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CN107137628B - 来源于共生发酵生成物的透明质酸酶抑制剂及其应用 - Google Patents

来源于共生发酵生成物的透明质酸酶抑制剂及其应用 Download PDF

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CN107137628B CN201610108181.9A CN201610108181A CN107137628B CN 107137628 B CN107137628 B CN 107137628B CN 201610108181 A CN201610108181 A CN 201610108181A CN 107137628 B CN107137628 B CN 107137628B
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Abstract

本发明涉及一种透明质酸酶抑制剂，其包含共生发酵生成物，且此共生发酵生成物是于植物性培养基利用多种发酵菌株经共生发酵步骤以及固液分离步骤而得，所得的透明质酸酶抑制剂可应用于皮肤外用组合物，或用于制备抑制透明质酸酶的口服组合物或医药组合物。

Description

来源于共生发酵生成物的透明质酸酶抑制剂及其应用
技术领域
本发明涉及一种透明质酸酶抑制剂，特别是涉及一种来源于共生发酵生 成物的透明质酸酶抑制剂及其于口服组合物、皮肤外用组合物以及医药组合 物的应用。
背景技术
透明质酸酶(hyaluronidase；HAase)亦称扩散因子，是一群水解透明质酸(hyaluronic acid；HA)糖苷酶的总称，主要存在于动物组织(例如皮肤、关 节、韧带、眼睛等)、动物毒液及微生物中。透明质酸酶主要作用在透明质 酸的N-乙酰胺基葡糖和D-葡糖醛酸之间的β-1,3、β-1,4糖苷键，将其解聚合 并水解成相对低分子质量(Mr)的HA或寡糖。透明质酸广泛地存在于动物的 各种组织中，在机体内显示出多种重要的生理功能，如润滑关节、调节蛋白 质的运转、促进创伤愈合等。更为重要的是，它具有良好的保湿作用，在保湿的同时，又是良好的透皮吸收促进剂。含透明质酸的化妆品目前在国际 上被公认为「仿生化妆品」、「第四代化妆品」。
透明质酸酶依据最适反应pH值、氨基酸序列同源性及来源、结构和作 用机制，可概分成三类，分别是内切-β-N-乙酰胺基葡萄糖苷酶、内切-β-葡 萄糖醛酸苷酶、透明质酸裂解酶。
透明质酸酶是I型过敏反应和肿瘤细胞增殖的参与者，它与发炎、过敏 有强相关性。可使结缔组织的间质分解，组织水肿，血管通透性增加，炎症 加剧。这些作用与细菌及其产物的穿透和炎症迅速扩散有关。因此，抑制透 明质酸酶的活性，既能使透明质酸不被分解以维持其正常的生理功能，又能 达到抗炎、抗过敏、抗肿瘤的功效。透明质酸酶也能暂时降低细胞间质的黏 性，使皮下注射输液、局部累积的渗出液或血液加快扩散而利于吸收，更可 舒缓退化性关节炎的症状。因此，透明质酸酶也可作为药物扩散剂以及治疗 退化性关节炎等应用。另外，在含有透明质酸的制剂(特别地，如美容增强 剂和组织填充剂)中加入抑制透明质酸酶活性的添加剂，能够增强制剂作用 的持久性，避免规律性地重复给药。所以，抑制透明质酸酶活性的添加剂的 开发在制药、保健品、化妆品行业具有重要意义。
透明质酸被分解会造成许多疾病，例如过敏、发炎、退化性关节炎等。 目前已知有一些透明质酸酶抑制剂，例如多磺酸基粘多糖等，可抑制透明质 酸酶的酵素活性，使透明质酸不被分解以维持其正常的生理功能，又能达到 抗发炎、抗过敏、减缓退化性关节炎等功效。
目前已知天然来源产物中，列当科管花肉苁蓉、七叶树科天师栗的果实 娑罗子、迷迭香等提取物，具有抑制透明质酸酶活性的活性。然而，上述具 有抑制透明质酸酶的天然来源产物对于透明质酸酶的抑制效果有限。
有鉴于此，亟需开发一种天然来源产物，以提供具有抑制透明质酸酶活 性的产品。
发明内容
本发明的一方面是提供一种来源于共生发酵生成物的透明质酸酶抑制 剂，其包含共生发酵生成物，且此共生发酵生成物为于植物性培养基中以多 种发酵菌株经共生发酵步骤以及固液分离步骤而得。
本发明的另一方面是提供一种皮肤外用组合物，包含上述的透明质酸酶 抑制剂，其中透明质酸酶抑制剂作为有效成分。
本发明的又一方面是提供一种透明质酸酶抑制剂用于制备具有抑制透明 质酸酶的口服组合物，其是以上述透明质酸酶抑制剂作为有效成分。
本发明的再一方面是提供一种透明质酸酶抑制剂用于制备具有抑制透明 质酸酶的医药组合物，其是以上述的透明质酸酶抑制剂作为有效成分。
根据本发明的上述方面，提出一种来源于共生发酵生成物的透明质酸酶 抑制剂，其于植物性培养基中以多种发酵菌株经共生发酵步骤以及固液分离 步骤而得，其中前述共生发酵步骤是于37℃下进行70小时至100小时，且前 述发酵菌株选自于由多种乳酸菌菌株以及至少一非乳杆菌属菌株所组成组中 的至少8者。
依据本发明一实施例，上述乳酸菌菌株包括多种双歧杆菌属 (Bifidobacteriumspp.)菌株和/或乳杆菌属(Lactobacillus spp.)菌株。
