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CN107551264B - L3和/或l5源作为寄生虫病疫苗或诊断的用途 - Google Patents

L3和/或l5源作为寄生虫病疫苗或诊断的用途 Download PDF

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CN107551264B CN201710683003.3A CN201710683003A CN107551264B CN 107551264 B CN107551264 B CN 107551264B CN 201710683003 A CN201710683003 A CN 201710683003A CN 107551264 B CN107551264 B CN 107551264B
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Abstract

本发明涉及L3和/或L5源作为寄生虫病疫苗或诊断的用途。所述L5源为具有氨基酸序列SEQ ID NO:3的多肽和/或由具有SEQ ID NO:4的核苷酸序列编码的多肽；或者，所述L5源为具有核苷酸序列SEQ ID NO:4的核酸和/或编码具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的核酸。本发明能够有效实现诊断、预防或治疗寄生虫病，特别是利什曼病。

Description

L3和/或L5源作为寄生虫病疫苗或诊断的用途
本申请为申请日为2010年11月12日、申请号为201080061107.7、名 称为“L3和/或L5源作为寄生虫病疫苗或诊断的用途”的中国发明专利申请 的分案申请。
技术领域
本发明涉及一种用于制备治疗、预防和/或诊断寄生虫病的药剂或药物 的L3和/或L5源。
背景技术
利什曼病包括若干种由属于利什曼原虫(Leishmania)属的细胞内原生 寄生虫引起的疾病，利什曼原虫主要感染各种哺乳动物(包括人和犬)的巨 噬细胞。疾病谱在很大程度上取决于寄生虫的种类和人宿主的免疫能力状 态，范围从自愈的皮肤利什曼病(CL)到致死的内脏利什曼病(VL)或黑 热病(kalaazar)(18)。由婴儿利什曼原虫(Leishmaniainfantum)和恰氏利 什曼原虫(L.chagasi)引起的犬内脏皮肤利什曼病(VCL)是发现于地中海 盆地、中东和拉丁美洲周围国家的重要新兴动物传染病(16)；作为这些寄 生虫的主要储主，犬在通过白蛉(phebotomine sand flies)(44)传播给人中 起着重要的作用。感染的结果由宿主免疫系统和不同寄生虫种类间的相互作 用决定，但是利什曼病的发病机理仍是不清楚的且关于涉及对人和犬中利什 曼原虫的免疫反应的机制的认识仍是有限的。一般而言，保护性免疫与典型 的细胞介导的免疫反应相关，该典型的细胞介导的免疫反应通过T细胞产生 的细胞因子诱导巨噬细胞活化。另一方面，不可治愈的疾病与强烈的体液反 应的产生相关(15、24)。
基于未加工的寄生虫成分或确定的寄生虫抗原，对于第二代疫苗的开发 的研究，集中于不同表面或分泌的寄生虫分子(secreted parasite molecules) 的鉴定，所述分泌的寄生虫分子已利用不同佐药以几种试验模式作为候选疫 苗被测试(1、17、20、43、45、46、49、50)。来自感染的动物或人的血清 的表达库的筛选能够促进作为候选疫苗的一些抗原的选择(参见(9))。在 表达库中，在感染的小鼠或患者细胞中主要引出Th1-型免疫反应的表达库， 不考虑细胞位置，与不同动物模型中的保护性反应的产生有关(48、51、52)。 另一方面，一些分离的抗原为细胞内保守蛋白，在用实验方法感染的小鼠中， 所述细胞内保守蛋白主要刺激遭受VL或Th2-介导的体液反应的人或犬中的 体液反应(3、33、35、37、39)。在患有利什曼病的犬中对利什曼病所引起 的不充足的体液反应被认为会导致免疫病理(immunopathology)，主要由于 免疫复合物(immune complexes)的副作用如葡萄膜炎(uveitis)(13)、中 枢神经系统病变(central nervous system lesions)(14)或肾炎(21、22、30、 31)。最近还显示了人体内IgG免疫复合物的存在和VL与不能解除感染相 关，表明了免疫复合物对感染的宿主可能是不利的(27)。
尽管不作为优良的疫苗候选被首先考虑，在感染过程中引起强烈体液反 应的蛋白质与保护性反应的诱导相关。例如，寄生虫的微管蛋白和组蛋白 H2B被来源于免疫供体的T-细胞克隆识别(36)。另外，通过免疫小鼠的T 细胞，rK39引起增殖并产生IFN-γ(23)。还显示了在小鼠内脏利什曼病模 型中，利用寄生虫H2B、H3和H4基因的基因免疫会引起保护(62)。而且， 激活的C激酶(LACK)受体的免疫(29)，一些寄生虫半胱氨酸蛋白酶(38、 41)或形成Th1促进佐药管理的组蛋白的寄生虫核小体(11、19)产生了与 小鼠模型中抗皮肤利什曼病的保护相关的免疫反应。
在利什曼原虫进化的保守抗原中，几种迹象表明，在利什曼原虫感染过 程中，核糖体蛋白质为免疫相关的分子。一些情况下，在感染过程中，核糖 体成分能够通过调节细胞活性和细胞因子的释放的能力导致宿主免疫系统 功能紊乱。因此，将硕大利什曼原虫(L.major)核糖体蛋白质S3a注入BALB/c 小鼠中，引起了B-细胞克隆的多克隆扩增(polyclonal expansion)并抑制了 T-细胞的增殖(10)。而且，在小鼠模型中，通过IL-10和Th2细胞因子的诱 导，利用DNA疫苗编码用于公认的60S核糖体蛋白质L31的基因免疫加重了病情(41、63)。另外，在患有利什曼病的犬和人中，一些寄生虫核糖体 蛋白质如寄生虫酸性P蛋白与强烈体液反应的发生相关(参见(39))。然而， 还指出了几种试验的核糖体蛋白质并不能诱导产生免疫性的保护性反应，或 者获得的免疫性保护反应是次优的(55、41)。
目前，虽然做了许多努力，但仍没有针对寄生虫病(如利什曼原虫病) 有价值的疫苗。因此，仍然迫切需要这种疫苗。
发明内容
在本发明中，我们意外地发现两种硕大利什曼原虫的核糖体蛋白质L3 和L5是抗原性的。这意味着这两种蛋白质的每一种都能够被感染利什曼病 的个体的血清识别。另外，在皮肤利什曼病的小鼠模型中，发现了IgG1同 型的抗L3和抗L5抗体。在BALB/c小鼠中两种蛋白质的免疫，在CpG-ODN 的存在下，诱导抗两种蛋白质的Th1反应。作为疫苗接种的结果，能够保护 小鼠抵抗硕大利什曼原虫攻击后CL的发展。我们进一步论证了硕大利什曼原虫蛋白质还能够赋予保护抵抗巴西利什曼原虫的感染。我们还论证了L3 和L5核糖体蛋白质至少在不同的利什曼原虫物种间是高度保守的。将这种 组合物用于药物组合物，特别是作为诊断、疫苗或治疗用途是非常吸引人的。 下面进一步描述本发明。
用途
在本发明的第一方面，提供了L3和/或L5源与任选的佐药在制备用于 治疗或预防受试对象的寄生虫病的药物或药剂中的用途。
L3和L5蛋白为核糖体蛋白质。核糖体蛋白质是很保守的胞浆蛋白质。 因此，L3和/或L5源可以从任何的真核生物中制得，所述真核生物为植物或 动物，可以选自哺乳动物、爬行动物、鱼类、昆虫类或任何其他具有染色体 的生物，如原生动物。L3和/或L5源优选从与疾病紧密相关的生物中获得， 优选从进化树中引起寄生虫病的生物中获得。因此，特别优选用于预防和/ 或治疗寄生虫病的L3和/或L5源为原生动物如疟原虫(Plasmodium)和特别是锥虫(trypanosomatid)科中的成员，更特别是锥虫原生动物利什曼原虫 的不同物种。存在超过20种已知的利什曼原虫，包括利什曼原虫亚属的物 种，包括复杂的硕大利什曼原虫，包括硕大利什曼原虫，复杂的杜氏利什曼 原虫(L.donovani)，包括恰氏利什曼原虫、杜氏利什曼原虫和婴儿利什曼原 虫，复杂的墨西哥利什曼原虫(L.mexicana)，包括亚马孙利什曼原虫(L. amazonensis)和墨西哥利什曼原虫，以及维纳尼亚亚种(subspeciesViannia)，包括复杂的巴西利什曼原虫(L.braziliensis)，包括巴西利什曼 原虫和秘鲁利什曼原虫(L.peruviana)和复杂的圭亚利什曼原虫(L. guyanensis)，包括圭亚利什曼原虫和巴拿马利什曼原虫(L.panamensis)。 特别优选的疟原虫为恶性疟原虫(Plasmodiumfalciparum)和间日疟原虫 (Plasmodium vivax)。在优选的实施方式中，L3和/或L5源从利什曼原虫 物种中获得，优选硕大利什曼原虫、婴儿利什曼原虫、杜氏利什曼原虫、墨 西哥利什曼原虫、恰氏利什曼原虫和/或巴西利什曼原虫。更优选L3源从 利什曼原虫物种中获得，优选硕大利什曼原虫、婴儿利什曼原虫和/或墨西 哥利什曼原虫。更优选L5源从利什曼原虫物种中获得，优选硕大利什曼 原虫、婴儿利什曼原虫、巴西利什曼原虫和/或墨西哥利什曼原虫。在实施 例2中，我们证实了在至少三个不同的利什曼原虫物种中存在高度保守的 L3和L5同系物(一致性至少为90％，见表1)。在另一优选实施方式中， L3和/或L5源从疟原虫物种中获得。本领域技术人员将理解，L3和/或L5 源优选还可以通过混合来自本文限定的几种不同生物的L3和/或L5源而制 得。由于L3和/或L5源在治疗对象(treatedsubject)中表现出诱导免疫保 护性反应，本文已证实将L3和/或L5源用于疫苗具有诱人的免疫性能。
术语“L3和/或L5源”可以被“L3源和/或L5源”替换。L3和/或L5 源优选包括L3和/或L5蛋白、L3和/或L5衍生的肽或蛋白片段和/或编码 L3和/或L5蛋白或衍生的肽或蛋白片段的核酸。优选的L3蛋白如SEQ ID NO:1所示。该优选的L3蛋白源于硕大利什曼原虫且优选由SEQ ID NO:2 编码。另一优选的L3蛋白如SEQ ID NO:48所示。该优选的L3蛋白源于婴 儿利什曼原虫且优选由SEQ ID NO:49编码。另一优选的L3蛋白如SEQ ID NO:50所示。该优选的L3蛋白源于墨西哥利什曼原虫且优选由SEQ ID NO:51编码。
优选的L5蛋白如SEQ ID NO:3所示。该优选的L5蛋白源于硕大利什 曼原虫且优选由SEQ ID NO:4编码。另一优选的L5蛋白如SEQ ID NO:52 所示。该优选的L5蛋白源于婴儿利什曼原虫且优选由SEQ ID NO:53编码。 另一优选的L5蛋白如SEQ ID NO:54所示。该优选的L5蛋白源于墨西哥利 什曼原虫且优选由SEQ ID NO:55编码。另一优选的L5蛋白如SEQID NO:56 所示。该优选的L5蛋白源于巴西利什曼原虫且优选由SEQ ID NO:65编码。
贯穿本申请，每次提及的特定核苷酸序列SEQ ID NO(以SEQ ID NO:2 或4或49或51或53或55或65为例)可以被包括与SEQ ID NO:2或4或49或51或53或55或65具有至少60％的序列一致性或相似性的核苷酸序 列的核苷酸序列替代。
贯穿本申请，每次提及的特定氨基酸序列SEQ ID NO(以SEQ ID NO:1 或3或48或50或52或54或56为例)可以被包括与氨基酸序列SEQ ID NO:1 或3或48或50或52或54或56具有至少60％的序列一致性或相似性的氨 基酸序列的多肽替代。
因此，在优选的实施方式中，L3源为包括与氨基酸序列SEQ ID NO:1 或48或50具有至少60％的序列一致性或相似性的氨基酸序列的多肽和/或 由与SEQ ID NO:2或49或51具有至少60％的一致性的核苷酸序列编码的多 肽。
因此，在优选的实施方式中，L5源为包括与氨基酸序列SEQ ID NO:3 或52或54或56具有至少60％的序列一致性或相似性的氨基酸序列的多肽 和/或由与SEQ ID NO:4或53或55或65具有至少60％的一致性的核苷酸序 列编码的多肽。
因此，在优选的实施方式中，L3源为包括与核苷酸序列SEQ ID NO:2 或49或51具有至少60％的序列一致性或相似性的核苷酸序列的核酸和/或 编码与SEQ ID NO:1或48或50具有至少60％的一致性的氨基酸序列的核 酸。
因此，在优选的实施方式中，L5源为包括与核苷酸序列SEQ ID NO:4 或53或55或65具有至少60％的序列一致性或相似性的核苷酸序列的核酸 和/或编码与SEQ ID NO:3或52或54或56具有至少60％的一致性的氨基酸 序列的核酸。
优选地，当编码的蛋白质或多肽、蛋白片段、肽至少在一定程度上仍能 至少引起从SEQ ID NO:1或3或48或50或52或54或56获得的免疫反应 时，与特定限定的氨基酸或核苷酸序列具有至少60％的一致性或相似性的所 述氨基酸序列或核苷酸序列被本发明涵盖且据说是功能性的。至少在一定程 度上优选指至少50％、至少60％、70％、80％、至少90％或100％。引起免 疫反应定义如下：当能够引起治疗对象的免疫反应，优选指能够促进或引起 Th1免疫反应对给定的抗原L3和/或L5和/或能够预防和/或延缓真皮或粘膜 病变的发展和/或引起重要的真皮和/或粘膜病变中和/或耳朵中和/或引流淋 巴结(draininglymph node)(DLN)(优选引流任意这些感染的部位(真皮、 粘膜部位、耳朵))中以及内部器官(如肝脏、脾脏、骨髓、肾脏、大脑等) 中寄生虫量下降的时候，化合物是功能性的。涵盖于本发明的氨基酸序列可 以包括一、二、三、四、五或更多的取代和/或插入和/或缺失和/或添加的 N-或C-端氨基酸或化学基团，以增强稳定性、溶解性和免疫原性。
本文定义的L3和/或L5蛋白片段或L3和/或L5衍生的肽优选为包括与 L3和/或L5蛋白对应的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、 14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30 或更多个连续的氨基酸的片段并能够引起前文定义的免疫反应。因此，在优 选实施方式中，本文定义的L3和/或L5蛋白片段或L3和/或L5衍生的肽优 选为包括SEQ ID NO:1或3或48或50或52或54或56的至少2、3、4、5、 6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、 24、25、26、27、28、29、30或更多个连续的氨基酸的片段。
作为优选的实施方式，优选的L3蛋白片段或优选的L3-衍生的肽包括 或由L3蛋白的C-端部的最后的40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、 30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20个连续的氨基酸组成。甚至 更优选地，包括或由SEQ ID NO:1或48或50的最后的40、39、38、37、 36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20 个连续的氨基酸组成。甚至更优选地，包括或由SEQ ID NO:1的氨基酸 394-419组成。作为另一优选实施方式，优选的L5蛋白片段或优选的L5-衍 生的肽包括或由L5蛋白的N-端部的起始的40、39、38、37、36、35、34、 33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20个连续的氨基 酸组成。甚至更优选地，包括或由SEQ ID NO:3或52或54或56的起始的 40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、 23、22、21、20个连续的氨基酸组成。甚至更优选地，包括或由SEQID NO:3 的氨基酸1-23组成。作为另一优选实施方式，优选的L5蛋白片段或优选的 L5-衍生的肽包括或由L5蛋白的C-端部的最后的40、39、38、37、36、35、 34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、 17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6个连续的氨基酸组成。甚至 更优选地，包括或由SEQ ID NO:3或52或54或56的最后的40、39、38、 37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、 20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6个连续的氨基 酸组成。甚至更优选地，包括或由SEQ ID NO:3的氨基酸322-328组成。在 另一优选实施方式中，L3和L5源含有蛋白质，所述蛋白质含有至少一种 L3蛋白的蛋白片段以及至少一种L5蛋白的蛋白片段。更优选地，将L3蛋 白片段和L5蛋白片段融合在一起以形成嵌合蛋白(chimeric protein)。因此， 本发明还涵盖一种核酸或编码该L3和L5源的核酸。
在优选的实施方式中，L3和/或L5源包括至少一种L3和/或L5蛋白和/ 或至少一种L3和/或L5的蛋白片段。在更优选的实施方式中，L3和/或L5 源包括至少两个L3和/或L5蛋白和/或至少两个L3和/或L5的蛋白片段。该 实施方式涉及蛋白质-基源，优选蛋白质基疫苗。
提出在优选实施方式中本文限定的L3和/或L5源不能理解为涵盖WO 2009/090175中限定的核糖体蛋白质提取物(RPE)。利用存在于受试对象体 内时引起寄生虫病的寄生虫细胞通过进行以下步骤获得RPE：
a.将寄生虫细胞与裂解缓冲液混合，
b.离心获得的混合物以获得胞浆提取物，
c.从获得的胞浆提取物中制备RPE。
因此在优选的实施方式中，L3和/或L5源不是以上定义的RPE。
在另一优选实施方式中，L3和/或L5源包括至少一种编码L3和/或L5 的核酸和/或至少一种编码L3和/或L5的蛋白片段的核酸。在更优选的实施 方式中，L3和/或L5源包括至少两个编码L3和/或L5蛋白的核酸和/或至少 两个编码L3和/或L5蛋白片段的核酸。该实施方式涉及核酸-基源，优选核 酸-基疫苗。
L3和/或L5源可以为蛋白质、蛋白质的消化物和/或其片段，可以为纯 化的形式或者可以包含在未加工的组合物中，优选为生物源的组合物，如细 菌溶菌产物、酵母菌溶菌产物、真菌溶菌产物，超声波降解(sonicate)或固 定(fixate)。替换地，L3和/或L5源可以为化学合成的或体外酶促反应的产 物。L3和/或L5源蛋白或其片段还可以为从RNA或DNA模版编码所述蛋 白或其片段的核酸。RNA或DNA分子可以为‘裸’DNA，优选包含在囊泡或 脂质体中，或包含在载体中。所述载体可以为本领域已知的任意(重组)DNA 或RNA载体，且优选为质粒；其中，将编码潜在抗原的基因可操作地连接 于赋予编码信使的表达和翻译的调控序列上。所述载体还可以为任意DNA 或RNA病毒，例如但不限于腺病毒、腺-相关病毒(AAV)、逆转录病毒、 慢病毒、修饰的痘苗安卡拉病毒(modified Vaccinia Ankara virus)(MVA)或禽痘病毒或任何其他能够赋予多肽表达至被选择的受试对象的病毒性载 体。DNA载体可以为非整合的，例如附加型复制载体(episomally replicating vectors)，或可以为通过随机整合或通过同源重组整合到宿主基因组的载体。
根据本发明，DNA分子包括编码L3和/或L5蛋白或其片段的基因，任 选地嵌入载体如病毒或质粒中，可以整合到受试对象的基因组中。在本发明 优选的实施方式中，所述宿主可以为微生物。优选该重组微生物为分枝杆菌 (Mycobacterium)，种类如结核分枝杆菌(M.tuberculosis)、耻垢分枝杆菌 (M.smegmatis)(Yue.Y.et al、(2007),J.Virol.Meth.,141:41-48,Cayabiyab Y. et al,(2006),J.Virol.,80:1645-1652)或牛分枝杆菌(M.bovis)且最优选牛 分枝杆菌卡介苗(Bacillus Calmette Guerin)(BCG)或耻垢分枝杆菌，根据 本发明能够传递多肽或其片段到宿主中。重组BCG和重组的方法为本领域 所熟知；例如，WO2004094469。可以将该重组微生物制成活重组体和/或活 减毒疫苗，如Jacobset al.1987,Nature,327(6122):532-5)。所述载体还可以包 含在细菌源的宿主中，例如但不限于活减毒的和/或重组的志贺氏杆菌 (Shigella)或沙门氏菌(Salmonellabacteria)。
本发明可以使用任何已知的佐药。本领域技术人员知道几种合适的佐 药。佐药最优选选自以下列出的佐药：阳离子(抗菌的)肽、皂角苷(saponine) 和Toll-样受体(TLR)配体例如但不限于聚(I:C)、CpG基序、LPS、脂质 A、脂肽Pam3Cys和细菌鞭毛蛋白或其部分，及它们的具有化学修饰的衍生 物。在根据本发明的方法和组合物中使用的其他优选的佐药为：活的或死的 BCG的混合物、带有所述潜在抗原或其部分的免疫球蛋白复合物、IC31(来自www.intercell.com；WO03047602中)、QS21/MPL(US2003095974)、 DDA/MPL(WO2005004911)、DA/TDB(WO2005004911；Holten-Andersen et al,2004InfectImmun.2004Mar；72(3):1608-17.)和可溶的LAG3(CD223)(来 自www.Immunotep.com；US2002192195)。另外，其他优选的佐药包括短小 棒状杆菌(Corynebacterium paryum)或痤疮丙酸杆菌(Propionobacterium acnes)的使用(64、65、66)。
特别优选的佐药为已知通过Toll-样受体作用的佐药。能够激活先天免疫 系统的佐药能通过Toll样受体(TLR’s)(包括TLR’s 1–10)和/或通过RIG-1 (维甲酸诱导基因-1)蛋白和/或通过内皮素受体(endothelin receptor)很好 地被激活。本领域很好地记载了能够激活TLR受体的化合物及其变形和衍 生物。TLR1可以被细菌脂蛋白及其乙酰化形式激活，TLR2还可以被革兰氏 阳性细菌的糖脂、LPS、LPA、LTA、菌毛、外膜蛋白、来自细菌或来自宿主 的热休克蛋白(heatshock proteins)、以及分枝杆菌的脂阿拉伯甘露聚糖(Mycobacterial lipoarabinomannans)激活。TLR3可以被dsRNA，尤其为病 毒源的dsRNA，或被化合物聚(I:C)激活。TLR4可以被革兰氏阴性LPS、 LTA、来自宿主或来自细菌源的热休克蛋白、病毒衣壳或包膜蛋白、紫杉醇 (taxol)或其衍生物、含有低聚糖和纤维连接蛋白的透明质酸激活。TLR5 可以被细菌的鞭毛或鞭毛蛋白激活。TLR6可以被分枝杆菌的脂蛋白和B族 链球菌不耐热的可溶性因子(GBS-F)或葡萄球菌调节蛋白(Staphylococcusmodulins)激活。TLR7可以被喹啉咪唑(imidazoquinolines)及衍生物激活。 TLR9可以被未甲基化的CpG DNA或染色质-IgG复合物激活。特别地， TLR3、TLR4、TLR7和TLR9在调节对病毒感染的先天免疫反应中发挥着 重要的作用，并将能够激活这些受体的化合物特别优选用于本发明。特别优 选的佐药包括但不限于合成的化合物，包括dsRNA、聚(I:C)、触发TLR3和 TLR9受体的未甲基化的CpG DNA、IC31、TLR9激动剂、IMSAVAC、TLR4 激动剂。在另一优选的实施方式中，所述佐药物理地连接至前文定义的L3 和/或L5源上。佐药和共刺激化合物(costimulatory compounds)或官能团与 含有肽的HLA I类和HLA II类表位的物理连接通过同时发生的抗原递呈细 胞(特别是吸收、消化并显示抗原的树突细胞)的刺激提供了增强的免疫反 应。其他优选的免疫修饰化合物为T细胞粘附抑制剂，更优选为内皮素受体 如BQ-788(67)的抑制剂。BQ-788为N-顺-2,6-二甲基哌啶羰基-L-γ-甲基亮氨 酰-D-1-甲氧基羰基色氨酰基-D-正亮氨酸 (N-cis-2,6-dimethylpiperidinocarbonyl-L-gamma-methylleucyl-D-1-methoxy- carbonyltryptophanyl-D-norleucine)。然而，任意BQ-788的衍生物或改性的 BQ-788化合物也涵盖在本发明的范围内。
其他佐药包括MPL-SE(Glaxo Smithkline Biologicals，比利时)或EM005 (IDRI美国)。
在优选的实施方式中，佐药为Th1-促进佐药(如含有CpG ODN基序的 佐药)。如文献(68)所述，Th1-促进佐药是当与抗原(此处为L3和/或L5 源)一起使用时，能够促进或引起对给定抗原的Th1免疫反应的佐药，当与 抗原一起培养时，在治疗对象的脾细胞的上层清液中检测到。作为对照，在 同一受试对象的脾细胞群中评测Th1免疫反应的促进或引起，所述受试对象 未用抗原和佐药处理，或者同一群仅用抗原处理。优选用通过与抗原一起培养治疗对象的脾细胞和/或通过诱导产生抗原特异性IgG2a免疫球蛋白检测 到的IFNγ的诱导定义引起或促进Th1免疫反应。优选通过实施例中描述的 脾细胞的ELISA而进行该细胞因子诱导的评测。优选通过实施例1中描述 的ELISA或蛋白质印迹(Western Blot)进行IgG2a诱导的评测。用L3和/ 或L5源和佐药刺激脾细胞的IFNγ和/或IgG2a的诱导优选指佐药适合用作 Th1-促进佐药。
替换地或者与以上给出的引起或促进Th1免疫反应的第一定义结合，引 起或促进Th1免疫反应可以进一步定义为不存在(或诱导的不存在)Th2免 疫反应。Th2免疫反应的特征在于当与未处理的脾细胞相比时，IL-4、IL-10 诱导的显著增强和/或显著IgG1免疫球蛋白的产生。优选通过实施例中描述 的脾细胞的ELISA进行IL-4和/或IL-10的诱导的评测。优选通过实施例1 中描述的ELISA或蛋白质印迹进行IgG1诱导的评测。
替换地或者与以上给出的引起或促进Th1免疫反应的两个第一定义结 合，引起或促进Th1免疫反应可以进一步定义为针对指定抗原(L3和/或L5 源的情况)，发生IFNγ/IL-10比例和/或IFNγ/IL-4比例的增大和/或IgG1/IgG2a 比例的减小。在优选的实施方式中，这些比例中任意2个以上的变化表明佐 药具有Th1性能。优选通过实施例中描述的脾细胞的ELISA进行各个提到 的细胞因子诱导的评测。优选通过实施例1中描述的ELISA或蛋白质印迹 进行免疫球蛋白IgG1或IgG2a诱导的评测。
在优选的实施方式中，Th1-促进佐药是，或包括，或由寡脱氧核苷酸(oligodeoxynucleotide)组成。更优选地，寡脱氧核苷酸(ODN)包括或由 CpG组成，其中，C是未甲基化的(CpG ODN)：3’嘌呤-CpG-5’嘧啶。优选 的寡脱氧核苷酸是，或包括，或由硫代磷酸-修饰的ODN序列组成。使用具 有这种修饰的寡脱氧核苷酸是有利的，因为使用的寡脱氧核苷酸因此比未修 饰的寡脱氧核苷酸更稳定且因此它们在血流中不易降解。优选的Th1-促进佐 药由或包括至少一种CpG基序、至少两种或至少三种组成。优选的免疫刺 激ODN(immunostimulatory ODN)(5’至3’)序列为TCAACGTTGA(SEQ ID NO:5)和GCTAGCGTTAGCGT(SEQ ID NO:6)。本领域技术人员不会受到本 文明确描述的序列的限制。他/她可以设计其他序列并随后测试它们如前文定 义的它们的Th-1促进性能。该优选限定的佐药CpG ODN极具吸引力，因为 在实施例中证实了LRPE与该Th1-促进佐药的混合接种(co-inoculation)诱 导了抵抗BALB/c和C57BL/6小鼠菌株中抗硕大利什曼原虫寄生虫的攻击的 保护。在两个模型中，保护与特定IFN-γ的产生有关。在BALB/c中，还检 测到了IL-4和IL-10产生的限制。
本发明提供了L3和/或L5源的适当的用途如1)预防(预防剂)，2)暴 露/感染后(post-exposure/infection)或3)治疗/医疗的疫苗。本发明的一个 优点是可以制备用于治疗寄生虫病的广谱药制剂即跨物种特异性的药的制 备。在许多寄生虫病中，疫苗针对特定的物种，只对特定的物种有作用。其 中这种寄生虫病的一个实例为利什曼病。目前，该病已被药物控制，但是药 物治疗并不能防止该病的传播且在很多情况下并不是很有效。在优选的实施 方式中，寄生虫病为利什曼病或疟疾。更优选地，寄生虫病由利什曼原虫或 疟原虫物种引起。在进一步优选的实施方式中，寄生虫病由除L3和/或L5 源来源的物种外的不同物种引起。具体地，由利什曼原虫属的一种物种引起 的利什曼病可以通过使用基于来源于另一利什曼原虫物种的L3和/或L5源 的组合物来治疗，如实验部分(见实施例2)所示，几个利什曼原虫物种的 L3和L5同系物是高度保守的(至少90％的一致性，见表1)。另外，我们还在实验部分(见实施例1和3)证实了硕大利什曼原虫的L3和L5蛋白能 够保护抵抗硕大利什曼原虫或巴西利什曼原虫感染。在一个实施方式中， 由硕大利什曼原虫引起的利什曼病成功地被含有来自婴儿利什曼原虫、恰氏 利什曼原虫、亚马孙利什曼原虫或巴西利什曼原虫的L3和/或L5源的组合 物治疗。在另一实施方式中，由恰氏利什曼原虫或亚马孙利什曼原虫引起 的利什曼病成功地被含有来自婴儿利什曼原虫的L3和/或L5源的组合物治 疗。在另一实施方式中，由硕大利什曼原虫或巴西利什曼原虫引起的利什 曼病成功地被含有来自硕大利什曼原虫的L3和/或L5源的组合物治疗。替 换地，其他寄生虫病如疟疾可以成功地被基于其他物种的L3和/或L5源(例 如基于婴儿利什曼原虫或硕大利什曼原虫或墨西哥利什曼原虫或巴西利什 曼原虫的L3和/或L5源)的组合物治疗。
在本发明的上下文中，受试对象指人或动物。涵盖在本发明范围内的动 物包括哺乳动物，优选为犬。
在优选的实施方式中，本文定义的药物(或药制剂或制药组合物或药剂) 用于增强人或动物免疫系统抗感染和/或疾病(更优选为寄生虫感染和/或寄 生虫病)的能力。具体地，它可给人或动物受试对象服用。本文定义的药物 优选肠道外给药，例如通过静脉、皮下、腹腔、肌肉、动脉或病灶(intralesional) 途径注射或注入。优选的给药模式为皮下注射。本发明并不限于L3和/或L5 源给药的特定模式。优选的给药模式为使用胶囊或片剂的口服给药。替换地， L3和/或L5源可以通过导管或泵、或栓剂局部给药。替换地，L3和/或L5源可以整体给药。L3和/或L5源或包括L3和/或L5源的组合物的配制取决 于预期的给药模式和(治疗)应用。药物载体可以为任何适于递送L3和/或 L5源给受试对象的可兼容的、无毒的物质。如可以使用无菌水、或惰性固 体或赋形剂作为载体，通常补充制药可接受的佐药、缓冲剂、分散剂等。组 合物可以为液体的，如稳定的L3和/或L5源或包括L3和/或L5源的组合物 的悬浮液，也可以为固体的和/或干燥的形式：如粉末。对于口服和直肠给药， L3和/或L5源可以以固体制剂如胶囊、片剂、栓剂和粉末的形式给药，或者 以液体制剂如酏剂、糖浆剂、乳剂、软膏和悬浮液的形式给药。另一形式可 以为半固体或半液体形式，其中，L3和/或L5在固体支持物(如块)中或上 以液体形式存在。
可以通过本领域熟知的传统技术将药物与制药可接受的介质或递送载 体组合。例如，可以将L3和/或L5源和任选的佐药溶于磷酸盐缓冲液(PBS) 中。制备肠道外给药的组合物的方法为本领域所熟知且在多种资源中描述得 更详细，包括例如，Remington'sPharmaceutical Sciences，Ed.AR Gennaro， 第20版，2000，Williams&Wilkins，PA，美国。优选药物以治疗有效剂量 给药，治疗有效剂量即可增强人或动物免疫系统抗本文定义的感染和/或疾病 的能力的剂量。优选地，本发明药物制剂的治疗有效剂量能够引起本文定义 的免疫反应：当能够引起治疗对象免疫反应时，优选指当能够对给定的抗原 L3和/或L5促进或引起Th1免疫反应和/或能够预防和/或延缓真皮或粘膜病 变的发展和/或引起真皮和/或粘膜病变中和/或耳朵中和/或引流淋巴结 (DLN)(优选引流任意感染的部位(真皮、粘膜部位、耳朵))中以及内部 器官(如肝脏、脾脏、骨髓、肾脏、大脑等)中寄生虫量的显著下降时，剂 量是治疗有效的。真皮病变存在的评测如实施例1所描述(见图4：脚掌肿 胀(footpad swelling))。寄生虫量的评测如实施例所描述(见图4)。在使用 本发明组合物的最初一次疫苗接种然后一次连续用寄生虫感染并等待约6个 星期的时间段之后，本发明药物的治疗有效剂量将优选预防真皮病变的发展 和/或将优选诱导耳朵中寄生虫量下降约3个数量级和/或DLN中约相似的数 量级。在优选的实施方式中，本文定义的药物为疫苗。在更优选的实施方式 中，将至少12μg的L3和/或L5源用作疫苗。使用的L3和/或L5源的量指的是使用的L3和L5的总量。在甚至更优选的实施方式中，应当将至少 12-20μg的L3和/或L5源用于提供免疫反应，任选地与至少50μg的佐药结 合，例如优选为Th1促进佐药如CpGODN。本文定义的疫苗可以为预防的 或治疗的疫苗。L3和/或L5源和任选的佐药(优选Th1促进佐药)溶解的量 可以在100-500微升范围内变动。
组合物
在另外的方面，提供了一种包括L3和/或L5源和任选的佐药(优选Th1促进佐药)的组合物。本文已定义L3和/或L5源和佐药。在优选的实施方 式中，组合物由L3和/或L5源和Th1促进佐药组成。优选的Th1促进佐药为 CpG ODN。优选的组合物包括或由L3和/或L5源和任选的佐药(优选Th1促进佐药)溶于PBS中组成。在更优选的实施方式中，本发明还涵盖将L3 和/或L5源和佐药(优选Th1促进佐药)连续给药。因此，两种成分不需要 完全地存在于一种单一的组合物中，只要将它们都供给受试对象即可。
该组合物进一步包括制药可接受的佐药和/或载体。
优选将该组合物用作药物。所述药物优选为疫苗。本文已扩展定义了药 物、佐药和疫苗。
如本文已定义的，组合物可以为液体、固体或半液体或半固体形式。
在优选的实施方式中，为了改善治疗或预防处理的特异性，与L3和/或L5源按顺序或同时使用其他化合物。例如使用其他化合物是有利的，将进 一步增强治疗对象的免疫反应。更优选地，该化合物不与L3和/或L5源一 起存在于单一组合物中。例如，所述化合物选自由来自引起寄生虫病(19) 如利什曼病的寄生虫的其他蛋白质源组成的组中。所述蛋白质源与前文定义 的L3和/或L5源具有相同的含义。优选上下文中的蛋白质为组蛋白如H2A、H2B、H3、H4，其他核糖体蛋白如Li2A(LiP)、LiP2b(LiP’)、LiP0、L2、 L7、L8、L16、S6、L19和S4。
优选的H2A蛋白如SEQ ID NO:7所示。优选的编码H2A的核酸如SEQ ID NO:8所示。优选的H2B蛋白如SEQ ID NO:9所示。优选的编码H2B的 核酸如SEQ ID NO:10所示。优选的H3蛋白如SEQ ID NO:11所示。优选的 编码H3的核酸如SEQ ID NO:12所示。优选的H4蛋白如SEQ ID NO:13所 示。优选的编码H4的核酸如SEQ ID NO:14所示。优选的Li2A(也称为LiP2a蛋白)如SEQ ID NO:15或16所示。优选的编码Li2A的核酸如SEQ ID NO:17 所示。SEQ IDNO:17为基因组序列。本领域技术人员可以从该基因组序列 衍生出优选的编码序列。该优选的编码序列对应于编码mRNA的核酸，编 码如SEQ ID NO:15或16所示的Li2A蛋白的mRNA：一个来自SEQ ID NO:17的核苷酸791-1111且一个来自1662-1982。
