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CN107106626A - 来自茶科植物的生物活性组合物及其在饮料、功能性食品、营养品、补充物等中的用途 - Google Patents

来自茶科植物的生物活性组合物及其在饮料、功能性食品、营养品、补充物等中的用途 Download PDF

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CN107106626A CN201480020123.XA CN201480020123A CN107106626A CN 107106626 A CN107106626 A CN 107106626A CN 201480020123 A CN201480020123 A CN 201480020123A CN 107106626 A CN107106626 A CN 107106626A
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extract
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O·杜瓦-克格诺夫
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HC Starck GmbH
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Abstract

本发明涉及包含来自茶科植物的生物活性部分的分离的生物活性组合物。本发明还涉及包含该生物活性组合物的生物活性的局部制剂。本发明进一步涉及使用本发明的生物活性组合物的方法，包括例如在哺乳动物的皮肤组织中抑制炎症活性、保护哺乳动物的皮肤组织避免紫外光诱导的损害以及使哺乳动物的皮肤组织中皮肤病症的正常化的方法。本发明还涉及分离来自茶科植物的细胞汁或细胞壁组分的生物活性部分的方法。所述生物活性组合物适合用于特别是饮料、功能性食品、营养品、补充剂等。

Description

来自茶科植物的生物活性组合物及其在饮料、功能性食品、营 养品、补充物等中的用途
相关申请的交叉参考
本申请要求于2013年2月8日提交的美国临时专利申请序列号61/762,545的优先权利益，其内容以其整体引入本文作为参考。
发明领域
本发明涉及来自茶科(Theacea)植物的生物活性组合物、其制备方法，以及这些组合物的用途。该生物活性组合物适合用于特别是饮料、功能性食品、营养品、添加物等。
发明背景
茶科(茶植物)包括乔木或者灌木，含有约40个属和600个种。山茶(Camelliasinensis)在茶科占有独一无二的地位，因为该特殊的植物物种主要用作生产全部三种基本种类的茶：绿茶、乌龙茶和红茶的单一原料来源(在本文中统称为“茶植物”)。按照某些来源，还有第四种茶，即所谓的“白茶”，其唯一地产自茶植物的芽和尖。
三种基本的茶形式是由加工程度确定，其涉及相同的幼嫩茶树叶。将该树叶采摘、分类、洗净，并在蒸煮或干燥前进行不同的氧化。术语“发酵”往往用于描述茶的加工，但是术语“氧化”对于所发生的化学转化是更为准确的描述。
尽管在加工过程中有些不同，但一般而言绿茶的氧化程度最低，而红茶最高。乌龙茶被认为是部分氧化，因此处于绿茶和红茶之间。关于加工方式，绿茶和白茶之间的差别很小(或者根本没有差别)。
绿茶是由蒸制和凋萎并随后立即干燥的新鲜树叶制备。红茶是由凋萎并在滚筒中粉碎、随后氧化数小时、然后干燥的树叶制备。乌龙茶是由仅部分氧化、然后干燥的树叶制备。
世界上，茶是第二种(在水之后)最普遍消费的液体，且在美国是第六种(在水、软饮料、咖啡、啤酒和牛奶之后)最普遍消费的液体。茶的消费在世界范围内持续增加，特别是由于对该液体的健康益处的公众认知不断提高。日益增多的出版物提示了茶及其成分的抗血管生成、抗细菌、抗致癌、抗炎、抗诱变、抗氧化、抗感染和解毒的特性。茶的一系列益处还包括降低罹患风湿性关节炎的风险、降低胆固醇水平和抗糖尿病特性。并非所有这些益处都被证实具有统计学显著性。尽管如此，非常广泛的茶的益处反映了具有非常强大的生物活性物质的独特组成，其存在于新鲜植物树叶中，并且在传统的茶叶加工过程中存留。
具体而言，已经报道过在山茶(Camellia sinensis)的新鲜树叶中包含22.2％多酚类、17.2％蛋白质、4.3％咖啡因、27.0％粗纤维、0.5％淀粉、3.5％还原糖、6.5％果胶、2.0％醚提取物和5.6％灰分(Duke,J.A.,Handbook of Energy Crops(1983),参见www.hort.purdue.edu/newcrop/duke energy/Camellia_sinensis.html)。据报道，每100g叶中包含8.0g H2O、24.5g蛋白质、2.8g脂肪、58.8g总碳水化合物、8.7g纤维、5.9g灰分、327mg Ca、313mg P、24.3mg Fe、50mg Na、2700μgβ-胡萝卜素当量、0.07mg硫胺、0.8mg核黄素、7.6mg烟酸和9mg抗坏血酸。另一项报告记录了8.0g H2O、28.3g蛋白质、4.8g脂肪、53.6g总碳水化合物、9.6g纤维、5.6g灰分、245mg Ca、415mg P、18.9mg Fe、60mg Na、8400μgβ-胡萝卜素当量、0.38mg硫胺、1.24mg核黄素、4.6mg烟酸和230mg抗坏血酸。而另一项报告给出8.1g H2O、24.1g蛋白质、3.5g脂肪、59.0g总碳水化合物、9.7g纤维、5.3g灰分、320mg Ca、185mg P、31.6mg Fe、8400μgβ-胡萝卜素当量、0.07mg硫胺、0.79mg核黄素、7.3mg烟酸和85mg抗坏血酸(J.A.Duke和A.A.Atchley,“Proximate Analysis,”In:Christie,B.R.(编辑)。The Handbook of Plant Science in Agriculture,CRC Press,Inc.,Boca Raton,Fla.(1984))。
该树叶还包含胡萝卜素、核黄素、烟酸、泛酸和抗坏血酸。咖啡因和鞣质属于更有活性的组分(Council for Scientific and Industrial Research,1948-1976)。存在于新鲜树叶中的抗坏血酸在制作红茶过程中被破坏。产生苹果酸和草酸，以及山奈酚、槲皮苷、茶碱、可可碱、黄嘌呤、次黄嘌呤、腺嘌呤、树胶、糊精类和肌醇。挥发油(树叶鲜重的0.007-0.014％)的主要成分是己烯醛、己烯醇和低级醛类，丁醛、异丁醛、异戊醛，以及正己基、苄基和苯乙基醇类，酚类、甲酚、己酸、正辛醇、香叶醇、沉香醇、乙酰苯、苯甲醇和柠檬醛。
已经发现，新鲜茶叶含有异常高水平的多酚类的黄酮醇组(儿茶素类)，其可以达到树叶干物质的30％。儿茶素类主要包括(-)-表儿茶素、(-)-表儿茶素没食子酸酯、(-)-表没食子酸儿茶素和(-)-表没食子酸儿茶素没食子酸酯。此外，还有茶中独有的3-没食子酰基奎宁酸(茶素)和独有的氨基酸茶氨酸(5-N-乙基谷氨酰胺)(Duke,J.A.,Handbook ofEnergy Crops(1983),参见www.hort.purdue.edu/newcrop/duke_energy/Camellia_ sinensis.html)。
茶叶包含高水平的多酚氧化酶和过氧化物酶。第一个酶催化儿茶素的有氧氧化，且该过程在树叶细胞结构的完整性被破坏时开始。酚氧化酶使得双黄酮醇、茶黄素、表茶黄酸和茶红素的产生，它们构成了红茶中可萃取物质的最大部分。大部分这些化合物容易与咖啡因形成复合物，其在新鲜树叶中具有显著水平(干物质的2-4％)。过氧化物酶在化合物与原花色素形成上述复合物中发挥重要作用。儿茶素醌类还引发成百上千种在红茶的芳香部分中发现的挥发性化合物的形成。此外，发生由相对可溶的糖苷类向较低溶解度的苷元的转化。
上述加工过程的全部复杂的级联反应都是由树叶细胞结构破坏所引发，并随氧化时间而加强。因此，通常经过深度揉捻、切割和相对长时间氧化加工的红茶成分与新鲜树叶中的非常不同。尽管绿茶(和白茶)经过最低程度的氧化加工，且其成分与新鲜树叶中的更加近似，但是其具有非酶的和酶催化的变化，这在采摘后非常迅速地发生，并且在干燥阶段期间产生了新的挥发性物质。因此，即使相对柔和的绿茶加工仍会引发对原始新鲜植物成分的某些改变，并且可以降低新鲜的茶植物树叶的治疗价值和其它潜在益处。
许多近期研究都清楚的证实茶的治疗性益处按照以下次序降低：白茶>绿茶>乌龙茶>红茶。因此，作为对传统茶叶加工观察的结果，新鲜茶植物的研究可以防止特定活性的降解。新鲜、柔嫩的山茶属(Camellia)树叶包含大约80％的水。细胞的刚性细胞壁阻止了细胞的溶胀和脱水。细胞壁结构的破坏引发了新鲜植物组织的脱水，并随后依次发生不期望的物理化学和生物化学过程：渗透冲击、区室结构破坏以及酶破坏、水解及氧化、酚类聚合、糖苷类向苷元转化、美拉德反应产物生成、异构化和微生物污染。因此，新鲜的山茶包含了范围非常广泛的生物活性物质，并且仅有其中的一部分在传统萃取过程中被获取。因此，仅有细胞壁、分解代谢物和稳定的代谢产物可以用开水萃取以获得茶饮料，或者用不同的溶剂萃取以获得生物活性成分的有限部分(主要是多酚类和黄酮类)。
鉴于新鲜茶叶作为有价值的治疗性和其它潜在有益的生物活性成分来源的可能性，需要对新鲜茶植物进行探索以确定如何将其治疗性和其它潜在有益的生物活性特性最大化。
发明简述
本发明涉及生物活性组合物。在一项实施方案中，该生物活性组合物包含来自茶科植物的分离的生物活性部分。适合的生物活性部分可以非限定性地包含细胞壁部分、细胞壁部分的提取物、膜部分、膜部分的提取物、细胞质部分、细胞质部分的提取物、细胞汁液(cell juice serum)和/或其组合。
本发明还涉及适合于哺乳动物局部应用的生物活性局部制剂。在一项实施方案中，该生物活性局部制剂包含局部有效量的本发明的生物活性组合物。该生物活性局部制剂可以进一步包含局部可接受的载体。
本发明还涉及在哺乳动物皮肤组织中抑制炎症活性的方法。该方法包括提供本发明的生物活性组合物。该方法进一步包括以抑制皮肤组织中炎症活性有效的量将该生物活性组合物应用于皮肤组织。
本发明还涉及保护哺乳动物皮肤组织避免紫外光诱发的损伤的方法。该方法包括提供本发明的生物活性组合物。该方法进一步包括以降低紫外光诱发的皮肤组织损伤以及防止对皮肤组织的氧化损伤有效的量将该生物活性组合物应用于皮肤组织。
本发明还涉及使哺乳动物的皮肤组织中皮肤病症正常化的方法。该方法包括提供本发明的生物活性组合物。该方法进一步包括以使皮肤组织中细胞病症正常化有效的量将该生物活性组合物应用于皮肤组织。
本发明还涉及分离来自茶科植物的细胞汁(cell juice)中的生物活性部分的方法。该方法包括提供茶科植物。然后将该茶科植物分离为细胞汁液和细胞壁组分。随后将细胞汁在有效获得生物活性部分的条件下进行处理。适合的生物活性部分非限定性地包括膜部分、膜部分的提取物、细胞质部分、细胞质部分的提取物和/或细胞汁液(cell juiceserum)。随后将该生物活性部分从所处理的细胞汁中分离。本发明进一步涉及按照该方法制备的分离的生物活性组合物。
本发明还涉及分离来自茶科植物的细胞壁组分中的生物活性部分的方法。该方法包括提供茶科植物。随后将该茶科植物分离成为细胞汁液和细胞壁组分。将细胞壁组分在有效获得生物活性部分的条件下处理。随后从处理过的细胞壁组分中分离生物活性部分。本发明进一步涉及按照此方法制备的分离的生物活性部分。
本发明用于弥补传统茶叶加工方法的缺陷，特别是传统茶叶加工方法不能保留广谱的有效生物活性成分。如本发明所提供，与传统茶叶加工的产品相比，对新鲜的山茶属生物质不经发酵和过度加热处理的加工方式可以获得更加强大且多样化的生物活性成分。
本发明还涉及饮料、治疗性饮料、功能性饮料等，其包含至少一种本发明的生物活性组合物。在一个实施方案中，所述饮料、治疗性饮料、功能性饮料等包含分散在液体中的至少一种本发明的生物活性组合物。在特定的实施方案中，所述液体选自水、小杯饮料(shot drink)、功能性饮料、绿茶、乌龙茶、红茶、白茶、调味茶、软饮料、咖啡、牛奶、奶昔、酒精饮料、无酒精饮料、运动饮料、果汁、蔬菜汁、人工增甜果汁、汽水、混合甜饮料、苹果酒和营养补充饮料。
本发明还涉及包含至少一种本发明的生物活性组合物的营养产品。
本发明还涉及包含至少一种本发明的生物活性组合物的功能性食品。
本发明还涉及将来自茶科植物的至少一种生物活性组合物分散于液体中以制备饮料的装置，所述装置包括：包含半透膜的过滤包或袋；以及装在该过滤包或袋中的至少一种本发明的生物活性组合物。在一项实施方案中，该液体选自水、小杯饮料、功能性饮料、绿茶、乌龙茶、红茶、白茶、调味茶、软饮料、咖啡、牛奶、奶昔、酒精饮料、无酒精饮料、运动饮料、果汁、蔬菜汁、人工增甜果汁、汽水、混合甜饮料、苹果酒和营养补充饮料。在特定的实施方案中，该饮料是治疗性饮料。
本发明还涉及制备饮料的方法，所述方法包括步骤：提供本发明所述的装置、将该装置与液体在有效将装置中的至少一种生物活性组合物分散于液体中的条件下接触，由此获得包含所述至少一种生物活性组合物的饮料。在一项实施方案中，将该装置与液体在有效引起所述至少一种生物活性组合物中的低分子量和还原的、非氧化的组分分散于液体中的条件下接触。在多项实施方案中，该液体选自水、小杯饮料、功能性饮料、绿茶、乌龙茶、红茶、白茶、调味茶、软饮料、咖啡、牛奶、奶昔、酒精饮料、无酒精饮料、运动饮料、果汁、蔬菜汁、人工增甜果汁、汽水、混合甜饮料、苹果酒和营养补充饮料。在特定的实施方案中，该饮料是治疗性饮料。
本发明还涉及用于来自茶科植物的至少一种生物活性组合物的全身或局部施用的制剂，所述制剂包括：包含至少一种本发明的生物活性组合物的溶液、混悬液、分散剂、糊剂或干燥粉末。在一项实施方案中，该制剂包括用于与液体混合而产生功能性饮料的干燥粉末。在另一项实施方案中，该制剂包括用于与液体混合而产生功能性饮料的至少一种生物活性组合物的浓缩溶液。
根据本发明的许多方面，本文所提供的生物活性组合物可以用于粉末、浓缩物，和/或作为在任何液体、凝胶、洗剂、食品等中的成分的液体形式，用于个体(包括但不限于人和动物)的任何口服、全身或局部应用。在特定的实施方案中，该生物活性部分可以与任何热的或冷却的饮料组合使用，包括鸡尾酒、无酒精饮料和本文所述或考虑到的任何其它液体。此外，在多项实施方案中，本发明的生物活性组合物可以与任何市售的饮料组合，包括但不限于基于茶的饮料、非基于茶的饮料、碳酸饮料、基于咖啡因的饮料、美容饮料、维生素水、小杯茶饮料(tea shots)、健康饮料、小杯饮料(shots)、运动饮料和本文所述或考虑到的任何其它液体。本发明的生物活性部分还可以用作用于改善个体(包括但不限于人和动物)皮肤、头发和指甲的补充剂。本发明的生物活性部分还可以用作营养品或其它膳食补充剂。
附图简述
图1是例证本发明的生物活性组合物的制备方法的一个实施方案的示意图。
图2是显示细胞壁部分的提取物与常规茶叶提取物(稀释度1:1000)的紫外/可见光谱图。
图3是显示山茶属生物活性组合物(稀释度1:4000)的紫外/可见光谱图。
图4是显示在测试基质(IMS Testing Group,Milford,Conn.)上应用的细胞壁部分的提取物和常规茶叶提取物的吸光度光谱图。干物质水平相同。
图5是显示在测试基质(IMS Testing Group,Milford,Conn.)上应用的山茶属生物活性组合物的吸光度光谱图。干物质水平相同。
图6是显示在测试基质(IMS Testing Group,Milford,Conn.)上应用的山茶属生物活性组合物和白茶提取物的吸光度光谱图。
图7A是显示在测试基质(IMS Testing Group,Milford,Conn.)上应用的以稀释溶液(1:200)的山茶属膜部分的提取物的吸光度光谱图。图7B是显示在测试基质(IMS Testing Group,Milford,Conn.)上应用的以稀释溶液(1:200)的山茶属细胞汁液的吸光度光谱图。
图8A是显示在测试基质(IMS Testing Group,Milford,Conn.)上应用的以稀释溶液(1:200)的大麦(Hordeum vulgare)的细胞汁液的吸光度光谱图。图8B是显示在测试基质(IMS Testing Group,Milford,Conn.)上应用的以稀释溶液(1:200)的鼠尾草(Salvia officinalis)的细胞汁液的吸光度光谱图。
图9是显示广谱紫外照射在测试基质(IMS Testing Group,Milford,Conn.)上的效果的图。
图10是显示在测试基质(IMS Testing Group,Milford,Conn.)上应用的白茶提取物的广谱紫外照射效果的图。
图11是显示在测试基质(IMS Testing Group,Milford,Conn.)上应用的细胞壁部分提取物的广谱紫外照射效果的图。
