CN107206108B

CN107206108B - 术中成像

Info

Publication number: CN107206108B
Application number: CN201580068816.0A
Authority: CN
Inventors: A·梅奥希; C·布里奥希; G·瓦尔布萨; F·尤格里
Original assignee: Bracco Imaging SpA
Current assignee: Bracco Imaging SpA
Priority date: 2014-12-19
Filing date: 2015-12-18
Publication date: 2021-08-31
Anticipated expiration: 2035-12-18
Also published as: HUE051161T2; JP6793122B2; ES2823729T3; US10682427B2; EP3233133B1; JP2018500338A; CN107206108A; WO2016097317A1; US20170340755A1; EP3233133A1

Abstract

本发明涉及包含用Cy5.5染料部分标记的基于氮杂‑双环烷烃的环状肽的NIR荧光探针在病理区域的荧光引导手术中的用途，以及光学成像方法，所述方法包括使用该荧光探针在手术切除期间识别和分界肿瘤边缘。

Description

术中成像

发明领域

本发明涉及体内术中成像领域。更具体地，本发明涉及包含用 Cy5.5染料部分标记的基于氮杂-双环烷烃的环状肽的近红外(NIR)荧光探针DA364在肿瘤和病理部位的引导手术中的应用。本发明还涉及一种光学成像方法，其包括在术中成像中使用该荧光探针，用于在其手术切除期间识别和分界肿瘤边缘。

现有技术

过去几十年来，为改进治疗方式、如靶向化疗和放疗用于治疗急性疾病和癌症，已经作出了相当大的努力。然而，治疗性手术仍然是大多数癌症的治疗选择，特别是对于早期恶性肿瘤，手术切除术目前是治疗大多数癌症患者的护理标准(CA Cancer J.Clin.2012；62:220-241)。例如，93％的早期乳腺癌患者(I和II)和75％的晚期(III 和IV)患者均手术治疗；手术去除癌症和附近淋巴结是早期(I期和II 期)结肠癌(94％)和直肠癌(74％)最常见的治疗方法。相比用于结肠癌 (7％)，结肠造口术更常用于直肠癌(26％)。根治性前列腺切除术是57％的治疗年龄在18至64岁之间的前列腺癌患者和33％的65至74岁的患者的选择。

尽管在术前成像技术和术后相关治疗方面取得了重大进展，但患者的预后与初始手术的成功息息相关，即完全手术切除癌组织和细胞。因此，手术治疗和患者生存成功的关键在于明确识别和分界肿瘤边缘，帮助外科医生避免去除或损伤健康组织，特别是不留下导致局部复发形成的常有严重或致命影响的残留肿瘤细胞(Ann Surg 2005；241: 715–724)。

目前，大多数肿瘤手术仅在由外科医生直接目视检查和触诊提供的指导下进行的，其中外科医生的经验和他区分病理组织与正常组织的能力是选择要切除的组织的唯一可用的指导。然而，凭人眼通常难以区分癌组织与瘤周水肿或炎症，或者癌组织太小而不能用手感觉到。肿瘤类型和肿瘤患者之间存在显著差异，导致手术方案缺乏，从而产生其他困难。

因此，成像技术和探针的开发引起越来越多的兴趣，其能增加外科医生“看到”肿瘤边缘的能力，从而改善手术结果。

在过去几年中，集成的荧光和标准白光的应用已进入外科手术室，证明能区分健康和病理组织，尤其是当与靶向病理区域的近红外(NIR) 荧光团结合时。作用在700-900nm的NIR窗口的NIR荧光的优点包括从毫米到厘米的组织穿透，减少的散射和自发荧光，使信号与外部NIR 造影剂提供的背景对比度最大化。此外，NIR荧光成像给外科医生带来帮助，诸如实时可视化、非接触成像、无电离辐射和外科手术视野的不改变。事实上，在这个程度上，只有特定的术中成像系统的激活才能让外科医生“看到”造影剂，否则对于人眼是不可见的，从而避免外科医生观察到的临床图像的污染(Mol Imaging.2010；9(5): 237–255)。

随后越来越多的兴趣投入了NIR荧光成像探针，使在肿瘤部位记录的信号与背景比(SBR)最大化，并能够识别和分界目标肿瘤区域。

整联蛋白，特别是α_vβ₃和α_vβ₅，是已知在几种恶性肿瘤的新生血管形成过程期间在激活的内皮细胞上被上调的多数细胞类型表达的跨膜细胞表面蛋白，所述恶性肿瘤包括黑素瘤、胶质母细胞瘤、卵巢癌、乳腺癌、肺癌、肝癌和结肠癌，其中它们在肿瘤血管发生的早期阶段以及在控制肿瘤生长和转移的过程中起重要作用(Mol.Cancer Ther. 2005；4:1670-1680)。因此，它们构成靶向肿瘤的NIR荧光探针的有吸引力的靶标。实际上，目前正在研究的大多数肿瘤靶向探针在其结构中包括一个基于RGD的靶向整联蛋白的部分，目的在于靶标肿瘤部位积聚荧光探针。

用于医学成像(包括光学成像)的整联蛋白靶向诊断剂，例如在WO2006/095234中公开。

分别在Contrast Media&Molecular Imaging 2011；6:449-458 和ContrastMedia&Molecular Imaging 2013；8,350-360中公开了NIR荧光探针，包括用Cy5.5染料标记的基于氮杂-双环烷烃的环状肽，其被鉴定为DA364，并且具有下式

及其在胶质母细胞瘤异种移植物中用于α_vβ₃整联蛋白的光学成像检测和用于乳腺癌的早期诊断的用途。

两性离子NIR荧光团及其靶向整联蛋白的RGD衍生物公开于 NatureBiotechnology 2013；31(2),148-153和引用的文献中，且它们在结直肠癌和输尿管的近红外荧光成像中的应用最近已经在Ann. Surg.Oncol.2014Feb 11.(在线发布，提前印刷)中公开。这些荧光探针已被专门设计用于提供优化的信号相对于背景(非肿瘤)的比率(SBR)，且因此，为具有显著的α_vβ₃整联蛋白过表达的特定肿瘤提供优化的可见性和分界。

还公开了靶向前列腺癌的NIR荧光剂，其包含通过与前列腺特异性膜抗原(PSMA)的结合相互作用而缀合至肽或小靶向分子的NIR荧光团，所述小靶向分子将荧光探针累积到靶向肿瘤位点(参见，例如Mol. Imaging 2005；4(4),448-462和引用的文献)。

还通过将NIR荧光团缀合到FDA批准的和临床上可用的单克隆抗体或FAB(例如贝伐单抗或西妥昔单抗)或肽而获得了肿瘤特异性NIRF 造影剂(例如参见例如J.Nucl.Med.2011；52:1778-1785)。

包含近红外染料与合成聚乙二醇(PEG)聚合物的共轭物的光学成像剂公开于WO2010/106169和所引用的文献中。

然而，在术中成像中使用这些大分子探针的可能限制代表为它们的大尺寸，这通常在从血液系统完全清除之前显著增加其在循环中的保留时间(Mol.Cancer Ther.2009；8:2861-2871和Trends in Pharmacological Sciences第29卷第2期)。

WO2010/076334中公开了一面接枝到α_vβ₃整联蛋白靶向基序，另一面接枝到花青标志物的功能化RAFT(区域可寻址功能化模板)骨架 (RAFT)，以及其在术中检测肿瘤边缘中的用途。

然而，NIR荧光引导手术发展的主要限制在于所遇到的以下被证实的障碍：将用于荧光光学成像的NIR试剂转化至术中临床应用中，以及验证的NIR荧光探针的可用性差。

事实上，诊断成像方法要求，在与患者成像相容的时间窗口中，荧光造影剂优先在病理部位积累，并且局部产生明显高于周围健康组织中观察到的信号(并且其不衰减或不被活组织分散)。为此，信号是否由与靶标肿瘤部分结合的造影剂产生，或至少部分地在上调的肿瘤血管形成中仍然循环是无关紧要的。因此，NIR荧光诊断成像中不需要彻底消除未结合的探针。同样，为了诊断目的，SBR不需要长时间保持最佳，诸如手术的那些。

在引导手术的情况下，NIR荧光探针在目标肿瘤部位的优先积累是必要条件，但不是充分条件。

用于引导手术的NIRF造影剂必须显示清晰、精确和持久的健康和病理组织之间的荧光探针的浓度差异，以确保在手术肿瘤切除的整个持续时间内的对于肿瘤边缘的清晰明确的分界。同时，循环(未结合) 荧光探针绝对有必要在手术前从血液系统中完全清除，以避免任何随着出血(手术中产生)释放的残留的造影剂污染手术室并混淆外科医生的视野。

为了实现这些结果，用于成像引导手术的合适的NIR荧光剂必须显示：

-足够长的在血液系统中的最佳持续时间以确保药剂与靶标的足够的接触时间(及因此在靶标部位的有效积累)，同时从循环系统完全除去未结合的药剂；

-在靶向肿瘤部位的选择性积累，包括药物在病理区域中的选择性摄取和均匀分布，以及足够的保留(在肿瘤部位)，在整个肿瘤区域的整个持续时间内能清楚划分整个肿瘤区域手术；

-从病理区域到健康组织的缓释动力学和可忽略的提取和扩散 (荧光剂)，以防止肿瘤边缘的污染或损害渗透组织的识别；此外

-荧光探针必须提供由于对激发光的延长的暴露而不被漂白或损害的信号。

因此，NIR试剂的清除率和清除路径至关重要，因为它们控制血液半衰期，并因此控制与目标靶标物的接触时间，进一步影响排泄器官中的背景信号。同样重要的是NIR探针对靶标显示的亲和力，其必须几乎是绝对的，或者与任何现有的非特异性摄取完全相容。

进一步的困难可以由表达引起，无论是在目标肿瘤中靶向受体或表位的丰度和分布均匀性方面，这两者均与肿瘤的类型、患者以及由任何可选的治疗预处理密切(例如在手术前进行以减少肿瘤块的治疗预处理)相关。

事实上，一些典型的肿瘤受体(例如整联蛋白)的过度表达可被例如化学治疗的作用降低或修饰，以至在预处理的肿瘤或转移中损害特异性靶向这些受体的探针的有效积累，从而损害其提供可靠分界的能力。

最后，由不同组织的不同光学性质引起的误导效应能阻碍或降低造影剂区分健康和肿瘤组织的区域的能力，特别是对于在组织光学窗口(NIR)外操作的药剂如荧光素和5-ALA。特别是在荧光信号可能低的肿瘤边缘，这种局限性变得更糟。

