳原子作为连接臂，并在最后1个碳原子末端连接1个氨基基团，利用PAGE纯化，备用。

实施例3

特异探针与微球的偶联（需要避光操作）

（1）涡旋仪上以最高转速悬浮微球30 s，核对微球、探针编号，进行标记。

（2） 取80 微升微球于1.5mL离心管中，12000转/分钟，离心2分钟。

（3）弃上清，用10微升浓度为 0.1 mol/L的2-（N-吗啡啉）乙磺酸溶液（MES）（pH4.5）重悬，彻底涡旋，使微球分散；

（4）加入2 微升探针(提前置于室温)和6 微升新鲜配制的浓度为10 mg/mL的1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液（EDC）,混匀，室温黑暗孵育30 分钟（每隔15 min振荡混匀一番）。

（5）再加6 微升新鲜配制的10 mg/mL的EDC溶液混匀，室温黑暗孵育30分钟。

（6）加入1 毫升浓度为0.02%的吐温20溶液（TWEEN-20），混匀，12000转/分钟，离心2分钟。

（7）弃上清，加入1 毫升浓度为 0.1%的十二烷基硫酸钠溶液（SDS），重悬沉淀40秒，12000转/分钟，离心2分钟。

（8）弃上清，加入25 微升的Tris-EDTA缓冲液（pH8.0），重悬沉淀，高速涡旋30秒，4度并黑暗储存待用。

实施例4

产气肠杆菌血清型1-8多重PCR体系的建立

（1）首先利用天根生化科技（北京）有限公司的细菌基因组DNA提取试剂盒（产品号DP302），按照其操作步骤进行细菌基因组DNA的提取。

（2）取上述基因组DNA提取液0.5微升为模板，加入PCR反应混合液中。PCR反应混合液成分见表1。

表1. PCR反应混合液成分

（3）将反应混合物置于PCR仪（Biometra）中，设定循环参数并运行。循环参数如下：

实施例5

多重PCR产物与探针-微球偶联产物的杂交

（1）将全部准备好的探针-微球偶联产物，最大转速涡旋混匀，每种探针-微球偶联产物取2微升混合，用1.5×TMAC杂交缓冲液稀释250倍，振荡混匀。

（2）取上述探针-微球混合液33微升，加入PCR产物17微升，形成共50微升的杂交反应体系。空白对照则加17 微升的Tris-EDTA缓冲液（pH8.0）代替PCR产物。

（3）将上述杂交反应体系置于PCR仪中，设定反应参数并运行。反应参数如下：

实施例6

杂交产物的洗涤与染色

（1）将PCR管中的杂交产物转移到96孔板中，12000转/分钟，离心1分钟，加入70 微升的1×TMAC缓冲液洗涤2次，每次洗涤后12000转/分钟，离心1分钟。

（2）利用1×TMAC缓冲液将Streptavidin-PE荧光素稀释250倍，每孔中加入80 微升稀释后的荧光素溶液。

（3）将96孔板置于杂交炉中，55℃，500 转/分钟，震荡反应30分钟。

实施例7

杂交产物的上机检测（利用Bio-Plex 200悬液芯片系统）

（1）打开仪器电源和连接电脑的电源，点击电脑桌面的Bio-Plex Manager按钮，进入软件界面。

（2）在仪器配套的MCV板中加入ddH2O和70%异丙醇溶液，置于机器中后，点击软件界面的Start up按钮，后根据界面提示点击Warm up按钮进行预热，一般预热30分钟。

（3）预热结束后，在MCV板中加入编号为CAL1和CAL2的校正液，点击Calibrate按钮，进行仪器的校正。其中CAL1和CAL2校正液在加入前需恢复至室温，并斡旋混合30秒以上。

（4）校正完成后，点击工具栏的New按钮，打开方法编辑Protocol窗口，按照提示填入微球编号和对应的探针编号。编辑结束后，点击Format Plate按钮，按照96孔板的加样顺序依次设定检测背景（B）和待检样本（X）的检测位置。取出仪器中的MCV板，加入盛有样品的96孔板，点击run Protocol按钮开始检测。

