CN107072944B - 具有抗非结核分枝杆菌活性的脂质体环丙沙星制剂 - Google Patents

Abstract

采用脂质体环丙沙星的制剂来治疗NTM肺部感染的方法。公开了特定脂质体制剂及其用于治疗呼吸道感染和其它身体状况的递送，以及与之联用的装置和制剂。

Description

具有抗非结核分枝杆菌活性的脂质体环丙沙星制剂

政府权利

本发明在国立卫生研究院(National Institutes of Health)的国家过敏和传染病研究所(National Institutes of Allergy and Infectious Disease)授予的小型企业创新研究基金1R43-AI-106188-01的政府资助下完成。政府享有本发明的某些权利。

发明领域

本发明涉及供于吸入的、脂质体环丙沙星的药物组合物，用以预防或治疗由多种微生物或胞内病原体，尤其是非结核分枝杆菌(NTM)所致的呼吸道感染。

发明背景

呼吸道感染可由多种微生物所致。对于卫生保健团体而言，顽固的感染会产生大量后果，包括增加的治疗负担和成本，而对于患者而言则为更具侵袭性的治疗模式，以及严重疾病甚至死亡的可能性。如果存在一种改善的治疗模式，其能够提供预防性治疗来预防易感患者患上呼吸道感染，并且对于已被微生物感染的患者而言，增加根除的速率和有效性，那么将会是有益的。

众所周知，非结核分枝杆菌(NTM)的肺部感染难以治疗。它们以多种形式存在于肺中，包括巨噬细胞内和生物膜内。抗生素特别难以触及这些位置。此外，NTM还可以处于静止(称为固着)或复制期，从而，有效的抗生素治疗将要靶向这两个时期。我们吃惊地发现，包含脂质体中包封的环丙沙星的某些环丙沙星组合物针对巨噬细胞中聚留的NTM和静止存在于生物膜中的NTM的抗细菌活性是有效的。

鸟分枝杆菌(Mycobacterium avium)候米瑟氏(hominissuis)亚种(后文称作鸟分枝杆菌(M.avium))和脓肿分枝杆菌(Mycobacterium abscessus)(后文称脓肿分枝杆菌)的肺部感染是严重的医疗卫生问题，并且在目前的疗法中存在很大的限制。由NTM造成的肺部感染的发生率正在增长(Adjemian等，2012；Prevots等，2010)，尤其是因鸟分枝杆菌和脓肿分枝杆菌所致(Inderlied等，1993)。美国有约80％的NTM与鸟分枝杆菌相关联(Adjemian等，2012；Prevots等，2010)。脓肿分枝杆菌，其在最具毒力的类型之中发病率排列第二(Prevots等，2010)。由这两种分枝杆菌所致的疾病在具有慢性肺部病症，例如，肺气肿、囊性纤维化和支气管扩张的患者中常见(Yeager和Raleigh，1973)。它们还可引起严重呼吸疾病，例如，支气管扩张(Fowler等，2006)。所述感染来自环境来源，并且对肺造成渐进性损害。现有治疗通常在功效上不理想，或与显著的副作用相关联。鸟分枝杆菌感染通常采用大环内酯(克拉霉素)或氮杂红霉素(阿奇霉素)联合乙胺丁醇和阿米卡星的全身疗法来治疗。口服或静脉(IV)喹诺酮，例如环丙沙星和莫西沙星，可与其它化合物联用(Yeager和Raleigh，1973)，但需要较高的胞内药物水平来实现最大功效。口服环丙沙星仅在与大环内酯或氨基糖苷联合给予时具有针对鸟分枝杆菌的临床功效(Shafran等1996；de Lalla等，1992；Chiu等，1990)。体外和小鼠内研究表明，仅口服环丙沙星的受限活性与环丙沙星无法在感染位置处达到杀细菌浓度相关(Inderlied等，1989)；5μg/ml的最小抑制浓度(MIC)对比4μg/ml的临床血清C_最大解释了实验模型和人类中有限的功效(Inderlied等，1989)。脓肿分枝杆菌常对克拉霉素具有抗性。需要施用静脉氨基糖甙类或亚胺培南，其通常是唯一可用的治疗可选方式，并且这些携载着严重副作用的可能，以及与静脉给予相关联的创伤和成本。有时也规定氯法齐明、利奈唑胺和头孢西丁，但用于静脉给予的毒性和/或需求限制了这些化合物的应用。因此，可用的疗法具有显著的缺陷，从而需要改良的方案。