所有上述因素的多重性和复杂性可能是以下事实的原因：即尽管已经在临床前研究中开发和测试了多种新的荧光团和肿瘤特异性NIR 荧光剂，利用对肿瘤受体的特异性或利用对于肿瘤血管生成标志物的特异性，但它们都没有获得临床批准。

实际上，唯一的FDA批准的NIR荧光造影剂是亚甲基蓝(MB)和吲哚青绿(ICG)，后者是目前临床实践中的参考产品。它们都不是靶向肿瘤的。

因此，存在以下需要：肿瘤特异性NIR荧光探针和术中成像形式，使得外科医生能够实时检测肿瘤边缘并促进病理区域的根本性和精确切除。

发明概述

如上所述，在上文引用的文献的诊断领域中已知：鉴定为DA364、并具有上式的NIR荧光剂在用于高度过度表达α_vβ₃整联蛋白的肿瘤的光学成像中的用途。

我们现在已经发现，这种化合物可以有效地用于术中成像，以在 NIR荧光成像引导的肿瘤治疗性手术中提供肿瘤边缘的实时检测和分界。因此，DA364的使用可以帮助外科医生降低留下残留肿瘤组织或不必要地去除大部分健康组织的风险(具有可能损伤局部神经支配和血管形成的风险)。

此外，已经观察到，该试剂在肿瘤部位提供最佳的积聚和保留，从而能够清楚地识别和分界肿瘤边缘，甚至是具有降低的整联蛋白过度表达的肿瘤。

因此，一般而言，本发明涉及荧光探针DA364在术中成像中的用途，更具体而言，涉及肿瘤手术中使用来为外科医生提供肿瘤边缘的实时检测和分界。

更具体而言，一方面，本发明涉及DA364在手术中、特别是在患者的肿瘤或病理区域的NIR荧光引导的治疗性手术中用于待切除病理区域或肿瘤区域的边缘的术中检测和分界的用途。

在另一个方面，本发明涉及一种组合物，其包含用于术中成像的用于肿瘤边缘的实时鉴定和分界的称为DA364的NIR荧光造影剂。

在另一个方面，本发明提供了一种术中成像方法，其包括使用DA364作为造影剂来鉴定和分界经历治疗性手术的肿瘤的边缘。

在另一个方面，本发明涉及用于患者肿瘤块、范围或区域的治疗性手术的导向手术方案，其包括使用DA364和荧光来进行术中或术前的肿瘤边缘的界定和分界。

在某些实施方案中，对具有α_vβ₃整联蛋白的减少的过度表达的肿瘤进行所述术中或术前成像。

在其他实施方案中，对具有α_vβ₃整联蛋白的可变过度表达的肿瘤进行所述内或手术中成像。

发明详述

为了向外科医生提供有用的支持，用于引导手术的有效造影剂应能够以基本均匀的方式选择性地在目标病理部位积累，以便提供对整个肿瘤区域的清楚的检测及其边界的明显和持久地划分。

已证明造影剂DA364可确保在肿瘤部位的最佳聚集和保留，然后局部提供持久的荧光信号，使得外科医生在治疗性手术期间能够实时地“看到”要切除的病理区域并明确地确定其手术边界。有趣的是，事实上，该化合物显示出的药代动力学特征和药效学性质使其能够在循环系统中保持足够长的时间，以保证在其从循环中完全消除之前在目标部位的选择性和基本均匀的积聚。

进一步观察到，对于具有减少(例如有限或不均匀)的α_vβ₃整联蛋白过度表达的肿瘤，化合物DA364在肿瘤部位处的意外地提供有效的积累和保留。

虽然不愿意受到任何特定的理论的约束，但可以假设在肿瘤部位 (特别是具有α_vβ₃整联蛋白的减少或不均匀的过度表达)的积累是对整联蛋白受体(尤其是α_vβ₃)的高度特异性、以及非特异性保留的综合作用的结果，所述非特异性保留是例如通过与细胞外组分(例如包括从损伤的肿瘤脉管系统泄漏的血管外血浆白蛋白)的非特异性结合相互作用而介导。

这种意想不到的进入和有效分布在肿瘤区域的细胞外(间质)空间中的能力从一侧起促进了在肿瘤部位所记录的信号的扩增并使其更持久，这实际上是由与在肿瘤和内皮细胞上表达的α_vβ₃整联蛋白受体结合的NIR试剂(特异性结合)以及由于非特异性相互作用结合而保留在肿瘤间质空间中的试剂(非特异性结合)二者共同决定。

此外，有利的是，在肿瘤部位的最佳聚集和保留使得该试剂即使在具有降低的或非均匀的整联蛋白表达的病理组织的存在下也能够提供肿瘤边缘的改善和持续的分界，并且能克服由整联蛋白表达在个体肿瘤和个体患者中的变化性所带来的限制。

事实上，由保留在肿瘤的细胞外空间中的荧光探针提供的检测信号的贡献有利地被证明可补偿荧光信号的任何减少或非均匀性，以及肿瘤边缘的任何后续的不准确或不明确的分界(可能由特异性靶向整联蛋白受体的减少或非均匀表达引起)。

因此，有利地，除了提供具有α_vβ₃整联蛋白受体的显著表达的肿瘤和病变的实时的改进的NIR荧光分界之外，DA364已被证明可以提供对血管化肿瘤和病理区域可靠的边界划分，所述血管化肿瘤和病理区域(由于其特异性或由于以前的治疗方法所促进的作用)显示或可显示出α_vβ₃整联蛋白受体的有限或非均质表达。

因此，本发明的NIR药剂可以有利地被认为具有普遍用途，即其可以被提出用于患者的NIR荧光引导的治疗性手术中，为外科医生提供待切除恶性肿瘤区域的边缘的实时的可靠的识别和分界，无论该恶性肿瘤区域是否可显示α_vβ₃整联蛋白受体的任何可能的减少或不均匀的表达。

因此，本发明的一个实施方案涉及造影剂DA364在患者的术中成像中用于实时检测和分界肿瘤边缘的用途。

在优选的方面，所述术中成像在治疗性手术期间被直接记录，特别是在治疗性肿瘤手术期间，以便为外科医生提供要去除的肿瘤区域或恶性区域的边缘的实时鉴定。

因此，本发明的优选实施方案涉及造影剂DA364在手术、优选在肿瘤的引导手术中用于提供要去除的病理区域的边缘的实时识别和分界的用途。

包括使用DA364作为造影剂来检测和分界目标肿瘤区域的根据本发明的治疗性手术适合在荧光(例如，通过使用在例如约600至约700 nm的波长范围内适当过滤的激发光获得的)下进行。根据一个特别优选的实施方案，本发明涉及造影剂DA364在NIR荧光引导的肿瘤手术中用于提供要切除的病理范围或区域的边界的术中的、实时检测和分界的用途。

在本说明书和权利要求中，如本文所使用的术语“肿瘤”、“病理区域”、“恶性肿瘤”或“恶性范围或区域”可互换地指个体患者身体的组织、器官、范围或区域，其包含肿瘤细胞，无论其数量和分布如何，因此包括肿瘤、转移灶和浸润的身体区域或组织，而“健康区域、组织或区域”是个体患者身体的组织、范围或区域，其不包含任何肿瘤细胞。

本文所用的术语肿瘤“边缘”或“边界”是指肿瘤或其他恶性肿瘤的区域，其将病理学区域与健康区域划分和分开。

本文所用的表述“手术边缘”或“无肿瘤边缘”是指外科医生在手术切除肿瘤中沿着切除边缘，其包括直到其可见(例如通过NIR荧光)边界的病理区域，以及通常为至少3mm、优选为至少约5mm至多至约1cm 和大于1cm的可检测肿瘤边界附近的未受影响(即非荧光)的额外区域。

本文使用的术语“患者”或“个体患者”包括动物受试者，优选哺乳动物受试者，更优选患有可通过手术治疗的肿瘤或恶性疾病的人。

表达“α_vβ₃整联蛋白受体表达降低的肿瘤”是指显示α_vβ₃整联蛋白受体过表达的肿瘤，虽然高于正常健康组织中α_vβ₃整联蛋白受体的表达，但通常少于已知具有大量的α_vβ₃整联蛋白受体过表达的肿瘤中α_vβ₃整联蛋白受体的表达。

减少的过表达可能是由于肿瘤细胞的α_vβ₃整联蛋白受体的有效的较低(有限的)表达，或者是由于肿瘤块中α_vβ₃整联蛋白受体(否则相对高的)表达的不均匀分布，例如当α_vβ₃整联蛋白由与新生血管发生相关的内皮细胞表达时，或者由于两者的组合。在后一种情况下，相对于肿瘤总质量的α_vβ₃整联蛋白表达的测量将因此提供肿瘤块中α_vβ₃整联蛋白的有效的表达，其独立于肿瘤块中肿瘤细胞的α_vβ₃整联蛋白的特异性表达。

如申请人所观察到的，肿瘤块中α_vβ₃整联蛋白表达的量可以根据已知的分析技术来测定，例如，能定量组织中特定蛋白质含量的蛋白质印迹分析，如实验部分中详细描述。

根据这种技术，可以确定每毫克肿瘤块或优选肿瘤块中每μg总蛋白裂解物(对细胞的数量和种类具有更好的规格化)中的表达的α_vβ₃整联蛋白的量(单位：ng)。以这种方式，所减少的是由于肿瘤细胞的有效较低的α_vβ₃整联蛋白表达还是由于高α_vβ₃整联蛋白表达细胞的肿瘤块内的不均匀分布是无关紧要的；测量值实际上提供了总肿瘤质量中α_vβ₃整联蛋白表达的示值。

特别是已经确定，对于具有高α_vβ₃整联蛋白过度表达的肿瘤(例如 IV型恶性黑素瘤或U-87MG肿瘤)，α_vβ₃整联蛋白的量高于0.20ng/μg 的总蛋白(约0.241149和0.221000ng的α_vβ₃整联蛋白/μg蛋白)。另一个方面，已经观察到，DA364显像剂令人惊讶地适合于具有降低的α_vβ₃整联蛋白受体表达的肿瘤的可视化(并且因此也适用于术中或术前的方法)。特别地，DA364适用于可视化肿瘤，其显示0.15ngα_vβ₃整联蛋白/μg蛋白质或更低、0.10ngα_vβ₃整联蛋白/μg蛋白质或更低、或0.05ngα_vβ₃整联蛋白/μg蛋白质或更低的表达；并且低至例如0.005ngα_vβ₃整联蛋白/μg蛋白、0.01ngα_vβ₃整联蛋白/μg蛋白或 0.02ngα_vβ₃整联蛋白/μg蛋白。或者定义为表达比例，DA364适用于使肿瘤可视化，其相对于IV型恶性黑素瘤(来自OriGene的CP565523) 中的α_vβ₃整联蛋白表达显示60％或更低、40％或更低或20％或更低的α_vβ₃整联蛋白表达；并且低至例如在恶性黑色素瘤IV型中的α_vβ₃整联蛋白表达的2％、4％或8％。

