CN107345242A

CN107345242A - TCR β链互补决定区的处理方法

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Publication number: CN107345242A
Application number: CN201610317368.XA
Authority: CN
Inventors: 眭维国; 戴勇
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2016-05-12
Filing date: 2016-05-12
Publication date: 2017-11-14

Abstract

一种TCR β链互补决定区的处理方法，包括以下步骤：设置实验组与对照组，每组包括若干份相异人体的已经脱离人体的外周血标本；分离各所述外周血标本的淋巴细胞，并分别提取所述外周血标本淋巴细胞中的DNA；采用多重PCR技术，构建DNA文库；对所述DNA文库进行高通量测序，对所述实验组及对照组中的TCR β链互补决定区进行数据分析。上述TCR β链互补决定区的处理方法，设计合理可行，综合分析失代偿期乙肝肝硬化患者移植手术前后其体内TCR β链互补决定区受体库动态变化特征，可了解病人的免疫状态，为移植后疾病情况的监测进行指导用药，预防术后出现排斥、感染，并为疾病的发病机制提供依据。

Description

TCR β链互补决定区的处理方法

技术领域

本发明涉及一种获取作为中间结果的围手术期肝移植受者信息，特别是涉及一种TCRβ链互补决定区的处理方法。

背景技术

肝硬化(liver Cirrhosis，LC)是一种常见的慢性肝病，是由单一的或很多种致病因素持续作用于肝脏，引起肝脏实质弥漫性损伤等进一步引起一系列肝功损伤，最终发展成门脉高压或晚期肝病的结局。其特点是主要由于肝细胞变性坏死，残存的肝细胞结节再生以及纤维组织再生，导致肝变形变硬等，已超出肝细胞的代偿能力。其主要发病机制是发生了肝纤维化。肝纤维化是由于肝组织内细胞外的胶原纤维发生了持续大量的增殖，从而不断挤压肝细胞并逐渐将其包围起来形成纤维隔，最终导致肝结构及功能发生了病理性改变的结果。按照临床表现情况不同肝硬化可分为代偿期(早期)和失代偿期(晚期)，并且它们的分界线不明显而且常呈现重叠征象。代偿期症状较轻常缺乏特异性，一般没有明显的临床表现，甚至身体上也没有感觉到任何的不适，主要以疲倦乏力、消瘦、腹部胀气、腹泻、上腹不适及隐痛为主，行肝功能检查时各项指标可在正常范围内或出现轻度异常，这种情况多见于小结节性肝硬化；失代偿期症状显著，常伴随各种并发症出现，主要表现为肝功能衰退，常伴有多器官功能受损、黄疸、门脉高压、脾大、腹水、肝性脑病或上消化道出血等，行肝功能检查时各指标明显异常，多见于大结节性肝硬化，因此，临床上通常将血常规、尿常规、肝功能和腹水常规以及必要条件下结合影像学检查来诊断肝硬化，而且从它们的各项指标的检查以及临床表现可不难判断失代偿期肝硬化，但代偿期肝硬化的诊断却比较艰难。

而失代偿期乙型肝炎肝硬化主要是因为乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)持续感染患者并反复作用于病灶部位导致肝细胞受损严重、不断凋亡等而导致肝功能受到严重破坏而引起机体的一系列生理病理的改变，出现黄疸、食管静脉曲张、腹水、肝脑疾病和脾脏肿大等临床特征。在我国，乙型病毒性肝炎是引起肝硬化的主要因素，其次是丙型病毒性肝炎，其中慢性乙型肝炎病毒感染已成为全世界公共健康卫生问题。据世界卫生组织报道，全球每年约有100万人死于HBV感染所致肝硬化、肝衰竭和肝细胞癌，严重影响我国居民身体健康和国民经济，阻止患者疾病病情的发展并降低病死率的重要手段就是进行准确的诊断和早期及时进行治疗。有文献报道，有40％以上的慢性乙型肝炎病毒感染的患者会发展成严重的并发症，约12％的乙肝肝硬化患者死于肝衰竭，10％左右的死于肝癌。由于临床表现的多样性和复杂的病理过程以及代偿期与失代偿期之间的分界不明显甚至出现重叠现象，给疾病早期及准确的诊断提出了巨大的挑战。使得失代偿期乙肝肝硬化的预后很差，并且多半患者在5年内病情发展急速恶化，只有约14％的患者有5年以上的存活率。