近期研究也显示，鸟分枝杆菌和脓肿分枝杆菌感染均与显著的生物膜形成相关联(Bermudez等，2008；Carter等，2003)：在实验动物模型中，鸟分枝杆菌中与生物膜相关联的基因的删除对于细菌形成生物膜和造成肺部感染的能力具有影响(Yamazaki等，2006)。

环丙沙星是广谱氟喹诺酮抗生素，其针对若干其它类型的革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌具有活性，从而指示用于下呼吸道感染的口服和静脉治疗。其通过抑制拓扑异构酶II(DNA旋转酶)和拓扑异构酶IV来发挥作用，上述酶是细菌的复制、转录、修复和重组所需的酶。该作用机理与青霉素、头孢菌素、氨基糖甙类、大环内酯类和四环素不同，因此，对于这些类别的药物具有抗性的细菌可能对环丙沙星易感。目前在喹诺酮(环丙沙星所属的抗微生物剂类别)和其它类别的抗微生物剂之间还没有已知的交叉抗性。

尽管它有吸引人的抗微生物性质，环丙沙星确实会产生麻烦的副作用，例如GI不耐症(呕吐、腹泻、腹部不适)，以及头晕、失眠、应激和增加的焦虑水平。明确需要可长期使用而不会导致这些使人衰弱的副作用的改良的治疗方案。

以吸入气溶胶形式递送环丙沙星，通过划分所述药物在呼吸道(感染的主要位置)中的递送和作用，而具有解决这些担忧中的一些的潜力。目前，还没有经监督管理批准的用于人类应用的气溶胶化形式的环丙沙星能够将抗生素直接靶向递送至主要感染区域。这部分是因为该药物的较差溶解性和苦味抑制了适于吸入的制剂的开发；患有气道疾病的许多患者在吸入未经脂质体包封的抗生素时可能会咳嗽或支气管狭窄(Barker等，2000)。此外，环丙沙星的组织分布极为快速，致使肺中的药物停留时间过短，以无法提供口服或静脉途径给予药物以外的附加治疗益处(Bergogne-Bérézin E，1993)。

通过纳入脂质体，许多药物的治疗性质得到了改善。作为药物递送系统，在1965年重新发现磷脂载剂作为“脂质体”(Bangham等，1965)。通用术语“脂质体”涵盖了多种结构，但其均由一种或多种脂质双层组成，封闭出一水性空间，其中亲水性药物，例如环丙沙星，可被包封。脂质体包封通过多种机理改善了生物药学特性，包括改变的药物药代动力学和生物分布、从该运载体的持续药物释放、对于疾病位置增强的递送，和，保护活性药物物质不被降解。如下物质的的脂质体制剂：抗癌剂阿霉素

道诺霉素

抗真菌剂两性霉素B

和苯并卟啉

是在过去20年引入美国、欧洲和日本市场的成功产品的示例。近期，长春新碱

的脂质体制剂经批准用于肿瘤学指示。基于脂质的运载体的已证安全性和功效使其成为用于药学制剂的吸引人的候选物。

因此，相比现有的环丙沙星制剂，脂质体环丙沙星气溶胶制剂应具有如下数项益处：1)较高的药物浓度，2)通过感染位置处的持续释放实现的增长的药物停留时间，3)减少的副作用，4)增加的适口性，5)进入细菌生物膜的较好透过性，和6)进入被细菌感染的细胞的较好透过性。