如本领域已知的，许多肿瘤(或肿瘤块中的细胞)可以在其不同发展阶段期间显示出可变的α_vβ₃整联蛋白表达，通常在从最早到晚期肿瘤阶段的发展中显示出α_vβ₃整联蛋白表达的增加。

如申请人所观察到的，具有相对低的α_vβ₃整联蛋白表达的肿瘤可视化的有利特性还允许使用DA364试剂用于在其各自的发展或进展阶段具有可变的α_vβ₃整联蛋白表达的那些肿瘤的可视化(包括术中和术前的可视化)。

特别地，尤其在手术期间，可以有利地可视化处于相对早期发展阶段(具有相对减少的α_vβ₃整联蛋白的过表达，相对于较晚的发展阶段的相对更高的过度表达)的肿瘤。

因此，本发明的另一个实施方案涉及用于具有可变的α_vβ₃整联蛋白表达的肿瘤的术中或术前可视化的方法，其中所述肿瘤具有如下发展阶段：其中α_vβ₃整联蛋白表达为0.15ngα_vβ₃整联蛋白/μg蛋白质或更少，0.10ngα_vβ₃整联蛋白/μg蛋白质或更少，或0.05ngα_vβ₃整联蛋白/μg蛋白质或更少；且低至例如0.005ngα_vβ₃整联蛋白/μg蛋白， 0.01ngα_vβ₃整联蛋白/μg蛋白质肿瘤或0.02ngα_vβ₃整联蛋白/μg蛋白。

根据替代实施方案，本发明涉及一种用于具有可变的α_vβ₃整联蛋白表达的肿瘤的术中或术前可视化的方法，其中所述肿瘤具有发展阶段，相对于IV型恶性黑素瘤(来自OriGene的CP565523)中的α_vβ₃整联蛋白表达，所述阶段期间α_vβ₃整联蛋白表达为60％或更少、40％或更少或20％或更少；且低至例如IV型恶性黑色素瘤中α_vβ₃整联蛋白表达的2％、4％或8％。

在本发明的一个实施方案中，治疗性手术下的肿瘤或恶性肿瘤选自黑素瘤、神经胶质瘤、胶质母细胞瘤、成神经细胞瘤、肉瘤、卵巢癌、乳腺癌、肺癌、肝癌、结肠癌、头颈部和前列腺癌；优选地、选自神经胶质瘤、胶质母细胞瘤、乳腺癌、卵巢癌和前列腺癌，最后是特别优选的。

在另一个实施方案中，本发明涉及一种药物诊断组合物，其包含有效量的用于术中和术前(或手术期间，如本文可互换地用于指示描述患者外科手术的持续时间的时间段)成像的DA364，用于在外科手术的整个时间段内对患者的肿瘤边缘的实时检测和分界。

在这个程度上，根据本发明的术中或术前(或手术期间，如本文可互换地用于指示描述患者外科手术的持续时间的时间段)成像属于光学成像，其优选地在荧光光学范围内、更优选使用NIR荧光进行。

在一个优选的实施方案中，本发明涉及一种药物诊断组合物，其包含有效量的用于在引导手术中、优选在单个患者肿瘤的NIR荧光引导手术中用于实时检测和分界要切除的病理区域的边缘的DA364。

在此范围内，除非另有规定，本文所用的术语“有效量”或“有效剂量”是指足以实现其预期诊断目的的NIR试剂DA364的任何量：即，例如，提供实时的，即在个体患者的荧光引导手术期间，以及在手术的所有持续时间内，待切除的肿瘤范围、区域或组织和恶性浸润的边界的清楚的检测和分界。例如，合适剂量范围可以为约0.6至约250nmol 的荧光探针/kg个体患者、优选为1至60、更优选为1.7至17nmol/kg，对应于每患者约0.05至20.0mg、优选0.08-5.0mg、最优选0.15至 1.5mg荧光探针的剂量。

根据本发明的合适的药物组合物可以根据常规方法配制成适用于所有常用的施用途径的药物组合物。通常，组合物包含有效量的NIRF 造影剂和至少一种合适的载体。药学上可接受的载体的非限制性实例包括无菌水、盐溶液、缓冲盐水、缓冲盐溶液(包括缓冲液如磷酸盐缓冲液或乙酸盐缓冲液)、醇、植物油、聚乙二醇、明胶、乳糖、直链淀粉、硬脂酸镁、滑石、硅酸、石蜡等。如果需要，组合物还可以包括增溶剂和局部麻醉剂，例如利多卡因，以缓解注射部位的疼痛；并且还可以包括防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、盐、润滑剂等，只要它们不与活性化合物发生有害反应即可。类似地，组合物可以包含常规赋形剂，即适用于肠胃外、肠内或鼻内施用的药学上可接受的有机或无机载体物质，其不与活性化合物发生有害反应。通常，各成分将单独供应或以单位剂型混合在一起，例如作为干燥冻干粉末或无水浓缩物在密封容器中，例如指示活性单位的活性剂的量的安瓿或小药囊 (sachette)。当组合物要通过输注施用时，其可以用含有无菌药用级“注射用水”或盐水的输液瓶分配。当组合物通过注射施用时，可以提供无菌注射用水或盐水的安瓿，使得可以在施用前混合成分。

当组合物用于口服施用时，其可以适当地配制为例如片剂、胶囊或丸剂，或配置为用于口服的液体剂或混悬剂。

在优选的方面，将根据本发明的DA364的药物组合物在用于肠胃外施用、最优选用于静脉内或动脉内施用的等渗无菌水性的、任选地缓冲的溶液中适当地配制。

优选地，所述诊断组合物具有NIR试剂DA364的浓度为至少 0.05mg/mL、更优选为0.15至40mg/mL，并且例如作为大丸剂或作为两个或更多个在时间上分开的剂量供给，或作为恒定或非线性流输注供给。

本发明还涉及一种用于病理区域、尤其是单个患者肿瘤的边缘的光学成像的方法，所述方法包括使用DA364生成肿瘤边缘的成像和分界。优选地，光学成像是基于荧光的，并且更优选地是基于NIR荧光的光学成像，并且包括在荧光下检测和分界目标肿瘤的边界。

在一个实施方案中，光学成像在体外(离体)、在切除的肿瘤或肿瘤的部分上进行，例如，手术切除个体患者的肿瘤获得的组织样本，并且包括在荧光下检查切除的样品下并检测它们提供的荧光信号，以鉴定去除的肿瘤的边缘并验证它们周围非荧光区域的存在。在这个程度上，所检查的离体肿瘤样品可以从用DA364适当预处理的个体患者切除的肿瘤获得。或者，光学成像在体外(离体)、在从未治疗的患者切除的肿瘤或肿瘤的部分进行，其中，在这种情况下，本发明的药物用作肿瘤边缘的组织学标志物。

更优选地，在包括目标肿瘤的个体患者的病理身体区域的术中手术检查期间，在体内进行肿瘤边缘的光学成像。

因此，本发明的优选的另一个方面涉及造影剂DA364在已经预先施用DA364的患者中用于体内检测所称肿瘤的边缘的方法中的用途，所述方法包括：

i)产生包括所述所述肿瘤的目标区域(ROI)的术中光学成像，以及

ii)在荧光下检测所称肿瘤的边缘。

在一个实施方案中，上述方法还包括向患者施用有效量的DA364 荧光探针，并允许其在成像之前在患者体内循环适当的时间。

在一个优选的实施方案中，该方法在体内进行，并且包括产生术中成像和在已经预先施用合适量的荧光造影剂DA364的患者中、在术中成像之前的适合的时间窗口确定肿瘤边缘的分界。

根据优选实施方式，通过适当地光谱解析的(通常适当过滤)、连续或不连续的能够激发DA364剂的激发光源来照射ROI，然后通过使用适当的荧光检测器(允许滤出和分离发射的荧光信号)检测由造影剂发出的荧光，来进行肿瘤区域的术中光学成像和肿瘤边缘的检测。在这个程度上，用于实施上述步骤的设备和装置的非限制性实例公开于例如Mol.Imaging 2010October；9(5):237-255和引用的文献。

因此，在荧光下获得反映DA364探针在目标肿瘤部位的选择性积累的ROI的荧光图像，这能清晰明确地界定肿瘤边界。

肿瘤区域的术中光学成像和肿瘤边缘的检测可以有利地在病变身体区域或范围、特别是肿瘤的手术检查和治疗性切除术期间实时进行，以使外科医生能“看到”目标肿瘤，并清楚地确定要切除的肿瘤区域的边缘，并帮助他(她)从个体患者切除肿瘤。

因此，本发明的另一个方面涉及一种用于个体患者的肿瘤的引导手术的方法，其包括以下主要步骤：

i)为个体患者提供适量的荧光探针DA364；

ii)在治疗性手术下生成包括所述肿瘤的目标区域的术中的基于荧光的光学成像；

iii)在荧光下识别肿瘤的边缘，

iv)手术治疗肿瘤。

优选地，根据本发明的手术方法是荧光引导的；更优选地，它是用于患者的ROI的NIR荧光引导手术的方法，其包括使用荧光探针 DA364产生肿瘤的术中检测和对于肿瘤边界清楚和准确的分界，使肿瘤能够被根治性切除。

根据一个优选实施方式，包括生成ROI的术中成像和肿瘤边缘的检测的本发明的引导手术方法的步骤ii)和iii)方便地在荧光下进行，例如如上文所讨论。

实际上，这些步骤可以例如通过使用配备有激发灯和合适的滤光器组(能使累积在肿瘤中的荧光探针可视化并且识别其边缘)的外科手术器械来进行。在这种程度上，激发光例如在600-700nm的范围内优选在630-694的范围内被适当地过滤施用。由此获得发射的荧光，其被适当地在650-1000nm、优选694-800nm的范围过滤。相反，当不需要荧光信号时，可以用白光例如通过冷光源适当地照亮手术视野。在这方面，可以方便地使用合适的装置，例如FLARE系统，其允许用自然光检测离开手术视野的荧光，因此，不需要打开和关闭荧光激发光。

