CN107405395A - 疫苗与佐剂的组合物以及治疗尿路感染的方法 - Google Patents

Abstract

本发明描述了新的佐剂组合物和制剂，其在冷藏和室温下以及在达到和约37℃下具有极好的稳定性，可以以显著低的成本生产。本发明描述了新的疫苗组合物和制剂，来治疗和预防由革兰氏阴性细菌包括大肠杆菌和多药物抗性大肠杆菌所引起的尿路感染。本发明还描述了施用所述新的疫苗组合物和制剂的方法，以及预防和治疗由革兰氏阴性细菌包括大肠杆菌和多药物抗性大肠杆菌引起的尿路感染的治疗方法。

Description

疫苗与佐剂的组合物以及治疗尿路感染的方法

发明背景

发明领域

本发明提供了新的佐剂组合物和制剂，其在冷藏和室温下以及还在达到约37℃下具有极好的稳定性，可以以显著低的成本生产。这些新的佐剂组合物和制剂被用于疫苗，展现了增强对抗原的免疫反应的优越性质，同时引起更少的严重的注射位置和全身性反应。本发明还描述了新的疫苗组合物和制剂，来治疗和预防由革兰氏阴性细菌包括大肠杆菌和多药物抗性大肠杆菌(E.coli)所引起的尿路感染。本发明还提供了施用所述新的疫苗制剂的方法，以及预防和治疗由革兰氏阴性细菌包括大肠杆菌和多药物抗性大肠杆菌引起的尿路感染的治疗方法。

相关技术说明

在美国和其他国家，通过使用疫苗来保护大多数人群免于许多传染性疾病。仅举几个例子，疫苗保护人免于传染性疾病，例如，白喉、破伤风、百日咳、肝炎、流感和脊髓灰质炎。社会依赖于疫苗所提供的保护，这使得大部分这些传染性疾病仅是美国公民历史的一部分。实际上，在美国，疾病控制中心(CDC)实施了儿童疫苗计划，其在2010年为对于4千万儿童提供了免费的接种。这些儿童的大约70％加入了医疗补助计划。为了防止疾病的爆发和降低治疗这些传染性疾病的成本，美国已经使疫苗接种具有独立于经济状态的国家优先性。低成本的疫苗是急需的，在现在和可预见的将来，这些疫苗具有国家优先性。

考虑到疫苗的重要性，很明显需要继续开发新的和改进的疫苗，来改善我们的人群的健康状态。更关键的是需要提供更低成本的疫苗来帮助降低美国卫生系统的扶摇直上的成本。国家优先性是要降低美国卫生系统的成本。

即使在美国，造成这些困难是符合疫苗保存要求。由卫生和公共事业部(HHS)的监察长办公室所进行的并于2012年报道的一项研究(OEI-04-10-00430)发现，参与CDC的儿童疫苗计划的供应商：1.)将疫苗暴露于这些疫苗被批准的温度范围以外的温度下：2.)将疫苗保存在它们被批准的温度范围之外的温度下保存在冷柜和冷冻库中；以及3.)将到期的疫苗与未到期疫苗保存在一起。

疫苗的其他问题在于，疫苗可能具有短的贮存寿命，容易在使用之前到期。

此外，监察长办公室进行的上述研究发现，儿童疫苗计划的46名美国卫生供应商中的16名将到期的疫苗与未到期的疫苗保存在一起。平均起来，这些到期的疫苗已经过期约6个月。例如，据报导在2010年7月1日耗费了约2亿6千万美元生产的4千万份未使用的家猪流感疫苗到期并被销毁。在美国每年疫苗到期产生了巨大的经济损失。

佐剂增强了对疫苗的抗原的免疫反应。在美国由CDC实施的儿童疫苗计划中提供了34种疫苗中，20种含有佐剂。这20种具有佐剂的疫苗中，19种疫苗含有白矾佐剂，1种疫苗含有吸附到白矾的单磷酰基脂质A(GSK的MPL)作为佐剂。

尽管全行业尝试开发新的佐剂，目前在美国只有白矾和GSK的MPL用于批准的疫苗。在美国许多佐剂开发遭遇失败，但对新的和有效的佐剂的需求仍然很高。

含有吸附到白矾的3'-O-脱酰基-4'-单磷酰基脂质A的葛兰素史克(GSK)的Cervarix疫苗在美国被批准用于预防由人类乳头状瘤病毒引起的子宫颈癌。由于生产MPL的起始材料分离自沙门氏菌(Salmonella minnesota)，最终产品是六酰基、五酰基和四酰基类似物的动态的复杂混合物；这些类似物的每一种在生物学活性方面都不同。结果，3'-O-脱酰基-4'-单磷酰基脂质A呈现了制造、测试和使用上的挑战，其大大提高了疫苗的成本和供应问题。

除了保存问题之外，疫苗注射对受试者而言经常是痛苦的。在疫苗的施用之后可能发生注射部位的发红、膨胀、痒和触痛。含有MPL和白矾佐剂的GSK的Cervarix疫苗处方信息列出了局部有害事件，其可能包括疼痛、发红和肿胀。在接受了GSK的Cervarix疫苗或单独的佐剂白矾的受试者中约百分之8报告了妨碍日常生活动作的局部疼痛。在施用含有MPL和白矾佐剂的疫苗之后观察到的全身性不良反应包括头痛、疲劳、发热、皮疹、肌肉痛、关节痛、荨麻疹和消化系统症状，包括恶心、呕吐、腹泻和/或腹痛。

此外，在中“Clinical Review of Human Papillomavirus Bivalent(Types 16and 18)vaccine[GSK's Cervarix Vaccine]，Recombinant，Biologies LicenseApplication Efficacy Supplement”描述的，四项研究报告了局部有害事件，包括在大约百分之16的受试者中妨碍运动的局部疼痛。在大约百分之3的受试者中也报告了大于50mm的肿胀。对于关节痛、疲劳、胃肠、头痛和肌肉痛，这四项研究报道了百分之2.4到7.8的全身性的严重有害事件。

注射部位反应和全身性反应的严重度是重要的，需要涉及麻醉剂使用、IV水化或其他医师实施的处置，以及来自于防止由腹泻、肌肉痛、疲劳、头痛和呕吐的日常活动带来的工作损失。

免疫实践顾问委员会(Advisory Committee on Immunization Practices)建立了流行性感冒的国家策略的建议。这种策略包括“在大流行宣告的6个月内向所有美国居民提供大流行病疫苗：大流行病疫苗(6亿剂)[大流行性流感的国家策略(2005年11月)和HHS大流行性感冒规划(2005年11月)”的需求，以及需要使用佐剂来试图接近这种表面上无法实现的免疫接种目标。由于在美国没有用于一般性流感疫苗的批准的佐剂，美国国家疫苗储备没有选择，花费约5亿美元从Novartis购买MF59佐剂。由于“在9到12岁儿童中观察到的高度疫苗反应原性，研究V7P29的方案被修改为排除了小于9岁的儿童”，MF59佐剂在Fluad儿科的临床研究中被中断。该证据支持了在国家大流行病宣告期间，由于使用MF59佐剂将发生大量的严重反应，并需要额外的医学护理。

单磷酰基脂质A的合成类似物在约2005年期间由Avanti Polar Lipids(Alabaster，Alabama，USA)引入。Avanti Polar Lipids将这种合成类似物命名为六酰基磷酸化二糖(PHAD)，也被称为“GLA”。Avanti Polar Lipids供应的PHAD作为单一化合物提供，在附图1中显示，大约98％纯度，分子量1763道尔顿。PHAD的纯度与GSA的MPL形成显著对比，如上所述，MPL分离自沙门氏菌，作为动态的复杂化合物存在。不同于GSA的MPL，PHAD的生产过程、供应、使用和稳定性可以作为纯化合物来紧密的监视与控制。

特定的佐剂或佐剂的组合是否将增强针对每种特定抗原的免疫应答是不可预见的。例如，GSK的Cervarix疫苗含有单磷酰基脂质A和白矾，因为这种组合优于单独的白矾(Giannini et al.Vaccine，2006，24，p.5937-5949)。使用了重组乙型肝炎表面抗原的疫苗观察的了类似的效力提高(Vaccine，1998，16(7)，p.708-714).在美国专利6,889,885的表6中显示了另一个实例，其展现了抗原-佐剂组合在产生针对特定抗原的免疫应答方面的可变性。这些发明人展现了，与单独的白帆或单磷酰基脂质A相比，QS-21佐剂，以及单独的白矾加单磷酰基脂质A的佐剂组合产生了针对74kD蛋白质的更大的抗体反应。此外在2009年，Novartis Vaccines的Derek T.O'Hagan和Ennio De Gregorio公开了关于佐剂开发的综述。(Drug Discovery Today，14(11/12)，June 2009，p.541-551)他们报告了，对于某些蛋白质或抗原，白矾是相对弱的佐剂，仍然需要新的佐剂。

2004年，美国传染性疾病协会(IDSA)预先警告了世界范围内不断增多的抗生素抗性细菌的危机，没有新的地平线抗生素能对抗它的发生。2009年，IDSA鉴定出对当前所有抗生素有抗性的正在发生的细菌感染，最具警告性的抗生素抗性细菌是革兰氏阴性细菌，包括大肠杆菌。2010年，IDSA声称，尽管许多私营的、公众的和政府的实验室作出了努力，研究没有产生治疗抗生素抗性细菌的新选择，现在需要全球性的投入。IDSA的敦促得到了葛兰素史克的科学家的支持，他们预测的是，用于治疗革兰氏阴性细菌感染的任何新抗生素启用之前需要超过十到十五年(Payne et al.Nature Reviews Drug Discovery.2007，6，p.29-40)。

他们的预测基于34家公司开发新抗生素的失败尝试。在科学界中正在出现共识，美国急需新的治疗用于细菌感染的方法。Adam L.Hersh和同事在2012年在ClinicalInfectious Disease的期刊中(Hersh et al.CID.2012.54(11)，1677-8)报告了对整个美国的562名传染病医生的调查，在过去的一年，63％的医生治疗过对所有已知抗生素有抗性的细菌感染患者。这些数据强调了对细菌感染的新的治疗手段的需求。本领域中鉴定新的治疗剂选择来预防和治疗革兰氏阴性细菌感染的失败被很好地记录了。

此外，处于开发中的来预防或治疗金黄葡萄球菌感染的至少五种疫苗近年来被停止了。这些包括STAPHVAX、Veronate、Aurexis、Aurograb和V710。鉴定新的疫苗来预防和治疗细菌感染的失败被很好地记录了。

尿路感染(UTI)是世界范围内最普遍的传染性疾病之一，在美国是女性遭遇的第一位的传染性疾病。UTI的症状包括排尿困难(排尿痛苦)、尿急和耻骨上疼痛.在美国每年估计有7百万到1千1百万女性发生急性不复杂的UTI。所有成年女性的超过一半在她们的一生中将遭遇一次或多次UTI，25-44％的女性经历复发性UTI。实际上，在美国大约1,000,000名女性和男性每年经历三次或更多次UTI急性发作。此外，尽管有适当的抗生素治疗和尿液中初始感染的明显清除，复发常常在感染的30到90天内发生。

尽管在UTI的流行病学和病理学方面有了新的进展，在我们实际上预防或治疗这些感染的能力方面还没有新近的较大进步。经历复发性感染的患有UTI的25-44％的女性需要额外的治疗、额外的费用，以及在某些情况下需要广泛的泌尿学评估来防止发生更严重的并发症。因而，具有改善患者便利性和降低费用的潜力的安全有效的疫苗对于患者、供应商和卫生保健机构是相当有吸引力的。在复发的UTI群体中，由于治疗选项不断减少，抗微生物剂抗性是重要的问题。因而，急需开发新的方法用于UTI预防和治疗，其更少地依赖于抗微生物剂的使用。

UTI最常见地由尿路致病性大肠杆菌(UPEC)引起，其可能对高达85％的社区获得性UTI负责。已经揭露了关键的致病级联，UPEC通过它逃避宿主防御并在尿路中快速扩大数量导致疾病。这一工作支持了对UTI疫苗的医学需求。

FimH在致病级联的几个阶段中起到重要作用，这使得它成为主要的疫苗靶点。缺乏FimH粘附素的UPEC菌株不能有效地定殖膀胱。针对FimH的疫苗将激活宿主防御来在感染的所有阶段识别和清除UPEC，即使是在IBC或细胞内储库中被保护时。

使用MF59作为佐剂含有角鲨烯的FimCH疫苗由Medlmmune Inc.和Scott Hultgren教授的实验室的科学家共同发明(美国专利6,500,434；完全合并在本文中)。FimH蛋白和FimC蛋白以非共价的蛋白质复合物FimCH的形式存在。FimC使FimH稳定化，抗体针对两种蛋白质产生，然而仅针对FimH的抗体显示了在动物中降低膀胱的大肠杆菌定殖。因而在疫苗中使用FimCH作为抗原受到了需要有效佐剂的限制。

具有含角鲨烯的MF59佐剂的FimCH疫苗(水包油的乳剂)在1期临床试验中引发了免疫应答(美国专利申请20030138449，全部合并在本文中)。再次使用含有角鲨烯的MF59佐剂在两个独立的群体中进行了2期临床试验，但是在这些试验的任一个中女性都没有产生针对FimH的相关的IgG滴度。由于这些令人失望的结果，使用MF59佐剂的Medlmmune的FimCH疫苗的开发被停止。当与某些抗原一起使用时，带有角鲨烯的MF59佐剂有引起严重的局部注射部位和全身性反应的历史。在这些2期临床试验期间，女性经历了严重的注射部位反应和严重的全身性反应。由于这种失败，在美国还没有用于UTI的治疗或预防的疫苗。

对于预防和治疗UTI的疫苗存在着持续的需求。Medlmmune和其他人在开发UTI疫苗上的失败证明了开发用于细菌感染的新疫苗方面的困难性。Medlmmune证明了白矾不足以增强对FimCH的免疫应答。Medlmmune没有明确的佐剂选择来匹配FimCH抗原。

因而，对于疫苗以及在疫苗中用来增强对抗原的免疫应答的佐剂存在急迫的需求。需要疫苗和用于疫苗的佐剂，其具有扩展的稳定性而不牺牲效力。特别地，对于在室温下稳定的疫苗和佐剂存在着急迫的和公认的需求。此外，希望的是拥有在高于室温的温度下稳定的疫苗、佐剂和组合物。

此外，需要产生更少的严重的注射部位和全身性反应的佐剂和药物组合物。

需要新的疫苗来预防和治疗细菌感染，特别是用于UTI的预防和治疗的疫苗。

希望的是拥有疫苗，和用于在疫苗中增强抗原的免疫应答的佐剂，具有提高的贮存寿命并可以以低成本的方式生产。这样的疫苗和佐剂将显著地降低美国的卫生成本，特别是如果它们可以在室温或更高温度下保存而不影响它们的稳定性。