目前，肝移植是治疗晚期不可逆肝病患者唯一的方法，给患者提供了一个再生的机会，但由于供肝资源短缺以及配型不符等问题使得世界各地的许多失代偿期乙肝肝硬化患者无法获得或者没有资格获得这种治疗方式，而对这些病人唯一的救治方法就是进行抗病毒治疗。抗病毒治疗是抑制慢性乙肝肝硬化患者和失代偿期乙肝患者体内HBV的复制来减少肝脏坏死性炎症反应并改善其肝功能情况。近十多年肝移植术的发展和免疫抑制剂的问世以及移植收术的提高，我国每年的移植病例数不断在增加，在美国每年所完成的肝移植病例数中，约5％都是乙肝肝移植，这比例在亚太地区已经是比较高的。自从1963年美国Starzl进行了第1例人体原位肝移植到现在，无论在移植的数量还是移植的数量和临床疗效方面都取得了很大的成就。但是随着移植数量的积累，肝移植后出现的排斥反应等各种并发症仍然避免不了，其中与免疫相关的问题成为影响术后生存率的主要因素。大部分乙肝患者以及行肝移植后手术患者都是通过抗病毒药物和免疫抑制剂进行治疗，但因为长期使用这类药物会造成免疫力降低，从而使得患者更易受到其他病原体的感染，还会发生耐药，一旦出现耐药就会降低疗效，甚至会导致病情加重。

发明内容

基于此，有必要针对上述问题，提供一种围手术期肝移植受者TCRβ链互补决定区的处理方法。

一种TCRβ链互补决定区的处理方法，包括以下步骤：

设置实验组与对照组，每组包括若干份相异人体的已经脱离人体的外周血标本；

分离各所述外周血标本的淋巴细胞，并分别提取所述外周血标本淋巴细胞中的DNA；

采用多重PCR技术，构建DNA文库；

对所述DNA文库进行高通量测序，对所述实验组及对照组中的TCRβ链互补决定区进行数据分析。

在其中一个实施例中，采用多重PCR技术之前，所述处理方法还包括测定DNA的含量以及检测DNA完整性的步骤。

在其中一个实施例中，采用荧光分析法测定DNA的含量。

在其中一个实施例中，用琼脂糖凝胶电泳法检测DNA完整性。

在其中一个实施例中，利用Illumina MiSeq平台对DNA文库进行高通量测序。

在其中一个实施例中，采用多重PCR技术，构建DNA文库，其具体包括：

计算所述实验组及对照组中DNA的取用量，称取，并加入V区引物及J区引物进行多重PCR；

电泳检测回收多重PCR产物；

加入末端修护混合液进行末端修护反应，并纯化；

将纯化后的产物在3’端连上A碱基；

在接头连接反应体系中进行接头连接；

通过PCR反应富集经过接头修饰的DNA片段，并对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，切取目的片段后，纯化回收，得到DNA文库。

在其中一个实施例中，构建DNA文库后，还包括检测所述DNA文库的插入片段范围及对所述DNA文库的浓度进行定量。

在其中一个实施例中，对所述实验组及对照组中的TCRβ链互补决定区进行数据分析包括：对测序数据进行质控和预处理、对数据进行比对分析、对序列结构进行分析、构建免疫组库及对免疫组库进行差异分析。

在其中一个实施例中，对测序数据进行质控和预处理包括：对测序后的数据进行过滤处理。

在其中一个实施例中，采用Ficoll密度梯度离心法分离出所述外周血标本的淋巴细胞。

上述TCRβ链互补决定区的处理方法，设计合理可行，综合分析失代偿期乙肝肝硬化患者移植手术前后其体内TCRβ链互补决定区受体库动态变化特征，可了解病人的免疫状态，为移植后疾病情况的监测进行指导用药，预防术后出现排斥、感染，并为疾病的发病机制提供依据。

附图说明

图1为本发明一实施例中TCRβ链互补决定区的处理方法的流程示意图。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。

请参阅图1，本发明的一个实施例是，一种TCRβ链互补决定区的处理方法，其包括如下步骤。

S110、设置实验组与对照组，每组包括若干份相异人体的已经脱离人体的外周血标本，例如，所述实验组包括术前1天组、术后1天组、术后7天组。

例如，本发明各实施例实验组采用的外周血标本，分别来自于桂林市解放军第181医院器官移植与透析治疗中心住院并经确诊为乙肝肝硬化终末期进行肝移植手术的患者6例和在南方医科大学附属桂林解放军第181医院同一时间段体检的健康者6例。