图12是显示在测试基质(IMS Testing Group,Milford,Conn.)上应用的山茶属膜部分的提取物的广谱紫外照射效果的图。
图13是显示在测试基质(IMS Testing Group,Milford,Conn.)上应用的山茶属细胞汁液的广谱紫外照射效果的图。
图14是显示白茶提取物对培养24小时和48小时的MDA-MB-435S细胞的效果的图。
图15是显示白茶提取物对培养24小时的MCF-7细胞(对照)和在5ng/ml TGF-β存在下培养24小时和48小时的MCF-7细胞的效果的图。
图16是显示细胞壁部分的提取物对培养24小时和48小时的MDA-MB-435S细胞的效果的图。
图17是显示细胞壁部分的提取物对培养24小时的MCF-7细胞(对照)和在5ng/mlTGF-β存在下培养24小时和48小时的MCF-7细胞的效果的图。
图18是显示膜部分的提取物对培养24小时和48小时的MDA-MB-435S细胞的效果的图。
图19是显示膜部分的提取物对培养24小时的MCF-7细胞(对照)和在5ng/ml TGF-β存在下培养24小时和48小时的MCF-7细胞的效果的图。
图20是显示细胞汁液对培养24小时和48小时的MDA-MB-435S细胞的效果的图。
图21是显示细胞汁液对培养24小时的MCF-7细胞(对照)和在5ng/ml TGF-β存在下培养24小时和48小时的MCF-7细胞的效果的图。
图22是显示白茶提取物对培养24小时和48小时的Mono Mac 6细胞的效果的图。
图23是显示白茶提取物对在10nM PMA存在下培养24小时和48小时的Mono Mac 6细胞的效果的图。
图24是显示细胞壁部分的提取物对培养24小时和48小时的Mono Mac 6细胞的效果的图。
图25是显示细胞壁部分的提取物对在10nM PMA存在下培养24小时和48小时的Mono Mac 6细胞的效果的图。
图26是显示膜部分的提取物对培养24小时和48小时的Mono Mac 6细胞的效果的图。
图27是显示膜部分的提取物对在10nM PMA存在下培养24小时和48小时的MonoMac 6细胞的效果的图。
图28是显示细胞汁液对培养24小时和48小时的Mono Mac 6细胞的效果的图。
图29是显示细胞汁液对在10nM PMA存在下培养24小时和48小时的Mono Mac 6细胞的效果的图。
图30是显示白茶提取物对PMA刺激的Mono Mac 6细胞所分泌的MMP水平的影响的图。
图31是显示细胞壁部分的提取物对PMA刺激的Mono Mac 6细胞所分泌的MMP水平的影响的图。
图32是显示膜部分的提取物对PMA刺激的Mono Mac 6细胞所分泌的MMP水平的影响的图。
图33是显示细胞汁液对PMA刺激的Mono Mac 6细胞所分泌的MMP水平的影响的图。
图34是Mono Mac 6细胞暴露于白茶提取物48小时后收集的培养基以及从不存在10nM PMA(U)或存在10nM PMA(S)、但不存在山茶属组合物的条件下培养的细胞所收集的培养基的凝胶酶谱。
图35是Mono Mac 6细胞暴露于细胞壁部分的提取物48小时后收集的培养基以及从不存在10nM PMA(U)或存在10nM PMA(S)、但不存在山茶属组合物的条件下培养的细胞所收集的培养基的凝胶酶谱。
图36是Mono Mac 6细胞暴露于膜部分的提取物48小时后收集的培养基以及从不存在10nM PMA(U)或存在10nM PMA(S)、但不存在山茶属组合物的条件下培养的细胞所收集的培养基的凝胶酶谱。
图37是Mono Mac 6细胞暴露于细胞汁液48小时后收集的培养基以及从不存在10nM PMA(U)或存在10nM PMA(S)、但不存在山茶属组合物的条件下培养的细胞所收集的培养基的凝胶酶谱。
图38是比较白茶提取物(“WTE”)和本发明的细胞壁部分提取物(“CWFE”)、膜部分提取物(“MFE”)和细胞汁液(“CJS”)中各种儿茶素类含量的柱状图。
图39是显示ELSD绝对信号强度相对于PurecentiaTM山茶、红茶和绿茶的传统制备物的保留时间的图。
图40是显示ELSD相对信号强度相对于PurecentiaTM山茶、红茶和绿茶的传统制备物的保留时间的图。
图41是PurecentiaTM山茶的LC-DAD三维色谱图。X轴：保留时间0～15min；Y轴：波长200～420nm；Z轴：强度0～3400。
图42是红茶传统制备物的LC-DAD三维色谱图。X轴：保留时间0～15min；Y轴：波长200～420nm；Z轴：强度0～580。
图43是绿茶传统制备物的LC-DAD三维色谱图。X轴：保留时间0～15min；Y轴：波长200～420nm；Z轴：强度0～580。
图44是显示PurecentiaTM山茶、红茶和绿茶的传统制备物相对于市售的茶基饮料的相对ORAC活性的柱状图。X轴是相对ORAC活性，以倍数表示，最低活性的检验物(饮料D)被视为1。
图45是显示在ORAC实验中评价的含有0.5％山茶的精华胶(serumgel)和不含山茶的精华胶基质的抗氧化剂活性的柱状图。这些制剂在进行评价之前在室温和45℃下保持2个月。以这些检验物的相对ORAC活性％呈现。
发明详述
本发明涉及生物活性组合物。在一项实施方案中，该生物活性组合物包含来自茶科植物的分离的生物活性部分。如本文所用，术语“分离的生物活性部分”含义是包括从未经任何传统茶叶加工(例如加热处理、氧化、发酵、干燥)的茶科植物(例如茶科植物的新鲜生物质)中分离的部分。适合的分离的生物活性部分包括但不限于细胞壁部分、细胞壁部分的提取物、膜部分、膜部分的提取物、细胞质部分、细胞质部分的提取物、细胞汁液，和/或其组合。
本发明的生物活性组合物和生物活性部分可以具有不同的儿茶素谱和总的儿茶素含量，如下文所定义，且使用本领域熟知的常规儿茶素诊断方法进行确定。如本文所用，术语“儿茶素”一般是指全部的儿茶素类，包括但不限于以下特定的儿茶素类型：(i)(-)-表没食子酸儿茶素(参见CAS编号970-74-1，其以其整体引入本文作为参考)；(ii)(+)-儿茶素(参见CAS编号7295-85-4，其以其整体引入本文作为参考)；(iii)(-)-表儿茶素(参见CAS编号490-46-0，其以其整体引入本文作为参考)；(iv)(-)-表没食子酸儿茶素没食子酸酯(参见CAS编号989-51-5，其以其整体引入本文作为参考)；(v)(-)-没食子儿茶酸没食子酸酯(参见CAS编号4233-96-9，其以其整体引入本文作为参考)；和(vi)(-)-表儿茶素没食子酸酯(参见CAS编号1257-08-5，其以其整体引入本文作为参考)。“总儿茶素含量”(如本文所用)是指包含于本发明的特定生物活性组合物或生物活性部分中的全部儿茶素类的合并的含量水平，并不意味着限定于上文所列出的儿茶素特定类型的含量水平。如本文所用，术语“儿茶素含量谱”是用以描述包含于本发明的特定生物活性组合物或生物活性部分中的所选择的儿茶素类的量。
在本发明的生物活性组合物的一项实施方案中，所述生物活性部分可以是细胞壁部分。
在本发明的生物活性组合物的一项实施方案中，所述生物活性部分可以是细胞壁部分的提取物。在本发明的特定的实施方案中，细胞壁部分的提取物可以包含每克干物质约2.1至约4.5毫克、特别是每克干物质约2.6至约4.0毫克、且更加特别是每克干物质约3.0至约3.6毫克总儿茶素含量。在另一项特定的实施方案中，细胞壁部分的提取物可以具有如下儿茶素含量谱：(i)每克细胞壁部分的提取物干物质约2.0至约3.0毫克(+)-儿茶素；(ii)每克细胞壁部分的提取物干物质约0.005至约0.02毫克(-)-表儿茶素；(iii)每克细胞壁部分的提取物干物质约0.005至约0.02毫克(-)-表没食子酸儿茶素没食子酸酯；且(iv)每克细胞壁部分的提取物干物质约0.003至约0.01毫克(-)-表儿茶素没食子酸酯。更加特别地是，该细胞壁部分的提取物可以具有如下儿茶素含量谱：(i)每克细胞壁部分的提取物干物质约2.2至约2.7毫克(+)-儿茶素；(ii)每克细胞壁部分的提取物干物质约0.01至约0.015毫克(-)-表儿茶素；(iii)每克细胞壁部分的提取物干物质约0.01至约0.015毫克(-)-表没食子酸儿茶素没食子酸酯；且(iv)每克细胞壁部分的提取物干物质约0.005至约0.007毫克(-)-表儿茶素没食子酸酯。
在本发明的生物活性组合物的一项实施方案中，所述生物活性部分可以是膜部分。
在本发明的生物活性组合物的一项实施方案中，所述生物活性部分可以是膜部分的提取物。在本发明的特定的实施方案中，膜部分的提取物可以包含每克干物质约15.0至约30.5毫克、特别是每克干物质约18.0至约27.5毫克、且更加特别是每克干物质约21.0至约24.5毫克总儿茶素含量。在另一项特定的实施方案中，膜部分的提取物可以具有如下儿茶素含量谱：(i)每克膜部分的提取物干物质约1.7至约3.3毫克(-)-表没食子酸儿茶素；(ii)每克膜部分的提取物干物质约6.1至约10.2毫克(+)-儿茶素；(iii)每克膜部分的提取物干物质约0.3至约1.1毫克(-)-表儿茶素；(iv)每克膜部分的提取物干物质约6.2至约12.5毫克(-)-表没食子酸儿茶素没食子酸酯；(v)每克膜部分的提取物干物质约0.007至约0.03毫克(-)-没食子儿茶酸没食子酸酯；且(vi)每克膜部分的提取物干物质约1.3至约3.3毫克(-)-表儿茶素没食子酸酯。更加特别地是，该膜部分的提取物可以具有如下儿茶素含量谱：(i)每克膜部分的提取物干物质约2.0至约3.0毫克(-)-表没食子酸儿茶素；(ii)每克膜部分的提取物干物质约7.0至约9.0毫克(+)-儿茶素；(iii)每克膜部分的提取物干物质约0.5至约0.9毫克(-)-表儿茶素；(iv)每克膜部分的提取物干物质约8.0至约10.0毫克(-)-表没食子酸儿茶素没食子酸酯；(v)每克膜部分的提取物干物质约0.01至约0.02毫克(-)-没食子儿茶酸没食子酸酯；且(vi)每克膜部分的提取物干物质约1.8至约2.8毫克(-)-表儿茶素没食子酸酯。
在本发明的生物活性组合物的一项实施方案中，所述生物活性部分可以是细胞质部分。
在本发明的生物活性组合物的一项实施方案中，所述生物活性部分可以是细胞质部分的提取物。
在本发明的生物活性组合物的一项实施方案中，所述生物活性部分可以是细胞汁液。在特定的实施方案中，所述细胞汁液可以包含每克干物质约8.0至约20.0毫克、特别是每克干物质约10.0至约18.0毫克、且更加特别是每克干物质约12.0至约16.0毫克总儿茶素含量。在另一项特定的实施方案中，细胞汁液可以具有如下儿茶素含量谱：(i)每克细胞汁液干物质约2.1至约4.4毫克(-)-表没食子酸儿茶素；(ii)每克细胞汁液干物质约4.2至约8.6毫克(+)-儿茶素；(iii)每克细胞汁液干物质约0.2至约2.0毫克(-)-表儿茶素；(iv)每克细胞汁液干物质约1.2至约3.2毫克(-)-表没食子酸儿茶素没食子酸酯；(v)每克细胞汁液干物质约0.01至约0.1毫克(-)-没食子儿茶酸没食子酸酯；且(vi)每克细胞汁液干物质约0.2至约1.3毫克(-)-表儿茶素没食子酸酯。更加特别地是，该细胞汁液可以具有如下儿茶素含量谱：(i)每克细胞汁液干物质约3.0至约3.5毫克(-)-表没食子酸儿茶素；(ii)每克细胞汁液干物质约5.0至约7.0毫克(+)-儿茶素；(iii)每克细胞汁液干物质约0.7至约1.5毫克(-)-表儿茶素；(iv)每克细胞汁液干物质约1.7至约2.7毫克(-)-表没食子酸儿茶素没食子酸酯；(v)每克细胞汁液干物质约0.03至约0.07毫克(-)-没食子儿茶酸没食子酸酯；且(vi)每克细胞汁液干物质约0.5至约1.0毫克(-)-表儿茶素没食子酸酯。
在一项实施方案中，茶科植物的新鲜生物质可以用于分离本发明的生物活性组合物。可以从山茶属和/或柃属的茶科植物获得该新鲜生物质。用于本发明的山茶属的适合的物种包括但不限于山茶(Camellia sinensis)、山茶(Camellia japonica)、滇山茶(Camellia reticulate)和茶梅(Camellia sasanqua)。用于本发明的柃属的适合的物种包括但不限于夏威夷柃(Eurya sandwicensis)。
本发明的生物活性组合物可以进一步包含稳定剂。适合的稳定剂是本领域所通常使用的那些。特别适合的稳定剂可以包括但不限于乳化剂、防腐剂、抗氧化剂、聚合物基质和/或其混合物。
在本发明的一个方面，该生物活性部分可以对至少一种哺乳动物细胞功能具有调节活性。该调解活性可以包括例如细胞生长抑制活性、细胞生长刺激活性、酶分泌活性、酶抑制活性、抗氧化剂活性、UV-保护活性、抗炎活性、伤口愈合活性和/或这些活性的组合。关于细胞生长抑制活性，该活性可以包括癌症细胞的生长抑制。能够被本发明的生物活性部分抑制生长的适合的癌症细胞可以包括但不限于乳腺癌细胞和/或结肠癌细胞。所述细胞生长抑制活性还可以包括白血病细胞的生长抑制。能够被本发明的生物活性部分抑制生长的适合的白血病细胞可以包括但不限于单核细胞性白血病细胞。
在另一项实施方案中，该生物活性组合物可以在抑制不期望的皮肤细胞增殖过度或增殖低下和/或抑制不期望的皮肤细胞中失调的酶活性或酶分泌过程中是有效的。
在另一项实施方案中，本发明的生物活性组合物可以进一步包括本领域所通常使用的全身或局部施用的递送系统。
本发明还涉及适合于哺乳动物局部应用的生物活性的局部制剂。在一项实施方案中，该生物活性局部制剂包含局部有效量的本发明的生物活性组合物。该生物活性局部制剂可以进一步包含局部可接受的载体。适合的局部可接受的载体可以包括但不限于亲水性霜基质、亲水性洗剂基质、亲水性表面活性剂基质、亲水性凝胶基质、亲水性溶液基质、疏水性霜基质、疏水性洗剂基质、疏水性表面活性剂基质、疏水性凝胶基质和/或疏水性溶液基质。在一项实施方案中，所述生物活性组合物可以以生物活性局部制剂总重的0.001％至约90％的量存在。
本发明还涉及在哺乳动物的皮肤组织中抑制炎症活性的方法。该方法包括提供本发明的生物活性组合物。该方法进一步包括以在皮肤组织中抑制炎症活性有效的量将该生物活性组合物应用于皮肤组织。在该方法的一项实施方案中，该生物活性组合物可以进一步包含稳定剂(其适合的实例如本文所述)。在该方法的另一项实施方案中，该生物活性组合物可以进一步包含局部可接受的载体(其适合的实例如本文所述)。
本发明还涉及保护哺乳动物皮肤组织避免紫外光诱导的损害的方法。该方法包括提供本发明的生物活性组合物。该方法进一步包括以减少皮肤组织紫外光诱导的损害并防止皮肤组织氧化损害的有效的量将该生物活性组合物应用于皮肤组织。在一项实施方案中，该方法是用于保护皮肤组织避免由约320至约400纳米范围的紫外光引发的紫外光诱导的损害。在该方法的另一项实施方案中，该生物活性组合物可以进一步包含稳定剂(其适合的实例如本文所述)。在该方法的另一项实施方案中，该生物活性组合物可以进一步包含局部可接受的载体(其适合的实例如本文所述)。
本发明还涉及在哺乳动物的皮肤组织中使皮肤病症正常化的方法。该方法包括提供本发明的生物活性组合物。该方法进一步包括以使皮肤组织中细胞病症正常化的有效量将该生物活性组合物应用于皮肤组织。在该方法的另一项实施方案中，该生物活性组合物可以进一步包含稳定剂(其适合的实例如本文所述)。在该方法的另一项实施方案中，该生物活性组合物可以进一步包含局部可接受的载体(其适合的实例如本文所述)。
本发明还涉及分离来自茶科植物的细胞汁中的生物活性部分的方法。该方法包括提供茶科植物(例如以新鲜生物质的形式)。用于该方法适合的茶科植物如上文所述。然后将该茶科植物(例如新鲜生物质)分离为细胞汁和细胞壁组分。随后将该细胞汁在有效获得生物活性部分的条件下处理。适合的生物活性部分包括但不限于膜部分、膜部分的提取物、细胞质部分、细胞质部分的提取物和/或细胞汁液。随后从该处理过的细胞汁中分离生物活性部分。在一项实施方案中，通过该方法产生的多种适合的生物活性部分如本文所述。本发明进一步涉及通过该方法产生的分离的生物活性组合物。
本发明还涉及分离来自茶科植物的细胞壁组分中生物活性部分的方法。该方法包括提供茶科植物(例如以新鲜生物质的形式)。用于该方法适合的茶科植物如上文所述。然后将该茶科植物(例如新鲜生物质)分离为细胞汁和细胞壁组分。将该细胞壁组分在有效获得生物活性部分的条件下处理。随后从该处理过的细胞壁组分中分离生物活性部分。在一项实施方案中，通过该方法产生的多种适合的生物活性部分如本文所述。本发明进一步涉及通过该方法产生的分离的生物活性组合物。
举例而言，制备本发明的生物活性部分(如上文所述)的总体过程如图1中所示意性地显示。加工步骤的细节在实施例(下文)中进一步描述。如图1中所述，将茶科植物的新鲜生物质10(例如新鲜植物生物质)进行研磨、浸软，并在有效破坏刚性细胞壁的条件下压制20，因此获得植物细胞汁30和细胞壁32。该新鲜生物质10还用于常规茶叶加工22，以制备用于对照试验和评价的阳性对照150。将细胞汁30经聚沉作用40(例如微波处理)实现新鲜植物生物质10的膜部分组分的定量聚沉。聚沉作用40足以使得聚沉的膜部分从细胞汁30的其它非聚沉组分中随后分离。如图1中所示，该分离的一项实施方案是通过冷却并离心42，得到膜部分(沉淀)50和上清液60(其不含特定的叶绿体膜组分，例如叶绿素和磷脂类)。