（5）上述程序完成后，根据软件界面提示，保存数据为Excel表格，用于后续分析。

点击工具栏的Shut down按钮，按照屏幕提示进行操作，提示结束后先关闭电脑的Bio-Plex Manager程序，再关闭机器电源和电脑电源。检测结果表明：本发明的悬液芯片可以实现对产气肠杆菌1-8型至少一种血清型的检测。

实施例8

用于检测血清型产气肠杆菌分型的悬液芯片在临床检测上使用情况及结果

（1）收集了来源于上海市基因预防控制中心的血清型未知的产气肠杆菌临床分离株共97株。

（2）将上述临床分离株，分别过夜培养后，稀释为10³CFU每毫升浓度的菌液，分别与0.5克粪便样品混合后，置于5毫升LB培养基中，37度震荡培养2小时。

（3）利用天根生化科技（北京）有限公司的粪便基因组DNA提取试剂盒（产品号DP328-02），按照其操作步骤进行细菌基因组DNA的提取。

（4）按照实施例3的步骤进行特异探针和微球的偶联，以及按照实施例4的步骤进行多重PCR，后分别按照实施例5、6、7的步骤进行多重PCR产物与探针-微球偶联产物的杂交、杂交产物的洗涤与染色以及利用Bio-Plex 200悬液芯片系统对杂交产物进行检测。

（5）检测结果表明，在97例临床菌株中，每一株细菌均属于血清型1-8中的一种。即，7株属于产气肠杆菌1型，11株属于产气肠杆菌2型，1株属于产气肠杆菌3型，32株属于产气肠杆菌4型，7株属于产气肠杆菌5型，12株属于产气肠杆菌6型，16株属于产气肠杆菌7型，11株属于产气肠杆菌8型。

SEQUENCE LISTING

<110> 南开大学

<120> 用于检测血清型产气肠杆菌分型的悬液芯片及应用

<160> 24

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gatggcttca aatcaagtag t 21

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

agcactatac ataccgatta aa 22

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gctattacca aatgcgagta g 21

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

actgggatac atggttgcg 19

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

atacgcagca tttaagagag a 21

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

aaggttcagt tgggttacgc 20

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

accaggtttg gcaagaca 18

<210> 8

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

tttcgtggga caaacgtaga 20

<210> 9

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

ttgattactg gcgttggc 18

<210> 10

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

ttcacccaca gactgttcc 19

<210> 11

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

ttgttctgga atctgggtt 19

<210> 12

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

cgcatcttga agggttgta 19

<210> 13

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

tttggtcgta ctggttagg 19

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<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

aatcccacca ttcaaacg 18

<210> 15

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

atagagacgg taaagaaagt aa 22

<210> 16

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

tcccgatttc tgtccttc 18

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

atactggtga gatggaggaa 20

<210> 18

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

cccgccattt agtcttcc 18

<210> 19

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

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tttcatcgcc cattacct 18

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<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

ttgaacagcc aaggaaat 18

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

ttatttgttg gactggctat 20

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<211> 18

<212> DNA

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<400> 22

caggcgaatc aataaagg 18

<210> 23

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

ttcaggcttg ggaataga 18

<210> 24

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

tgaggcttgc tattctacg 19

Claims (3)

1.连接在标记有不同荧光染料磁性微球上的寡核苷酸探针，其特征在于该寡核苷酸包括下述DNA片段：

（1）产气肠杆菌1型、2型、3型、5型、6型、7型和8型的wzy基因中选取的一种DNA片段；

（2）产气肠杆菌4型的orf8基因中选取的一种DNA片段；

上述的寡核苷酸DNA片段为SEQ ID NO: 1-8所示的核苷酸序列如下：

SEQ ID (5'-3')