优选的LiP2b蛋白如SEQ ID NO:18所示。优选的编码LiP2b的核酸如 SEQ ID NO:19所示。优选的LiP0蛋白如SEQ ID NO:20所示。优选的编码 LiP0的核酸如SEQ ID NO:21所示。
SEQ ID NO:8、10、12、14、19和21为基因组序列。本领域技术人员 可以从这些基因组序列衍生出其他优选的编码序列。这些其他优选的编码序 列对应于编码mRNA的核酸，mRNA编码各自的蛋白质：这些核酸序列分 别如SEQ ID NO:68、69、70、71、72和73所示。
优选的L2蛋白如SEQ ID NO:22所示。优选的编码L2的核酸如SEQ ID NO:23所示。优选的L7蛋白如SEQ ID NO:24所示。优选的编码L7的核酸 如SEQ ID NO:25所示。优选的L8蛋白如SEQ ID NO:26所示。优选的编码 L8的核酸如SEQ ID NO:27所示。优选的L16蛋白如SEQ ID NO:28所示。 优选的编码L16的核酸如SEQ ID NO:29所示。优选的L19蛋白如SEQ IDNO:30所示。优选的编码L19的核酸如SEQ ID NO:31所示。优选的S4蛋 白如SEQ ID NO:32所示。优选的编码S4的核酸如SEQ ID NO:33所示。优 选的S6蛋白如SEQ ID NO:34所示。优选的编码S6的核酸如SEQ ID NO:35 所示。
另一实例是使用含有几种寄生虫抗原的聚蛋白(63，65)。聚蛋白的例 子为EP 1141 305中限定的蛋白Q。编码蛋白Q的核酸分子如SEQ ID NO:36 所示。对应的编码的蛋白Q如SEQ ID NO:37所示。蛋白Q或其部分或其片 段或蛋白Q源或蛋白Q的片段源可以与L3和/或L5源组合使用。另一聚蛋 白的例子为Leish-110f(69)。Leish-110f或其部分或其片段或Leish-110f源或 Leish-110f的片段源可以与L3和/或L5源组合使用。
下段中，可以用来与L3和/或L5蛋白源组合的蛋白质以组蛋白源为例。 同样适用于以上定义的其他蛋白质，优选除L3和/或L5外的其他核糖体蛋 白。优选的化合物包括组蛋白或其片段，或编码所述组蛋白或所述组蛋白片 段的核酸分子。更优选地，组蛋白为EP1 687 023中限定的H2A、H2B、H3 和/或H4。组蛋白H2A、H2B、H3和H4为很保守的核蛋白且其序列为本领 域所熟知，见参考文献39。优选地，组蛋白从在进化树中与引起疾病的生物 邻近的生物中获得。因此，特别优选用于治疗寄生虫病如利什曼病的组蛋白 源为原生动物且特别是锥虫科中的成员，更特别是锥虫原生动物利什曼原虫 的不同物种。
其他优选的化合物包括其他核糖体蛋白或其片段或编码所述蛋白或其 片段的核酸分子。其他核糖体蛋白的实例包括L19和S4。
其他优选的化合物包括WO 2009/090175中限定的核糖体蛋白提取物。
各化合物或各化合物源可以与L3和/或L5源组合使用。组合使用可以 按顺序或同时。
在优选的实施方式中，L3和/或L5源与S4和/或S6源组合使用。更优 选地，L3、L5、S4和S6源组合使用。在另一更优选的实施方式中，L3、 L5和S4源组合使用。在另一更优选的实施方式中，L3、L5和S6源组合使 用。我们证实了(见实施例5)与单独使用L3或L5或S4相比，将L3、L5 和S4源组合使用提供了协同保护作用。在上下文中，优选的S4蛋白如SEQ IDNO:32所示。优选的编码S4的核酸如SEQ ID NO:33所示。优选的S6蛋 白如SEQ ID NO:34所示。优选的编码S6的核酸如SEQ ID NO:35所示。在 “S4和/或S6源”中使用的术语“源”与在“L3和/或L5源”中使用的术 语“源”具有相同的含义。
因此，在优选的实施方式中，S4源为多肽，所述多肽包括与氨基酸序 列SEQ IDNO:32具有至少60％的序列一致性或相似性的氨基酸序列和/或由 与SEQ ID NO:33具有至少60％的一致性的核苷酸序列编码的氨基酸序列。
因此，在优选的实施方式中，S6源为多肽，所述多肽包括与氨基酸序 列SEQ IDNO:34具有至少60％的序列一致性或相似性的氨基酸序列和/或由 与SEQ ID NO:35具有至少60％的一致性的核苷酸序列编码的氨基酸序列。
因此，在优选的实施方式中，S4源为核酸，所述核酸包括与核苷酸序 列SEQ IDNO:33具有至少60％的序列一致性或相似性的核苷酸序列和/或编 码与SEQ ID NO:32具有至少60％的一致性的氨基酸序列的核苷酸序列。
取决于使用的源的类型(蛋白质基或核酸基)，本领域技术人员将知道 哪种类型的制剂是合适的。源可以这样给药(裸蛋白或核酸)。替换地，核 酸基源可以利用本文定义的核酸构建体(nucleic acid construct)给药。
S6源
在另一方面提供了一种S6源或组合物，所述组合物包括或由S6源但不 包括L3和/或L5和/或S4源组成。我们证实了(见实施例4)单独使用S6 能够提供保护抵抗利什曼原虫感染。
在“S6源”中使用的术语“源”与在“L3和/或L5源”中使用的术语 “源”具有相同的含义。
本文定义的包括L3和/或L5源的各个用途或方法或组合物的类型也适 用于S6源。
因此，在优选的实施方式中，S6源为多肽，所述多肽包括与氨基酸序 列SEQ IDNO:34具有至少60％的序列一致性或相似性的氨基酸序列和/或由 与SEQ ID NO:35具有至少60％的一致性的核苷酸序列编码的氨基酸序列。
因此，在优选的实施方式中，S6源为核酸，所述核酸包括与核苷酸序 列SEQ IDNO:35具有至少60％的序列一致性或相似性的核苷酸序列和/或编 码与SEQ ID NO:34具有至少60％的一致性的氨基酸序列的核苷酸序列。
方法
在另一方面，本发明提供了一种预防和/或治疗寄生虫病和/或延缓其发 展和/或能够引起本文定义的免疫反应的方法：当能够引起治疗对象的免疫反 应，优选指能够对给定的抗原L3和/或L5和/或对给定的L3和/或L5源促进 或引起Th1免疫反应和/或能够预防和/或延缓真皮或粘膜病变的发展和/或引 起真皮和/或粘膜病变中和/或耳朵中和/或引流淋巴结(DLN)(优选引流任 意感染的部位(真皮、粘膜部位、耳朵))中以及内部器官(如肝脏、脾脏、 骨髓、肾脏、大脑等)中寄生虫量的显著下降的时候，方法是有疗效的。在 该方法中，本发明的疫苗发挥治疗疫苗的作用。典型地，在感染和患病之间 存在一定的时间。在这种情况下，疫苗会发挥药理学免疫产品 (pharmacological immune product)的作用，所述药理学免疫产品会通过引 发宿主中与感染的病理学作用相抵消的免疫反应来预防和/或治疗疾病和/或 延缓其发展。治疗疫苗与预防疫苗的不同在于治疗疫苗将在已感染或患病的 患者中诱导保护。本发明既涵盖治疗也涵盖预防疫苗。在该方法中，任选的 S4和/或S6源可以与L3和/或L5源组合使用。
用途
在另一方面，提供了L3和/或L5源在诊断受试对象寄生虫病中的用途。 寄生虫病、L3和/或L5源和受试对象前文已定义。在这种情况下，任选的 S4和/或S6源可以与L3和/或L5源组合使用。
本发明的一个优点是可以获得特定和早期寄生虫病的广谱诊断。寄生虫 病的一个实例为利什曼病。在优选的实施方式中，寄生虫病为利什曼病或疟 疾。更优选地，寄生虫病由利什曼原虫或疟原虫物种引起。在进一步优选的 实施方式中，寄生虫病由除L3和/或L5源来源的物种外的不同物种引起。 具体地，由利什曼原虫属的一个物种引起的利什曼病可以通过使用基于来源 于另一利什曼原虫物种的L3和/或L5源的组合物来诊断。在一个实施方式 中，由硕大利什曼原虫引起的利什曼病成功地被含有来自硕大利什曼原虫、 婴儿利什曼原虫、巴西利什曼原虫或墨西哥利什曼原虫的L3和/或L5源的 组合物诊断。替换地，其他寄生虫病如疟疾可以成功地被基于另一物种的 L3和/或L5源(例如基于婴儿利什曼原虫、硕大利什曼原虫、巴西利什曼原 虫或墨西哥利什曼原虫的L3和/或L5源)的组合物诊断。
原则上，任何受试对象都可以利用本发明进行诊断。诊断方法可以根据 需要时常用于受试对象。优选地，诊断的受试对象为疑似存在感染引起所述 寄生虫病的所述寄生虫的风险。疑似存在感染所述寄生虫的风险的受试对象 可以生活在病区(endemic area)或去过病区。病区包括从阿尔及利亚到沙 特阿拉伯、肯尼亚、苏丹、埃塞俄比亚的北非。还包括南欧：地中海国家西 班牙、法国、希腊等。还包括中美洲(所有国家)和南美洲：巴西、委内瑞 拉、秘鲁、玻利维亚、哥伦比亚、阿根廷北部、巴拉圭、乌拉圭，亚洲中部 至西南部：印度、伊朗、伊拉克、蒙古、阿富汗、尼泊尔、孟加拉国。
在本发明的上下文中，本文定义的用途优选为体外(in vitro)或离体(ex vivo)的用途。优选指所述用途在来自于所述受试对象的样品上进行。优选 的样品包括血液、血清、血浆、唾液、脑脊液或尿液。更优选地，所述样品 为从受试对象获得的血液或血清样品。
在优选的实施方式中，在表现出所述寄生虫病的症状之前诊断出来，称 为症状前诊断或无症状诊断受试对象。在该上下文中，“症状前”优选指在 表现出第一症状的至少1天、至少2天、至少3天、至少4天、至少5天、 至少6天、至少7天、至少8天、至少9天、至少10天、至少15天、至少 20天、至少25天、至少30天或更多天前。与寄生虫病有关的第一症状或第一临床表现如利什曼病可以选自发热、脾肿大、肝肿大、淋巴结肿大、结膜 炎、皮炎钩甲(onychogriphosis)、角膜结膜炎、冷漠(apathy)和极度瘦弱 (cachexia)。他们中的大多数可以通过身体的外部检查进行简单的检测。 结膜炎、皮炎钩甲、角膜结膜炎是皮肤变化(cutaneous alteration)的形式。
优选的与利什曼病有关的第一症状是淋巴结肿大。可以通过身体的外部 检查如触诊(palpation)进行检测。
在另一优选的实施方式中，在表现出所述寄生虫病的一些症状之前诊断 出来，称为寡症状(oligosymptomatic)受试对象的诊断。在该上下文中，“寡 症状”优选指具有最多三种以上定义的症状的受试对象。
在另一优选的实施方式中，在表现出所述寄生虫病的所有症状之前诊断 出来，称为有症状的受试对象的诊断。在该上下文中，“有症状的”优选指 具有至少四种以上定义症状(包括以上定义的皮肤变化形式)的受试对象。
本领域技术人员可以理解的是诊断的最重要类型是无症状受试对象的 诊断，因为这将有助于防止疾病的进一步传播且可以更有效地帮助并治疗无 症状的受试对象，如果他们被诊断处于该阶段。
在这种用途中，L3和/或L5和/或S4和/或S6源可以为用于检测下文阐 释的样品中抗体存在的L3和/或L5和/或S4和/或S6蛋白或蛋白片段。
替换地，L3和/或L5和/或S4和/或S6源可以为用于检测下文阐释的样 品中L3和/或L5和/或S4和/或S6核酸存在的核酸分子。
方法
在另一方面，提供了一种利用L3和/或L5源诊断受试对象寄生虫病的 方法，该方法包括检验从受试对象获得的样品中是否存在识别L3和/或L5 源的抗体。任选地，可以将S4和/或S6源与L3和/或L5源组合使用。本发 明优选的方法为关于优选体外或离体进行的本发明的优选用途。前文已定 义。
在优选的方法中，L3和/或L5源存在于组合物中。在优选的实施方式中， 另一种化合物也存在于所述组合物中。替换地，没有其他的化合物存在于所 述组合物中。
在优选的实施方式中，为了改善方法的特异性，其他化合物与L3和/或 L5源按顺序或同时使用。例如，使用将能够辨别无症状、寡症状或有症状 受试对象和接种了疫苗的受试对象的其他化合物是有利的。更优选地，所述 化合物不与L3和/或L5源一起存在于单一的组合物中。在上下文中，可以 使用名为组合物部分中鉴别的每种蛋白质。例如，所述化合物选自由引起寄 生虫病(19)如利什曼病的其他蛋白质源组成的组中。所述蛋白质源与前文 定义的L3和/或L5源具有相同的含义。优选上下文中的蛋白质为组蛋白如 H2A、H2B、H3、H4，另一核糖体蛋白如Li2A(LiP)、LiP2b(LiP’)、LiP0、 L2、L7、L8、L16、S6、L19和S4。
另一实例为使用含有几种寄生虫抗原的聚蛋白(59，61)。聚蛋白的例 子为EP 1141 305中限定的蛋白Q。蛋白Q或其部分或其片段或蛋白Q源或 蛋白Q的片段源可以与L3和/或L5源组合使用。
优选的抗原包括组蛋白或其片段或编码所述组蛋白的核酸分子。更优选 地，组蛋白为EP 1 687 023中限定的H2A、H2B、H3和/或H4。组蛋白H2A、 H2B、H3和H4为很保守的核蛋白且其序列为本领域所熟知，见参考文献 39。优选地，组蛋白从在进化树中与引起疾病的生物邻近的生物中获得。因 此，特别优选用于治疗寄生虫病如利什曼病的组蛋白源为原生动物且特别是 锥虫科中的成员，例如疟原虫如恶性疟原虫，更特别是锥虫原生动物利什曼原虫的不同物种。
在更优选的诊断方法中，当存在可检测量的识别L3和/或L5源的抗体 (优选为蛋白质或肽或蛋白部分)时和/或当所述抗体存在的量增加时，诊断 寄生虫病。在受控制的或健康的受试对象中，一般不能检测所述抗体。
利用本领域技术人员所熟知的方法如ELISA进行所述抗体存在的检测。 优选的检测方式如实施例1所述。
识别L3和/或L5源的抗体(优选为蛋白质或肽或蛋白部分)优选指至 少存在一种能够识别存在于L3和/或L5源中的至少一种化合物的抗体。所 述化合物可以为L3和/或L5蛋白或L3和/或L5蛋白片段或蛋白部分或肽。 同样适用于识别S4和/或S6源的抗体。
在另一方法中，利用另一核酸分子检测L3和/或L5核酸分子。L3和/ 或L5核酸分子优选为前文定义的编码L3和/或L5分子的核酸分子或其部 分。另一核酸分子优选为引物，所述引物被设计为能够检测PCR反应或RNA 印迹中L3和/或L5核酸分子的存在。同样适用于能够检测S4和/或S6核酸 分子存在的引物。检测L3和/或L5核酸分子存在的引物优选包括或由以下 序列组成：
通过PCR特异性检测L3的引物序列
正义链，5’-AACACGAAGGAGGGCAAGGTC-3’(LmL3序列的核苷酸 418-438)(SEQ IDNO:38)
反义链，5’-CTTCTTCGCGGCCTTTGCCTTG-3’(LmL3序列的核苷酸 1242-1263的反向和互补)(SEQ ID NO:39)
通过PCR特异性检测L5的引物序列
正义链，5’-TGCACGCTGGCAAATTGGGTAC-3’(LmL5序列的核苷 酸10-31)(SEQ IDNO:40)
反义链，5’-CTT CTT CGT GCG CAC AGC AG-3’(LmL5序列的核苷酸 464-483的反向和互补)(SEQ ID NO:41)
通过RNA印迹特异性检测L3的引物序列
5’-CTTCTTCGCGGCCTTTGCCTTG-3’(LmL3序列的核苷酸1242-1263 的反向和互补)(SEQ ID NO:42)
通过RNA印迹特异性检测L5的引物序列
5’-CTT CTT CGT GCG CAC AGC AG-3’(LmL5序列的核苷酸464-483 的反向和互补)(SEQ ID NO:43)。L3和/或L5核酸分子的表达水平的检测或 增强优选定义为与所述核酸分子在对照受试对象中的表达水平相比，所述核 酸分子的表达水平的可检测的变化。通常，对照受试对象不包括该L3和/或 L5核酸分子。优选地，L3和/或L5核酸分子表达水平的增强指利用PCR核 苷酸序列的表达水平的至少5％的增加。
分析
在另一方面，提供了一种用于诊断受试对象寄生虫病的分析设备，其中， 所述设备包括L3和/或L5源。任选地，S4和/或S6源与L3和/或L5源组合 也存在于该分析设备中。可以通过任何本领域技术人员熟知的标准方法检测 特异性识别所述源的抗体的存在(如参见通过引用的方式并入本文的Harlow 和Lane，Antibodies:A Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory， 1988)。适当的方法包括亲和层析联合电泳(ACE)分析和(酶联免疫吸附 分析)ELISA。优选地，所述分析包括ELISA。以下将更广泛地描述多种分 析方法。
在优选的实施方式中，分析涉及固定于以结合至固体支撑(solid support) 上的L3和/或L5源的使用并除去样品中的抗体。然后可以利用与抗体/L3和 /或L5源复合物结合的且具有可检测的信息基团的检测试剂检测所述结合的 抗体。适当的检测试剂包括与抗体/L3和/或L5源复合物结合的抗体以及用 信息基团标记的游离多肽(如半竞争性分析中)。替换地，可以使用竞争性 分析，其中，与L3和/或L5源结合的抗体用信息基团标记且在带有样品的 源温育后，将所述抗体结合于固定的L3和/或L5源。样品的成分抑制标记 抗体与所述L3和/或L5源结合的程度表示样品与固定的L3和/或L5源的反 应度。
固体支撑可以为本领域普通技术人员熟知的可以粘附L3和/或L5源的 任何材料。例如，支撑可以为微量滴定板(microtiter plate)或硝化纤维或其 他适当的膜中的试验孔(test well)。替换地，支撑可以为小珠(bead)或圆 盘(disc)，如玻璃、玻璃纤维、乳胶或塑料材料如聚苯乙烯或聚氯乙烯。支 撑还可以为磁性粒子或光纤传感器(fiber opticsensor)，例如美国专利 5,359,681中公开的那些材料。
可以利用各种本领域已知的技术将L3和/或L5源结合至所述固体支撑。 在本发明的上下文中，术语“结合”既指非共价连接(如吸附)，也指共价 连接(可以是在抗原和支撑上的功能基团之间的直接连接或者可以是通过交 联剂的方式的连接)。优选通过吸附结合至微量滴定板或膜中的孔。在这种 情况下，可以通过将适当缓冲液中的L3和/或L5源与固体支撑接触适当的 时间完成吸附。接触时间随着温度而变化，但是典型的在1小时和1天之间。 通常，与塑料的微量滴定板(如聚苯乙烯或聚氯乙烯)的孔接触的L3和/或 L5源的量在10ng-1g范围内，优选为100ng，足以结合充足量的L3和/或L5 源。此外，当给出了一定数量或量的L3和/或L5源时，就确定了使用的L3 和/或L5源的总量。
通常可以通过支撑与双官能团试剂的第一反应实现L3和/或L5源与固 体支撑的共价连接，所述双官能团试剂将与支撑和功能基团(如多肽上的羟 基或氨基)反应。例如，可以利用苯醌或通过支撑上的醛基与多肽上的氨基 和活性氢的缩合将L3和/或L5源结合至具有适当聚合物涂层的支撑上(如 参见Pierce Immunotechnology Catalog andHandbook(1991)at A12-A13)。
在特定的实施方式中，分析为酶联免疫吸附分析(ELISA)。该分析可 以通过首先将已固定在固体支撑(通常为微量滴定板的孔)上的L3和/或L5 源与样品接触，使得样品内L3和/或L5源特异的抗体与固定的L3和/或L5 源结合进行。然后从固定源上除去未结合的样品并添加能够与固定的抗体 -L3和/或L5源复合物结合的检测试剂。然后利用适于特异性检测试剂的方 法测定仍然结合至固体支撑上的检测试剂的量。
一旦将L3和/或L5源固定在支撑上，通常将所述支撑上剩余的蛋白质 结合位点封闭。可以使用本领域普通技术人员熟知的任何适当的封闭剂，如 牛血清白蛋白(BSA)或吐温20(Sigma Chemical公司，圣路易斯，MO)。 然后将固定的L3和/或L5源与样品一起温育，并使抗体(如果样品中存在) 与所述源结合。可以在温育前用适当的稀释剂(如磷酸盐缓冲液(PBS))稀 释样品。通常，合适的接触时间(即温育时间)为允许充分检测样品中抗体 存在的时段。优选地，所述接触时间为足以获得结合程度至少为结合与未结 合抗体间平衡时获得的95％。本领域普通技术人员可以认识的是，可以容易 地通过分析时段内产生的结合程度而测得达到平衡所需的时间。在室温下， 通常充足的温育时间约为30min。
然后可以通过用适当的缓冲液清洗固体支撑除去未结合的样品，如然后 可以将含有0.1％吐温20的PBS检测试剂添加至固体支撑。适当的检测试 剂为任何与固定的抗体-L3和/或L5源复合物结合的化合物且可以通过任何 各种本领域熟知的方式检测。优选地，所述检测试剂含有与信息基团结合的 结合剂(例如，如蛋白A、蛋白G、免疫球蛋白、凝集素或游离的抗原)。 优选的信息基团包括酶(如辣根过氧化物酶)、底物、辅因子、抑制因子、染料、放射性核素(radionucleides)、发光基团、荧光基团和生物素。可以 利用本领域普通技术人员熟知的标准方法实现结合剂与信息基团的结合。可 以商购的常规结合剂与来自一些源(如Zymed Laboratories，旧金山，CA and Pierce，罗克福德，IL)的信息基团结合。
然后将检测试剂与固定的抗体L3和/或L5源复合物温育一段充足的时 间以检测结合的抗体。通常可以从厂家的说明书或通过分析时段内产生的结 合程度确定合适的时间。然后除去未结合的检测试剂并利用信息基团检测结 合的检测试剂。
用来检测信息基团的方法取决于信息基团的性质。对于放射性基团，闪 烁计数(scintillation counting)或自动射线照相方法通常是合适的。可以使 用光谱法检测染料、发光基团和荧光基团。可以利用联接至不同信息基团(通 常放射性或荧光基团或酶)的抗生物素蛋白检测生物素。一般可以通过添加 底物(通常为特定的时段)，然后通过光谱或其他反应产物的分析方法检测 酶信息基团。
为了确定样品中寄生虫病如利什曼病特异性抗体的存在或不存在，一般 将检测到的来自仍结合至固体支撑上的信息基团的信号与相应的预测定的 临界值(cut-offvalue)比较。在一种优选的实施方式中，临界值优选为当固 定的L3和/或L5源与来自未感染的受试对象的样品温育时获得的信号的平 均值。通常，产生在预测定的临界值以上为三个标准偏差的信号的样品被认 为是阳性的(即与L3和/或L5源反应)。在替换的优选的实施方式中，根据 Sackett et al,Clinical Epidemiology:A Basic Science for ClinicalMedicine,p. 106-7(Little Brown and Co.,1985)的方法，利用接收器操作曲线(Receiver Operator Curve)测定所述临界值。简单地说，在该实施方式中，可以从多对 对应于各个可能的诊断测试结果的临界值的真阳性率(即敏感性)和假阳性 率(100％-特异性)的曲线(plot)中确定所述临界值。
曲线上最接近左上角(即围绕最大区域的值)的临界值是最准确的临界 值，且产生比通过该方法确定的临界值高的信号的样品可以认为是阳性的。 替换地，所述临界值可以沿曲线移动至左边，以减小假阳性率，或至右边， 以减小假阴性率。
在相关的实施方式中，以穿流或带状测试形式(flow-through or strip testformat)进行分析，其中，将L3和/或L5源固定在膜如硝化纤维上。在穿流 测试中，当样品穿过膜时，样品中的抗体与固定的L3和/或L5源结合。然 后当含有检测试剂的溶液穿过膜时，检测试剂(如蛋白A胶体金(protein A-colloidal gold))与抗体-L3和/或L5源复合物结合。然后可以如上所述的 进行结合的检测试剂的检测。在带状测试形式中，将结合有源的膜的一端浸 入含有样品的溶液中。样品沿膜移动穿过含有检测试剂的区域至固定有多肽的区域。L3和/或L5源中检测试剂的浓度表示样品中存在引起寄生虫病如利 什曼病的寄生虫的抗原的特异性抗体。通常地，那个位点上检测试剂的浓度 会形成图案，如线条，是可见的。不存在该图案表示阴性结果。通常，如上 所述，当样品含有抗体的量足以在ELISA中产生阳性信号时，选择膜上固 定的L3和/或L5源的量以产生视觉可辨别的图案。优选地，膜上固定的L3 和/或L5源的量在25ng-500ng范围内。通常可以用很少量(如一滴)受试 对象的血清或血液进行这样的测试。
如果在该分析设备中S4和/或S6源与L3和/或L5源组合使用，公开的 用于L3和/或L5源的分析设备的各个部件也可以用于S4和/或S6源。
任何受试对象或医师可以在办公室/家中使用该设备，每当有需要时， 重复使用该设备。
一般在分析中使用额外的分子作为阳性或阴性对照。典型的阳性对照可 以为识别测试样品中已知存在的分子的抗体。典型的阴性对照可以为识别测 试样品中已知存在的分子的抗体。
一般定义
在本发明的上下文中，蛋白质或蛋白片段由氨基酸序列表示。
在本发明的上下文中，核酸分子由编码蛋白质或多肽或蛋白片段的核酸 或核苷酸序列表示。核酸分子可以包括调控区域。
应当理解的是，本文通过给出的序列号(SEQ ID NO)限定的各个核酸分 子或蛋白质或蛋白片段并不限于所公开的特定序列。本文限定的各个基因序 列或核苷酸序列编码给出的蛋白质或多肽或蛋白片段或自己本身是蛋白质 或蛋白片段。贯穿本申请，每次提及的特定核苷酸序列SEQ ID NO(以SEQ ID NO:2或4为例)，可以将其替换为：
i.含有与SEQ ID NO:2或4或49或51或53或55或65(示例)具有至 少60％的序列一致性或相似性的核苷酸序列的核苷酸序列。
ii.与(i)的序列的核酸分子杂交的核苷酸序列的互补链；
iii.由于遗传密码的简并，与(iii)的核酸分子的序列不同的核苷酸序列。
iv.编码与由核苷酸序列SEQ ID NO:2或4或49或51或53或55或65 编码的氨基酸序列具有至少60％的氨基酸一致性或相似性的氨基酸序列的 核苷酸序列。
贯穿本申请，每次提及的特定氨基酸序列SEQ ID NO(以SEQ ID NO:1 或3或48或50或52或54或56为例)，可以将其替换为：
含有与氨基酸序列SEQ ID NO:1或3或48或50或52或54或56具有 至少60％的序列一致性或相似性的氨基酸序列的多肽。
本文通过借助与给定的核苷酸序列或氨基酸序列的一致性或相似性百 分比(至少60％)描述的各个核苷酸序列或氨基酸序列在优选的实施方式中 分别与给定的核苷酸或氨基酸序列具有至少65％、70％、75％、80％、85％、 90％、95％、97％、98％、99％的一致性或相似性或者分别与给定的核苷酸或 氨基酸序列具有更多的一致性或相似性。在优选的实施方式中，通过比对前 文限定的序列的全长确定序列一致性或相似性。
本文将“序列一致性”定义为两个或更多的氨基酸(多肽或蛋白质)序 列间的关系或两个或更多的核酸(多核苷酸)序列间的关系，通过比对序列 而确定。在优选的实施方式中，基于两个给出的SEQ ID NO的全长或其部 分计算序列一致性。其部分优选指两个SEQID NO的至少50％、60％、70％、 80％、90％或100％。本领域中，“一致性”还指氨基酸或核酸序列间序列相 关性的程度，根据具体情况，通过这些序列的条带(strings)间的匹配确定。
通过将氨基酸序列及其一个多肽的保守氨基酸取代与第二个多肽序列 比对确定两个氨基酸序列间的“相似性”。可以通过已知的方法容易地计算 “一致性”和“相似性”，包括但不限于这些文献中描述的方法：Computational Molecular Biology,Lesk,A.M.,ed.,牛津大学出版社，纽约,1988； Biocomputing:Informatics and Genome Projects,Smith,D.W.,ed.,学术出版 社，纽约,1993；Computer Analysis of Sequence Data,Part I,Griffin,A.M.,and Griffin,H.G.,eds.,胡马纳出版社，新泽西,1994；Sequence Analysisin Molecular Biology,von Heine,G.,学术出版社，1987；and Sequence AnalysisPrimer,Gribskov,M.and Devereux,J.,eds.,M Stockton出版社，纽约，1991；以 及Carillo,H.,and Lipman,D.,SIAM J.Applied Math.,48:1073(1988)。
设计确定一致性的优选方法以在测试的序列间产生最大的匹配。确定一 致性和相似性的方法编纂在公开可用的计算机程序中。优选的确定两个序列 一致性和相似性的计算机程序方法包括例如GCG程序包(Devereux、J.,et al., Nucleic Acids Research 12(1):387(1984))、BestFit、BLASTP、BLASTN和 FASTA(Altschul、S.F.et al.,J.Mol.Biol.215:403-410(1990)。BLAST X程序 是NCBI和其他来源(BLAST Manual、Altschul,S.,et al.,NCBI NLM NIH Bethesda，MD 20894；Altschul，S.,et al.,J.Mol.Biol.215:403-410(1990))公 开可获得的。还可以使用众所周知的Smith Waterman算法来确定一致性。
优选的多肽序列比对参数包括如下：规则系统(Algorithm)：Needleman andWunsch,J.Mol.Biol.48:443-453(1970)；比对矩阵(Comparison matrix)： BLOSSUM62来自Hentikoff and Hentikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 89:10915-10919(1992)；间隙罚分(Gap Penalty)：12和间隙长度罚分(Gap Length Penalty)：4。就像来自位于麦迪逊，威斯康星州(Madison,WI)的 遗传学电脑集团的“Ogap”程序一样，带有这些参数的有用的程序是公开可 获得的。前述的参数为氨基酸比对(闭口间隙(end gaps)不伴随罚分(penalty))的默认参数。
优选的核酸比对参数包括如下：规则系统：Needleman and Wunsch,J.Mol.Biol.48:443-453(1970)；比对矩阵：匹配(matches)＝+10,失配(mismatch) ＝0；间隙罚分：50；间隙长度罚分：3。可获得如来自麦迪逊，威斯康星州 (Madison,Wis)的遗传学电脑集团的间隙程序。以上给出的是核酸比对的 默认参数。
任选地，本领域技术人员清楚的是，在确定氨基酸相似性程度时，本领 域技术人员还可以考虑称为“保守的”氨基酸取代。保守的氨基酸取代指的 是具有相似的侧链的残基的可替换性。例如，一组具有脂肪族侧链的氨基酸 是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；一组具有脂肪族-羟基的 侧链的氨基酸是丝氨酸和苏氨酸；一组具有含酰胺侧链的氨基酸是天冬酰胺 和谷氨酰胺；一组具有芳香族侧链的氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸； 一组具有碱性侧链的氨基酸是赖氨酸、精氨酸和组氨酸；以及一组具有含硫 侧链的氨基酸是半胱氨酸和蛋氨酸。优选的保守氨基酸取代组为：缬氨酸- 亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、天 冬酰胺-谷氨酰胺。本文公开的氨基酸序列取代变体为公开的序列中至少一 个残基缺失且不同的残基在其位置插入的氨基酸序列。优选地，氨基酸的变 化是保守的。优选的各个自然发生的氨基酸的保守取代如下：Ala到Ser； Arg到Lys；Asn到Gln或His；Asp到Glu；Cys到Ser或Ala；Gln到Asn； Glu到Asp；Gly到Pro；His到Asn或Gln；Ile到Leu或Val；Leu到Ile或 Val；Lys到Arg；Gln或Glu；Met到Leu或Ile；Phe到Met、Leu或Tyr； Ser到Thr；Thr到Ser；Trp到Tyr；Tyr到Trp或Phe；以及Val到Ile或Leu。
核酸构建体
核酸构建体包括编码本文定义的蛋白质或蛋白片段的核苷酸序列。包括 编码本文定义的给定的蛋白质或蛋白片段的核酸分子的核酸构建体将确保 给定的核酸分子、以及相应的蛋白质或蛋白片段在治疗对象中的表达。在更 优选的实施方式中，核酸构建体包括1个以上的核酸分子，各个核酸分子编 码给定的蛋白质或蛋白片段。在甚至更优选的实施方式中，核酸构建体包括 2个、3个、4个核酸分子，各个核酸分子编码给定的蛋白质或蛋白片段。在 优选的实施方式中，核酸构建体包括表达盒，所述表达盒包括各种所需的核 酸分子。各个核酸分子可操作地与存在的其他核酸分子相连。最优选地，适 当的启动子可操作地与所述表达盒相连，以确保受试对象中核酸分子的表 达。
在本文和其权利要求中，动词“包括”及其词形变化(conjugations)以 其非限制性的意义使用，意指含有词后的那些项，但是没有排除未明确提到 的项。另外，动词“组成”可以由“基本上由…组成”替换，意指除了明确 鉴定的成分外，本文定义的产物或组合物或L3或L5源可以包括其他的成分， 所述其他的成分不会改变本发明的独特特征。
另外，关于用不定冠词“a”或“an”修饰的元件不排除存在一个以上 的可能性，除非上下文中明确要求存在一个且仅一个元件。因此不定冠词“a” 或“an”通常指“至少一个”。
将本说明书中引用参考的所有专利和文献通过引用其全部内容的方式 并入本文。
以下通过实施例进一步阐述本发明，实施例不应当理解为是对本发明范 围的限制。
附图说明
图1.重组硕大利什曼原虫rLmL3和rLmL5蛋白质的表达和纯化。诱 导后(泳道1)、通过Ni-NTA琼脂糖柱传代后(泳道2)以及纯化的重组rLmL3 和rLmL5(泳道3)的pQELmL3(板L3)或pQELmL5(板L5)载体转染 的大肠杆菌溶菌产物的考马斯亮蓝染色的(Coomassie-blue-stained)13％聚 丙烯酰胺凝胶。
图2a-2c.L3和L5蛋白的抗原性
(a)用5×104的硕大利什曼原虫稳定期的前鞭毛体s.c.感染12只BALB/c 小鼠的左脚掌并在攻击后8周获得血清。通过ELISA分别确定患有皮肤利 什曼病(MCL)的小鼠血清的IgG1和IgG2a抗体抗rLmL3和rLmL5的相 关性(relativities)。还表征了感染前相同小鼠血清缺乏相关性。患有有症状 CVL犬的血清和抗rLmL3(b)和rLmL5(c)重组蛋白质的对照组血清的ELISA 相关性。
图3a-3f.BALB/c小鼠中通过接种疫苗诱导的细胞因子产物。将BALB/c 小鼠(每组6只)用10μg的rLmL3+50μg的CpG-ODN(L3+CpG)或10μg的 rLmL5+50μg的CpG-ODN(L5+CpG)、用50μg的CpG-ODN(CpG)或用PBS (生理盐水)s.c.免疫三次。接种疫苗后4周获得脾脏细胞并于存在rLmL3(a、 c和e)、rLmL5(b、d和f)和仅培养基中体外培养48h。通过ELISA评估培养物上层清液中IFN-γ(a和b)、IL-4(c和d)和IL-10(e和f)的水平。各条代 表来自单个小鼠的数据的平均值±SD。
图4a-4b.攻击后BALB/c接种疫苗的小鼠中硕大利什曼原虫感染的过 程。(a将给出的脚掌肿胀作为感染和未感染的对侧脚掌间厚度的差异。(b 在攻击后8周，通过有限稀释各自确定感染了的腿的腿弯部(poplyteal)引 流淋巴结和脾脏中有活性的寄生虫的量。(*，P<0.01)