其中实验组6例，女性2例，男性4例，年龄44～60岁，平均年龄48.67±6.31岁。

健康对照组6例，其中女性3例，男性3例，年龄为35～50岁，平均年龄44.17±5.85岁，为南方医科大学附属桂林解放军第181医院同一时间段体检的健康者，无重大疾病史，无免疫方面的相关疾病，本人及其直系亲属无乙肝病史、无自身免疫性疾病。

例如，在室温条件下，获取脱离人体的外周静脉血3～4mL置于5mL EDTA抗凝真空采血管，盖上盖子后，将EDTA抗凝真空采血管轻轻颠倒混匀数次后，放入-80℃超低温冰箱保存备用。采集每个健康对照者外周肝素抗凝静脉血约5mL，每个肾移植受者于术前1天、术后1天、术后7天共3个时间点各采集外周肝素抗凝静脉血5mL，一共24个标本，每个标本在收集后当天分离出淋巴细胞。

S120、分离各所述外周血标本的淋巴细胞，并分别提取所述外周血标本淋巴细胞中的DNA。

例如，采用Ficoll密度梯度离心法分离出所述外周血标本的淋巴细胞，通过使一定密度的细胞按相应密度梯度分布，从而将各种血细胞加以分离，得到所述外周血标本的淋巴细胞。。

又如，步骤S120包括如下步骤：

(1)吸取1mL外周血至2.0mL的离心管中，加入1mL红细胞裂解液并漩涡振荡器混匀。

(2)放入离心机中，25℃的条件下，以12000rpm离心10min，。

(3)静置分层后，弃去上清液，加入900μL的核细胞裂解液，50μL的20mg/mL的蛋白酶K和50μL的10％SDS，混匀并置于恒温混匀器中裂解1h。

(4)裂解完成后迅速冷却，加入1mL酚/氯仿/异戊醇，上下颠倒混匀至无明显界线。

(5)在25℃的条件下，以12000rpm离心10min，静置，然后吸取900μL上清液置于1.5mL的离心管中，并加入2/3体积的-20℃预冷的异丙醇和10％3M 醋酸钠，上下颠倒混匀数次，接着放置于-20℃的冰箱中过夜。

(6)在25℃的条件下，以12000rpm离心10min，静置。

(7)弃去上清液，加入750μL75％的乙醇，洗涤DNA沉淀。

(9)在25℃的条件下，以12000rpm离心5min，静置，弃去上清液，自然晾干。

(10)收集DNA并于-80℃的条件下保存待用。

S130、测定中DNA含量及完整性。

例如，步骤S130包括如下步骤：

S131、测定DNA含量，例如，采用荧光分析法测定DNA的含量。

具体地，步骤S131包括如下步骤：

配制DNA染料工作液；

例如，DNA染料为Quant-iT^TM reagent，通过用Quant-iT^TM buffer将其稀释200倍得到Quant-iT^TM Working Solution。

制备标准品溶液，并制作标准曲线；

例如，分别取Quant-iT^TM standard1(100ng/μL)和Quant-iT^TM standard2(100ng/μL)0～10μL混合后，其中Quant-iT^TM standard1和Quant-iT^TM standard2的总体积为10μL，再与190μL Quant-iT^TM Working Solution混合后，按照Fluorometer已设定好的程序进行标准曲线的制作。

将DNA待测液与DNA染料工作液混合，室温静置2分钟后，进行荧光检测；

分别取2～20μL的DNA待测液与180～198μL的Quant-iT^TM Working Solution混合后，其中，DNA待测液与Quant-iT^TM Working Solution总体积为200μL，室温静置2分钟，使DNA与染料充分结合，然后置于Fluorometer中进行荧光检测。

根据标准曲线，计算得出DNA待测液的DNA含量。

S132、测定DNA完整性，例如，采用琼脂糖凝胶电泳法测定DNA的完整性。又如，测定DNA待测液的完整性包括如下步骤。

具体地，称0.6g取琼脂糖溶解在电泳缓冲液中，置于微波炉或沸水浴中加热至完全溶化并摇匀，制成0.6％的琼脂糖凝胶，等到琼脂糖凝胶溶液的温度降到到55℃左右时小心倒入电泳槽水平板上，并注意不要倒满至溢出，待琼脂糖凝胶凝固后向电泳槽中加入适量的电泳缓冲液，然后拔出即可；将DNA待测液在冰上融化后，充分混匀后离心；取3μL DNA样品与加样缓冲液混合后加入孔板，其中孔板中的一孔加入2μL DNA marker，选用0.6％的琼脂糖凝胶在120V电压下电泳50分钟，电泳至溴酚蓝在凝胶中迁移出适当距离，切断电流，取出凝胶，在紫外灯下检查并扫描图像。