为了制备细胞壁部分的提取物(即组合物A 110)，将细胞壁32干燥34(例如若干随后的微波处理)，并随后将该干燥物质与水36在通常用于制备传统茶叶的条件下混合(于85℃下在水中混合)。
为了制备膜部分的提取物(即组合物B 120)，将膜部分50与溶剂52混合，并随后离心54，得到上清液56和组合物B 120。
为了制备细胞质部分的提取物(即组合物C 130)，将上清液60经聚沉作用62(例如等电沉淀)并离心64，得到包含绝大部分可溶性细胞质蛋白的细胞质部分(沉淀)70。随后将细胞质部分(沉淀)70与溶剂72混合，然后经离心74，得到上清液76及随后的组合物C 130。
为了制备细胞汁液(即组合物D 140)，将上清液60经聚沉作用62(例如等电沉淀)并离心64，得到细胞汁液(上清液)66及随后的组合物D 140。
新鲜生物质10的传统茶叶加工22是用于制备例如阳性对照150(多种茶，包括例如白茶、绿茶、乌龙茶和红茶)。
组合物A 110、组合物B 120、组合物C 130、组合物D 140和阳性对照150随后可用于过滤和检验80。
本发明还涉及用于选择性地将生物活性组合物的低分子量和还原的、非氧化的组分分散于液体中的装置。在一项实施方案中，该装置包含本发明的生物活性组合物。该生物活性组合物可以包装入过滤包中。适合的过滤包可以是选择性地将生物活性组合物的低分子量和还原的、非氧化的组分有效分散于液体中的过滤包。在一项实施方案中，该包包含了将该包中生物活性组合物的低分子量和还原的、非氧化的组分分散入液体的选择性膜，但该膜抑制高分子量和氧化的组分从该包中分散入液体。如本文所用，术语“低分子量和还原的、非氧化的组分”包含少于或等于约5,000道尔顿的本发明的生物活性组合物的组分。在该方法的一项实施方案中，该生物活性组合物可以进一步包含稳定剂(其适合的实例如本文所述)。在该方法的另一项实施方案中，该生物活性组合物可以进一步包含局部可接受的载体(其适合的实例如本文所述)。
本发明还涉及制备包含低分子量和还原的、非氧化的生物活性组合物的治疗性饮料的方法。该方法包括提供按照本发明方法制备的装置。将该装置与液体在有效引起生物活性组合物的低分子量和还原的、非氧化的组分分散入液体的条件下接触。在该方法的一项实施方案中，该生物活性组合物可以进一步包含稳定剂(其适合的实例如本文所述)。在该方法的另一项实施方案中，该生物活性组合物可以进一步包含局部可接受的载体(其适合的实例如本文所述)。用于该方法的适合的液体包括但不限于水。该水可以是热的或冷的。本发明进一步涉及按照该方法制备的治疗性饮料。
实施例
实施例1
来自山茶植物的生物活性组合物的制备
制备本发明生物活性组合物的方法的一项实施方案的概要如图1中所示。下文是本发明方法的一项实施方案中相关方面的描述。
生物质制备。采集足够量的新鲜山茶属(山茶)植物生物质(仅带芽的顶部幼嫩叶组织)，得到大约100kg干物质。在新鲜生物质中干物质的水平经计算为21.70％，需要采集大约461kg新鲜植物生物质以获得100kg干物质。要注意维持该植物生物质的固有水分含量，以避免由于水分流失造成的凋萎。以避免或者最小化切碎、捣碎和压碎所收集的生物质的方式进行采集，以避免叶细胞结构的破坏，其将触发由酚氧化酶和过氧化物酶催化的内源性酶促反应。由于这些反应将随氧化时间而加剧，因此全部步骤都在可能的最短时间内完成。例如，所采集的生物质在剪切后不超过10分钟交付加工。这样可以将植物生物质暴露于阳光、高温和其它不利环境因素的时间减到最低。在进一步加工前进行洗涤步骤，以除去植物中的土壤颗粒和其它碎屑。以≦1kg/cm2水压在≦5分钟内洗涤所采集的植物来完成该洗涤步骤。水洗涤的残余物不包含任何绿色或褐色色素，指示适合的水压和洗涤时间。从洗涤后的植物生物质中除去过量的水。
植物生物质的研磨、浸软和压制。采集后，收集并洗涤该植物生物质，随后将该植物研磨、浸软并压制以提取细胞内容物(即植物细胞汁)，并将其从富含纤维的细胞壁部分(细胞壁部分)分离。使用具有10HP发动机和一套过滤筛的锤式磨(Model VS 35,VincentCorporation,Fla.)研磨该生物质，以在最短的时间内和生物质温度未显著升高的情况下获得适当小尺寸的植物组织颗粒。调整该锤式磨以生产在≦10秒处理过程中最大尺寸≦0.5厘米的浸软后的植物颗粒。该生物质温度仅升高≦5℃。立即使用水平方向连续螺杆压榨机(Compact Press“CP-6”,Vincent Corporation,Fla.)以从植物中提取该植物细胞汁。该螺杆压榨机的椎体压力保持在24kg/cm2水平，螺杆速度12rpm，且温度仅升高≦5℃。该处理获得具有41.39％干物质水平的185kg细胞壁部分和具有8.49％干物质水平的276kg植物细胞汁。
细胞壁部分的提取物的制备(组合物A)。将具有41.39％初始干物质水平的细胞壁部分的等分试样在微波罩组合(Model GH9115XE,Whirlpool)中干燥30秒，并随后冷却30秒。重复该处理几次直至细胞壁部分的干物质水平达到96.52％。将66.01的温度85℃的去离子水加入4.0kg的干燥的细胞壁部分中，并强烈震荡5分钟。这些条件与茶叶制备方法一致，其描述于D'Amelio,F.S.,Botanicals.A Phytocosmetic Desk Reference,BocaRaton,London,New York,Washington,D.C.:CRC Press,p.361(1999)，其以其整体引入本文作为参考(还参见在www.leaftea.com；www.divinitea.com；www.equatorcoffee.com中的讨论，其以其整体引入本文作为参考)。将该混合物经4层尼龙织物过滤，并随后经具有0.8μm孔径的滤器过滤。所得细胞壁提取物的pH为5.24，且干物质水平为0.84％。该提取物进一步用于其活性检测。
从细胞汁中分离膜部分。具有8.49％干物质水平的初始的植物细胞汁包含细小的纤维颗粒，将其通过经四层尼龙织物过滤或者经使用低速离心生物质而除去。将该过滤后的细胞汁接受使用温度探针控制的微波处理。该处理持续直至细胞汁温度达到60℃。一旦引起聚沉作用，立即将所处理的细胞汁冷却至40℃。使用在高于或等于3,000g离心大于或等于20分钟，以完成从聚沉的细胞汁液中分离膜部分。获得膜部分(沉淀)和细胞汁上清液，其包含细胞质部分和细胞汁液部分(即低分子量的可溶性组分)。该具有32.89％干物质水平的膜部分用于制备来自膜的生物活性组合物的提取物。细胞汁上清液用于进一步处理以获得细胞质部分和细胞汁液。
膜部分的提取物的制备(组合物B)。将一份膜部分(10.0kg)和两份二甲基亚砜—(20.0kg)在室温下混合1小时，并持续搅拌。随后将该物质在高于或等于4,000g下离心大于或等于45分钟。弃去沉淀，并将上清经具有0.8μm孔径的滤器过滤。该滤液具有6.83％的干物质水平—膜部分的提取物(组合物B)用于其活性的进一步检测。
从细胞汁上清液中分离细胞质部分。为了分离细胞质部分，将该细胞汁上清液进行等电沉淀。使用滴定法用5.0N盐酸(HCl)将该细胞汁上清液的pH调至4.0，引发细胞质部分沉淀。通过在高于或等于3,000g下离心大于或等于20分钟，将具有14.5％干物质水平的沉淀的细胞质部分从上清中分离。
细胞质部分的提取物的制备(组合物C)。将一份细胞质部分(10.0kg)和两份二甲基亚砜—(20.0kg)在室温下混合1小时，并持续搅拌。随后将该物质在高于或等于4,000g下离心大于或等于45分钟。弃去沉淀，并将上清经具有0.8μm孔径的滤器过滤。该滤液具有3.50％的干物质水平—细胞质部分的提取物(组合物C)，可用于其活性的进一步检测。
细胞汁液的制备(组合物D)。分离细胞质部分后，该上清包含悬浮的颗粒。为了分离出这些颗粒，将该上清在高于或等于7,500g下离心大于或等于30分钟。将该透明上清—细胞汁液经具有0.8μm孔径的滤器过滤。该具有5.69％干物质水平的滤液(组合物D)用于其活性的进一步检测。
传统茶提取物制备—对照。将用于制备组合物A、B、C和D的相同批次的新鲜山茶属树叶用于制备传统白茶和红茶。
使用以下方法来制备白茶。将包含21.70％干物质的新鲜生物质在沸腾的水中放置20秒使内源性酶—酚氧化酶和过氧化物酶失活。在该过程中，将该树叶置于尼龙过滤袋中。然后，将该处理过的树叶在微波中干燥30秒，并随后冷却30秒。重复该处理数次直至在生物质中的干物质水平达到93.74％。随后将66.01的温度85℃的去离子水加入4.0kg的干燥树叶中，并高度震荡5分钟。这些条件与茶叶制备方法一致，其描述于D'Amelio,F.S.,Botanicals.A Phytocosmetic Desk Reference,Boca Raton,London,New York,Washington,D.C.:CRC Press,p.361(1999)，其以整体引入本文作为参考(参见www.leaftea.com；www.divinitea.com；www.equatorcoffee.com中的讨论，其以整体引入本文作为参考)。将该混合物经4层尼龙织物过滤，并随后经具有0.8μm孔径的滤器过滤。所得细胞壁部分的提取物的pH为5.52，且干物质水平为1.10％。该提取物进一步用于其活性检测。
使用以下方法来制备红茶。将该包含21.70％干物质水平的新鲜生物质保持在25℃，并周期性(1小时开启，1小时关闭)通风直至干物质水平达到35％。随后将该树叶研磨(粉碎)至具有2-3mm大小的颗粒。该方法导致生物质的温度升至大约30℃。将研磨后的生物质以分层(2″高)的形式放置于塑料传送带上于25℃下发酵(氧化)持续90分钟。将该发酵过的获得褐色颜色的生物质在130℃下干燥30分钟以达到97.5％的干物质水平。随后将66.0l的温度85℃的去离子水加入4.0kg的干燥树叶中，并高度震荡5分钟。这些条件与茶叶制备方法一致，其描述于D'Amelio,F.S.,Botanicals.A Phytocosmetic Desk Reference,BocaRaton,London,New York,Washington,D.C.:CRC Press,p.361(1999)，其以整体引入本文作为参考(还参见在www.leaftea.com；www.divinitea.com；www.equatorcoffee.com中的讨论，其以其整体引入本文作为参考)。将该混合物经4层尼龙织物过滤，并随后经具有0.8μm孔径的滤器过滤。所得细胞壁部分的提取物的pH为4.96，且干物质水平为1.38％。该提取物进一步用于其活性检测。
实施例2
关于制备来自山茶(Camellia sinensis)、山茶(Camellia japonica)、滇山茶(Camellia reticulate)、茶梅(Camellia sasanqua)和夏威夷柃(Eurya sandwicensis)的生物活性组合物的干物质分布
分析生物活性组合物制备过程中所收集的不同部分，并比较干物质分布。表1显示了茶植物分级分离产物中100kg干物质的分布。已经确定，本发明的方法使得提取产率转化为初始生物质干物质的约20-30％范围的植物细胞汁液。膜部分干物质的产率是初始生物质干物质的5％至10％和细胞汁干物质的25％至35％范围。表1显示细胞质部分干物质的产率不超过初始生物质干物质的1.0％及随后细胞汁上清液干物质的2.5％。大部分细胞汁上清液干物质浓缩于细胞汁液中。细胞壁部分、膜部分和细胞质部分用作制备其提取物的来源，其分类为生物活性组合物。所述细胞汁液直接以其原样用作不含外源性溶剂的后续生物活性组合物。
表1—新鲜生物质的分级分离产品中100kg干物质的分布
应当指出，三种所选物质是存在于新鲜植物组织中的全部功能结构的最多样化的代表。仅有可溶性细胞汁液具有允许向通常所用的体外试验系统直接施用的理化特性。细胞壁部分、膜部分和细胞质部分用作用溶剂提取的原料。由于细胞壁部分与传统茶植物产品在结构上类似，该部分用水提取提供了与传统茶叶的最佳比较。膜部分用二甲基亚砜提取，其便于有效溶解在叶绿体和线粒体结构中整合的亲水和疏水性组分。细胞质部分用水提取。细胞汁液以其原样使用。
表2显示全部四种检测的生物活性组合物的产率：来自100kg初始生物质干物质的细胞壁部分的提取物(组合物A)、膜部分的提取物(组合物B)、细胞质部分的提取物(组合物C)、细胞汁液(组合物D)和对照—白茶提取物或红茶提取物。
表2—来自100kg初始生物质的生物活性组合物的产率
表2显示来自100kg山茶干物质的生物活性组合物A、B、C和D的总产率等于33.3％，其非常显著地超过了传统茶叶加工的产率—15.14...19.36％。
实施例3
组合物A(细胞壁部分的提取物)与传统茶叶提取物的比较
检测从相同批次的新鲜山茶中获得的生物活性组合物A和传统白茶和红茶提取物的多个参数，且这些参数随后的结果如表3中所示(所用的试验方法如实施例9和20以及美国专利申请公开号2003/0175235中所述，其以其整体引入本文作为参考)。
表3—生物活性组合物A与白茶和红茶提取物的各种参数
表3显示，与传统白茶和红茶提取物相比，该细胞壁部分的提取物具有较低水平的干物质、电解质和溶解的固体。紫外/可见光光谱数据显示细胞壁部分的提取物具有最高的光谱曲线下面积的特定数值，即该特定的山茶属产品(组合物A)具有每单位干物质最高水平的光学活性组分。此外，该细胞壁部分的提取物具有较低量的氧化还原电位，说明该组合物比传统白茶和红茶提取物的氧化度低。该细胞壁部分的提取物证实具有过氧化物清除活性，导致在比白茶和红茶提取物更低的浓度下对细胞色素c还原的50％的抑制率(ICR50)。选择定量描述分析(“QDA”)试验方法基于颜色、香味和口感对茶叶进行系统性的鉴定和量化，其决定了茶饮料的可接受性。QDA方法雇用了训练过的一组专业品尝者对茶饮料相对于已定义的参考标准就上述属性进行定量。茶的颜色、香味和口感的对比评价证实，细胞壁部分的提取物显著超过了传统茶的这些特征。
因此，获自新鲜山茶属生物质的未经任何发酵(氧化)和加热处理的细胞壁部分与其它全部茶不同(Wilson等人编辑，Tea:Cultivation to Consumption,London:ChapmanHall(1992)，其以其整体引入本文作为参考)。此外，主要的山茶属酶(酚氧化酶和过氧化物酶)始终保留于传统茶叶内。相反，本发明包括将山茶属树叶分离为细胞壁部分和富含这些酶的细胞汁，因此细胞壁部分不包含内源性酚氧化酶和过氧化物酶。因此，细胞壁部分必须归类为具有与白茶、绿茶、乌龙茶和红茶根本上不同的新的茶类。该新的细胞壁部分茶可以用于松散或小包或其它形式以制备种类广泛的饮品、饮料，以及营养和功能性食品的添加物。
实施例4
用于不同应用的生物活性组合物制备
全部生物活性组合物都可以用作溶液、混悬液、分散液、糊剂或干燥粉末，整合到用于全身或局部施用的多种制剂中。组合物的溶解形式可以经具有0.2μm孔径的滤器过滤以完全去除未完全溶解的细小颗粒和内源性微生物。灭菌过滤前后的生物活性组合物中干物质水平如表4中所示。
表4—在灭菌过滤之前(分子)和之后(分母)的生物活性组合物中的干物质水平
表4显示在灭菌过滤后全部生物活性组合物中的干物质水平降低。但是该降低未导致其生物活性的任何损失或显著降低，且在2-14％范围内。因此，组合物的主要部分是以可溶性生物活性成分存在。
新鲜山茶属树叶包含相对低分子量(还原的，非氧化的)的成分。由于在生产传统茶叶中氧化和聚合作用，上述潜在成分转化为具有相对低活性的高分子量物质部分。
本发明的生物活性组合物是不经发酵(氧化)和过度热处理而获得。因此，这避免了新鲜植物活性的不可逆损失，其可以使用例如新茶叶包或类似的递送系统以最大效能进行递送。与传统的纸质茶叶包(其使得全部可溶性茶叶成分通过大的孔径移动至周围的水中)不同，该新茶叶包是用半透性膜制作。该包内部装有生物活性组合物，并且使得仅有低于某种膜截留值(例如5,000道尔顿)的分子量的成分透入周围水相中。具有较高分子量的成分保留在该包内，因此未包含于该饮料内。
因此，具有高于某一水平分子量的成分的截留能够制备不含氧化成分的饮料，因为具有高于某一水平分子量的生物活性组合物的全部氧化的成分保留于该包内。该新茶叶包设计可以是基于角锥状茶叶包构造，其使用透析膜管(dialysis membrane tube)。新茶叶包的设计还可以包含内部装有生物活性组合物的薄的塑料框架和两个用半透性膜构成的透明表面。具体的膜截留值的选择是通过生物活性组合物的类型而确定，但一般而言优选使更高百分比的组合物干物质释放进入周围水相和较低的氧化还原电位的较高截留。
实施例5
来自细胞汁液的局部成分SF的制备。