NO: 1 GATGGCTTCAAATCAAGTAGT 用于检测产气肠杆菌1型

NO: 2 AGCACTATACATACCGATTAAA 用于检测产气肠杆菌2型

NO: 3 GCTATTACCAAATGCGAGTAG 用于检测产气肠杆菌3型

NO: 4 ACTGGGATACATGGTTGCG 用于检测产气肠杆菌4型

NO: 5 ATACGCAGCATTTAAGAGAGA 用于检测产气肠杆菌5型

NO: 6 AAGGTTCAGTTGGGTTACGC 用于检测产气肠杆菌6型

NO: 7 ACCAGGTTTGGCAAGACA 用于检测产气肠杆菌7型

NO: 8 TTTCGTGGGACAAACGTAGA 用于检测产气肠杆菌8型。

2.权利要求1所述连接在标记有不同荧光染料磁性微球上的寡核苷酸探针在制备用于检测产气肠杆菌1-8型中至少一种血清型的悬液芯片方面的应用。

3.权利要求1所述连接在标记有不同荧光染料磁性微球上的寡核苷酸探针悬液芯片的制备方法，主要包含以下步骤：

（1）在产气肠杆菌1-3型和5-8型的wzy基因内部，以及产气肠杆菌4型的orf8基因内部设计并制备用于多重PCR的DNA引物，每个血清型的引物包含上、下游引物个1对，且下游引物利用生物素基团进行标记；

（2）在产气肠杆菌1-3型和5-8型的wzy基因内部，以及产气肠杆菌4型的orf8基因内部设计并制备用DNA探针，每个血清型的探针在基因上的位置均位于对应的上、下游引物之间，每条DNA探针在5'末端均加入15个胸腺嘧啶核苷酸（dT）作为连接臂，并在连接臂末端加入氨基基团进行修饰，以便与带有羟基基团的磁性微球进行偶联；

（3）利用步骤（2）制备的特异探针与标记有不同荧光染料的磁性微球进行偶联；

（4）制备待检测样品的基因组DNA，利用步骤（1）制备的引物，进行多重PCR扩增；

（5）利用步骤（4）获得扩增产物与步骤（3）获得的偶联微球的探针进行杂交和染色；

（6）将步骤（5）获得的染色后的杂交产物利用Bio-Plex 200悬液芯片系统进行检测；

其中，步骤（1）所述的引物包括SEQ ID NO: 9-24所示的核苷酸序列，各条序列(5'-3')如下：

P1 （SEQ ID NO: 9）TTGATTACTGGCGTTGGC 扩增产气肠杆菌1型wzy基因的上游引物

P2 （SEQ ID NO: 10）TTCACCCACAGACTGTTCC 扩增产气肠杆菌1型wzy基因的下游引物

P3 （SEQ ID NO: 11）TTGTTCTGGAATCTGGGTT 扩增产气肠杆菌2型wzy基因的上游引物

P4 （SEQ ID NO: 12）CGCATCTTGAAGGGTTGTA 扩增产气肠杆菌2型wzy基因的下游引物

P5 （SEQ ID NO: 13）TTTGGTCGTACTGGTTAGG 扩增产气肠杆菌3型wzy基因的上游引物

P6 （SEQ ID NO: 14）AATCCCACCATTCAAACG 扩增产气肠杆菌3型wzy基因的下游引物

P7 （SEQ ID NO: 15）ATAGAGACGGTAAAGAAAGTAA 扩增产气肠杆菌4型orf8基因的上游引物

P8 （SEQ ID NO: 16）TCCCGATTTCTGTCCTTC 扩增产气肠杆菌4型orf8基因的下游引物

P9 （SEQ ID NO: 17）ATACTGGTGAGATGGAGGAA 扩增产气肠杆菌5型wzy基因的上游引物

P10 （SEQ ID NO: 18）CCCGCCATTTAGTCTTCC 扩增产气肠杆菌5型wzy基因的下游引物

P11 （SEQ ID NO: 19）TTTCATCGCCCATTACCT 扩增产气肠杆菌6型wzy基因的上游引物

P12 （SEQ ID NO: 20）TTGAACAGCCAAGGAAAT 扩增产气肠杆菌6型wzy基因的下游引物

P13 （SEQ ID NO: 21）TTATTTGTTGGACTGGCTAT 扩增产气肠杆菌7型wzy基因的上游引物

P14 （SEQ ID NO: 22）CAGGCGAATCAATAAAGG 扩增产气肠杆菌7型wzy基因的下游引物

P15 （SEQ ID NO: 23）TTCAGGCTTGGGAATAGA 扩增产气肠杆菌8型wzy基因的上游引物

P16 （SEQ ID NO: 24）TGAGGCTTGCTATTCTACG 扩增产气肠杆菌8型wzy基因的下游引物。