在本发明的一个示例中，包封环丙沙星的脂质体是单层载剂(平均粒径75-120nm)。环丙沙星以约10小时的半衰期在肺中从这些脂质体缓慢释放(Bruinenberg等，2010b)，这允许一天一次的给药。此外，在体外和鼠类感染模型中进行的，采用多种脂质体组合物的研究显示，脂质体环丙沙星有效抵抗数种胞内病原体，包括鸟分枝杆菌。吸入型脂质体环丙沙星也有效治疗患者中的铜绿假单胞菌(PA)肺部感染(Bilton等，2009a、b，2010，2011；Bruinenberg等，2008，2009，2010a、b、c、d，2011；Serisier等，2013)。

相比批准的口服和静脉环丙沙星剂量，通过吸入进入气道递送的脂质体环丙沙星制剂达到了呼吸道粘膜中和巨噬细胞中的高得多的浓度，并伴随获得如下临床功效的改善：在患者中，吸入我们的脂质体环丙沙星的治疗剂量之后2小时，痰液中的环丙沙星浓度超过200μg/ml，并且，甚至在20小时后(下一次给药之前2小时)，其浓度>20μg/ml，远高于上述用于抵抗分枝杆菌(约4μg/ml的断点(Bruinenberg 2010b))的最小抑制浓度。因为包含环丙沙星的脂质体被巨噬细胞竭力吞噬，使得环丙沙星得以达到胞内病原体的紧密附近，所以进一步增加了抗分枝杆菌浓度，因此该吸入型脂质体制剂相对于环丙沙星的其它形式而言应能获得改善的功效。因此，我们认为，采用我们的吸入型脂质体环丙沙星甚至能抑制高抗性NTM。这极具意义，因为在这些患者长期应用全身抗生素，已常见鸟分枝杆菌和脓肿分枝杆菌对于抗生素的抗性。我们采用绿脓假单胞菌(P.aeruginosa(PA))的临床实践也显示，在吸入型脂质体环丙沙星治疗之后，没有明显的抗性产生：事实上，甚至在初始时已经具有抗性菌株的那些患者均对治疗有良好响应(Serisier等，2013)。这可能归因于持续的压倒性浓度的环丙沙星的存在。此外，在患有囊性纤维化的患者中采用其它抗假单胞菌性药物妥布霉素和多粘菌素的实践显示，甚至具有PA抗性菌株的患者也对所述吸入形式的药物临床响应良好(Fiel，2008)。

数项体外研究已显示，脂质体环丙沙星有效抵抗胞内病原体：1)在人类外周血单核细胞/巨噬细胞中，测试的浓度为0.1-5μg/ml的脂质体环丙沙星，相比相同浓度的游离药物，造成了胞内鸟分枝杆菌-细胞内分枝杆菌复合物(MAC)集落形成单位(CFU)的浓度相关减少(Majumdar等，1992)；2)在鼠类巨噬细胞样细胞系J774中，脂质体环丙沙星使细胞相关的鸟分枝杆菌的水平减少高达43倍，并且这些减少大于游离环丙沙星的结果(Oh等，1995)。

一旦鸟分枝杆菌或脓肿分枝杆菌感染单核细胞/巨噬细胞，该感染可随后扩散至肺、肝、脾、淋巴结、骨髓和血液。对于动物模型中脂质体环丙沙星抵抗鸟分枝杆菌或脓肿分枝杆菌的功效还没有公开的研究。

少数体内研究已显示，脂质体环丙沙星有效抵抗胞内病原体土拉弗朗西斯菌：采用少至单一剂量的脂质体环丙沙星，在小鼠中证明了通过吸入或鼻内滴注递送至肺的脂质体环丙沙星抵抗吸入性兔热病(土拉弗朗西斯菌活疫苗菌株(LVS)和Schu S4)的功效，其提供100％的接触后保护，并且甚至对于已经具有显著的全身感染的动物具有有效的接触后治疗(Blanchard等，2006；Di Ninno等，1993；Conley等，1997；Hamblin等，2011；Hamblin等，2014；Wong等，2003)。这些研究还发现，吸入型脂质体环丙沙星优于吸入和口服的未包封的环丙沙星。