图5a-5c.L3+CpG ODN接种疫苗的小鼠中由感染引起的细胞免疫反 应。寄生虫攻击后8周，制备脾脏细胞培养物。将细胞不刺激(培养基)或 在37℃下于5％CO2中，分别用LRP(利什曼原虫核糖体蛋白质)(12μg ml-1)、 SLA(溶解的利什曼原虫抗原)(12μg ml-1)、MRP(鼠核糖体蛋白质)(12μg ml-1)或L3(6μg ml-1)刺激48h。通过捕获酶联免疫吸附方法(capture enzyme-linked immunosorbent assay)测量培养物上层清液中IFN-γ(a,)IL-4(b) 和IL-10(c)水平。各条代表每组6只单个小鼠中细胞因子水平的平均值加上 标准偏差。
图6a-6c.L5+CpG ODN接种疫苗的小鼠中由感染引起的细胞免疫反 应。寄生虫攻击后8周，制备脾脏细胞培养物。将细胞不刺激(培养基)或 在37℃下于5％CO2中，分别用LRP(12μg ml-1)、SLA(12μg ml-1)、MRP(12 μg ml-1)或L5(6μg ml-1)刺激48h。通过捕获酶联免疫吸附方法测量培养物 上层清液中IFN-γ(a)IL-4(c)和IL-10(b)水平。各条代表每组6只单个小鼠中 测定的细胞因子水平的平均值加上标准偏差。
图7a-7b.攻击后BALB/c接种疫苗的小鼠中巴西利什曼原虫感染的过 程。(a)感染耳朵的炎性病变。病变尺寸(毫米)用在5只小鼠上进行一个 实验获得的平均值±SD表示。用rLmL5+CpG-ODN或rLmL3+CpG-ODN 接种疫苗的以及两对照组的小鼠间的*P<0.05。(b)在感染后5周，测定耳 朵真皮中寄生虫载量。结果用每组5个耳朵的平均值±SD表示。rLmL5+CpG-ODN和两对照小鼠组间*P<0.05显著下降。
图8a-8b.LmL3和LmL5蛋白的核糖体位置。将1μg的rLmL3蛋白(a)、 1μg的rLmL5蛋白(b)和10μg的硕大利什曼原虫LRP提取物(a和b)在线 性10-13％梯度SDS-PAGE凝胶上进行电泳。考马斯亮蓝染色的凝胶如左边 板所示(a和b)。将相等的凝胶与用rLmL3(板α-LmL3)(a)免疫的小鼠的 血清和五犬内脏利什曼病血清(板α-LmL5)(b)的亲和纯化的抗LmL5抗体部 分杂交并探测。
图9a-9b.在CpG的存在下用核糖体蛋白质S6、L2、L7、L8和L6接 种疫苗的小鼠中感染参数的分析。(a)每周检测感染组的病变发展直至感染 后8周。感染后8周，S6加CpG ODN和对照(生理盐水和佐药)组间脚掌 肿胀的差异是统计上显著的(*P<0.05)。(b)感染后8周，分析DLNs和脾 脏中寄生虫载量测定。S6加CpG ODN接种免疫组和对照(生理盐水和佐药) 组的脾脏中寄生虫负载的差异是统计上显著的(*P<0.05)。为了简明，仅 显示了生理盐水组和S6加CpG ODN接种免疫组的SD。
图10a-10b.S6加CpG ODN接种疫苗引起的免疫反应。(a)在最后一 次剂量给药后，从用S6加CpG ODN、CpG ODN和生理盐水免疫了4周的 小鼠中获得血清样品。通过ELISA分别测试血清以确定抗-S6特异性IgG、 IgG1和IgG2a抗体的存在。S6加CpG ODN组和对照(生理盐水和CpG) 组间统计上显著的差异(*P<0.05)。(b)将脾脏细胞不刺激(培养基)或在 37℃下于5％CO2中用S6刺激48h。通过捕获酶联免疫吸附方法测量培养物 上层清液中IFN-γ、IL-4和IL-10水平。各条代表每组4只单个小鼠中测定 的细胞因子水平的平均值加上标准偏差。S6加CpG ODN组和对照(生理盐 水和CpG)组间统计上显著的差异(*P<0.05)。
图11a-11b.在CpG的不存在或存在下用L3、L5和S4单独或混合制 剂免疫的小鼠中病变的发展。每周检测病变直至感染后6周。(a)对照小鼠 组和用不含佐药的重组蛋白质接种疫苗的小鼠组。(b)对照小鼠组和用重组 蛋白质加CpG ODN接种疫苗的小鼠组。感染后6周，L3加CpG ODN、L5 加CpG ODN、L3加L5加CpG ODN或L3加L5加S6加CpG ODN以及对 照(生理盐水和佐药)组间脚掌肿胀的差异是统计上显著的(*P<0.05)。
图12a-12b.接种疫苗的小鼠中寄生虫载量。感染后7周，确定脾脏和 DLN中的寄生虫负载。(a)对照小鼠组和用不含佐药的重组蛋白质接种疫苗 的小鼠组。(b)对照小鼠组和用重组蛋白质加CpG ODN接种疫苗的小鼠组。 L3加CpG ODN、L5加CpG ODN、L3加L5加CpGODN或L3加L5加S6 加CpG ODN以及对照(生理盐水和佐药)组间脾脏寄生虫载量的差异是统计上显著的(*P<0.05)。L3加L5加CpG ODN或L3加L5加S6加CpG ODN 以及对照(生理盐水和佐药)组间腿弯部(popliteal)寄生虫载量的差异是 统计上显著的(*P<0.05)。
图13.提出的嵌合结构的图示。显示了为克隆设计的引物和选择的酶切 位点。
具体实施方式
实施例
实施例1：硕大利什曼原虫L3和L5蛋白的克隆以及这些蛋白赋予的对硕大利什曼 原虫感染的防护作用
材料和方法
小鼠菌株和寄生虫
雌性BALB/c小鼠(6-8周大)购于Harlan Interfauna Ibérica S.A.(巴塞 罗那，西班牙)。
硕大利什曼原虫寄生虫(WHOM/IR/-/173)通过在BALB/c小鼠中传代 而保持在易传染的状态(virulent state)。通过在补充有20％的胎牛血清的 Schneider’s培养基(Gibco，BRL，格兰德岛，纽约，美国)中于26℃下培 养而获得硕大利什曼原虫无鞭毛体并转化成前鞭毛体。
CpG-ODN
硫代磷酸修饰的CpG-ODN(5’-TCAACGTTGA-3’和5’- GCTAGCGTTAGCGT-3’)(SEQ IDNO:5、6)通过等基因(Isogen)(荷兰) 合成。
编码硕大利什曼原虫核糖体蛋白L3和L5的DNA序列的克隆。
从硕大利什曼原虫基因组数据库(www.genedb.org/genedb/leish)利用酿 酒酵母(S.cerevisiae)L3和L5蛋白序列作为探针(56)获得编码硕大利什 曼原虫L3和L5蛋白的开放阅读框(ORF)。对于rLmL3和rLmL5蛋白的 表达，使用硕大利什曼原虫(MHOM/IL/80(Friedlin))的DNA作为模板PCR 扩增其编码区(CR)。将扩增的DNAs克隆至pBluescript质粒(Stratagene， La Jolla加拿大)并在克隆至pQE30表达载体(QIAGEN，希尔登，德国) 前进行测序。
LmL3CR克隆使用的引物为：正义链，5'- CGGGATCCATGTCTCACTGCAAGTTCGAG-3’(LmL3CR的位置1-20 (LmjF34.2880))(SEQ ID NO:44)；反义链，5’-AACTGCAGTTACTTCTTCGCGGCCTTTG-3’(与LmL3CR的位置 1241-1260反向和互补(LmjF34.2880))(SEQ ID NO:45)。包括BamHI和 PstI限制酶切位点(画有下划线)用于克隆的目的。
LmL5CR克隆使用的引物为：正义链，5'-CGGGATCCATGTGCACGC TGGCAAATTG-3’(LmL5CR的位置1-20(LmjF35.1890))(SEQ ID NO:46)； 反义链，5'-CCCAAGCTTTTACTTGCCGAGGCGCTCGC-3’(与LmL5CR的 位置968-987反向和互补(LmjF35.1890.319))(SEQ ID NO:47)。包括BamHI 和HindIII限制酶切位点(画有下划线)用于克隆的目的。
蛋白质的纯化
rLmL3和rLmL5蛋白在用pQE-LmL3或pQE-LmL5质粒转化的大肠杆 菌中过表达并在变性的条件下于Ni-次氮基三乙酸(Ni-NTA)琼脂糖柱 (Qiagen)上纯化。结合到Ni-NTA琼脂糖上后，重组蛋白质在所述亲和柱 上重折叠(57)。所述重组蛋白质穿过多粘菌素-琼脂糖(Sigma，圣路易斯， 密苏里州)。用定量显色鲎变形细胞法(Quantitative ChromogenicLimulus Amebocyte Assay)QCL-1000(BioWhittaker，Walkersville，马里兰州)测定残 余的内毒素含量(<12pg/μg的重组蛋白质)。
免疫、寄生虫攻击和寄生虫的定量
用各自与25μg的CpG-ODN混合的10μg的rLmL3或10μg的rLmL5 在两个独立的BALB/c小鼠组(每组六只)的右脚掌(right footpad)上皮下 (s.c.)接种。作为对照，分别仅用25μg的CpG-ODN或用具有磷酸盐缓冲 液(PBS)的CpG-ODN接种两个另外的小鼠组。2和4周后，每组使用用 于启动(priming)的相同剂量进行提升(boosted)。最后一次接种后4周， 通过在左(未处理)脚掌s.c.接种5×104稳定期的硕大利什曼原虫 (WHOM/IR/-/173)的前鞭毛体进行寄生虫攻击。用度量卡尺(metric caliper) 测定脚掌肿胀并计算左脚掌的厚度减去右脚掌的厚度。通过所述的有限稀释 测定法(limiting dilution assay)(70)确定耳朵、引流淋巴结(DLN)和脾 脏中的寄生虫数量。
利什曼原虫抗原和小鼠核糖体蛋白。
对于硕大利什曼原虫LRP的制备，收获109个前鞭毛体，在预冷的PBS 中洗涤两次并悬浮于1ml的NP40裂解缓冲液(10mM Tris HCl、pH 8.0、150 mM NaCl、1.5mM MgCl2和0.5％NP40)中并用移液器吸取来回10次。裂 解后，在4℃下将样品以3000×g微量离心(microfuged)2min，以使细胞 核团成小球(pellet the nuclei)。在4℃下将上层清液以13000×g微量离心15min并如[57]所述地从细胞溶质上层清液中制得核糖体。简单地说，在4℃ 下将细胞溶质置于Beckman TL100.3转子中以90000rpm高速离心30min。 将未加工的核糖体小球(pellet)重新悬浮于缓冲液A(20mM Tris-HCl、pH 7.4、500mM AcNH4、100mMMgCl2、5mMβ-巯基乙醇)中并在4℃下置于 TL100.3转子中以90000rpm离心通过缓冲液A中的不连续蔗糖梯度 (20/40％)。将洗过的核糖体小球溶解于PBS中并用超声波处理直至核糖体 RNA完全降解。利用相同的方法从5×107RAW 264.7鼠科动物的巨噬细胞中 制得小鼠核糖体蛋白提取物(MRP)。
如(70)所述地制备硕大利什曼原虫的总蛋白(可溶的利什曼原虫抗原 [SLA])。简单地说，将硕大利什曼原虫前鞭毛体(1010)在PBS中洗涤两次， 重新悬浮于500ml的PBS中并通过三次冷冻和解冻的循环进行裂解。细胞 裂解后，通过利用微型离心机以12000×g离心15min从不溶的部分分离可溶 的抗原。将上清液等分(aliquoted)并贮存于-70℃。
上层清液中细胞因子的测量
利用商用ELISA试剂盒(Diaclone，
Figure BDA0001375961830000421
法国)测量用重组蛋白 质刺激的脾细胞培养物的上层清液中IFN-γ、IL-10和IL-4的释放。简单地 说，在48h过程中在37℃下将3×106脾脏细胞接种于存在rLmL3(6μg ml-1) 或rLmL5(6μg ml-1)或仅培养基的48-孔板中。
在小鼠和犬中抗-L3和抗-L5抗体反应的检测
从埃斯特雷马杜拉区(Extremadura region)(西班牙)的20只天生被婴 儿利什曼原虫感染的有临床症状的犬中收集犬血清样品。在西班牙克瑞斯的 埃斯特雷马杜拉大学兽医院寄生虫系(the Department of Parasitology of the Veterinary School,Extremadura University,Cáceres,Spain)临床分析评价感染 的动物。当通过间接免疫荧光法测试时，所有的血清是呈阳性的，并通过直 接观察确定腿弯部和前肩胛骨淋巴结中寄生虫无鞭毛体形式的存在。从寄生 虫系(埃斯特雷马杜拉大学)饲养的8只健康动物中获得对照组血清。
感染后8周，收集用实验方法感染5×104个稳定期硕大利什曼原虫 (WHOM/IR/-/173)前鞭毛体的12只BALB/c小鼠的血清。作为对照，收 集相同小鼠感染前的血清。
在室温下用100μl各个重组核糖体蛋白(PBS中2μg ml-1)包被标准 ELISA板过夜。在PBS-Tween 20(0.5％)-酪蛋白(5％)中以1/200的稀释度分 析犬和鼠的血清样品。使用购于北欧免疫学实验室(Nordic Immunological Laboratories)(蒂尔堡，荷兰)的第二抗体辣根过氧化酶偶联的抗-犬-IgG (1/1000)、抗-鼠-IgG1(1/1000)和抗-鼠-IgG2a(1/500)。使用邻苯二胺氢氯化物 (Ortophenyle diamine dihydrochloride)(OPD)(Dako，A/S，葛洛斯楚普， 丹麦)作为ELISA分析的过氧化物酶底物。15min后，添加100μl的H2SO4 1M终止反应并读取450nm下的吸光度。
统计分析
通过学生t测试进行统计分析。当P<0.05时，认为差异是显著的。
结果和讨论
LmL3和LmL5蛋白的鉴定、克隆和表达
为了鉴定硕大利什曼原虫L3和L5的编码区，我们进行了BLASTP检 索，利用酿酒酵母L3和L5的氨基酸序列(分别为YOR063w和YPL131w) 作为探针[58]。将注释为推定LmL3和LmL5蛋白的两个不同的词条 (LmjF34.2880和LmjF35.1890)用BLAST分值的显著值显示(rescued)。 基于数据库序列数据，设计PCR引物以扩增LmL3和LmL5CR，包括克隆 目的的不同限制性内切酶酶切位点。对扩增的DNAs在pBluescript中进行亚 克隆并测序。硕大利什曼原虫推定的L3蛋白拥有分子量为47.5kDa的419 氨基酸和11.67的预测等电点。硕大利什曼原虫推定的L5蛋白拥有分子量 为36.6kDa的328氨基酸和10.69的预测等电点。硕大利什曼原虫L3和L5 推导氨基酸序列与它们的酿酒酵母对应物的比较揭示了高度的同源性：L3蛋白57％的一致性，73.5％的相似性；L5蛋白51.2％的一致性，66.3％的相 似性(见比对图)。本文中的比对图显示了利什曼原虫L3和L5蛋白含有一 些具有高度相似性的区域。还明显地观察到这两种寄生虫的蛋白质比酵母的 蛋白质长，在LmL3的羧基端和LmL5的两端存在额外的氨基酸残基。属于 保守蛋白家族的利什曼原虫蛋白质不寻常的一级结构似乎与免疫相关，因为 在感染过程中引起的抗这些蛋白质的体液和细胞反应能够特异性地抗寄生 虫，而不与宿主对应物的同源蛋白交叉反应(39、36、58)。
在pQE30表达载体中将LmL3和LmL5 CR亚克隆。推导重组蛋白质的 氨基酸序列如比对图的C和D部分所示。两种蛋白质均存在包括用于亲和 层析纯化的6个组氨酸的N-端标记。随后，两种蛋白质在大肠杆菌培养物 中过表达并被纯化。如图1所示，根据它们N-端区12个氨基酸额外的组氨 酸-标记延伸(stretch)的存在，纯化的rLmL3和rLmL5蛋白质显示明显的 分子量分别为48kDa和38kDa。因为在考马斯亮蓝染色SDS-PAGE凝胶(图 1)中两个纯化的重组蛋白质均观察到了单一的条带，所以确定了蛋白质的 纯度。
通过犬内脏利什曼病(CVL)血清和来自感染了硕大利什曼原虫的 BALB/c小鼠(MCL)的血清识别LmL3和LmL5。
为了确定VL影响的犬体内硕大利什曼原虫L3和L5蛋白质的抗原性， 在利用20只婴儿利什曼原虫感染的犬的血清的ELISA分析中，使用重组的 rLmL3和rLmL5蛋白质作为抗原。作为对照，分析从8只健康犬获得的血 清对两个重组蛋白质的反应。CVL血清75％(15/20)识别rLmL3蛋白质(图 2b)且90％(18/20)识别反应活性值(reactivity values)高于阻断值(cut off value)的rLmL5蛋白质(图2c)。抗rLmL3和rLmL5间的吸光值的光谱不 同，因为CVL血清抗rLmL5的反应活性高(平均值＝0.61±0.36)于rLmL3 获得的反应活性(平均值＝0.28±0.10)。可以推论，犬天生利什曼病的免疫 系统中，暴露的两种寄生虫蛋白质是LmL5蛋白比LmL3蛋白与免疫原更相 关。虽然此处使用的血清量有限，但是获得的数据可以作为可以与其他抗原 组合使用两种重组寄生虫蛋白质的指示，用于促进CVL的血清学诊断测试。
接下来我们利用由于感染硕大利什曼原虫而患有皮肤利什曼病(MCL) 的BALB/c小鼠血清分析了LmL3和LmL5蛋白质的抗原性。为了那个目的， 通过ELISA分析了抗两种重组蛋白质的IgG1和IgG2a抗体的存在。两种蛋 白质被MCL血清识别，MCL血清为IgG1同型的主要抗它们而引起的抗体 (图2a)。感染前相同小鼠中未观察到抗它们的反应活性(图2a)。由于分 别将IgG1和IgG2a抗体的诱导用作Th2-型和Th1-型免疫反应的标志(8)， 我们可以推断在BALB/c小鼠感染硕大利什曼原虫的过程中，诱导了Th2- 样体液反应来抗这些抗原。
在CpG ODN存在下用rLmL3和rLmL5重组核糖体蛋白免疫BALB/c小 鼠诱导了抗它们的Th1-型反应。
由于在感染的BALB/c小鼠中引起了抗它们的Th2介导的体液反应，我 们分析了在Th1诱导佐药(CpG-ODN)存在下的rLmL3和rLmL5的免疫效果。 为了那个目的，将6只小鼠的组各自用结合CpG-ODN的rLmL3和rLmL5 进行免疫。作为对照，将6只小鼠的组仅用CpG-ODN和PBS(用作辅料的 缓冲液)进行免疫。三次剂量后，分析由免疫带来的细胞反应。获得脾脏细 胞并在相应rLmL3和rLmL5抗原的存在和不存在下培养。在rLmL3抗原刺 激后，用rLmL3+CpG-ODN免疫了的小鼠的脾脏细胞产生高水平的IFN-γ(图 3a)。在rLmL5抗原刺激后，在用rLmL5+CpG-ODN免疫了的小鼠的脾脏细 胞上层清液中检测相似的IFN-γ水平(图3b)。相反，在对rLmL3或rLmL5 刺激的反应中，用佐药或辅料免疫了的小鼠的脾脏细胞产生低水平的IFN-γ (图3ab)。从分别用rLmL3+CpG-ODN(图3c)或rLmL5+CpG-ODN(图 3d)免疫了的小鼠获得的脾脏细胞的rLmL3或rLmL5刺激后，对IL-4产物， 检测到该细胞因子非常低的水平。最后，在任何组中都没有检测到IL-10特 异性产物(图3ef)。因此，可以推断CpG-ODN佐药使抗重组抗原对Th1反 应的免疫反应偏斜(skews)。
rLmL3+CpG-ODN和rLmL5+CpG-ODN的疫苗接种保护BALB/c小鼠抗 硕大利什曼原虫的攻击。
我们分析了给药两种重组蛋白质是否能够诱导保护易受感染的BALB/c 小鼠抗硕大利什曼原虫感染。rLmL3+CpG-ODN或rLmL5+CpG-ODN接种 疫苗的小鼠的脚掌肿胀明显小于PBS或CpG-ODN对照组的脚掌肿胀(图 4a)。另外，在rLmL3+CpG-ODN或rLmL5+CpG-ODN免疫的小鼠的引流 淋巴结细胞中，观察到了大约2-log寄生虫载量(parasite burden)的下降。最后，在脾脏中不能检测到寄生虫，然而在两个对照组小鼠的脾脏中都检测 到了寄生虫(图3b)。可以推断用寄生虫LmL3和LmL5蛋白(表示为重组 蛋白质)与CpG-ODN混合免疫了的小鼠被保护抗硕大利什曼原虫感染。接 种疫苗的小鼠真皮病状不存在或很低。在这些小鼠中，寄生虫的存在受腿弯 部引流淋巴结的限制。观察到的防护与通过用编码利什曼原虫核小体组蛋白(19)、如DNA疫苗一样给药的P0蛋白(54)和与CpG-ODN结合的LRP 提取物(55)的质粒DNA混合物的小鼠的免疫而获得的防护相似。因此，我 们已确定了两种核糖体成分的特征，所述两种核糖体成分的免疫可以促进抗 利什曼病的有效分子定义的疫苗的更合理的发展。
与防护相关的免疫参数的分析
为了确定与防护相关的免疫参数，攻击后8周，分析接种疫苗的小鼠组 和对照小鼠组中由SLA、LRP、MRP和相应的重组蛋白质驱动的细胞因子 产物(IFN-γ，IL-4和IL-10)。攻击后8周，L3和L5接种疫苗的小鼠比对 照组小鼠的脾脏细胞产生更多的SLA、LRP和重组抗原特异性IFN-γ(图5a 为L3的且图6a为L5的)。因为脾脏细胞与MRP的培养物的刺激不导致该 细胞因子的产生，发现IFN-γ产物特异性地由利什曼原虫核糖体蛋白质诱导 (图5a为L3的且图6a为L5的)。另外，与对照组小鼠(CpG和生理盐水) 相比，从防护小鼠获得的脾脏细胞上层清液中发现了更低水平的SLA和LRP 特异性IL-10(图5b为L3的且图6b为L5的)和IL-4(图5c为L3的且图 6c为L5的)。另外，在防护的小鼠中，IL-10和IL-4的MRP-特异性L3和 L5依赖的产物很低。因此，可以推断感染后，防护的表型与能够控制由寄 生虫引起的IL-4和IL-10反应的L3和L5Th1反应的诱导相关。
LmL3和LmL5序列数据的比对图。硕大利什曼原虫L3(A)和L5(B)蛋 白与它们的酿酒酵母同源基因的氨基酸序列比对图。保守氨基酸加有阴影。 显示了LmL3和LmL5氨基酸数量。从它们相应的DNA序列预测硕大利什 曼原虫氨基酸序列。(C和D)重组LmL3(rLmL3)(C)和LmL5(rLmL5)(D) 蛋白的氨基酸序列或预测的氨基酸序列在细菌中表达。位于它们N-端的额 外组氨酸-标记序列加粗并画下划线表示。显示了LmL3和LmL5蛋白的氨 基酸数量。
A
Figure BDA0001375961830000481
B
Figure BDA0001375961830000482
Figure BDA0001375961830000491
C
Figure BDA0001375961830000492
D
Figure BDA0001375961830000493
实施例2：L3和L5同系物的分析
L3和L5同系物的比对图
我们分析了不同利什曼原虫物种间L3和L5核糖体蛋白质保守的程度。 为了那个目的，通过基因组数据库(www.genedb.org)的生物信息学(in silico) 分析并与硕大利什曼原虫同源基因的氨基酸序列(SEQ ID NO:1为L3的且 SEQ ID NO:3为L5的)(比较的比对图在下页，部分A和B))比较显示 (rescued)了婴儿利什曼原虫和墨西哥利什曼原虫的L3蛋白(SEQ ID NO:48and 50)以及婴儿利什曼原虫(克隆JPCM5[MCAN/ES/98/LLM-877])、 巴西利什曼原虫(MHOM/BR/75/M2904)和墨西哥利什曼原虫 (MHOM/GT/2001/U1103)(SEQ IDNO:52、56和54)的L5蛋白的氨基 酸序列。硕大利什曼原虫L5蛋白中除了N-端延伸的存在，还观察到了不 同物种间的高度保守。表1A-B分别显示了L3和L5同源基因间的一致性 和相似性百分比。
硕大利什曼原虫L3和L5在核糖体中的位置
为了论证该工作使用的重组LmL3和LmL5对应于位于寄生虫核糖体中 的蛋白质，我们使用在含有重组蛋白质和LRP提取物的蛋白印迹中对重组 蛋白质特异性的抗体。图8a显示了从用重组蛋白质免疫了的小鼠中获得的 抗-LmL3抗体识别了在LRP提取物中具有预期分子量(47,5kDa)的单个条 带。对于L5蛋白观察到了的相似的结果(图8b)。当我们如前所述使用通 过rLmL5-Shepharose 4B柱中的亲和层析从婴儿利什曼原虫天生感染犬血清中纯化的抗-LmL5抗体时，在LRP提取物中观察到了36,6kDa的单个条带 (71)。作为阳性对照，在两种情况下，通过特异性抗体识别相应的重组蛋 白质。
利什曼原虫L3和L5序列比较。硕大利什曼原虫、婴儿利什曼原虫、 婴儿利什曼原虫和墨西哥利什曼原虫L3(A)(SEQ ID NO:1、48和50) 以及硕大利什曼原虫、巴西利什曼原虫、婴儿利什曼原虫和墨西哥利什曼 原虫L5(B)(SEQ ID NO:3、56、52和54)的氨基酸序列比对图。利用 ClustalW(DNAstar软件)的默认设置比对婴儿利什曼原虫(GeneDBidentifier LinJ32_V3.3320)和墨西哥利什曼原虫(GeneDB identifier LmxM33.2900)的LmL3蛋白、推定的L3蛋白序列，以及巴西利什曼原虫(GeneDB identifier LbrM34_V2.1790)、婴儿利什曼原虫(GeneDB identifier LinJ35_V3.1870)和 墨西哥利什曼原虫(GeneDB identifier LmxM34.1880)的LmL5蛋白和推 定的L5蛋白序列。氨基酸取代加有阴影。
A
Figure BDA0001375961830000521
Figure BDA0001375961830000531
B
Figure BDA0001375961830000532
Figure BDA0001375961830000541
表1
A
Figure BDA0001375961830000542
B
显示了一致性和相似性值(括号内)。
Figure BDA0001375961830000543
实施例3：用rLmL3+CpG-ODN和rLmL5+CpG-ODN保护BALB/c小 鼠抗巴西利什曼原虫攻击的接种免疫
在由感染巴西利什曼原虫引起的皮肤利什曼病的发展中，我们分析了硕 大利什曼原虫重组蛋白质rLmL3和rLmL5与Th1诱导佐药(CpG-ODN)结合 的免疫的效果。为了那个目的，5只小鼠的组各自用10μg的rLmL3或10μg 的rLmL5与50μg的CpG-ODN(25μg的CpG-1[5’-TCAACGTTGA-3’]加25μg 的CpG-2[5’-GCTAGCGTTAGCGT-3’)](SEQ ID NO:5和6))结合进行免疫。 作为对照，5只小鼠的组仅用50μg的CpG-ODN或用PBS(用作辅料的缓冲 液)进行免疫。在小鼠耳朵真皮(左耳)处接种。2和4周后，将各个组用 与启动时使用的相同剂量进行提升。通过将105稳定的巴西利什曼原虫 (MHOM/BR/01/BA788)前鞭毛体与两对长须罗蛉(Lutzomya intermedia)沙 蝇唾腺结合注射到右(未处理)耳中进行寄生虫攻击。在该感染模式中，寄 生虫攻击BALB/c小鼠在感染耳朵处产生炎性病变后，所述炎性病变稳定变 化并在大约5周时达最大限度。此后，病变尺寸复原且在感染后约9周时观 察到了耳朵完全结疤(72)。我们分析了4个小鼠组中皮肤病变的发展，直 到寄生虫攻击后5周，用度量卡尺测量病变的厚度。如图7a所示，与 CpG-ODN对照组的PBS相比，rLmL3+CpG-ODN或rLmL5+CpG-ODN接种 疫苗的小鼠的耳朵病变明显更低。另外，感染后5周，分析感染的耳朵中的 寄生虫载量。通过所述的有限稀释测定法确定寄生虫量(73)。当与对照组 相比时，在接种疫苗的小鼠中观察到了寄生虫载量的下降。发现 rLmL5+CpG-ODN组相对于两个对照组的差异是显著的(P<0.05，t分布检 验(T-student test))。而且，5只小鼠(rLmL5+CpG-ODN组)中的4只和 rLmL3+CpG-ODN组5只小鼠中的1只的耳朵中未检测到寄生虫(图7b)。 因此，可以推断用表示为重组蛋白质并与CpG-ODN结合的硕大利什曼原虫L3和L5核糖体蛋白质接种疫苗的小鼠被保护抗不同巴西利什曼原虫的攻 击。
实施例4：硕大利什曼原虫S6赋予的抗硕大利什曼原虫感染的部分防护
在由前面的SEQ ID NO:5和6定义的CpG ODN(50μg)的存在下，各 自用10μg的S6(SEQ ID NO:34)、L2(SEQ ID NO:22)、L7(SEQ ID NO:24)、 L8(SEQ ID NO:26)和L16(SEQID NO:28)免疫5个小鼠组(每组n＝4)。作 为对照，用佐药免疫小鼠组且用辅料(PBS-生理盐水)免疫其他组。间隔2 周地给药三个剂量。所有的免疫均在右脚掌上进行。最后一次剂量后一个月， 左脚掌皮下注射105硕大利什曼原虫稳定的前鞭毛体使小鼠感染。通过测量脚掌肿胀直至攻击后8周而评价真皮病变的发生(图9a)。虽然用S6加CpG ODN接种疫苗的小鼠的脚掌肿胀明显低于对照组以及用其他四种蛋白质免 疫的小鼠中观察到的脚掌肿胀，所有组的小鼠均发生了炎性病变。另外，分 析了小鼠引流淋巴结(DLN)和脾脏中的寄生虫载量。分别与生理盐水和 CpG ODN组相比，用S6加CpG ODN免疫的动物脾脏中的寄生虫数量表现 出2-log下降(图9b)。然而，S6加CpG ODN组的DLN中发现的寄生虫载 量与对照组中观察到的寄生虫载量相似。
从该分析可以推断，在CpG ODN佐药的存在下，用S6重组蛋白质的 接种免疫诱导了免疫状态(immune state)，所述免疫状态导致BALB/c小鼠 中部分保护抗由硕大利什曼原虫感染引起的CL：感染位点中炎性病变的存 在和脾脏中的寄生虫载量低于对照组。另一方面，相对于对照组，用其他四 种抗原(L5、L7、L8和L16)的接种免疫不会导致CL发展的显著变化。
为了分析由接种免疫诱导的免疫反应，将S6+CpG ODN接种免疫的小 鼠引起的体液和细胞反应与用佐药和疫苗稀释液免疫的小鼠进行比较。图10 显示了疫苗制剂诱导了抗S6蛋白的Th1/Th2混合反应，由于在接种免疫的 小鼠血清中检测到了抗-S6特异性IgG2a和IgG1抗体(见图10a)。另外， 虽然S6体外刺激接种免疫小鼠脾脏细胞后产生了IFNγ，还在培养物上层清 液中观察到了可检测的IL-4细胞因子的存在(见图10b)。
可以推断接种免疫诱导了主要的抗S6蛋白的Th1反应，还观察到了抗 该蛋白的Th2反应的轻微刺激(S6-特异性IL-4和S6-特异性IgG1抗体的可 检测水平)。
实施例5：基于L3、L5和S4硕大利什曼原虫重组蛋白质的疫苗
为了更详细地分析L3、L5和S4核糖体蛋白质诱导的防护，进行了新 的免疫-感染实验。分析中包括12个小鼠组(每组n＝4)。在所有情况中，于 小鼠右脚掌皮下免疫3次(间隔2周)。然后分析各组。
■疫苗辅料：生理盐水。
■疫苗佐药：CpG-ODN。每个剂量：50μg的CpG ODN(25μg CpG-ODN-1[5’-TCAACGTTGA-3’](SEQ ID NO:5)和25μg的 CpG-ODN-2[5’-GCTAGCGTTAGCGT-3’](SEQ IDNO:6)。
■L3(SEQ ID NO:1)。每个剂量：10μg的重组蛋白质。
■L3+CpG ODN。每个剂量：10μg的重组蛋白质和50μg的CpG ODN。
■L5(SEQ ID NO:3)。每个剂量：10μg的重组蛋白质。
■L5+CpG ODN。每个剂量：10μg的重组蛋白质和50μg的CpG ODN。
■S4(SEQ ID NO:32)。每个剂量：10μg的重组蛋白质。
■S4+CpG ODN。每个剂量：10μg的重组蛋白质和50μg的CpG ODN。
■L3+L5。每个剂量：10μg总重组蛋白质；5μg各个蛋白质。
■L3+L5+CpG ODN。每个剂量：10μg的总重组蛋白质和50μg的 CpG ODN。
■L3+L5+S4。每个剂量：10μg总重组蛋白质；3.3μg各个蛋白质。
■L3+L5+S4+CpG ODN。每个剂量：10μg的总重组蛋白质和50μg 的CpG ODN。
简单地说，在CpG ODN的存在和不存在下，分析3种抗原。另外，在 CpG ODN的存在和不存在下，分析L3+L5和L3+L5+S4的结合。最后一次 剂量后一个月，左脚掌皮下注射105硕大利什曼原虫稳定的前鞭毛体使小鼠 感染。
通过测量脚掌肿胀直至攻击后6周而评价真皮病变的发展。图11a显示 了两个对照组(生理盐水和CpG ODN)以及用不含佐药的抗原接种免疫的 5个组。未观察到对照组和用不含佐药的蛋白质接种免疫的5个组之间炎性 病变的差异。图11b显示了两个对照组(生理盐水和CpG ODN)以及用与 佐药结合的抗原接种免疫的5个组。这种情况中，在佐药的存在下，除了 S4+CpG ODN组，所有用重组蛋白质接种免疫的小鼠组均表现出脚掌肿胀的 下降。在L5+CpG ODN、L3+L5+CpG ODN和L3+L5+S4+CpG ODN组中观 察到了更低的炎性病变。
感染后7周，分析了所有小鼠组DLN和脾脏中的寄生虫载量。未发现 对照组和用不含佐药的核糖体蛋白质免疫的小鼠中包括的小鼠之间统计上 的差异(图12a)。另一方面，除了S4加CpG ODN组，核糖体蛋白质加CpG ODN免疫的小鼠均表现出脾脏中寄生虫载量的显著下降(图12b)。置于腿 弯部淋巴结中的寄生虫负载，我们仅发现用2个(L3+L5)或3个(L3+L5+S4) 核糖体蛋白质加CpG ODN的结合接种免疫的组中的显著下降。L3加CpG ODN和L5加CpG ODN接种免疫的小鼠还表现出比对照组更低的寄生虫载 量。然而，由于发现不同动物间高度的可变性(variability)，结果并不是统 计上有意义的。为了分析疫苗对局部寄生虫载量的影响，应该用大量的小鼠 重复这些分析，因为在之前的分析中，我们发现了L3加CpG ODN和L5 加CpG ODN接种免疫的以及对照组的小鼠间统计上的差异。
关于基于单个抗原或不同抗原的共同给药的疫苗的使用，我们的结果表 明，组合的疫苗比由单个抗原组成的疫苗诱导更高程度的防护。
实施例6：用于结合4种已被表征的防护性核糖体抗原(硕大利什曼原 虫的L3、L5、S4和S6)的重组分子构建的克隆步骤的设计。
基于前面的结果，我们计划制备基于硕大利什曼原虫L3(SEQ ID NO:1)、L5(SEQID NO:3)、S4(SEQ ID NO:32)和S6(SEQ ID NO:34)蛋白的 新重组产物。
首先，将编码四种蛋白质的DNA嵌入物(DNA inserts)克隆至真核生 物的表达载体(pcDNA-3；Stratagene)中。该载体使得利什曼原虫蛋白质在 哺乳动物细胞中表达，可以用于测试DNA疫苗。
其次，我们通过不同的四种抗原的结合设计了克隆不同嵌合蛋白质的步 骤(图13)。首先将基因嵌合体克隆至pBluescript(分析质粒)中，然后将 DNA嵌入物克隆至两种不同的表达质粒中：
■pQE30；原核生物的表达质粒。
■pcDNA3，真核生物的表达质粒。
该克隆策略使得我们通过提出的抗原结合同时拥有在大肠杆菌中表达 的DNA疫苗和重组蛋白质。
使用以下引物：
LmL3 正义链5’-CGGGATCCATGTCTCACTGCAAGTTCGAG-3’(SEQ ID NO:57)
反义链5’-GCGATATCTCCCTTCTTCGCGGCCTTTGCC-3’(SEQ ID NO:58)
LmS4 正义链5’-GCGATATCGGGATGGCCAAGAAGCACCTCAAG-3’ (SEQ ID NO:59)
反义链5’-CGGAATTCTCCCTTGCGGGCCCTGCGGG-3’(SEQ ID NO:60)
LmS6 正义链5’-CGGAATTCGGGATGAAGCTCAACATCGCGTAC-3’ (SEQ ID NO:61)
反义链5’-GCGATATCTCCCTTCTTCTGGAATGCTGCCAC-3’(SEQ ID NO:62)
LmL5 正义链5’-GCGATATCGGGATGTGCACGCTGGCAAATTG3’(SEQ ID NO:63)
反义链5’-GGGGTACCGGATCCTTACTTGCCGAGGCGCTCGC-3’ (SEQ ID NO:64)