希望的是拥有佐剂和疫苗，它们需要产生最小的注射部位和全身性反应的佐剂和疫苗。希望的是拥有需要具有尽可能少的赋形剂的制剂。

希望的是拥有疫苗和用于疫苗的佐剂，所述佐剂增强治疗细菌感染的免疫应答。希望的是拥有疫苗和用于疫苗的佐剂，所述佐剂增强患有UTI的患者对大肠杆菌的免疫应答。

发明内容

本发明解决了在此描述的先有技术的佐剂、疫苗和药物组合物的许多难题。本发明提供了新的液体佐剂组合物和制剂，其提供了许多出乎意料和有益的性质，其在佐剂和药物组合物的领域中是未知的。

在一个方面，提供了液体佐剂组合物和制剂，其展现了室温稳定性约超过6个月，以及达到约37b℃下约60天或更久。所述新的液体佐剂组合物和制剂可以保存在冷藏温度或室温条件下，有利于储运期间的贮存寿命和降低运输成本。

通过允许一种低成本和出乎意料地和显著地稳定的佐剂制剂，其以更低的严重注射部位和全身性反应增强了对大肠杆菌抗原的免疫应答，在此描述的本发明的佐剂制剂解决了在疫苗施用中许多当前的障碍。

本文描述的数据展现了，本发明的佐剂制剂增强了对包括细菌和病毒抗原的其他抗原的免疫应答。

本文描述的本发明通过治疗由革兰氏阴性细菌包括大肠杆菌引起的尿路感染为降低这种困难作出了贡献。

在一个方面，公开了新的佐剂组合物，其在2℃到8℃和室温以及达到约37℃下具有显著的稳定性。

在本发明的一个方面，一种组合物，包含一种合成生产的佐剂六酰基磷酸化二糖或它的衍生物3-脱酰基-六酰基磷酸化二糖，以及选自由约25mM到约50mM，优选的28mM到约50mM和最优选的30mM到约50mM的柠檬酸盐、琥珀酸酯和磷酸盐构成的组的缓冲液。这些新的六酰基磷酸化二糖组合物优选地是水性缓冲的悬浮液。所述组合物可以在疫苗和药物情境下以各种方式使用。所述组合物，优选地不具有其他成分，显著地改善了六酰基磷酸化二糖或它的衍生物3-脱酰基-六酰基磷酸化二糖在悬浮液中的稳定性，在室温下和达到和约37℃下实现了优越的稳定性。所述组合物在冷藏温度下也展现了极好的稳定性。通过提供一种高效的和经济的六酰基磷酸化二糖组合物，其不需要为了长期稳定性而冷藏，这代表了在佐剂和制药技术方面的显著进步。

在本发明的另一个方面中，提供了作为水性缓冲的悬浮液的新的佐剂制剂。在一个实施方式中，所述佐剂制剂包括一种合成生产的佐剂六酰基磷酸化二糖或它的衍生物3-脱酰基-六酰基磷酸化二糖，选自由约10mM到约50mM，优选的约25mM到约50mM，更优选的28mM到约50mM和最优选的30mM到约50mM的柠檬酸盐、琥珀酸盐和磷酸盐构成的组的缓冲液，以及优选的一种合成生产的磷脂酰胆碱。当添加磷脂酰胆碱时，优选的缓冲液浓度可以扩展到约10mM到约50mM，并实现了本文描述的显著的稳定性。这些新的佐剂制剂优选地是水性缓冲的悬浮液。所述佐剂制剂在保存在冷藏和室温下时具有极好的长期稳定性，在达到和约37℃下具有极好的稳定性。这些制剂可以以显著低的成本生产。

为了室温稳定性或达到和约37℃下的稳定性，本文描述的新的佐剂制剂不需要冻干或等效的加工。所述佐剂制剂包括一种特定的缓冲液，以及任选地和优选地一种或更多种合成生产的选自由DMPC、DPPC、DSPC、DOPC和POPC构成的组、优选的DPPC的磷脂酰胆碱，以及一种合成生产的佐剂六酰基磷酸化二糖或它的衍生物3-脱酰基-六酰基磷酸化二糖，摩尔比约1:1到40:1(磷脂酰胆碱:六酰基磷酸化二糖)，优选的约1:1到20:1(磷脂酰胆碱:六酰基磷酸化二糖)，更优选的约2:1到5:1(磷脂酰胆碱:六酰基磷酸化二糖)，以及最优选的约2:1到5:1(DPPC:六酰基磷酸化二糖)。

本发明的最有价值的方面之一是，所述佐剂制剂仅包括处于本文描述的指定浓度的柠檬酸盐、琥珀酸盐或磷酸盐缓冲液中的单一佐剂六酰基磷酸化二糖或它的衍生物3-脱酰基-六酰基磷酸化二糖，以及优选的单一的磷脂酰胆碱。不需要其他的成分来产生在室温下的出乎意料的长期稳定性。此外，所述佐剂制剂可以以低成本生产。就此来说，这些佐剂制剂在室温下的长期稳定性是显著的，不需使用胆固醇、磷脂酰甘油、磷脂酰乙醇胺、单酰基甘油、冻干保护剂和可代谢的油而实现。在不使用一种或更多种这些成分的情况下，常规的先有技术佐剂不能实现稳定。

本发明的另一个方面是不需要两种或更多种磷脂酰胆碱或添加磷脂酰甘油的佐剂制剂。如实施例中显示的，两种或更多种磷脂酰胆碱或一种或更多种磷脂酰甘油可以添加到这些制剂中，但优选地不需要它来实现本文展现的显著的长期稳定性。

然而不受理论的限制，柠檬酸盐、琥珀酸盐或磷酸盐缓冲液的优选的缓冲液浓度扩展到约10mM到约50mM来实现本文描述的本发明的显著稳定性，被认为是由于是以本文描述的磷脂酰胆碱与六酰基磷酸化二糖或它的衍生物3-脱酰基-六酰基磷酸化二糖的本发明优选方面的限定摩尔比来添加优选的赋形剂，优选的为磷脂酰胆碱。更优选的，优选的缓冲液浓度是约25mM到约50mM，再更优选的28mM到约50mM，最优选的30mM到约50mM。优选地，pH值在约4.0到约7.5，优选的约4.5到约6.5，更优选的约5.0到约6.0的范围内。

如实施例中显示的，当配制在水、等于或大于100mM的乙酸盐缓冲液、PBS、或柠檬酸盐或磷酸盐缓冲液中时，不存在这种优越的室温稳定性。相反，约10mM到约50mM，但优选的约25mM到约50mM，更优选的28mM到约50mM，最优选的30mM到约50mM浓度的柠檬酸盐、琥珀酸盐或磷酸盐产生了稳定性。

本发明的另一个实施方式包括非离子表面活性剂，优选的聚山梨酯80，来降低本发明的颗粒聚集。

不需要冻干是显著的优点和出乎意料的突破，因为消除了许多高成本的步骤和风险。本发明的另一个方面是，与先有技术相比，这些佐剂制剂在增强对抗原的免疫应答方面是优越的，同时在施用期间引起显著更少的严重注射部位和全身性反应。本发明的另一个方面是基本上没有可代谢的油包括角鲨烯和基本上没有胆固醇的佐剂制剂。在本领域中，广泛地认为的是胆固醇是佐剂制剂或脂质体实现功能所必需的。本发明产生了本文描述的所有益处而不需要胆固醇。

因而，本文描述的佐剂制剂和药物组合物的优点包括：作为水性缓冲的悬浮液至少6个月的室温稳定性，和/或在达到和约37℃下约60天或更久的稳定性；每次施用更低的严重注射部位和全身性反应，同时增强对抗原的免疫反应；以及，使用更少的材料或成分以及更低浓度的所述材料或成分，更低的生产或制造成本。本发明的佐剂制剂提供了这三种组合的主要益处，这是作为对基于白矾的佐剂的可选项的、MLA或MPL的合成类似物的佐剂早先未能实现的。

在本发明的另一个方面，提供了含有所述新的佐剂制剂的新的疫苗组合物，用于治疗或预防由革兰氏阴性细菌包括大肠杆菌和多药物抗性大肠杆菌引起的尿路感染。还提供了施用所述新的疫苗组合物的方法，以及预防和治疗由革兰氏阴性细菌包括大肠杆菌和多药物抗性大肠杆菌引起的尿路感染的方法。

在本发明的另一个方面中，提供了在患有复发性尿路感染的人类中诱导产生针对FimH的抗体的方法。

本发明的另一个方面是疫苗组合物，其在患有复发性尿路感染的人类中诱导产生针对FimH的抗体。

在本发明的另一个方面中，提供了包含六酰基磷酸化二糖组合物或制剂或疫苗组合物，以及施用指导和储存说明的疫苗试剂盒。为在室温和达到和约37℃下所述六酰基磷酸化二糖组合物或制剂的暴露提供所述说明。描述了保存、运输和暴露温度的这些说明可以由政府管理部门包括美国FDA和欧洲药品管理局批准。优选地，一种或更多种试剂盒成分是处于注射器中的六酰基磷酸化二糖组合物或制剂。

本发明的另一个方面是，PHAD组合物和制剂以及疫苗组合物是无菌的组合物和无菌的药物组合物，优选的，所述无菌的六酰基磷酸化二糖组合物和制剂被包含于无菌注射器中。

附图说明

图1显示了六酰基磷酸化二糖的一种盐的化学结构。

图1a显示了优选的3-脱酰基-六酰基磷酸化二糖盐。

图2显示了DPPC的化学结构。

图3是说明利用IgG抗FimH对FimCH和Q133K间接ELISA的图形。

图4是说明分析FimCH和Q133K的效价分析的图形。

图5是说明在效价测定中评估小分子抑制物的图形。两种小分子，4-甲基伞形酮酰基-α-D甘露吡喃糖苷(UFMP)和甲基-α-D甘露吡喃糖苷(MDMP)抑制甘露糖与FimH的结合。

图6是通过CEX-HPLC的FimCH药物物质样品的代表性的层析谱。

图7是说明在小鼠的FimCH/PHAD免疫之后保护免受大肠杆菌感染的图形。

图8是DPPC和PHAD的HPLC实例层析谱。

具体实施方式

定义

关于六酰基磷酸化二糖数量或缓冲液浓度(除非限定了)时“约”是指所列数量的加和减10％。

“约25℃”是指20℃到30℃的温度。

“约37℃”是指34℃到40℃的温度。

“约50mM”是指本文描述的缓冲液浓度在50mM和小于100mM之间。如实施例中显示的，100mM或更高的指定缓冲液在允许长期室温稳定性方面是无效的。缓冲液浓度的上限一般被评估为两倍增加。参考约50mM时，本发明的指定的缓冲液浓度优选地小于90mM，优选地小于80mM，更优选地小于70mM，最优选地小于60mM。

“约10mM”是指本文描述的缓冲液浓度在6mM到10mM之间。

“可接受的载体”是指一种载体，其对于组合物的其他成分是无害的，以及对于要与之应用的材料是无害的。

“佐剂”是指以有效量存在时提高抗原反应的一种试剂；增强对抗原的免疫反应的物质；或刺激针对抗原的抗体生产的试剂。本领域中存在多种命名规则或术语。不参考特定的命名惯例，本文描述的佐剂组合物可以简单地称为佐剂制剂或佐剂制品。

“施用”是指向受试者提供化合物或组合物的任何方式。

“胶体”是指在整个水性缓冲的溶液或其他物质中显微地分散的一种或更多种化学物质、化合物或物质。本文描述的佐剂制剂也可以描述为胶体。胶态分散体的一个实例是Fungizone，其由用于胃肠外施用的两性霉素B-去氧胆酸钠组成。

“临界胶粒团浓度”是指表面活性剂的浓度，高于该浓度形成胶粒团，添加到系统的所有额外的表面活性剂进入胶粒团。

“DLPC”是指1，2-二月桂酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱。

“DMPC”是指1，2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱。

“DOPC”是指1，2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱。

“DPPC”是指1，2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(分子式C₄₀H₈₀NO₈P(MW＝734Da)(化学结构在附图2中示出)。

“DPPG”是指1，2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酸-(1'-rac-甘油)。

“DSPC”是指1，2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱。

“有效量”是指施用给人类的疫苗组合物中足够数量的FimCH或截短的FimH或其他抗原，以引发针对FimH或其他抗原的免疫应答，或足够数量的佐剂，优选的六酰基磷酸化二糖或它的衍生物3-脱酰基-六酰基磷酸化二糖，以引发针对抗原的提高的免疫应答。

“基本上没有”材料、添加剂、化学物质或赋形剂是指所述材料、添加剂、化学物质或赋形剂不被添加到本发明的组合物或制剂中，然而可以存在一定的混杂水平数量。

“基本上没有严重的注射部位和全身性反应”是指百分之二或更少的人经历这些可归因于佐剂组合物或制剂的严重的注射部位和全身性反应。

“注射部位反应”是指在施用的部位或注射部位的疼痛、触痛、发红和/或肿胀。

“发明”是指本发明的至少某些实施方式；在本文中提及“发明”或“本发明”的各种特征不意味着所有要求权利的实施方式或方法包括所提及的特征。

“标记”或“标签”是指在任何物品或其任何容器或包装物上，或伴随这样的物品的所有的标签和其他手写、印刷或图形的物质，因而，包括了伴随本发明的疫苗或佐剂组合物或制剂的任何包装插页或信息页。

“更少的严重的注射部位和全身性反应”是指与在本文中和在其产品信息文件中详述的商业疫苗Cervarix，以及本文和Treanor等人(Vaccine 2013)中描述的在研疫苗佐剂GLA-SE相比，较不严重的或3级的注射部位反应和/或全身性反应。

“脂质体”一般是指泡囊，其由围绕亲水性核心的脂质双分子层膜组成。

“低成本”是指一组合物，其具有足以实现本发明的新特性的最低浓度下的成分或材料。

“冻干保护剂”是指材料、化学物质或赋形剂，主要用于保护材料免于制造、保存和使用期间的冻伤或其他损伤，或改善重构，包括允许使用前的适当溶解，还包括用于修改渗透压或调节渗涨度的这些材料、化学物质或赋形剂，包括但不限于山梨醇、甘露醇、甘露糖、赤藓醇、木糖醇、甘油、蔗糖、葡萄糖、海藻糖、麦芽糖、乳糖和纤维二糖。

“可代谢的油”主要是指在疫苗制剂或佐剂制剂中用作佐剂的角鲨烯，或紧密相关的角鲨烯类似物，但是还指在疫苗或佐剂制剂中作为赋形剂使用、或用来产生佐剂效果、或产生乳剂的中链的甘油三酯，包括Miglyol 810和来自植物、动物或鱼类的油。实施例包括葡萄籽油、大豆油、椰子油、橄榄油、葵花油、玉米油和鲨鱼肝油。