不同的是，a)在分枝杆菌感染的巨噬细胞模型中，游离环丙沙星不如脂质体环丙沙星(Majumdar等，1992；Oh等，1995)；b)在土拉弗朗西斯菌感染的鼠模型中测试时，递送至肺的单独的游离环丙沙星的功效不如游离环丙沙星(Conley等，1997；Wong等，2003)，因为其被迅速吸收进入血流。由游离环丙沙星和脂质体环丙沙星两者制成的制剂结合了游离环丙沙星的初始瞬时高浓度的潜在优势，以增加肺中的C_最大，随后是环丙沙星从脂质体组分的缓释，这由阿拉迪姆公司(Aradigm)在非CF支气管扩张患者中得到证实(Cipolla等，2011；Serisier等，2013)。游离环丙沙星组分还具有希望的免疫调节作用(美国专利号8,071,127、8,119,156、8,268,347和8,414,915)。

此外，胃肠外注射的脂质体环丙沙星能活化巨噬细胞，甚至在低于抑制水平的浓度下也能导致增加的吞噬作用、一氧化氮产量，和胞内微生物杀灭作用，这可能是通过免疫刺激作用所致(Wong等，2000)。载有环丙沙星的巨噬细胞可能会从肺迁移进入淋巴，以治疗肝、脾和骨髓中的感染–由肺部-递送的CFI在兔热病中的全身作用所表明(Di Ninno等，1993；Conley等，1997；Hamblin等，2011；Hamblin等，2014；Wong等，2003)。已知脂质体-包封的抗生素能够较好地透过由铜绿假单胞菌在肺中形成的细菌膜(Meers等，2008)。然而，之前从未显示一般载有抗生素的脂质体，或脂质体包封的环丙沙星，能够透过由肺中的分枝杆菌(尤其是NTM)形成的生物膜。因此，递送至肺的新型制剂的抗分枝杆菌和免疫调节作用可提供用于被鸟分枝杆菌或脓肿分枝杆菌感染的患者的现有治疗的更好替代方式，或者，如果该抗生素制剂有效抵抗，浮游型以及处于生物膜和巨噬细胞中的这些生物体，则提供对于增进改善的附加作用。还要求抗生素治疗在通过吸入给予时具有良好耐受性和安全性。鉴于现有的抗生素治疗选项常常造成严重的全身副作用，希望获得新的疗法，以采用较低毒性的抗生素，并使其在循环中的浓度最小化以避免全身副作用。

一项关于脂质体环丙沙星的研究证实了动物中通过肺泡巨噬细胞的高摄取，这大概也是小鼠中吸入性兔热病的高度有效的接触后预防和治疗的原因。尽管在呼吸道给予我们的脂质体环丙沙星之后，环丙沙星的血浆水平较低，观察到肝、脾、气管支气管淋巴结以及肺中的兔热病感染的减少，表明载有脂质体环丙沙星的肺泡巨噬细胞通过淋巴从肺迁移进入肝、脾和淋巴结(未检测骨髓和血液中的土拉弗朗西斯菌CFU水平)(Conley等，1997)。

发明内容

现有的临床模式是采用口服或通过静脉给予的联合疗法来治疗患有鸟分枝杆菌或脓肿分枝杆菌肺部感染的患者。但是，如上所述，现有的治疗方法具有许多问题，并且功效不佳。本发明的制剂是吸入型脂质体环丙沙星制剂，其对于NTM患者具有改善的功效，并且允许每天一次吸入，其可与其它疗法相联合。本发明的吸入型脂质体环丙沙星提供针对鸟分枝杆菌散播性感染的全身治疗，其与其它抗生素协同作用，并在肺中达到高浓度。可发生巨噬细胞摄取的脂质体环丙沙星通过淋巴向脾和肝的运输，如在土拉弗朗西斯菌鼠模型中观察到的那样。

