CN107176976B - 微小rna31前体编码多肽在制备免疫调节药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及微小RNA31前体编码多肽在制备免疫调节药物中的应用。本发明所述的微小RNA31前体编码多肽能够增加调节性T细胞的数量，具有免疫调节功能，因此其可应用于免疫调节，预防或治疗自身免疫性疾病，如多发性硬化症。

Description

微小RNA31前体编码多肽在制备免疫调节药物中的应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，更具体地，本发明涉及微小RNA31前体编码多肽在制备免疫调节药物中的应用。

背景技术

调节性T细胞(Regulatory Cells，简称Treg)是一类控制体内自身免疫反应性的T细胞亚群，其与自身免疫性疾病的发生关系密切。调节性T细胞可分为天然产生的自然调节性T细胞(nTreg)和诱导产生的适应性调节性T细胞(aTreg或iTreg)，如Th3、Tr1，另外尚有CD8 Treg、NKT细胞等。

已有研究表明，Treg与I型糖尿病、系统性红斑狼疮、再生障碍性贫血、特发性血小板减少性紫癜、自身免疫性溶血性贫血、多发性硬化、炎症性肠病、重症肌无力等疾病密切相关。此外，其也与类风湿性关节炎、自身免疫性甲状腺炎，自身免疫性肝病、多种肾脏疾病等很多自身免疫性疾病的发病有关。因此，Treg对于自身免疫性疾病的发生和发展都具有重要意义，对其进行深入研究将有助于了解自身免疫性疾病的发病机制，对疾病预后判断、进一步的治疗有着深远的意义。

多发性硬化症(multiple sclerosis)属于自身免疫性疾病的一种，其是发生于中枢神经系统(脑部以及脊髓)的慢性、炎症性、自体免疫疾病，其特征是在中枢神经系统中异常神经退行病变(neurodegeneration)引发以T细胞、B细胞、抗原提呈细胞为主的炎症细胞浸润，从而导致多处的神经出现脱髓鞘(demyelination)现象，并在髓鞘组织修复的过程中，沿着轴突受损硬化。多发性硬化症的确切发病原因还不清楚，患者可能出现行动不便、视力受损、疼痛等神经功能残缺症状，严重会致死。多发性硬化症目前尚无根治的药物。

多肽类(peptide)药物习惯上常指多肽类激素。一般将50或50以下氨基酸残基组成的化合物列入多肽。现已知生物体内含有和分泌很多种激素和活性多肽，仅脑中就存在近40种，而人们还在不断地发现、分离、纯化新的活性多肽物质。多肽在生物体内的浓度很低，但生理活性很强，在调节生理功能时起着非常重要的作用。多肽类药物由于其毒性低，特异性高，分子量小等自身独特的优势，成为患者的最佳选择。

因此，针对自身免疫性疾病的多肽类药物具有重要的临床应用价值。

发明内容

本发明的目的在于提供本发明提供一种新的多肽，其可在炎症环境中有选择地增加Treg的数量，可应用于制备免疫调节药物。

在本发明的第一方面，提供一种分离的多肽，该多肽选自：

(a)具有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽；或

(b)将(a)所限定的多肽的氨基酸序列经过一个或多个(如1-10个；较佳地1-5个；更佳地1-3个，如2个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)所限定的多肽的功能的多肽；或

(c)与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列有至少85％(较佳地至少90％；更佳地至少95％)相同性，且具有(a)所限定的多肽的功能的多肽。