由于缺少稳定性且颜色和气味变差，细胞汁液(组合物D)无法用作局部产品的活性成分。所述方法使得对细胞汁液部分进行精制以获得稳定和活性的局部成分SF(该方法与之前在美国专利申请出版号2003/0175235中所述类似，其以其整体引入本文作为参考)。该细胞汁液的精制包含以下步骤：热处理、冷却、过滤并稳定化。精制是在如实施例1中所述从细胞质部分中分离细胞汁液之后立即进行。将该细胞汁液暴露于使用温度探针控制的微波处理中。继续该处理直至细胞汁液的温度达到99℃(需要90℃，如之前在美国专利申请出版号2003/0175235中所述，其以其整体引入本文作为参考)。一旦引起聚沉作用，将该处理过的细胞汁液立即冷却至10℃。将该聚沉的细胞汁液经具有0.8μm孔径的滤器真空过滤(使用如美国专利申请出版号2003/0175235中所用的双层Whatman 2号滤材，其以其整体引入本文作为参考)。弃去沉淀，并将所得细胞汁液滤液用于进一步加工(即，稳定化)。通过加入防腐剂来完成细胞汁液滤液的稳定化(不需要外源性抗氧化剂，如以前如美国专利申请出版号2003/0175235中所述，其以其整体引入本文作为参考)，并孵育该混合物直至实现完全溶解。所用的防腐剂包括如下：0.1％山梨酸钾、0.1％苯甲酸钠、0.1％尼泊金甲酯钠和0.1％柠檬酸。该制备方法使得产生16.3kg干物质产率(或大约286升)的局部成分SF，其用于其理化性质和生物活性特性的鉴定。用于局部成分SF的推荐储存条件包括在密闭容器中于15℃-25℃之间的温度下避光储存。
实施例6
来自细胞汁液部分的局部成分SF的产品说明
按照如上文实施例5中所述的方法制备局部成分SF。对局部成分SF进行分析以确定其多种物理化学、微生物、细胞毒性和生物活性特征，如下文所述。局部成分SF是澄清液体，其具有浅黄褐色颜色和淡的特征性气味。载体介质中不加入溶剂(即乙二醇、油或水)。表5总结了局部成分SF的物理和化学数据。
表5—局部成分SF的物理和化学参数
文献：[1]Handbook of Chemistry and Physics，80th Edition，CRC Press，1999-2000，5-90；[2]Handbook of Chemistry and Physics，80th Edition，CRC Press，1999-2000，8-21，其整体引入本文作为参考。
表6描述了局部成分SF相关的UV光谱数据。
表6—局部成分SF(1:500稀释)的紫外光谱
按照以下方法(USP<61>)进行的微生物分析证实局部成分SF包含每克样品少于100个的菌落形成单位且无病原体(大肠杆菌、白色假丝酵母、假单胞菌属物种和金黄色葡萄球菌)。该数据证实局部成分SF满足了用于局部产品成分的工业要求。
经测定，当在15-25℃之间的温度下在避光的密闭容器中储存时局部成分SF在至少12-18个月内是稳定的(即保持物理和化学完整性)。局部成分SF是可生物降解的产品。在对照的临床评价中，已证实了局部成分的生物活性，其在表7中总结。
表7—局部成分SF的生物活性
文献：[1]Cannel等人，Planta Mdeica 54:10-14(1988)，其整体引入本文作为参考。
表7显示，证实了局部成分SF的过氧化物清除能力。在对照的临床评价中，证实了局部成分SF具有在每ml 69.5μg干物质浓度下的细胞色素c还原的50％抑制率(ICR50)。阳性对照(迷迭香酸)的ICR50＝26.5μg/ml。除了抗氧化剂特性以外，还证实局部成分SF对抗肽水解酶(例如弹性蛋白酶、明胶酶B或所谓的基质金属蛋白酶9(MMP-9)和胰蛋白酶)的抗蛋白水解活性。在这些酶中，唯一的位置属于弹性蛋白酶和MMP-9，其在皮肤炎症中协同性地作用并发挥非常重要的作用。应当注意地是，MMP-9和弹性蛋白酶均由白细胞(中性粒细胞)分泌，并且这些酶是在导致炎症的最终通路中的关键酶。一般认为，如果该制剂能够同时抑制两种酶(弹性蛋白酶和MMP-9)，那么就确定该制剂对治疗炎症过程非常有效。
应当注意地是，皮肤衰老过程、晒伤、外伤和疤痕形成具有非常相同的炎症机理，其同时涉及MMP-9和弹性蛋白酶。因此，能够同时抑制两种上述酶类的局部成分SF具有非常广泛的应用，其中是炎症损伤的是由于以下原因：
a.这两种酶能够协同降解人体组织中细胞外基质的全部组分；
b.弹性蛋白酶可以使得身体对抗MMP-9的自身抑制性防护失活；且
c.MMP-9可以使得身体对抗弹性蛋白酶的自身抑制性防护失活。
局部成分SF的抗炎症和抗氧化剂特性的组合提示了基于生物活性组合物D的亲水性制剂能够全身性地作用于非常基础的皮肤病症问题。
实施例7
来自膜部分的局部成分MF的制备
新鲜获得的膜部分是具有深色颜色和特定气味的糊剂。该部分主要由叶绿体及其主要包含磷脂类、膜蛋白质类、叶绿素和类胡萝卜素的组合物来代表。对膜部分的干燥导致作为局部成分的膜部分研究所需要的许多有价值的特性的不可逆的损失。不干燥的情况下，该不稳定的膜部分迅速转化为具有强烈和非特征性气味的暗色的不可分散的不可溶密集物。作为结果，该物质无法用作局部成分。下文所述的方法使得新鲜获得的膜部分转化为稳定且有活性的局部成分(该方法与以前在美国专利申请出版号2003/0175235中所述方法类似，其以其整体引入本文作为参考)。
按照如实施例1中所述方法从细胞汁中分离膜部分后立即将该膜部分稳定化，并混入聚合物基质中。为制备大约100克局部成分MF，将细胞膜部分通过将其与非离子型乳化剂聚山梨酯80(Tween 80)和抗氧化剂(Tenox 4)混合来稳定化。具体而言，将20克新鲜膜部分与3.5克Tween 80和0.1克Tenox 4(丁羟茴醚和丁羟甲苯在油中的溶液)剧烈混合直至均质，在搅拌过程中避免通气。
稳定化后，将该膜部分混入聚合物基质(即聚合物乳化剂、丙烯酸酯/C10-C30丙烯酸酯交联聚合物)中。通过将0.9克Pemulen TR-2分散于69.2克温热的去离子水中并使用适度振荡混合直至均匀(期间避免通风)来制备该聚合物基质。在平行试验中，将5克甘油和1.0克Phenonip(苯氧乙醇(和)羟苯甲酯(和)羟苯丁酯(和)羟苯乙酯(和)羟苯丙酯的混合物)在独立的瓶中合并并混合至均匀。在适度振荡下，将包含Pemulen和甘油的各相与Phenonip合并并混合直至均匀。为将该膜部分引入该聚合物基质中，将包含膜部分、Tween80和Tenox 4的相加入包含Pemulen、甘油和Phenonip的相中，并随后在剧烈振荡下混合，期间避免通气。膜部分混合物的稳定化是通过用18％氢氧化钠(NaOH)水溶液中和并剧烈混合以产生具有5.0±0.4的pH的均一系统来完成。该制备方法，其从100kg新鲜山茶属生物质(大约461kg具有21.7％干物质的新鲜树叶)开始，产生局部成分MF的11.85kg的干物质产率(或大约172升)，其用于其物理化学和生物活性特性的鉴定。局部成分MF的推荐储存条件包括在2-8℃之间的温度下储存于避光的密闭容器中。
实施例8
来自膜部分的局部成分MF的产品说明
按照如上文实施例7中所述的方法制备局部成分MF。对局部成分SF进行分析以确定其多种物理化学、微生物、细胞毒性和生物活性特征，如下文所述。局部成分MF是不透明的凝胶，其具有绿褐色颜色和淡的特征性气味。使用天然细胞汁液组分与聚合物凝胶化来配制局部成分MF，以确保最高水平的纯度均匀度、相容性、稳定性、安全性和效能。
表8总结了局部成分MF的物理和化学数据。
表8-局部成分MF的物理和化学参数
参数 方法 结果
非挥发性残余物(NVR)，％ 参见实施例20，“方法2” 6.9
比重，g/cm3 USP<841> 1.035
粘度，cps USP<911> 18,700
pH USP<791> 4.6
总类胡萝卜素，％NVR 参见实施例20，“方法4” 0.36
叶黄素，％NVR 参见实施例20，“方法4” 0.34
表9总结了关于局部成分MF的L＊a＊b＊值。
参数 方法 结果
L* 参见实施例20，“方法3” 30.27
a* -”- 27.36
b* -”- 42.56
微生物分析证实局部成分MF满足了局部产品成分关于CFU和不含病原体(USP<61>)的工业要求。
经测定，当在2-8℃之间的温度下在避光的密闭容器中储存时局部成分MF在至少12-18个月内是稳定的(即保持物理和化学完整性)。局部成分MF是可生物降解的产品。在对照的临床评价中，已证实了局部成分MF的弹性蛋白酶抑制活性和胰蛋白酶抑制活性。表10总结了局部成分MF的某些生物活性结果。
表10
活性 方法 IC50(μg/ml)
弹性蛋白酶抑制(IC50) 参见实施例20，“方法5” 12.3
MMP-9抑制(IC50) 参见实施例20，“方法6” 5.6
胰蛋白酶抑制(IC50) 参见文献【1】 3.8
文献：[1]Cannel等人，Planta Mdeica 54：10-14(1988)，其整体引入本文作为参考。
表10显示局部成分MF已证实具有与局部成分SF(参见实施例6)类似的特性。尽管局部成分MF不具有过氧化物清除活性，但是已证实其比局部成分SF具有更高的特异性酶抑制活性。因此，基于生物活性组合物B的局部成分MF应当被认为是广泛应用于皮肤病症治疗的有效的多相抗炎成分。
实施例9
来自山茶植物的生物活性组合物的光谱分析
光谱分析介绍。紫外线(UV)辐射对人类皮肤具有损害作用。短期影响包括晒黑和晒伤，而累积的UV暴露的长期影响包括皮肤光老化和增加的罹患皮肤癌的风险。紫外线皮肤损害是由氧化损害所介导，许多具有抗氧化剂活性的植物提取物都显示出作为保护剂的前景：葡萄籽提取物(Carini等人，“Protective Effect of Procyanidines from Vitisvinifera Seeds on UV-Induced Photodamage：In vitro and In vivo Studies，”Proceedings of the 19th IFSCC Congress 3：55-63(1996)，其以其整体引入本文作为参考)、番茄红素(Di Mascio等人,“Lycopene as the Most Efficient BiologicalCarotenoid Singlet Oxygen Quencher,”Archives of Biochemistry and Biophysics274:532-8(1989)；和Ribaya-Mercado等人,“Skin Lycopene is DestroyedPreferentially Overβ-Carotene During Ultraviolet Irradiation in Humans,”Journal of Nutrition 125:1854-9(1995)，其以其整体引入本文作为参考)、水飞蓟素(Morazzoni等人,“Silybum marianum(Carduus marianus),”Fitoterapia 66:3-42(1995)；Katiyar等人,“Protective Effects of Silymarin AgainstPhotocarcinogenesis in a Mouse Skin Model,”Journal of the National CancerInstitute 89:556-66(1997)，其以其整体引入本文作为参考)，以及特别是与产自其它植物来源的提取物相比具有更高效能的绿茶提取物(Katiyar等人,“Protection AgainstUltraviolet-B Radiation-Induced Local and Systemic Suppression of ContactHypersensitivity and Edema Responses in C3H/HeN Mice by Green TeaPolyphenols,”Photochemistry and Photobiology 62:855-61(1995)；Ruch等人,“Prevention of Cytotoxicity and Inhibition of Intercellular Communication byAntioxidant Catechins Isolated from Chinese Green Tea,”Carcinogenesis 10:1003-8(1989)；Wang等人,“Protection Against Ultraviolet B Radiation-InducedPhotocarcinogenesis in Hairless Mice by Green Tea Polyphenols,”Carcinogenesis12:1527-30(1991)，其以其整体引入本文作为参考)。
已经发现，茶植物(山茶)的树叶具有高含量的具有抗氧化剂活性的多酚类，包括(-)-表儿茶素、(-)-表儿茶素-3-没食子酸酯、(-)-表没食子酸儿茶素和(-)表没食子酸儿茶素-3-没食子酸酯。已经显示，绿茶提取物具有对抗过氧化氢和超氧化物自由基的抗氧化剂活性并防止氧化性细胞毒性。该提取物还能防止细胞间通讯的抑制，其是肿瘤发生的一种可能机制。在UV-诱导的免疫抑制和皮肤癌发生之间具有紧密的联系，且已经发现绿茶提取物能够保护避免由UV-B辐射引起的炎症和免疫抑制。在动物模型中，经在饮用水中口服提供或者局部应用的绿茶提取物能够保护避免UV-B-诱导的皮肤癌症形成。这些结果表明口服绿茶提取物能够有助于预防皮肤癌。
尽管山茶属产品的UV保护特性已经确定，但是由于常规技术的局限，作为避免日光伤害的有效的皮肤保护来源的茶植物的更大潜力未被充分研究，常规技术导致集中限定于相对窄范围的活性成分：主要是儿茶酚类。
本文所述的“新的”和“传统”山茶属产品之间的对比性UV保护特性研究目前已经证实，“新鲜山茶属分级分离法”的技术能够获得更加有效的产品。通过使用通常用以测定溶液光谱特性的方法以及体外日光防护系数(SPF)来进行比较。
方法学A:紫外/可见光光谱。使用药典标准的分光光度计Ultrospec4300Pro(Amersham Biosciences公司,白金汉郡,英国)获得山茶属产品在200-450nm区域的紫外/可见光光谱。按照如USP<197>中所述的方法测定山茶属产品在蒸馏水中稀释后的光谱参数。
方法学B:吸光度光谱。在250-450nm区域的山茶属产品的吸收度光谱的获得是使用UV-1000S透光度分析仪(Labsphere,Inc.,North Sutton,N.H.)和检测基质(IMS Testing Group,Milford,Conn.)，其模拟人皮肤的表面特性。其同时具有最佳化的蛋白质和脂质组分，并且设计具有与人皮肤类似的拓扑学、pH、关键性的表面张力和离子强度。
将山茶属样品均匀地覆盖于预先脱水的基质表面(应用量＝2.0μl/平方厘米)。应用后15分钟后，经五次(5)重复获得起始吸光度光谱。随后将应用了产品的基质用装有300瓦氙灯的广谱日光模拟器(Model 16S-300Single Port,Solar Light Company,Inc.,Philadelphia,Pa.)照射。剂量控制系统PMA 2100-DCS允许向样品递送剂量的精确控制。
照射(照射量＝60焦耳/平方厘米)后立即进行五次(5)重复测定相同位置的吸光度光谱。照射前后样品的吸光度光谱用于统计学分析。
样品。对下述按照上文实施例1中所述方法制备的生物活性组合物进行评价：组合物A(包含0.84％干物质的细胞壁部分的提取物)、组合物B(包含6.83％干物质的膜部分的提取物)、组合物D(包含5.69％干物质的细胞汁液)。包含1.10％干物质的常规白茶提取物和包含1.38％干物质的常规红茶提取物用作对照。全部样品都获自在Charleston TeaPlantation,SC采集的同一批次的新鲜山茶属。这些样品不包含任何添加物。
分析。已经发现全部山茶属样品都具有高的UV吸光度值，并因此将其用蒸馏水稀释。稀释过的山茶属产品的UV-VIS光谱如图2和3中所示。
全部液体样品的光谱具有某些相似性。例如，峰的位置在相对狭窄的λmax1＝269-274nm和λmax2＝205-208nm范围内变化，其说明在全部检测样品中芳香环和σ-π键共轭系统的存在。但是，各峰的峰值、各峰下面积和积分光谱曲线下总面积是不同的(表11)，其提示了检测样品具有不同的光学活性组分的组合物。
表11—山茶属产品的紫外/可见光谱的参数
＊根据样品的稀释度对光谱曲线下面积进行标准化。
从200nm至450nm获得的积分光谱曲线下面积的对比清楚地证实膜部分的提取物(组合物B)和细胞汁液(组合物D)具有更高的吸光度值(表11)。“光谱下面积:干物质”比率指示样品的特定吸光度值按照以下次序升高：红茶提取物>白茶提取物>细胞壁部分的提取物>细胞汁液>膜部分的提取物(表12)。
表12—山茶属产品的所选择的光谱特征