依据本发明一实施例，上述双歧杆菌属选自于由青春双歧杆菌(B.adolescentis；BCRC 14606或ATCC 15703、BCRC 14607或ATCC 15704、 BCRC 14608或ATCC15705、BCRC 14658或DSM 20087、和/或BCRC 80247 或ATCC 15706)、两叉双歧杆菌(B.bifidum；BCRC 11844或DSM 20082、 BCRC 11845或ATCC 29521、BCRC 14613或ATCC11863、BCRC 14614或 ATCC 15696、BCRC 14615或ATCC 29521、BCRC 14630或ATCC 35914、和/或BCRC 14670或DSM 20215)、短双歧杆菌(B.breve；BCRC 11846或 ATCC 15700、BCRC12584或CSCC 1900、BCRC 14601或ATCC 15698、和/ 或BCRC 14612或NCDO 1456)、长双歧杆菌(B.longum；BCRC 11847或 ATCC 15707、BCRC 12585或CSCC 1901、BCRC 14602或ATCC15697、 BCRC 14634或ATCC 15708、和/或BCRC 14664或DSM 20097)及上述的任意 组合所组成的。
依据本发明一实施例，上述乳杆菌属菌株选自于由德氏乳杆菌保加利亚 亚种(L.delbrueckii subsp.bulgaricus；BCRC 10696或ATCC 15703、BCRC 12297或NCDO 970、BCRC 14007或NCDO 2074、BCRC 14008或NCDO 2394、BCRC 14010或NCDO 2487、BCRC 14069或CSCC 2505、和/或BCRC 14071)、瑞士乳杆菌(L.helveticus；BCRC 11052或IAM 12090、BCRC 12258 或ATCC 10386、BCRC 12259或ATCC 12046、BCRC 12296或NCDO 1844、 BCRC12936或ATCC 15009、BCRC 14021或IFO 3809、BCRC 14026或 ATCC 521)、鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus；BCRC 10940或ATCC 7469、 BCRC 11673或ATCC 9595、BCRC 12249或CSCC2602、BCRC 14027或 ATCC 14957、BCRC 14029或ATCC 21052、BCRC 14068或CSCC 2608、BCRC 16000或ATCC 53103、和/或BCRC 16095或NCIMB 8824)、乳杆菌副 干酪亚种(L.paracasei subsp.paracasei；BCRC 12188或ATCC 27216、BCRC 12193或ATCC 25598、BCRC 12248或ATCC 25302、BCRC 14001或ATCC 335、BCRC 14023或ATCC 27092、BCRC 16100或ATCC 11582、BCRC 17002或ATCC 334、BCRC 17005或ATCC 11578、和/或BCRC 17475或IAM10074)、短乳杆菌(L.brevis；BCRC10361或ATCC 8287、BCRC 11196或 NRRL 1834、BCRC12187或ATCC 14869、BCRC 12310或ATCC 367、和/或 BCRC 14060或DSM 1268)、干酪乳杆菌(L.casei；BCRC 10358或IAM 1045、BCRC 10697或ATCC 393、BCRC 11197或NRRL 1445、BCRC12272 或CSCC 2607、和/或BCRC 14025或ATCC 27139)、乳杆菌属(Lactobacillus sp.；BCRC 12945、BCRC 14018或IFO 14511、BCRC 14031或ATCC 33222、BCRC 14040或ATCC27305、BCRC 14044或IFO 3914、BCRC 14045或ATCC 27306、BCRC 14061或ATCC 8291、和/或BCRC17003或 ATCC 14435)及上述的任意组合所组成的。
依据本发明一实施例，上述至少一非乳杆菌属菌株包括链球菌属(Streptococcus spp.)菌株和/或酵母菌属(Saccharomyces spp.)菌株。
依据本发明一实施例，上述链球菌属菌株包括嗜热链球菌(Streptococcussalivarius subsp.thermophilus；BCRC 12257或CSCC 2012、BCRC 12268或 CSCC 2002、BCRC 12307或NCDO 1409、BCRC 13869或ATCC 19258、 BCRC 14017或ATCC 14485、BCRC14308和/或BCRC 14085)。
依据本发明一实施例，上述酵母菌属菌株包括啤酒酵母菌 (Saccharomycescerevisiae；BCRC 20262、BCRC 20263、BCRC 20270或 ATCC 2345、BCRC 20271或ATCC26602、BCRC 20405或ATCC 26603、 BCRC 20496或ATCC 28683、BCRC 20497或ATCC 28684、BCRC 20498或 ATCC 28685、和/或BCRC 21680或CBS 5816)。
依据本发明一实施例，上述发酵菌株于植物性培养基的接种量可例如为 3重量百分比至5重量百分比。
依据本发明一实施例，上述植物性培养基包含大豆、芝麻、薏苡、蔗 糖、氯化钠及水。