在本发明的一个优选例中，所述的多肽由微小RNA-31(miRNA-31)前体编码。

在本发明的另一方面，提供一种分离的多核苷酸，其编码所述的多肽。

在本发明的另一方面，提供一种表达载体(包括病毒载体或非病毒载体)，其含有所述的多核苷酸。

在本发明的另一方面，提供一种重组细胞，其中含有所述的表达载体或其基因组中包含所述的多核苷酸。

在本发明的另一方面，提供所述的多肽或编码其的多核苷酸，或所述的表达载体或所述的重组细胞在制备免疫调节药物中的应用。

在本发明的一个优选例中，所述的免疫调节药物是：预防或治疗自身免疫性疾病的药物。

在本发明的另一优选例中，所述的自身免疫性疾病包括(但不限于)：多发性硬化症，类风湿性关节炎，系统性红斑狼疮和银屑病；或

在本发明的另一优选例中，所述的免疫调节药物是增加调节性T细胞(Treg)的数量的药物(通过增加Treg的数量，进行免疫调节)。

在本发明的另一方面，提供一种制备所述的多肽的方法，所述方法包括：培养所述的重组细胞，从而重组表达所述的多肽；或

所述方法包括：通过体外人工合成的方法制备所述的多肽。

在本发明的另一方面，提供一种用于免疫调节的药物组合物，所述的药物组合物包括：所述的多肽或编码其的多核苷酸，或所述的表达载体或所述的重组细胞；以及

药学上或生理学上可接受的载体。

在本发明的另一方面，提供一种用于免疫调节的药盒，所述药盒中包括：

述的多肽或编码其的多核苷酸；或

所述的表达载体；或

所述的重组细胞；或

所述的药物组合物。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、电泳-免疫印迹检测与GFP蛋白表达与分子量。

其中，空白组只转染空白的GFP质粒，miPEP31组同时转染miPEP-GFP和GFP空质粒。Fusion EGFP表示miPEP-GFP融合蛋白的条带。

图2、miPEP31的读码框(ORF)的启动序列可以启动翻译GFP蛋白。

A，miPEP31的起始密码子为ATG；

B，miPEP31的起始密码子为ATT。

图3、外源合成的miPEP31可以进入到细胞当中。

A，1nM FITC标记的miPEP31与3T3细胞共培养，流式细胞术检测细胞的FITC荧光，可以观测到FITC进入到细胞中；

B，1nM FITC标记的miPEP31与CD4⁺T细胞共培养，流式细胞术检测细胞的FITC荧光，可以观测到FITC进入到细胞中；

C，3T3细胞固定后用DAPI染细胞核后用激光共聚焦显微镜观察荧光；

D，3T3细胞与FITC标记的miPEP31共培养，固定后用DAPI染细胞核后用激光共聚焦显微镜观察荧光；

E，上图中放大观察FITC的荧光。

图4、外源合成的miPEP31可以促进Treg的分化。

A，不同浓度的miPEP31加入到Treg的分化体系中，流式细胞术检测细胞的分化；

B，不同浓度的miPEP31加入到EAE小鼠造模15天后分离的脾脏细胞中，加入MOG再刺激后检测Treg的分化。

图5、外源合成的miPEP31可以促进EAE中枢Treg的分化并治疗EAE。

A，miPEP治疗EAE小鼠15天后，杀死小鼠分离中枢系统的单个核细胞，检测Treg的比例；

B，miPEP治疗EAE小鼠的EAE评分情况，miPEP可以明显改善EAE小鼠的发病情况；

黑色点状线条：miPEP31第10天开始，每3天1次治疗EAE小鼠30天的评分；

空心点状线条：只注射PBS的对照EAE小鼠30天的评分。

具体实施方式

本发明人研究发现，微小RNA31的前体的部分核苷酸序列能够编码产生一段多肽，并将之称为微小RNA31前体编码多肽(miPEP31)。所述的miPEP31多肽能够增加Treg数量，具有免疫调节功能，因此其可应用于免疫调节，预防或治疗自身免疫性疾病，如多发性硬化症。

如本文所用，所述的“保守性变异多肽”是指miPEP31多肽的片段、衍生物和类似物。一般地，该“保守性变异多肽”是与SEQ ID NO:2的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多5个，更佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。

如本文所用，所述的“微小RNA31前体编码多肽”、“miRNA-31前体编码多肽”、“miPEP31多肽”可以互换使用。

如本文所用，“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。该术语指这样一些药剂载体：它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。

如本文所用，“有效量”指治疗剂治疗、缓解或预防目标疾病或状况的量，或是表现出可检测的治疗或预防效果的量。

miPEP31多肽

本发明人发现微小RNA31的前体的部分核苷酸序列能够编码产生一段多肽，命名为miPEP31。

本发明的miPEP31多肽可以是重组多肽、合成多肽。其可以是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。化学合成的方法对于本领域技术人员而言是熟悉的，例如固相多肽合成方法。

本发明的miPEP31多肽的序列可以是：MRDWASVSSLGSGLWKERLWKSITTKRDGIAPVTRNWRGGKMLA(SEQ ID NO:2)。

本发明还包括miPEP31多肽的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的miPEP31多肽相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是：

(i)有一个或多个(如1-10个、1-5个、1-3个或1-2个)保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或

(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或

(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或

(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根据本文的定义这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