“胶粒团”是指分散在水性缓冲的溶液中的表面活性剂分子的聚集物，亲水性的头部区域与周围的水性缓冲的溶液接触，将处于胶粒团中心的疏水性的单独的尾部区域隔离。

“MLA”是指单磷酰基脂质A。

“MPL”是指3'-O-脱酰基-4'-单磷酰基脂质A。

“药学上可接受的载体”是指一种载体，其对于组合物的其他成分是无害的，以及对于它的人类或其他动物受试者是无害的。在组合物的其他成分的情境下，“无害的”是指所述载体将不会与其他成分反应或降解其他成分，或干扰它们的效力。然而，干扰成分的效力不是指纯粹的成分稀释。

“六酰基磷酸化二糖”是一种Toll样受体4激动剂，是指六酰基磷酸化二糖、它的酸或六酰基磷酸化二糖的其他药学上可接受的盐。优选的六酰基磷酸化二糖盐的结构在附图1中显示，其可从Avanti Polar Lipids获得(PHAD)。如本文使用的，六酰基磷酸化二糖可以是完全或部分合成的或是非合成的，而完全合成的是优选的。

“3-脱酰基-六酰基磷酸化二糖”是一种Toll样受体4激动剂，是指3-脱酰基-六酰基磷酸化二糖、它的酸或3-脱酰基-六酰基磷酸化二糖的其他药学上可接受的盐。优选的3-脱酰基-六酰基磷酸化二糖盐的结构在附图1A中显示，其可从Avanti Polar Lipids获得(PHAD)。如本文使用的，3-脱酰基-六酰基磷酸化二糖可以是完全或部分合成的或是非合成的，而完全合成的是优选的。

“药物组合物”是指一种组合物，其被给与哺乳动物以图治疗或预防疾病，或对于疫苗组合物来说，产生治疗或预防疾病的免疫原性应答，降低症状，或提供某些类型的治疗益处，或对于佐剂组合物来说，增强对一种或更多种抗原的免疫应答。

“磷酸盐缓冲液”或“磷酸盐”是指选自以下的组的磷酸盐缓冲液：磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾和磷酸氢二钾，或其一定的组合。优选的，“磷酸盐”由磷酸氢二钠、磷酸二氢钠和磷酸二氢钾组成。除非另有说明，提及磷酸盐缓冲液特别地排除磷酸铵。

“PBS”是指磷酸盐缓冲液(Na₂HPO₄和/或KH₂PO₄)、氯化钾和氯化钠的一般组成的磷酸盐缓冲盐水。典型的PBS组合物包含约10mM磷酸盐缓冲液(Na₂HPO₄和/或KH₂PO₄)，2.7mM氯化钾和0.14M氯化钠，pH7.4，25℃。

“磷酸盐柠檬酸盐缓冲液”是指含有柠檬酸和磷酸钠的磷酸缓冲液，其中pH值通过柠檬酸盐/柠檬酸和磷酸盐/磷酸氢盐的平衡来维持。磷酸盐可以包括，例如Na₂HPO₄和/或KH₂PO₄，可以使用柠檬酸钠。

“磷脂酰胆碱”(也称为“PC”)是指含有胆碱的脂质。实例包括但不限于DMPC(1，2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱)、DPPC(1，2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱)、DSPC(1，2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱)、DOPC(1，2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱)和POPC(1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱)。磷脂酰胆碱可从AvantiPolar Lipids获得。

“磷脂酰乙醇胺”是指含有附着于乙醇胺的磷酸基团的脂质，例如，1，2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺。

“磷脂酰甘油”是指含有甘油的脂质。实施例包括但不限于1，2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油基-3-磷酸-(1'-rac-甘油)(DMPG)，1，2-二棕榈酰-sn-甘油基-3-磷酸(1'-rac-甘油(DPPG)和1，2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸-(1’-rac-甘油)(DSPG)。

“POPC”是指1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱。

复发性尿路感染”是指人在约一年内患有3到4次尿路感染。

“冷藏”是指2℃到8℃的温度范围。

“室温”是指19℃(66°F)到25℃(77°F)的范围。

“盐水”是指在缓冲的水性溶液中约125mM到约155mM的NaCl。例如，PBS一般含有137mM NaCl，Tris缓冲盐水可以含有150mM。

“严重的注射部位反应”是指一种或更多种以下的：需要麻醉性止痛药的、或妨碍日常活动的疼痛；静止时引起显著不适的触痛；超过10cm的发红，和超过10cm或妨碍日常活动的肿胀。

“严重的全身性反应”是指以下的一种或更多种：恶心/呕吐，其妨碍日常活动或需要体外IV水化；24小时内由6次或更多次水状便和/或>800克的腹泻，或需要体外IV水化；重度使用麻醉止痛药或妨碍日常活动的头痛；显著的或妨碍日常活动的疲劳；以及显著的或妨碍日常活动的肌肉痛。

提及的胆固醇“基本上没有”是指，如果存在的话，胆固醇是0.3mM或更少。

提及的单酰基甘油“基本上没有”是指，如果存在的话，单酰基甘油是0.5mM或更少。单酰基甘油的实例是单棕榈酰基甘油。

提及的磷脂酰甘油或磷脂酰乙醇胺“基本上没有”是指果存在的话，这些物质是0.1mM或更少。

提及的冻干保护剂“基本上没有”是指如果存在的话，这些物质是0.5％或更少的组合物或制剂浓度。

“基本上没有盐水”是指在本发明的组合物或制剂中低于30mM NaCl。

“全身性反应”是指恶心/呕吐、腹泻、头痛、疲劳和/或肌肉痛。

“琥珀酸盐缓冲液”或““琥珀酸盐”是指琥珀酸二钠或丁二酸钠二碱。可以使用丁二酸钾，但是是较不优选的。

提及的佐剂、活性、蛋白质、抗原或药物时“稳定性”或“稳定的”是指物质或产品从它的制造日期开始的一段时间中、在一些变量如温度和/或湿度的影响下为其预定用途保持可接受的质量。物质的稳定性常常通过分析数据(或其他相当的证据)来证明。

“柠檬酸三钠”是指柠檬酸盐缓冲液(也称为“柠檬酸盐”)，例如，柠檬酸三钠二水合物、柠檬酸钠、柠檬酸钠三碱水化物或柠檬酸三钠盐二水合物，如供应商包括Sigma-Aldrich和BDH Chemicals所称的。可以使用柠檬酸钾、柠檬酸钠单碱和柠檬酸钠二碱，但是它们是较低优选的。例如，用于注射的产品伊米苷酶(imiglucerase)使用了柠檬酸三钠和柠檬酸氢二钠的组合。这些类型的组合是可接受的。柠檬酸，CAS 77-92-9可以用于调节缓冲液的pH值，但是它不能代替在此列出的缓冲液。

“截短的FimH”是指被截短的、包括来自FimH的前175个氨基酸的至少约25个到约175个氨基酸残基的截短的FimH蛋白。对于截短的FimH，截短的FimH蛋白优选地包括FimH蛋白的至少9％，更优选的FimH蛋白的至少30％，最优选的FimH蛋白的至少60％。

“尿路感染”是指以一种或更多种以下体征和症状为特征的医学诊断：刺激性的排尿，例如尿频、尿急和排尿困难；肉眼血尿症；或在检查时引发的耻骨上触痛；和/或一种或更多种以下的实验结果：来自净采集或导管尿液样本的阳性的尿液试纸检查；来自净采集或导管尿液样本的显微镜尿分析(可能存在白细胞、细菌和管状物)；或净采集或导管尿液样品的尿液培养中大肠杆菌≥10³CFU/ml。

“疫苗”或“疫苗组合物”是指改善对疾病的免疫性的免疫性。所述疫苗组合物是引发诊断所述组合物的抗原的免疫反应和抗体生产的免疫原性组合物。

发明实施方式

在一个实施方式中，提供了药物组合物或药学上可接受的载体。所述药物组合物或药学上可接受的载体包含六酰基磷酸化二糖或它的衍生物3-脱酰基-六酰基磷酸化二糖，以及缓冲液(称为“六酰基磷酸化二糖组合物”或“含有六酰基磷酸化二糖的组合物”或“含有六酰基磷酸化二糖的组合物和携带者”，这些也单独地适用它的衍生物(3-脱酰基-六酰基磷酸化二糖)。本发明的六酰基磷酸化二糖组合物优选地是水性缓冲的悬浮液。所述缓冲液选自由约25mM到约50mM，更优选的28mM到约50mM，最优选的30mM到约50mM的柠檬酸盐、琥珀酸盐和磷酸盐构成的组。优选地，pH值在约4.0到约7.5，优选的约4.5到约6.5，更优选的约5.0到约6.0的范围内。具有这种组合(六酰基磷酸化二糖或它的衍生物3-脱酰基-六酰基磷酸化二糖和所述缓冲液)的药物组合物或载体展现了作为药物组合物的基础的极好的稳定性，并改善了六酰基磷酸化二糖组合物的总体稳定性。具体地，这些含有六酰基磷酸化二糖的组合物和载体在室温下和达到约37℃下实现了稳定性。本发明的这些含有六酰基磷酸化二糖的组合物和载体还展现了在冷藏温度到室温下的极好的长期稳定性。

含有六酰基磷酸化二糖的药物组合物和药物载体(如早先描述的其包括六酰基磷酸化二糖或它的衍生物3-脱酰基-六酰基磷酸化二糖和特定的缓冲液)可以任选地包括对于疫苗、佐剂制剂和其他药物组合物典型的其他成分，例如赋形剂、修饰剂、表面活性剂和添加剂。例如，磷脂酰胆碱(如以下更详细描述的)可以任选地被添加，单独或与其他脂质载体组合。在一个实施方式中，可以添加来自大豆或蛋的天然发生的磷脂酰胆碱，或来自大豆或蛋的氢化的磷脂酰胆碱，或合成的或天然混合的酰基磷脂酰胆碱。

在优选的实施方式中，一种或更多种疫苗抗原被添加到含有六酰基磷酸化二糖的组合物中来形成疫苗。疫苗抗原可以是疫苗中使用的任何抗原，包括但不限于白喉、破伤风、百日咳、脊髓灰质炎、肝炎和/或流感病毒的抗原制品。优选地，疫苗抗原是如下文详细描述的FimCH蛋白质复合物。

含有六酰基磷酸化二糖的组合物和载体可以以任何浓度制备，一般地以约0.005到约1.0mg/ml的六酰基磷酸化二糖，优选的约0.05到1.0mg/ml的六酰基磷酸化二糖来制备，通常不超过约2.5mg/ml的六酰基磷酸化二糖。

含有六酰基磷酸化二糖的组合物可以作为疫苗的佐剂来施用给动物或人类，优选地给予约10微克六酰基磷酸化二糖每剂到约50微克六酰基磷酸化二糖每剂。确切的剂量可以根据使用的抗原来修改。更优选的，施用约20微克六酰基磷酸化二糖每剂到约50微克六酰基磷酸化二糖每剂。再更优选的，施用约40微克六酰基磷酸化二糖每剂到约50微克六酰基磷酸化二糖每剂。

如本文显示的，当配制在水、乙酸盐缓冲液、PBS或等于或大于100mM的柠檬酸盐或磷酸盐中时，含有六酰基磷酸化二糖的组合物在室温下和达到37℃下出乎意料的稳定性是不存在的。六酰基磷酸化二糖组合物含有柠檬酸盐、琥珀酸盐或磷酸盐缓冲液来产生出乎意料的稳定性，优选的约25mM到约50mM，更优选的28mM到约50mM，和最优选的30mM到约50mM。

更具体地，六酰基磷酸化二糖组合物的优选的缓冲液，缓冲液的浓度选自以下构成的组：约25mM到约50mM；25mM到约50mM；约30mM到约50mM；28mM到约50mM；30mM到约50mM；约30mM；约40mM到约50mM；40mM到约50mM；约40mM；以及约50mM。

此外，如下文的实施例中所显示的，在含有六酰基磷酸化二糖的组合物和制剂中使用PBS不展现本发明的新的特征，特别是本发明的稳定性特征。相比之下，使用在此特别指定的柠檬酸盐、琥珀酸盐和磷酸盐缓冲液允许本发明的新的稳定性特征。

本发明的六酰基磷酸化二糖组合物优选地基本上没有角鲨烯。

本发明的六酰基磷酸化二糖组合物优选地基本上没有用作佐剂的可代谢的油。

本发明的六酰基磷酸化二糖组合物优选地基本上没有可代谢的油。

本发明的六酰基磷酸化二糖组合物优选地是水性缓冲的悬浮液，优选地这些水性缓冲的悬浮液具有小于150nm，更优选的小于130nm的颗粒大小，优选的，这些六酰基磷酸化二糖组合物不是水包油乳剂。

本发明的六酰基磷酸化二糖组合物优选地基本上没有第二佐剂，包括白矾、角鲨烯、QS21、MF59、Toll-样受体9激动剂，以及其他佐剂，包括基于角鲨烯的佐剂。第二佐剂具有在人类中产生更多严重的局部和全身性反应的可能性，而没有进一步提高免疫应答来改善治疗结果的益处。

六酰基磷酸化二糖组合物优选地含有低于5mM的胆固醇，更优选的低于1mM的胆固醇，再更优选的大体上没有胆固醇，最优选的基本上没有胆固醇。

优选地，六酰基磷酸化二糖组合物基本上没有磷脂酰甘油，更优选的基本上没有磷脂酰甘油。

优选地，六酰基磷酸化二糖组合物大体上没有磷脂酰乙醇胺，更优选的基本上没有磷脂酰乙醇胺。

优选地，六酰基磷酸化二糖组合物大体上没有单酰基甘油，更优选的基本上没有单酰基甘油。

六酰基磷酸化二糖组合物优选地大体上没有盐水，优选的含有低于20mM的NaCl，更优选的含有低于10mM的NaCl，再更优选的基本上没有NaCl。

六酰基磷酸化二糖组合物优选地大体上没有冻干保护剂，再更优选的基本上没有冻干保护剂。

所述六酰基磷酸化二糖组合物不需要冻干或等效的加工来为了贮存寿命或稳定性保持六酰基磷酸化二糖或它的衍生物3-脱酰基-六酰基磷酸化二糖的浓度。因此，所述六酰基磷酸化二糖组合物优选地不被冻干或不发生冻干；所述六酰基磷酸化二糖组合物优选地在制备之后不被干燥；所述六酰基磷酸化二糖组合物优选地不需要在制备之后用液体或缓冲液从干燥的材料中重构；所述六酰基磷酸化二糖组合物优选地在制造之后施用之前保持为水性缓冲的悬浮液。

优选地，六酰基磷酸化二糖组合物大体上没有胆固醇、磷脂酰甘油和磷脂酰乙醇胺，以及基本上没有可代谢的油和第二佐剂。

更优选的，六酰基磷酸化二糖组合物大体上没有胆固醇、磷脂酰甘油和磷脂酰乙醇胺，以及基本上没有可代谢的油和第二佐剂。

优选地，本发明的六酰基磷酸化二糖组合物大体上没有本文描述的实现本发明的新特征所不需要的材料或赋形剂，而再更优选的本发明的六酰基磷酸化二糖组合物基本上没有本文描述的实现本发明的新特征所不需要的材料或赋形剂.