依据本发明一实施例，上述植物性培养基包含1.0至10.0重量百分比的大 豆、1.0至5.0重量百分比的芝麻、1.0至5.0重量百分比的薏苡、1.0至5.0重量 百分比的蔗糖以及0.1至2.0重量百分比的氯化钠。
依据本发明一实施例，上述植物性培养基包含1.0至6.0重量百分比的大 豆、1.0至3.0重量百分比的芝麻、1.0至3.0重量百分比的薏苡、2至5重量百分 比的蔗糖以及0.2至1.0重量百分比的氯化钠。
根据本发明的另一方面，提出一种透明质酸酶抑制剂用于制备具有抑制 透明质酸酶的口服组合物，其是以上述的透明质酸酶抑制剂作为有效成分。
根据本发明的又一方面，提出一种皮肤外用组合物，其包含上述的透明 质酸酶抑制剂，其是以上述的透明质酸酶抑制剂作为有效成分。
根据本发明的再一方面，提出一种透明质酸酶抑制剂用于制备具有抑制 透明质酸酶的医药组合物，其是以上述的透明质酸酶抑制剂作为有效成分。
应用本发明的透明质酸酶抑制剂，其包含来源于共生发酵生成物，且此 来源于共生发酵生成物为于植物性培养基利用多种发酵菌株经共生发酵步骤 以及固液分离步骤而得，所得的透明质酸酶抑制剂具有抑制透明质酸酶的活 性，可应用于皮肤外用组合物、制备具有抑制透明质酸酶的口服组合物或医 药组合物。
附图说明
为使本发明的上述和其他目的、特征、优点与实施例能更明显易懂，提 供附图，所述附图的详细说明如下：
图1绘示根据本发明实施例1的实验例、比较例1及比较例2所得的共生发 酵生成物的HPLC图谱。
图2A至图2C示出根据本发明浓度1.0～10％的实施例1的实验例(图 2A)、比较例1(图2B)及比较例2(图2C)的共生发酵生成物与3T3纤维母细 胞共培养后，透明质酸酶的透明质酸酶谱胶体照片。
具体实施方式
承前所述，本发明提供一种来源于共生发酵生成物的透明质酸酶抑制 剂，其包含来源于共生发酵生成物，且此共生发酵生成物为于植物性培养基 利用多种发酵菌株经共生发酵步骤以及固液分离步骤而得。
展开讲，本发明此处所称的「共生发酵生成物」是指在体外将各种不同 菌株，培养于发酵基质中进行共生发酵，再经固液分离等处理所得的生成 物，其中包含菌体残留成分、代谢物质等。
在一实施例中，前述共生发酵生成物可例如于植物性培养基，以多种发 酵菌株接种后，经共生发酵步骤以及固液分离步骤而得。在此说明的是，并 非共生发酵生成物当然就具有抑制透明质酸酶活性，需经实验证实才能确 认。
在一实施例中，上述植物性培养基可包含例如大豆、芝麻、薏苡、蔗 糖、氯化钠及水。在一例示中，上述植物性培养基可包含1.0至10.0重量百分 比的大豆、1.0至5.0重量百分比的芝麻、1.0至5.0重量百分比的薏苡、1.0至 5.0重量百分比的蔗糖以及0.1至2.0重量百分比的氯化钠，其余量为水。在另 一例示中，上述植物性培养基可包含1.0至6.0重量百分比的大豆、1.0至3.0重 量百分比的芝麻、1.0至3.0重量百分比的薏苡、2至5重量百分比的蔗糖以及 0.2至1.0重量百分比的氯化钠，其余量为水。
在此说明的是，倘若植物性培养基的各成分的使用量在上述范围之外， 则未经实验证实，无法预期能获得具有抑制透明质酸酶活性的共生发酵生成 物。
在一实施例中，上述发酵菌株选自于由多种乳酸菌菌株以及至少一非乳 杆菌属菌株所组成的组中的至少8者。在一例示中，上述发酵菌株于植物性 培养基的接种量可例如为3重量百分比至5重量百分比。
依据本发明一实施例，上述乳酸菌菌株可包括但不限于多种双歧杆菌属(Bifidobacterium spp.)菌株和/或乳杆菌属(Lactobacillus spp.)菌株。
在上述实施例中，双歧杆菌属可例如选自于由青春双歧杆菌(B. adolescentis；BCRC 14606或ATCC 15703、BCRC 14607或ATCC 15704、 BCRC 14608或ATCC 15705、BCRC14658或DSM 20087、和/或BCRC 80247 或ATCC 15706)、两叉双歧杆菌(B.bifidum；BCRC11844或DSM 20082、 BCRC 11845或ATCC 29521、BCRC 14613或ATCC 11863、BCRC 14614或ATCC 15696、BCRC 14615或ATCC 29521、BCRC 14630或ATCC 35914、 和/或BCRC 14670或DSM 20215)、短双歧杆菌(B.breve；BCRC 11846或 ATCC 15700、BCRC 12584或CSCC 1900、BCRC 14601或ATCC 15698、和/ 或BCRC 14612或NCDO 1456)、长双歧杆菌(B.longum；BCRC11847或 ATCC 15707、BCRC 12585或CSCC 1901、BCRC 14602或ATCC 15697、 BCRC 14634或ATCC 15708、和/或BCRC 14664或DSM 20097)及上述的任意 组合所组成的。