在本发明中，miPEP31多肽可以指具有SEQ ID NO:2所示序列的多肽。该术语还包括具有与miPEP31多肽相同功能的、SEQ ID NO:2序列的变异形式(保守性变异多肽)。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(如1-10个、1-5个、1-3个或1-2个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(例如为300个以内，较佳地200个以内，更佳地100个以内，更佳地50个以内，例如40、30、20、10、5、3、2、1)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括miPEP31多肽的活性片段和活性衍生物。

本发明中，也包括为了增加多肽的稳定性、半衰期、促进功效而对一个或几个氨基酸加以修饰后构成的修饰形式的多肽(通常不改变一级结构)，包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了抗水解性能或优化了溶解性能的多肽。

本发明公开的miPEP31合成简易、成本低、不具免疫排斥性、能够在炎症环境中特异诱导Treg细胞应答、疗效好、治疗后疾病不易复发并且副作用小。

本发明还提供了miPEP31多肽与其它物质融合、偶联或附着后所形成的复合体。例如，所述的miPEP31多肽可以与一些荧光标记(如FITC，GFP或EGFP)偶联，从而便于观察到miPEP31多肽在细胞内的存在情况。

所述的miPEP31多肽可以与一些具有穿膜功能的肽融合，以提高其穿透细胞，进入到细胞内的能力。一些具有穿膜功能的肽包括：①蛋白衍生肽(protein derived CPPs)，如penetratin、TAT和pVEC等；②模型肽(model peptides)如MAP和(Arg)7等；③设计肽(designed CPPs)如MPG和Transportan等。从其两亲性性质也可将其分为3类：①两亲性CPPs(PaCPPs)，如MPG、transportan、TP10、Pep-1；②中等两亲性CPPs(SaCPPs)，如penetratin，RL16；③非两亲性CPPs(NaCPPs)，如R9。

本发明还提供了编码本发明miPEP31多肽或其保守性变异多肽的多核苷酸序列。本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA可以是编码链或非编码链。也即，“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或miPEP31多肽的编码序列经基因工程产生的宿主细胞(重组细胞)，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。

术语“表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

包含上述的适当多核苷酸序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达多肽。宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属、农杆菌；真菌细胞如酵母；植物细胞等。

miPEP31多肽的应用

本发明还提供了所述的miPEP31多肽的应用，用于制备免疫调节药物，或用于制备增加调节性T细胞(Treg)的数量的药物。较佳地，所述的免疫调节药物是：预防或治疗自身免疫性疾病的药物。

在本发明的具体实施例中，确定了miPEP31能够在细胞中表达，外源合成的miPEP31可以进入到细胞中，miPEP能够促进Treg分化。并且，miPEP31能够有效地诱导多发性硬化症的动物模型EAE小鼠中具功能的Treg的产生，从而减轻EAE小鼠发病。上述的研究结果表明，miPEP31多肽可应用于增加Treg的数量，制备免疫调节药物。

例如，所述的自身免疫性疾病包括：多发性硬化症，类风湿性关节炎，系统性红斑狼疮和银屑病等。此外，对其它一些与Treg的免疫调节功能失调相关的疾病或症状也具有潜在的预防或治疗作用。目前，已知与Treg的免疫调节功能失调相关的疾病或症状选自：肿瘤或病毒感染，炎症反应、类风湿关节炎、器官移植、系统性红斑狼疮、银屑病、克罗恩氏病或溃疡性结肠炎、传染性疾病等。

例如，所述肿瘤包括：前列腺癌、乳腺癌、肝癌、胶质瘤、肠癌、子宫颈癌、非小细胞肺癌、肺癌、胰腺癌、胃癌、膀胱癌、皮肤癌、横纹肌癌、舌鳞癌、鼻咽癌、卵巢癌、胎盘绒毛癌、神经胶质瘤、淋巴瘤、白血病、直肠腺癌或黑色素瘤，等。

例如，所述炎症反应包括：过敏性炎症、毛囊炎、扁桃体炎、肺炎、肝炎、肾炎、痤疮、哮喘、自身免疫性疾病、慢性炎症、慢性前列腺炎、肾小球肾炎、超敏反应、炎性肠道疾病、盆腔炎、再灌注损伤、类风湿关节炎、移植排斥反应、血管炎或间质性膀胱炎，等。