优选地，本发明的六酰基磷酸化二糖组合物大体上没有本文描述的每种组合物的一种、两种、三种或更多种材料或赋形剂，并且这种限制不排除每种组合物的仅一种材料或赋形剂每组合物。

优选地，本发明的六酰基磷酸化二糖组合物基本上没有每种本文描述的组合物一种、两种、三种或更多种材料或赋形剂，这种限制不排除每种组合物的仅一种材料或赋形剂每组合物。

优选地，当本发明的含有六酰基磷酸化二糖的组合物或制剂在室温下或达到约37℃下被保存、运输、保持或施用时，最优选的是已经被使用无菌技术无菌过滤或制备，更优选的，所述无菌的六酰基磷酸化二糖组合物和制剂被包含在无菌注射器中。

在另一个实施方式中，提供了新的佐剂制剂。所述佐剂制剂包括一种合成生产的六酰基磷酸化二糖或它的衍生物3-脱酰基-六酰基磷酸化二糖，选自由约10mM到约50mM的柠檬酸盐、琥珀酸盐和磷酸盐构成的组的缓冲液，以及优选的一种合成生产的磷脂酰胆碱(称为“六酰基磷酸化二糖制剂”或“含有六酰基磷酸化二糖的佐剂制剂”或“含有六酰基磷酸化二糖的制剂”，这些也分别指它的衍生物3-脱酰基-六酰基磷酸化二糖)。磷脂酰胆碱与六酰基磷酸化二糖或它的衍生物3-脱酰基-六酰基磷酸化二糖以约1(PC)比1(六酰基磷酸化二糖)到约40(PC)比1(六酰基磷酸化二糖)，优选的约2.5(PC)比1(六酰基磷酸化二糖)的摩尔比存在。除非另有说明，对六酰基磷酸化二糖制剂的引述适用于佐剂制剂。这些新的六酰基磷酸化二糖制剂优选地是水性缓冲的悬浮液。当保存在冷藏温度到室温、以及达到约37℃下时，所述佐剂制剂具有极好的长期稳定性。另外，所述佐剂制剂可以以低成本生产。

在优选的实施方式中，所述佐剂制剂优选地包括一种合成生产的磷脂酰胆碱，优选的DPPC，一种合成生产的佐剂六酰基磷酸化二糖或它的衍生物3-脱酰基-六酰基磷酸化二糖，其摩尔比约1：1到40：1(DPPC：六酰基磷酸化二糖)，以及约10mM到50mM、但优选的约25mM到50mM、更优选的28mM到约50mM和最优选的30mM到约50mM的柠檬酸盐、琥珀酸盐或磷酸盐缓冲液。优选地，pH值在约4.0到约7.5，优选的约4.5到约6.5，更优选的约5.0到约6.0的范围内。重要地，所述六酰基磷酸化二糖佐剂制剂可以用仅一种佐剂六酰基磷酸化二糖或它的衍生物3-脱酰基-六酰基磷酸化二糖和优选地一种磷脂酰胆碱来生产，从而允许它们以低成本生产。优选地，所述佐剂制剂含有六酰基磷酸化二糖或它的衍生物3-脱酰基-六酰基磷酸化二糖作为唯一佐剂，然而可以使用其他的佐剂。本发明的长期稳定性特征进一步降低了使用这些含有六酰基磷酸化二糖的佐剂制剂的成本。

然而不受理论的限制，在所述六酰基磷酸化二糖制剂中柠檬酸盐、琥珀酸盐或磷酸盐缓冲液的优选的缓冲液浓度扩展到约10mM到约50mM来实现本文描述的本发明的显著稳定性，被认为是由于是以本文描述的磷脂酰胆碱与六酰基磷酸化二糖的本发明优选方面的限定摩尔比来添加优选的赋形剂，优选的为磷脂酰胆碱。

本发明的含有六酰基磷酸化二糖的佐剂制剂优选地基本上没有角鲨烯。

本发明的含有六酰基磷酸化二糖的佐剂制剂优选地基本上没有用作佐剂的可代谢的油。

本发明的含有六酰基磷酸化二糖的佐剂制剂优选地基本上没有可代谢的油。

本发明的含有六酰基磷酸化二糖的佐剂制剂优选地是水性缓冲的悬浮液，优选地这些水性缓冲的悬浮液具有小于150nm，再更优选的小于130nm的颗粒大小，优选的，这些含有六酰基磷酸化二糖的佐剂制剂不是水包油乳剂。

本发明的含有六酰基磷酸化二糖的佐剂制剂优选地基本上没有第二佐剂，包括白矾、角鲨烯、QS21、MF59、Toll-样受体9激动剂，以及其他佐剂，包括基于角鲨烯的佐剂。所述六酰基磷酸化二糖制剂优选地基本上没有其他或额外的佐剂，因为它们有在人类中产生更多的严重局部和全身性反应的可能性，而没有进一步提高免疫应答或大体上改善治疗结果的益处。

所述含有六酰基磷酸化二糖的佐剂制剂优选地含有低于5mM的胆固醇，更优选的低于1mM的胆固醇，再更优选的大体上没有胆固醇，最优选的基本上没有胆固醇。

优选地，所述含有六酰基磷酸化二糖的佐剂制剂大体上没有磷脂酰甘油，更优选的基本上没有磷脂酰甘油。

优选地，所述含有六酰基磷酸化二糖的佐剂制剂大体上没有磷脂酰乙醇胺，更优选的基本上没有磷脂酰乙醇胺。

优选地，所述含有六酰基磷酸化二糖的佐剂制剂大体上没有单酰基甘油，更优选的基本上没有单酰基甘油。

本发明的含有六酰基磷酸化二糖的佐剂制剂优选地大体上没有盐水，优选的含有低于20mM的NaCl，更优选的，所述六酰基磷酸化二糖制剂含有低于10mM的NaCl，再更优选的基本上没有NaCl。

优选地，所述含有六酰基磷酸化二糖的佐剂制剂大体上没有冻干保护剂，更优选的基本上没有冻干保护剂。

优选地，所述含有六酰基磷酸化二糖的佐剂制剂大体上没有胆固醇、磷脂酰甘油和磷脂酰乙醇胺，以及基本上没有可代谢的油和第二佐剂。

更优选的，含有六酰基磷酸化二糖的制剂基本上没有胆固醇、磷脂酰甘油和磷脂酰乙醇胺，以及基本上没有可代谢的油和第二佐剂。

优选地，本发明的含有六酰基磷酸化二糖的制剂大体上没有本文描述的实现本发明的新特征所不需要的材料或赋形剂，而再更优选的本发明的含有六酰基磷酸化二糖的制剂基本上没有本文描述的实现本发明的新特征所不需要的材料或赋形剂.

优选地，本发明的含有六酰基磷酸化二糖的制剂大体上没有一种、两种、三种或更多种材料或赋形剂每份本文描述的含有六酰基磷酸化二糖的制剂，这种限制不排除仅一种材料或赋形剂每份含有六酰基磷酸化二糖的制剂。

优选地，本发明的含有六酰基磷酸化二糖的制剂基本上没有一种、两种、三种或更多种材料或赋形剂每份本文描述的含有六酰基磷酸化二糖的制剂，这种限制不排除仅一种材料或赋形剂每份含有六酰基磷酸化二糖的制剂。在另一个方面，提供了疫苗以及用疫苗治疗和预防疾病的方法。

为了制备疫苗，一种或更多种疫苗抗原被添加到如上所述的含有六酰基磷酸化二糖的佐剂制剂中。所述抗原可以是本文描述的FimCH蛋白质复合物，或其他抗原，包括但不限于与白喉、破伤风、百日咳、脊髓灰质炎、肝炎相关的抗原或流感病毒的抗原制品。

使用六酰基磷酸化二糖制剂制备的疫苗不需要冻干来为了贮存寿命或稳定性保持六酰基磷酸化二糖的浓度。冻干是一种主要用于保存材料的脱水过程或冷冻-干燥过程。现在有等效的过程来实现保存材料的同一目标。在制备本文描述的疫苗和六酰基磷酸化二糖组合物时，不需要冻干的疫苗或佐剂制剂是出乎意料的和显著的优点.通过消除冻干的必要性，可以除去许多昂贵的步骤。首先，冻干步骤本身被去除，其不仅除去了必需在良好监视的无菌条件下进行的昂贵的制造步骤，还消除了对这种制造步骤的审批和评估。接下来，步骤的去除代表了一种不间断的费用节省。例如，每制备一个批次时，冻干步骤被节省了。此外，当制备更大的批次时，或生产工序被转移到另一个设施时，除去这个步骤节省了额外的审批步骤。第二，冻干需要制造或采购、运送和与冻干制品一起保存稀释剂的无菌小瓶，用于重构。除去重构步骤消除了这种稀释剂小瓶和它的供应链管理的成本。第三，佐剂制剂的重构可能影响它的无菌性，需要即刻使用，如果不在预定的时间内使用需要抛弃产品。第四，重构过程易于出错，因而厂家失去了对最终被施用给患者的产品的确切浓度的控制。本文描述的佐剂组合物和制剂通过除去冻干需求消除了这四个缺点。因此，所述含有六酰基磷酸化二糖的制剂优选地不被冻干或不发生冻干；所述含有六酰基磷酸化二糖的制剂优选地在制备之后不被干燥；所述含有六酰基磷酸化二糖的制剂优选地不需要在制备之后用液体或缓冲液从干燥的材料中重构；所述含有六酰基磷酸化二糖的制剂优选地在制造之后施用之前保持为水性缓冲的悬浮液。

现在实现了本文描述的本发明的进一步的显著优点。不需要冻干或等效的过程，本发明的六酰基磷酸化二糖组合物或含有六酰基磷酸化二糖的制剂可以在制造之后立即被高效地和低成本地包装到注射器中。优选地，所述组合物和制剂是无菌的，优选地所述注射器是无菌的。这些预装填的注射器可以在冷藏温度到室温下和在达到约37℃下被运输、保存、投递或转移。这一优点提供了最高效和低成本的方式来使六酰基磷酸化二糖组合物和含有六酰基磷酸化二糖的制剂到达施用的地点。

在另一个实施方式中，非离子表面活性剂被添加到所述佐剂制剂中。优选地，所述非离子表面活性剂是聚山梨酯80，然而也可以使用其他的。所述非离子表面活性剂一般以约0.001％到1.0％，优选的0.01％到0.1％的浓度添加到所述佐剂组合物中。这种添加可以防止当被保存在室温和达到约37℃下时所述六酰基磷酸化二糖制剂的轻微聚集和平均颗粒大小的轻微提高。优选地，非离子表面活性剂来源于聚乙氧基化的山梨糖醇酐，包括但不限于聚山梨酯20和聚山梨酯80。

优选的佐剂制剂包含选自由约25mM到约50mM，更优选的28mM到约50mM，最优选的30mM到约50mM的柠檬酸盐、琥珀酸盐和磷酸盐构成的组的特定缓冲液，以及优选的按照约1：1到40：1(磷脂酰胆碱：六酰基磷酸化二糖)，优选的约1：1到20：1(磷脂酰胆碱：六酰基磷酸化二糖)，更优选的约2：1到5：1(磷脂酰胆碱：六酰基磷酸化二糖)和最优选的约2：1到5：1(DPPC:六酰基磷酸化二糖)的选自由DMPC、DPPC、DSPC、DOPC和POPC构成的组的一种合成生产的磷脂酰胆碱，优选的DPPC，以及一种合成生产的佐剂六酰基磷酸化二糖或它的衍生物3-脱酰基-六酰基磷酸化二糖。更优选的，柠檬酸盐或琥珀酸盐缓冲液按照约10mM到约50mM，优选的约25mM到约50mM，更优选的28mM到约50mM，最优选的30mM到约50mM用于六酰基磷酸化二糖制剂中。

如本文对于六酰基磷酸化二糖制剂的优选的缓冲液的浓度所描述的，缓冲液的浓度选自以下构成的组：约10mM到约50mM；15mM到约50mM；20mM到约50mM；约25mM到约50mM；25mM到约50mM；约30mM到约50mM；28mM到约50mM；30mM到约50mM；约30mM；约40mM到约50mM；40mM到约50mM；约40mM；以及约50mM。本文描述的含有六酰基磷酸化二糖的制剂优选地大体上没有盐水，优选地含有低于20mM的NaCl，更优选的，所述六酰基磷酸化二糖组合物含有低于10mM的NaCl，再更优选的基本上没有NaCl。

此外，如下文的实施例中所显示的，在含有六酰基磷酸化二糖的组合物和制剂中使用PBS不展现本发明的新的特征，特别是本发明的稳定性特征。相比之下，在此特别指定的磷酸盐缓冲液允许本发明的新的稳定性特征。

所述六酰基磷酸化二糖制剂优选地通过选择以高纯度合成制备的单一磷脂酰胆碱来制备。然而，来自大豆或蛋的天然发生的磷脂酰胆碱，或来自大豆或蛋的氢化的磷脂酰胆碱，或合成的或天然混合的酰基磷脂酰胆碱也可以用于制备所述佐剂制剂。

所述六酰基磷酸化二糖制剂可以以任何浓度制备，但一般地以约0.005到约1.0mg/ml的六酰基磷酸化二糖，优选的约0.05到约1.0mg/ml的六酰基磷酸化二糖来制备，但优选地不超过约2.5mg/ml的六酰基磷酸化二糖。所述六酰基磷酸化二糖制剂的磷脂酰胆碱可以以任何浓度制备，但是优选地按照约0.005到约16mg/ml(0.007mM到22mM)，更优选的约0.05到约8mg/ml(0.07mM到11mM)，再更优选的约0.05到约0.8mg/ml(0.07mM到1mM)来制备。