治疗非结核分枝杆菌感染的方法包括：

使一剂量的制剂气溶胶化，以产生气溶胶化的颗粒，该颗粒的气动学直径在1微米-12微米，或2微米-10微米，或4微米-8微米范围内；和

将该气溶胶化的颗粒吸入患者的肺，大约一天一次，持续约7到56天或直至感染被根除。

该制剂包含抗感染药物，其可以是环丙沙星。该制剂可包括液体运载体，其可以是液体药物或惰性液体例如水或乙醇。所述运载体可具有溶解或分散于其中的药物。

所述运载体将具有分散于其中的脂质体，并且所述脂质体包封具有抗感染药学活性的药物的纳米晶体，所述药物可以是环丙沙星。所述脂质体包含脂质双层，其初始包封运载体和药物的溶液，随后冷冻至-20℃～-80℃，然后融化，从而药物纳米晶体保留在脂质体双层的内部。

所述脂质体可包含冷冻保护剂和表面活性剂。冷冻保护剂可以是多元醇，例如蔗糖或海藻糖。表面活性剂是非离子去污剂，其可以是聚山梨醇酯20和/或BRIJ 20。

本发明还包括用于治疗非结核分枝杆菌的制剂的应用，其中，所述制剂通过特定方法产生，由此药物(例如环丙沙星)以25mg/mL或更高、50mg/mL或更高、100mg/mL或更高、200mg/mL或更高的范围内的浓度溶解于水性溶液中，并且被包封进入脂质体的脂质双层。然后，可将所述脂质体纳入溶液中，该溶液可包括抗感染剂，该抗感染剂可与包封在该脂质体内的抗感染化合物(且例如可以是环丙沙星)相同或不同。该制剂经冷冻，例如，在-20℃～-80℃范围内的极低温度下被冷冻。该冷冻制剂可长期维持冷冻状态以供储存，例如一周或更久，一个月或更久，一年或更久，或者可以立即再融化以供使用。脂质体内的药物再融化之后形成纳米晶体。在给予溶解于溶剂中的药物之后，脂质体周围的运载体提供药物即释，随后，当脂质体溶解于肺中时，药物被释放，随后，当纳米晶体溶解时，药物进一步被释放。该制剂提供抗感染药物(例如环丙沙星)在肺中的长时间控释，由此使其能够有效地根除以生物膜形式出现的感染。

直接递送该制剂至肺的脂质体中环丙沙星的包封的组合使这些治疗在生物分布、药物动力学以及改善的安全性和功效方面本质上不同于环丙沙星和其它抗生素的口服和胃肠外产品。该脂质体-包封的环丙沙星以极高浓度直接递送至呼吸道，其在彼处停留一段延长的时间，在此期间，环丙沙星从脂质体缓慢释放至肺中的感染位置，并且相较于口服或静脉环丙沙星而言具有较低的全身暴露度。

设计脂质体环丙沙星制剂的大小和组成，以促进在肺中被巨噬细胞摄取。最重要的特征是，该制剂应对雾化工艺稳健，从而脂质体能够保留其大小和包封特点。如果脂质体对气溶胶化不稳健，那么可能会出现包封的药物的损失，或者脂质体大小或表面特点的变化。这些变化或尚未述及的其它因素可能会导致巨噬细胞对脂质体的较低摄取。在雾化或气溶胶化过程中损失其包封的药物的部分的脂质体，即便它们以与未受影响的脂质体相同的效率被脂质体摄取，也会因为具有较少的包封药物，以至于处理巨噬细胞和生物膜中的感染性物质的负载量较低，由此降低治疗功效。

本发明涵盖的一种脂质体具体组成相对不受雾化加工影响，并且已描述于美国专利号8,071,127、8,119,156、8,268,347和8,414,915。那些专利描述了吸入型液滴或颗粒的可气溶胶化的、双相气溶胶。所述液滴或颗粒包含游离药物(例如，抗感染化合物)，其中，药物不被包封，并且其可以是环丙沙星。所述颗粒还包含脂质体，该脂质体包封药物(例如，抗感染化合物，其也可以是环丙沙星)。游离药物和脂质体包封的药物被包含在药学上可接受的赋形剂之内，该赋形剂经配制用于气溶胶化的递送。所述颗粒还可包括其它治疗剂，其可以是游离的和/或处于脂质体中，并且，其可以是不同于第一药物的任何具有药学活性的药物。