在上述实施例中，乳杆菌属菌株可例如选自于由德氏乳杆菌保加利亚亚 种(L.delbrueckii subsp.bulgaricus；BCRC 10696或ATCC 15703、BCRC 12297或NCDO 970、BCRC 14007或NCDO 2074、BCRC 14008或NCDO 2394、BCRC 14010或NCDO 2487、BCRC 14069或CSCC 2505、和/或BCRC 14071)、瑞士乳杆菌(L.helveticus；BCRC 11052或IAM 12090、BCRC 12258 或ATCC 10386、BCRC 12259或ATCC 12046、BCRC 12296或NCDO 1844、 BCRC12936或ATCC 15009、BCRC 14021或IFO 3809、BCRC 14026或 ATCC 521)、鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus；BCRC 10940或ATCC 7469、 BCRC 11673或ATCC 9595、BCRC 12249或CSCC2602、BCRC 14027或 ATCC 14957、BCRC 14029或ATCC 21052、BCRC 14068或CSCC 2608、BCRC 16000或ATCC 53103、和/或BCRC 16095或NCIMB 8824)、乳杆菌副 干酪亚种(L.paracasei subsp.paracasei；BCRC 12188或ATCC 27216、BCRC 12193或ATCC 25598、BCRC 12248或ATCC 25302、BCRC 14001或ATCC 335、BCRC 14023或ATCC 27092、BCRC 16100或ATCC 11582、BCRC 17002或ATCC 334、BCRC 17005或ATCC 11578、和/或BCRC 17475或IAM10074)、短乳杆菌(L.brevis；BCRC10361或ATCC 8287、BCRC 11196或 NRRL 1834、BCRC12187或ATCC 14869、BCRC 12310或ATCC 367、和/或 BCRC 14060或DSM 1268)、干酪乳杆菌(L.casei；BCRC 10358或IAM 1045、BCRC 10697或ATCC 393、BCRC 11197或NRRL 1445、BCRC12272 或CSCC 2607、和/或BCRC 14025或ATCC 27139)、乳杆菌属(Lactobacillussp.；BCRC 12945、BCRC 14018或IFO 14511、BCRC 14031或ATCC 33222、BCRC 14040或ATCC27305、BCRC 14044或IFO 3914、BCRC 14045或ATCC 27306、BCRC 14061或ATCC 8291、和/或BCRC17003或 ATCC 14435)及上述的任意组合所组成的。
在上述实施例中，至少一非乳杆菌属菌株可包括例如链球菌属 (Streptococcusspp.)菌株和/或酵母菌属(Saccharomyces spp.)菌株。
在上述实施例中，链球菌属菌株包括嗜热链球菌(Streptococcus salivariussubsp.thermophilus；BCRC 12257或CSCC 2012、BCRC 12268或 CSCC 2002、BCRC 12307或NCDO 1409、BCRC 13869或ATCC 19258、 BCRC 14017或ATCC 14485、BCRC 14308和/或BCRC14085)。
在上述实施例中，酵母菌属菌株包括啤酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae；BCRC 20262、BCRC 20263、BCRC 20270或ATCC 2345、BCRC 20271或ATCC 26602、BCRC 20405或ATCC 26603、BCRC 20496或ATCC 28683、BCRC 20497或ATCC 28684、BCRC 20498或ATCC28685、和/或BCRC 21680或CBS 5816)。
上述ATCC代表美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection；ATCC)，BCRC代表中国台湾新竹食品工业发展研究所生物资源 保存及研究中心(Bioresource Collection and Research Center；BCRC)，CBS代 表荷兰皇家艺术与科学院真菌生物多样性中心(Centraalbureau voor Schimmelcultures；CBS)，DSM代表德国微生物及细胞培养保藏中心 (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen GmbH；DSMZ)， NRRL代表美国农业研究菌种保藏中心(AgriculturalResearch Service Culture Collection；NRRL)。CSCC、IAM、IFO、NCDO、NCIMB则为非国际寄存 机构(international depositary authority；IDA)，其中CSCC代表澳洲食品科学 联邦科学与工业研究组织(Commonwealth Scientific and Industrial ResearchOrganisation；CSIRO)部的入门菌种保藏(Starter Culture Collection)中心， IAM代表日本东京大学应用微生物研究所(Institute of Applied Microbiology； IAM)菌种保藏中心，IFO代表日本大阪发酵研究所(Institute for Fermentation；IFO)微生物保藏中心，NCDO代表荷兰国际合作及可持续发 展国家委员会(National Committee forInternational Cooperation and Sustainable Development；NCDO)，NCIMB代表英国苏德兰国立工业食品及海洋微生物 保藏中心(National Collection of Industrial andMarine Bacteria；NCIMB)， NRRL代表美国农业部国立农业利用研究中心(NationalCenter for Agricultural Utilization Research)北方地区性研究实验室(NorthernRegional Research Laboratory；现改名为农业研究服务保藏中心，AgriculturalResearch Service (ARS)Culture Collection)。