例如，所述传染性疾病包括：鼠疫、霍乱、传染性非典型肺炎、艾滋病、病毒性肝炎、脊髓灰质炎、人感染高致病性禽流感、麻疹、流行性出血热、狂犬病、流行性乙型脑炎、手足口病、登革热、炭疽、细菌性和阿米巴性痢疾、肺结核、伤寒和副伤寒、流行性脑脊髓膜炎、百日咳、白喉、新生儿破伤风、猩红热、布鲁氏菌病、淋病、梅毒、钩端螺旋体病、血吸虫病、疟疾、流行性感冒、流行性腮腺炎、风疹、急性出血性结膜炎、麻风病、流行性和地方性斑疹伤寒、黑热病、包虫病、丝虫病，除霍乱、细菌性和阿米巴性痢疾、伤寒和副伤寒以外的感染性腹泻病、真菌感染，等。

药物组合物及药盒

本发明还提供一种用于免疫调节的药物组合物，所述的药物组合物包括：本发明所述的多肽或编码其的多核苷酸，或含有该多核苷酸的表达载体或表达该多肽的重组细胞；以及药学上或生理学上可接受的载体。

合适的药学上可接受的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在Remington’sPharmaceutical Sciences中可找到关于药学上可接受的载体的充分说明。在组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、磷酸盐缓冲液、ringer溶液、生理盐水、平衡盐溶液、甘油或山梨醇等。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如润滑剂、助流剂、润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质和稳定剂，如白蛋白等。

在使用时，是将安全有效量的本发明所述的本发明所述的多肽或编码其的多核苷酸，或含有该多核苷酸的表达载体或表达该多肽的重组细胞施用于哺乳动物(如人)，其中该安全有效量通常至少约0.01微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约10毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

对于某一对象的精确有效量取决于该对象的体型和健康状况、病症的性质和程度、以及选择给予的治疗剂和/或治疗剂的组合。对于某给定的状况而言，可以用常规实验来确定该有效量，临床医师是能够判断出来的。

本发明还提供了一种药盒或试剂盒，其中包括：本发明所述的多肽或编码其的多核苷酸，或含有该多核苷酸的表达载体或表达该多肽的重组细胞；或所述的药物组合物。

为了便于临床应用，本发明的药物组合物可以包含在注射用给药器(如注射用针)中，所述的注射用给药器中，可以包含一次给药量的所述的药物组合物。所述的注射用给药器可以被包含在药盒中，以方便储存、使用。

本发明所述的药盒或试剂盒中，还可包括使用说明书，以利于本领域技术人员按照正确的方式使用。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1、miPEP31序列分析和体外合成

1、miPEP31序列分析

miR-31前体的序列如下：

ACGTAACCTAAAGCTAACAGACGGGGAAGCCATCACCAGGGTTTGGGTTGGATTCCCTACCAGTAAAATGAGGTAATGATGTGAAATTGGTCACGTTGTTGAAGAGTTGAA

CTGTTGAACTGAGAACCTGCTATGCCAACATATTGCCATCTTTCCTGTCTGACAGCAGCTTGGCTACCTCCGTCCTGTTCCTCCTTGTCTTGCTACAAGCCATCCATGATATGTAGGGCCCTGTGACTTGGTCTGTCTCGCCCTGACTTCTCTCCAGTCCTATACCGAATCACTCGCTCTGTTCTAGCCACACTGGCCTTTTGGGGATGTTCTTGGCTGCACCAGGAATATTCCCGCCTCTACTGCCCTGTCTTATCTTTTGGGCATCAGTGGAGAACTCTTTCACCATGGCACTGTCTATAAAACCTTACATGTGCCCAGCCACCGTTCACCTCATGACCCTGCTCTGACTTGTCAGAATCATTGGGCACTACCTGTCCATGTTCATTTGCTTAGTTGCTGCTTGATTTACTGTACCAGGTTGTAAGTCCTTTAAGGGACACCCGTCTTCATTTCTGTTCACCATACCCCTAAACCCTGACGTTTGCAAGTCCTCAAGTCATGTCTTTGCGACTCTACCCTGGACTTATTGTGCAACAGAAGTGTCAAATAATGAGATTTTAATCATGCCATGAATGGCTGTGATGAAACACTGGTTTATAAGTAACAAAGAATAAACAAATGCTACTGATTTCTAAGCCTGCAAACCCAACATCTTAAAGGAGCCACAATAAAGTTACCATCAGGTCTACAACTCAGAGAAGACAAAATATTGTATGGAAAAGAGATTATATTCAAAATAAAAGTTACTTTTGCGGTTTCA(SEQ ID NO:1)