S140、采用多重PCR技术，构建DNA文库。

例如，步骤S140具体包括：

例如，取DNA含量为500ng的所述DNA待测液，加入预设计的V区家族引物和J区家族引物后用QIAGEN multiplex PCR Kit进行多重PCR，进行30循环(cycles)。值得说明的是，采用略长一些的引物具有较好的扩增效果，例如，预设计的V区家族引物和J区家族引物较常规的引物长15～20个碱基；例如，预设计的V区家族引物和J区家族引物延长15～20个碱基设置；又如，预设计的V区家族引物和J区家族引物较常规的引物增长15～20个碱基。

电泳检测回收多重PCR产物；

例如，电泳检测回收100～190bp的多重PCR产物，并使用QIAquick Gel Extraction kit进行回收。

加入末端修护混合液进行末端修护反应，并纯化；

例如，在20℃条件下，加入10×End Repair buffer及End Repair Mix，进行末端修复反应，并使用QIAquick PCR Purification Kit进行纯化。

将纯化后的产物在3’端连上A碱基；

例如，利用NEBNext dA-tailing module在已补平末端的DNA片段3’端加入腺嘌呤(A)。又如，在37℃的条件下，加入NEBNext dA-tailing buffer及NEBNext dA-tailing enzyme，反应30分钟。又如，增加体系中的聚合酶的用量，例如，较常规的聚合酶的用量增加200％～300％；即，聚合酶的用量设计为常规用量的300％～400％。

在接头连接反应体系中进行接头连接；优选的，在反应中，根据之前反应效果提升缓冲盐的浓度。

例如，用Adapter oligo mix和DNA ligase配制接头连接反应体系进行接头连接。

通过PCR反应富集经过接头修饰的DNA片段，并对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，切取目的片段后，纯化回收，得到DNA文库。为提升切取效果，优选的，解链温度大于67摄氏度；又如，解链温度为67摄氏度～70摄氏度，又如，之后降温处理，例如，降至室温。

在本实施例中，将接头连接后的产物PCR扩增后，对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，切取目的片段后，使用QIAquick Gel Extraction kit进行胶纯化回收，溶于洗脱缓冲液中。

在本发明一实施例中，还包括检测所述DNA文库的插入片段范围及对所述DNA文库的浓度进行定量。

例如，检测所述基因文库包括检测所述基因文库的插入片段范围及定量测定所述基因文库的浓度。又如，使用Agilent 2100Bioanalyzer(Agilent DNA 1000 Reagents)检测文库的插入片段范围，又如，使用ABI StepOnePlus Real-Time PCR System(TaqMan Probe)对文库进行浓度的定量。

S150、对所述DNA文库进行高通量测序，对所述实验组及对照组中的TCRβ链互补决定区进行数据分析。

对所述DNA文库进行高通量测序，对所述实验组及对照组中的TCRβ链互补决定区进行数据分析，包括以下步骤：分析对照组和失代偿期乙肝肝硬化患者术前1天、术后1、7天外周血淋巴细胞中TCRβ链的CDR3区多样性、长度分布特征各以及各基因家族的表达频率、碱基插入缺失情况和V-J配对；筛选出对照组和失代偿期乙肝肝硬化患者术前1天、术后1天、术后7天中高度克隆性扩增(频率大于0.5％)的氨基酸序列(AA)，DNA序列和V-J组合；并根据Distinct(uniq)clone数和辛普森系数去分析失代偿期乙肝肝硬化患者术前1天、术后1、术后7天和NC组的TCR多样性和克隆表达差异。

例如，按照预期上机数据量，在检测合格的基因文库加入0.5mmol/L的NaOH溶液，变性30分钟，使双链DNA片段变性形成单链DNA。并将变性后的文库加入到FlowCell内，与FlowCell上的接头进行杂交，然后在簇生成平台cBot上结合TruSeq PE Cluster Kit v3-cBot-HS试剂完成桥式PCR扩增。最后将制备好的FlowCell采用HiSeq 2000测序系统和TruSeq SBS KIT-HS v3试剂进行上机测序。