基于吸光度值的比较，新的生物活性组合物显示是比传统白茶和红茶提取物更加有效的对抗日光损害的皮肤保护剂。应当指出，使用涉及290nm至400nm区域的吸光度数据能够较好地评估山茶属产品的UV保护特性，因为该特定光谱区域导致UV诱发的皮肤损害(Sayre等人,“A Method for the Determination of UVA Protection for NormalSkin,”Journal of American Academy of Dermatology 23:429-40(1990)，其以其整体引入本文作为参考)。尽管检测的液体样品在290-400nm区域的吸光度仅占总紫外/可见光吸光度的～10％，新的山茶属组合物在上述光谱区域具有较高的吸光度。
因此，与山茶属样品稀释后溶液有关的数据提供了检测产品的UV保护效能的初始评估，其使用检测基质(IMS Testing Group,Milford,Conn.)做进一步评价。结果如图4-13中所示。已经发现，新的山茶属组合物和传统白茶和红茶提取物即使在其以不同浓度(干物质水平一致)应用于基质后仍具有不同的光谱特征(图4和5)。
应用在检测基质(IMS Testing Group,Milford,Conn.)上的山茶属样品的光谱包含四个至两个特征峰，其具有不同的峰值(表13)。
表13—在检测基质上应用的山茶属产品的吸光度光谱的参数
应当指出，在溶液中的山茶属产品的特征峰参数(表11)与应用于检测基质(IMS Testing Group,Milford,Conn.)的山茶属产品的特征性峰参数(表13)相比非常不同。如对照试验所示，在表面的较低的pH水平(～5.5)不能负责上述差异，这可能是山茶属产品和用于制备检测基质(IMS Testing Group,Milford,Conn.)的成分之间化学相互作用的结果。因此，同时包含蛋白质和脂质组分的检测基质(IMS Testing Group,Milford,Conn.)可能与山茶属酚类组分发生化学上的相互作用。应当注意，全部生物活性组合物以及传统茶叶提取物都观察到检测产品的光谱特性的变化。
还对新的山茶属组合物和传统山茶属产品的光谱进行比较，把检测样品的不同干物质含量也考虑进去。以相等体积应用于检测基质(IMS Testing Group,Milford,Conn.)的山茶属产品的吸光度光谱如图6所示。
尽管细胞壁部分的提取物和白茶提取物之间具有某些相似性，但是第一种产品在250-280nm和近UV区域具有更高的吸光度。应当注意，更高的吸光度不与干物质水平相对应，与细胞壁部分的提取物(0.84％)相比，在白茶提取物(1.10％)中干物质水平更高。这提示了这两种样品的组成是不同的，且细胞壁部分的提取物还具有更低的导电率，其包含具有高吸光度的更多非解离的光学活性成分(如表3中数据所示)。
此外，已经发现膜部分的提取物(组合物B)和细胞汁液(组合物D)的光谱与细胞壁部分的提取物(组合物A)和白茶提取物的光谱不同。因此，膜部分的提取物和细胞汁液的光谱再次说明这些产品具有比白茶提取物和细胞壁部分的提取物不同的组成。同时，该光谱数据提示膜部分的提取物和细胞汁液的组成是不同的。例如，膜部分的提取物具有在260nm、286nm和394nm的三个特征峰。细胞汁液光谱包含在260nm和286nm的两个峰。
这两个光谱的对比说明膜部分的提取物具有比细胞汁液高大约两倍的消光率(extinction)，但干物质水平的差异仅～1％。因此，四种检测的山茶属产品含有显著不同的在250-450nm区域是光学活性的组分的组合物。
与山茶属产品的定量比较有关的数据如表14中所示。
表14—在检测基质上应用的山茶属产品的所选择的参数
表14显示在250-450nm区域和290-400nm区域样品的吸光度按照以下次序升高：白茶提取物>细胞壁部分的提取物>细胞汁液>膜部分的提取物。该次序与在稀释溶液中检测的山茶属产品的特定吸光度值的次序完全一致。当检测样品应用于检测基质(IMS Testing Group,Milford,Conn.)时，在250-400nm区域的吸光度对250-450nm光谱吸光度的贡献达到～55-60％。
应当注意，在稀释的溶液中新的山茶属组合物与其应用于检测基质(IMS Testing Group,Milford,Conn.)后的光谱显著不同。对于膜部分的提取物和细胞汁液而言这些差异既是定量又是定性的。因此，在溶液中膜部分的提取物在250nm至450nm范围的峰在274nm。当应用于检测基质(IMS Testing Group,Milford,Conn.)时，相同的膜部分的提取物在上述波长未显示任何特征峰，而是在260nm和286nm具有两个特征峰(图7A)。
在细胞汁液中观察到在光谱性质中近似的图案，尽管应用于检测基质(IMS Testing Group,Milford,Conn.)的样品中检测出在～360nm的另外的吸光度，但是该现象在相同组合物的溶液中的紫外/可见光光谱中没有记录(图7B)。
应当指出，上述光谱之间的差异可能是新的山茶属组合物和包含蛋白质和脂质组分的检测基质(IMS Testing Group,Milford,Conn.)的表面(其模拟人皮肤)之间化学相互作用的结果。这些相互作用导致造成UV照射损害作用的光谱区域中的吸光度剧烈升高，即新的山茶属组合物具有显著的UV保护效能。用大麦(Hordeum vulgare)(图8A)和鼠尾草(Salvia officinalis)(图8B)的细胞汁液的对照试验显示，在溶液中和将其应用于检测基质(IMS Testing Group,Milford,Conn.)后的相同样品的光谱差异在除山茶属之外的其它植物来源中未观察到。因此，在应用于检测基质(IMS Testing Group,Milford,Conn.)后的山茶属产品中的光谱变化说明该特定的相互作用仅在新的山茶属产品与模拟人皮肤的基质之间发生。
用预先水化的基质的对照试验证实照射后检测基质(IMSTesting Group,Milford,Conn.)的吸光度、特别是在260-330nm范围内显著降低(图9)。该作用反映出经高剂量广谱日光照射的未受保护的基质的相对低的光照稳定性。
对应用白茶提取物的基质的照射引发了吸光度光谱中的变化(图10)，其与未受保护的检测基质(IMS Testing Group,Milford,Conn.)的光谱变化类似。当消除基质的影响时，未照射和照射过的样品的光谱指示某些相似性，但是不能证实具有完全一致的表现。例如，在290-310nm范围的吸光度降低而且在360nm的宽峰开始形成。
对细胞壁部分的提取物的照射(图11)导致吸光度光谱、特别是在消除(扣除)基质影响后所得到的曲线的类似变化。
尽管白茶提取物和细胞壁部分的提取物的组成不同，其光谱中由照射引起的改变模式是非常近似的。应当注意，白茶和细胞壁部分的提取物都不能完全保护基质避免照射的破坏性作用，因此，检测基质(IMS Testing Group,Milford,Conn.)的吸光度与该基质完全不被保护时的情况下降低程度几乎一样(图9)。这在250nm-330nm范围尤其明显，但在更长的波长观察到吸光度的某些升高。
对膜部分的提取物的照射对其吸光度光谱产生非常不同的影响(图12)。例如，照射在250-285nm光谱范围未引起任何改变。如所讨论，该光谱的特定范围受到被照射过的检测基质(IMS Testing Group,Milford,Conn.)的破坏的显著影响，并且因此对光谱的对比提示了基质的破坏完全被存在于其表面的膜部分的提取物阻止。
然而，记录到在膜部分的提取物光谱中的某些变化。例如，在290-320nm范围的吸光度轻微降低，且伴随在较长波长下吸光度的细微升高。应当特别指出，已经证实膜部分的提取物对于在260nm和280nm具有特征峰的核酸和芳香氨基酸的光谱范围内非常有效。因此，膜部分的提取物的作用使得该产品用于局部应用的保护性UV保护成分。
照射后，证实细胞汁液部分在其吸光度光谱中的某些改变(图13)。
一般而言，这些改变可以描述为在250-340nm范围内吸光度的轻微降低和在340-450nm范围内吸光度的轻微降低。应当注意，消除由检测基质(IMS TestingGroup,Milford,Conn.)的光破坏所提供的可能影响(参见未经照射的细胞汁液部分的初始光谱上方光谱的红色曲线)清楚地表明基质被在其表面应用的细胞汁液部分有效地保护。
观察及结论。上述结果清楚地显示最佳传统山茶属产品—白茶提取物—提供了对抗UV照射的破坏作用相对弱的保护作用。细胞壁部分的提取物证实具有与白茶提取物类似的特性，但是膜部分的提取物和细胞汁液具有更加有效的UV保护特性。
发现山茶属产品的UV保护特性按照如下次序升高：白茶提取物＝细胞壁部分的提取物>细胞汁液>膜部分的提取物。
应当注意，山茶属产品的光谱特性和UV照射后这些特性变化的图形为白茶提取物(对照)、细胞壁部分的提取物、膜部分的提取物和细胞汁液中组分的组成都不相同和表现出的独特活性提供了有力的证据。这是关于新的山茶属组合物的特别益处，其中上文所述的UV活性不能因为其存在于白茶提取物而归功于多酚类。
实施例10
山茶属产品的对比评价：概述
实施例10至19描述了与试验相关的方法、结果和分析，所述试验是用于评价与由来自本发明的山茶的生物活性组合物调节细胞功能相关的生物活性范围。首要目的是评价获自本发明方法的产品的生物活性范围，并且与通过常规(传统)茶叶技术所获得的最佳产品(白茶提取物，其作为阳性对照进行研究并与以下本发明的生物活性组合物比较)进行活性比较：(1)新鲜树叶的细胞壁部分的提取物(组合物A，如本文所述)；(2)膜部分的提取物(组合物B，如本文所述)；和(3)细胞汁液(组合物D，如本文所述)。
进行评价这些山茶属生物活性组合物对三种人细胞系生长模式的影响的试验：具有单核细胞性白血病特征的髓细胞系(Mono Mac 6)以及两种具有体内恶性肿瘤早期阶段特征的乳腺癌细胞系(MCF-7)和具有晚期癌特征的更加高侵袭性、转移性和雌激素不敏感的细胞系(MDA-MB-435S)。
已经发现，传统的白茶提取物证实具有对一些肿瘤细胞代谢活性的某种抑制性作用。但是，该抑制的程度对检测细胞的全部类型而言不显著，并且即使检测到该抑制作用，其通常不是完全的而是微弱或中度的。细胞壁部分的提取物证实具有与白茶提取物类似的那些特性。
值得注意地是，两种细胞汁衍生物(膜部分的提取物和细胞汁液)对于在存在或不存在不同刺激物下培养的全部检测细胞系都是更有效的代谢功能的抑制剂。例如，膜部分的提取物清楚地证实了更高的抑制效能，且其作用能够在0.001％剂量下可靠地检测。细胞汁液证实了复杂的响应：较低剂量下刺激和高剂量下抑制。
应当注意，并非诱导坏死性细胞溶解，膜部分的提取物和细胞汁液表现出开启了肿瘤细胞中的程序性细胞死亡或凋亡细胞死亡的通路。该试验数据指示该通路归因于线粒体功能丧失，并且可能需要接触24-48小时来检测。
作为与生物活性组合物接触的后果，全部检测的肿瘤细胞系(MCF-7，人乳腺癌早期模型；MDA-MB-435S，乳腺癌晚期模型；和Mono Mac 6，单核细胞性白血病模型)的代谢功能被膜部分的提取物最有效地抑制，抑制效力较差且更具选择性的是细胞汁液。值得注意地是，白茶提取物和细胞壁部分的提取物证实是无活性的或者比上述组合物B和D的活性低很多。该趋势在不同条件下检测的细胞中已经清楚地证实，所述条件是指：在不存在或存在转化生长因子情况下的MCF-7细胞、MDA-MB-435S细胞以及刺激和未被刺激的单核细胞MonoMac 6细胞。
这些结果提供了本发明方法显著提升山茶属植物效能并产生证实具有活性的令人印象深刻的新产品能力的有力证据，所述活性即使是在传统茶叶技术的最佳产品中也未确认过。
本发明的山茶属部分对细胞介导的蛋白水解活性的作用对炎症组织损伤以及肿瘤侵袭和转移都具有意义。因此，乳腺癌细胞和白血病细胞可以清楚地建议作为本发明生物活性组合物的预期靶点，最值得注意的是膜部分的提取物。应当注意，之前已经显示结肠癌来源的细胞系COLO 205释放显著水平的MMP-2，其随后被也由该细胞分泌的类胰蛋白酶活化。基于Mono Mac 6细胞的结果，这也是本发明山茶属组分的潜在靶点之一。
通过这些研究得出结论，从新鲜山茶属中分离的本发明的生物活性组合物具有令人印象深刻的导致调节关键细胞功能的活性。已经观察到的作用可以在从个人护理产品到营养制品和潜在药物的范围内具有有价值的应用。
还应当注意，本发明的非常有效的生物活性组合物不是单一纯化的组分，而是分离的组分的复合物。膜部分的提取物(组合物B)和细胞汁液(组合物D)的进一步分级分离可以获得对于天然药物不断增长的市场而言的极为有效的成分。
实施例11
山茶属产品的对比评价：待检测的组合物。
以下生物活性组合物用于实施例10至19中所述的试验：
(1)阳性对照：按照实施例1和4中所述方法制备的白茶提取物。
(2)组合物A：按照实施例1和4中所述方法制备的山茶属的新鲜树叶的细胞壁部分的提取物
(3)组合物B：获自按照实施例1和4中所述方法制备的山茶属的新鲜加工过的树叶的膜部分的提取物。
(4)组合物D：获自按照实施例1和4中所述方法制备的山茶属的新鲜加工过的树叶的细胞汁液。
上述产品都获自制备传统白茶提取物和本发明的三种“平行”产品(组合物A、B和D)的同一批次的新鲜山茶属。
在文献中有许多报道，其提示山茶属树叶的提取物具有一系列生物活性，主要归因于在处理过程中形成的多酚类单宁的有效浓度。这些多酚类以及聚合的单宁例如表没食子酸儿茶素-3-O-没食子酸酯(EGCG)的低分子量前体已经报道显示出有效的抗氧化剂活性。越来越多的出版物提出了从山茶属的干燥树叶中制备的茶叶的不仅抗氧化剂，还有抗血管生成、抗菌、抗肿瘤、抗炎症、抗诱变、防腐和解毒特性。并非全部上述特性都已经证实具有统计学有意义的效益。仅有其中部分已经使用多种试验系统在综合性研究中确认。
如以往参考文献所述，应当指出，根据以往经验使用本发明的技术从许多新鲜植物来源(而非山茶属)中分离生物活性组合物，使用如以前美国专利申请出版号2003/0175235(其以其整体引入本文作为参考)中所述的许多参数证实，此类组合物比从同样的干燥植物中分离的传统产品更加有效。例如，使用本发明的方法从其它类型植物(紫花苜蓿、大麦、薰衣草花、金盏草成药和药用鼠尾草)中制备的组合物的几种令人印象深刻的生物活性已被确定并评价，包括高的抗弹性蛋白酶和抗明胶酶B(MMP-9)活性、新的中性粒细胞的呼吸爆发的调节以及针对活性氧物质的显著的过氧化物清除活性，这些活性不可能仅归功于多酚类的混合物。
因此，特别感兴趣地是探寻更加综合的方法来比较活性范围，其能够将本发明的山茶属组合物中检测到的活性范围与使用常规(传统)山茶属技术从相同干燥植物中获得的提取物中存在的活性进行比较。因此，已经对从新鲜采集的山茶属的树叶制备的细胞壁部分的提取物(组合物A)、膜部分的提取物(组合物B)和细胞汁液(组合物D)对活的哺乳动物细胞功能的调节进行了分析。已将这些组合物与从干燥的山茶属树叶中制备的传统白茶提取物进行比较。
应当注意，按照传统山茶属产品的多项研究，白茶提取物证实具有更高的特定活性，并因此选择此种制剂作为与本发明的新的山茶属产品比较的代表性的阳性参考对照。
实施例12
山茶属产品的对比评价：细胞系选择的原理
作为细胞功能调节的检测系统，使用两种作为肿瘤细胞模型的人乳腺癌来源的细胞系(MCF-7和MDA-MB-435S)和用作炎症细胞模型的人单核细胞样细胞系(Mono Mac 6)。上述细胞系如实施例21中所述。
MCF-7作为早期或较少去分化乳腺癌的模型。该细胞系仍保留雌激素敏感性，并且具有相对低的侵袭表现型；其转移至免疫缺陷动物模型的能力非常一般。在之前的研究中，MCF-7细胞系已经显示对转化生长因子-β(TGF-β)表现出特征性响应：在TGF-β的存在下孵育24小时后，该细胞分泌蛋白水解酶类的基质金属蛋白酶(MMP)家族和促血管生成因子血管内皮生长因子(VEGF)(两种提高的侵袭和转移效能的不同标记)的水平升高。对TGF-β的响应是肿瘤和部分肿瘤细胞系的标志，与生长停止相反，其是在正常细胞中由生长因子诱发。为了评价本发明的生物活性组合物，将不存在和存在TGF-β情况下培养的MCF-7细胞用作靶点。
MDA-MB-435S细胞系具有更高的侵袭、转移和雌激素不敏感性。该人癌来源的细胞系还显示对TGF-β的敏感性，但即使在不含生长因子的情况下，其自发地释放比MCF-7更高水平的MMP和VEGF，与其用作更晚期癌模型一致。在本评价试验中，仅检测生物活性组合物对不含TGF-β情况下培养的MDA-MB-435S细胞的作用。
人单核细胞样细胞系(Mono Mac 6)表达许多与休眠的单核细胞或巨噬细胞一致的那些生物标记物，并与人单核细胞和巨噬细胞一样对促炎症活化刺激物例如咐拜十四烷酯(PMA)有响应。检测生物活性组合物对不包含和包含PMA情况下培养的作为休眠和活化的单核细胞/巨噬细胞模型的Mono Mac 6细胞的作用。
因此，上述所选择的细胞系组合为评价山茶属生物活性组合物的抗肿瘤和抗炎症效能提供了可靠的基础。与单一试验靶点的响应或对某种刺激物具有类似敏感性或类似响应的靶点的响应所进行的研究相比，用许多功能性探针进行的所选择细胞的平行试验可以提供获得更多关于产品活性及其作用机制的有价值的结论的机会。