其它脂质体组合物包括通过雾化改性的那些，这导致囊泡大小变化，或药物包封，或两者。这些包括含有药物(例如阿米卡星)的脂质体，其已描述于美国专利号8,226,975、8,642,075、8.673.348、8,673,349，和美国专利申请：2007196461、20130028960、20130052260、20130064883、20130071469、20130087480、20130330400、20140072620。美国专利申请20130330400特别描述了阿米卡星的脂质体制剂，其受雾化影响，从而仅58-73％的药物在接触雾化之后仍被包封。在该申请，美国专利申请20130330400中，平均囊泡大小也受雾化加工的影响，其从雾化前的平均285nm减小至雾化后的265nm(范围：249-289nm)。美国专利申请20140072620也描述了脂质体阿米卡星制剂，其在雾化后被降级成60％包封药物和40％的游离药物。

与本发明联用的脂质体，相对于在雾化之前包封的情况，在雾化之后保留80％或更多，且优选90％或更多，且最优选95％或更多的包封的药物。如果在雾化过程中从脂质体损失了显著量的药物，例如，大于20％的包封的药物，那么在脂质体被巨噬细胞摄取的过程中，假设其被设计进入脂质体的特征集，那么将会有较少的包封的药物被释放进入巨噬细胞，由此影响体内功效。这在将对胞内感染产生活性的脂质体制剂的能力中是一项关键要素。即便是经过体外或体内研究且能够在那些模型中展现功效的制剂，在实践情况中，该制剂首先要被雾化或气溶胶化，因此，除非该制剂以气溶胶形式(这并不典型)使用，或者已经进行了其它研究以验证在气溶胶化之后保留的脂质体的完整性，否则无法确保在该模型中的结果的有效性。

肺泡巨噬细胞是鸟分枝杆菌和脓肿分枝杆菌(Jordao等，2008)以及其它分枝杆菌物种的靶标。巨噬细胞竭力摄入脂质体环丙沙星和分枝杆菌，在吞噬体中使两者紧密邻近。这种在感染的靶标(肺中的肺泡巨噬细胞)处的生物可及性上的增加，提供了对比全身递送的环丙沙星或其它抗分枝杆菌剂而言的，改善的功效。环丙沙星从脂质体的持续释放还能，具体地，增加肺和巨噬细胞中的曲线下面积与MIC之比(AUC/MIC)，并且允许每天一次给药。这些制剂的给予提供了较低的复发率和减小的负面全身作用。

本发明的方面是吸入的液滴或颗粒的气溶胶。所述液滴或颗粒包含游离药物(例如，抗感染化合物)，其中药物不被包封，并且所述药物可以是环丙沙星。所述颗粒还包含脂质体，其包封药物，例如，抗感染化合物，所述药物也可以是环丙沙星。游离药物和脂质体包封的药物被包括在药学上可接受的赋形剂中，其经配制用于气溶胶化递送。所述颗粒还可包括其它治疗剂，其可以是游离的和/或处于脂质体中，并且，其可以是不同于第一药物的任何具有药学活性的药物。

本发明的另一方面是包含脂质体的制剂，其通过气溶胶递送至患有NTM感染的人类患者的肺，或用以预防NTM感染，所述脂质体包含游离的和包封的环丙沙星。所述脂质体可以是单层的或多层的。所述气溶胶化可通过雾化，包括射流雾化或网雾化来实现。包封的环丙沙星处于脂质体中，其对雾化工艺稳健，并在雾化之后保持其包封状态至大于90％，且优选在雾化之后保持其包封状态大于95％。

本发明的第三方面是用于治疗患者中的胞内感染的方法，所述方法包括：给予所述患者包含所述抗感染剂(例如，包封在脂质体中的环丙沙星)的制剂。该制剂优选通过吸入法给予所述患者，且更优选通过雾化。胞内感染可表示NTM感染，包括脓肿分枝杆菌(M.abscessus)，鸟分枝杆菌(M.avium)，鸟分枝杆菌复合群(M.avium complex)，(MAC)(鸟分枝杆菌和细胞内分枝杆菌(M.avium和M.intracellulare))，博氏分枝杆菌(M.Bolletii)，龟分枝杆菌(M.chelonae)，溃疡分枝杆菌(M.ulcerans)，蟾分枝杆菌(M.xenopi)，堪萨斯分枝杆菌(M.kansasii)，偶发分枝杆菌复合群(M.fortuitum complex)(偶发分枝杆菌和龟分枝杆菌(M.fortuitum和M.chelonae))或海鱼分枝杆菌(M.marinum)感染。