在一个实施方案中，本发明的引导手术方法包括步骤i)，其包括向个体患者施用有效量的DA364荧光探针，然后将其循环适当的时间。

在一个优选的实施方案中，根据本发明的引导手术方便地在用有效剂量的荧光剂DA364预处理的个体患者中进行；在这方面，向个体患者适当施用荧光剂方便地在治疗性手术的一周内静脉内或动脉内进行，优选在48小时内、更优选在指导性肿瘤手术前的约24至48小时的时间窗内进行。

因此，根据本发明方法的步骤ii)，在荧光下生成肿瘤区域的荧光成像，使得能够清楚且明确地鉴定经历治疗性手术切除的病理区域的边界，并帮助外科医生识别手术要切除的病理区域的边缘，通常包括直到高度荧光性的肿瘤边缘的所有病理区域，以及荧光信号不存在或与由正常健康组织产生的背景(自发荧光)信号一致的另外的、肿瘤周围的可能健康的额外区域(或本文中可互换使用的负(negative margin))，例如至少0.3mm、优选约0.5mm至约1cm及1cm以上，用于补偿任何可选的不准确的测定的肿瘤边界。

然后根据本发明方法的步骤iv)，由外科医生根据肿瘤的确定的手术切缘来操作肿瘤区域的引导手术。

本发明的荧光引导手术方法然后可以任选地包括另外的步骤v)，其包括在荧光下验证所进行的治疗性切除的精度和有效性，并且任选地根据在检测到的肿瘤区域周围的更大的边缘来重复手术直至达到阴性边缘，即没有荧光信号的被切除肿瘤周围的边缘。

在一个特别优选的实施方案中，本发明涉及用于个体患者的肿瘤的NIR荧光引导手术的方法，其中所述肿瘤是前列腺肿瘤。

如以前讨论的，由本发明鉴定的荧光探针能够在荧光下改善和持续地界定肿瘤边缘，不论肿瘤是何种类或其是否可能显示减少或非均匀的整联蛋白表达。

因此，它在NIR荧光术中检测肿瘤边缘和用于标准化个体患者的肿瘤的手术切除术的引导手术方案中能找到有益的用途，包括使用化合物DA364和荧光进行术中或术前的进行治疗性手术的肿瘤的边缘的划分和界定。

因此，在另一个实施方案中，本发明涉及用于肿瘤边缘的术中成像和个体患者肿瘤的治疗性引导手术的标准化方案，其包括：

a)向个体患者施用有效量的DA364荧光探针，例如在成像引导手术之前的一周内、优选至少24小时、更优选在24至48小时的时间窗内；

b)将包括目标肿瘤的个体患者的身体区域暴露于外科医生的目视检查，例如，通过任选的(相关的身体区域)的切口并任选地去除有干扰的皮肤和组织；

c)在荧光下生成所述个体患者身体区域的术中成像并检测肿瘤边缘；

d)沿着检测到的边缘来操作肿瘤的治疗性切除，

e)评估荧光灯下切除边缘的状态，并验证切除的肿瘤周围阴性边缘的存在，或者，

f)沿着肿瘤周围的较大边缘重复切除，以及

g)重复步骤e)和f)直至切除的肿瘤周围的阴性(非荧光)边缘；

这构成本发明的另外的实施例。

所述方案的步骤a)-e)中的每一个例如如前所述进行。在这种程度上，在根据方案的步骤d)进行肿瘤的手术切除后，根据方案的步骤e)在荧光下验证手术切除的有效性，以评估存在或不存在阴性边缘，即切除肿瘤周围的非荧光的健康的区域。然后，如果需要，即如果在切除的肿瘤周围的患者身体区域中仍然检测到荧光区域，或者在切除的肿瘤周围没有阴性边缘的情况下，沿着肿瘤区域周围的较大边缘重复该方案的步骤g)和h)，直至在荧光下达到阴性肿瘤边缘。然后任选地收集围绕切除的肿瘤的非荧光组织并用于另外的病理检查。

本发明提供的解决方案的潜力，即DA364在术中检测和个体患者肿瘤边缘界定、特别是肿瘤(即使具有减少的或非均匀的整联蛋白表达) 根治性切除中显示的功效，已通过体外和体内测试进行了评估。

在这个程度上，首先评估DA 364探针的荧光特性，然后测量DA364 对整联蛋白所显示的亲和性(实施例2-4)。

还测定了DA364与2.8670 10⁴±0.1140·10⁴的HAS的缔合常数(k_a (M^-1))(实施例5)和血浆动力学(实施例6)。

在术中检查和肿瘤的导向切除期间，用本发明鉴定的NIR试剂在荧光下获得的肿瘤边缘的视觉估计的可靠性及其手术功效，已经通过在具有原位Mat-Ly-Lu前列腺肿瘤的大鼠模型上进行的体内试验进行了验证。

在这个程度上，故意选择不属于具有高α_vβ₃表达的肿瘤的前列腺癌，以证明除了在具有高α_vβ₃整联蛋白表达的肿瘤中的最佳靶向和积累特性之外，DA364还显示出意想不到的能力，在具有这些受体的减少或不均匀表达的肿瘤中的优先积累，其完全足以能为外科医生提供肿瘤区域的术中检查和肿瘤的引导手术的有效支持。事实上，本领域已知前列腺癌中表达的整联蛋白的种类及其浓度是远未被确定的参数。甚至，α_vβ₃整联蛋白在前列腺癌中的表达仍然是一个相当模糊的值，范围可从强至无，且已知依赖于个体患者(The Prostate70:1189-1195(2010)，这可能是因为前列腺癌的靶向的原因，且其测定现在通常通过利用前列腺特异性膜抗原(PMSA)的活性位点获得，所述前列腺特异性膜抗原(PMSA)为几乎完全由恶性前列腺细胞的前列腺上皮及其转移灶过表达的膜结合的糖蛋白(参见，例如J.Med.Chem. 2009,52(2)544-550和Trans.Androl.Urol.2013；2(3):254-264 和引用的文献)。

在这方面，应该指出，关于动物肿瘤模型的相关文献(参见例如 Ann Nucl Med2011Dec 31；25(10):717-31)实际上从MAT-Ly-Lu前列腺肿瘤的适合的靶向示踪剂排除了基于RGD的靶向示踪剂。

如实施例中详细说明的，现在已经令人惊讶地评估了DA364在上文引证的大鼠原位MAT-Ly-Lu前列腺肿瘤模型(可被分类为具有降低的α_vβ₃整联蛋白的表达的肿瘤)的手术治疗中的功效。进一步证明 DA364在用于低整联蛋白过表达的肿瘤的术中荧光指导手术中的能力，该结果支持选择前列腺肿瘤作为代表具有减少的或非均匀的α_vβ₃整联蛋白受体表达的肿瘤的适当模型。

此外，如在体内实施例中所示，DA364适用于包含具有减少的α_vβ₃整联蛋白受体过度表达的其他肿瘤的目标区域的术中或术前可视化。这些低α_vβ₃整联蛋白表达肿瘤的代表(除了上述引用的大鼠原位 MAT-Ly-Lu前列腺肿瘤模型外)是如实施例中所述的A431肿瘤模型(报告具有低表达的整联蛋白的人类表皮样癌的异种移植小鼠模型)，以及人卵巢癌或结肠直肠腺癌。

这些结果是非常有希望的，尤其是因为在实施例7的实验测试中，严格沿着在荧光下鉴定并通过高强度荧光信号界定的肿瘤边缘进行肿瘤区域的切除，其不包括检测到的肿瘤周围的较大体积，例如约0.5 毫米的健康(低荧光)组织，如更安全的手术策略所建议的。

这些结果还证实了由本发明鉴定的化合物提供的大的操作时间窗 (从4小时到超过24小时)，因为成像剂允许在注射最小量的造影剂 24小时之后仍然清楚界定前列腺肿瘤，同时静脉内施用4小时后循环的试剂几乎观察不到)。

此外，实验图像显示在肿瘤细胞内和周围间质空间内均可检测到施用的试剂。

所有这些结果与本发明所鉴定的荧光探针意外地显示出的潜能一致并证实了这一点：通过在荧光下促进肿瘤边缘的清晰和持久的划分，为外科医生提供可靠的实时反馈，允许进行证实效果良好的肿瘤的治疗性切除，即使存在具有代表DA364探针的天然靶标的α_vβ₃整联蛋白的降低的或次优的或不均匀的表达的肿瘤。

关于荧光剂DA364及其在本发明中的用途的进一步细节报告在以下实验部分中，其唯一目的是更好地说明本发明，而不对其进行任何限制。

附图简述

图1用于评估荧光探针DA364的摩尔消光系数的线性回归。

图2显示了DA364在PBS(左图；ex/em:674/694；SS:20nm)和 Seronorm(右图；694/704,SS:10nm)中的激发和发射光谱。

图3显示了在引导外科手术过程中使用DA364获得的荧光图像(图 A、B和C)以及在白光下获得的相应图像(图D、E和F)。特别是：图A 和D显示完整的前列腺，在图B和E中显示右腹瓣的囊被移除的前列腺，图C和F显示手术结束时的外科视野。

图4显示切除的组织样品。在图A中，组织样品在白光下成像，图B显示相应的NIR荧光图像。

图5显示了基于荧光的视觉分类的组织学验证的结果。特别是：图A显示了前列腺癌的苏木精/曙红染色切片的一个例子，显示出健康的(低密度和低荧光)和病理(高密度和高荧光)区域；图C显示DAPI 荧光染色，图D显示白光自动检测的非空区域(NON EMPTYAREA)；图 B报告了从低荧光样品部分测量的参数组织密度的组织学和视觉结果之间的对应关系图(p值<0.001，Mann Whitney U Test)。

图6显示了在实施例6的实验测试中记录的DA364血浆浓度(循环血液中游离试剂的浓度)时间曲线。在图中清楚地显示了来自血浆室 (plasma compartment)的循环DA364探针的快速消除。