例如，测序后还包括：对测序数据进行质控和预处理、对所述测序数据进行比对分析、对序列结构进行分析、构建免疫组库、免疫组库差异性分析及统计学分析。

例如，对所述测序数据进行质控和预处理具体包括：在所述测序数据的序列结构进行分析数据下机后，首先对原始数据做过滤处理，过滤的过程中，首先过滤掉含有接头的序列；将平局质量低于15(Illumina 0-41质量体系)的reads去掉；对于未知碱基(N碱基)，要求碱基数不能多于5％；针对序列尾部质量较差的序列，在对低质量部分(质量小于10的碱基)截取，保证截取后的序列平均质量高于15，同时，截取后剩余序列的长度要求不小于60。根据以上过滤条件，获得过滤后的cleandata。过滤完成后，将Pair-end(PE)数据的两条序列拼接成一条完整的contig(片段重叠群)，在读长是100的情况下，拼接过程分为两步：1、将两条序列的尾部比对，寻找匹配序列，这样的拼接需要最小10个碱基的重叠，重叠区域碱基的匹配率要不小于90％；2、鉴于免疫组库捕获区域的长短不同，在某些情况下会存在端序列被测通的情况，在第1部分尾部拼接剩下的序列中，尝试用头部将其继续拼接，经过前面的数据处理后便可得到最终的合并后的序列及合并的序列contig的长度分布图。

例如，利用高通量测序方法(Illumina2000基因组分析仪)，对实验组术前1天组、术后1天组、术后7天组和对照组共24标本的外周血TCRβ链互补决定区进行测序。对照组中平均每个样本获得17769012.83条总读长(Total Reads)，术前1天组中平均每个样本获得16499515.8条总读长，术后1天组中平均每个样本获得17158190.3条总读长，术后7天组中平均每个样本获得20811576.2条总读长。然后对这些原始数据做过滤处理(过滤掉含有接头、平均质量低于15以及未知碱基(N碱基)多于5％的读长Reads)，得到的结果：对照组的平均过滤率为4.37％，术前1天组的平均过滤率为11.27％，术后1天组的平均过滤率为18.70％，术后7天组的平均过滤率为11.82％。过滤完成后，将Pair-end(PE)数据的两条序列拼接成一条完整的contig，最终得到合并后的完整优质序列。对照组中平均有9446150.2条优质序列(Total good sequences)，术前1天组中平均有9090364.7条优质序列，术后1天组中平均有8385257.2条优质序列，术后7天组中平均有12796683.8条优质序列。而对照组的平均克隆(Clones)数为79360.7个，术前1天组的平均克隆(Clones)数为46274.5个，术后1天组的平均克隆(Clones)数为28850.8个，术后7天组的平均克隆(Clones)数为80009.5个。

例如，对所述测序数据进行比对分析具体包括：使用milaboratory开发的miTCR对T细胞受体进行自动校正，校正由PCR、测序等原因带来的序列错误。比对完成后，自动统计互补决定区克隆的表达及插入缺失情况。

例如，对所述测序数据的序列结构进行分析具体包括：根据比对分析得到的结果，得到比对得到V基因序列的最后位点，D基因的起始位点，D基因的终止位点及J基因的起始位点，通过位点信息找到V-D-J插入缺失的碱基并统计其长度分布。根据比对找到的互补决定区，并统计互补决定区序列的长度分布。