实施例13
山茶属生物活性组合物的对比评价：试验选择的原理
基于两个生存力试验和细胞功能探针的初始评价(参见实施例20，“方法8”)。
第一个试验检测细胞溶质酶、乳酸脱氢酶的水平，当细胞裂解时其释放入细胞外的培养基中。该细胞膜完整性的丧失在常规情况下为认为是坏死细胞死亡的信号，并反映了细胞毒特性。
第二个试验检测线粒体脱氢酶活性，如四唑盐还原为其有色的甲臜所反映。当MTS试剂(四唑盐)应用于活的细胞时，其转化为深度着色的化合物(甲臜)。线粒体脱氢酶活性的丧失还可以与细胞死亡相关，但通常是程序性细胞死亡、或细胞凋亡的通路的早期步骤的标志物，其中在细胞核已经浓缩且线粒体停止功能后细胞膜完整性一般保留完好。
乳酸脱氢酶的泄露指示了与细胞溶解相关的生存力完全丧失，而四唑盐还原减少指示了线粒体活性的丧失，但不是必须有不可逆的细胞膜完整性或生存力的丧失。
作为额外的细胞功能探针，已经检测了山茶属生物活性组合物对由Mono Mac 6细胞系分泌的蛋白酶水平的作用(参见实施例20，“方法9”)。在之前用该细胞系的研究中，观察到用PMA孵育后，Mono Mac 6细胞分泌两种所谓的溶解明胶的基质金属蛋白酶MMP-2(明胶酶A)和MMP-9(明胶酶B)。这些MMP还由许多肿瘤及其周围的间质分泌，并且涉及炎症组织损伤以及肿瘤侵袭和转移。之前还显示某些开发为抗炎和抗肿瘤的药物除任何对MMP的蛋白水解活性的任何直接抑制以外还表现出降低由细胞产生的MMP水平(已经研究的药物已知减少炎症性组织破坏以及肿瘤细胞系侵袭和转移的药物)。这些研究的目的是评价本发明的山茶属生物活性组合物可能具有降低由活化的Mono Mac 6细胞释放的MMP水平的类似能力的可能性。
因此，所选择的试验使人们能够可靠地评价广泛的代谢过程，并有效地获得重要数据，其可能揭示由某些山茶属生物活性组合物所触发的作用机制。
实施例14
山茶属产品的对比评价：山茶属生物活性组合物对乳腺肿瘤细胞系的作用
在这些研究的自始至终，仅通过四唑盐MTS还原为其甲臜的试验来检测线粒体功能。应当注意地是，更高浓度的本发明的山茶属生物活性组合物已被观察到具有在不存在任何活的细胞情况下直接还原MTS的内在能力，并且在本文所报道的全部结果中，该在不含细胞情况下甲臜的本底形成已经从在细胞存在下所观察到的还原酶活性水平中扣除。
图14至21说明，在不存在和存在5ng/ml TGF-β下培养的MCF-7细胞和仅在不包含TGF-β情况下培养的MDA-MB-435S细胞在加入四种在0.01％或0.02％至0.0001％范围(w/v，培养基中的终浓度，基于山茶属组合物中的固体干重)内各自不同剂量的山茶属组合物后24小时和48小时的还原酶活性的量级。
实施例15
山茶属生物活性组合物的对比评价：MCF-7细胞。
在不包含TGF-β的情况下，最高检测浓度(0.01％)的组合物A和白茶提取物(阳性对照)对由MCF-7细胞引起的MTS还原具有显著作用。在该浓度下与山茶属组合物A接触24小时后具有显著但不完全的还原酶活性抑制(～50-70％抑制率)。暴露于白茶提取物中24小时后检测到类似的还原酶活性抑制。
相反，从山茶属细胞汁制备的两种山茶属生物活性组合物(膜部分的提取物和细胞汁液)在不含TGF-β的MCF-7细胞中是更有效的还原酶活性抑制剂。膜部分的提取物(组合物B)除了某种程度上效能更强以外在剂量依赖方面与白茶提取物类似，在最高测试剂量0.01％下产生实质上地完全抑制。细胞汁液(组合物D)也在0.01％下产生实质上地完全抑制，但在0.0025％的较低剂量下，有一些刺激还原酶活性的证据。组合物D的较低剂量没有显著作用。
当将MCF-7细胞在生长因子TGF-β的存在下培养时，其对山茶属组合物的敏感性显著改变。暴露于细胞壁部分的提取物和白茶提取物24小时或48小时后，除了在最高剂量(0.01％)的白茶提取物中低于20％的中度抑制外，以任何剂量对还原酶活性都无刺激或抑制作用的证据。
相反，将用TGF-β处理过的MCF-7细胞与膜部分的提取物以0.02％剂量接触24小时导致还原酶活性的70％的抑制率，且48小时后，还原酶活性实质上完全抑制。在较低剂量的膜部分的提取物下24小时后检测到更弱的抑制率，但是在48小时后，检测到还原酶活性显著活化。接触48小时后检测到在低剂量的细胞汁液下获得还原酶活性的同样活化以及在最高剂量(0.02％)下的显著抑制，但是该组合物在更有限的24小时接触后无论剂量大小都仅对TGF-β处理过的MCF-7细胞的还原酶活性具有最小的作用。
在评价试验中，即使与最高剂量的任何山茶属组合物接触24小时都未能检测到乳酸脱氢酶显著释放到MCF-7细胞的培养基中。这表明，这些细胞中线粒体功能的丧失不伴随细胞的坏死性溶胞作用。如果所述细胞实际是在接触的头48小时过程中死亡，其更加可能是程序性细胞死亡或细胞凋亡通路已经启动。该结论通过光学显微观察被证实，其显示存在一些细胞的圆化(rounding)，但是在接触过程中未形成细胞碎片或膜碎片。
因此，显示出线粒体功能的抑制是全部测试的山茶属产品的主要作用模式，其没有证实通过所释放的乳酸脱氢酶水平表明的具有细胞毒或坏死作用。
实施例16
山茶属生物活性组合物的对比评价：MDA-MB-435S细胞。
MDA-MB-435S细胞对山茶属组合物的响应模式与MCF-7(其中最有效的组合物是组合物B和D)类似，膜部分的提取物(组合物B)显示比细胞汁液(组合物D)某种程度更高的效能。仅有膜部分的提取物在仅接触24小时后产生显著的还原酶活性抑制作用。在最高剂量0.01％下抑制率达到对照还原酶数值的-70％，即使在可标记浓度的最低剂量—0.0001％下仍然可以可靠地检测到-10％的中度抑制率。其它检测组合物在接触24小时后仅有中度抑制率，且仅在较高检测剂量下。
接触48小时后，还原酶活性在各种所述组合物存在下以剂量依赖的形式被抑制，但是在所述组合物的最高剂量下都未能达到接近100％抑制的效能，除了膜部分的提取物以外。该组合物在0.001％下接触48小时后抑制还原酶活性-50％。白茶提取物和细胞壁部分的提取物在接触48小时后也对MDA-MB-435S细胞具有显著的抑制活性，其实际上高于细胞汁液。不论接触期多长，任何所述制剂的剂量都不会引发该细胞系中还原酶活性的活化。
应当注意，在仅24小时后很少能观察到对MDA-MB-435S细胞系的高度侵袭、转移和雌激素不敏感的任何影响。
实施例17
山茶属生物活性组合物的对比评价：山茶属组合物对单核细胞样细胞的作用
线粒体脱氢酶活性：乳腺癌细胞系的初步研究显示的某些趋势证实与Mono Mac 6细胞对四种检测的山茶属组合物的响应一致。与细胞壁部分的提取物(组合物A)和白茶提取物(阳性对照)相比，膜部分的提取物(组合物B)和细胞汁液(组合物D)对炎症细胞系中的MTS还原酶活性是更有效的抑制剂，膜部分的提取物(组合物B)明显具有最强的抑制效力。对未受刺激的和用10nM PMA刺激的细胞中的MTS还原酶的作用进行检测，并评价与山茶属组合物接触24和48小时后的还原酶活性。这些组合物对Mono Mac 6细胞中还原酶活性的作用如图22至33所示。
在与PMA-刺激后的细胞接触48小时后，白茶提取物显示出对还原酶活性微弱但剂量依赖性的抑制；无论在不含PMA情况下接触的剂量还是时长如何，还原酶活性都无显著损失，并且以任何剂量与PMA处理过的细胞接触24小时后都无任何作用。无论接触的剂量还是时间以及所述细胞是否用PMA刺激过，细胞壁部分提取物对Mono Mac 6细胞都无作用。
新鲜山茶属树叶的细胞汁液在接触24或48小时后以剂量依赖的方式中度地抑制未刺激的Mono Mac 6细胞。在0.01％(w/v，在培养基中的终浓度，基于起始制剂中固体的干重量)的最高剂量下的最大抑制率仅为对照物活性的～20-30％。仅以最高剂量的组合物D(0.01％)且仅在接触48小时后，对PMA-刺激后细胞的抑制率才达到对照物活性的50％。
新鲜采集的山茶属的膜部分提取物(组合物B)证实在抑制Mono Mac 6细胞还原酶活性中是所检测制剂中最有效的，如其对乳腺肿瘤细胞系一样。PMA刺激的作用或与组合物接触的持续时间对抑制作用的影响微不足道，其在存在或不存在PMA的情况下都是剂量依赖性的，并且在接触24小时或48小时后大致相同。在0.02％的最高剂量下还原酶活性在PMA存在下被抑制-70％且在不含PMA情况下被抑制-80-90％，而在0.001％剂量下可以可靠地检测到较低的抑制水平(-15％)。未进行细胞溶质酶类释放的检测以确定还原酶活性的损失不与坏死的细胞溶解相关，但是通过对与0.02％的任何生物活性组合物接触48小时的Mono Mac 6细胞的光学显微镜检查没有见到膜碎片的证据。此外，如下文所示，在MTS还原被显著减弱的条件下所述细胞显示仍然能够分泌至少一种MMP。
这些结果提示，在这些细胞以及乳腺肿瘤细胞系中还原酶活性损失是与线粒体功能的相对选择性的损失相关，并且可以反映出程序性细胞死亡或凋亡通路的开启。
MMP的分泌。已经使用两种不同的分析方法来检测由Mono Mac 6细胞释放的两种明胶酶类MMP-2(明胶酶A)和MMP-9(明胶酶B)的水平。这些MMP已显示与炎症性组织损害以及肿瘤侵袭和转移相关。所用的MMP-2和MMP-9的酶联免疫吸附试验(ELISAs)首先用于评估在10nM PMA和不同剂量的三种山茶属生物活性组合物和阳性对照的存在下培养48小时的Mono Mac 6细胞的培养基中这两种酶的总水平。
该细胞系在其未受刺激时仅分泌MMP-2，但在其活化时同时分泌MMP-2和MMP-9。(24小时后MMP的释放水平通常太低而不能可靠地检测)。
ELISA检测结果如图34至37所示。如细胞壁部分提取物和白茶提取物对Mono Mac6细胞的MTS还原所观察到的作用，以任何剂量的这些提取物对所分泌的MMP-2和MMP-9水平都无显著改变。在膜部分提取物和细胞汁液的最高剂量(0.01％w/v)下，观察到MMP-2的水平降低，在此剂量下膜部分提取物表现出最强的效能。应当注意，在下一个最高剂量的组合物B(0.001％)和组合物D(0.002％)下观察到MMP-2释放的明显的轻微刺激。该刺激是在类似剂量的此类组合物存在下TGF-β处理后的MCF-7细胞中MTS还原酶活性刺激的暗示。
由ELISA检测的剂量依赖性的MMP-2水平的降低不与膜提取部分和细胞汁液对MMP-9水平的影响平行。这些水平在较高剂量下升高(由细胞汁液引起的明显显著)，但是在较低检测剂量下无变化。由与仅24小时就产生MTS还原酶活性显著抑制的山茶属制剂的剂量接触48小时的Mono Mac 6细胞分泌的MMP-9水平的未变化或升高的检测，进一步证实了与山茶属的膜部分提取物或细胞汁液接触的Mono Mac 6细胞中线粒体功能的损失不反映出坏死性细胞溶解，在此情况下MMP分泌将突然停止。
作为山茶属组合物影响Mono Mac 6细胞的MMP分泌的进一步证据，使用明胶酶谱法来检测如上文ELISA检测所述方法收集的培养基。在该方法中，首先将所述培养基在明胶浸透的聚丙烯酰胺凝胶中在十二烷基硫酸钠的存在下电泳(SDS-PAGE)，以将蛋白质按照分子量分离。随后，将SDS从凝胶中洗出，使得任何酶类的至少一部分存在以进行复性，并将该凝胶在培养基中孵育，其将MMP活性最大化。MMP溶解明胶，无论其存在于哪里。用蛋白质染色将凝胶块中未消化的明胶可视化以后，扫描该凝胶，MMP显示为相对于染色后背景的亮区。此处提供的是负像，因此MMP相对于亮色背景为暗区。
应当注意地是，MMP是作为无活性的前体由大部分细胞分泌，其随后在细胞外活化。但是，由于在酶谱法中所用的变性和复性次序，即使无活性的MMP的前体形式仍然具有溶解明胶的活性并产生亮区。图34至37显示了Mono Mac 6细胞与不同的山茶属生物活性组合物接触48小时后收集的培养基以及从不存在(U)或存在(S)10nM PMA、但是不存在山茶属组合物情况下培养的细胞中收集的培养基的明胶酶谱的负像。
仅用制剂的最低剂量(0.0001％,“lo”)和最高剂量(0.01％,“hi”)来评价组合物A和阳性对照的作用，而组合物B和D的作用还在0.001％的中间剂量(“med”)进行评价。从四个平板可以显而易见，在不含PMA情况下Mono Mac 6细胞仅释放MMP-2(～67kD)，并且该酶主要以前体形式发现。用10nM PMA处理导致诱导MMP-9的分泌(～92kD)，以及将显著水平的两种MMP的前体形式转化为其略低分子量的活性形式的进一步蛋白水解活性。
与ELISA结果一致，与细胞壁部分和白茶提取物接触的PMA-刺激的Mono Mac6细胞经明胶酶谱法显影对两种MMP的前体或活化形式水平均无可检测到的作用。相反，经明胶酶谱法显影，与最高剂量的组合物B或D接触导致MMP-2水平的显著减少，但是对MMP-9的水平无明显改变。
MMP-9的前体和活性形式的出现，以及对应于在从用最高剂量组合物B和D处理过的细胞中收集的培养基中见到的MMP-2活性形式的微弱但是可识别的条带，提示了在这些培养的细胞中这些组合物主要作用于MMP-2释放的调节，而不涉及对MMP活化机制的额外作用。
实施例18
山茶属生物组合物的对比评价：结论概述
实验数据指出山茶属生物活性组合物触发MTS还原酶活性的剂量依赖性损失，其一般而言归因于线粒体功能的损失。该抑制作用需要至少接触48小时才能检测到，并且至少在前24小时无可检测到的细胞溶质酶类的释放，提示了生物活性组合物并非引发了坏死性细胞溶解，而是开启了肿瘤细胞中的程序性或细胞凋亡的细胞死亡的通路。
MCF-7细胞和MDA-MB-435S细胞响应的时间-及剂量-依赖性的差异以及MCF-7细胞的TGF-β处理的作用，全部都指出更加侵袭性和转移性的表型对白茶提取物、细胞壁提取物都具有一定程度增加的抗性，而在某种程度上还有细胞汁液，其证实在接触的前24小时内具有相对中度的还原酶活性损失。但是，膜部分提取物由其在TGF-β-处理过的MCF-7细胞以及MDA-MB-435S细胞中在24小时内抑制MTS还原酶活性的能力证实了其更强效能的倾向。
所检测的山茶属生物活性组合物对Mono Mac 6细胞系(人单核细胞/巨噬细胞模型)的作用与在乳腺肿瘤细胞系中观察到的作用具有某种相似性。根据在乳腺肿瘤细胞系的培养基中乳酸脱氢酶的不存在以及在Mono Mac 6细胞的培养基中存在MMP-9分泌的正常至升高水平，可以总结出即使在最高检测剂量下(0.01％w/v)这些组合物也不会引起坏死性细胞溶解。
然而，两种生物活性组合物(膜部分提取物和细胞汁液)引起线粒体还原酶活性的剂量依赖性抑制，其反映了Mono Mac 6细胞中程序性细胞死亡的细胞凋亡通路的开启。此外，这些炎症细胞与膜部分提取物和细胞汁液接触导致明胶分解酶MMP-2(明胶酶A)水平的选择性降低。明胶酶谱法显示“前体形式”或酶原活化机制不受山茶属生物活性组合物影响，因此在培养基中MMP-2水平的降低反映出蛋白水解破坏增强是非常不可能的。
因此，全部检测细胞系(即人乳腺癌早期阶段模型、晚期乳腺癌细胞模型和单核细胞性白血病模型)的代谢活性都被膜部分提取物(组合物B)和细胞汁液(组合物D)(大部分情况下)有效地抑制。值得注意地是，茶的细胞壁提取物(组合物A)和白茶提取物(阳性对照)被证实无活性或者比上述组合物B和D的效能低很多。
在不存在和存在转化生长因子情况下所有检测的MCF-7人癌细胞、MDA-MB-435S晚期人乳腺癌细胞和刺激和未刺激的单核细胞样Mono Mac 6细胞都清楚地证实了该倾向。与生物活性山茶属组合物检测和评价的概述相关的数据如表15中所示。
表15—生物活性山茶属组合物的检测和评价的概述
表15显示山茶属制剂以剂量依赖的方式调节细胞功能的能力按如下次序升高：白茶提取物＝细胞壁部分提取物>细胞汁液>膜部分提取物。实验数据提示，通过将新鲜植物组织加工成细胞汁衍生的膜部分提取物(组合物B)和细胞汁液(组合物D)而制备的新的生物活性山茶属组合物不会触发任何对细胞的彻底的坏死性毒性。
因此，本发明的技术显示了显著提升山茶属生物活性组合物效能的能力，以及制备令人印象非常深刻的证实对活的人细胞具有按常规山茶属技术生产的最佳产品(例如白茶提取物)所无法证实的活性的新产品的能力。
实施例19
山茶属生物活性组合物的对比评价：未来研究的意义
本发明的山茶属生物活性组合物对细胞介导的蛋白水解活性的作用对于炎症性组织损害以及肿瘤侵袭和转移具有意义。因此，可以清楚地建议乳腺癌细胞和单核细胞性白血病作为本发明的山茶属生物活性组合物(最值得注意地是组合物B(膜部分提取物))的预期靶点。以前已经显示，结肠癌来源的细胞系COLO 205释放显著水平的MMP-2，其随后被也由该细胞分泌的类胰蛋白酶活化。基于Mono Mac 6细胞的结果，该类型的肿瘤细胞是本发明的山茶属生物活性组合物的许多潜在靶点之一。
从这些研究中，可以确定从本发明的新鲜山茶属中分离的生物活性组合物具有显著的活性，其导致关键细胞功能的令人印象深刻的调整。已观察到的作用对于从个人护理产品乃至营养品和潜在药物来说具有有价值的应用。