图7获得的与来自DA364和质膜染料WGA的信号重叠的组织载玻片中Mat-Ly/Lu肿瘤细胞的黑白图像。

图8大鼠前列腺肿瘤Mat-Ly-Lu细胞和人前列腺肿瘤PC3细胞(用作内参照)中α_vβ₃整联蛋白表达的流式细胞术。α_vβ₃整联蛋白表达显示在灰色直方图中，标记物显示了小鼠IgG阴性对照的背景。数字显示阳性细胞的百分比，通过从用特异性mAb检测到的值减去用同种型匹配对照Ig获得的值来计算。

图9小鼠的荧光成像图。

实验部分

实施例1NIR试剂DA364的制备

基本上如先前引用的参考文献Contrast Media Mol.Imaging 2011,6,449-458中所述，使用上文所示的合成方法进行NIR试剂 DA364的制备

包括:

1)靶向整联蛋白的环状五肽cRGD-NH₂的制备

靶向整联蛋白的类肽部分cRGD-NH₂的制备基本上如 WO2006/095234中所述进行，更详细地分别在Angew.Chem.Int.Ed., 2010,49,7111-7115,J.Org.Chem.2005,70,4124-4132和Chem Med.Chem.2009,4,615-632中描述了根据以下流程的单个中间体和靶向整联蛋白的的环状cRGD-NH₂骨架的制备：

a.中间体5的合成

b.中间体10的合成

c.cRGD-NH₂的合成

2)NIR试剂DA364的制备

将Cy5.5-NHS酯(13mg，0.011mmol)(购自GE Healthcare，产品编号PA15602)在硼酸盐缓冲液pH 9(4mL)中的溶液加入环状cRGD-NH₂骨架(8,8mg，0.011mmol)在硼酸盐缓冲液pH 9(3.5mL)中的溶液中。将该反应混合物在室温下搅拌24小时，避光保存(产生的pH8.1)。在反应结束时(通过HPLC-MS评估)，将粗反应混合物用5％CH3COOH 水溶液(1.5mL)稀释，然后通过冷冻干燥除去残留的反应溶剂。

将粗产物通过制备型HPLC纯化(洗脱液A：H₂O+0.1％TFA，洗脱液B：CH₃CN+0.1TFA，流速：15mL/min，固定相：Waters Atlantis Prep T3OBD 5μm,19x 100mm，检测：UV，λ₁：210nm，λ₂:255nm)，冷冻干燥后得到深蓝色固体状(11.8mg，0.0082mmol)的所需产物。收率：74.6％。HPLC纯度：92.96％(为面积％)

分析表征

通过HPLC-MS和¹H-NMR进行对于所得到的NIR试剂的分析表征。

核磁共振

使用具有氘作为锁定通道的Bruker Avance-III(¹H,600.13 MHz)，在298K在DMSO-d6或D₂O中记录¹H-NMR光谱。

记录的¹H-NMR与预期结构一致。

HPLC-UV-MS制备方法

LC柱：Agilent Zorbax SB-PHENYL-250mm x 4.6mm x 5μm(P/N: 880975-312)

HPLC参数

仪器：三重四极杆Thermo Fisher LC Accela，装备有Accela泵，Accela自动进样器，Accela PDA检测器和TSQ Quantum Access。

注射体积：5μl(样品浓度为200μg/ml)

柱温箱：40℃

托盘温度：5℃

洗针程序：内针洗涤存在，以防止记忆效应。

洗涤液：40:50:10-水:甲醇:异丙醇

Uv-vis采集范围：200-790nm(钨灯需要：最大吸收值为776nm)

MSD采集范围：50-1500a.m.u。

MSD模式：ESI两极性(正，负，优选负)

将分析的化合物用milli-Q水稀释。

泵流量：0.5ml/min；最大压力：400巴

溶剂A：水+乙酸铵(1g/l)；溶剂B：乙腈100％

停止时间：42分钟

梯度：

时间(min)	A(％)	B(％)
			0	98	2
2	98	2
			10	80	20
25	70	30
			30	64	40
35	0	100
			36	98	2
42	98	2

DA364的荧光特征

实施例2：消光系数的测定

材料与方法

使用双束Perkin Elmer Lambda 40UV-VIS分光光度计来测定NIR 试剂DA364的消光摩尔系数。

制备在PBS中含有NIR试剂的两种标准储备溶液：1000μM(溶液I：1.27mg，0.884mL)和1250μM(溶液II：7.03mg，3.915mL)。然后通过使用PBS将储备溶液在适当的容量瓶中稀释来制备如表A所报道的稀释的标准溶液。测量每种标准稀释溶液的吸光度，无需进一步稀释。

表A：标准溶液稀释表

标准	浓度,μM	储备溶液I,mL	储备溶液II,mL	V tot,mL
					空白	0	0	0	-
STD 1	1.25		0.050	50
					STD 2	2		0.040	25
STD 3	3		0.060	25
					STD 4	1		0.040	50
STD 5	0.5	0.050		100
					STD 6	1.5	0.030		20
STD 7	2.5	0.050		20
					STD 8	3.5	0.035		10

结果

测量每个稀释的标准溶液的吸光度，并从图1所示线性回归的斜率计算DA364的摩尔消光系数。该条件下测得的消光系数为208500 M^-1·cm^-1(相当于83％的对Cy5.5染料报道的理论值250000M^-1·cm^-1)。

还进行统计分析(数据未报道)，以验证线性回归可靠性

实施例3：荧光量子产率的评估。

材料与方法

在具有积分球附件的FluoroLog-3 1IHR-320(HORIBA-JobinYvon) 上进行荧光量子产率(Φ％)测量。

使用625nm的激发波长并使用450W的氙光源进行测量。在TBX-04 检测器上从645至850nm进行检测(激发和发射狭缝为1.8nm)。

在人血清(Seronorm^TM Human,NycomedPhama,batch 1109514)和磷酸盐缓冲盐水(PBS)中都测量了DA364溶液的荧光量子产率。

在PBS中和吸光度低于0.1的人血清中制备NIR试剂的溶液。在室温(RT)下温育NIR试剂15分钟后进行荧光(Φ％)测量。

结果

如下表B所示的获得的Φ％值显示DA364在PBS中的量子产率为 36.5％(±2.37)，且在Seronorm^TM中的量子产率为57.5％(±1.26)。

在PBS(ex/em:674/694；斯托克斯位移:20nm)和Seronorm^TM (694/704，斯托克斯位移：10nm)中的NIR试剂的标准化激发和发射光谱如图2所示。如图所示，DA364造影剂与血清白蛋白的相互作用促进发射最大值从694nm变化至704nm(分别在PBS和Seronorm^TM中)，并促进斯托克斯位移的减小。

表B.DA364在PBS和Seronorm^TM中的Φ％值

DA364的生物学特征

实施例4：对α_vβ₃、α_vβ₅和α_vβ₁整联蛋白的体外竞争性结合测定

通过体外结合试验评估DA364对其特异靶向的(整联蛋白α_vβ₃)的亲和力及其对其他整联蛋白(例如α_Vβ₁、α_vβ₅)的交叉反应性。

材料与方法

将96孔微量滴定板(MediSorp，Nunc)在4℃下用测试的整联蛋白 (0.5μg/mL，用包被/洗涤缓冲液(20mM Tris HCl pH 7.4；150mM NaCl；1mM MnCl2；0.5mM MgCl2；2mMCaCl2)稀释)包被过夜。包被后，用洗涤缓冲液冲洗该板，然后在封闭缓冲液(在包被缓冲液中的3％BSA) 中在室温(RT)温育2小时(24℃，在Thermomixer中，震荡)。然后将板在洗涤缓冲液中冲洗，并在室温用DA364(浓度范围为5000至 0.005nM)在室温下温育3小时。在生物素化的玻连蛋白(1μg/mL,cod. HVN-U605,Molecular Innovations)的存在下，通过在包被缓冲液中的1％BSA中连续稀释NIR试剂的储液，制备DA364溶液。然后将板再次冲洗，并用链霉亲和素-HRP(cod.EG RPN 1051,GE Healthcare) (1:10000，在PBS中)在室温下温育1小时，结合生物素化的玻连蛋白。在PBS中再次清洗后，将板与TMB溶液(3,3’,5,5’-四甲基联苯胺) (cod.T-0440,Sigma-Aldrich)温育5-10分钟，然后通过加入2N硫酸终止比色反应。通过读取450nm处的吸光度来测量竞争剂(生物素化的玻连蛋白)来进行DA364的IC50的定量。通过最小二乘非线性回归分析确定IC50值。

结果

与玻连蛋白(α_vβ₃的天然底物)的竞争性结合测定证明DA364对其特异性靶标(即α_vβ₃)的高亲和力和对类似物α_vβ₅的较低的亲和力；此外，对α_vβ₁突出显示交叉反应性。

获得的整联蛋白α_vβ₃、α_vβ₅和α_vβ₁的亲和力结果在下表C中提供。

表C.DA364与整联蛋白的结合亲和力，其表达为玻连蛋白IC50

*一式三份试验的平均值

实施例5：针对人血清白蛋白(HSA)的体外结合测定

根据例如Connors,K.A.(1987)Binding Constants.The Measurement ofMolecular Complex Stability,John Wiley&Sons, New York(特别参见第4章)中公开的操作，通过吸光度的光谱测量来确定DA364对HSA的亲和力。

材料与方法

使用双束Perkin Elmer Lambda 40UV-VIS分光光度计获得与HSA 一起温育的DA364的吸收光谱。在PBS中每天新鲜制备含有HSA的两种标准溶液(75mM和500mM)，并分别保持搅拌约30分钟和1小时。

将DA364(845±5mM)储备溶液稀释1:20，并与HAS(HSA Sigma Aldrich，批号049K7535，项目A1653)混合，得到浓度梯度(0、1、10、 20、40、60、30、80、100、200、400mM)。将含有0.99mM NIR试剂和不同量的HSA的最终溶液在室温下温育1小时，然后测量。相对于相同浓度的HSA的参比溶液测量每种溶液的吸光度。使用以下等式拟合在689nm的波长处测量的吸光度值(对应于与HSA结合的DA364的最大吸收)：

其中Δε是从游离和结合的DA364获得的摩尔吸光度差，ΔA是 DA364和参比溶液的吸光度差，b是通过溶液的光路的长度，[HSA]是 HAS的浓度，C_DA364是荧光团的浓度，ka是缔合常数。

结果

测量DA364的HAS(k_a(M^-1))的缔合常数为2.8670·10⁴±0.1140·10⁴ (R²＝0.9949)。

该结果表明存在由本发明鉴定的NIR试剂显示的对血清白蛋白的亲和力，这与其显示的体内杂交(hybrid)行为一致，由于对于整联蛋白受体的高特异性以及非特异性保留、例如由与细胞外成分(包括血管外(泄漏)白蛋白)非特异性结合所介导的非特异性保留，允许其积累和扩散到肿瘤。