本发明的六酰基磷酸化二糖制剂如下制备来产生摩尔比约40:1到约1:1的磷脂酰胆碱比六酰基磷酸化二糖，优选的DPPC比六酰基磷酸化二糖，优选的约2.5:1DPPC比六酰基磷酸化二糖。将六酰基磷酸化二糖称出到适当的玻璃小瓶中，例如，Type1 Plus Schott玻璃小瓶。添加处于乙醇中的适当数量的磷脂酰胆碱，优选的DPPC。将这种制品超声约1分钟，同时轻轻地旋转制剂，然后通过蒸发适当地除去乙醇。薄膜用柠檬酸盐、琥珀酸盐或磷酸盐缓冲液，优选的10mM到约50mM的柠檬酸钠pH 6.0重构，在约50℃到65℃下，优选的55℃下超声大约30分钟，优选的可以进行超过一个周期的超声处理。制备的六酰基磷酸化二糖制剂一般具有约60nm到约500nm的颗粒大小。为了实现无菌过滤，优选地进一步加工六酰基磷酸化二糖制剂来实现降低的和适当匀质的颗粒大小，优选的在约70nm到130nm之间。六酰基磷酸化二糖制剂通过80nm孔径的聚碳酸酯膜(Avestin，LFLM-80)用Avestin挤压机或等效物挤出，在约45℃到65℃下，优选的55℃下约7到约12次穿过，来实现低于约130nm的匀质的颗粒大小。为了确保无菌过滤之后可接受的回收率，优选的，所述六酰基磷酸化二糖制剂的颗粒大小是150nm或更低，但再更优选的130nm或更低。

然后所述六酰基磷酸化二糖制剂任选地可以用本文描述的浓度，优选的约25mM到约50mM，更优选的28mM到约50mM，最优选的30mM到约50mM，pH6.0的柠檬酸盐、琥珀酸盐或磷酸缓冲液进行稀释，所述缓冲液含有合适数量的聚山梨酯80以实现优选的0.02％的聚山梨酯80的终浓度，但0.01％到0.1％的聚山梨酯80是可接受的。一般地，六酰基磷酸化二糖制剂被稀释到接近0.05mg/ml到0.5mg/ml的浓度。所述六酰基磷酸化二糖制剂然后通过0.2μm过滤器，优选的Sartorius进行无菌过滤。本文描述的本发明的六酰基磷酸化二糖和佐剂制剂展现了约-20mV到-80mV的zeta电位。

本文描述的六酰基磷酸化二糖制剂在一个实施方式中被用于疫苗的制品中，作为疫苗的佐剂被施用给动物和人类。优选地，所述制剂被设计以递送约10微克六酰基磷酸化二糖每剂到约50微克六酰基磷酸化二糖每剂，优选的约20微克六酰基磷酸化二糖每剂到约50微克六酰基磷酸化二糖每剂，再更优选的，约40微克六酰基磷酸化二糖每剂到约50微克六酰基磷酸化二糖每剂。

在优选的实施方式中，作为单一化合物提供六酰基磷酸化二糖，大约98％纯度，分子量1763道尔顿(其结构在附图1中显示)。优选的六酰基磷酸化二糖的一个来源是AvantiPolar Lipids(Alabaster，Alabama，USA)(PHAD)。然而，本发明的六酰基磷酸化二糖组合物涵盖六酰基磷酸化二糖或六酰基磷酸化二糖的药学上可接受的盐。组合物中使用的六酰基磷酸化二糖可以是完全或部分合成的或是非合成的，而完全合成的是优选的。

在其他实施方式中，六酰基磷酸化二糖的衍生物，例如，3-脱酰基-六酰基磷酸化二糖(可从Avanti Polar Lipids获得；称为3D-PHAD)在本发明的组合物和制剂中单独使用或与六酰基磷酸化二糖组合使用。3-脱酰基-六酰基磷酸化二糖以接近大于98％的纯度提供，分子量1537道尔顿(其结构在附图1A中显示)。

与PHAD的纯度鲜明对比的是分离自沙门氏菌的GSK的单磷酰基脂质A，其作为六酰基、五酰基和四酰基类似物的动态复杂混合物存在；这些类似物的每一种在生物学活性方面都是不同的。药物和疫苗开发领域的技术人员知道PHAD优于GSK的单磷酰基脂质A，因为PHAD的制造过程、供应、使用和稳定性可以作为纯的化合物来紧密的监控。

柠檬酸盐、琥珀酸盐或磷酸盐缓冲液的浓度被用于改善所述六酰基磷酸化二糖制剂在室温下和达到约37℃下的稳定性。不受理论的限制，相信的是优选的组合PC：六酰基磷酸化二糖或它的衍生物3-脱酰基-六酰基磷酸化二糖的摩尔比，以及具有本文描述的特定浓度范围的柠檬酸盐、琥珀酸盐或磷酸盐缓冲液的组合产生了协同作用。

重要地，六酰基磷酸化二糖制剂优选地被配制为大体上没有各种赋形剂或化学物质。因而，添加胆固醇或两种或更多种磷脂酰胆碱或一种或更多种磷脂酰甘油不是必需的，优选地不被包括在本发明的制剂中。基本上没有可代谢的油，包括角鲨烯，以及大体上没有胆固醇的佐剂制剂是优选的。此外，虽然先有技术提示胆固醇是脂质体或佐剂制剂所需的必需化学物质，本文描述的佐剂制剂不需要用于佐剂的胆固醇来提供相对于先有技术制剂的显著优点，优选地不向所述佐剂制剂添加胆固醇。如实施例中所示，两种或更多种磷脂酰胆碱或一种或更多种磷脂酰甘油(总共两种或更多种磷脂酰胆碱或磷脂酰甘油)任选地可以以微小的浓度添加到制剂中，但是对于实现本发明在室温和达到约37℃下的稳定性，或防止、减低或降低严重的注射部位和全身性反应同时增强免疫应答，这些不是必需的、或是不需要的。

如本文详述的，本领域的技术人员已经使用含有MLA、MPL或这些佐剂的合成类似物的脂质体和其他各种制剂超过二十年，已经无法生产处于水悬浮液中的容许本文描述的稳定性的制剂。疫苗佐剂的室温和达到约37℃下的稳定性是本领域技术人员高度追求的目标。尽管有许多努力，还没有开发出能在本文描述的温度和持续时间下将MLA、MPL或合成类似物保持稳定的制剂。在此描述的方面解决了这个问题。

疫苗的制备

本发明的另一个实施方式进一步描述了包含佐剂或六酰基磷酸化二糖制剂以及FimCH或截短的FimH的新的疫苗组合物。这种疫苗被用于治疗和预防由革兰氏阴性细菌包括大肠杆菌和多药物抗性大肠杆菌引起的尿路感染。FimCH是FimC和FimH重组蛋白质的非共价的复合物。通过向FimCH的小瓶中添加预定体积的六酰基磷酸化二糖制剂来制备FimCH和六酰基磷酸化二糖制剂的疫苗。

以下是根据本发明制备的疫苗的实例。一般地，为了制备用于施用的疫苗，FimCH或截短的FimH的有效量的抗原与含有约0.005mg/ml到约0.5mg/ml六酰基磷酸化二糖的佐剂制剂组合，来向人类施用每次注射约10μg到约50μg的六酰基磷酸化二糖。

实际上，以下是可以由医务人员用于根据本发明制备和施用疫苗的过程的实例。所述的条件和过程是示范性的，不限制本发明的范围。

FimCH的小瓶从约-20℃的储存中取出，容许在室温下放置约二十分钟达到接近室温。在FimCH小瓶达到近似室温之后，翻转小瓶数次来混合内容物。单独地，含有六酰基磷酸化二糖制剂的小瓶从2℃到8℃储存的贮藏容器中取出。翻转六酰基磷酸化二糖制剂的小瓶数次来混合内容物，然后用无菌的1.0mL注射器抽出约0.2mL，穿过塞子注射到FimCH小瓶中。再次翻转小瓶数次来混合内容物。无菌注射水(WFI)或更优选的本发明的无菌缓冲液使用无菌的1.0mL注射器抽出0.2mL，穿过塞子注射到FimCH/六酰基磷酸化二糖小瓶中。再次翻转小瓶数次。最后，利用无菌的1.0mL注射器抽出约0.3mL制备的FimCH/六酰基磷酸化二糖疫苗。制备的疫苗每0.3mL剂量含有50μg的FimCH和20μg的六酰基磷酸化二糖。在施用之前这种制备的疫苗可以在冷藏温度或室温保存。

一般地，FimCH在-70℃、-20℃或2℃到8℃下长时间保存，或甚至在室温短时间保存约4天至两到三周。一般地，仅无菌的产品可在室温下保存，因为如果产品不是无菌的，微生物生长是可能的，但不能保证。疫苗优选地通过肌内注射来施用。一般地，约5微克的FimCH到约200微克的FimCH被施用给人类，优选的约20微克到约110微克。一般地，约10微克六酰基磷酸化二糖每剂到约50微克六酰基磷酸化二糖每剂与FimCH一起施用，更优选的约20微克六酰基磷酸化二糖每剂到约50微克六酰基磷酸化二糖每剂，再更优选的约40微克六酰基磷酸化二糖每剂到约50微克六酰基磷酸化二糖每剂，然而可以使用更多或更少。一般地，三到四剂的具有六酰基磷酸化二糖制剂的FimCH被施用给需要的患者。这些剂量一般在第0天进行，然后在首次施用后约30到60天，然后约90到180天，然后如果是优选的，约180到360天。根据需要，额外的注射可以在首次接种后12到36个月进行。

如上所述，本发明的更优选的方面是，六酰基磷酸化二糖组合物和制剂与抗原或FimCH单独地保存，因为六酰基磷酸化二糖组合物和制剂具有极好的稳定性，在向患者或人类施用之前一定时间与抗原或FimCH适当地配制或混合。然而，混合、制备和施用疫苗的其他方法是可能的，并将有效地起作用。

以下的小节中的数据展现了，本发明的佐剂制剂增强了对包括细菌和病毒抗原的其他抗原的免疫应答。一种或更多种疫苗抗原可以添加到根据本发明制备的六酰基磷酸化二糖制剂中。这些抗原可以是本文描述的FimCH蛋白质复合物，或其他抗原，包括但不限于白喉、破伤风、百日咳、脊髓灰质炎、肝炎，和/或流感病毒的抗原制品。

在另一个实施方式中，提供了施用包含佐剂或六酰基磷酸化二糖制剂以及FimCH或截短的FimH的新的疫苗组合物的方法。特别地，提供了预防和治疗由革兰氏阴性细菌包括大肠杆菌和多药物抗性大肠杆菌引起的尿路感染的方法。一般地，约5微克的FimCH到约200微克的FimCH被施用给人类，优选的约20微克到约110微克。一般地，施用约10微克六酰基磷酸化二糖每剂到约50微克六酰基磷酸化二糖每剂，优选的约20微克六酰基磷酸化二糖每剂到约50微克六酰基磷酸化二糖每剂，再更优选的约40微克六酰基磷酸化二糖每剂到约50微克六酰基磷酸化二糖每剂。取决于使用的抗原和治疗的状况，可以使用其他剂量数量和给药方案。

在另一个实施方式中，提供了在患有复发性尿路感染的人类中诱导产生针对FimH的抗体的方法。

在另一个实施方式中，提供了在患有复发性尿路感染的人类中诱导产生针对FimH的抗体的疫苗组合物。

在另一个实施方式中，提供了含有六酰基磷酸化二糖或它的衍生物3-脱酰基-六酰基磷酸化二糖的无菌组合物和无菌药物组合物；优选的，这些水性缓冲的悬浮液的组合物具有小于150nm的颗粒大小，再更优选的小于130nm。所述无菌的六酰基磷酸化二糖组合物和制剂被保存在药物容器中，所述药物容器与所述六酰基磷酸化二糖组合物和制剂直接接触。这些药物容器的实例是小瓶或注射器，更优选的，所述无菌的六酰基磷酸化二糖组合物和制剂被包含在无菌的注射器中。容纳所述六酰基磷酸化二糖组合物或制剂的这些药物容器可以被保存在批准的温度的容器中，例如，保温箱中，在室温下。这些容纳了无菌的六酰基磷酸化二糖组合物制剂的药物容器可以放置到组装的运输容器中，在室温下或达到约37℃下转移到其他位置。这些运输容器可以通过政府邮政服务或商业的运输服务来运输。由于本文描述的本发明的杰出的稳定性，接受所述六酰基磷酸化二糖组合物和制剂的地点可以是没有冷藏或间断冷藏的地点，或没有电力或只有间断电力的地点。

在另一个实施方式中，提供了包含六酰基磷酸化二糖或佐剂组合物或制剂或疫苗组合物的疫苗试剂盒。所述试剂盒任选地可以包括制备和施用所述疫苗的方法，和/或在室温下和达到约37℃下保存和暴露所述六酰基磷酸化二糖组合物或制剂的说明。描述了保存、运输和暴露温度的这些说明可以由政府管理部门包括美国FDA和欧洲药品管理局批准。优选地，一种或更多种试剂盒成分是处于注射器中的六酰基磷酸化二糖组合物或制剂。优选地，所述六酰基磷酸化二糖组合物或含有六酰基磷酸化二糖的制剂是无菌的，以及是处于无菌的注射器中的。

所述试剂盒可以包括本发明的六酰基磷酸化二糖或佐剂组合物或制剂的标签，其提供在室温下和达到和约37℃下保存和暴露所述六酰基磷酸化二糖组合物或制剂的说明或限制。描述了保存、运输和暴露温度的这些标签或说明可以由政府管理部门包括美国FDA和欧洲药品管理局批准。

如本文声明的，本发明的新的特征允许六酰基磷酸化二糖组合物和制剂在冷藏温度、室温、达到和约37℃、冷藏温度和室温之间的温度和室温下被制造、测试、分析、保存、运输、容纳、移动、转移或施用持续本文描述的时间。由于本文描述的本发明的杰出的稳定性，接受所述六酰基磷酸化二糖组合物和制剂的地点可以是没有冷藏或间断冷藏的地点，或没有电力或只有间断电力的地点。

实施例

参考以下实施例更详细地解释本公开内容的某些具体的方面和实施方式，其完全为了举例的目的来提供，而不被看作是以任何方式限制公开内容的范围。所使用的数量不代表一种限制，所述过程可以扩大来产生更大的批次。

实施例1

如下制造六酰基磷酸化二糖制剂来产生摩尔比约2.5：1的DPPC比六酰基磷酸化二糖。

PHAD Avanti Polar Lipids(Alabaster，Alabama，USA)、六酰基磷酸化二糖和DPPC可以从Avanti Polar Lipids(Alabaster，Alabama，USA)作为非GMP或GMP材料(分析证明书在表1中提供)获得。PHAD是单磷酰基脂质A的合成的版本。PHAD与DPPC一起配制来制备本发明的佐剂制剂。DPPC的发布规范在表2中提供。DPPC的转变温度是41℃。

将PHAD称出到适当的玻璃小瓶中，优选的Type 1Plus Schott玻璃小瓶。添加处于乙醇中的适当数量的大约2.3mg/ml的DPPC溶液，或等效物。将这种制品超声约1分钟，同时轻轻地旋转制品，然后通过蒸发适当地小心除去乙醇。薄膜用pH6.0的10mM柠檬酸钠重构，在大约50℃到65℃，优选的55℃下超声约30分钟。六酰基磷酸化二糖制剂一般以约0.5到1.0mg/ml，但是不超过约2.5mg/ml来制备。(如本文描述的，例如约13:1DPPC:六酰基磷酸化二糖的摩尔比也可以通过按需调整DPPC的数量使用相同的过程来制备。