产生的嵌合蛋白如由SEQ ID NO:67组成的氨基酸序列所示。该嵌合蛋 白由SEQID NO:66组成的核酸分子所示的核酸编码。
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SEQUENCE LISTING
<110> 热体实验室有限公司
<120> L3和/或L5源作为寄生虫病疫苗或诊断的用途
<130> I46363NEO
<150> EP09175929.0
<151> 2009-11-13
<150> US61/261,020
<151> 2009-11-13
<160> 73
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 419
<212> PRT
<213> Leishmania major
<400> 1
Met Ser His Cys Lys Phe Glu His Pro Arg His Gly His Leu Gly Phe
1 5 10 15
Leu Pro Arg Lys Arg Ser Arg Gln Ile Arg Gly Arg Ala Arg Ala Phe
20 25 30
Pro Lys Asp Asp Ala Thr Gln Lys Pro His Leu Thr Ser Phe Met Val
35 40 45
Phe Lys Ala Gly Met Thr His Ile Val Arg Asp Val Asp Arg Pro Gly
50 55 60
Ser Lys Val Asn Lys Lys Glu Val Val Glu Pro Val Thr Ile Leu Glu
65 70 75 80
Ala Pro Pro Met Val Ile Val Gly Ile Val Gly Tyr Arg Gln Thr Pro
85 90 95
Val Gly Leu Lys Thr Ile Gly Thr Val Trp Ala His His Thr Ser Val
100 105 110
Glu Phe Arg Arg Arg Tyr Tyr Lys Asn Trp Lys Gln Ser Ala Gln Leu
115 120 125
Ala Phe Ser Arg Gln Lys Gln Phe Ala Asn Thr Lys Glu Gly Lys Val
130 135 140
Ala Glu Ala Arg Thr Leu Asn Ala Phe Ala Lys Lys Ala Ser Val Ile
145 150 155 160
Arg Val Ile Ala His Thr Gln Leu Arg Lys Leu Arg Asn His Arg Val
165 170 175
Gly Val Lys Lys Ala His Val Gln Glu Ile Gln Val Asn Gly Gly Ser
180 185 190
Val Ala Ala Lys Ile Ala Leu Ala Lys Ser Leu Leu Glu Lys Glu Val
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210 215 220
Val Thr Lys Gly His Gly Thr Glu Gly Val Val Lys Arg Trp Gly Val
225 230 235 240
Ala Cys Leu Pro Arg Lys Thr His Arg Gly Leu Arg Lys Val Ala Cys
245 250 255
Ile Gly Ala Trp His Pro Ala Arg Val Met Tyr Thr Val Ala Arg Ala
260 265 270
Gly Gln His Gly Tyr His His Arg Thr Gln Leu Asn Lys Lys Ile Tyr
275 280 285
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290 295 300
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305 310 315 320
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Gly Pro Arg Arg Arg Val Met Thr Leu Arg Arg Pro Met Ala Pro Gln
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Ser Ser Lys Ile Gly His Gly Arg Phe Gln Thr Lys Lys Glu Lys Asn
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Gln Trp Phe Gly Pro Leu Lys Lys Asp Arg Ile Arg Arg Glu Glu Arg
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Leu Arg Lys Glu Arg Ala Ala Arg Ala Val Glu Arg Lys Ala Lys Ala
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Ala Lys Lys
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<212> DNA
<213> Leishmania major
<400> 2
atgtctcact gcaagttcga gcacccccgc cacggccatc tcggcttcct gccgcgcaag 60
cgctcgcgcc agatccgcgg ccgtgcgcgc gcgttcccca aggacgacgc gacgcagaag 120
ccccacctga cgagcttcat ggtgttcaag gccggtatga cgcacattgt gcgtgatgtc 180
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gcgccgccga tggtgattgt cggcattgtg ggctaccgcc aaacgccggt tggcctgaag 300
acgatcggca ccgtgtgggc gcaccacacg agcgtcgagt tccgccgccg ctactacaag 360
aactggaagc agtctgcgca actggccttc tcccgccaga agcagtttgc gaacacgaag 420
gagggcaagg tcgccgaggc gcgcacgctg aacgcgttcg cgaagaaggc gtccgtcatc 480
cgcgtgatcg cgcacacgca gctgcgcaag cttcgcaacc accgcgtggg cgtgaagaag 540
gcgcacgtgc aggagatcca ggtcaacggc ggcagcgttg cggcgaagat cgcgctggcc 600
aagtccctgc tggagaagga ggtgcgcgtc gactccgtgt tccagcagtc cgaggcgtgc 660
gacgtgtgct ccgtcacgaa aggccacggt acggagggcg tggtgaagcg ctggggcgtt 720
gcctgcctgc cacgcaagac gcaccgcggt ctgcgcaagg ttgcgtgcat cggcgcgtgg 780
caccctgccc gcgtcatgta cactgtcgcg cgcgccggtc agcacggtta ccaccaccgc 840
acgcagctga acaagaagat ctaccagatc ggccgctccg ttgctgtgga gccgaaccag 900
gcgacgacga cctacgatct gacagccaag acgatcacgc ccatgggtgg cttcgtcggc 960
tacggtacgg tgcgcaacga ctacgtgatg ctgaagggct ccgtgtctgg cccgcgccgc 1020
cgtgtgatga cgctgcgccg cccgatggcg ccgcagacgt cgcgccagct gaaggagaag 1080
atcgtgctga agttcatcga cacgagctcg aagatcggcc acggccgctt ccagacgaag 1140
aaggagaaga accagtggtt cggcccgctc aagaaggacc gcatccgccg cgaggagcgc 1200
ctgcgcaagg agcgcgctgc ccgcgccgtg gagcgcaagg caaaggccgc gaagaagtaa 1260
<210> 3
<211> 328
<212> PRT
<213> Leishmania major
<400> 3
Met Cys Thr Leu Ala Asn Trp Val Arg Ala Ile Ile Lys Lys His Ser
1 5 10 15
Thr Leu Ala His Thr Leu Glu Met Pro Phe Val Lys Val Val Lys Asn
20 25 30
Lys Ala Tyr Phe Lys Arg Phe Gln Val Lys Tyr Arg Arg Arg Arg Glu
35 40 45
Gly Lys Thr Asp Tyr His Ala Arg Arg Gln Met Val Leu Gln Asp Lys
50 55 60
Thr Lys Phe Gly Ser Pro Lys Tyr Arg Leu Val Val Arg Ile Thr Asn
65 70 75 80
Lys Asp Ile Ile Ala Gln Ile Val Gln Ala Lys Ile Val Gly Asp Glu
85 90 95
Val Val Met Ala Ala Tyr Ala His Glu Leu Pro Ala Phe Gly Ile Glu
100 105 110
His Gly Leu Thr Asn Tyr Ala Ala Ala Tyr Ala Thr Gly Leu Leu Leu
115 120 125
Ala Arg Arg Thr Leu Ala Lys Leu Gly Ile Ala Asp Lys Phe Gln Gly
130 135 140
Ala Lys Glu Ala Asp Gly Ser Tyr Ser Ala Val Arg Thr Lys Lys Asp
145 150 155 160
Asp Glu Gly Asp Asp Glu Glu Arg Phe Pro Phe Lys Ala Ile Leu Asp
165 170 175
Val Gly Leu Ala Arg Thr Thr Thr Gly Ala Arg Val Phe Gly Val Leu
180 185 190
Lys Gly Ala Val Asp Gly Gly Met Ala Val Pro His Arg Pro Asn Arg
195 200 205
Phe Pro Gly Tyr Asn Lys Glu Lys Ser Ser Leu Asp Ala Lys Val His
210 215 220
Arg Asp Arg Ile Phe Gly Lys His Val Ala Asp Tyr Leu Lys Gln Val
225 230 235 240
Lys Glu Glu Ala Ser Ser Asn Pro Asp Glu Lys Cys Val Gln Phe Ser
245 250 255
Lys Tyr Met Ala Ala Lys Val Leu Pro Glu Ser Ile Glu Gly Met Tyr
260 265 270
Lys Lys Ala His Ala Ala Ile Arg Ala Asp Pro Ser Lys Ser Leu Pro
275 280 285
Lys Lys Ala Lys Lys Glu Gly Val Ala His Lys Ser Tyr Lys Thr Lys
290 295 300
Lys Leu Ser Gly Ala Glu Lys Arg Ala Ala Ala Lys Ala Lys Val Ala
305 310 315 320
Ala Ile Arg Glu Arg Leu Gly Lys
325
<210> 4
<211> 987
<212> DNA
<213> Leishmania major
<400> 4
atgtgcacgc tggcaaattg ggtacgcgct atcatcaaga aacactcaac actcgcccac 60
acactcgaga tgccgttcgt caaggtcgtg aagaacaagg cgtacttcaa gcgcttccag 120
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aaggacatca ttgcgcagat cgtgcaggcg aagatcgtcg gcgacgaggt ggtgatggcc 300
gcgtacgcgc acgagctgcc tgcgttcggc attgagcacg gcctgacaaa ctacgctgct 360
gcgtacgcga ctggtctgct gctggcgcgc cgcacgctgg cgaagctggg catcgcggac 420
aagttccagg gcgcgaagga ggcggacggc tcgtactctg ctgtgcgcac gaagaaggac 480
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cgcacgacga ccggcgcccg cgtgttcggc gtgctgaagg gcgcggtgga cggcggtatg 600
gctgtgccgc accgccccaa ccgcttcccc ggctacaaca aggagaagag ctcgctggac 660
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gccatccgcg agcgcctcgg caagtaa 987
<210> 5
<211> 10
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> adjuvant
<400> 5
tcaacgttga 10
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<211> 14
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> adjuvant
<400> 6
gctagcgtta gcgt 14
<210> 7
<211> 132
<212> PRT
<213> Leishmania infantum
<400> 7
Met Ala Thr Pro Arg Ser Ala Lys Lys Ala Val Arg Lys Ser Gly Ser
1 5 10 15
Lys Ser Ala Lys Cys Gly Leu Ile Phe Pro Val Gly Arg Val Gly Gly
20 25 30
Met Met Arg Arg Gly Gln Tyr Ala Arg Arg Ile Gly Ala Ser Gly Ala
35 40 45
Val Tyr Leu Ala Ala Val Leu Glu Tyr Leu Thr Ala Glu Leu Leu Glu
50 55 60
Leu Ser Val Lys Ala Ala Ala Gln Ser Gly Lys Lys Arg Cys Arg Leu
65 70 75 80
Asn Pro Arg Thr Val Met Leu Ala Ala Arg His Asp Asp Asp Ile Gly
85 90 95
Thr Leu Leu Lys Asn Val Thr Leu Ser His Ser Gly Val Val Pro Asn
100 105 110
Ile Ser Lys Ala Met Ala Lys Lys Lys Gly Gly Lys Lys Gly Lys Ala
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Thr Pro Ser Ala
130
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<212> DNA
<213> Leishmania infantum
<400> 8
gcctcatccg tcatccgtca tctttgtgct acagctttac tctcactccc ctccaaccta 60
cccatcgcag ccatggctac tcctcgcagc gccaagaagg ccgtccgcaa gagcggctcc 120
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ggccagtacg ctcgccgcat cggtgcctct ggcgccgtgt acctggccgc cgtgctggag 240
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cggtgccgcc tgaacccgcg caccgtgatg ctggccgcgc gccacgacga cgacatcggc 360
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<212> PRT
<213> Leishmania infantum
<400> 9
Met Ala Ser Ser Arg Ser Ala Pro Arg Lys Ala Ser His Ala His Lys
1 5 10 15
Ser His Arg Lys Pro Lys Arg Ser Trp Asn Val Tyr Val Gly Arg Ser
20 25 30
Leu Lys Ala Ile Asn Ala Gln Met Ser Met Ser His Arg Thr Met Ser
35 40 45
Ile Val Asn Ser Tyr Val Asn Asp Val Met Glu Arg Ile Cys Met Glu
50 55 60
Ala Ala Ser Ile Val Arg Ala Asn Lys Lys Arg Thr Leu Gly Ala Arg
65 70 75 80
Glu Val Gln Thr Ala Val Arg Ile Val Leu Pro Ala Glu Leu Ala Lys
85 90 95
His Ala Met Ala Glu Gly Thr Lys Ala Val Ser Ser Ala Ser Ala
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<210> 10
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<212> DNA
<213> Leishmania infantum
<400> 10
ccaagccagc caaatccttc gcactttcac gctgtccctc ctttccaacc aacccacatc 60
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<212> PRT
<213> Leishmania infantum
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Met Ser Arg Thr Lys Glu Thr Ala Arg Ala Lys Arg Thr Ile Thr Ser
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Lys Lys Ser Lys Lys Ala Pro Ser Gly Ala Ser Gly Val Lys Arg Ser
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His
<210> 12
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<212> DNA
<213> Leishmania infantum
<400> 12
gtttcactac cgccatccaa ccccctgcca ctcccacccc caccgcacca ccatgtcccg 60
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<211> 100
<212> PRT
<213> Leishmania infantum
<400> 13
Met Ala Lys Gly Lys Arg Ser Thr Asp Ala Lys Gly Ser Gln Arg Arg
1 5 10 15
Gln Lys Lys Val Leu Arg Asp Asn Ile Arg Gly Ile Thr Arg Gly Cys
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Val Arg Arg Met Ala Arg Arg Gly Gly Val Lys Arg Ile Ser Thr Glu
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Val Tyr Glu Glu Val Arg Arg Val Leu Lys Ala Tyr Val Glu Asp Ile
50 55 60
Val Arg Cys Ser Thr Ala Tyr Thr Glu Tyr Ala Arg Lys Lys Thr Val
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Thr Ala Cys Asp Val Val Thr Ala Leu Arg Lys Gln Gly His Ile Leu
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Tyr Gly Tyr Ala
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<212> DNA
<213> Leishmania infantum
<400> 14
gctccctttc ttgcctcctc tcccccccac gcctcctccc ttcacatatc caccatggcc 60
aagggcaagc gttccactga tgccaagggc agccagaggc gccagaagaa ggtgctgcgc 120
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cacccttccc tactcatcgc tgtttgctga aggcagtaca gaacgaagcg g 531
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<213> Leishmania infantum
<400> 15
Met Gln Tyr Leu Ala Ala Tyr Ala Leu Val Ala Leu Ser Gly Lys Thr
1 5 10 15
Pro Ser Lys Ala Asp Val Gln Ala Val Leu Lys Ala Ala Gly Val Ala
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Val Asp Ala Ser Arg Val Asp Ala Val Phe Gln Glu Val Glu Gly Lys
35 40 45
Ser Phe Asp Ala Leu Val Ala Glu Gly Arg Thr Lys Leu Val Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Ala Ala Pro Ala Gly Ala Val Ser Thr Ala Gly Ala Gly Ala
65 70 75 80
Gly Ala Val Ala Glu Ala Lys Lys Glu Glu Pro Glu Glu Glu Glu Ala
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<211> 106
<212> PRT
<213> Leishmania infantum
<400> 16
Met Gln Tyr Leu Ala Ala Tyr Ala Leu Val Ala Leu Ser Gly Lys Thr
1 5 10 15
Pro Ser Lys Ala Asp Val Gln Ala Val Leu Lys Ala Ala Gly Val Ala
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Val Asp Ala Ser Arg Val Asp Ala Val Phe Gln Glu Val Glu Gly Lys
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<213> Leishmania infantum
<400> 17
gtcgacggcg acatggctag agcagtttgt gcagctcccg ctgagcgaca agaaacacga 60
tctgccgcgt cgccacggag gtgtttctcc atgcctttgc ccagtgcatc aatgagtccg 120
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caatgcgacc ttttgcacag taccccgagg agacgatcgc ccaggcaaat gcgtttctgc 240
atcaaggagg gcttccgcat gtcccgttcg cagctgaggc ggtggagcag caggttatga 300
atctccagcg gctgcattaa tcgccgcctg ccagacaccg gggaggtcct ctgtttctgt 360
ttttgcgtgt tgcgtctttc tctttatgtt tgctcctttg tgtctgtcgg ttaagagctc 420
ctcccttgcc cagaaaacag gagtaaccga gtacgccgca gcgcctgcgc cacacgttgt 480
ccatggaacc cctcccctcc tcgctcctcc cttctccact ccctccttct gggtgctgca 540
tgtgtgtgtg catgtgtgtg taactttgcc tcggtgtggc tggcacgctg cgccccctcc 600
cccccccccc ccaaaaaaaa aaaacagcat catcagtggg ctgacctgga tacatctcct 660
cctctccttg tgttccccat cccctcttcg ctcttcctct atgcacctcg cccactgcgc 720
gcatcacgca cgcatcatcg cggctacgga acacgcgacc cccaccccac ataggttttt 780
tcaacgagaa atgcagtacc ttgccgcgta cgccctcgtg gcgctgtctg gcaagacgcc 840
gtcgaaggcg gacgttcagg ctgtcctgaa ggccgccggc gttgccgtgg atgcctcccg 900
cgtggatgcc gtcttccagg aggtggaggg caagagcttc gatgcgctgg tggccgaggg 960
ccgcacgaag ctggtgggct ctggctctgc cgctcctgct ggcgctgtct ccactgctgg 1020
tgccggcgct ggcgcggtgg ccgaggcgaa gaaggaggag cccgaggagg aggaggccga 1080
tgatgacatg ggcttcggtc tctttgacta agcagccccg cactgcgctg caggcgcctc 1140
tgccgaagat tctcacgcgg gcctgctctc attgttgtga tgcatcgttt ctttctttgc 1200
ttgtgacttc ggttcgtctt ttgatttcga gtggaaagac tctgcaaatc gaacaacccg 1260
tgcgagatga gctgggagcg taggcgaggt ggctgctcgc gaggctgtaa cgaaaaaaaa 1320
aagacagcag cggcgccctc ggcacaaaca cagcgagccc tcccctcccc cgcttcgtcc 1380
ctcctcgaga agagagagac aaagaatctc cacagacgct gtacgagagg caccggcctc 1440
gtcatcgaga gaagcaaccg cgctttcgtg ccgtgacccg ctgaccttcg ataaccgaga 1500
gagggtgtct tctcttctca aagtgggttc attgcgaagt gctgctctac tgtccctcct 1560
gctcgtcttc ccccagttct cgtttcgtct cttttttgtt cgttccatgc actttctctc 1620
atactgtttt tgcctcttgt cgtacaagag gtgtatcaaa catgcagtac ctcgccgcgt 1680
acgccctcgt ggcgctgtct ggcaagacgc cgtcgaaggc ggacgttcag gctgtcctga 1740
aggccgccgg cgttgccgtg gatgcctccc gcgtggatgc cgtcttccag gaggtggagg 1800
gcaagagctt cgatgcgctg gtggccgagg gtcgcacgaa gctggtgggc tctggctctg 1860
ccgctcctgc tggcgctgtc tccactgctg gtgccggcgc tggcgcggtg gccgaggcga 1920
agaaggagga gcccgaggag gaggaggccg atgatgacat gggcttcggt ctctttgact 1980
aagcagcctc cgtgagtggt ctactgtcgt tactttttga cttgtttcat ttgacttgtt 2040
ttcttcccgt aagcaaagaa cagagtaagc aagcatccat gcacgtcgaa gcgatgctac 2100
gaaccggtct ccctgctgcc catatcccct cagcgacggc gaccctccct cctttccacg 2160
tgctgacctc atctcctcca atctttcacc ttctcttctg tctctcttct tgggttccct 2220
cttgaccgat cctgcatcga ccatgaccag gtaattgcta tggctcttca agagaatagg 2280
gactcctaca aggtcaaagc tttttccttg tccgagtttg tgcggcagtg ttccgactgc 2340
caccagctgt gcctcgagaa gacggcccgc gttgtggaaa acagcagtcg tgccccgcgg 2400
ggatgggaag ccctattcaa ctccgttgcg gaggagcggc ggtctgagga cttggacctc 2460
tgcgagtcgc gatgccggta catgcaggcc acctgcccgt cacaggagaa ggtccagcag 2520
tacgagcagg ctctcgccgc cgcgttactc aagccgaaaa agagcacgcc cccaaacccg 2580
tctgtcttgc aagacgcttc ccggtgcggc acgcggtcga ggttttctcg aacgtcctgt 2640
tgcccgtggc gcacaaaccc agaaggtatc cttcccaacc aaagacctga aacgggaggc 2700
acaccgacgc cggtcccacg ccggacggcc gacggaggcg accgaaggtg ctcgagggga 2760
ccaagacatg gacaacgata tttcgcgccg ctggagcaag cttcgccaag agcgcttcgg 2820
ctcaaaggca gagcacgttg ctccgtcgac 2850
<210> 18
<211> 111
<212> PRT
<213> Leishmania infantum
<400> 18
Met Ser Thr Lys Tyr Leu Ala Ala Tyr Ala Leu Ala Ser Leu Ser Lys
1 5 10 15
Ala Ser Pro Ser Gln Ala Asp Val Glu Ala Ile Cys Lys Ala Val His
20 25 30
Ile Asp Val Asp Gln Ala Thr Leu Ala Phe Val Met Glu Ser Val Thr
35 40 45
Gly Arg Asp Val Ala Thr Leu Ile Ala Glu Gly Ala Ala Lys Met Ser
50 55 60
Ala Met Pro Ala Ala Ser Ser Gly Ala Ala Ala Gly Val Thr Ala Ser
65 70 75 80
Ala Ala Gly Asp Ala Ala Pro Ala Ala Ala Ala Ala Lys Lys Asp Glu
85 90 95
Pro Glu Glu Glu Ala Asp Asp Asp Met Gly Phe Gly Leu Phe Asp
100 105 110