又如，对6个乙肝后肝硬化失代偿期患者围手术期三个时间点(术前1天、术后1天及术后7天)和6个正常健康者外周血的TCRβ链的互补决定区(CDR3)、VD Indel以及DJ Indel长度分布进行统计并求平均值，发现在术前1天组、术后1天组、术后7天组和对照组中，根据统计发现TCRβCDR3的长度分布在16nt～106nt之间，并且发现乙肝后肝硬化失代偿期患者移植前后中分布频率最大的5个CDR3长度是：其中在术前1天组中为42，39，45，36和48nt，在术后1天组中为42，45，39，48和36nt，在术后7天组中为42，45，39，36和48nt，对照组中5个频率最大的CDR3长度为42，45，36，39，48nt；DJ indel长度分布在-1～68nt间，其中乙肝后肝硬化患者各个组中分布频率最大的5个DJ indel长度分别是：在术前1天组中为0，2，3，1和4nt，术后1天组中为0，2，3，1，和4nt，术后7天组中为0，2，3，1和4nt，而在对照组中，频率最大的5个DJ indel长度是0，3，2，1及4nt；VD indel长度分布为-1～73nt区间，其中术前1天组中分布频率最大的5个VD indel长度为0，3，2，1和4nt，术后1天组中为0，2，3，1和4nt，术后7天组中为0，3，2，4和1nt，对照组中5个频率最大的VD indel长度为1，0，2，3和4nt；根据前面的分析结果可知，乙肝后肝硬化失代偿期患者移植前1天、移植后1天及移植后7天的外周血单个核细胞中TCRβCDR3、DJ inDel、VD indel长度分布频率和对照组中的分布频率相类似，没有显著的差异。

例如，对所述测序结果进行分析还包括：

1、免疫组库的构建，其具体包括：根据比对分析得到的结果，统计每一个克隆的表达情况，分别统计DNA序列，氨基酸序列，V-J组合三种不同分辨率情况下得到的各个样本的表达情况。例如，为了衡量样品的多样性，分别统计和计算各个样本的distinct clone数，辛普森系数及香农威纳系数，三个系数分别针对DNA、氨基酸、V-J组合三种不同的分辨率。对于每一个样本中每个克隆的表达情况，按照DNA序列、氨基酸序列、V-J组合三种不同分辨率统计每个克隆的表达。筛选出各细胞亚群的高度克隆性扩增(频率大于0.5％)的DNA序列，氨基酸序列，V-J组合。

2、免疫组库的差异分析，其主要包括：样本多样性差异和克隆表达差异两部分。其中，样本多样性差异旨在找出样品间整体克隆表达模式的差别，表达差异则旨在找出差异显著的克隆。样本多样性差异首先针对的是每个样本计算出的多样性系数，即Distinct(uniq)clone数，辛普森和香农威纳系数。根据不同组间样本属性，针对的是DNA序列、氨基酸序列、V-J组合三种分辨率，统计计算差异显著性。进一步地，在DNA序列、氨基酸序列和V-J组合三个层面进行分析，使用泊松分布等相应的检验方案计算出每一个差异对的P值，同时使用FDR和bonferroni对P值做校正。

例如，将克隆扩增程度划分为≥0.5％，0.05～0.5％，0.005～0.05％，0.0005～0.005％和<0.0005％五个等级，定义克隆频率大于0.5％的Clones为高度扩增性克隆(highly expanded clones，HEC)，并从DNA序列、氨基酸序列、 V-J组合三种不同分辨率统计每个克隆的克隆扩增程度。每一个Clone的克隆性扩增程度的计算方法是：该Clone在测试样本中出现的次数/该样本的总Total good sequences数。在DNA序列中，发现实验组术前1天组(pre)、术后1天组(post1)、术后7天组(post7)和对照组(NC)的高度扩增性克隆数(highly expanded clones，HECs)分别为49、43、41和14个；对应的在氨基酸序列中，术前1天组，术后1天组，术后7天组和对照组的高度扩增性克隆数分别为49、43、41和14个；在V-J组合中，术前1天组，术后1天组，术后7天组和对照组的高度扩增性克隆数分别292个、299个、304个和232个。在DNA和氨基酸序列中，术后7天组中的高度扩增性克隆数比对照组、术前1天组和术后1天组都少，而在V-J组合中其高度扩增性克隆数为最多。在所有Clones中，高度扩增性克隆(HECs)所占的比例很小。以DNA序列为例，在NC组中克隆频率≥0.5％的clones有1.11×10^-2％，而在pre组中HEC在所有的Clones中所占的比例为4.99×10^-2％，同样，在post1、post7中分别有3.35×10^-2％和3.86×10^-3％的clones属于HEC，根据分析结果可以知道，这四个组之间没有显著性差异(p＝0.180＞0.05)。但从整体克隆性扩增程度方面去分析，可发现PRE、post1、post7三个患者组中克隆频率分布在≥0.5％，0.05～0.5％及0.005～0.05％区间的Clones数量显著多于NC组，而在0.0005～0.005％区间却明显比NC组少，这揭示了pre、post1、post7患者组中的克隆性扩增程度比对照组明显要高。