制备的PHAD制剂一般展现约60nm到约500nm的颗粒大小。为了实现无菌过滤，必须一般地进一步加工PHAD制剂来实现降低的和适当均匀的颗粒大小，一般在约70nm到130nm之间。虽然有许多的参考文献，包括美国专利6,630,161，报道了高压均质化是降低脂质体的颗粒大小的优选的方法，使用压力达到25,000psi的Avestin均质器的高压匀质化不会显著地或贴切地降低这些PHAD制剂的颗粒大小。这种困难是出乎意料的。这些PHAD制剂必需使用Avestin挤压机或等效物挤压通过80nm孔径的聚碳酸酯膜(Avestin，LFLM-80)在约45℃到65℃，优选的55℃下约7到约12次穿过，来实现低于约130nm的均匀的颗粒大小。在45℃到65℃下挤压是重要的参数。为了确保过滤除菌之后可接受的回收率，六酰基磷酸化二糖佐剂制剂的颗粒大小优选地是150nm或更低，但更优选的130nm或更低。

然后可以用含有适当数量的聚山梨酯80的10mM柠檬酸钠pH6.0，稀释六酰基磷酸化二糖制剂，来达到最优选的0.02％的聚山梨酯80终浓度，但是0.01％到0.1％的聚山梨酯80是可接受的。一般地，六酰基磷酸化二糖制剂被稀释到约0.05mg/ml到0.5mg/ml的浓度。这些六酰基磷酸化二糖制剂然后通过0.2μm滤器，优选的Sartorius来无菌过滤。

根据低温透射电子显微镜的测定，本文描述的佐剂制剂是悬浮液。

额外的或可选择的步骤可以增加到上述过程中来制备六酰基磷酸化二糖制剂。举一个实例，乙醇可以通过旋转蒸发或等价方法，或通过氮气流或等价方法来蒸发。作为其他的实例，包括本发明的缓冲液的超声处理步骤可以重复两次或更多次，在重复的超声处理之间制剂可以被冷却到室温或更低温度，在所述超声处理之前、期间或之后，制剂可以保持在类似于超声处理步骤的温度下一小时或更久。

表1：来自Avanti Polar Lipids公司的PHAD的分析证明信息

表2：来自Avanti Polar Lipids公司的DPPC的分析证明信息

实施例2

疫苗的抗原可以如下制备。

FimCH是FimC和FimH重组蛋白质的非共价的复合物。所述重组蛋白质来自转基因的大肠杆菌培养物。FimC和FimH蛋白在大肠杆菌中单独地表达，它们自发地形成非共价的复合物。FimCH复合物的分子量大约51,700道尔顿。

复合物的FimH蛋白(SEQ ID NO：1)具有29,065道尔顿的分子量，它由以下序列表示的279个氨基酸残基组成：

Phe Ala Cys Lys Thr Ala Asn Gly Thr Ala Ile Pro Ile Gly Gly Gly SerAla Asn Val Tyr Val Asn Leu Ala Pro Val Val Asn Val Gly Gln Asn Leu Val ValAsp Leu Ser Thr Gln Ile Phe Cys His Asn Asp Tyr Pro Glu Thr Ile Thr Asp TyrVal Thr Leu Gln Arg Gly Ser Ala Tyr Gly Gly Val Leu Ser Asn Phe Ser Gly ThrVal Lys Tyr Ser Gly Ser Ser Tyr Pro Phe Pro Thr Thr Ser Glu Thr Pro Arg ValVal Tyr Asn Ser Arg Thr Asp Lys Pro Trp Pro Val Ala Leu Tyr Leu Thr Pro ValSer Ser Ala Gly Gly Val Ala Ile Lys Ala Gly Ser Leu Ile Ala Val Leu Ile LeuArg Gln Thr Asn Asn Tyr Asn Ser Asp Asp Phe Gln Phe Val Trp Asn Ile Tyr AlaAsn Asn Asp Val Val Val Pro Thr Gly Gly Cys Asp Val Ser Ala Arg Asp Val ThrVal Thr Leu Pro Asp Tyr Arg Gly Ser Val Pro Ile Pro Leu Thr Val Tyr Cys AlaLys Ser Gln Asn Leu Gly Tyr Tyr Leu Ser Gly Thr His Ala Asp Ala Gly Asn SerIle Phe Thr Ash Thr Ala Ser Phe Ser Pro Ala Gln Gly Val Gly Val Gln Leu ThrArg Asn Gly Thr Ile Ile Pro Ala Asn Asn Thr Val Ser Leu Gly Ala Val Gly ThrSer Ala Val Ser Leu Gly Leu Thr Ala Asn Tyr Ala Arg Thr Gly Gly Gln Val ThrAla Gly Asn Val Gln Ser Ile Ile Gly Val Thr Phe Val Tyr Gln

复合物的FimC(SEQ ID NO：2)蛋白具有22,700道尔顿的分子量，它由以下序列表示的205个氨基酸残基组成：

Gly Val Ala Leu Gly Ala Thr Arg Val Ile Tyr Pro Ala Gly Gln Lys GlnVal Gln Leu Ala Val Thr Asn Asn Asp Glu Asn Ser Thr Tyr Leu Ile Gln Ser TrpVal Glu Asn Ala Asp Gly Val Lys Asp Gly Arg Phe Ile Val Thr Pro Pro Leu PheAla Met Lys Gly Lys Lys Glu Asn Thr Leu Arg Ile Leu Asp Ala Thr Asn Asn GlnLeu Pro Gln Asp Arg Glu Ser Leu Phe Trp Met Asn Val Lys Ala Ile Pro Ser MetAsp Lys Ser Lys Leu Thr Glu Asn Thr Leu Gln Leu Ala Ile Ile Ser Arg Ile LysLeu Tyr Tyr Arg Pro Ala Lys Leu Ala Leu Pro Pro Asp Gln Ala Ala Glu Lys LeuArg Phe Arg Arg Ser Ala Asn Ser Leu Thr Leu Ile Asn Pro Thr Pro Tyr Tyr LeuThr Val Thr Glu Leu Asn Ala Gly Thr Arg Val Leu Glu Asn Ala Leu Val Pro ProMet Gly Glu Ser Ala Val Lys Leu Pro Ser Asp Ala Gly Ser Asn Ile Thr Tyr ArgThr Ile Asn Asp Tyr Gly Ala Leu Thr Pro Lys Met Thr Gly Val Met Glu

为了产生转基因细胞系，来自大肠杆菌菌株J96的FimC基因用引物SLC4-28-fimC5和SLC4-28-FimC3从纯化的J96基因组DNA中扩增得到771碱基对的产物。用BamHI和EcoRI消化，纯化，连接到用相同的酶(BamHI和EcoRI)切割的pTRC99a中。连接产物转化到大肠杆菌C600细胞中，在氨苄西林上选择，产生质粒pSJH-32。

氨苄西林抗生素抗性使用以下过程切换为卡那霉素：引物pKD4-pr1和pKD4-pr2用于从pKD4扩增卡那霉素抗性基因。这一PCR产物用T4多核苷酸激酶磷酸化，进行凝胶纯化。pSJH-32用ScaI和BglI切割，用T4 DNA聚合酶钝化，用小牛肠碱性磷酸酶脱去磷酸，然后与磷酸化的卡那霉素抗性基因PCR产物连接。连接产物然后转化到大肠杆菌C600细胞中，在卡那霉素上选择，产生质粒pSJH-319。

来自菌株J96的FimH基因用引物FimH5和FimH3从纯化的J96基因组DNA中扩增得到978碱基对的产物。用SacI和HindIII消化，纯化，连接到用SacI和HindIII消化的pBAD33中。此后，构建体转化到C600细胞中，在氯霉素上选择。

实施例3

生物加工(获得疫苗的抗原的过程)。

启动生物加工步骤，将主细胞库(MCB)接种到含有带卡那霉素(50μg/ml)和氯霉素(20μg/ml)的APS LB培养基的摇瓶中。当OD达到2.0-3.0单位(约生长15小时后)时，细胞培养物无菌转移到反应器中用于进料-分批发酵。在接种之前将含有APS超级肉汤、约0.8％甘油和抗生素的培养基消毒。FimH蛋白表达在OD＞10时用IPTG诱导。添加IPTG后五分钟，用阿拉伯糖诱导FimC蛋白表达。大约一小时后收获细胞。在收获之后，通过连续的或分批的离心从培养基成分中分离细胞。

蛋白质回收

重组FimCH被表达在大肠杆菌周质中。作为革兰氏阴性细菌，大肠杆菌拥有内和外脂质双分子层膜。脂质双分子层之间的空间是周质。在离心之后立即使用周质制备物从细胞中回收FimCH。在存在蔗糖、Tris和EDTA的情况下在2-8℃将细胞与重组溶菌酶反应。然后离心混合物，采集产生的周质蛋白质溶液。蛋白质然后用硫酸铵沉淀，离心，重悬浮在20mMMES pH 5.9中，然后使用SpectraPor 2透析膜(Spectrum Labs 132680)通过透析过滤到20mM MES pH 5.9中。当溶液电导率降低到大约<1.5mS/cm时，采集溶液并转移到纯化步骤。

蛋白质纯化

纯化由三个柱层析步骤(1.CEX，2.HIC，3.CEX)，使用SpectraPor 2渗析膜(Spectrum Labs 132680)渗滤随后过滤的一个缓冲液交换步骤，以及一个最终的无菌过滤步骤组成。渗滤步骤用于将蛋白质交换到pH 5.9的20mM MES缓冲液中，从而它将结合第二个CEX柱。

两个CEX步骤使用XK26柱中的Source 15S(GE Healthcare 17-1273-02)。对两个CEX柱，使用以下的条件：缓冲液A：20mM MES，pH 5.9；缓冲液B：20mM MES/500mM氯化钠，pH5.9；除了XK26/10柱的装载之外，所有步骤8mL/分钟，用5CV的缓冲液B预平衡，用4CV的缓冲液A平衡柱子，对XK26 10使用样品泵并特别地不通过层析泵以5mL/分钟加载透析的FimCH样品，用4CV的缓冲液A洗涤柱子，用0-25％缓冲液B的线性的5CV梯度洗脱柱子，采集级分。

对于HIC柱，在XK26柱中使用Butyl Sepharose 4FF(GE Healthcare17-0980-01)。缓冲液C：20mM MES/550mM硫酸铵，pH5.9；除了加载之外对XK26/10为8mL/分钟，用3CV的缓冲液A(如上述)预平衡柱子，用6CV的缓冲液C平衡柱子，以5mL/分钟XK26/10柱加载集中的FimCH样品，用6CV的缓冲液C洗涤柱子，用0-100％缓冲液A和馏分收集的线性的4CV梯度洗脱柱子。FimCH配制以0.3mg/mL的浓度配制在20mM MES pH 5.9或20mM柠檬酸钠pH 5.4中。然后通过0.2μm无菌滤器无菌过滤。FimCH是稳定的，可以在-20℃保存约至少2年。

实施例4

体外甘露糖结合的效价(证明FimCH的生物学活性)

FimCH药物物质(例如，来自实施例3)的生物学活性通过体外的甘露糖结合分析来测定。FimH蛋白是大肠杆菌用以结合糖基化蛋白质上的甘露糖残基的细菌粘附素。在尿路感染期间，FimH粘附素结合膀胱上皮细胞上的甘露糖基化的尿溶蛋白蛋白，其促进结合的大肠杆菌的内在化。FimCH与甘露糖基化的尿溶蛋白的结合是大肠杆菌导致尿路感染必不可少的。为了在体外监视FimH的甘露糖结合活性，观察FimH与酶辣根过氧化酶(HRP)的结合。HRP是含有甘露糖残基的糖基化蛋白，早先被用于研究哺乳动物甘露糖结合受体。也已经产生并研究了HRP和凝集素ConA的复合物，其结合α-D-甘露糖基和α-D葡萄糖基基团。这些结果表明HRP作为其他已知的甘露糖结合蛋白的配体起作用。利用下文描述的这种效价测定，与FimH的HRP结合显示了是浓度依赖性的，并且被阻断甘露糖与FimH结合的小分子抑制。

在体外的FimCH效价分析中，通过结合在ELISA平板上的、纯化的和有作用的抗-FimH抗血清来“捕获”FimCH。这项分析中使用的抗-FimH抗血清已经展现了在间接ELISA(作为检测抗血清，附图3)和Western印迹中结合FimH的能力。然后添加HRP，清洗掉过量的HRP，检测结合的HRP的活性。测得的HRP活性与添加的FimCH的浓度成比例(附图4)。这些结果表明，HRP以剂量依赖性的方式结合FimH。

为了证明HRP与FimH的结合需要FimH甘露糖结合活性，对也处于与FimC的复合物中、称为Q133K的甘露糖结合缺陷性FimH进行分析并与FimCH比较。Q133K与FimH共有相同的氨基酸序列，只是位置133处的关键的谷氨酰胺被赖氨酸替换。这一突变处于FimH甘露糖结合口袋中，使得Q133K在结合甘露糖和甘露糖基化蛋白方面有功能上的缺陷。如附图4中所示，Q133K FimCH不结合HRP。在间接ELISA(附图3)中，Q133K突变复合物被纯化的抗FimH抗血清识别。这表明，使用Q133K的HRP信号缺乏不是由于纯化的抗血清不能结合Q133K；而是由于Q133K不能结合HRP上的甘露糖残基。这些结果也表明，HRP不结合FimC，因为Q133K也处于与FimC的复合物中。

如Hung等人2002中证明的，FimH在位置54、133、135和140处的单点突变完全地消除甘露糖结合。按照Hung等人.所报道的“……在不直接结合甘露糖的原子上，在甘露糖结合口袋中即使最轻微的改变，显著地降低结合”，表明可在体外发生的突变可以严重地限制或消除FimH甘露糖结合活性。HRP缺乏对Q133K突变体的结合支持了这种分析用来评估FimH与甘露糖基化蛋白结合的生物学活性的能力。

已经描述了甘露糖结合FimH的几种小分子抑制物。这些抑制物中的两种，4-甲基伞形酮酰基-α-D甘露吡喃糖苷(UFMP)和甲基-α-D-甘露吡喃糖苷(MDMP)已经被用于进一步增强这种效价测定。UFMP结合FimH的报告的解离常数(Kd)是20nM，它比MDMP的2.2μM的Kd更强大约100倍。如所预料的，在HRP结合步骤中添加这些FimH甘露糖结合抑制物的任一个以剂量依赖性方式阻断了HRP与FimH的结合(参见附图5)。对于UFMP，在10ng/ml(30nM)下观察到50％抑制。对于MDMP，在大约1μg/ml(5.1μM)下观察到50％抑制，其比UFMP的浓度高大约100倍。