在一实施例中，前述共生发酵步骤可例如于37℃下进行70小时至100小 时，然以于37℃下进行72小时至96小时为较佳，以获得发酵产物。在另一例 示中，固液分离步骤可例如过滤步骤或离心步骤，除去发酵产物的固形物， 以获得共生发酵生成物。
在其他实施例中，上述共生发酵步骤以及固液分离步骤之间，更可选择 性进行终止发酵步骤。在一例示中，前述终止发酵步骤可例如在90℃下进行 15分钟。
在一实施例中，上述所得的共生发酵生成物可选择性进行公知的后处理 步骤，例如浓缩步骤、脱色步骤和/或微生物检测步骤，端视实际需求而 定。
上述所得的共生发酵生成物经体外活性试验评估后，证实具有抑制透明 质酸酶活性，故可进一步应用于各种剂型的组合物。适合的组合物可包括但 不限于口服组合物、皮肤外用组合物和/或医药组合物。在一实施例中，上 述的共生发酵生成物的口服组合物、皮肤外用组合物和/或医药组合物是以 共生发酵生成物为有效成分，使上述剂型的组合物具有抑制透明质酸酶的活 性。在此说明的是，一般而言，目前已知天然来源产物中具有抑制透明质酸 酶活性者，其抑制活性的程度都有剂量及时间依存(dose-and time-dependent)相关性。然而，本发明上述所得的共生发酵生成物在作为透明质 酸酶抑制剂时，具有良好的水溶性，不具有剂量依存相关的细胞毒性，更可 于无剂量及时间依存表现下完全抑制透明质酸酶酶活性，因此可提供生物安 全性高、稳定、生体吸收性佳且有效的透明质酸酶抑制剂。
以下利用数个实施例以说明本发明的应用，然其并非用以限定本发明， 本发明技术领域中普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，可作各 种修改与改变。
实施例1：制备共生发酵生成物
1.配制植物性培养基
首先，根据表1配制实施例、比较例1至2的植物性培养基。
表1
Figure BDA0000930483850000091
在进行发酵前，表1所列的植物性培养基可先利用公知的高压蒸气灭菌 法进行灭菌，其灭菌的工艺条件可例如在121℃下进行40分钟。然后，将至 少8种不同的发酵菌株分别接种至于表1的植物性培养基中，其中发酵菌株于 植物性培养基的总接种量可为3％(w/v)至5％(w/v)。
在此实施例中，前述发酵菌株包括青春双歧杆菌(B.adolescentis； BCRC 14606或ATCC 15703、和/或BCRC 14658或DSM 20087)、两叉双歧杆 菌(B.bifidum；BCRC 11845或ATCC 29521、和/或BCRC 14615或ATCC 29521)、短双歧杆菌(B.breve；BCRC 11846或ATCC15700、和/或BCRC 14612或NCDO 1456)、长双歧杆菌(B.longum；BCRC 12585或CSCC 1901、和/或BCRC 14602或ATCC 15697)、德氏乳杆菌保加利亚亚种(L.delbrueckiisubsp.bulgaricus；BCRC 10696或ATCC 15703、和/或BCRC 14008或NCDO 2394)、瑞士乳杆菌(L.helveticus；BCRC 12936或ATCC 15009、和/或BCRC 14026或ATCC 521)、鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus；BCRC 14068或CSCC 2608、和/或BCRC 16000)、乳杆菌副干酪亚种(L.paracasei subsp. paracasei；BCRC 14023或ATCC 27092、和/或BCRC 17475或IAM10074)、 短乳杆菌(L.brevis；BCRC 11196或NRRL 1834、和/或BCRC 12187或ATCC 14869)、干酪乳杆菌(L.casei；BCRC 10697或ATCC 393、和/或BCRC 11197 或NRRL 1445)、乳杆菌属(Lactobacillus sp.；BCRC 14061或ATCC 8291、和 /或BCRC17003或ATCC 14435)、嗜热链球菌(Streptococcus salivarius subsp. thermophilus；BCRC 12257或CSCC 2012、和/或BCRC 13869或ATCC 19258) 以及啤酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae；BCRC 20262和/或BCRC 21680或 CBS 5816)。上述同种但不同保藏编号的菌株，各选择一种菌株与其他不同 种的菌株混合使用。