上述序列中，斜体下划线部分为miPEP31预测序列(SEQ ID NO:1的第112-246位)。翻译为氨基酸的序列为：MRDWASVSSLGSGLWKERLWKSITTKRDGIAPVTR NWRGGKMLA(SEQ ID NO:2)。

2、miPEP的体外合成

使用常规的固相多肽合成方法，按照SEQ ID NO:2氨基酸序列合成多肽，质谱分析确定氨基酸正确。纯度达到96％以上，使用前溶于PBS待用。

实施例2、miPEP31在细胞中的表达

将miPEP31的编码序列构建到质粒pEGFP-N1(Addgene)的Sal1/Xhol1限制性位点中。从而，获得的重质粒在表达后能够形成miPEP31与GFP的融合蛋白。

将前述获得的重组质粒转染到脂肪细胞前体细胞(3T3)中，以转入空质粒(pEGFP-N1blank)的脂肪细胞体细胞为对照。空白组只转染空白的GFP质粒，miPEP31组同时转染miPEP-GFP和GFP空质粒。

培养细胞，提取蛋白后用电泳-免疫印迹的方法检测GFP的表达，结果如图1。

空质粒组可以检测GFP的表达，miPEP31组检测到两条GFP的条带，而且其中一条分子量偏大，为融合了GFP的miPEP31。

此外，本发明人将miPEP31编码序列中的起始密码子ATG突变成ATT，该序列采用如前所述的方法构建到质粒pEGFP-N1中，转入3T3细胞表达。

观察突变前后的细胞产生的GFP荧光情况，结果如图2。将miPEP31读码框前的序列连同起始密码子ATG克隆到去除ATG的GFP质粒上，转入脂肪细胞前体细胞(3T3)中，检测细胞产生的GFP荧光，可以发现出现GFP荧光；将miPEP31读码框前的序列连同起始密码子ATG突变成ATT并克隆到去除ATG的GFP质粒上后检测GFP的荧光，并没有发现GFP荧光的出现。

上述结果说明，miPEP31确实是在生理状态下表达的一种多肽。

实施例3、外源合成的miPEP31可以进入到细胞中

实施例1中固相多肽合成方法得到的miPEP31 miPEP，在其C端标记FITC。

1、3T3细胞

将1nM FITC标记的miPEP31与3T3细胞共培养，流式细胞术检测细胞的FITC荧光。结果如图3A，可以观测到细胞中存在FITC信号，说明miPEP能够进入到3T3细胞中。

3T3细胞固定后，用DAPI染细胞核，之后用激光共聚焦显微镜观察荧光。结果如图3C。用DAPI染细胞核，可以观测到蓝色的荧光。

将3T3细胞与1nM FITC标记的miPEP31共培养；之后，将细胞固定，用DAPI染细胞核后用激光共聚焦显微镜观察荧光。结果如图3D～E，可以观察到在细胞核(蓝色荧光)外存在绿色荧光，为FITC产生的荧光。

因此可见，miPEP31可以明显地进入到细胞内。

2、CD4⁺T细胞

将1nM FITC标记的miPEP31与CD4⁺T细胞共培养，流式细胞术检测细胞的FITC荧光。结果如图3B，可以观测到细胞中存在FITC信号，说明外源合成的miPEP31可以明显地进入到CD4⁺T细胞中。

实施例4、miPEP促进Treg分化

实施例1中固相多肽合成方法得到的miPEP31 miPEP，测定其对于Treg分化的影响作用。

1、对Treg细胞的体外诱导体系的影响

获取小鼠的脾脏细胞，利用免疫磁珠分离小鼠CD4⁺CD25^-T细胞，在37℃条件下培养于1640培养基中，在培养基中加入anti-CD3(2μg/ml)、anti-CD28(2μg/ml)、TFG-β(2ng/ml)和IL-2(2ng/ml)培养4天以得到Treg。

在37℃条件下、1640培养基中培养Treg，分为若干个培养组，分别加入0nM，0.1nM，1nM和10nM浓度的miPEP31，流式细胞术观察miPEP31对Treg分化的影响。