这些结果证明了这种测定用来评估FimH的生物学活性和验证制造过程的批次之间的一致性的能力。此外，这种效价测定确认了FimH表位的正确折叠，对于通过施用FimCH/六酰基磷酸化二糖疫苗来产生显示了降低小鼠膀胱中大肠杆菌CFU的IgG抗-FimH是预示性的。

实施例5

据CEX-HPLC的FimCH药物物质混杂物

CEX-HPLC被用于测定最终的FimCH药物物质中的FimCH复合物、未结合的FimC和混杂物。使用20mM MES缓冲液pH6.2(缓冲液B)(缓冲液A是20mM MES缓冲液，pH6.2)中0.3MNaCl的梯度从GE Healthcare Mono S 5/50GL柱上洗脱蛋白质。在T＝0时，移动相是100％缓冲液A，在T＝22分钟时，移动相是100％缓冲液B。根据峰面积确定未结合的FimC和混杂物的相对含量。在附图6中提供了代表性的层析谱。

实施例6

FimCH和PHAD制剂：在家兔中85天肌肉内毒性/免疫原性研究，21天的恢复期(GLP)

在雌兔中进行关键的GLP毒性研究，来评估含有本发明的PHAD制剂(DPPC:PHAD-约2.4:1摩尔比)的FimCH疫苗的毒性和免疫原性。该研究检查眼科发现、抗体评估和病理解剖。雌兔通过每3周的IM注射(第1、22、43、64和85天)持续13周施用总共5剂的盐水对照(N＝6)，只40到50μg的PHAD(N＝12)，100μg FimCH加20μgPHAD(N＝6；低剂量)，或125μg FimCH加40到50μg PHAD(N＝12；高剂量)。在第五剂之后的三天(第88天)，每组的6只兔子进行安乐死，剩下的只用PHAD组和FimCH高剂量组中的6只兔子在3周恢复期之后(第106天)进行安乐死。

根据临床观察、眼科学、体温、体重、采食量、临床病理学、肉眼尸检、器官重量和病理解剖学数据来评估毒性。在每次注射之前和之后2、4、6、24、48和72小时获得体温。除了标准的临床病理学参数(给药前，第2和88天)之外，给药后2天和7天评估C-反应性蛋白(CRP)和纤维蛋白原。每一剂后24、48和72小时，可能的注射部位反应使用Draize量表对水肿和红斑进行计分，评估局部毒性的其他表现(即，焦痂、水泡、溃疡和血肿)。对第1、22、43、64和85天给药前，在第88和106天的尸检之前采集的血清样品，在第64天给药之前、第88和106天尸检之前采集的尿液样品，第1天给药之前、第88和106天尸检之前采集的阴道洗出物进行抗FimH抗体评估。尿液和阴道洗涤样品的抗体评估是使用有资格的MSD-ECL分析定性的。使用验证有效的MSD-ECL分析测定血清中的抗体水平。在用FimCH和PHAD免疫的18只兔子中，在大约第88天，17只展现了约1:3,200,000的抗FimH IgG滴度。

所有的兔子存活到计划的尸检之时。初步数据表明FimCH加PHAD以及单独的PHAD被良好地耐受。这些发现证明了，对于临床观察、体重、采食量、体温、临床病理学或器官重量，没有明显的PHAD单独的影响或疫苗相关的影响。根据活体观察，局部反应是有限的。

使用按照DPPC:PHAD大约1:3.9摩尔比制备的FimCH和PHAD进行了类似的家兔研究。在这项研究中，在大约第43天，16只家兔的仅5只展现了1:400,000到1:800,000的抗FimH IgG滴度。相比之下，以DPPC:PHAD大约2.4:1的摩尔比制备的FimCH和PHAD(上文列出的)免疫接种的18只家兔中的16只在大约第43天展现了1:400,000到3,200,000的抗FimHIgG滴度。这些免疫原性差异与本文描述的在小鼠中进行的研究一致，表明约2.4:1的DPPC:PHAD摩尔比优于约1:3.9的DPPC:PHAD摩尔比。

实施例7

为了测试小鼠UTI感染模型中六酰基磷酸化二糖作为佐剂用于全身性疫苗接种的效力，C3H/HeN小鼠在IM免疫后通过经尿道导管插入术感染大约1×10⁸CFU的临床膀胱炎大肠杆菌分离物UTI89。雌性C3H/HeN小鼠(大约9周龄)购自Charles River实验室(Wilmington，MA)。小鼠在轻度异氟烷麻醉(Henry Schein，Melville，NY)下在右腿通过肌肉内途径(IM)使用30规格针头以50μl体积进行注射。在这些效力研究中，小鼠用12.5μgPHAD/15μg FimCH进行免疫。与单独用佐剂免疫的小鼠和首次接收试验的小鼠(使用PHAD的实验在图7中显示)相比，用PHAD作为佐剂和FimCH作为抗原免疫的小鼠显示了在感染后一天或两天膀胱中的大肠杆菌CFU的统计学上显著的降低。这些数据表明，用六酰基磷酸化二糖作为佐剂的FimCH疫苗在小鼠中产生了抗体，其降低了膀胱的大肠杆菌定殖。这些数据提供了证据，即，使用根据本文描述的组合物制备的、以及根据本文描述的方法使用的六酰基磷酸化二糖作为佐剂的FimCH疫苗施用给有需要的人类患者也将降低人类膀胱中的大肠杆菌定殖。

实施例8

用六酰基磷酸化二糖制剂或弗氏佐剂作为佐剂的截短的FimH(FimHt)：家兔中的免疫原性研究

雌性家兔通过IM注射在第0、21和42天施用总共3剂的100μg FimHt加约50μg本发明的PHAD制剂(N＝2)，或总共5剂的100μg FimHt加弗氏佐剂(首次接种是完全的，在约第14、21、49和70天的每次强化是不完全的)(N＝2)。在这项实验中，截短的FimH具有一系列组氨酸或组氨酸标签，本领域技术人员理解的是也可以使用其他截短版本的FimH，最优选的需要甘露糖结合结构域。这个实施例中的截短的FimH由具有C-末端6-组氨酸标签(SEQ IDNO：3)的FimH残基1到175组成。FimH的序列在实施例2中描述。对约第30天或约第35和56天采集的血清样品进行抗FimH抗体评估。血清中的抗体使用本文描述的ELISA来测定。这个实验的捕获抗原是没有组氨酸标签的相当地截短的FimH。用两种制剂接种的家兔展现了大于1:1,600,000(免疫前血清<1:10,000)的抗FimH IgG。早先的截短的FimH版本已经公开，一个实例是美国专利6,737,063中的，特别地将它完全合并在本文中。

实施例9

施用给家兔的具有六酰基磷酸化二糖制剂的FimCH疫苗

使用50μg FimCH与有和没有0.1％聚山梨酯80的54μg PHAD(本发明的PHAD制剂，10mM柠檬酸钠，pH 6.0)通过IM注射在第0天免疫、在第21、42天强化两组家兔(N＝3)。使用本文描述的ELISA测定血清中的抗体水平。包括在约第30天从两个组中采集血清。在两个组中，IgG抗FimH滴度大约相当于或超过1:1,600,000(免疫前的血清<1:10,000)。在此描述的数据表明，有或者没有聚山梨酯80的本发明的六酰基磷酸化二糖制剂的FimCH疫苗产生了相等的免疫原性应答。

实施例10

组合物中PHAD和DPPC的HPLC分析

PHAD制剂中的PHAD和DPPC浓度使用Agilent Eclipse XBD C18，1.8μm，4.6mm×50mm柱通过HPLC-ELSD进行分析。移动相如下：MP A：水中的20mM乙酸铵/1％乙酸；MP B：甲醇中的20mM乙酸铵/1％乙酸；以及MP C：甲醇/氯仿(50/50)中的20mM乙酸铵/1％乙酸。方法1：梯度从5％MP A和95％MP B开始，在2分钟时是100％MP B，在8分钟时是100％MP C。方法2：梯度从5％MP A和95％MP B开始，在2分钟时是100％MP B，在15分钟时是100％MP C。样品稀释剂1：85:15(有20mM乙酸铵/1％乙酸的75:15:10的甲醇：氯仿：水)：(有20mM乙酸铵/1％乙酸的1：1的甲醇：氯仿)。样品和标准物用样品稀释剂1按1：4稀释。样品稀释剂2：有20mM乙酸铵/1％乙酸的(70:25:5)甲醇：氯仿：水。如果使用样品稀释剂2，样品和标准物用样品稀释剂2按1：10稀释。ELSD增益是8，温度60℃，氮气流设置在大约3.7bars。使用方法2和样品稀释剂2的实例层析谱在附图8中示出。

实施例11

PHAD组合物和制剂的稳定性研究

使用实施例10中描述的HPLC方法，作为悬浮液的不同的PHAD制品，或作为包括磷脂酰胆碱的悬浮液的PHAD制剂的稳定性通过分析这些制品的PHAD浓度并将其与初始结果比较来监视。通过结果意味着PHAD浓度处于发布样品的初始测试结果的加/减20％之内，这处于使用蒸发光散射检测器(ELSD)的HPLC方法的界限之内。在2℃到8℃或25℃或到37℃下保存时，比较这些制品的PHAD浓度来映射(估计)这些样品在数月到数年间的稳定性。对于本领域技术人员而言，25℃的数据是中度的/加速的条件，37℃的数据是加速的条件，用于映射2℃到8℃的长期保存条件下的贮存寿命。首先测定了允许PHAD的优越稳定性的缓冲液；然后用包括磷脂酰胆碱的PHAD制剂评估这些优选的缓冲液。

表3.在选定的缓冲液中25℃下7天的PHAD稳定性

		条件/时间点	结果
				1	水中的0.5mg/ml PHAD	25℃/7天	失败
2	10mM柠檬酸钠pH6.0中的0.5mg/ml PHAD	25℃/7天	通过
				3	10mM柠檬酸钠pH5.0中的0.5mg/ml PHAD	25℃/7天	通过
4	50mM柠檬酸钠pH6.0中的0.5mg/ml PHAD	25℃/7天	通过
				5	100mM柠檬酸钠pH6.0中的0.5mg/ml PHAD	25℃/7天	失败
6	10mM乙酸钠pH6.0中的0.5mg/ml PHAD	25℃/7天	失败
				7	10mM琥珀酸二钠pH6.0中的0.5mg/ml PHAD	25℃/7天	通过
8	磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的0.5mg/ml PHAD	25℃/7天	失败
				9	200mM Na2HPO4和100mM柠檬酸pH6.0中的0.5mg/ml PHAD	不可用	沉淀
10	20mM Na2HPO4和10mM柠檬酸pH6.0中的0.5mg/ml PHAD	25℃/7天	通过
				11	10mM Na2HPO4pH6.0中的0.5mg/ml PHAD	25℃/7天	通过

表格中的数据表明，约10mM到50mM的柠檬酸盐、琥珀酸盐和磷酸盐缓冲液优于所检查的某些其他缓冲液，在列出的温度和列出的时间期下提供了稳定性。

表4.在选定的缓冲液中在25℃下持续30或60天，以及在37℃下持续7天、60天或4个月的PHAD的稳定性

表4中的数据表明，约30mM到约50mM的柠檬酸盐和磷酸盐缓冲液优于所检查的其他缓冲液。柠檬酸盐和磷酸盐缓冲液在列出的温度和列出的时间周期下提供了稳定性。数据表明将柠檬酸盐和磷酸盐浓度提高到约25mM到约50mM，更优选的28mM到约50mM，最优选的30mM到约50mM的显著的稳定性效益。根据在此描述的所有数据，显示了琥珀酸盐作为缓冲液的优选的运用。在30mM到50mM柠檬酸盐和磷酸盐缓冲液中六酰基磷酸化二糖在37℃下持续60天或更久的稳定性是先有技术中未知的，是本发明的重要的方面。

表5.在25℃下60天或37℃下30天，没有聚山梨酯80和没有挤压，在选定的缓冲液和选定的磷脂酰胆碱中本发明的0.5mg/ml(或如果标注了1.5mg/ml)PHAD制剂的稳定性。按2.5到1比PHAD的摩尔比制备磷脂酰胆碱。

表5中的数据表明了本发明组合约10mM到50mM的柠檬酸盐、琥珀酸盐和磷酸盐缓冲液与磷脂酰胆碱的显著的和出乎意料的效益。本发明的优选的缓冲液与磷脂酰胆碱的组合产生了与单独的缓冲液相比制剂中六酰基磷酸化二糖的优越的稳定性。

表6.

如表6所示，约10mM的柠檬酸盐与DPPC比六酰基磷酸化二糖的特定摩尔比的组合提供了约25℃下的长期稳定性。

如上表中显示的，在水中制备的制剂在2℃到8℃保存时是短期稳定的，然而，长久以来追求的目标是降低冷链保存和管理。本文公开的发明性的佐剂制剂通过提供具有在室温到约37℃下延长的稳定性的佐剂制剂实现了这一目标。表6中的数据清楚地显示了，在柠檬酸盐缓冲液中制备的这些制剂的PHAD浓度将保持稳定，在大约25℃下持续至少约6个月或更久，在2℃到8℃下可能持续2到3年。

向磷脂酰胆碱：六酰基磷酸化二糖制剂添加柠檬酸盐、琥珀酸盐或磷酸盐缓冲液显著地和出乎意料地允许在室温下的保存和达到约37℃下的暴露。在水中制备的磷脂酰胆碱:六酰基磷酸化二糖制剂可以在小鼠和家兔中产生相当的免疫原性反应，但是在约25℃下是不稳定的。

实施例12

用MalvernZS90或Brookhaven Instruments Corp.，使用ZetaPlusParticle Sizing软件，使用动力学光散射对PHAD制剂测定颗粒大小和ζ电位。遵循厂家的指导和建议。表7提供了代表性的数据。ζ电位值被用作估计双分子层的电荷的定性数据的一块，以及如本文描述的来使用。PHAD制剂的稳定性根据制剂的颗粒大小和PHAD的浓度来实验上地测定。

表7.