接下来，上述接种后的植物性培养基进行共生发酵步骤，其是于37℃下 进行72小时至96小时。所得的共生发酵生成物在终止发酵步骤以及固液分离 步骤后，即获得所得的共生发酵生成物并进行后续评估。
实施例2：利用高效液相层析评估共生发酵生成物
1.共生发酵生成物的分析产物萃取
实施例1的实验例、比较例1及比较例2所得的共生发酵生成物先分别以 50％乙酸乙酯萃取，再以多层(例如6层)纱布过滤后的滤液，于45℃下烘干6 小时，以获得共生发酵生成物测试样品的萃取产物，取1mg样品，以2mL DMSO回溶，以进行高效液相层析(HPLC)分析。
2.共生发酵生成物测试样品萃取产物的分析方法
HPLC分析条件如下，其结果如图1所示：
(i)分析管柱：Cosmosil C18；
(ii)UV-VIS检测器：Hitachi L-7420；
(iii)检测波长：243nm；
(iv)移动相：洗提液A：甲醇/醋酸(100/0.5)；
(v)洗提液B：甲醇/水/醋酸(80/20/0.5)；
(vi)梯度洗提的条件：甲醇浓度在0至15分钟内从80％线性递增至84％， 在15至30分钟内再递增至86％，在30至40分钟内再递增至88％，在0至50分 钟内再递增至94％，在50至70分钟内再递增至100％；
(vii)流速：0.7mL/min。
参阅图1，其绘示实施例1的实验例、比较例1及比较例2所得的共生发酵 生成物的HPLC图谱。由图1的结果可知，不同的植物性培养基经共生发酵 等步骤处理后，其峰值分布(peak pattern)亦有所不同。实验组1的共生发酵 生成物出现的峰值分布(peak pattern)可作为参考，并作为未来生产共生发酵 生成物的品管标准。
实施例3：评估共生发酵生成物抑制透明质酸酶的活性(即抗过敏活性分析)
1.细胞培养
首先，将老鼠3T3纤维母细胞(mouse 3T3fibroblasts；BCRC 60071)培养 于含10％胎牛血清(fetal calf serum,Hyclone)及2.5％小牛血清(bovine calf serum,Hyclone)的Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium(DMEM)培养基并加 入3.7％(w/v)的碳酸氢钠，0.03％(w/v)的谷氨酸(L-glutamine)，每毫升含100 单位的青霉素(penicillin)及100毫克的链霉素(streptomycin)等抗生素，在 37℃、10％CO2培养箱培养，一般以1×106个细胞的细胞密度接种于75cm2的培养皿，每三至四天进行继代培养并换以新鲜培养基。之后，取约第十代 的3T3细胞，进行不同浓度的共生发酵生成物的细胞实验。
2.透明质酸酶活性抑制分析方法(透明质酸酶谱分析；hyaluronan-basedzymography)
将3T3老鼠纤维母细胞(mouse 3T3fibroblasts；BCRC 60071)与实施例1 的实验例、比较例1至2的共生发酵生成物共培养，或不与前述共生发酵生成 物(对照组)共培养。培养1或2天(24或48小时)后，取各组的细胞培养液，配 制含有玻尿酸的电泳胶片(包括stacking gel及separating gel)，再进行蛋白质 电泳分析，其中蛋白质电泳的条件应为本发明所属技术领域中普通技术人员 所熟知，在此不另赘述。待电泳结束后，将电泳槽中的胶片取出，浸泡于清 洗缓冲溶液(washing buffer)中，于室温震荡清洗1小时后，移除清洗缓冲溶 液，再加入反应缓冲溶液(reaction buffer)中，于37℃水浴中震荡反应16小时。反应完毕后，将胶片取出，浸泡于0.5％的阿尔辛蓝染液(Alcian blue solution)中震荡染色2小时后，再浸泡于褪染缓冲溶液(destaining buffer)中， 褪染约1至2小时至条带清晰可见为止。之后，再以玻璃纸封片固定于压克力 板上，放置室温下自然风干，即完成共生发酵生成物测试样品萃取产物对于 透明质酸酶活性影响的分析步骤，其结果如图2A至图2C。
参阅图2A至2C，其示出根据本发明浓度1.0～10％的实施例1的实验例(图 2A)、比较例1(图2B)及比较例2(图2C)的共生发酵生成物与3T3纤维母细胞共 培养后，透明质酸酶的透明质酸酶谱胶体照片。在图2A至2C中，第M道代 表蛋白质标记，第C0、C24、C48道分别显示未经处理的3T3老鼠纤维母细胞 经0、24、48小时培养后的透明质酸酶活性。
由图2A至图2C的结果可知，本发明实施例1的实验例(图2A)的共生发酵 生成物在1.0～10％的浓度(处理24小时)对于玻尿酸酶活性均具有强大的抑制 作用，而且无剂量依存关系。在此说明的是，图2A不仅显示实施例1的实验 例的共生发酵生成物在体外以低剂量(1.0％)的实验例(图2A)的共生发酵生成 物，于24小时内可完全抑制透明质酸酶活性，在1.0～10％的浓度皆可明显抑 制对玻尿酸酶活性，且其抑制作用在1.0～10％的浓度之间不具有剂量相关 性。相较于其他已知具有剂量及时间相关性的天然来源产物的透明质酸酶抑 制剂，本发明实验例的共生发酵生成物对玻尿酸酶的抑制作用显然是更加有 效的。至于比较例1(图2B)的共生发酵生成物在10％以内的浓度(处理48小时) 对于透明质酸酶的酵素活性没有任何的抑制作用，不具有保护玻尿酸的作 用。比较例2(图2C)的共生发酵生成物在10.0％的浓度(处理24小时)以及在 1.0％的浓度(处理48小时)对于玻尿酸酶活性才具有较有效的抑制作用(甚至 完全的活性抑制)，但抑制效果远不及实验例(图2A)。