本发明的第四方面是，所述脂质体抗感染制剂，优选脂质体环丙沙星制剂，在气溶胶化且递送至气道和肺部深处后，可被巨噬细胞摄取的能力，且，具有杀灭复制性和非复制性(固着的)分枝杆菌的能力。就NTM的成功治疗而言，所需的是所述治疗既杀灭复制性分枝杆菌又杀灭静止(或固着的)分枝杆菌，应为这两种形成均见于分枝杆菌感染。

本发明的第五方面是，对于最大有效性的治疗而言，所述抗生素制剂还需能够透过分枝杆菌形成的生物膜。

本发明的第六方面是，合适载剂中的抗生素不仅能够透过所述生物膜，而且针对固着的(静止的)和复制性分枝杆菌均具有功效。

本发明的另一方面是，所述抗生素不增强分枝杆菌生物膜在肺中的形成。具体地，鸟分枝杆菌形成生物膜，这是与通过气溶胶形成肺部感染的小鼠中的状况。将鸟分枝杆菌与环境中发现的两种抗生素，链霉素和四环素孵育，导致生物模形成的增加而非减少。其它抗生素，包括氨苄青霉素、莫西沙星、利福平和TMP/SMX，对于生物膜无作用；即，它们无法杀灭鸟分枝杆菌。莫西沙星是一种氟喹诺酮，类似环丙沙星。因此，令人吃惊的是，本发明的特定脂质体环丙沙星制剂有效杀灭生物膜中的分枝杆菌。注意到，即便抗生素能够杀灭分枝杆菌的所有浮游生物表型，浮游的细菌和固着的细菌均能够等同地建立感染，确保剩余的固着细菌再次感染宿主。患有慢性肺部病症的许多患者采用抗生素(例如氨基糖甙类或四环素)治疗由多种病原体所致的感染。因此，在鸟分枝杆菌定殖于接受抗生素(不论预防抑或治疗)的个体的情况中，其可能会导致产生增加量的生物膜，并且进一步建立感染。

根据本发明的另一方面，同时包含游离抗感染剂和包封的抗感染剂的制剂在肺中提供初始高治疗水平的抗感染剂，同时维持抗感染剂随时间的持续释放，以攻破所述屏障，从而根除治疗生物膜细菌方面的困难。因此，即刻-释放抗感染剂(例如，环丙沙星)的目的是使肺部难以根除的生物膜细菌周围的抗生素浓度快速增加至治疗水平，以克服抗生素向生物膜和在生物膜中扩散速率较低的问题。缓释抗感染剂(例如，环丙沙星)的作用是，在肺部保持治疗水平的抗生素，由此提供较长时间范围内的持续的治疗，增加功效、降低给予频率，并减小形成耐药集落的可能性。抗感染剂从本发明脂质体的持续释放能够确保该抗感染剂从不减少到低于抑制水平(sub-inhibitory)的浓度之下，从而减小形成针对该抗感染剂的抗性的可能性。

尽管环丙沙星是具体用于本发明的抗感染剂，并不希望将本发明限制于环丙沙星。可采用其它抗生素或抗感染剂，例如，选自下组的那些：氨基糖苷、四环素、磺胺，对氨基苯甲酸、二氨基嘧啶、喹诺酮、β-内酰胺、β-内酰胺和β-内酰胺酶抑制剂、氯霉素、大环内酯、青霉素、头孢菌素、洁霉素、克林霉素、壮观霉素、多粘菌素B、粘菌素、万古霉素、杆菌肽、异烟肼、利福平、乙胺丁醇、乙硫异烟胺、氨基水杨酸、环丝氨酸、卷曲霉素、砜、氯法齐明、萨力多胺、多烯抗真菌剂、氟胞嘧啶、咪唑、三唑、灰黄霉素、特康唑、布康唑环吡司、环吡酮胺、卤普罗近、托萘酯、萘替芳、特比萘芬，或其任意组合。