实施例6：评估DA364的血浆动力学

在CD-1(ICR)BR小鼠中单次静脉内施用后评价NIRF探针DA364 的血浆动力学。

方案

荧光探针以0.4μmol/kg的剂量施用，相当于成像研究中使用的有效剂量的约10倍(1nmol/小鼠，考虑到25g的平均小鼠体重)。处理后在不同时间点处死动物(多至并包含14天)，收集血液样品以测定 DA364含量，使用与荧光检测器结合的HPLC方法进行。

制剂的制备

DA364作为655μM的淡蓝色溶液提供。在动物施用前几天，解冻后，将655μM的DA364溶液稀释至0.04μmol/mL的最终浓度。为此，用12.2mL的0.9％NaCl生理盐水稀释0.8mL的655μM的DA364溶液。将0.04μmol/mL制剂在-80℃储存直至施用。

动物

使用购自(Charles River Laboratories Italia,Calco(LC)，意大利)的CD-1(ICR)BR小鼠(40只雄性；到达重量：22-30g；年龄： 4-5周龄)进行实验。涉及动物的所有操作均按照国家和国际实验动物护理和使用的法律和政策进行(L.D.116/92；Authorizationn.19/2008-A issued March 6,2008,by the Italian Ministry of Health；EEC CouncilDirective 86/609CEE和EEC Council Directive 2010/63/EU)。

实验设计

在药代动力学研究中测量DA364的血浆动力学。允许动物到达和治疗之间至少有3天的时间。在施用当天，将动物随机分配到药代动力学时间点和校准组。用尾巴上的彩色标记来识别动物。将每个笼子标签按照研究编号、化合物、施用途径、物种、剂量、治疗日期和处死日期和动物数量进行唯一地编号。

将在室温下预热的NIR试剂DA364通过尾静脉用Harvard输液泵以1mL/min的注射速率以0.4μmol/kg的剂量静脉内注射。施用的剂量相当于成像研究中使用的有效剂量的约10倍。选择静脉内施用途径作为用于人类的可能的暴露途径。

实验方案：

在DA364施用前和施用之后5分钟、10分钟、20分钟、30分钟、60分钟、4小时、24小时、48小时、7天和14天处死动物(每个时间点三只)。

此外，还使用七只动物来收集用于校准曲线的空白血浆。

在用七氟烷麻醉动物当天，诱导时呼气浓度为3-4％，维持浓度 2-3％，然后断头处死。使用肝素化管收集用于HPLC测定的血液(至少 0.5mL)。将离心(2100g，10分钟)后得到的血浆在-80℃储存直到分析当天。

血浆中DA364的评估

通过与先前提及的荧光检测器联用的HPLC方法进行血浆样品中 DA364的量的测定。

DA364乙酸盐缓冲溶液的制备

通过将1g乙酸盐缓冲液溶解在1L Milli-Q水中制备乙酸盐缓冲溶液。然后将适量的NIR试剂加入到所得溶液中。

血浆“CAL”样品的制备

通过向90μL空白血浆中加入10μL的DA364乙酸盐缓冲溶液 (0.04至4nmol/mL)和100μL甲醇和乙腈溶液(50:50)，制备校准标准品(CAL)。搅拌管并随后在4℃下以13000g离心10分钟。将10微升澄清的上清液注入HPLC设备中。

血浆“QC”样品的制备

通过将10μL的DA364乙酸盐缓冲溶液(0.06至3nmol/mL)和 100μL甲醇和乙腈溶液(50:50)加入90μL血浆中制备质量控制(QC)。搅拌管并随后下在4℃以13000g离心10分钟。将10微升澄清的上清液注入HPLC设备中。

血浆“S”样品的制备

通过向100μL稀释的血浆中加入100μL乙酸盐缓冲液和100μL甲醇乙腈溶液(50:50)来制备血浆样品(S)。将管搅拌并随后在4℃下以 13000g离心10分钟。将10微升的透明上清液注入HPLC设备。在血浆样品过浓的情况下进行适当的稀释。

色谱条件

色谱：Waters Alliance 2695XC

HPLC柱：Zorbax SB-Phenyl，5μm，250×4.6mm

流动相A：将1克乙酸盐缓冲液溶于1升Milli-Q水中(0.013M，pH～7.0)

流动相B：将1克乙酸盐缓冲液溶于1升甲醇和乙腈(50:50)

样品温度：10℃

柱温：60℃

注射量：10μL

检测器：FL detector Waters 2475；激发波长：670nm；发射波长：700nm

运行时间：23分钟

洗脱：梯度

时间(min)	％A	％B	流
				0	91	9	1.0
5	91	9	1.0
				11	44	56	1.1
15	44	56	1.1
				17	91	9	1.0
23	91	9	1.0

通过内插(interpolating)血浆和器官中DA364的校准曲线进行 HPLC测定，所述曲线通过测定荧光剂DA364的校准标准样品(CAL)(6 个浓度，每个浓度3次平行测定)制备。

数据分析

在肝素化管中收集用于HPLC测定的血液(至少0.5mL)。通过与荧光检测器结合的HPLC方法测量DA364的血浆浓度。

为了评估全身暴露，使用计算机程序WIN-NONLIN 6.3(WinNonlin 6.3SCI软件，Lexington，KE，美国)通过非参数方法计算C_max和作为时间的函数的血浆DA364浓度曲线下面积(AUC)。对于测试的剂量，使用来自3只动物的每个时间点的平均血浆浓度进行非房室性分析(non-compartmental analysis)。对于C_max和相应的t_max，报告了观测值。使用对数梯形法从观察数据计算至最后可观察血浆浓度的血浆浓度-时间曲线下面积(AUC_{(0to t)})。事实上，我们也可以计算t_1/2、Vd和 Cl。

器官中的Da 364含量将以μg/mL(血液)或μg/g(组织)报告。将数据转化为每个器官中的注射剂量的百分比(％ID)。然后对每个采样时间计算平均值和标准偏差。

结果

HPLC分离后通过荧光测量的DA364的血浆浓度包括在下面的表D 中，并且以图形方式示于图6中。获得的结果证实游离的循环剂的快速清除，在施用至测试动物4小时后在血液中达到可忽略的浓度，其变得小于仪器检测限(LOD＝0.0012nmol/mL)。

表D

注射后5分钟(t_max)测定C_max为1.629nmol/mL。与末端消除阶段相关的半衰期值为64分钟。AUC_(0至∞)值为77min*nmol/mL。总血浆清除率值为5mL/min/kg(0.15mL/min)。清除率显著低于小鼠肝脏和肾脏血流量(1.8和1.3mL/min)，表明体内(其他组织)积累。在稳态(V_dss)下的体积分布值为329mL/kg(10mL)，比小鼠全身含水量 (14.5mL)略低，表明DA364从血浆室(plasma compartment)外渗。

实施例7：在大鼠前列腺肿瘤模型中使用DA364作为NIR荧光探针的荧光引导手术

本实施例旨在评估NIR RGD环状探针DA364在使用大鼠原位前列腺肿瘤模型MatLy-Lu(具有降低的α_vβ₃整联蛋白表达的肿瘤，如下所示)的肿瘤块识别中的敏感性。

在Zeiss系统上进行术中成像，该系统是一种修改后的手术显微镜，包括适当的用于照射和选择从探针发出的信号的过滤器。将大鼠肿瘤MatLyLu前列腺细胞接种在前列腺的右腹瓣。接种3-4天后，对动物静脉注射范围5-20nmol/大鼠的NIR荧光探针剂量，24小时后成像。然后通过荧光信号指引切除肿瘤。切除包括来自左前列腺叶的组织的荧光区域周围的组织用于组织学比较。通过常规组织学处理(苏木精和伊红染色)和另外的免疫标记来分析所有样品。

肿瘤细胞及其制备

前列腺肿瘤Mat-Ly-Lu细胞系(大鼠前列腺腺癌模型G-Dunning R-3327的一个亚系)由欧洲细胞培养物集存库(ECACC)提供。细胞在补充有10％胎牛血清(FBS)、2mM谷氨酰胺、100IU/mL青霉素、100μg/mL 链霉素和250nM地塞米松(DXMT)的RPMI 1640培养基中生长。使用台盼蓝排除试验来评估细胞接种前的细胞活力。存活率以％(活细胞与总细胞比例×100)表示。丢弃活力<70％的细胞培养物。人类前列腺腺癌 PC-3细胞系由美国模式培养物集存库(ATCC)提供。细胞在补充有10％胎牛血清(FBS)、2mM谷氨酰胺、100IU/mL青霉素、100μg/mL链霉素的Ham’s F-12培养基中生长。使用台盼蓝排除试验来评估细胞接种前的细胞活力。存活率以％(活细胞与总细胞比例×100)表示。丢弃活力 <70％的细胞培养物。人类黑素瘤细胞系WM-266由美国模式培养物集存库(ATCC)提供。细胞在补充有10％胎牛血清(FBS)、2mM谷氨酰胺、100 IU/mL青霉素、100μg/mL链霉素的Eagle最低必需培养基中生长。

α_vβ₃表达

通过与已知具有整联蛋白的高的过度表达的WM266黑素瘤细胞系进行比较，通过蛋白质印迹法测定α_vβ₃整联蛋白在MatLyLu细胞系中的表达(Anticancer Research 33:871-880(2013))。为了提取总蛋白，将细胞沉淀溶解于裂解缓冲液(Tris-HCl pH 8 50mM、NaCl 150 mM、EDTA 1mM、NaF 100mM、甘油10％、MgCl2 1mM、TritonX-100 1％、蛋白酶抑制剂)，进行3轮冷冻和融化(-80℃/37℃)，并在冰中放置 20分钟。然后将所得到的溶液超声处理10秒，并在4℃以14000g 离心15分钟。然后用BCA法定量上清液的蛋白质含量。在这种程度上，将总提取物载入10％聚丙烯酰胺凝胶中，并在变性条件(20％SDS)下进行电泳，基于蛋白质的分子量来分离它们。然后将凝胶内的蛋白转移到硝酸纤维素膜上，随后用抗体抗-β₃整联蛋白进行印迹。通过化学发光检测方法将特定信号显示为单个或多个条带。通过ChemiDoc MP成像系统获得标记的硝基纤维素的图像，并且使用Image Lab v.4.1软件量化相对于β₃表达水平的条带的面积。