结果如图4A，说明在Treg细胞的体外诱导体系中加入不同浓度的miPEP31可以明显的促进Treg的分化。

2、对炎症环境分离得到的淋巴细胞的影响

实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)小鼠造模：在不完全弗氏佐剂中加入热灭活结核分枝杆菌，即为完全弗氏佐剂，MOG35-55配成终浓度10mg/ml。小鼠分别于背侧中线两侧2点皮下注射由MOG35-55与CFA按1:1混合乳化抗原。免疫当天及第二天给小鼠尾静脉注射百日咳毒素200ng/只，诱导小鼠产生EAE。

造模15天后，处死小鼠，分离脾脏细胞。

将0nM，0.1nM，1nM和10nM浓度的miPEP31分别加入到EAE小鼠造模15天后分离的脾脏细胞中，加入MOG再刺激后检测Treg的分化。

结果如图4B，说明从炎症环境分离得到的淋巴细胞再刺激时加入miPEP31发现可以在体外提高Treg的分化。

因此，miPEP31在炎症环境中能够有选择地诱导调节性T细胞发生而达到治疗效果。

实施例5、测试miPEP31对多发性硬化症(EAE)的治疗效果

将miPEP31注入在组织学、免疫学、多基因特性和治疗反应性上与人类多发性硬化症极为相似的实验性自身免疫性脑脊髓炎(Experimental AutoimmuneEncephalomyelitis，EAE)小鼠体内。

首先是建立EAE模型，在不完全弗氏佐剂中加入热灭活结核分枝杆菌，即为完全弗氏佐剂，MOG35-55配成终浓度10mg/ml。小鼠分别于背侧中线两侧2点皮下注射由MOG35-55与CFA按1:1混合乳化抗原。免疫当天及第二天给小鼠尾静脉注射百日咳毒素200ng/只，诱导小鼠产生EAE。

每只患病小鼠第10天开始尾静脉注射50μg的miPEP31(溶于PBS，浓度为0.5mg/ml)，之后每3天注射一次。从患病起观察30天且每天评分。采用5分评分法，EAE评分标准具体如下：

0分：不发病；

1分：尾巴无力；

2分：轻微后肢无力；

3分：严重后肢瘫痪；

4分：四肢瘫痪；

5分：濒临死亡或死亡。

miPEP治疗EAE小鼠15天后，杀死小鼠，分离中枢系统的单个核细胞，检测Treg的比例。结果如图5A，可见与对照组相比，miPEP治疗后中枢系统中Treg的比例被极大的提高。

每天的观察、评分结果如图5B，miPEP治疗组的EAE小鼠的发病情况较轻，能被基本治愈。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (9)

1.一种分离的多肽，其特征在于，该多肽为氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的多肽。

2.一种分离的多核苷酸，其编码权利要求1所述的多肽。

3.一种表达载体，其含有权利要求2所述的多核苷酸。

4.一种重组细胞，其中含有权利要求3所述的表达载体或其基因组中包含权利要求2所述的多核苷酸。

5.权利要求1所述的多肽或权利要求2所述的多核苷酸，或权利要求3所述的表达载体或权利要求4所述的重组细胞在制备免疫调节药物中的应用；所述的免疫调节药物是预防或治疗自身免疫性疾病的药物；所述的自身免疫性疾病包括：多发性硬化症，类风湿性关节炎，系统性红斑狼疮和银屑病。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的免疫调节药物是增加调节性T细胞的数量的药物。

7.一种制备权利要求1所述的多肽的方法，其特征在于，所述方法包括：培养权利要求4所述的重组细胞，从而重组表达权利要求1所述的多肽；或

所述方法包括：通过体外人工合成的方法制备权利要求1所述的多肽。

8.一种用于免疫调节的药物组合物，其特征在于，所述的免疫调节药物是预防或治疗自身免疫性疾病的药物；所述的自身免疫性疾病包括：多发性硬化症，类风湿性关节炎，系统性红斑狼疮和银屑病；所述的药物组合物包括：权利要求1所述的多肽或编码其的多核苷酸，或权利要求3所述的表达载体或权利要求4所述的重组细胞；以及

药学上或生理学上可接受的载体。

9.一种用于免疫调节的药盒，其特征在于，所述的免疫调节药物是预防或治疗自身免疫性疾病的药物；所述的自身免疫性疾病包括：多发性硬化症，类风湿性关节炎，系统性红斑狼疮和银屑病，所述药盒中包括：

权利要求1所述的多肽或编码其的多核苷酸；或

权利要求3所述的表达载体；或

权利要求4所述的重组细胞；或

权利要求8所述的药物组合物。

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