实施例20
用于确定生物活性组合物的某些特性的方法
以下是用于确定生物活性组合物的某些特性的不同方法。这些方法在上述实施例中用作参考。下文所述的“检测产品”或“检测样品”是指生物活性组合物。
方法1：测定固体含量的方法。测定固体含量的方法包括将所测试生物活性组合物在水浴中于100℃下蒸发直至水全部蒸发，将样品于105℃下在烤箱中储存3小时，冷却至室温，并立即测定装有固体物质的容器重量。
方法2：测定不挥发残余物的方法。测定不挥发残余物的方法包括将测试生物活性组合物在105℃下在烤箱中储存5小时，冷却，并立即测定装有固体物质的容器重量。
方法3：测定L＊a＊b＊值的方法。测定L＊a＊b＊值的方法是使用Hunter Labscan固定几何比色计用0°/45°的检测几何学测定L＊a＊b＊值。使用带有朝上视窗的标准照明D65。将装有所试验生物活性组合物的容器置于视窗上，并通过底部检测。使用以下CIELAB等式：
C*＝(a*2+b*2)1/2
DE*＝[(DL)2+(Da*)2+(Db*)2]1/2
DH＝[(DE*)2-(DL*)2-(DC*)2]1/2
方法4：测定总类胡萝卜素类含量和叶黄素含量的方法。将试验生物活性组合物用丙酮提取。匀浆化并真空过滤后，将全部提取物用30％氢氧化钾在甲醇中的溶液皂化。用石油醚将类胡萝卜素从生物活性组合物这连续提取。额外处理后并在乙醇中再次溶解，全部样品在446nm下检测。
为了检测叶黄素含量，来自各个样品提取物的额外干燥样品用于高效液相色谱(“HPLC”)分析。将该干燥样品再次溶于MTBE和甲醇中。使用装有(250×4.60mm I.D.)5μmC18柱的反相HPLC系统。叶黄素的鉴定是通过可靠标准的联合色谱法来确定。叶黄素在乙醇中的摩尔吸光系数是144,800cm-1mol-1。
方法5：测定弹性蛋白酶抑制活性的方法。使用试剂盒来测定试验生物活性组合物的弹性蛋白酶的抑制活性，该试剂盒使用了中性白细胞弹性蛋白酶(由“ElastinProducts”生产的纯化的酶制剂)和由“Sigma”生产的合成肽可溶性底物甲氧基琥珀酰基-Ala-Ala-Pro-Val-对硝基苯胺。底物的酶裂解导致产生随时间黄色增强(405nm)；通过增加包含抑制活性的试验生物活性组合物的浓度使颜色产生的速率降低。抑制作用的浓度依赖性分析使得抑制活性的效能可以定量，表示为需要达到50％抑制率的每个测试生物活性组合物的干物质的浓度(IC50)，而且还提供了与抑制模式相关的信息。
为了测定IC50，弹性蛋白酶的浓度为2.5μg/ml且底物的浓度为150μM。为了测定Ki，底物的浓度为100μM和200μM。
方法6：测定明胶酶B(MMP-9)抑制活性的方法。在洗去其它蛋白酶以后，使用能够在多孔微量培养板上通过免疫识别特异性地捕获明胶酶B的市售的分布试验(由“AmershamPharmacia”生产的MMP-9活性ELISA)。通过明胶酶B的低分子量合成底物：APMA的水解，在405nm下检测酶活性。该抑制的浓度依赖性分析用于测定所检测的生物活性组合物干物质的效能。
方法7：测定超氧化物清除活性的方法。使用黄嘌呤氧化酶(由“Sigma”生产的纯化的酶制剂)的酶系统用于以高产率和可控的方式产生超氧负离子。通过该酶将黄嘌呤向氢化黄嘌呤的转化产生大量的超氧负离子，并且高铁细胞色素c还原为亚铁细胞色素c用作超氧化物水平的灵敏检测。当将试验生物活性组合物加入反应系统时，对亚铁细胞色素c水平(550nm)的检测是能够测定其超氧化物清除活性。每孔的终浓度为细胞色素c 75μM、黄嘌呤425μm/L和黄嘌呤氧化酶10mU/ml。
方法8：测定体外毒性和细胞凋亡的方法。研究了CellTiter 96AQueous一种细胞增殖试验溶液和CytoTox 96非放射性细胞毒性试验以及随后的方案(两种试验都由PromegaCorporation,Madison,Wis.生产)。
第一个试验是用于测定活细胞数量的比色法，其研究了四唑化合物(3-(4,5-二甲基噻-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑，内盐；MTS和电子偶联试剂(吩嗪硫酸甲脂；PMS)。MTS被细胞生物还原为在组织培养基中可溶的在490μm吸收度最大的甲臜产物。MTS向水性可溶的甲臜的转化是由在代谢活性细胞中发现的脱氢酶来完成，并且甲臜产物的量与培养基中的活细胞数量成正比。
第二个试验是脱氢酶(LDH)的定量检测，脱氢酶是细胞溶胞后释放的稳定的细胞溶质酶。在细胞培养基上清中释放的LDH用30分钟偶联酶试验检测，其导致四唑盐(INT)转化为红色甲臜产物。所形成颜色的量与溶胞的细胞数量成正比。
方法9：测定由刺激后的细胞所分泌的酶水平的方法。用PMA孵育后，Mono Mac 6细胞分泌两种溶解明胶的基质金属蛋白酶，MMP-2(明胶酶A)和MMP-9(明胶酶B)。在试验生物活性组合物存在下这些酶的水平由二维十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳来测定。
实施例21
用于检测山茶属产品的某些生物活性特性的细胞系
认为是晚期乳腺癌模型的细胞系MDA-MB-435S是获自美国标准培养收集所(ATCC编号HTB-129)。将该细胞系在37℃下在以下ATCC培养基中孵育：Leibovitz's L-15培养基，含有添加了0.01mg/ml胰岛素的2mM L-谷氨酰胺90％；胎牛血清10％。
认为是早期或较少未分化的乳腺癌模型的MCF-7细胞系是获自ATCC(编号HTB-22)，将其在37℃下在以下ATCC培养基中孵育：最低基础培养基(Eagle)，含有2mM的L-谷氨酰胺和调整包含1.5g/L碳酸氢钠的Earle's BSS、0.1mM非必需氨基酸和1mM丙酮酸钠，并添加了0.01mg/ml牛胰岛素，90％；胎牛血清，10％。
细胞系MonoMac6(MM6，获自German Collection of Microorganisms and CellCultures)与分化的人单核细胞(Ziegler-Heitbrock等人,“Establishement of a HumanCell Line(Mono Mac 6)with Characteristics of Mature Monocytes,”InternationalJournal of Cancer 41:456-461(1988)，其以其整体引入本文作为参考)非常类似。将细胞保存在RPMI 1640中，添加2mM L-谷氨酰胺、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素、1mM丙酮酸钠、10％FCS、非必需氨基酸、9μg/ml胰岛素和1mM草乙酸。试验条件下，还加入0.2％葡萄糖。
实施例22
山茶属产品的儿茶素分析
分析本发明的细胞壁部分提取物、膜部分提取物和细胞汁液中不同的儿茶素含量。白茶样品用作对照物。分析以下儿茶素：(-)-表没食子酸儿茶素；(+)-儿茶素；(-)-表儿茶素；(-)-表没食子酸儿茶素没食子酸酯；(-)-没食子儿茶酸没石子酸酯；和(-)-表儿茶素没食子酸酯。将样品用0.1％H3PO4萃取，并超声处理15分钟。离心后，将提取物注射入HPLC上。C-18反相柱用作固定相。0.1％磷酸和乙腈用作流动相。在280nm下检测。该计算是基于将各种列出的儿茶素与其纯度标准品面积的比较。结果如图38和表16(下文)所示。
表16
实施例23
某些山茶属产品的功能性饮料和个人护理应用
介绍：活的茶植物能力的应用
皮肤是人体最大的器官，而且是对其他人而言最明显的器官。其外观不仅反映外在的损害和局部护理，而且还反映了个体的总体健康状况。根据Epstein的最近综述，保持健康代谢、特别是关于胰岛素敏感性、血糖水平和适合的氨基酸摄入，对于保持更加年轻样的皮肤而言至关重要。同时，控制氧化损害和炎症的恶性循环仍然任务艰巨。[1]
Lesley E.Rhodes等人最近的研究提供了当口服时绿茶化合物、绿茶儿茶素类的潜在健康益处。已经发现，是将绿茶儿茶素代谢物引入人皮肤，并保护避免由UV照射引起的与促炎症类二十烷酸12-羟基二十碳四烯酸产生减少相关的皮肤炎症，并且可能有助于保护避免晒伤炎症和潜在的长期UVR-介导的损害。[2]
因此，茶植物(山茶)可能从内到外都有助于实现皮肤健康。
成分CS是经Zeta FractionTM技术从活的山茶中开发用于潜在个人护理应用，并且其多功能活性以前在Personal Care杂志的2012年11月版中由Koganov等人描述过。
该实施例23包括关于用于功能饮料的活的茶植物能力的应用的持续研究，其可以潜在地支持“内在美”的概念；以及用于具有抗氧化特性的局部个人护理制剂。此外，该实施例23包括基于该成分的饮料制剂与传统绿茶和红茶以及市售的基于茶的饮料的对比评价。
PurecentiaTM山茶–用于支持“内在美”概念的功能饮料
Zeta FractionTM技术用于开发功能饮料应用PurecentiaTM Camellia和局部美容应用CS植物汁液部分两者的有效成分。
用于个人护理的成分CS[3]和开发为用于功能饮料应用的有效成分PurecentiaTM山茶的区别与特定应用的生产规程和防腐系统相关。
PurecentiaTM山茶与红茶和绿茶传统制剂比较
PurecentiaTM山茶、绿茶和红茶传统制剂均获自在位于美国南加州中心WadmalawIsland的Charleston茶叶种植场于2012年6月采集的相同茶树品种。对于不同茶植物制剂的精确比较而言，相同树种的使用是关键性的；如Karori等人所示树种类型能够显著影响茶叶产品的特性[4]；因此，相同树种的使用消除了与树种类型相关的差异性。
PurecentiaTM山茶制剂：PurecentiaTM山茶是按照Koganov US 7,473,435；8,043,635and 8,318,220中所述方法制作，所述公开物以其整体引入本文作为参考。[5-7]
红茶传统制剂：将去离子水加热至约99℃；将2.0g锡等级散装红茶置于烧杯中；当水达到所需温度时，将水倒入装有茶叶的烧杯中；将该烧杯封盖，并在磁力搅拌器上放置四分钟；四分钟过去后，将该烧杯从搅拌器上移去，并将该红茶制剂经过滤器倒出，冷却至室温。
绿茶传统制剂：将去离子水加热至约85℃；将2.0g锡等级散装绿茶置于烧杯中；当水达到所需温度时，将水倒入装有茶叶的烧杯中；将该烧杯封盖，并在磁力搅拌器上放置两分钟；两分钟过去后，将该烧杯从搅拌器上移去，并将该绿茶制剂经过滤器倒出，冷却。
分析性评价
来自活的茶植物的PurecentiaTM山茶相对于红茶和绿茶传统制剂的物理化学参数如下表17中所示。
表17–PurecentiaTM山茶、红茶和绿茶传统制剂的物理化学参数＊
＊全部分析性评价都快速地进行以对未保存过的制剂进行评价。
对PurecentiaTM山茶、红茶和绿茶传统制剂进行LC(液相色谱)-ELSD(蒸发激光散射检测器)评价。
ELSD绝对信号强度相对于保留时间如图39中所示；且ELSD相对信号强度相对于保留时间如图40中所示。
图39中峰高的差异显示了检验品中单个成分浓度的差异。
在图40中，将相同数据进行标度，各个信号强度中“0”为最小且“1”为最大，以显示峰的位置及其大小的比例。
还进行LC(液相色谱)-DAD(二极管阵列检测器)评价。各自的LC-DAD三维色谱图如图41-43中所示。
通过这些表征以及酶解图谱法的数据显示出PurecentiaTM山茶的组合物与绿茶和红茶传统制剂相比较具有显著的性质上的差异。PurecentiaTM山茶具有更高的固体含量、某些峰的更好表示以及更强的化合物多样性。总之，PurecentiaTM山茶比传统红茶和绿茶制剂具有更高的浓度，并且包含更多组分；其表征正在进行中。
用LC-MS(液相色谱-质谱)分析L-茶氨酸的浓度
L-茶氨酸是几乎仅在茶植物的树叶中才能发现的非必需氨基酸，并且当作为补充剂口服时提供多种健康益处。[8]某些公司生产的皮肤护理产品开始在其化妆品中包含L-茶氨酸。例如Dermascriptive，在晚霜中包含L-茶氨酸以湿润并向压力皮肤提供营养。[9]
三个样品中L-茶氨酸的量如下表18中所示。
表18–来自活的茶植物的PurecentiaTM山茶与红茶和绿茶传统制剂中L-茶氨酸的比较
PurecentiaTM山茶 红茶传统制剂 绿茶传统制剂
L-茶氨酸(μg/ml) 1150 23 33
L-茶氨酸(μg/ml) 3000+ 23 33
液相色谱-质谱分析显示PurecentiaTM山茶比传统红茶和绿茶制剂具有更高浓度的L-茶氨酸。
PurecentiaTM山茶与红茶、绿茶传统制剂和市售的基于茶的饮料相比的抗氧化剂活性
市售基于茶的饮料的成分(标签信息)和物理化学参数如下表19所示。
表19–市售基于茶的饮料的成分(标签信息)和物理化学参数
PurecentiaTM山茶、红茶和绿茶传统制剂与市售基于茶的饮料的相对ORAC活性比较如图44中所示。
ORAC实验显示试验的市售的绿茶饮料，最高的ORAC值比最低的高大约五倍。试验的传统茶制剂的活性在此范围内。但是，应当注意，饮料的抗氧化剂活性部分地来自茶以外的其它来源–例如柠檬酸和抗坏血酸，以及在某些情况下的草药(herbal)提取物。PurecentiaTM山茶的活性比效果最佳的试验的市售绿茶饮料高超过二十倍，并且甚至5％的PurecentiaTM山茶制剂超过了试验的市售饮料。这提示了，PurecentiaTM山茶可能成为向现有饮料中添加抗氧化活性的有效成分，或者用其作为基础活性成分来制作功能性饮料。
具有抗氧化特性的个人护理制剂
研究了个人护理制剂的抗氧化剂活性，如表20中所示。
表20–含有0.5％CS＊的精华胶
＊不含CS的精华胶基质含有去离子水代替CS。
含有0.5％CS的精华胶与不含CS的精华胶的抗氧化剂活性在ORAC实验中进行评价。将这些制剂在室温下和45℃下保持2个月，然后对其进行评价。这些试验品的相对ORAC活性如图45所示。
如个人护理原型的数据所示，CS的抗氧化剂作用显著高于精华胶基质制剂。加速稳定性试验过程在45℃下进行2个月，该制剂的抗氧化剂作用降低了精华胶基质的～11％，且仅降低了包含CS的精华胶的～4％。数据证实，CS在个人护理凝胶原型中保留了其活性，且有助于保持该制剂中其它组分的抗氧化剂活性。
方法
重量摩尔渗透压浓度，每单位质量溶液中溶质颗粒的数量(例如每千克毫渗摩尔)，是按照基于设备手册的方法使用来自Advanced Instruments,Inc(Norwood,MA,USA)的冰点降低渗压计Model 3250进行检测。
折射率(nD)，光在真空中的光速与光在其它介质中光速的比率，其确定了当光线从一种介质中通过另一种介质是其转折的情况，是按照基于设备手册的方法使用来自Reichert Technologies(Depew,NY,USA)的Reichert Arias 500折射计在20℃下检测。
密度，每单位体积质量的量度(例如每立方厘米的克数)，是按照基于设备手册的方法使用来自Mettler-Toledo LLC(Columbus,OH,USA)的Densito 30PX密度计在环境温度下检测。
干物质，在105℃下持续24小时以将水喝挥发性化合物从样品中蒸发除去后剩余质量的百分比，已按照基于常规实验室实践的方法使用来自Ohaus公司(Parsippany,NJ,USA)的Ohaus Explorer E00640分析天平和来自SPX Thermal Product Solutions(Rochester,NY,USA)的Lindberg Blue M重力烤箱测定。
LC(液相色谱)–ELSD(蒸发激光散射检测器)或DAD(二极管排列检测器)。在40℃下将整4μl注射体积的三个样品在装有反相C18柱(Kinetex C18Coreshell,4.6mm i.d.x10cm,2.6μm颗粒大小，和孔径,Phenomenex,USA)的Agilent 1260infinity LC上分离。溶剂梯度通过将溶剂A(含有0.1％甲酸的100％水)与溶剂B(含有0.1％甲酸的100％乙腈)混合以0.8mL/min的流速产生。25分钟LC梯度按照如下方法产生：5％溶剂B，0～0.5分钟(等度)；5％-30％溶剂B，0.5～6.5分钟(线性)；30％–100％溶剂B，6.5～13.5分钟(线性)；100％溶剂B，13.5～18.5分钟(等度)；100％～5％溶剂B，18.5～20分钟(线性)；5％溶剂B，20～25分钟(等度)。用ELSD(Model 300S,SofTA公司,Westminster,CO,USA)和DAD(1040A,Hewlett-Packard)在多个波长(UV＝204nm、254nm、270nm、280nm、320nm、350nm和410nm)下收集数据。