<210> 19
<211> 2936
<212> DNA
<213> Leishmania infantum
<400> 19
gtcgacgccg cacctccgtc tctccccctc ctcgcccgcc atgcgtcgta tgtcgatgct 60
tccggtgggg gggtgcagtg aacgtagtcg atgatccatg ccgcgtcatc tctctataag 120
tacgtggcac atgcacctac acccaccacc accgttaccc atccacccct ggcaccgcat 180
gcacccgcca ctcgcggctt ttctctcttt ttgatctcac ccatcccacc ttgcccagta 240
ttgttcctct gcgactcccc gagtgttctc acgcacgcct cctcccacga tcgcttactt 300
tcgaatcttc gcttcaccat gtccaccaag tacctcgccg cgtacgctct ggcctccctg 360
agcaaggcgt ccccgtctca ggcggacgtg gaggctatct gcaaggccgt ccacatcgac 420
gtcgaccagg ccaccctcgc ctttgtgatg gagagcgtta cgggacgcga cgtggccacc 480
ctgatcgcgg agggcgccgc gaagatgagc gcgatgccgg cggccagctc tggtgccgct 540
gctggcgtca ctgcttccgc tgcgggtgat gcggccccgg ctgccgccgc cgcgaagaag 600
gacgagcccg aggaggaggc cgacgacgac atgggcttcg gtctgttcga ctaagcccat 660
cgacgcgttg tttgcgtgtg tgcgtgtatg taagggtgga tgcggggggc ttgctgtttc 720
ggtaaagttt cttctggcgt ggccccgcgt gcgcccagtc gttcccttga gggcatgaca 780
gaagcacacg aaaccggcat gcgcggctcc gtgactgaag aggggggcgc ccgtctctct 840
ttctgcgcgt gtgtcactca tttttttttt gccgtcttaa ctcacaggaa aacgccgccg 900
agatggtgtt gcggtgtctg atgtagggag gccaatcagg gatgaggatg gcacggttgg 960
tgctcacaac agcggaggca gcccttcaag acgcgtacgc ggtcctctct gtctttctca 1020
cgtgcatcca ccatcgcgcc caagcacgcg cccagcgaag gcgcacacgc gacgaacaga 1080
tgcgcggcgg atagcggaat ggaggaagag gaaggcgggt gggcgcacgc actgaaagct 1140
gcgagatagg cgagcaatga acgcgttgat gggtcgatcc cccttcctcg tgcagccctg 1200
tcgtccatgc ggggaggagg tggtgtcagc agcgcagcga aaaggatgga agcgagggag 1260
agagagagag agagacgtgc ataatctcgc gggcgggggc ggggaggagt gatgatggtg 1320
ctgatggacg ggcggagcac ggatggcgag cagtcggcgc atgcctgtct ctcttggcag 1380
tgcagcaccc ggtggagagt ctccctcctc caccctgccc cgcccttccc acattgctgg 1440
tccgccatgt gtgcacgcct gtgcctgtat gcctttacac gaacctttcc tactgttcct 1500
cacacgccca caactctatc gaacgtctcc tccccccccc cctcgacgca tccgtgctaa 1560
ccacacaacg cgcacacacg cacgcacgca atacacacac acgtatatct gcatatacgc 1620
atgccaccca ccgctgctcg ggtgtcgacg tggacgtaaa gctttctgtc tcgttttacg 1680
ccagtcgcac actctccacc atgtccacca agtacctcgc cgcgtacgct ctggcctccc 1740
tgagcaaggc gtccccgtct caggcggacg tggaggctat ctgcaaggcc gtccacatcg 1800
acgtcgacca ggccaccctc gcctttgtga tggagagcgt tacgggacgc gacgtggcca 1860
ccctgatcgc ggagggcgcc gcgaagatga gcgcgatgcc ggcggccagc tctggtgccg 1920
ctgctggcgt cactgcttcc gctgcgggtg atgcggcccc ggctgccgcc gccgcgaaga 1980
aggacgagcc cgaggaggag gccgacgacg acatgggctt cggtctgttc gactaagccc 2040
atcgacgcgt tggcagctgt gacatgtgac acggcggcgg tcctgcttct ctcctgccca 2100
ccttcatctt ctcggaagcc gagccgctta tcatctctct gtcttctcgc gcgcgcggct 2160
gccgcctctc tgtgagcatg cgtgcgtgta cgtcgtgtcg tcccatagcg agctgctggc 2220
gcgcgccgcg agagagagag agagagcacg aggcgcgggg gaagtggagg cgaatgggga 2280
atagagtggg ggccctgcgc acgggaaaag ccttctcccg gaaagtgata ccgacacatg 2340
cgtatgggag gagggggtgg gagaggatgc gagacgtcgt tgtctgcatc ctctccaacc 2400
ccacccccgc gtgtgtgcct gcacttattt ttcgtttttc gataatttct tcgtcactta 2460
ccagcatctg gcatatatga catacctgca gacacacaag acaggcgcgc agcacacgac 2520
gacgggcgcc ggtgcggtgc cgacagacat gttcactgtg cctaacctgt gtatgcgtgt 2580
gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgcatgggt gggtgaatac gtctctctca cggcggtggt 2640
gcgacaacgc agagcgatag ggagaggaga agggggcagg agggggcggc actcctcgtg 2700
cgcccgcttc ccgcgtcgcc gacctccact cccttgctca ctcactctcg ataccagtct 2760
cgtggcggag aggaggcggg agtcactctg gatatcgccc tgtgagagcg gcccaacacg 2820
ctcacatgag ccccaccgct ctccatctca tctcctcacg gccatcacac atacgcacgc 2880
gccactgcct ctccttcaac ttcctcccac atgattgctt cgacgccact gtcgac 2936
<210> 20
<211> 323
<212> PRT
<213> Leishmania infantum
<400> 20
Met Pro Ser Ile Thr Thr Ala Lys Arg Glu Tyr Glu Glu Arg Leu Val
1 5 10 15
Asp Cys Leu Thr Lys Tyr Ser Cys Val Leu Phe Val Gly Met Asp Asn
20 25 30
Val Arg Ser Gln Gln Val His Asp Val Gly Arg Ala Leu Arg Ala Lys
35 40 45
Ala Glu Phe Met Met Gly Lys Lys Thr Leu Gln Gly Lys Ile Val Glu
50 55 60
Lys Arg Ala Gln Ala Lys Asp Ala Ser Pro Glu Ala Lys His Phe Asn
65 70 75 80
Asp Gln Cys Glu Glu Tyr Asn Leu Leu Ser Gly Asn Thr Gly Leu Ile
85 90 95
Phe Thr Asn Asn Ala Val Gln Glu Ile Thr Ser Val Leu Asp Ala His
100 105 110
Arg Val Lys Arg Ala Ala Arg Val Gly Ala Ile Ser Pro Cys Asp Val
115 120 125
Ile Val Ala Ala Gly Ser Thr Gly Met Glu Pro Thr Gln Thr Ser Phe
130 135 140
Phe Gln Ala Leu Asn Ile Ala Thr Lys Ile Ala Lys Gly Met Val Glu
145 150 155 160
Ile Val Thr Glu Lys Lys Val Leu Ser Val Gly Asp Lys Val Asp Asn
165 170 175
Ser Thr Ala Thr Leu Leu Gln Lys Leu Asn Ile Ser Pro Phe Tyr Tyr
180 185 190
Gln Val Asn Val Leu Ser Val Trp Asp Arg Gly Val Leu Phe Thr Arg
195 200 205
Glu Asp Leu Met Met Thr Glu Asp Met Val Glu Lys Met Leu Met Glu
210 215 220
Gly Leu Ser Asn Val Ala Ala Met Ala Leu Gly Ala Gly Ile Pro Thr
225 230 235 240
Ser Ser Thr Ile Gly Pro Met Leu Val Asp Ala Phe Lys Asn Leu Leu
245 250 255
Ala Val Ser Val Ala Thr Ser Tyr Glu Phe Glu Glu His Asn Gly Lys
260 265 270
Glu Leu Arg Glu Ala Ala Ile Asn Gly Leu Leu Ala Gly Ser Cys Ser
275 280 285
Ala Ala Ala Glu Pro Ala Ala Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ser Ala Ala
290 295 300
Ala Lys Glu Glu Pro Glu Glu Ser Asp Glu Asp Asp Phe Gly Met Gly
305 310 315 320
Gly Leu Phe
<210> 21
<211> 3790
<212> DNA
<213> Leishmania infantum
<400> 21
atgcgcgcgc gcgcgcgaga gagcatgtat ccctgcgtgc cttcaatgga gacttgacac 60
ccctcttctc tgctctctgc tttctgctcc gtcccctaat taccttgact gccttttact 120
tgttcccttt ctatttcctc gggttttggc aaccttcctt atgcgcccaa cacccacaac 180
atacccaccc acaaatcgtt gcttcacggc ctcccctcgt gctttgcagc tccctttagc 240
aacgatgccg tctatcacca ctgccaagcg cgagtacgag gagcgcctcg tcgactgcct 300
gaccaagtac agctgcgtgc tgttcgtggg catggacaac gtccgctcgc agcaggtgca 360
cgatgtcggc cgtgcgctgc gcgcgaaggc cgagttcatg atgggcaaga agacgctgca 420
gggcaagatc gtggagaagc gcgcgcaagc caaggacgcg agccccgagg cgaagcactt 480
caacgatcag tgtgaggagt acaacctgct gagcggcaac accggcctca tcttcacgaa 540
caacgctgtc caggagatca cgtctgtgct tgacgcgcac cgcgtgaagc gcgcggcgcg 600
tgtcggagcg atttccccgt gtgacgtgat tgtcgctgct ggcagcaccg gcatggagcc 660
gacccagacg tccttcttcc aggcgctgaa cattgcgacg aagattgcca agggtatggt 720
ggagatcgtg acggagaaga aggtgctgag cgtcggcgac aaggtggaca actcgacggc 780
gacgctgctg caaaagctga acatcagccc gttctactac caggtgaatg tgctgtccgt 840
gtgggaccgc ggtgtgctgt tcacccgcga ggacctgatg atgacggagg acatggtgga 900
gaagatgctg atggaaggcc tgagcaacgt tgcggcgatg gcgctgggtg ctggcatccc 960
gacgtcttcg acgattggcc cgatgctggt ggacgccttc aagaacctgc tggctgtctc 1020
tgtggcgacc tcgtacgagt tcgaggagca caacggcaag gagctgcgcg aggccgcgat 1080
caacggcctg ctggccggct cttgctcggc tgctgcggag cccgccgctg ccgcgccggc 1140
cgcccctagc gccgctgcca aggaggagcc ggaggagagc gacgaggacg acttcggcat 1200
gggcggtctc ttctaagcga ctcgccatct cttagcctcc ttgtggtgcg cttgaggtgc 1260
tctcgctctg cttctccttg cagtgttggc tgactctagc gggtatgtgt cgtcgcatta 1320
cacccacctc tcccacccct ttgctctacg cgctcgcatg cgcaatccgt gaatcatcga 1380
gggaagtctc tctgggtggc agtgggtaag cttgtgagga aagaggtgtg tgtgtgagcg 1440
ggcaggtacg tcggaccact taaacaaaca aacacacaca cacacggaaa gactcacgta 1500
cagcatccgt ccggcgcaac agcaacgtcc gccgcgcgaa gcagagcgcg tgcgctcatt 1560
gtaccgctgt gaacggagga gggggggact cttcgctttt ttctttttct tttttttgtt 1620
tcggtagttt attcttcatt ttccgtctca actcaaaaaa cagcacaaaa acgcggaaac 1680
gcagcatgag tggcgccgtt gcaatcgggg acggtggcgg cgcaacgcgt cgtggcaact 1740
gcgcatgggt tgctatctga tggatggttg cactgctgct cgaacacagg tggacctccc 1800
ccccccccgc aacgacgacg tccggtcgag tcgcgggcgt gtggccgtga gcacagggta 1860
gcctttcttt gcgtcgcaca gcacctatcg tcgtcgtcgg cactcctcat cacatctccc 1920
tcgtgtcgca cgaaggtgtg ctgtctgtga ggacgcttcc gtgtgagtag gtgcgtgcaa 1980
acatgcgtgc atcggcaccg gatcgcggtc gggtaggttc cacgctcctg gagggtcgca 2040
agtgtcttgc tgctccaggt gactgatgac caaggccata tcctcacgca acaccttcac 2100
tgctgccgcg ctgctttcct ccagcacgaa gcgagcacag gggcacgggt gggggcggca 2160
agcgagtagc ctctgaggtt gtgcgtaggc gacacgtcgt gtgccagtgg gcactgcgca 2220
ccttttcagt gttgtgtgtg gaacacaggg tcggcgcacg ctgtcttcgg tgatgctttc 2280
tcattatgag ccgcttgccg agcgtgcgcg cgacccccgg cccctcctca cctcctcgcg 2340
cggagttaac gcgtgcacgc tgtgtcccct gtgtaaagac agcttccccc acccccttgt 2400
caactccctc tcggtccgtc tttctcgcgt tcattctctc ttcttcgtga acgaaacacg 2460
accactcgcc tcgcatattc cgcgtgccca atatcccact cactccctta cacatgcatt 2520
gtccgtgcca caacccggcg cacacttcgg cacacgaaaa acaccttccc cgaccccacg 2580
acagatagcc aaggctattg caagtctcac aagatgccgt ctatcaccac tgccaagcgc 2640
gagtacgagg agcgcctcgt cgactgcctg accaagtaca gctgcgtgct gttcgtgggc 2700
atggacaacg tccgctcgca gcaggtgcac gatgtcggcc gtgcgctgcg cgcgaaggcc 2760
gagttcatga tgggcaagaa gacgctgcag ggcaagatcg tggagaagcg cgcgcaagcc 2820
aaggacgcga gccccgaggc gaagcacttc aacgatcagt gtgaggagta caacctgctg 2880
agcggcaaca ccggcctcat cttcacgaac aacgctgtcc aggagatcac gtctgtgctt 2940
gacgcgcacc gcgtgaagcg cgcggcgcgt gtcggagcga tttccccgtg tgacgtgatt 3000
gtcgctgctg gcagcaccgg catggagccg acccagacgt ccttcttcca ggcgctgaac 3060
attgcgacga agattgccaa gggtatggtg gagatcgtga cggagaagaa ggtgctgagc 3120
gtcggcgaca aggtggacaa ctcgacggcg acgctgctgc aaaagctgaa catcagcccg 3180
ttctactacc aggtgaatgt gctgtccgtg tgggaccgcg gtgtgctgtt cacccgcgag 3240
gacctgatga tgacggagga catggtggag aagatgctga tggaaggcct gagcaacgtt 3300
gcggcgatgg cgctgggtgc tggcatcccg acgtcttcga cgattggccc gatgctggtg 3360
gacgccttca agaacctgct ggctgtctct gtggcgacct cgtacgagtt cgaggagcac 3420
aacggcaagg agctgcgcga ggccgcgatc aacggcctgc tggccggctc ttgctcggct 3480
gctgcggagc ccgccgctgc cgcgccggcc gcccctagcg ccgctgccaa ggaggagccg 3540
gaggagagcg acgaggacga cttcggcatg ggcggtctct tctaagcgac tcgccatctc 3600
ccactgagca ccgtcgagtg ttcgtgtgtt cgcagggtgg acagcggcga gcgtgtgatg 3660
cccttggatc atcaggaagc aactctctcc ctttctctct gtgttcttcg tttcttcttt 3720
cattagtttt ggatcgccgt gcgctgcgca tcgctcagtt ctcatttata tcaataacaa 3780
caacgaagac 3790
<210> 22
<211> 260
<212> PRT
<213> Leishmania major
<400> 22
Met Gly Lys Thr Val Leu Ser Cys Arg Lys Gly Asn Gly Ser Val Tyr
1 5 10 15
Gln Val His Gly His Lys Arg Leu Gly Pro Ala Lys Leu Arg Ile Leu
20 25 30
Asp Tyr Ala Glu Arg His Gly Tyr Met Arg Gly Val Val Lys Ser Ile
35 40 45
Glu His Glu Ala Gly Arg Gly Ala Ala Leu Ala Arg Val Glu Phe Arg
50 55 60
His Pro Tyr Lys Phe Arg Arg Val Lys Glu Leu Met Val Ala Pro Glu
65 70 75 80
Gly Met Phe Thr Gly Gln Ser Val Phe Cys Gly Gln Lys Ala Pro Leu
85 90 95
Ala Ile Gly Asn Val Leu Pro Leu Gly Gln Ile Thr Glu Gly Cys Ile
100 105 110
Val Cys Asn Val Glu Ala Lys Pro Gly Asp Arg Gly Thr Leu Ala Arg
115 120 125
Ala Ser Gly Asp Tyr Cys Ile Ile Ile Ser His Asn His Glu Thr Gly
130 135 140
Arg Thr Arg Leu Lys Leu Pro Ser Gly Gln Lys Lys Ser Val Pro Ser
145 150 155 160
Thr Ser Arg Ala Met Ile Gly Ile Ile Ser Gly Gly Gly Arg Ile Glu
165 170 175
Lys Pro Val Leu Lys Ala Gly Asn Ser Phe Tyr Arg Phe Arg Gly Lys
180 185 190
Arg Asn Cys Trp Pro Lys Val Arg Gly Val Ala Arg Asn Pro Val Glu
195 200 205
His Pro His Gly Gly Gly Asn His Gln His Ile Gly His Pro Ser Thr
210 215 220
Val Ser Arg His Ser Pro Pro Gly Gln Lys Val Gly Leu Ile Ala Ala
225 230 235 240
Arg Arg Thr Gly Arg Ile Arg Gly Gly Lys Ala Val Lys Gly Ala Trp
245 250 255
His Pro Glu Glu
260
<210> 23
<211> 783
<212> DNA
<213> Leishmania major
<400> 23
atgggtaaga ctgtgctgag ctgccgtaag ggcaacggct ccgtgtacca ggtgcacggc 60
cacaagcgcc ttggccccgc caagctgcgc attctggact acgccgagcg ccacggctac 120
atgcgcggtg tggtgaagtc gatcgagcac gaggctggcc gcggtgcggc gctggcgcgc 180
gtggagttcc gccacccgta caagttccgc cgcgtgaagg agctgatggt ggcgccggag 240
ggcatgttca ccggccagtc ggtgttctgc ggccagaagg ccccgctcgc gatcggcaac 300
gtgctgcccc ttggccagat cacggagggc tgcattgtgt gcaacgtgga ggcgaagccc 360
ggtgaccgcg gcacgctggc gcgcgcgtcc ggcgactact gcatcatcat ctcgcacaac 420
cacgagacag gccgcacgcg cctgaagctg ccgagcgggc agaagaagtc cgtgccgagc 480
acgagccgcg cgatgatcgg catcatcagc ggcggtggcc gcatcgagaa gcccgtgctg 540
aaggccggta actcgttcta ccgcttccgc ggcaagcgca actgctggcc caaggtgcgt 600
ggtgttgccc gcaacccggt ggagcacccg cacggtggtg gtaaccatca gcacattggc 660
cacccgtcga cggtgtcgcg ccactcgccg ccgggccaga aggtgggtct gatcgctgcc 720
cgtcgcaccg gccgtattcg cggtggtaag gctgtcaagg gcgcgtggca cccggaggag 780
taa 783
<210> 24
<211> 252
<212> PRT
<213> Leishmania major
<400> 24
Met Ala Thr His Ser Val Tyr Gly Asn Ala Ser Asp Met Pro Ala Val
1 5 10 15
Pro Ala Pro Glu Ser Ala Ile Lys Arg Ala Ala Phe Lys Gln Gln Gln
20 25 30
Thr Glu Ser Phe Lys Lys Ala Val Val Ala Arg Lys Ala Ala Lys Ala
35 40 45
Ala Leu Lys Lys Thr Ala Tyr Leu Arg Ala Arg Lys Tyr Ser Arg Glu
50 55 60
Tyr Arg Gly Ala Glu Lys Lys Leu Val Thr Leu Arg Arg Gln Ala Ala
65 70 75 80
Ser His Gly Asn Tyr Tyr Leu Glu Ala Lys Pro Lys Val Ala Val Val
85 90 95
Thr Arg Ile Arg Gly Ile Ala Lys Val Asn Pro Lys Gln Arg Lys Ile
100 105 110
Leu Gln Leu Leu Arg Leu Arg Gln Ile Phe Asn Thr Val Phe Val Lys
115 120 125
Met Asn Lys Pro Met Glu Asn Met Leu Arg Ala Val Glu Pro Tyr Ile
130 135 140
Ala Tyr Gly Tyr Pro Ser Leu Ala Thr Val Arg Ala Met Val Tyr Lys
145 150 155 160
Arg Gly Tyr Leu Lys Ile Asn Gly Gln Arg Val Lys Ile Thr Asp Asn
165 170 175
Gln Met Ile Lys Asp Lys Tyr Asn Asn Val Asp Ile Val Cys Ala Glu
180 185 190
Asp Met Val Asn Gln Ile Tyr Thr Cys Gly Lys His Phe Arg Thr Val
195 200 205
Thr His Gly Met Trp Pro Phe Lys Leu Ala Pro Pro Ala Gly Gly Met
210 215 220
Arg Gln Lys Arg Arg His Phe Val Glu Gly Gly Asp Tyr Gly Asn Arg
225 230 235 240
Asp Thr Leu Ile Asn Arg Phe Leu Ala Arg Met Ile
245 250
<210> 25
<211> 759
<212> DNA
<213> Leishmania major
<400> 25
atggccacac actcagttta cggcaacgca tccgacatgc ccgctgtccc tgcccctgag 60
tccgcgatca agcgtgctgc gttcaagcag cagcagacgg agagcttcaa gaaggccgtg 120
gtggccagaa aggctgccaa ggctgccctg aagaagaccg cctacctgcg tgcccgcaaa 180
tactcccgcg agtaccgcgg tgcggagaag aagctggtga cgctgcgccg ccaggccgcc 240
tctcacggta actactacct ggaggcgaag ccgaaggttg ccgtggtgac tcgcatccgc 300
ggtatcgcca aggtgaaccc gaagcagcgc aagattcttc agttgctgcg cctgcgccag 360
atcttcaaca cggtgtttgt gaagatgaac aagccgatgg agaacatgct gcgtgcggtg 420
gagccctaca tcgcgtacgg ctacccgtcc ctggccaccg tccgcgcgat ggtgtacaag 480
cgcggctacc tgaagatcaa cggccagcgc gtgaagatca ccgacaacca gatgatcaag 540
gataagtaca acaacgtgga cattgtgtgt gccgaggata tggtgaacca gatctacacc 600
tgcggcaagc acttccgcac ggtgacgcac ggcatgtggc ccttcaagct ggcccctccg 660
gccggtggca tgcgccagaa gcgccgtcac ttcgtggagg gtggcgacta tggtaaccgc 720
gacaccttga tcaaccgctt cctcgcccgc atgatctga 759
<210> 26
<211> 264
<212> PRT
<213> Leishmania major
<400> 26
Met Pro Gly Lys Glu Val Lys Lys Val Thr Gln Pro Ala Lys Ala Ala
1 5 10 15
Ser Pro Tyr Lys Lys Pro Ala Val Ala Ser His Phe Ala Ala Arg Pro
20 25 30
Lys Asn Phe Gly Ile Gly Gln Asp Val Pro Tyr Ala Arg Asp Leu Ser
35 40 45
Arg Phe Met Arg Trp Pro Thr Phe Val Thr Met Gln Arg Lys Lys Arg
50 55 60
Val Leu Gln Arg Arg Leu Lys Val Pro Pro Ala Leu Asn Gln Phe Thr
65 70 75 80
Lys Val Leu Asp Arg Ala Ser Arg Asn Glu Ala Leu Lys Leu Ile Lys
85 90 95
Lys Tyr Ala Pro Glu Thr Arg Lys Ala Arg Arg Glu Arg Leu Gln Lys
100 105 110
Val Ala Glu Glu Lys Lys Lys Asp Pro Lys Lys Thr Val Ser Thr Lys
115 120 125
Ala Pro Leu Ala Val Val Thr Gly Leu Gln Glu Val Thr Arg Ala Ile
130 135 140
Glu Lys Lys Gln Ala Arg Met Val Val Ile Ala Asn Asn Val Asp Pro
145 150 155 160
Val Glu Leu Val Leu Trp Met Pro Asn Leu Cys Arg Ala Asn Lys Ile
165 170 175
Pro Tyr Ala Ile Val Lys Asp Met Ala Arg Leu Gly Asp Ala Ile Gly
180 185 190
Arg Lys Thr Ala Thr Cys Val Ala Leu Thr Asp Val Asn Ala Glu Asp
195 200 205