由于实施例1的实验例的共生发酵生成物可明显抑制透明质酸酶的活 性，具有保护玻尿酸的较佳作用，也就是具有推迟玻尿酸因老化因素而被透 明质酸酶破坏的能力，可作为有效成分并应用于皮肤外用组合物，例如化妆 品组合物。
其次，实施例1的实验例的共生发酵生成物根据中国台湾公告的健康食 品安全性评估方法，以低剂量(3.5g/kg体重/天)、中剂量(7g/kg体重/天)及高 剂量(11.67g/kg体重/天)的剂量，利用胃管经口投予试验动物(雄、雌大鼠， 至少为三重复的数据)，进行28天亚慢性毒性试验，并未造成死亡现象以及 不良临床征兆。每日体重增加量及饮水、饲料消耗量、形态、行为活动力及 器官组织重量未产生与剂量相关的显著变化。血液分析及生化指针检测的结 果显示喂食实施例1的实验例的共生发酵生成物与比较例或对照组间无明显 差异，证实无明显亚慢性毒性，符合食品安全性的标准(图未绘示)，并推估 实施例1的实验例的共生发酵生成物的未观察到不良影响反应剂量(no- observed-adverse-effect-level；NOAEL)为11.67g/kg/天。
既然实施例1的实验例的共生发酵生成物能明显抑制透明质酸酶的活 性，又符合食品安全性的标准，可作为有效成分，并应用于制备具有抑制透 明质酸酶活性的口服组合物和/或医药组合物。
综言之，由上述数个实施例证实，本发明来源于共生发酵生成物的透明 质酸酶抑制剂，成功利用多种发酵菌株经共生发酵步骤以及固液分离步骤制 得，且所得的共生发酵生成物确实具有抑制透明质酸酶的活性，亦可进一步 抑制过敏、发炎、退化性关节炎，可应用于皮肤外用组合物、制备具有抑制 透明质酸酶的口服组合物或医药组合物。
需补充的是，本发明虽以特定的工艺、特定的分析方法或特定仪器作为 例示，说明本发明的具有抑制透明质酸酶活性的共生发酵生成物及其应用， 惟本发明所属技术领域中任何普通技术人员可知，本发明并不限于此，在不 脱离本发明的精神和范围内，本发明的具有抑制透明质酸酶活性的共生发酵 生成物亦可使用其他工艺、其他的分析方法或其他仪器进行。
由上述实施例可知，本发明的来源于共生发酵生成物的透明质酸酶抑制 剂及其应用，其优点在于利用多种发酵菌株经共生发酵步骤以及固液分离步 骤而得，所得的共生发酵生成物具有抑制透明质酸酶的活性，可应用于皮肤 外用组合物、制备具有抑制透明质酸酶的口服组合物或医药组合物。
虽然本发明已以数个实施例揭露如上，然其并非用以限定本发明，在本 发明所属技术领域中任何普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内， 可作各种修改与改变，因此本发明的保护范围视所附权利要求书所界定为 准。

Claims (20)

1.一种来源于共生发酵生成物的透明质酸酶抑制剂，其特征在于所述透明质酸酶抑制剂是于一植物性培养基中以多种发酵菌株经一共生发酵步骤以及一固液分离步骤而得，其中该共生发酵步骤是于37℃下进行70小时至100小时，该些发酵菌株选自于由多种乳酸菌菌株以及至少一非乳杆菌属菌株所组成组中的至少8者，所述植物性培养基包含6.0重量百分比的大豆、1.5重量百分比的芝麻、1.5重量百分比的薏苡、4.5重量百分比的蔗糖以及0.5重量百分比的氯化钠，且所述至少一非乳杆菌属菌株为嗜热链球菌和/或啤酒酵母菌；
其中，所述乳酸菌菌株为双歧杆菌属(Bifidobacterium spp.)菌株和/或乳杆菌属(Lactobacillus spp.)菌株。
2.根据权利要求1所述的来源于共生发酵生成物的透明质酸酶抑制剂，其特征在于所述双歧杆菌属选自于由青春双歧杆菌(B.adolescentis)、两叉双歧杆菌(B.bifidum)、短双歧杆菌(B.breve)、长双歧杆菌(B.longum)及上述的任意组合所组成的。
3.根据权利要求2所述的来源于共生发酵生成物的透明质酸酶抑制剂，其特征在于所述青春双歧杆菌为BCRC 14606、ATCC 15703、BCRC 14607、ATCC 15704、BCRC 14608、ATCC15705、BCRC 14658、DSM 20087、BCRC 80247和ATCC 15706中的至少一种。
4.根据权利要求2所述的来源于共生发酵生成物的透明质酸酶抑制剂，其特征在于所述两叉双歧杆菌为BCRC 11844、DSM 20082、BCRC 11845、ATCC 29521、BCRC 14613、ATCC11863、BCRC 14614、ATCC 15696、BCRC 14615、ATCC 29521、BCRC 14630、ATCC 35914、BCRC14670和DSM 20215中的至少一种。
5.根据权利要求2所述的来源于共生发酵生成物的透明质酸酶抑制剂，其特征在于所述短双歧杆菌为BCRC 11846、ATCC 15700、BCRC 12584、CSCC 1900、BCRC 14601、ATCC15698、BCRC 14612和NCDO 1456中的至少一种。
6.根据权利要求2所述的来源于共生发酵生成物的透明质酸酶抑制剂，其特征在于所述长双歧杆菌为BCRC 11847、ATCC 15707、BCRC 12585、CSCC 1901、BCRC 14602、ATCC15697、BCRC 14634、ATCC 15708、BCRC 14664和DSM 20097中的至少一种。