如上所示，与本发明的含有PHAD的制剂相比，单独的DPPC具有显著更低的zeta电位，更大得多的平均颗粒大小。DPPC的临界胶粒团浓度是约0.46纳摩尔。这些数据提供了证据，即，单独的DPPC是一种与DPPC和PHAD组合物显著不同的组合物。

实施例13

比较了保存在2℃到8℃或约25℃下，有或者没有聚山梨酯80或甘油来制备的实施例1的PHAD制剂的颗粒大小，来映射(估计)PHAD制剂在12到36个月期间的颗粒大小的稳定性。制备多个批次的PHAD制剂，一般展现了挤压之后即时的70到100nm之间的颗粒大小。这些PHAD制剂的目标是确保它们的平均有效直径在它的贮存寿命期间优选地保持在小于150nm，再更优选的小于130nm，基于在此描述的数据贮存寿命预计是2到3年或更久。重要的是在中间/加速条件下，例如25℃下归纳一定时间周期的平均有效直径，来帮助预测在2℃到8℃下大约2年或更久时的颗粒大小。

用MalvernZS90或Brookhaven Instruments Corp.，使用ZetaPlusParticle Sizing软件，使用动力学光散射测定颗粒大小和zeta电势。遵循仪器厂家的指导和建议。

表8.

这个实施例的表8中呈现的数据映射了，没有聚山梨酯80、在2℃到8℃保存的PHAD制剂的颗粒大小将保持在低于150nm大约最少2年，如下文描述的暗示了可能的3年。在这个具体的实施例中，仅为了这一测试的目的，稳定的是指平均有效直径保持在仪器的限制之内的低于150nm。对于本领域技术人员而言，25℃的数据是中间的/加速的条件，用于映射2℃到8℃的长期保存条件下的贮存寿命。这些数据清楚地映射了，这些PHAD制剂的颗粒大小将在约25℃下保持稳定至少6个月或更久，在2℃到8℃下可能3年。如本文描述的，这些PHAD制剂在25℃下的这种稳定性是先有技术未知的和出乎意料的。

实施例14

本发明的制剂与其他佐剂制剂在诱导小鼠的抗FimH抗体方面的比较

如实施例1中描述的制备本发明的PHAD制剂或水性制剂(这个实施例中的水性制剂是指美国专利6,491,919和美国专利申请20080131466中描述的脂质与佐剂的摩尔比)，有以下的例外。使用指定的脂质和/或摩尔比(在括号中显示)，根据实现匀质悬浮液的需要在约45℃进行超声约30分钟到2小时。如早先描述的，所有的脂质购自Avanti PolarLipids。

雌性C3H/HeN小鼠(大约9周龄)购自Charles River实验室(Wilmington，MA)。小鼠在轻度异氟烷麻醉(Henry Schein，Melville，NY)下在右腿通过肌肉内途径(IM)使用30规格针头以50μl体积进行注射。在第1天和第29天，小鼠用12.5μg PHAD或它的衍生物3-脱酰基-六酰基磷酸化二糖或弗氏佐剂(皮下施用)和15μg FimCH免疫接种。如本领域技术人员已知的，在使用时，在第1天给与完全弗氏佐剂，在第29天是不完全弗氏佐剂。

用于血清抗体检测的ELISA：在处死时从小鼠采集血清，通过ELISA分析抗FimH抗体。FimH截短的T3以PBS中2μg/ml附着于Immulon 4HBX平板(ThermoFisher)，在4℃过夜。在用PBS+0.05％Tween 20洗涤之后，用PBS中的1.5％BSA(Sigma Aldrich)阻断开放的结合位点1小时。在洗涤之后，样品血清的稀释物(在具有0.05％Tween 20、0.1％BSA、0.5％甲基-α-D-甘露吡喃糖苷的PBS中)孵育2小时。在洗涤之后，样品稀释缓冲液中1:500稀释的生物素化山羊抗小鼠IgG检测抗血清(Sigma Aldrich)在反应孔中4℃孵育过夜。在洗涤之后，样品稀释缓冲液中1:25,000稀释的抗生物素蛋白-辣根过氧化物酶(HRP，Sigma Aldrich)在反应孔中孵育20分钟。在洗涤之后，使用磷酸柠檬酸缓冲液中的TMB底物(Sigma Aldrich)检测HRP活性。使用VERSAMAX PLUS酶标仪在630nm处读取光密度，使用SoftMax Pro分析软件(Molecular Devices，Sunnyvale，California)进行分析。抗体滴度被定义为具有高于背景的信号的最高稀释度。

表9.

如表9中清楚显示的，与没有佐剂、弗氏佐剂、或1:3.9摩尔比的DPPC比PHAD的水性制剂相比，约2:1到约13:1的DPPC比PHAD摩尔比在增强小鼠中对FimH的免疫应答方面是优越的。弗氏佐剂被认为是动物试验中使用的标准佐剂。数据显示了，本文描述的约2:1到13:1的摩尔比优于这种常用的前临床佐剂。这是本发明展现了对先有技术制剂的优越性的一个方面。表9中的数据还表明，向这些制剂添加DPPC不减弱PHAD制剂的预期用途，即，增强对FimH的免疫应答。

实施例15

本发明的制剂在24小时内保持匀质混合物的测定。实施例1的过程被用于制备约2.5比1的DPPC:PHAD摩尔比的PHAD制剂，只是不添加聚山梨酯80。含有PHAD制剂的小瓶轻轻地翻转约三到五次。然后，容许PHAD制剂保持在室温约24小时。在24小时之后，不翻转、摇动或搅动PHAD制剂，小心地从PHAD悬浮液的顶部、中间和底部取出小的等分量。通过本文早先描述的HPLC分析这些等分量的PHAD浓度。结果表明，来自顶部、中间和底部的等分量含有相等的PHAD浓度。这些结果证明，本发明的PHAD制剂在24小时内不沉积。

实施例16

人类临床研究中使用的本发明的制剂

实施例1的佐剂制剂和FimCH根据cGMP制备，用于包含约21到64岁女性的人类临床研究。如本文早先描述的通过向FimCH的小瓶添加预定体积的PHAD制剂，以获得每个小瓶优选的FimCH和PHAD浓度，来制备FimCH和PHAD制剂的疫苗。IM(肌肉内)注射适当体积的制备的疫苗，来向每个女性受试者施用50μg或约107μg的FimCH，以及10μg、20μg或约40μg的PHAD。

根据人类中的这些IM注射，疫苗展现了，与在人类中使用的某些其他已知的佐剂制剂相比，本发明的佐剂制剂与FimCH在人类中产生了更少的严重的注射部位和全身性反应。这是本发明的显著的方面。注射部位和全身性反应的中间数据显示如下，注射次数是到每位女性的中间分析时为止。人类研究正在进行，研究中的女性计划接受4次注射。

表10.

	女性人数	按微克的FimCH/PHAD剂量	注射的次数	严重的注射部位和全身性反应
					组1	5	107μg/0μg	3到4	无
组2	8	50μg/10μg	2到3	无
					组3	16	50μg/20μg	1到2	无
组4	8	50μg/40μg	1	无

在中期分析时，已经对37名女性进行了超过60次IM注射，没有观察严重的注射部位和全身性反应。在这个中期分析之时，组2中的女性在两次IM注射之后展现了对FimH的抗体反应，其比疫苗接种之前的初始值大10倍。这些数据表明，疫苗产生了针对FimH的预期的抗体反应。这项研究中的女性将接受4次疫苗IM注射。组5和6将对有复发性UTI病史的女性开放。

相比较，施用含有佐剂MPL和白矾的Cervarix希瑞适疫苗引起约8％到超过10％的受试者展现严重的注射部位反应和全身性反应。如Treanor等人(Vaccine，2013，31(48)，5760-5)的出版物中报告的，已经在具有角鲨烯的不同制剂中制备PHAD并施用给人类。根据这一报告，这种制剂中的5μg的PHAD引起严重的局部反应、颤栗和僵直，因而限制了在将来的研究中使用这一制剂仅含有2微克或更少的PHAD。在这一制剂中1微克的PHAD下，仍然观察到严重的注射部位反应和全身性反应。在Treanor等的这一制剂中在2微克或更少的PHAD下，佐剂PHAD产生免疫应答的效益是有限的，因而由于较差的制剂剥夺了PHAD的潜力。然而，本发明的佐剂制剂使用优越的制剂克服了这一限制，其允许施用高达50μg的六酰基磷酸化二糖，或可能更多，更少的严重的注射部位和全身性反应。这些人类数据提供了证据，即，六酰基磷酸化二糖可以用本文描述的制剂以100μg或更多施用给人类。本发明的佐剂制剂优于早先尝试的那些制剂。

本说明书中引用的所有参考文献，包括但不限于本文引用的所有报纸、出版物、演讲、教科书、报告、手稿、手册、互联网发帖、期刊论文、周刊等。本文的参考文献的讨论仅仅意图概括它们的作者的主张，不承认任何参考文献构成先有技术。发明人保留权利来挑战引证的参考文献的准确性和适当性。

希望的是本文公开的所有可专利的主题被要求权利，这些可专利的主题不被贡献给公众。因而，希望的是权利要求根据该意图被广义地解读。此外，除非根据上下文是明显矛盾的，希望的是对“一”、“一个”的所有引用，以及随后回头指代由“一”“一个”所指示的在先基础时对“所述”的相应的引用，按照“至少一种”的意思被广义地解读。类似地，除非根据上下文是明显矛盾的，词语“或”在对可选择的指定元素使用时，意图被广义地解读为，在可选项中，指定元素的任意一个、指定元素的任何子集、或所有的指定元素。

根据上文，可以看出的是，实现了本发明的几个优点，获得了其他有益的结果。要理解的是，前述的实施方式仅为了示范性的目的，仅是代表本发明的原理应用的许多可能的具体实施方式的举例。因而，可以在上述方法和组合物中进行各种变化而不背离本发明的范围，希望的是伴随附图显示的上述说明书中含有的所有内容应被解释为说明性的，而不是限制性的。

此外，本领域的普通技术人员可以对本发明进行各种变化和修改来使它适应各种用途和条件，包括没有在此具体展开的那些，而不背离本发明的精神和范围。因而，那些变化和修改适当地、合理地以及意图处于本文所公开和描述的发明的等价物的完整范围之内。

Claims (33)

1.一种组合物，所述组合物包含

六酰基磷酸化二糖、3-脱酰基-六酰基磷酸化二糖，或其药学上可接受的盐；

磷脂酰胆碱；和

约10mM到约50mM的柠檬酸盐、琥珀酸盐或磷酸盐缓冲液，其中所述磷酸盐缓冲液选自磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾和其混合物的组，以及其中所述组合物含有小于30mM的NaCl，以及当暴露于19℃到25℃的温度范围60天或更久时是稳定的。

2.如权利要求1所述的组合物，其中，所述组合物包含六酰基磷酸化二糖、或六酰基磷酸化二糖的药学上可接受的盐。

3.如权利要求1所述的组合物，其中，所述缓冲液浓度是20mM到约50mM。

4.如权利要求1所述的组合物，其中，所述缓冲液浓度是30mM到约50mM。

5.如权利要求1所述的组合物，其中，所述缓冲液是柠檬酸盐。

6.如权利要求1所述的组合物，其中，所述缓冲液是15mM到约50mM的柠檬酸盐。

7.如权利要求1所述的组合物，其中，所述缓冲液是25mM到约50mM的柠檬酸盐。

8.如权利要求1所述的组合物，其中，所述组合物具有约4.5到约6.5的pH值。

9.如权利要求8所述的组合物，其中，所述组合物具有150纳米或更小的平均颗粒大小。

10.如权利要求9所述的组合物，其中，所述组合物是水性缓冲的悬浮液并含有小于10mM的NaCl。

11.如权利要求1所述的组合物，其中，所述缓冲液是25mM到约50mM的柠檬酸盐，以及所述组合物是平均颗粒大小150纳米或更小的水性缓冲的悬浮液。

12.如权利要求11所述的组合物，其中，所述组合物包含六酰基磷酸化二糖、或六酰基磷酸化二糖的药学上可接受的盐，具有约4.5到约6.5的pH值，以及所述磷脂酰胆碱与六酰基磷酸化二糖的摩尔比是大约1:1到约20:1。

13.一种疫苗组合物，所述疫苗组合物包含：

佐剂制剂；和，

有效量的抗原，

其中所述佐剂制剂包含：

有效量的六酰基磷酸化二糖、3-脱酰基-六酰基磷酸化二糖、或其药学上可接受的盐；

磷脂酰胆碱；和

约10mM到约50mM的柠檬酸盐、琥珀酸盐或磷酸盐缓冲液，

其中所述磷酸盐缓冲液选自磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾和其混合物的组，以及其中所述佐剂制剂含有小于30mM的NaCl。

14.如权利要求13所述的疫苗组合物，其中，所述抗原是FimCH。

15.如权利要求13所述的疫苗组合物，其中，所述组合物包含六酰基磷酸化二糖、或六酰基磷酸化二糖的药学上可接受的盐。

16.一种组合物，包含六酰基磷酸化二糖、3-脱酰基-六酰基磷酸化二糖、或其药学上可接受的盐，以及15mM到约50mM的柠檬酸盐缓冲液。

17.如权利要求16所述的组合物，其中，所述缓冲液浓度是20mM到约50mM。

18.如权利要求16所述的组合物，其中，所述缓冲液浓度是25mM到约50mM。

19.如权利要求16所述的组合物，其中，所述缓冲液浓度是30mM到约50mM。

20.如权利要求16所述的组合物，其中，所述组合物具有约4.5到约6.5的pH值。

21.如权利要求16所述的组合物，其中，所述组合物具有150纳米或更小的平均颗粒大小。

22.如权利要求21所述的组合物，其中，所述组合物是水性缓冲的悬浮液并含有小于10mM的NaCl。

23.如权利要求16所述的组合物，其中，所述组合物是平均颗粒大小150纳米或更小的水性缓冲的悬浮液。

24.如权利要求16所述的组合物，其中，所述组合物包含磷脂酰胆碱，具有约4.5到约6.5的pH值，以及所述磷脂酰胆碱与六酰基磷酸化二糖、3-脱酰基-六酰基磷酸化二糖、或其药学上可接受的盐的摩尔比是大约1:1到约20:1。

25.如权利要求16所述的组合物，其中，所述组合物包含六酰基磷酸化二糖、或六酰基磷酸化二糖的药学上可接受的盐。

26.如权利要求25所述的组合物，其中，所述缓冲液浓度是20mM到约50mM。

27.如权利要求25所述的组合物，其中，所述缓冲液浓度是25mM到约50mM。

28.如权利要求25所述的组合物，其中，所述缓冲液浓度是30mM到约50mM。

29.如权利要求25所述的组合物，其中，所述组合物具有约4.5到约6.5的pH值。

30.如权利要求25所述的组合物，其中，所述组合物具有150纳米或更小的平均颗粒大小。

31.如权利要求30所述的组合物，其中，所述组合物是水性缓冲的悬浮液并含有小于10mM的NaCl。

32.如权利要求25所述的组合物，其中所述组合物是平均颗粒大小150纳米或更小的水性缓冲的悬浮液。

33.如权利要求25所述的组合物，其中，所述组合物包含磷脂酰胆碱，具有约4.5到约6.5的pH值，以及所述磷脂酰胆碱与六酰基磷酸化二糖的摩尔比是大约1:1到约20:1。