Glu Ala Thr Leu Lys Asn Leu Ile Arg Ser Val Asn Ala Arg Phe Leu
210 215 220
Ser Arg Ser Asp Val Ile Arg Arg Gln Trp Gly Gly Leu Gln Leu Ser
225 230 235 240
Leu Arg Ser Arg Ala Glu Leu Arg Lys Lys His Ala Arg Asn Ala Gly
245 250 255
Val Asp Ala Ala Ala Ile Ile Gln
260
<210> 27
<211> 795
<212> DNA
<213> Leishmania major
<400> 27
atgcccggca aggaagtgaa gaaggtgacg cagcccgcga aggccgcgtc tccgtacaag 60
aagcccgccg ttgcgtcgca tttcgcggcc cgcccgaaga acttcggtat tggccaggat 120
gtgccgtacg cgcgtgacct gtcccgcttc atgcggtggc cgacgttcgt gacgatgcag 180
cgcaagaagc gcgtgctgca gcgccgcctg aaggtgccgc cggcgctgaa ccagttcacg 240
aaggtgctgg accgcgcgag ccgaaacgag gcgctgaagc tgattaagaa gtacgcgccg 300
gagacccgca aggctcgccg cgagcgcctg cagaaggttg ccgaggagaa gaagaaggac 360
ccgaagaaga cggtatcgac gaaggctccc ctggctgttg tgaccggtct gcaggaggtg 420
acgcgcgcga tcgagaagaa gcaggctcgc atggttgtga tcgcgaacaa cgtggaccct 480
gtggagctcg tgctgtggat gccgaacctg tgccgcgcga acaagatccc gtatgccatc 540
gtgaaggaca tggcgcgcct gggcgatgcg atcgggcgga agacggcgac gtgcgttgcg 600
ctcaccgacg tgaacgccga ggatgaggcg acgctgaaga acctgatccg ctccgtgaac 660
gctcgcttct tgtcccgctc ggacgtgatc cgccgccagt ggggtggtct gcagctgtct 720
ctgcgatccc gcgcggagct gcgcaagaag catgcccgca acgctggtgt ggacgccgcg 780
gccatcatcc agtaa 795
<210> 28
<211> 222
<212> PRT
<213> Leishmania major
<400> 28
Met Ala Phe Pro Ser Arg Lys Asp Ala Phe Arg Ala Gln Arg Lys Gly
1 5 10 15
Ala Lys Lys His Arg Pro Glu Ile Ile Val Ile Asp Leu Lys Asp His
20 25 30
Val Leu Gly Arg Ala Ala Ala Val Val Ala Lys Gln Leu Leu Leu Gly
35 40 45
Lys Lys Ile Thr Val Val Arg Cys Glu Gln Leu Asn Ile Ala Gly Thr
50 55 60
Glu Ile Arg Asn Lys Ile Lys Tyr Leu Gln Tyr Leu Arg Lys Arg Lys
65 70 75 80
Leu Thr Asn Pro Thr Lys Gly Pro Phe His His Arg Ala Pro Ser Asp
85 90 95
Val Phe Val Arg Thr Val Arg Ser Met Leu Pro Arg Tyr Thr Lys Arg
100 105 110
Gly Met Lys Ala Leu Asn Ser Leu Val Ala Tyr Glu Gly Ile Pro Pro
115 120 125
Asn Val Val Arg Thr Gly Gly Arg Val Val Ile Pro Arg Ala Gln Arg
130 135 140
His Val Cys Tyr Arg Ser Glu Arg Pro Tyr Thr Val Leu Gly Asn Met
145 150 155 160
Cys Lys His Val Gly Trp Lys Tyr Ser Asp Val Val Ala Asn Leu Glu
165 170 175
Lys Ala Arg Val Glu Lys Ala Ser Arg His His Glu Lys Gln Ala Lys
180 185 190
Leu Arg Asp Ala Trp Lys Ser Ala Arg Lys Glu Ala Leu Ala Lys Met
195 200 205
Pro Lys His Asn Val Glu Val Leu Lys Lys Phe Gly Tyr Ala
210 215 220
<210> 29
<211> 669
<212> DNA
<213> Leishmania major
<400> 29
atggcctttc ctagccgcaa ggatgcgttc cgcgcgcagc gcaagggcgc caagaagcac 60
cgccccgaga tcatcgtgat cgacctgaag gatcacgtgc ttggtcgcgc ggcggctgtg 120
gttgccaagc agctgctcct gggtaagaag atcaccgtgg tgcgctgcga gcagctcaac 180
attgccggta cggagatccg caacaagatc aagtacctgc agtacctgcg caagcggaag 240
ctgacgaacc ccacaaaggg tcccttccac caccgtgccc cgtccgacgt gtttgtccgc 300
actgtgcgca gcatgctgcc ccggtacacg aagcgcggca tgaaggcgct taactcgctg 360
gtggcctacg agggaattcc gcccaacgtg gtgcgcacgg gcgggcgcgt ggtgatcccg 420
cgcgcccagc gccatgtgtg ctaccgctcg gagcgtcctt acacagtgct cggcaacatg 480
tgcaagcacg tgggctggaa gtacagcgac gtcgtcgcca atctcgagaa ggctcgcgtg 540
gagaaggcgt cccgccacca cgaaaagcag gcgaagcttc gcgacgcgtg gaagtcggcc 600
cgcaaggagg cgctcgccaa gatgcccaag cacaacgtgg aggtgctgaa gaagtttggc 660
tacgcgtag 669
<210> 30
<211> 267
<212> PRT
<213> Leishmania major
<400> 30
Met Thr Pro Leu Ser Leu Ser Ser Ser Arg His Ser Phe Lys Gln Asn
1 5 10 15
Glu Thr Gln Asn Met Val Ser Leu Lys Leu Gln Ala Arg Leu Ala Ser
20 25 30
Ser Ile Leu Gly Cys Gly Arg Ala Arg Val Trp Leu Asp Pro Asn Glu
35 40 45
Ala Val Glu Ile Gln Asn Ala Asn Ser Arg Lys Ser Val Arg Lys Leu
50 55 60
Ile Lys Asp Gly Phe Ile Ile Arg Lys Pro Val Lys Val His Ser Arg
65 70 75 80
Ala Arg Trp Arg Lys Met Lys Glu Ala Lys Asp Met Gly Arg His Asn
85 90 95
Gly Val Gly Arg Arg Glu Gly Ser Arg Glu Ala Arg Met Pro Ser Lys
100 105 110
Glu Leu Trp Met Arg Arg Leu Arg Ile Leu Arg Arg Leu Leu Arg Lys
115 120 125
Tyr Arg Ala Asp Lys Lys Ile Asp Arg His Val Tyr Arg Asp Leu Tyr
130 135 140
Met Arg Ala Lys Gly Asn Val Phe Arg Asn Lys Arg Asn Leu Val Glu
145 150 155 160
His Ile His Lys Ile Lys Asn Glu Lys Lys Lys Glu Arg Gln Leu Ala
165 170 175
Glu Gln Leu Ala Ala Lys His Leu Arg Asp Glu Gln Asn Arg Asn Lys
180 185 190
Ala Arg Lys Gln Glu Leu Lys Lys Arg Glu Lys Glu Arg Glu Arg Ala
195 200 205
Arg Arg Asp Asp Ala Ala Ala Ala Ala Gln Lys Lys Lys Ala Asp Ala
210 215 220
Ala Lys Lys Ser Ala Ala Pro Ala Ala Lys Ser Ala Ala Pro Ala Ala
225 230 235 240
Lys Ala Ala Ala Pro Ala Thr Lys Ala Ala Ala Ala Ala Pro Ala Thr
245 250 255
Lys Gly Ala Ala Pro Val Lys Lys Ser Lys Lys
260 265
<210> 31
<211> 804
<212> DNA
<213> Leishmania major
<400> 31
atgacccctc tctccctctc ttcctcccgc cacagtttta agcagaacga aacgcagaac 60
atggtgtctc tgaagctgca ggctcgcctt gcgtcgagca tcctcggctg cggccgcgcc 120
cgcgtgtggc tggaccccaa cgaggcggtg gagatccaga acgcgaactc gcgcaagagc 180
gtgcgcaagc tgatcaagga tggcttcatc atccgcaagc cggtgaaggt gcactcgcgc 240
gcgcggtggc gtaaaatgaa ggaggcgaag gacatggggc gccacaacgg cgttgggcgc 300
cgcgagggta gccgcgaggc ccgcatgccg agcaaggagt tgtggatgcg ccgcctgcgc 360
attctgcgcc gcctgctgcg caagtaccgc gcggacaaga agattgaccg ccacgtgtac 420
cgcgacctgt acatgcgcgc gaagggtaac gtgttccgca acaagcgcaa ccttgtggag 480
cacatccaca agatcaagaa tgagaagaag aaggagcgcc agctggcgga gcagctcgcg 540
gcgaagcacc tgcgcgacga gcagaaccgc aacaaggctc gcaagcagga gctgaagaag 600
cgcgagaagg agcgcgagcg cgcgaggcgc gacgacgctg ctgccgctgc gcagaagaag 660
aaggcggacg ccgcgaagaa gtccgccgcg cctgctgcga agtccgccgc gcctgccgcg 720
aaggctgctg cccccgccac gaaggccgct gctgctgccc ccgccacgaa gggtgctgcg 780
ccggtgaaga agtcgaagaa gtaa 804
<210> 32
<211> 273
<212> PRT
<213> Leishmania major
<400> 32
Met Ala Lys Lys His Leu Lys Arg Leu Tyr Ala Pro Lys Asp Trp Met
1 5 10 15
Leu Ser Lys Leu Thr Gly Val Phe Ala Pro Arg Pro Arg Pro Gly Pro
20 25 30
His Lys Leu Arg Glu Cys Leu Pro Leu Leu Val Ile Ile Arg Asn Arg
35 40 45
Leu Lys Tyr Ala Leu Asn Ala Arg Glu Gly Glu Met Ile Leu Arg Gln
50 55 60
Gly Leu Val His Val Asp Asn His Pro Arg Arg Asp Gly Lys Tyr Pro
65 70 75 80
Ala Gly Phe Met Asp Val Val Glu Ile Pro Lys Thr Gly Asp Arg Phe
85 90 95
Arg Leu Met Tyr Asp Val Lys Gly Arg Phe Ala Leu Val Asn Leu Ser
100 105 110
Glu Ala Glu Ala Gln Ile Lys Leu Met Lys Val Val Asn Leu Tyr Thr
115 120 125
Ala Thr Gly Arg Val Pro Val Ala Val Thr His Asp Gly His Arg Ile
130 135 140
Arg Tyr Pro Asp Pro His Thr Ser Ile Gly Asp Thr Ile Val Tyr Asn
145 150 155 160
Val Lys Glu Lys Lys Cys Val Asp Leu Ile Lys Asn Arg Gln Gly Lys
165 170 175
Ala Val Ile Val Thr Gly Gly Ala Asn Arg Gly Arg Ile Gly Glu Ile
180 185 190
Val Lys Val Glu Cys His Pro Gly Ala Phe Asn Ile Ala His Leu Lys
195 200 205
Asp Ala Ser Gly Ala Glu Phe Ala Thr Arg Ala Ala Asn Ile Phe Val
210 215 220
Ile Gly Lys Asp Leu Asn Asn Leu Gln Val Thr Val Pro Lys Gln Gln
225 230 235 240
Gly Leu Arg Met Asn Val Ile Gln Glu Arg Glu Glu Arg Leu Ile Ala
245 250 255
Ala Glu Ala Arg Lys Asn Ala Pro Ala Arg Gly Ala Arg Arg Ala Arg
260 265 270
Lys
<210> 33
<211> 822
<212> DNA
<213> Leishmania major
<400> 33
atggccaaga agcacctcaa gcgcttgtat gcgcccaagg actggatgct gagcaagctg 60
accggcgtgt tcgcgccgcg tccgcgtccg ggtccgcaca agctgcgcga gtgcctgccg 120
ctgctggtga tcatccgcaa ccggctgaag tacgcgctga acgcgcgcga gggtgagatg 180
atcctgcgcc agggtctggt gcacgtggac aaccacccgc gccgcgacgg caagtatccc 240
gccggtttca tggacgtggt cgagatcccg aagacgggcg accgcttccg cctgatgtac 300
gacgtcaagg gccgcttcgc gttggtgaac ctgtccgagg cggaggcgca gatcaagctg 360
atgaaggttg tgaacctgta cacggccacc ggccgcgtgc cggtcgctgt gacgcacgac 420
ggccaccgca tccgctaccc ggacccgcac acctccattg gtgacaccat cgtgtacaac 480
gtcaaggaga agaagtgcgt ggacctgatc aagaaccgcc agggcaaggc cgtgatcgtg 540
accggtggcg ccaaccgcgg ccgcatcggc gagatcgtga aggtggagtg ccaccccggt 600
gcgttcaaca ttgcgcacct gaaggacgcg tccggcgccg agttcgccac ccgcgccgcg 660
aacatcttcg tgatcggcaa ggacctgaac aacctgcagg taacggtgcc gaagcagcag 720
ggcctgcgca tgaacgtgat ccaggagcgc gaggagcgcc tgatcgcggc ggaggcccgc 780
aagaacgcgc cggctcgtgg tgcccgcagg gcccgcaagt ga 822
<210> 34
<211> 249
<212> PRT
<213> Leishmania major
<400> 34
Met Lys Leu Asn Ile Ala Tyr Pro Arg Asn Gly Thr Val Lys Gln Phe
1 5 10 15
Glu Ile Ser Asp Glu Val Leu Arg Arg Val Gln Leu Gln Asp Tyr Arg
20 25 30
Leu Gly Asn Glu Val Asp Gly Ala Ile Phe Gly Ser Glu Phe Lys Gly
35 40 45
Tyr Ile Phe Arg Leu Arg Gly Gly Ser Asp Lys Asp Gly Phe Pro Met
50 55 60
Val Pro Gly Val Leu Ala Ser Ser Arg Val Ser Leu Leu Val Lys Arg
65 70 75 80
Gly Ala Ile Gly Phe Asn Thr Phe Arg Gly Tyr Gln Gly Glu Arg Arg
85 90 95
Arg Lys Asn Val Arg Gly Cys Val Leu Ala Ser Asp Ile Ala Leu Val
100 105 110
Asn Val Thr Ile Ser Lys Val Gly Asp Gln Pro Ile Glu Gly Val Thr
115 120 125
Asp Thr Thr Ala Pro Arg Arg Leu Gly Pro Lys Arg Ala Ser Lys Ile
130 135 140
Arg Lys Leu Phe Asn Leu Ser Arg Thr Glu Asp Val Arg Lys Tyr Val
145 150 155 160
Val Arg Arg Arg Val Val Lys Ser Gly Lys Lys Asp Arg Leu Lys Ala
165 170 175
Pro Lys Ile Gln Arg Leu Ile Thr Pro Arg Val Lys Ala Arg Arg Ala
180 185 190
Lys Lys Ala Lys Asp Ala Ile Ala Lys Val Arg Ala Ser Ala Ala Glu
195 200 205
Arg Arg Glu Tyr Leu Arg Leu Ile Ala Ser Asn Arg Arg Ala Leu Arg
210 215 220
Gln Arg Asp His Ser Lys Lys His Thr Arg Lys Val His Ala Gln Arg
225 230 235 240
Ala Glu Val Ala Ala Phe Gln Lys Lys
245
<210> 35
<211> 750
<212> DNA
<213> Leishmania major
<400> 35
atgaagctca acatcgcgta cccccgcaac gggacggtga agcagttcga gatctcggac 60
gaggtgctcc gccgcgtgca gctgcaggac taccgcctcg gcaacgaggt ggacggcgcc 120
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ggtgcgatcg gcttcaacac cttccgcggc taccagggtg agcgccgccg caagaacgtt 300
cgcggctgcg tgctcgcgag cgacattgcg ctggtgaacg tgaccatctc caaggtcggt 360
gaccagccga tcgagggtgt gacggacacc acggctcccc gccgtctggg tccgaagcgc 420
gcgagcaaga tccgcaagct cttcaacctg tcccgcaccg aagacgtgcg gaagtacgtt 480
gttcgccgcc gcgtcgtgaa gagcggcaag aaggaccggc tgaaggcccc gaagatccag 540
cgtctgatca cgccgagggt caaggcccgc cgtgccaaga aggccaagga cgccatcgcc 600
aaggtgcgcg cgtctgccgc tgagcgccgt gagtacctgc gccttatcgc ctcgaaccgc 660
cgtgcgctgc gccagcgtga ccactccaag aagcacaccc ggaaggtgca cgcccagcgc 720
gctgaggtgg cagcattcca gaagaagtaa 750
<210> 36
<211> 1436
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> protein Q
<400> 36
atgagaggat ctcaccatca ccatcaccat acggatccgc atgcgagctc gaacaacaac 60
aacaataaca ataacaacaa cctcgggatc gagggaaggc ctttagctac tcctcgcagc 120
gccaagaagg ccgtccgcaa gagcggctcc aagtccgcga aatgtggtct gatcttcccg 180
gtgggccgcg tcggcgggat gatgcgccgc ggccagtacg ctcgccgcat cggtgcctct 240
ggcgccccca ggatttcaga attctccgtg aaggcggccg cgcagagcgg gaagaagcgg 300
tgccgcctga acccgcgcac cgtgatgctg gccgcgcgcc acgacgacga catcggcacg 360
cttctgaaga acgtgacctt gtctcacagc ggcgttgtgc cgaacatcag caaggcgatg 420
gcaaagaaga agggcggcaa gaagggcaag gcgacaccga gcgcgcccga attcggatcc 480
tctagaccca tgtccaccaa gtacctcgcc gcgtacgctc tggcctccct gagcaaggcg 540
tccccgtctc aggcggacgt ggaggctatc tgcaaggccg tccacatcga cgtcgaccag 600
gccaccctcg cctttgtgat ggagagcgtt acgggacgcg acgtggccac cctgatcgcg 660
gagggcgccg cgaagatgag cgcgatgccg gcggccagct ctggtgccgc tgctggcgtc 720
actgcttccg ctgcgggtga tgcggctccg gctgccgccg ccgcgaagaa ggacgagccc 780
gaggaggagg ccgacgacga catgggcccc tctagagtcg accccatgca gtacctcgcc 840
gcgtacgccc tcgtggcgct gtctggcaag acgccgtcga aggcggacgt tcaggctgtc 900
ctgaaggccg ccggcgttgc cgtggatgcc tcccgcgtgg atgccgtctt ccaggaggtg 960
gagggcaaga gcttcgatgc gctggtggcc gagggccgca cgaagctggt gggctctggc 1020
tctgccgctc ctgctggcgc tgtctccact gctggtgccg ccgctggcgc ggtggccgag 1080
gcgaagaagg aggagcccga ggaggaggag gccgatgatg acatgggccc cgtcgacctg 1140
cagcccgccg ctgccgcgcc ggccgcccct agcgccgctg ccaaggagga gccggaggag 1200
agcgacgagg acgacttcgg catgggcggt ctcttctaag cgactcgcca tctcttagcc 1260
tccttgtggt gcgcttgagg tgctctcgct ctgcttctcc ttgcagtgtt ggctgactct 1320
ggcgggtatg tgccgtcgca ttacacccac ctctcccacc cctttgccct acgcgctcgc 1380
atgcgcaatc cgtgaatcat cgagggaagt ctctctgggt ggcagtgggt aagctt 1436
<210> 37
<211> 412
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> protein Q
<400> 37
Met Arg Gly Ser His His His His His His Thr Asp Pro His Ala Ser
1 5 10 15
Ser Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Leu Gly Ile Glu Gly
20 25 30
Arg Pro Leu Ala Thr Pro Arg Ser Ala Lys Lys Ala Val Arg Lys Ser
35 40 45
Gly Ser Lys Ser Ala Lys Cys Gly Leu Ile Phe Pro Val Gly Arg Val
50 55 60
Gly Gly Met Met Arg Arg Gly Gln Tyr Ala Arg Arg Ile Gly Ala Ser
65 70 75 80
Gly Ala Pro Arg Ile Ser Glu Phe Ser Val Lys Ala Ala Ala Gln Ser
85 90 95
Gly Lys Lys Arg Cys Arg Leu Asn Pro Arg Thr Val Met Leu Ala Ala
100 105 110
Arg His Asp Asp Asp Ile Gly Thr Leu Leu Lys Asn Val Thr Leu Ser
115 120 125
His Ser Gly Val Val Pro Asn Ile Ser Lys Ala Met Ala Lys Lys Lys
130 135 140
Gly Gly Lys Lys Gly Lys Ala Thr Pro Ser Ala Pro Glu Phe Gly Ser
145 150 155 160
Ser Arg Pro Met Ser Thr Lys Tyr Leu Ala Ala Tyr Ala Leu Ala Ser
165 170 175
Leu Ser Lys Ala Ser Pro Ser Gln Ala Asp Val Glu Ala Ile Cys Lys
180 185 190
Ala Val His Ile Asp Val Asp Gln Ala Thr Leu Ala Phe Val Met Glu
195 200 205
Ser Val Thr Gly Arg Asp Val Ala Thr Leu Ile Ala Glu Gly Ala Ala
210 215 220
Lys Met Ser Ala Met Pro Ala Ala Ser Ser Gly Ala Ala Ala Gly Val
225 230 235 240
Thr Ala Ser Ala Ala Gly Asp Ala Ala Pro Ala Ala Ala Ala Ala Lys
245 250 255
Lys Asp Glu Pro Glu Glu Glu Ala Asp Asp Asp Met Gly Pro Ser Arg
260 265 270
Val Asp Pro Met Gln Tyr Leu Ala Ala Tyr Ala Leu Val Ala Leu Ser
275 280 285
Gly Lys Thr Pro Ser Lys Ala Asp Val Gln Ala Val Leu Lys Ala Ala
290 295 300
Gly Val Ala Val Asp Ala Ser Arg Val Asp Ala Val Phe Gln Glu Val
305 310 315 320
Glu Gly Lys Ser Phe Asp Ala Leu Val Ala Glu Gly Arg Thr Lys Leu
325 330 335
Val Gly Ser Gly Ser Ala Ala Pro Ala Gly Ala Val Ser Thr Ala Gly
340 345 350
Ala Ala Ala Gly Ala Val Ala Glu Ala Lys Lys Glu Glu Pro Glu Glu
355 360 365
Glu Glu Ala Asp Asp Asp Met Gly Pro Val Asp Leu Gln Pro Ala Ala
370 375 380
Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ser Ala Ala Ala Lys Glu Glu Pro Glu Glu
385 390 395 400
Ser Asp Glu Asp Asp Phe Gly Met Gly Gly Leu Phe
405 410
<210> 38
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> primer
<400> 38
aacacgaagg agggcaaggt c 21
<210> 39
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> primer
<400> 39
cttcttcgcg gcctttgcct tg 22
<210> 40
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> primer
<400> 40
tgcacgctgg caaattgggt ac 22
<210> 41
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> primer
<400> 41
cttcttcgtg cgcacagcag 20
<210> 42
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> primer
<400> 42
cttcttcgcg gcctttgcct tg 22
<210> 43
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> primer
<400> 43
cttcttcgtg cgcacagcag 20
<210> 44
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> primer
<400> 44
cgggatccat gtctcactgc aagttcgag 29
<210> 45
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> primer
<400> 45
aactgcagtt acttcttcgc ggcctttg 28
<210> 46
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> primer
<400> 46
cgggatccat gtgcacgctg gcaaattg 28
<210> 47
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> primer
<400> 47
cccaagcttt tacttgccga ggcgctcgc 29
<210> 48
<211> 419
<212> PRT
<213> Leishmania infantum
<400> 48
Met Ser His Cys Lys Phe Glu His Pro Arg His Gly His Leu Gly Phe
1 5 10 15
Leu Pro Arg Lys Arg Ser Arg Gln Ile Arg Gly Arg Ala Arg Ala Phe
20 25 30
Pro Lys Asp Asp Ala Thr Gln Lys Pro His Leu Thr Ser Phe Met Val