7.根据权利要求1所述的来源于共生发酵生成物的透明质酸酶抑制剂，其特征在于所述乳杆菌属菌株选自于由德氏乳杆菌保加利亚亚种(L.delbrueckii subsp.bulgaricus)、瑞士乳杆菌(L.helveticus)、鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)、乳杆菌副干酪亚种(L.paracasei subsp.paracasei)、短乳杆菌(L.brevis)、干酪乳杆菌(L.casei)及上述的任意组合所组成的。
8.根据权利要求7所述的来源于共生发酵生成物的透明质酸酶抑制剂，其特征在于所述德氏乳杆菌保加利亚亚种为BCRC 10696、ATCC 15703、BCRC 12297、NCDO 970、BCRC14007、NCDO 2074、BCRC 14008、NCDO 2394、BCRC 14010、NCDO 2487、BCRC 14069、CSCC2505和BCRC 14071中的至少一种。
9.根据权利要求7所述的来源于共生发酵生成物的透明质酸酶抑制剂，其特征在于所述瑞士乳杆菌为BCRC 11052、IAM 12090、BCRC 12258、ATCC 10386、BCRC 12259、ATCC12046、BCRC 12296、NCDO 1844、BCRC 12936、ATCC 15009、BCRC 14021、IFO 3809、BCRC14026和ATCC 521中的至少一种。
10.根据权利要求7所述的来源于共生发酵生成物的透明质酸酶抑制剂，其特征在于所述鼠李糖乳杆菌为BCRC 10940、ATCC 7469、BCRC 11673、ATCC 9595、BCRC 12249、CSCC2602、BCRC 14027、ATCC 14957、BCRC 14029、ATCC 21052、BCRC 14068、CSCC 2608、BCRC16000、ATCC 53103、BCRC 16095和NCIMB 8824中的至少一种。
11.根据权利要求7所述的来源于共生发酵生成物的透明质酸酶抑制剂，其特征在于所述乳杆菌副干酪亚种为BCRC 12188、ATCC 27216、BCRC 12193、ATCC 25598、BCRC 12248、ATCC 25302、BCRC 14001、ATCC 335、BCRC 14023、ATCC 27092、BCRC 16100、ATCC 11582、BCRC 17002、ATCC 334、BCRC 17005、ATCC 11578、BCRC 17475和IAM 10074中的至少一种。
12.根据权利要求7所述的来源于共生发酵生成物的透明质酸酶抑制剂，其特征在于所述短乳杆菌为BCRC10361、ATCC 8287、BCRC 11196、NRRL 1834、BCRC 12187、ATCC 14869、BCRC 12310、ATCC 367、BCRC 14060和DSM 1268中的至少一种。
13.根据权利要求7所述的来源于共生发酵生成物的透明质酸酶抑制剂，其特征在于所述干酪乳杆菌为BCRC 10358、IAM 1045、BCRC 10697、ATCC 393、BCRC 11197、NRRL 1445、BCRC 12272、CSCC 2607、BCRC 14025和ATCC 27139中的至少一种。
14.根据权利要求1所述的来源于共生发酵生成物的透明质酸酶抑制剂，其特征在于所述乳杆菌属菌株为BCRC 12945、BCRC 14018、IFO 14511、BCRC 14031、ATCC 33222、BCRC14040、ATCC 27305、BCRC 14044、IFO 3914、BCRC 14045、ATCC 27306、BCRC 14061、ATCC8291、BCRC17003和ATCC 14435中的至少一种。
15.根据权利要求1所述的来源于共生发酵生成物的透明质酸酶抑制剂，其特征在于所述嗜热链球菌(Streptococcus salivarius subsp.Thermophilus)为BCRC 12257、CSCC2012、BCRC 12268、CSCC 2002、BCRC 12307、NCDO 1409、BCRC 13869、ATCC 19258、BCRC14017、ATCC 14485、BCRC 14308和BCRC 14085中的至少一种。
16.根据权利要求1所述的来源于共生发酵生成物的透明质酸酶抑制剂，其特征在于所述啤酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)为BCRC 20262、BCRC 20263、BCRC 20270、ATCC2345、BCRC 20271、ATCC 26602、BCRC 20405、ATCC 26603、BCRC 20496、ATCC 28683、BCRC20497、ATCC 28684、BCRC 20498、ATCC 28685、BCRC 21680和CBS 5816中的至少一种。
17.根据权利要求1所述的来源于共生发酵生成物的透明质酸酶抑制剂，其特征在于所述发酵菌株于该植物性培养基的接种量为3重量百分比至5重量百分比。
18.一种口服组合物，其特征在于所述口服组合物是以权利要求1至17中任一项所述的透明质酸酶抑制剂作为一有效成分。
19.一种皮肤外用组合物，其特征在于所述皮肤外用组合物包含如权利要求1至17中任一项所述的透明质酸酶抑制剂，其中该透明质酸酶抑制剂作为一有效成分。
20.一种医药组合物，其特征在于所述医药组合物是以权利要求1至17中任一项所述的透明质酸酶抑制剂作为一有效成分。
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