L-茶氨酸分析的LC-MS(液相色谱-质谱)。将样品稀释后进行LC-MS分析：将PurecentiaTM山茶稀释100倍，将红茶和绿茶传统制剂稀释10倍。为了产生用于定量的校正曲线，制备许多种浓度的L-茶氨酸标准品。使用装有Aqua C18柱(4.6μm i.d.×15cm,5μm颗粒大小，和孔径,Phenomenex,USA)的Agilent 1100LC系统用等度溶剂A(80％水和20％乙腈，含有0.1％甲酸)以0.8mL/min的流速洗脱4分钟来分离所述样品。将该LC系统通过点喷射离子化(ESI)源(LCT Premier,Waters公司,Milford,MA,USA)与飞行时间(TOF)质谱仪偶联，并且该MS谱需要50-500m/z(正离子模式)的m/z扫描范围。L-茶氨酸在～1.9分钟的保留时间洗脱出，并通过其特征性离子175.2m/z进行定量。
氧自由基吸收容量(ORAC)。抗氧化剂活性是使用来自BioTek的“PerformingOxygen Radical Absorbance Capacity(ORAC)Assays with Synergy HT Multi-Detection Microplate Reader”Application Note中所述方法通过ORAC检测来确定，在(www.biotek.com/resources/docs/ORAC_Assay_Application_Note.pdf)中可以获得，其修正使用了来自BioTek Instruments Inc(Winooski,VT)的Synergy 2全自动定量绘图酶标仪。在该实验中，AAPH(2,2'-偶氮二2-氨基-丙烷)产生破坏荧光探针(荧光素钠)的活性氧种类。抗氧化剂例如(R)-Trolox甲醚阻止或减缓这种破坏，且其作用可以通过荧光检测进行定量。在激发波长设定在485nm且发射波长设定在528nm下、200μl的反应体积、55mM的AAPH浓度、1.33μM的荧光素钠浓度以及80μM至2μM之间的(R)-Trolox甲醚浓度下于37℃连续进行荧光读数2小时。荧光素钠(Fluka 46960)、AAPH(Sigma 440914)和(R)-Trolox甲醚(Fluka 93509)是获自Sigma-Aldrich(St.Louis,MO)。AUC(曲线下面积)值计算为比例(当前孔的荧光读数除以该孔第一次的荧光读数)的总和。将用去离子水的各孔的平均AUC值从含有(R)-Trolox甲醚的各孔以及含有检测样品的各孔的AUC中扣减，得到对应于抗氧化剂荧光保持的AUC。各孔抗氧化剂的功能-相关AUC产生的校正曲线显示(R)-Trolox甲醚化学当量的ORAC活性。在去离子水中用来自Scientific Industries,Inc(Bohemia,NY)的Vortex Genie 2来制备样品的稀释剂。将精华胶样品以25％至3.125％之间的w/w浓度稀释，传统茶制剂以10％至0.31％的w/w浓度稀释，且PurecentiaTM山茶以2％至0.13％的w/w浓度稀释。以实现与由1单位重量(R)-Trolox甲醚所产生等价的抗氧化剂作用所必需的单位重量的检测样品来计算检测样品的ORAC活性，数字越低说明ORAC活性越强。
结论
从所应用的表征和酶解图谱法得到的数据显示使用Zeta FractionTM技术得到的PurecentiaTM山茶的组合物与绿茶和红茶传统制剂相比较的显著的性质上的差异。PurecentiaTM山茶具有更高的固体含量、某些峰的较好代表，以及化合物更强的多样性；此外，其与传统红茶和绿茶制剂相比，具有浓度高很多的L-茶氨酸。总之，PurecentiaTM山茶比传统红茶和绿茶制剂具有高很多的浓度，且包含更多组分。PurecentiaTM山茶的活性比效能最佳的检测的市售绿茶饮料高超过20倍，且甚至5％的PurecentiaTM山茶饮料原型超过了每个检测的市售饮料。这说明PurecentiaTM山茶可能成为向现有饮料中添加抗氧化剂活性的有效成分，或者用其作为基础活性成分来制作功能性饮料。化妆品成分CS在个人护理凝胶原型中保留了其抗氧化剂活性，并且有助于保持该制剂中其它组分的抗氧化剂活性。
实施例23的参考文献
以下是实施例23中引用的参考文献：
[1]Howard A.Epstein.The challenges of formulating“beauty from within”products for skincare.Monographic supplement series：Anti-Aging&BeautyInside.Household and Personal care Today n1/2012&AgroFOOD Industry hi-techvol 23n 1January/February 2012，pp.23-2；
[2]Lesley E.Rhodes，Gemma Darby，Karen A.Massey，Kayleigh A.Clarke，Tristan P.Dew，Mark D.Farrar，Susan Bennett，Rachel E.B.Watson，Gary Williamsonand Anna Nicolaou.Oral green tea catechin metabolites are incorporated intohuman skin and protect against UV radiation-induced cutaneous inflammation inassociation with reduced production of pro-inflammatory eicosanoid 12-hydroxyeicosatetraenoic acid.British Journal of Nutrition，available on CJO2013.doi：10.1017/S0007114512006071；
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[9]www.livestrong.com/article/103022-benefits-using-l-theanine/.
本文引用的文献不应当被认为是承认所述文献是本发明的现有技术。本文引用的所有文献都整体引入作为参考。
尽管本文已经详细描述了优选的实施方案，但对于本领域技术人员而言很清楚的是，可以在不偏离本发明的主旨的情况下进行多种修改、添加、替代等，因此，这些修改、添加、替代等被视为涵盖于下文的权利要求所定义的本发明范围之内。

Claims (54)

1.生物活性组合物，其包含：
来自茶科植物的分离的生物活性部分，其中所述生物活性部分是选自细胞壁部分、细胞壁部分的提取物、膜部分、膜部分的提取物、细胞质部分、细胞质部分的提取物、细胞汁液、和其组合。
2.如权利要求1中所述的生物活性组合物，其中所述生物活性部分是细胞壁部分。
3.如权利要求1中所述的生物活性组合物，其中所述生物活性部分是细胞壁部分的提取物。
4.如权利要求3中所述的生物活性组合物，其中所述细胞壁部分的提取物包含每克干物质约2.1至约4.5毫克的总儿茶素含量。
5.如权利要求3中所述的生物活性组合物，其中所述细胞壁部分的提取物具有如下儿茶素含量谱，包括：
每克细胞壁部分的提取物干物质约2.0至约3.0毫克(+)-儿茶素，
每克细胞壁部分的提取物干物质约0.005至约0.02毫克(-)-表儿茶素，
每克细胞壁部分的提取物干物质约0.005至约0.02毫克(-)-表没食子酸儿茶素没食子酸酯，且
每克细胞壁部分的提取物干物质约0.003至约0.01毫克(-)-表儿茶素没食子酸酯。
6.如权利要求1中所述的生物活性组合物，其中所述生物活性部分是膜部分。
7.如权利要求1中所述的生物活性组合物，其中所述生物活性部分是膜部分的提取物。
8.如权利要求7中所述的生物活性组合物，其中所述膜部分的提取物包含每克干物质约15.0至约30.5毫克的总儿茶素含量。
9.如权利要求7中所述的生物活性组合物，其中所述膜部分的提取物具有如下儿茶素含量谱，包括：
每克膜部分的提取物干物质约1.7至约3.3毫克(-)-表没食子酸儿茶素，
每克膜部分的提取物干物质约6.1至约10.2毫克(+)-儿茶素，
每克膜部分的提取物干物质约0.3至约1.1毫克(-)-表儿茶素，
每克膜部分的提取物干物质约6.2至约12.5毫克(-)-表没食子酸儿茶素没食子酸酯，
每克膜部分的提取物干物质约0.007至约0.03毫克(-)-没食子儿茶酸没食子酸酯，且
每克膜部分的提取物干物质约1.3至约3.3毫克(-)-表儿茶素没食子酸酯。
10.如权利要求1中所述的生物活性组合物，其中所述生物活性部分是细胞质部分。
11.如权利要求1中所述的生物活性组合物，其中所述生物活性部分是细胞质部分的提取物。
12.如权利要求1中所述的生物活性组合物，其中所述生物活性部分是细胞汁液。
13.如权利要求12中所述的生物活性组合物，其中所述细胞汁液包含每克干物质约8.0至约20.0毫克的总儿茶素含量。
14.如权利要求12中所述的生物活性组合物，其中所述细胞汁液具有如下儿茶素含量谱，包括：
每克细胞汁液干物质约2.1至约4.4毫克(-)-表没食子酸儿茶素，
每克细胞汁液干物质约4.2至约8.6毫克(+)-儿茶素，
每克细胞汁液干物质约0.2至约2.0毫克(-)-表儿茶素，
每克细胞汁液干物质约1.2至约3.2毫克(-)-表没食子酸儿茶素没食子酸酯，
每克细胞汁液干物质约0.01至约0.1毫克(-)-没食子儿茶酸没食子酸酯，且
每克细胞汁液干物质约0.2至约1.3毫克(-)-表儿茶素没食子酸酯。
15.如权利要求1中所述的生物活性组合物，其中所述茶科植物是山茶属植物或柃属植物。
16.如权利要求15中所述的生物活性组合物，其中所述山茶属植物是选自山茶(Camellia sinensis)、山茶(Camellia japonica)、滇山茶(Camellia reticulate)和茶梅(Camellia sasanqua)。
17.如权利要求15中所述的生物活性组合物，其中所述柃属植物是夏威夷柃(Euryasandwicensis)。
18.如权利要求1中所述的生物活性组合物，其进一步包含稳定剂。
19.如权利要求18中所述的生物活性组合物，其中所述稳定剂是选自乳化剂、防腐剂、抗氧化剂、聚合物基质、和其混合物。
20.适合于哺乳动物局部应用的生物活性的局部制剂，所述生物活性的局部制剂包含：
局部有效量的如权利要求1中所述的生物活性组合物，和
局部可接受的载体。
21.如权利要求20中所述的生物活性的局部制剂，其中局部可接受的载体是选自亲水性霜基质、亲水性洗剂基质、亲水性表面活性剂基质、亲水性凝胶基质、亲水性溶液基质、疏水性霜基质、疏水性洗剂基质、疏水性表面活性剂基质、疏水性凝胶基质和疏水性溶液基质。
22.如权利要求20中所述的生物活性的局部制剂，其中生物活性组合物是以生物活性局部制剂总重的0.001％至约90％的量存在。
23.包含至少一种如权利要求1中所述的生物活性组合物的饮料。
24.如权利要求23中所述的饮料，其中所述饮料包含分散于液体中的所述至少一种生物活性组合物。
25.如权利要求24中所述的饮料，其中所述液体是选自水、小杯饮料、功能性饮料、绿茶、乌龙茶、红茶、白茶、调味茶、软饮料、咖啡、牛奶、奶昔、酒精饮料、无酒精饮料、运动饮料、果汁、蔬菜汁、人工增甜果汁、汽水、混合甜饮料、苹果酒和营养补充饮料。
26.如权利要求23中所述的饮料，其中所述茶科植物是山茶属植物或柃属植物。
27.如权利要求26中所述的饮料，其中所述山茶属植物是选自山茶(Camelliasinensis)、山茶(Camellia japonica)、滇山茶(Camellia reticulate)和茶梅(Camelliasasanqua)，且其中所述柃属植物是夏威夷柃(Eurya sandwicensis)。
28.包含至少一种如权利要求1中所述的生物活性组合物的治疗性饮料。
29.如权利要求28中所述的治疗性饮料，其中所述饮料包含分散于液体中的所述至少一种生物活性组合物。
30.如权利要求29中所述的治疗性饮料，其中所述液体是选自水、小杯饮料、功能性饮料、绿茶、乌龙茶、红茶、白茶、调味茶、软饮料、咖啡、牛奶、奶昔、酒精饮料、无酒精饮料、运动饮料、果汁、蔬菜汁、人工增甜果汁、汽水、混合甜饮料、苹果酒和营养补充饮料。
31.如权利要求28中所述的饮料，其中所述茶科植物是山茶属植物或柃属植物。
32.如权利要求31中所述的饮料，其中所述山茶属植物是选自山茶(Camelliasinensis)、山茶(Camellia japonica)、滇山茶(Camellia reticulate)和茶梅(Camelliasasanqua)，且其中所述柃属植物是夏威夷柃(Eurya sandwicensis)。
33.包含至少一种如权利要求1中所述的生物活性组合物的营养产品。
34.如权利要求33中所述的营养产品，其中所述茶科植物是山茶属植物或柃属植物。
35.如权利要求34中所述的营养产品，其中所述山茶属植物是选自山茶(Camelliasinensis)、山茶(Camellia japonica)、滇山茶(Camellia reticulate)和茶梅(Camelliasasanqua)，且其中所述柃属植物是夏威夷柃(Eurya sandwicensis)。
36.包含至少一种如权利要求1中所述的生物活性组合物的功能性食品。
37.如权利要求36中所述的功能性食品，其中所述茶科植物是山茶属植物或柃属植物。
38.如权利要求37中所述的功能性食品，其中所述山茶属植物是选自山茶(Camelliasinensis)、山茶(Camellia japonica)、滇山茶(Camellia reticulate)和茶梅(Camelliasasanqua)，且其中所述柃属植物是夏威夷柃(Eurya sandwicensis)。
39.将来自茶科植物的至少一种生物活性组合物分散于液体中以制备饮料的装置，所述装置包括：
包含半透膜的过滤包或袋；以及
装在该过滤包或袋中的至少一种如权利要求1中所述的生物活性组合物。
40.如权利要求39中所述的装置，其中所述液体是选自水、小杯饮料、功能性饮料、绿茶、乌龙茶、红茶、白茶、调味茶、软饮料、咖啡、牛奶、奶昔、酒精饮料、无酒精饮料、运动饮料、果汁、蔬菜汁、人工增甜果汁、汽水、混合甜饮料、苹果酒和营养补充饮料。
41.如权利要求39中所述的装置，其中所述饮料是治疗性饮料。
42.如权利要求39中所述的装置，其中所述茶科植物是山茶属植物或柃属植物。
43.如权利要求42中所述的功能性食品，其中所述山茶属植物是选自山茶(Camelliasinensis)、山茶(Camellia japonica)、滇山茶(Camellia reticulate)和茶梅(Camelliasasanqua)，且其中所述柃属植物是夏威夷柃(Eurya sandwicensis)。
44.制备饮料的方法，所述方法包括步骤：
提供如权利要求39中所述的装置；
将该装置与液体在有效地将装置中的至少一种生物活性组合物分散于液体中的条件下接触，由此获得包含所述至少一种生物活性组合物的饮料。
45.如权利要求44所述的方法，其中所述装置与液体在有效引起所述至少一种生物活性组合物的低分子量和还原的、非氧化的组分分散于液体中的条件下接触。
46.如权利要求44所述的方法，其中所述液体是选自水、小杯饮料、功能性饮料、绿茶、乌龙茶、红茶、白茶、调味茶、软饮料、咖啡、牛奶、奶昔、酒精饮料、无酒精饮料、运动饮料、果汁、蔬菜汁、人工增甜果汁、汽水、混合甜饮料、苹果酒和营养补充饮料。
47.如权利要求44所述的方法，其中所述饮料是治疗性饮料。
48.如权利要求44所述的方法，其中所述茶科植物是山茶属植物或柃属植物。
49.如权利要求48中所述的方法，其中所述山茶属植物是选自山茶(Camelliasinensis)、山茶(Camellia japonica)、滇山茶(Camellia reticulate)和茶梅(Camelliasasanqua)，且其中所述柃属植物是夏威夷柃(Eurya sandwicensis)。
50.用于全身或局部施用来自茶科植物的至少一种生物活性组合物的制剂，所述制剂包括：
包含至少一种如权利要求1中所述的生物活性组合物的溶液、混悬液、分散剂、糊剂或干燥粉末。
51.如权利要求50中所述的制剂，其中所述茶科植物是山茶属植物或柃属植物。
52.如权利要求51中所述的制剂，其中所述山茶属植物是选自山茶(Camelliasinensis)、山茶(Camellia japonica)、滇山茶(Camellia reticulate)和茶梅(Camelliasasanqua)，且其中所述柃属植物是夏威夷柃(Eurya sandwicensis)。
53.如权利要求50中所述的制剂，其中所述制剂包括用于与液体混合而产生功能性饮料的干燥粉末。
54.如权利要求50中所述的制剂，其中所述制剂包括用于与液体混合而产生功能性饮料的至少一种生物活性组合物的浓缩溶液。
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