通过流式细胞术(FACS)方法测定MatLyLu细胞中α_vβ₃的表达，并与PC3细胞系的表达进行比较。

在这种程度上，回收细胞并在补充有0.2％BSA和0.01％叠氮化钠的PBS中洗涤。将非特异性位点用兔IgG(Sigma-Aldrich)封闭。然后将细胞与抗-α_vβ₃整联蛋白抗体(稀释1:100；克隆LM609，Millipore) 或同种型匹配的阴性对照一起在4℃温育30分钟，随后与异硫氰酸荧光素(FITC)缀合兔抗小鼠Ig(DakoCytomation)一起温育。收集样品并用CyAn ADP流式细胞仪和Summit 4.3软件(DakoCytoma tion)进行分析。根据其光散射性质收集细胞以排除细胞碎片，并根据其碘化丙啶(Sigma-Aldrich)负性来排除死细胞。

与WM266黑素瘤细胞的α_vβ₃整联蛋白表达相比，蛋白印迹分析导致MatLyLu细胞中α_vβ₃整联蛋白表达可以忽略。在FACS实验中，PC3 细胞证实了相对较高的α_vβ₃表达(45％细胞显示荧光信号)，与引用文献中引用的值一致，并且在Mat-Ly-Lu细胞上的α_vβ₃的表达(0.1％)可忽略(图8)。

肿瘤模型

该实验在11周龄的10只哥本哈根大鼠(雄性)进行，其购自 Harlan LaboratoriesSrl,S.Pietro al Natisone(UD)，意大利。通过在异氟烷麻醉下原位注射MatLylu肿瘤细胞，在哥本哈根大鼠中诱导大鼠前列腺腺癌。在肿瘤植入前约1小时，向大鼠皮下施用(5mg/kg)镇痛药(Rymadil)。然后将下腹部剃光并消毒

在尿道口上方3至4厘米处，沿着腹侧白线切开腹壁12毫米。在推开动物每一侧的脂肪组织后，暴露出前列腺。

将含有0.5x10⁶个肿瘤细胞的细胞混悬液(30μL)用27G针注射到前列腺的右腹瓣。用无菌不可吸收线(3-0黑丝，Distrex S.p.a.)缝合肌肉和皮肤。对伤口涂上消毒剂溶液

手术后(约24小时后)至少施用一次镇痛药。涉及动物的所有操作都是根据国家和国际实验动物护理和使用的法律和政策进行的(EEC Council Directive 86/609CEE；L.D.116/92和EEC Council Directive 2010/63/EU； L.D.26/2014.Authorization n.149/2006-A，由意大利卫生部于2006 年10月27日发布)。

荧光引导手术实验

使用专用手术显微镜(Axio Zoom v16,Carl Zeiss Beteiligungs GmbH,Jena,德国)进行肿瘤去除。显微镜配备了PLANAPO Z 0,5X/0.125FWD 114MM物镜。在手术期间约2.5x2.5cm²的面积可视。当不需要荧光信号时，通过冷光源(CL 9000LED CAN(D))白光照射手术区域，并且在肿瘤去除期间通过滤光(发光器：HXP 200C(D)，过滤器组:32Cy 5.5shiftfree(E))照射手术区域。

在手术前一天，对应于肿瘤植入3-4天后，向动物施用剂量为5-20 nmol/大鼠的DA364试剂。探针注入24小时后，将动物用0.5％异氟烷气体(O₂ 99.5％)麻醉，以仰卧位固定在手术台上，暴露前列腺肿瘤。

去除前列腺囊后，将前列腺肿瘤暴露于过滤的光，获得荧光图像以描绘原发肿瘤块和病理边缘的轮廓(见图3，图A和D)。然后通过使用荧光来引导切除直到肿瘤区域周围的区域中没有荧光信号(参见图 3，图B，E和C，F)，来反复进行肿瘤块的去除。大多数荧光信号被限制在植入区域，即前列腺右腹瓣。收集从荧光信号周围区域和左腹叶、背叶和前列腺前叶切除的组织样品，并获得离体荧光图像以研究荧光团积累的组织学图式(图4)。值得注意的是，在该实验测试中，严格按照由高强度荧光信号鉴别的肿瘤边缘来切除组织样品，但用于更安全的手术策略，推荐切除包括至少最小非荧光、阴性的边缘的更大的切除体积。对于所有收集的组织样品最后进行下列组织学分析。在实验结束时，通过麻醉过量处死动物。

组织学分析

将切割的样品直接包埋在Killik化合物(低温恒温器包埋介质) 中，并立即在液氮中冷却的异戊烷中冷冻。

将切除的组织块切成三个连续的10μm厚的切片组，用于平行标记。然后用组织病理学分析的标准方法处理每个组织样品。特别地，采用苏木精和曙红进行收集的样品的组织学染色，以检测和表征切除的样品中的解剖肿瘤边缘，并验证周围健康前列腺组织中任选的肿瘤细胞的存在，以评估和确认手术彻底切除肿瘤。

在室温(RT)解冻，并在PBS中洗涤以除去Killik后，在组织载玻片上操作切除组织样品中荧光剂DA364分布的检测。将细胞核用4',6- 二脒基-2-苯基吲哚(DAPI,cod.BML-AP402,Enzo Life Sciences) (5μg/mL，在PBS中，5min)染色。用2μg/mL FITC缀合的小麦胚芽凝集素(WGA)(cod.W11261Life Technologies)染色质膜，以鉴定 DA364的内在部分。在这种程度上，使用Aperio digital scanner ScanScope FL(探测整个染色部分)以及LeicaDM2500荧光显微镜(获取更多细节)二者可视化组织。

肿瘤细胞内在化

然后通过荧光显微镜观察肿瘤细胞中DA364的内在化。特别地，获得了Mat-Ly/Lu肿瘤细胞的黑白图像，例如图7所示，其中由DA364 产生的荧光信号与由用2μg/mL FITC缀合的小麦胚芽凝集素(WGA)染色的Mat-Ly/Lu肿瘤组织载玻片得到的信号重叠，小麦胚芽凝集素为一种能鉴定细胞膜和胞外间质空间的质膜染料。

图像分析

使用在手术后获得的离体荧光图像(图4)来将切除的组织样品视觉分类为两种荧光类别：荧光和非荧光。两种荧光类别的分类仅基于荧光信号，而不考虑组织样本的解剖来源。当组织样品至少包括特征为强烈和明亮的荧光发射的区域时，它们被归属为荧光类(参见例如图 4的样品3、4和5)。将所有剩余的组织样品，即不显示荧光的样品(例如图4的样品1)或显示与远离肿瘤区域的健康组织中观察到的自发荧光一致的荧光的样品(例如图4的样品2)分类为非荧光类。对于每个图像，使用所有像素强度范围、以像素强度反映荧光信号。该分类程序旨在再现外科医生在肿瘤去除期间需要操作的基于荧光的“健康”(非荧光)和“病理”(荧光)组织的视觉选择。

然后通过各组织样品的两个组织切片的H&E染色(能识别包含肿瘤区域的切片，无论其尺寸如何)来组织学验证(在引导手术期间收集的组织样本)的视觉分类的结果(图5图A)。然后将含有肿瘤的组织样品(即测试组织切片中至少1个含有肿瘤细胞的组织样品)分类为阳性，而将无肿瘤样品被归类为阴性。然后使用列联表来比较组织学和视觉分类，所述列联表提供由本发明鉴定的化合物赋予的视觉分类的灵敏度及其在无肿瘤和含肿瘤组织的鉴定和分离中的可靠性的量度。

基于核染剂4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)的荧光，还进行了收集的组织样品的另外分析。一般来说，这种分析依赖于健康和肿瘤组织的形态存在的差异，肿瘤组织中正常的前列腺形态被肿瘤浸润所破坏，这可以通过自动基于阈值的图像分析程序容易地区分(图5，图C、 D)。事实上，健康的前列腺组织主要由浸入纤维基质中的腺体和管道构成；组织的空白区域代表前列腺的宽腔，而上皮腺细胞和基质代表前列腺的实质。相反，肿瘤组织更典型地由均匀压积的细胞构成。该自动程序包括计算组织密度(TISSUE DENSITY)，其定义为组织占用的样本面积(NON EMPTY AREA)与切面面积的比值。健康组织的特征在于组织密度低于病理组织。

结果

手术功效的组织学验证。

通过使用列联表比较组织学和视觉分类的结果。例如包含在以下列联表E中的比较结果表明检测到的荧光强度与组织学检验的测试的组织样本的病理状态之间存在显著的相关性。特别地，获得的结果表明，DA634NIR荧光探针使得肿瘤组织的视觉分类具有87％的灵敏度和 83％的特异性(表E)。

荧光样品的特征还在于正常组织形态的实质破坏，显示统计学上更高的组织密度，主要是由于在病理组织中证实前列腺腺体和管道不存在(曼-惠特尼U检验，p值<0.05，图5，图B)。

表E.组织样本的视觉和组织学分类的对应关系的列联表。

注意：在测试中记录的三个假阴性中的两个(非荧光，但阳性)是来自被肿瘤细胞部分浸润的前列腺囊的组织样品，尽管在手术显微镜下显示低荧光，但可能是由于囊的切开引起其自身的弹性缠绕，这使得该特定的前列腺区域在荧光下不太可见并且不太适当地成像。剩余的假阴性是从大肿瘤中移除的非常小的一块组织，当仅通过其荧光进行评估时，显示低的光强度。

实施例8

α_vβ₃整联蛋白表达相对于肿瘤质量的测定

已经通过蛋白质印迹法检测了来自动物模型的三种不同类型的肿瘤的α_vβ₃整联蛋白表达：

·U-87MG，人胶质母细胞瘤的异种移植小鼠模型，据报道具有相对高的α_vβ₃整联蛋白表达

·MatLyLu，大鼠前列腺癌的原位大鼠模型，据报道具有中等低的α_vβ₃整联蛋白表达

·A431，是人类表皮样癌的异种移植小鼠模型，据报道具有相对较低的α_vβ₃整联蛋白表达

方法

在液氮存在下使用手术刀将冷冻的肿瘤组织切成小片，然后使用研钵和研杵粉碎。将粉末称重，然后溶解在足够体积的裂解缓冲液(Tris-HCl pH 8 50mM，NaCl 150mM，EDTA 1mM，NaF 100mM，甘油10％，MgCl2 1mM，TritonX-100 1％,蛋白酶抑制剂)中，涡旋1分钟，并放在冰上45分钟。然后将溶液超声处理15秒，并在4℃以14000 rpm离心15分钟。