35 40 45
Phe Lys Ala Gly Met Thr His Ile Val Arg Asp Val Asp Arg Pro Gly
50 55 60
Ser Lys Val Asn Lys Lys Glu Val Val Glu Pro Val Thr Ile Leu Glu
65 70 75 80
Ala Pro Pro Met Val Ile Val Gly Ile Val Gly Tyr Arg Gln Thr Pro
85 90 95
Val Gly Leu Lys Thr Ile Gly Thr Val Trp Ala His His Thr Ser Val
100 105 110
Glu Phe Arg Arg Arg Tyr Tyr Lys Asn Trp Lys Gln Ser Ala Gln Leu
115 120 125
Ala Phe Ser Arg Gln Lys Gln Phe Ala Asn Thr Lys Glu Gly Lys Val
130 135 140
Ala Glu Ala Arg Thr Leu Asn Ala Phe Ala Lys Lys Ala Ser Val Ile
145 150 155 160
Arg Val Ile Ala His Thr Gln Leu Arg Lys Leu Arg Asn His Arg Val
165 170 175
Gly Val Lys Lys Ala His Val Gln Glu Ile Gln Val Asn Gly Gly Ser
180 185 190
Val Ala Ala Lys Ile Ala Leu Ala Lys Ser Leu Leu Glu Lys Glu Val
195 200 205
Arg Val Asp Ser Val Phe Gln Gln Ser Glu Ala Cys Asp Val Cys Ser
210 215 220
Val Thr Lys Gly His Gly Thr Glu Gly Val Val Lys Arg Trp Gly Val
225 230 235 240
Ala Cys Leu Pro Arg Lys Thr His Arg Gly Leu Arg Lys Val Ala Cys
245 250 255
Ile Gly Ala Trp His Pro Ala Arg Val Met Tyr Thr Val Ala Arg Ala
260 265 270
Gly Gln His Gly Tyr His His Arg Thr Gln Leu Asn Lys Lys Ile Tyr
275 280 285
Gln Ile Gly Arg Ser Val Ala Val Glu Pro Asn Gln Ala Thr Thr Thr
290 295 300
Tyr Asp Leu Thr Ala Lys Thr Ile Thr Pro Met Gly Gly Phe Val Gly
305 310 315 320
Tyr Gly Thr Val Arg Asn Asp Tyr Val Met Leu Lys Gly Ser Val Ser
325 330 335
Gly Pro Arg Arg Arg Val Met Thr Leu Arg Arg Pro Met Ala Pro Gln
340 345 350
Thr Ser Arg His Leu Lys Glu Lys Ile Val Leu Lys Phe Ile Asp Thr
355 360 365
Ser Ser Lys Ile Gly His Gly Arg Phe Gln Thr Lys Lys Glu Lys Asn
370 375 380
Gln Trp Phe Gly Pro Leu Lys Lys Asp Arg Ile Arg Arg Glu Glu Arg
385 390 395 400
Leu Arg Lys Glu Arg Ala Ala Arg Ala Val Glu Arg Lys Ala Lys Val
405 410 415
Ala Lys Lys
<210> 49
<211> 1260
<212> DNA
<213> Leishmania infantum
<400> 49
atgtctcact gcaagttcga gcacccccgc cacggccatc tcggcttcct gccgcgcaag 60
cgctcgcgcc agatccgcgg ccgcgcgcgc gcgttcccca aggacgacgc gacgcagaag 120
ccccacctga cgagtttcat ggtgttcaag gccggcatga cgcacattgt gcgtgatgtc 180
gatcgccctg gatcgaaggt gaacaagaag gaggtggtgg agccggtgac gattctggag 240
gcgccgccga tggtgattgt cggcattgtg ggctaccgcc aaacgccggt cggcctgaag 300
acgatcggca ccgtgtgggc gcaccacacg agcgtcgagt tccgccgccg ctactacaag 360
aactggaagc agtctgcgca actggccttc tcccgccaga agcagtttgc gaacacgaag 420
gagggcaagg tcgccgaggc gcgcacgctg aacgcgttcg cgaagaaggc gtccgtcatc 480
cgcgtgatcg cgcacacgca gctgcgcaag cttcgcaacc accgcgtggg cgtgaagaag 540
gcgcacgtgc aggagatcca ggtcaacggc ggcagcgttg cggcgaagat cgcgctggcc 600
aagtccctgc tggagaagga ggtgcgcgtg gactccgtgt tccagcagtc ggaggcgtgc 660
gacgtgtgct ccgtgacgaa aggccacggt acggagggcg tggtgaagcg ctggggcgtt 720
gcctgcctgc cacgcaagac gcaccgcggt ctgcgcaagg ttgcgtgcat cggcgcgtgg 780
caccctgccc gcgtcatgta cactgtcgcg cgcgccggtc agcacggtta ccaccaccgc 840
acgcagctga acaagaagat ctaccagatc ggccgctccg ttgctgtgga accgaaccag 900
gcgacgacga cctacgatct gacggccaag acgatcacac ccatgggtgg cttcgtcggc 960
tacggcacgg tgcgcaacga ctacgtgatg ctgaagggct ccgtgtctgg tccgcgccgc 1020
cgtgtgatga cgctccgccg cccgatggca ccgcagacgt cgcgccacct gaaggagaag 1080
atcgtgctga agttcatcga cactagctcg aagattggcc acggccgctt ccagacgaag 1140
aaggagaaga accagtggtt cggcccgctc aagaaggacc gcatccgccg cgaggagcgc 1200
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<210> 50
<211> 419
<212> PRT
<213> Leishmania mexicana
<400> 50
Met Ser His Cys Lys Phe Glu His Pro Arg His Gly His Leu Gly Phe
1 5 10 15
Leu Pro Arg Lys Arg Ser Arg Gln Ile Arg Gly Arg Ala Arg Ala Phe
20 25 30
Pro Lys Asp Asp Ala Thr Gln Lys Pro His Leu Thr Ser Phe Met Val
35 40 45
Phe Lys Ala Gly Met Thr His Ile Val Arg Asp Val Asp Arg Pro Gly
50 55 60
Ser Lys Val Asn Lys Lys Glu Val Val Glu Pro Val Thr Ile Leu Glu
65 70 75 80
Ala Pro Pro Met Val Ile Val Gly Ile Val Gly Tyr Arg Gln Thr Pro
85 90 95
Val Gly Leu Lys Thr Ile Gly Thr Val Trp Ala His His Thr Ser Val
100 105 110
Glu Phe Arg Arg Arg Tyr Tyr Lys Asn Trp Lys Gln Ser Ala Gln Leu
115 120 125
Ala Phe Ser Arg Gln Lys Gln Phe Ala Asn Thr Lys Glu Gly Arg Ile
130 135 140
Ala Glu Ala Arg Thr Leu Asn Ala Phe Ala Lys Lys Ala Ser Val Ile
145 150 155 160
Arg Val Ile Ala His Thr Gln Leu Arg Lys Leu Arg Asn His Arg Val
165 170 175
Gly Val Lys Lys Ala His Val Gln Glu Ile Gln Ile Asn Gly Gly Asn
180 185 190
Val Ala Ala Lys Ile Ala Leu Ala Lys Ser Leu Leu Glu Lys Glu Val
195 200 205
Arg Val Asp Ser Val Phe Gln Gln Ser Glu Ala Cys Asp Val Cys Ser
210 215 220
Val Thr Lys Gly His Gly Thr Glu Gly Val Val Lys Arg Trp Gly Val
225 230 235 240
Ala Cys Leu Pro Arg Lys Thr His Arg Gly Leu Arg Lys Val Ala Cys
245 250 255
Ile Gly Ala Trp His Pro Ala Arg Val Met Tyr Thr Val Ala Arg Ala
260 265 270
Gly Gln His Gly Tyr His His Arg Thr Gln Leu Asn Lys Lys Ile Tyr
275 280 285
Gln Ile Gly Arg Ser Val Ala Val Glu Pro Asn Gln Ala Thr Thr Thr
290 295 300
Tyr Asp Leu Thr Ala Lys Thr Ile Thr Pro Met Gly Gly Phe Val Gly
305 310 315 320
Tyr Gly Thr Val Arg Asn Asp Tyr Val Met Leu Lys Gly Ser Val Ser
325 330 335
Gly Pro Arg Arg Arg Val Met Thr Leu Arg Arg Pro Met Ala Pro Gln
340 345 350
Thr Ser Arg Gln Leu Lys Glu Lys Ile Val Leu Lys Phe Ile Asp Thr
355 360 365
Ser Ser Lys Ile Gly His Gly Arg Phe Gln Thr Lys Lys Glu Lys Ser
370 375 380
Gln Trp Phe Gly Pro Leu Lys Lys Asp Arg Ile Arg Arg Glu Glu Arg
385 390 395 400
Leu Arg Lys Glu Arg Ala Ala Arg Ala Val Glu Arg Lys Ala Lys Ala
405 410 415
Ala Lys Lys
<210> 51
<211> 1260
<212> DNA
<213> Leishmania mexicana
<400> 51
atgtctcact gcaagttcga gcacccccgc cacggccatc tcggcttcct gccgcgcaag 60
cgctcgcgcc agatccgcgg ccgcgcgcgc gcgttcccca aggacgacgc gacgcagaag 120
ccccacctaa cgagcttcat ggtgttcaag gctggcatga cgcacattgt gcgtgatgtc 180
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aactggaagc agtctgcgca gctggccttc tcccgccaga agcagttcgc gaacacgaag 420
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cgcgtgatcg cgcacacgca gctgcgcaag cttcgcaacc accgcgtggg cgtgaagaag 540
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<210> 52
<211> 305
<212> PRT
<213> Leishmania infantum
<400> 52
Met Pro Phe Val Lys Val Val Lys Asn Lys Ala Tyr Phe Lys Arg Phe
1 5 10 15
Gln Val Lys Tyr Arg Arg Arg Arg Glu Gly Lys Thr Asp Tyr His Ala
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Arg Arg Gln Met Val Leu Gln Asp Lys Thr Lys Phe Gly Ser Pro Lys
35 40 45
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65 70 75 80
His Glu Leu Pro Ala Phe Gly Ile Glu His Gly Leu Thr Asn Tyr Ala
85 90 95
Ala Ala Tyr Ala Thr Gly Leu Leu Leu Ala Arg Arg Thr Leu Ala Lys
100 105 110
Leu Gly Ile Ala Asp Lys Phe Gln Gly Ala Lys Glu Ala Asp Gly Ser
115 120 125
Tyr Ser Ala Val Arg Thr Lys Lys Asp Asp Glu Gly Asp Asp Glu Glu
130 135 140
Arg Phe Pro Phe Lys Ala Ile Leu Asp Val Gly Leu Ala Arg Thr Thr
145 150 155 160
Thr Gly Ala Arg Val Phe Gly Val Leu Lys Gly Ala Val Asp Gly Gly
165 170 175
Met Ala Val Pro His Arg Pro Asn Arg Phe Pro Gly Tyr Asn Lys Glu
180 185 190
Lys Ser Ser Leu Asp Ala Lys Val His Arg Asp Arg Ile Phe Gly Lys
195 200 205
His Val Ala Glu Tyr Leu Lys Gln Val Lys Glu Glu Ala Ser Ser Asn
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Pro Asp Glu Lys Cys Val Gln Phe Ser Arg Tyr Met Ala Ala Lys Val
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Leu Pro Glu Ser Ile Glu Gly Met Tyr Lys Lys Ala His Ala Ala Ile
245 250 255
Arg Ala Asp Pro Ser Lys Ser Leu Pro Lys Lys Ala Lys Lys Glu Gly
260 265 270
Val Ala His Lys Ser Tyr Lys Thr Lys Lys Leu Ser Gly Ala Glu Lys
275 280 285
Arg Ala Ala Ala Lys Ala Lys Val Ala Ala Ile Arg Glu Arg Leu Gly
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Lys
305
<210> 53
<211> 918
<212> DNA
<213> Leishmania infantum
<400> 53
atgccgttcg tcaaggtcgt gaagaacaag gcgtacttca agcgcttcca ggtgaagtac 60
cgccgtcgcc gcgagggcaa gacggactac cacgcgcgcc gccagatggt gctgcaggac 120
aagacgaagt tcggctcgcc caagtaccgc cttgttgtgc gcatcacgaa caaggacatc 180
attgcgcaga tcgtgcaggc gaagatcgtc ggcgacgagg tggtgatggc cgcgtacgcg 240
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<210> 54
<211> 305
<212> PRT
<213> Leishmania mexicana
<400> 54
Met Pro Phe Val Lys Val Val Lys Asn Lys Ala Tyr Phe Lys Arg Phe
1 5 10 15
Gln Val Lys Tyr Arg Arg Arg Arg Glu Gly Lys Thr Asp Tyr His Ala
20 25 30
Arg Arg Gln Met Val Leu Gln Asp Lys Thr Lys Phe Gly Ser Pro Lys
35 40 45
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65 70 75 80
His Glu Leu Pro Ala Phe Gly Ile Glu His Gly Leu Thr Asn Tyr Ala
85 90 95
Ala Ala Tyr Ala Thr Gly Leu Leu Leu Ala Arg Arg Thr Leu Ala Lys
100 105 110
Leu Gly Ile Ala Asp Lys Phe Gln Gly Ala Lys Glu Ala Asp Gly Ser
115 120 125
Tyr Ser Ala Val Arg Thr Lys Lys Asp Asp Glu Gly Asp Asp Glu Glu
130 135 140
Arg Phe Pro Phe Lys Ala Ile Leu Asp Val Gly Leu Ala Arg Thr Thr
145 150 155 160
Thr Gly Ala Arg Val Phe Gly Val Leu Lys Gly Ala Val Asp Gly Gly
165 170 175
Met Ala Val Pro His Arg Pro Asn Arg Phe Pro Gly Tyr Asn Lys Glu
180 185 190
Lys Ser Ser Leu Asp Ala Lys Val His Arg Asp Arg Ile Phe Gly Lys
195 200 205
His Val Ala Glu Tyr Leu Lys Gln Val Lys Glu Glu Ala Ser Ser Asn
210 215 220
Pro Asp Glu Lys Cys Val Gln Phe Ser Lys Tyr Met Ala Ala Lys Val
225 230 235 240
Leu Pro Glu Ser Ile Glu Gly Met Tyr Lys Lys Ala His Ala Ala Ile
245 250 255
Arg Ala Asp Pro Ser Lys Ser Leu Pro Lys Lys Ala Lys Lys Glu Ser
260 265 270
Val Ala His Lys Ser Tyr Lys Thr Lys Lys Leu Ser Gly Ala Glu Lys
275 280 285
Arg Ala Ala Ala Lys Ala Lys Val Ala Ala Ile Arg Glu Arg Leu Gly
290 295 300
Lys
305
<210> 55
<211> 918
<212> DNA
<213> Leishmania mexicana
<400> 55
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caccgcccca accgcttccc cggctacaac aaggagaaga gctcactgga cgcgaaggtg 600
caccgcgacc gcatctttgg caagcacgtt gcggagtacc tgaagcaggt gaaggaggag 660
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ttgccggaga gcatcgaggg catgtacaag aaggcgcacg cggcgatccg cgcggacccg 780
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gagcgcctcg gcaagtaa 918
<210> 56
<211> 305
<212> PRT
<213> Leishmania braziliensis
<400> 56
Met Pro Phe Val Lys Val Val Lys Asn Lys Ala Tyr Phe Lys Arg Phe
1 5 10 15
Gln Val Lys Tyr Arg Arg Arg Arg Glu Gly Lys Thr Asp Tyr His Ala
20 25 30
Arg Arg Gln Met Val Leu Gln Asp Lys Thr Lys Phe Gly Ser Pro Lys
35 40 45
Tyr Arg Leu Val Val Arg Thr Thr Asn Lys Asp Ile Ile Ala Gln Ile
50 55 60
Val Gln Ala Lys Ile Ala Gly Asp Glu Val Leu Met Ala Ala Tyr Ala
65 70 75 80
His Glu Leu Pro Ala Phe Gly Ile Glu His Gly Leu Thr Asn Tyr Ala
85 90 95
Ala Ala Tyr Ala Thr Gly Leu Leu Leu Ala Arg Arg Thr Leu Ala Lys
100 105 110
Leu Gly Ile Ala Asp Lys Phe Gln Gly Ala Lys Glu Ala Asp Gly Ser
115 120 125
Tyr Ser Ala Val Arg Thr Lys Lys Asp Asp Gln Gly Asp Asp Glu Ala
130 135 140
Arg Phe Pro Phe Lys Ala Ile Leu Asp Val Gly Leu Ala Arg Thr Thr
145 150 155 160
Thr Gly Ala Arg Val Phe Gly Val Leu Lys Gly Ala Val Asp Gly Gly
165 170 175
Ile Ser Val Pro His Arg Pro Asn Arg Phe Pro Gly Tyr Ser Lys Glu
180 185 190
Lys Ser Ala Leu Asp Ala Lys Val His Arg Asp Arg Ile Phe Gly Lys
195 200 205
His Val Ala Glu Tyr Leu Lys Gln Val Lys Glu Glu Ala Ser Ser Asn
210 215 220
Pro Asp Glu Lys Cys Val Gln Phe Ser Lys Tyr Met Glu Ala Lys Val
225 230 235 240
Ala Pro Glu Ser Ile Glu Cys Met Tyr Lys Lys Ala His Ala Ala Ile
245 250 255
Arg Ala Asp Pro Ser Lys Ser Leu Pro Lys Lys Ala Lys Lys Glu Gly
260 265 270
Ala Lys His Lys Ser Tyr Lys Thr Lys Lys Met Ser Gly Ala Glu Lys
275 280 285
Arg Ala Ala Ala Lys Ala Lys Val Ala Ala Ile Arg Glu Arg Leu Gly
290 295 300
Lys
305
<210> 57
<211> 29
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> primer
<400> 57
cgggatccat gtctcactgc aagttcgag 29
<210> 58
<211> 30
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> primer
<400> 58
gcgatatctc ccttcttcgc ggcctttgcc 30
<210> 59
<211> 32
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> primer
<400> 59
gcgatatcgg gatggccaag aagcacctca ag 32
<210> 60
<211> 28
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> primer
<400> 60
cggaattctc ccttgcgggc cctgcggg 28
<210> 61
<211> 32
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> primer
<400> 61
cggaattcgg gatgaagctc aacatcgcgt ac 32
<210> 62
<211> 32
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> primer
<400> 62
gcgatatctc ccttcttctg gaatgctgcc ac 32
<210> 63
<211> 31
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> primer
<400> 63
gcgatatcgg gatgtgcacg ctggcaaatt g 31
<210> 64
<211> 34
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> primer
<400> 64
ggggtaccgg atccttactt gccgaggcgc tcgc 34
<210> 65
<211> 918
<212> DNA
<213> Leishmania braziliensis
<400> 65
atgccgttcg tcaaggtcgt gaagaacaag gcgtacttca agcgcttcca ggtgaagtac 60
cgccgtcgcc gcgagggcaa gacggactac cacgcacgcc gccagatggt gctgcaggac 120
aagacgaagt ttggctcacc caagtaccgc cttgttgtgc gcacgacgaa caaggacatc 180
attgcgcaga tcgtgcaggc gaagatcgcc ggcgacgagg tgctgatggc tgcgtacgcg 240
cacgagctgc ctgcgttcgg gattgagcac ggcctgacga actacgctgc ggcgtacgcg 300
acgggcctgc tgctggcgcg ccgcacgctg gcgaagttgg gcatcgcgga caagttccag 360
ggcgcgaagg aggcggacgg ctcgtactct gctgtgcgca cgaagaagga cgaccagggc 420
gacgacgagg cgcgcttccc gttcaaggcg atcctggacg ttggtcttgc gcgcacgacg 480
acgggtgccc gcgtgttcgg cgtgctgaag ggcgctgtgg acggcggcat ctcggtgccg 540
caccgcccca accgcttccc cggctacagc aaggagaaga gcgccctgga cgcgaaggtg 600
caccgtgacc gcatcttcgg caagcacgtt gcggagtacc tgaagcaggt gaaggaggag 660
gcgagctcga accctgacga gaagtgcgtg cagttctcga agtacatgga ggcgaaggtt 720
gcgccagaga gcatcgagtg catgtacaag aaggcacacg cggcgatccg cgcggacccg 780
tcgaagtcgc tgccgaagaa ggcgaagaag gagggcgcca agcacaagag ctacaagacg 840
aagaagatga gcggcgcgga gaagagggcc gccgcgaagg cgaaggtcgc cgccattcgc 900
gagcgccttg gcaagtga 918
<210> 66
<211> 3846
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Chimeric DNA encoding L3-S4-S6-L5
<400> 66
atgtctcact gcaagttcga gcacccccgc cacggccatc tcggcttcct gccgcgcaag 60
cgctcgcgcc agatccgcgg ccgtgcgcgc gcgttcccca aggacgacgc gacgcagaag 120
ccccacctga cgagcttcat ggtgttcaag gccggtatga cgcacattgt gcgtgatgtc 180
gatcgccctg gatcgaaggt gaacaagaag gaagtggtgg agccggtgac gatcctggag 240
gcgccgccga tggtgattgt cggcattgtg ggctaccgcc aaacgccggt tggcctgaag 300
acgatcggca ccgtgtgggc gcaccacacg agcgtcgagt tccgccgccg ctactacaag 360
aactggaagc agtctgcgca actggccttc tcccgccaga agcagtttgc gaacacgaag 420
gagggcaagg tcgccgaggc gcgcacgctg aacgcgttcg cgaagaaggc gtccgtcatc 480
cgcgtgatcg cgcacacgca gctgcgcaag cttcgcaacc accgcgtggg cgtgaagaag 540
gcgcacgtgc aggagatcca ggtcaacggc ggcagcgttg cggcgaagat cgcgctggcc 600
aagtccctgc tggagaagga ggtgcgcgtc gactccgtgt tccagcagtc cgaggcgtgc 660
gacgtgtgct ccgtcacgaa aggccacggt acggagggcg tggtgaagcg ctggggcgtt 720
gcctgcctgc cacgcaagac gcaccgcggt ctgcgcaagg ttgcgtgcat cggcgcgtgg 780
caccctgccc gcgtcatgta cactgtcgcg cgcgccggtc agcacggtta ccaccaccgc 840
acgcagctga acaagaagat ctaccagatc ggccgctccg ttgctgtgga gccgaaccag 900
gcgacgacga cctacgatct gacagccaag acgatcacgc ccatgggtgg cttcgtcggc 960
tacggtacgg tgcgcaacga ctacgtgatg ctgaagggct ccgtgtctgg cccgcgccgc 1020
cgtgtgatga cgctgcgccg cccgatggcg ccgcagacgt cgcgccagct gaaggagaag 1080
atcgtgctga agttcatcga cacgagctcg aagatcggcc acggccgctt ccagacgaag 1140
aaggagaaga accagtggtt cggcccgctc aagaaggacc gcatccgccg cgaggagcgc 1200
ctgcgcaagg agcgcgctgc ccgcgccgtg gagcgcaagg caaaggccgc gaagaaggga 1260
gatatcggga tggccaagaa gcacctcaag cgcttgtatg cgcccaagga ctggatgctg 1320
agcaagctga ccggcgtgtt cgcgccgcgt ccgcgtccgg gtccgcacaa gctgcgcgag 1380