为了进一步定量术前1天组，术后1天组，术后7天组和对照组的TCRβ链CDR3多态性，进一步使用辛普森(Simpson)指数倒数(1/Ds)统计每一个Clone的频率。这个指数的变化范围从1到∞，在该范围中的1表明样本中所有个体Clones的扩增程度不均匀，多样性最小；∞则相反，表示样本Clones的扩增程度较均匀，其多样性最大，即Simpson系数的值越大说明样本所有的克隆的扩增性程度越均匀，其多样性就越高。例如，从DNA序列、氨基酸序列、V-J组合三种分辨率分析术前1天组、术后1天组、术后7天组和对照组的TCRβ链CDR3多样性，三种分辨率显示对照组：DNA水平：1/Ds＝1.023；氨基酸和V-J组合水平：1.031；术前1天组的TCRβ链CDR3多样性：DNA水平：1/Ds≈1.007；氨基酸和V-J组合水平：1.017；术后一天组的TCRβ链 CDR3多样性：DNA水平：1/Ds≈1.005；氨基酸和V-J组合水平：1.014；术后7天组的TCRβ链CDR3多样性：DNA水平：1/Ds≈1.001；氨基酸和V-J组合水平：1.009)，以上对比表明：与对照组比较，术前1天组及术后1天组的多样性相对抑制，在术后1天组及术后7天组之间TCRβ链CDR3多样性呈抑制趋势。

可以理解，对于多样性高的样品，其表达也相对均匀。根据前面的分析，在NC组、pre患者组、post1患者组和post7组中分别有50、43、41和14个HECs，进一步分别对NC组、pre组、post1组和post7组组内不同个体或者是组间是否存在共有的HECs进行分析。结果发现，每个个体都存在一个独特的组库，这些组库之间少一部分重叠。同时不同个体之间在DNA序列和氨基酸序列中并没有共同的HECs，而在NC组、pre组、post1组和post7组组间也没有共同的HECs；相反，在V-J组合中却发现NC组、pre组、post1组和post7患者组组内不同个体之间以及组间都存在在很多频率不一致的共有组合。

需要补充的是，本发明的直接目的不是获得诊断结果或健康状况，而只是对已经脱离人体的体液，即外周血，进行处理或检测以获取作为中间结果的信息的方法，或处理该信息的方法，根据目前的医学知识和本发明所公开的内容，从所获得的信息本身不能够直接得出疾病的诊断结果，但是采用对所述实验组及对照组中TCRβ链进行DNA分析的结果或所述实验组及对照组的T细胞抗原受体β链互补决定区的分析结果，能够作为中间数据对围手术期肝移植受者的急性排斥反应作出进一步研究，以有利于移植受者和移植物的长期存活。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims

1.一种TCRβ链互补决定区的处理方法，其特征在于，包括以下步骤：

采用多重PCR技术，构建DNA文库；

2.根据权利要求1所述的处理方法，其特征在于，采用多重PCR技术之前，所述处理方法还包括测定DNA的含量以及检测DNA完整性的步骤。

3.根据权利要求2所述的处理方法，其特征在于，采用荧光分析法测定DNA的含量。

4.根据权利要求2所述的处理方法，其特征在于，用琼脂糖凝胶电泳法检测DNA完整性。

5.根据权利要求1所述的处理方法，其特征在于，利用Illumina MiSeq平台对DNA文库进行高通量测序。

6.根据权利要求1所述的处理方法，其特征在于，采用多重PCR技术，构建DNA文库，其具体包括：

电泳检测回收多重PCR产物；

加入末端修护混合液进行末端修护反应，并纯化；

将纯化后的产物在3’端连上A碱基；

在接头连接反应体系中进行接头连接；

7.根据权利要求6所述的处理方法，其特征在于，构建DNA文库后，还包括检测所述DNA文库的插入片段范围及对所述DNA文库的浓度进行定量。

8.根据权利要求1所述的处理方法，其特征在于，对所述实验组及对照组中的TCRβ链互补决定区进行数据分析包括：对测序数据进行质控和预处理、对数据进行比对分析、对序列结构进行分析、构建免疫组库及对免疫组库进行差异分析。

9.根据权利要求8所述的处理方法，其特征在于，对测序数据进行质控和预处理包括：对测序后的数据进行过滤处理。

10.根据权利要求1所述的处理方法，其特征在于，采用Ficoll密度梯度离心法分离出所述外周血标本的淋巴细胞。