用BCA法定量上清液的蛋白质含量。将总提取物载入10％聚丙烯酰胺凝胶中，并进行电泳以在变性条件(20％SDS)下通过分子量分离蛋白质。然后将凝胶内的蛋白转移到硝酸纤维素膜上，随后用抗体抗-β3 整联蛋白印迹。通过化学发光检测方法将特定信号显示为单个或多个条带。通过ChemiDoc MP成像系统获得标记硝酸纤维素的图像，并使用ImageLab v.4.1软件对相对于β3表达水平的条带的面积进行定量。

结果

将整联蛋白β3的量通过肿瘤质量(肿瘤的mg)标准化。每个肿瘤类型用至少两个样品进行实验。结果(整联蛋白表达的平均值)示于表 F。

表F

实施例9

相对于肿瘤块中蛋白质总量的α_vβ₃整联蛋白表达的测定

已经通过蛋白质印迹测量了之前在实施例8中详细描述的三种不同动物模型以及作为蛋白质提取物购买的其它人类肿瘤的α_vβ₃整联蛋白的表达。

使用前述提取方法从组织起始获得来自肿瘤模型的蛋白质提取物，而人类蛋白质提取物(如下表G中详述的)购自OriGene。

人提取物OriGene ID	病理特征
		CP565523	转移恶性黑素瘤IV
CP565782	浆液性乳头状卵巢腺癌IV(G2)
		CP541289	结肠腺癌IV(G2)

以下表H中报告的数据进一步证实了在Matlylu型肿瘤和A431 肿瘤中分别的降低的α_vβ₃整联蛋白的过度表达，也显示出可受益于本发明的α_vβ₃整联蛋白表达降低的其他人类肿瘤。

表H

整联蛋白β3的类型	ngβ3/μg prot tot
		恶性黑素瘤IV	0.241149
U-87MG肿瘤(Hu in Ms)	0.221000
		Matlylu肿瘤(Rt in Rt)	0.104000
A431肿瘤(Hu in Ms)	0.046500
		卵巢腺癌IV(G2)	0.027133
结直肠腺癌IV	0.020731

实施例10

α_vβ₃整联蛋白(A431)表达降低的肿瘤的体内可视化

该实施例显示DA364在特征分别为低和高的α_vβ₃过表达的人肿瘤的A431和U87-MG小鼠模型中的摄取。

肿瘤模型

收集A431细胞并用PBS洗涤两次。将500万个细胞重新混悬于0.1mL的DMEM高葡萄糖培养基中，并皮下注射到所有小鼠的右侧腹部。在A431接种后11天，收集U-87MG细胞，并用PBS洗涤2次。将两百万个细胞重新混悬于0.1mL的EMEM培养基中，并皮下注射预先注射了A431细胞的相同动物的左侧腹部。

接种后通过触诊和卡尺测量每周一次跟踪肿瘤发展。肿瘤体积根据以下公式计算：(L x W²)/2，其中L和W是肿瘤的最大长度和宽度。在实验阶段结束时或者两种肿瘤的总和达到约2000mm³的体积的情况下，通过过量麻醉处死动物。

荧光成像实验

在A431肿瘤植入后三周，给予5只小鼠1nmol的DA364，总施用体积为0.2mL(注射速率1mL/min)。使用IVIS Spectrum光学成像系统(Perkin Elmer)在在静脉内施用荧光探针后的5分钟、15分钟、 30分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、6小时、24小时、48小时获取体内OI。在OI实验期间，将动物保持在3-4％的七氟烷气体麻醉 (O₂ 97.0-96.0％)下。在麻醉期间，使用加热床将动物体温稳定在约 37℃。

在体内OI实验后，注射探针48小时后，处死动物。切除肿瘤、肝脏、肾脏、心脏和脾脏，用于在整个切除的肿瘤或器官上的离体荧光信号的测量。

结果

在体内与来自正常健康组织的信号(背景)一起测量来自U-87MG 和A431肿瘤的荧光强度。

在注射后3小时至24小时的时间窗口内，U-87MG和A431肿瘤显示稳定的与背景的信号比。图9描述小鼠的荧光成像，显示DA364 允许在皮肤下清楚地可视化低表达整联蛋白的肿瘤A431。

然后使用IVIS Spectrum光学成像系统(Perkin Elmer)在切除的离体样品上测量荧光信号(表示为辐射效率(RE)：p/s/(μW/cm²)，其中p是光子计数)。

如下表I所示，U-87MG肿瘤中DA364的荧光信号约为A431肿瘤中测量的信号强度的两倍。然而，在A431肿瘤中测量的荧光强度与在肝脏和肾脏(DA364积累的排泄器官)中测量的荧光强度相当，而相对于在心脏和脾脏中测量的信号(代表健康组织，背景)高约10倍。

表I

肿瘤/器官	荧光信号
		U87-MG	6.78E+08
A431	3.47E+08
		肝脏	4.04E+08
肾脏	3.55E+08
		心脏	4.61E+07
脾脏	5.79E+07

这些结果表明DA364是用于具有降低的整联蛋白表达的肿瘤、特别是用于其术中可视化的合适的成像剂。

Claims

1.下式的DA364的造影剂的用途，

其用于制备荧光探针，所述的荧光探针在个体患者的引导手术中用于肿瘤边缘的检测和分界，其中所述肿瘤是显示α_vβ₃整联蛋白受体减少的过度表达的肿瘤，其中所述表达为0.15ngα_vβ₃整联蛋白/μg蛋白质或更低。

2.根据权利要求1的造影剂的用途，其用于在治疗性手术下病理区域的手术边界的实时鉴定。

3.根据权利要求1或2中任意一项的造影剂的用途，其中肿瘤边缘的检测和分界在荧光下进行。

4.根据权利要求3的造影剂的用途，其中光的波长范围为630至690nm。

5.根据权利要求1，2和4中任意一项的造影剂的用途，其中所述检测和分界包括:

i)用能激发DA364试剂的光源照射适当地预施用了有效量的DA364的患者中的包含所称肿瘤的目标区域；和

ii)在荧光下鉴定病理范围或区域的边缘。

6.根据权利要求5的造影剂的用途，其中向所述个体患者预施用0.05至20mg的量的造影剂DA364。

7.根据权利要求5的造影剂的用途，其中造影剂的施用在引导手术的48小时内进行。

8.下式的DA364的造影剂的用途，

其用于制备药物诊断组合物，所述组合物用于术中或术前光学成像以提供肿瘤边缘的实时检测和分界，其中所述肿瘤是显示α_vβ₃整联蛋白受体减少的过度表达的肿瘤，其中所述表达为0.15ngα_vβ₃整联蛋白/μg蛋白质或更低。

9.根据权利要求8的造影剂的用途，其中在个体患者肿瘤的引导手术中进行光学成像，以提供进行治疗性切除的肿瘤区域的边缘的实时检测和分界。

10.下式的DA364的造影剂的用途，

其用于制备药物，所述药物在预施用所述造影剂DA364的个体患者中用于体内对于肿瘤边缘的光学成像，

其包括:

i)用能激发DA364试剂的光源照射所述患者中的包含所称肿瘤的目标区域；和

ii)在荧光下检测肿瘤边缘；

其中所述肿瘤是显示α_vβ₃整联蛋白受体减少的过度表达的肿瘤，其中所述表达为0.15ngα_vβ₃整联蛋白/μg蛋白质或更低。

11.根据权利要求10的用途，其中向所述个体患者在产生光学成像的一周内预施用0.05至20mg的DA364。

12.根据权利要求10或11中任意一项的用途，其在肿瘤的手术检查和治疗性切除期间实时进行。

13.下式的DA364的造影剂的用途，

其用于制备药物，所述药物在个体患者中用于体内对于肿瘤边缘的光学成像和检测，其包括:

i)向所述患者施用造影剂DA364；

ii)用能激发DA364试剂的光源照射所述患者中的包含所称肿瘤的目标区域；

iii)在荧光下检测肿瘤边缘；

14.下式的DA364的造影剂的用途，

其用于制备药物，所述药物用于治疗性手术，其包括:

i)根据权利要求13的用途检测肿瘤边缘；和

ii)沿着检测的边缘操作肿瘤的治疗性切除；

其中所述肿瘤是显示αvβ3整联蛋白受体减少的过度表达的肿瘤，其中所述表达为0.15ngαvβ3整联蛋白/μg蛋白质或更低。

15.下式的DA364的造影剂的用途，

其用于制备药物，所述药物用于患者的肿瘤边缘的术中成像和肿瘤的治疗性手术，

其包括：

a)向患者施用有效量的荧光探针DA364，

b)将患者的包含所称肿瘤的目标区域暴露于外科医生的目视检查下，

c)在荧光下生成所述目标区域的术中成像并检测肿瘤边缘，

d)沿着检测到的边缘来操作肿瘤的治疗性切除,

e)在荧光下评估切除边缘的状态，并验证切除的肿瘤周围阴性边缘的存在，或者

f)沿着肿瘤周围的较大边缘重复切除，以及

重复步骤e)和f)直至达到阴性非荧光边缘；

16.根据权利要求1-2，4，6和7中任意一项的造影剂的用途，其中所述肿瘤选自：黑素瘤、神经胶质瘤、胶质母细胞瘤、成神经细胞瘤、肉瘤、卵巢癌、乳腺癌、肺癌、肝癌、结肠癌、头颈部和前列腺癌。

17.根据权利要求16的造影剂的用途，其中所述肿瘤是前列腺癌。

18.根据权利要求10,11,13和14中任意一项的用途，其中所述肿瘤选自黑素瘤、神经胶质瘤、胶质母细胞瘤、成神经细胞瘤、肉瘤、卵巢癌、乳腺癌、肺癌、肝癌、结肠癌、头颈部和前列腺癌。

19.根据权利要求1，8,10和13-15中任意一项的用途，其中所述肿瘤是显示α_vβ₃整联蛋白受体减少的过度表达的肿瘤，其中所述表达为0.10ngα_vβ₃整联蛋白/μg蛋白质或更低。

20.根据权利要求1，8,10和13-15中任意一项的用途，其中所述肿瘤是显示α_vβ₃整联蛋白受体减少的过度表达的肿瘤，其中所述表达为0.05ngα_vβ₃整联蛋白/μg蛋白质或更低。