tgcctgccgc tgctggtgat catccgcaac cggctgaagt acgcgctgaa cgcgcgcgag 1440
ggtgagatga tcctgcgcca gggtctggtg cacgtggaca accacccgcg ccgcgacggc 1500
aagtatcccg ccggtttcat ggacgtggtc gagatcccga agacgggcga ccgcttccgc 1560
ctgatgtacg acgtcaaggg ccgcttcgcg ttggtgaacc tgtccgaggc ggaggcgcag 1620
atcaagctga tgaaggttgt gaacctgtac acggccaccg gccgcgtgcc ggtcgctgtg 1680
acgcacgacg gccaccgcat ccgctacccg gacccgcaca cctccattgg tgacaccatc 1740
gtgtacaacg tcaaggagaa gaagtgcgtg gacctgatca agaaccgcca gggcaaggcc 1800
gtgatcgtga ccggtggcgc caaccgcggc cgcatcggcg agatcgtgaa ggtggagtgc 1860
caccccggtg cgttcaacat tgcgcacctg aaggacgcgt ccggcgccga gttcgccacc 1920
cgcgccgcga acatcttcgt gatcggcaag gacctgaaca acctgcaggt aacggtgccg 1980
aagcagcagg gcctgcgcat gaacgtgatc caggagcgcg aggagcgcct gatcgcggcg 2040
gaggcccgca agaacgcgcc ggctcgtggt gcccgcaggg cccgcaaggg agaattcggg 2100
atgaagctca acatcgcgta cccccgcaac gggacggtga agcagttcga gatctcggac 2160
gaggtgctcc gccgcgtgca gctgcaggac taccgcctcg gcaacgaggt ggacggcgcc 2220
atctttggta gcgagttcaa gggctacatc ttccgcctgc gcggtggctc ggacaaggat 2280
ggtttcccga tggtccctgg cgtgcttgcc tccagccgtg tgtcgctgct ggtgaagcgc 2340
ggtgcgatcg gcttcaacac cttccgcggc taccagggtg agcgccgccg caagaacgtt 2400
cgcggctgcg tgctcgcgag cgacattgcg ctggtgaacg tgaccatctc caaggtcggt 2460
gaccagccga tcgagggtgt gacggacacc acggctcccc gccgtctggg tccgaagcgc 2520
gcgagcaaga tccgcaagct cttcaacctg tcccgcaccg aagacgtgcg gaagtacgtt 2580
gttcgccgcc gcgtcgtgaa gagcggcaag aaggaccggc tgaaggcccc gaagatccag 2640
cgtctgatca cgccgagggt caaggcccgc cgtgccaaga aggccaagga cgccatcgcc 2700
aaggtgcgcg cgtctgccgc tgagcgccgt gagtacctgc gccttatcgc ctcgaaccgc 2760
cgtgcgctgc gccagcgtga ccactccaag aagcacaccc ggaaggtgca cgcccagcgc 2820
gctgaggtgg cagcattcca gaagaaggga gatatcggga tgtgcacgct ggcaaattgg 2880
gtacgcgcta tcatcaagaa acactcaaca ctcgcccaca cactcgagat gccgttcgtc 2940
aaggtcgtga agaacaaggc gtacttcaag cgcttccagg tgaagtaccg ccgtcgccgc 3000
gagggcaaga cggactacca cgcgcgccgg cagatggtgc tgcaggacaa gacgaagttc 3060
ggctcgccca agtaccgcct tgttgtgcgc atcacgaaca aggacatcat tgcgcagatc 3120
gtgcaggcga agatcgtcgg cgacgaggtg gtgatggccg cgtacgcgca cgagctgcct 3180
gcgttcggca ttgagcacgg cctgacaaac tacgctgctg cgtacgcgac tggtctgctg 3240
ctggcgcgcc gcacgctggc gaagctgggc atcgcggaca agttccaggg cgcgaaggag 3300
gcggacggct cgtactctgc tgtgcgcacg aagaaggacg acgagggcga cgacgaggag 3360
cgctttccgt tcaaggcgat cctggacgtc ggccttgcgc gcacgacgac cggcgcccgc 3420
gtgttcggcg tgctgaaggg cgcggtggac ggcggtatgg ctgtgccgca ccgccccaac 3480
cgcttccccg gctacaacaa ggagaagagc tcgctggacg cgaaggtgca ccgcgaccgc 3540
atctttggca agcacgtggc ggactacctg aagcaggtga aggaggaggc gagctcgaac 3600
cctgacgaga agtgcgtgca gttctcgaag tacatggccg cgaaggtttt gccggagagc 3660
atcgagggca tgtacaagaa ggcgcacgcg gcgatccgcg cggacccgtc gaagtcgctg 3720
ccgaagaagg cgaagaagga gggcgtcgcg cacaagagct acaagacgaa gaagctgagc 3780
ggcgcggaga agagggccgc cgcgaaggcg aaggtcgcgg ccatccgcga gcgcctcggc 3840
aagtaa 3846
<210> 67
<211> 1281
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Chimeric protein L3-S4-S6-L5
<400> 67
Met Ser His Cys Lys Phe Glu His Pro Arg His Gly His Leu Gly Phe
1 5 10 15
Leu Pro Arg Lys Arg Ser Arg Gln Ile Arg Gly Arg Ala Arg Ala Phe
20 25 30
Pro Lys Asp Asp Ala Thr Gln Lys Pro His Leu Thr Ser Phe Met Val
35 40 45
Phe Lys Ala Gly Met Thr His Ile Val Arg Asp Val Asp Arg Pro Gly
50 55 60
Ser Lys Val Asn Lys Lys Glu Val Val Glu Pro Val Thr Ile Leu Glu
65 70 75 80
Ala Pro Pro Met Val Ile Val Gly Ile Val Gly Tyr Arg Gln Thr Pro
85 90 95
Val Gly Leu Lys Thr Ile Gly Thr Val Trp Ala His His Thr Ser Val
100 105 110
Glu Phe Arg Arg Arg Tyr Tyr Lys Asn Trp Lys Gln Ser Ala Gln Leu
115 120 125
Ala Phe Ser Arg Gln Lys Gln Phe Ala Asn Thr Lys Glu Gly Lys Val
130 135 140
Ala Glu Ala Arg Thr Leu Asn Ala Phe Ala Lys Lys Ala Ser Val Ile
145 150 155 160
Arg Val Ile Ala His Thr Gln Leu Arg Lys Leu Arg Asn His Arg Val
165 170 175
Gly Val Lys Lys Ala His Val Gln Glu Ile Gln Val Asn Gly Gly Ser
180 185 190
Val Ala Ala Lys Ile Ala Leu Ala Lys Ser Leu Leu Glu Lys Glu Val
195 200 205
Arg Val Asp Ser Val Phe Gln Gln Ser Glu Ala Cys Asp Val Cys Ser
210 215 220
Val Thr Lys Gly His Gly Thr Glu Gly Val Val Lys Arg Trp Gly Val
225 230 235 240
Ala Cys Leu Pro Arg Lys Thr His Arg Gly Leu Arg Lys Val Ala Cys
245 250 255
Ile Gly Ala Trp His Pro Ala Arg Val Met Tyr Thr Val Ala Arg Ala
260 265 270
Gly Gln His Gly Tyr His His Arg Thr Gln Leu Asn Lys Lys Ile Tyr
275 280 285
Gln Ile Gly Arg Ser Val Ala Val Glu Pro Asn Gln Ala Thr Thr Thr
290 295 300
Tyr Asp Leu Thr Ala Lys Thr Ile Thr Pro Met Gly Gly Phe Val Gly
305 310 315 320
Tyr Gly Thr Val Arg Asn Asp Tyr Val Met Leu Lys Gly Ser Val Ser
325 330 335
Gly Pro Arg Arg Arg Val Met Thr Leu Arg Arg Pro Met Ala Pro Gln
340 345 350
Thr Ser Arg Gln Leu Lys Glu Lys Ile Val Leu Lys Phe Ile Asp Thr
355 360 365
Ser Ser Lys Ile Gly His Gly Arg Phe Gln Thr Lys Lys Glu Lys Asn
370 375 380
Gln Trp Phe Gly Pro Leu Lys Lys Asp Arg Ile Arg Arg Glu Glu Arg
385 390 395 400
Leu Arg Lys Glu Arg Ala Ala Arg Ala Val Glu Arg Lys Ala Lys Ala
405 410 415
Ala Lys Lys Gly Asp Ile Gly Met Ala Lys Lys His Leu Lys Arg Leu
420 425 430
Tyr Ala Pro Lys Asp Trp Met Leu Ser Lys Leu Thr Gly Val Phe Ala
435 440 445
Pro Arg Pro Arg Pro Gly Pro His Lys Leu Arg Glu Cys Leu Pro Leu
450 455 460
Leu Val Ile Ile Arg Asn Arg Leu Lys Tyr Ala Leu Asn Ala Arg Glu
465 470 475 480
Gly Glu Met Ile Leu Arg Gln Gly Leu Val His Val Asp Asn His Pro
485 490 495
Arg Arg Asp Gly Lys Tyr Pro Ala Gly Phe Met Asp Val Val Glu Ile
500 505 510
Pro Lys Thr Gly Asp Arg Phe Arg Leu Met Tyr Asp Val Lys Gly Arg
515 520 525
Phe Ala Leu Val Asn Leu Ser Glu Ala Glu Ala Gln Ile Lys Leu Met
530 535 540
Lys Val Val Asn Leu Tyr Thr Ala Thr Gly Arg Val Pro Val Ala Val
545 550 555 560
Thr His Asp Gly His Arg Ile Arg Tyr Pro Asp Pro His Thr Ser Ile
565 570 575
Gly Asp Thr Ile Val Tyr Asn Val Lys Glu Lys Lys Cys Val Asp Leu
580 585 590
Ile Lys Asn Arg Gln Gly Lys Ala Val Ile Val Thr Gly Gly Ala Asn
595 600 605
Arg Gly Arg Ile Gly Glu Ile Val Lys Val Glu Cys His Pro Gly Ala
610 615 620
Phe Asn Ile Ala His Leu Lys Asp Ala Ser Gly Ala Glu Phe Ala Thr
625 630 635 640
Arg Ala Ala Asn Ile Phe Val Ile Gly Lys Asp Leu Asn Asn Leu Gln
645 650 655
Val Thr Val Pro Lys Gln Gln Gly Leu Arg Met Asn Val Ile Gln Glu
660 665 670
Arg Glu Glu Arg Leu Ile Ala Ala Glu Ala Arg Lys Asn Ala Pro Ala
675 680 685
Arg Gly Ala Arg Arg Ala Arg Lys Gly Glu Phe Gly Met Lys Leu Asn
690 695 700
Ile Ala Tyr Pro Arg Asn Gly Thr Val Lys Gln Phe Glu Ile Ser Asp
705 710 715 720
Glu Val Leu Arg Arg Val Gln Leu Gln Asp Tyr Arg Leu Gly Asn Glu
725 730 735
Val Asp Gly Ala Ile Phe Gly Ser Glu Phe Lys Gly Tyr Ile Phe Arg
740 745 750
Leu Arg Gly Gly Ser Asp Lys Asp Gly Phe Pro Met Val Pro Gly Val
755 760 765
Leu Ala Ser Ser Arg Val Ser Leu Leu Val Lys Arg Gly Ala Ile Gly
770 775 780
Phe Asn Thr Phe Arg Gly Tyr Gln Gly Glu Arg Arg Arg Lys Asn Val
785 790 795 800
Arg Gly Cys Val Leu Ala Ser Asp Ile Ala Leu Val Asn Val Thr Ile
805 810 815
Ser Lys Val Gly Asp Gln Pro Ile Glu Gly Val Thr Asp Thr Thr Ala
820 825 830
Pro Arg Arg Leu Gly Pro Lys Arg Ala Ser Lys Ile Arg Lys Leu Phe
835 840 845
Asn Leu Ser Arg Thr Glu Asp Val Arg Lys Tyr Val Val Arg Arg Arg
850 855 860
Val Val Lys Ser Gly Lys Lys Asp Arg Leu Lys Ala Pro Lys Ile Gln
865 870 875 880
Arg Leu Ile Thr Pro Arg Val Lys Ala Arg Arg Ala Lys Lys Ala Lys
885 890 895
Asp Ala Ile Ala Lys Val Arg Ala Ser Ala Ala Glu Arg Arg Glu Tyr
900 905 910
Leu Arg Leu Ile Ala Ser Asn Arg Arg Ala Leu Arg Gln Arg Asp His
915 920 925
Ser Lys Lys His Thr Arg Lys Val His Ala Gln Arg Ala Glu Val Ala
930 935 940
Ala Phe Gln Lys Lys Gly Asp Ile Gly Met Cys Thr Leu Ala Asn Trp
945 950 955 960
Val Arg Ala Ile Ile Lys Lys His Ser Thr Leu Ala His Thr Leu Glu
965 970 975
Met Pro Phe Val Lys Val Val Lys Asn Lys Ala Tyr Phe Lys Arg Phe
980 985 990
Gln Val Lys Tyr Arg Arg Arg Arg Glu Gly Lys Thr Asp Tyr His Ala
995 1000 1005
Arg Arg Gln Met Val Leu Gln Asp Lys Thr Lys Phe Gly Ser Pro
1010 1015 1020
Lys Tyr Arg Leu Val Val Arg Ile Thr Asn Lys Asp Ile Ile Ala
1025 1030 1035
Gln Ile Val Gln Ala Lys Ile Val Gly Asp Glu Val Val Met Ala
1040 1045 1050
Ala Tyr Ala His Glu Leu Pro Ala Phe Gly Ile Glu His Gly Leu
1055 1060 1065
Thr Asn Tyr Ala Ala Ala Tyr Ala Thr Gly Leu Leu Leu Ala Arg
1070 1075 1080
Arg Thr Leu Ala Lys Leu Gly Ile Ala Asp Lys Phe Gln Gly Ala
1085 1090 1095
Lys Glu Ala Asp Gly Ser Tyr Ser Ala Val Arg Thr Lys Lys Asp
1100 1105 1110
Asp Glu Gly Asp Asp Glu Glu Arg Phe Pro Phe Lys Ala Ile Leu
1115 1120 1125
Asp Val Gly Leu Ala Arg Thr Thr Thr Gly Ala Arg Val Phe Gly
1130 1135 1140
Val Leu Lys Gly Ala Val Asp Gly Gly Met Ala Val Pro His Arg
1145 1150 1155
Pro Asn Arg Phe Pro Gly Tyr Asn Lys Glu Lys Ser Ser Leu Asp
1160 1165 1170
Ala Lys Val His Arg Asp Arg Ile Phe Gly Lys His Val Ala Asp
1175 1180 1185
Tyr Leu Lys Gln Val Lys Glu Glu Ala Ser Ser Asn Pro Asp Glu
1190 1195 1200
Lys Cys Val Gln Phe Ser Lys Tyr Met Ala Ala Lys Val Leu Pro
1205 1210 1215
Glu Ser Ile Glu Gly Met Tyr Lys Lys Ala His Ala Ala Ile Arg
1220 1225 1230
Ala Asp Pro Ser Lys Ser Leu Pro Lys Lys Ala Lys Lys Glu Gly
1235 1240 1245
Val Ala His Lys Ser Tyr Lys Thr Lys Lys Leu Ser Gly Ala Glu
1250 1255 1260
Lys Arg Ala Ala Ala Lys Ala Lys Val Ala Ala Ile Arg Glu Arg
1265 1270 1275
Leu Gly Lys
1280
<210> 68
<211> 399
<212> DNA
<213> Leishmania infantum
<400> 68
atggctactc ctcgcagcgc caagaaggcc gtccgcaaga gcggctccaa gtccgcgaaa 60
tgtggtctga tcttcccggt gggccgcgtc ggcgggatga tgcgccgcgg ccagtacgct 120
cgccgcatcg gtgcctctgg cgccgtgtac ctggccgccg tgctggagta cctgacggcg 180
gagctgctgg agctgtccgt gaaggcggcc gcgcagagcg ggaagaagcg gtgccgcctg 240
aacccgcgca ccgtgatgct ggccgcgcgc cacgacgacg acatcggcac gcttctgaag 300
aacgtgacct tgtctcacag cggcgttgtg ccgaacatca gcaaggcgat ggcaaagaag 360
aagggcggca agaagggcaa ggcgacaccg agcgcgtaa 399
<210> 69
<211> 336
<212> DNA
<213> Leishmania infantum
<400> 69
atggcctctt ctcgctctgc tccccgcaag gcttcccacg cgcacaagtc gcaccgcaag 60
ccgaagcgct cgtggaacgt gtacgtgggc cgctcgctga aggcgatcaa cgcccagatg 120
tcgatgtcgc accgcacgat gagcatcgtg aactcgtacg tgaacgacgt gatggagcgc 180
atctgcatgg aggccgcgtc gatcgttcgc gcgaacaaga agcgcacgtt gggtgcgcgc 240
gaggtgcaga cggcggtgcg cattgtgctg ccggcggagc tcgcgaagca cgccatggct 300
gagggcacga aggccgtgtc gagcgcgtcg gcttga 336
<210> 70
<211> 390
<212> DNA
<213> Leishmania infantum
<400> 70
atgtcccgca ccaaggagac cgcccgcgcg aagcgcacca tcacgtcgaa gaagagcaag 60
aaggcgccga gcggggcgtc cggcgtgaag aggtcgcatc gccgctggcg cccgggcacc 120
tgcgcgatcc gcgagatccg caagttccag aagagtacga gcctgctgat ccagtgcgcg 180
ccgttccagc gcctggtgcg aggtgtcgag cggcagaagg agggcctgcg cttccagagc 240
agcgctatca tggcgctgca ggaggcgacg gaggcgtaca ttgtgtcgct gatggcggac 300
acgaacctcg cctgcatcca cgcgaagcgc gtgacgatcc agccgaagga catccagctg 360
gcgctgcgcc tgcgcggtga gcgccactag 390
<210> 71
<211> 303
<212> DNA
<213> Leishmania infantum
<400> 71
atggccaagg gcaagcgttc cactgatgcc aagggcagcc agaggcgcca gaagaaggtg 60
ctgcgcgaca acatccgcgg catcactcgc ggctgcgtcc gccgcatggc gcgccgcggt 120
ggcgtgaagc gcatctcgac cgaggtgtac gaagaggtgc gccgtgtgct gaaggcctac 180
gtggaggaca ttgtgcgctg cagcacggcc tacaccgagt acgcgcgcaa gaagaccgtg 240
acggcgtgcg atgttgtgac cgcgctgcgc aagcaaggcc acatcctgta cggctacgcg 300
taa 303
<210> 72
<211> 336
<212> DNA
<213> Leishmania infantum
<400> 72
atgtccacca agtacctcgc cgcgtacgct ctggcctccc tgagcaaggc gtccccgtct 60
caggcggacg tggaggctat ctgcaaggcc gtccacatcg acgtcgacca ggccaccctc 120
gcctttgtga tggagagcgt tacgggacgc gacgtggcca ccctgatcgc ggagggcgcc 180
gcgaagatga gcgcgatgcc ggcggccagc tctggtgccg ctgctggcgt cactgcttcc 240
gctgcgggtg atgcggcccc ggctgccgcc gccgcgaaga aggacgagcc cgaggaggag 300
gccgacgacg acatgggctt cggtctgttc gactaa 336
<210> 73
<211> 972
<212> DNA
<213> Leishmania infantum
<400> 73
atgccgtcta tcaccactgc caagcgcgag tacgaggagc gcctcgtcga ctgcctgacc 60
aagtacagct gcgtgctgtt cgtgggcatg gacaacgtcc gctcgcagca ggtgcacgat 120
gtcggccgtg cgctgcgcgc gaaggccgag ttcatgatgg gcaagaagac gctgcagggc 180
aagatcgtgg agaagcgcgc gcaagccaag gacgcgagcc ccgaggcgaa gcacttcaac 240
gatcagtgtg aggagtacaa cctgctgagc ggcaacaccg gcctcatctt cacgaacaac 300
gctgtccagg agatcacgtc tgtgcttgac gcgcaccgcg tgaagcgcgc ggcgcgtgtc 360
ggagcgattt ccccgtgtga cgtgattgtc gctgctggca gcaccggcat ggagccgacc 420
cagacgtcct tcttccaggc gctgaacatt gcgacgaaga ttgccaaggg tatggtggag 480
atcgtgacgg agaagaaggt gctgagcgtc ggcgacaagg tggacaactc gacggcgacg 540
ctgctgcaaa agctgaacat cagcccgttc tactaccagg tgaatgtgct gtccgtgtgg 600
gaccgcggtg tgctgttcac ccgcgaggac ctgatgatga cggaggacat ggtggagaag 660
atgctgatgg aaggcctgag caacgttgcg gcgatggcgc tgggtgctgg catcccgacg 720
tcttcgacga ttggcccgat gctggtggac gccttcaaga acctgctggc tgtctctgtg 780
gcgacctcgt acgagttcga ggagcacaac ggcaaggagc tgcgcgaggc cgcgatcaac 840
ggcctgctgg ccggctcttg ctcggctgct gcggagcccg ccgctgccgc gccggccgcc 900
cctagcgccg ctgccaagga ggagccggag gagagcgacg aggacgactt cggcatgggc 960
ggtctcttct aa 972

Claims (22)

1.表现出免疫性能的L5源在制备用于治疗或预防或延缓受试对象利什曼病的药物中的用途，
其中，L5源为氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的多肽和/或由如SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列编码的多肽；或者，所述L5源为如核苷酸序列SEQ ID NO:4所示的核酸和/或编码如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的核酸。
2.根据权利要求1所述的用途，其中，S4和/或S6和/或L3源与所述L5源组合，S4、S6和L3源均表现出免疫性能，其中，所述S4源为如氨基酸序列SEQ ID NO:32所示的多肽和/或由如SEQ ID NO:33所示的核苷酸序列编码的多肽；或者，所述S4源为如核苷酸序列SEQ ID NO:33所示的核酸和/或编码如SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列的核酸；和/或
所述S6源为如氨基酸序列SEQ ID NO:34所示的多肽和/或由如SEQ ID NO:35所示的核苷酸序列编码的多肽；或者，所述S6源为如核苷酸序列SEQ ID NO:35所示的核酸和/或编码如SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列的核酸；和/或
所述L3源为如氨基酸序列SEQ ID NO:1所示的多肽和/或由如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列编码的多肽；或者，所述L3源为如核苷酸序列SEQ ID NO:2所示的核酸和/或编码如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的核酸。
3.根据权利要求1或2所述的用途，其中，存在佐药。
4.根据权利要求1或2所述的用途，其中，如权利要求1或2所定义的L3和/或L5和/或S4和/或S6源为疫苗。
5.根据权利要求1或2所述的用途，其中，L3和/或L5和/或S4和/或S6源为蛋白质、蛋白片段、肽、核酸。
6.根据权利要求3所述的用途，其中，所述佐药为Th1-促进佐药。
7.根据权利要求6所述的用途，其中，所述Th1-促进佐药为CpG ODN。
8.一种包括如权利要求1所定义的L5源的组合物。
9.根据权利要求8所述的组合物，其中，所述组合物包括如权利要求2所定义的S4和/或S6和/或L3源。
10.根据权利要求8或9所述的组合物，其中，所述组合物进一步包括佐药。
11.根据权利要求10所述的组合物，其中，所述佐药为Th1-促进佐药。
12.根据权利要求11所述的组合物，其中，所述Th1-促进佐药为CpGODN。
13.根据权利要求8所述的组合物，其中，所述组合物进一步包括制药可接受的佐药和/或载体。
14.根据权利要求8所述的组合物，该组合物用作药物。
15.根据权利要求14所述的组合物，其中，所述药物为疫苗。
16.L5源在制备用于在体外诊断受试对象利什曼病的设备中的用途，其中，所述L5源为如氨基酸序列SEQ ID NO:3所示的多肽和/或由如SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列编码的多肽；或者，所述L5源为如核苷酸序列SEQ ID NO:4所示的核酸和/或编码如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的核酸。
17.根据权利要求16所述的用途，其中，进一步使用S4和/或S6和/或L3源，其中，所述S4源为如氨基酸序列SEQ ID NO:32所示的多肽和/或由如SEQ ID NO:33所示的核苷酸序列编码的多肽；或者，所述S4源为如核苷酸序列SEQ ID NO:33所示的核酸和/或编码如SEQ IDNO:32所示的氨基酸序列的核酸；和/或
所述S6源为如氨基酸序列SEQ ID NO:34所示的多肽和/或由如SEQ ID NO:35所示的核苷酸序列编码的多肽；或者，所述S6源为如核苷酸序列SEQ ID NO:35所示的核酸和/或编码如SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列的核酸；和/或
所述L3源为如氨基酸序列SEQ ID NO:1所示的多肽和/或由如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列编码的多肽；或者，所述L3源为如核苷酸序列SEQ ID NO:2所示的核酸和/或编码如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的核酸。
18.根据权利要求1、2、16和17中任意一项所述的用途，其中，如权利要求1、2、16或17所定义的L3和/或L5和/或S4和/或S6源从硕大利什曼原虫(Leishmania major)中获得。
19.根据权利要求1所述的用途，其中，所述利什曼病由除L5源来源的物种外的不同物种引起。
20.一种诊断受试对象利什曼病的分析设备，其中，该设备包括如权利要求16所定义的L5源。
21.根据权利要求20所述的分析设备，其中，如权利要求17所定义的S4和/或S6和/或L3源也存在于所述设备中。
22.根据权利要求20或21所述的分析设备，其中，所述分析为ELISA。
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