优选同时针对静止(固着的)和复制性跟细菌有效的抗生素。

本发明的一方面是应用于治疗非结核分枝杆菌感染的制剂，或治疗非结核分枝杆菌感染的方法，其包括：

使一剂量的制剂气溶胶化，以产生气动学直径在1微米-12微米范围内的气溶胶化颗粒；

将所述气溶胶化颗粒吸入患者的肺，

其中，所述气溶胶化制剂包含液体运载体，所述液体运载体包含：溶液中浓度为20mg/mL-80mg/mL的环丙沙星的游离环丙沙星液体运载体、溶液中的未经脂质体包封的环丙沙星，和包封在脂质体内的纳米晶体形式的环丙沙星；

其中，所述气溶胶化颗粒的气动学直径是2微米-8微米，所述脂质体的直径是20纳米-1微米，并且所述纳米晶体的尺寸是10纳米或更小；

其中，所述环丙沙星以30mg/mL-70mg/mL的浓度存在于溶液中；或者

其中，所述环丙沙星以40mg/mL-60mg/mL的浓度存在于溶液中；

其中，所述脂质体是单层的，并且在气溶胶化之后，以90％或更高的水平保持结构完整性；并且

在至少七天的时程内重复所述气溶胶化和吸入，每天一次；或者

其中，所述重复每天进行，在7天-56天的时程中每天一次，并且其中，所述感染是生物膜形式。

本发明的另一方面是如上所述的应用或方法，其还包括：

检测所述患者的感染；

当患者测试为阳性时，继续所述重复的气溶胶给予，而当该患者测试为阴性时，不继续上述给予；

其中，所述脂质体包含冷冻保护剂和表面活性剂；

其中，95％或更多的所述脂质体保持结构完整性，并且在所述制剂的气溶胶化之后继续包封环丙沙星的纳米晶体；或者

其中，98％或更多的所述脂质体保持结构完整性，并且在所述制剂的气溶胶化之后继续包封环丙沙星的纳米晶体。

本发明的另一方面是，制剂在治疗非结核分枝杆菌感染中的应用，其中，所述制剂包含：

脂质体，其中所述脂质体包含：

脂质双层；

冷冻保护剂；

和

被所述脂质双层围绕的具有药学活性的抗感染药物的纳米晶体，其中，所述纳米晶体的尺寸是100nm或更小；

其中，所述冷冻保护剂是多元醇；

其中，所述多元醇是蔗糖或海藻糖；

其中，所述脂质体还包含表面活性剂。

如上所述的本发明的应用还包括：

药学上可接受的运载体；或

溶解于所述运载体中的具有药学活性的抗感染药物；或

液体抗感染药物，所述脂质体分散于其中。

如上所述的应用还包括如下应用，其中，所述抗感染药物选自下组：喹诺酮、磺胺、氨基糖苷、四环素、对氨基苯甲酸、二氨基嘧啶、β-内酰胺、β-内酰胺和β-内酰胺酶抑制剂、氯霉素、大环内酯、洁霉素、克林霉素、壮观霉素、多粘菌素B、粘菌素、万古霉素、杆菌肽、异烟肼、利福平、乙胺丁醇、乙硫异烟胺、氨基水杨酸、环丝氨酸、卷曲霉素、砜、氯法齐明，萨力多胺、多烯抗真菌剂、氟胞嘧啶、咪唑、三唑、灰黄霉素、特康唑、布康唑环吡司、环吡酮胺、卤普罗近、托萘酯、萘替芳、特比萘芬及其组合；和

其中，所述脂质双层包含选自下组的脂质：脂肪酸；溶血脂质；鞘脂类；鞘磷脂；糖脂(glycolipid)；糖脂(glucolipid)；鞘糖脂；棕榈酸；硬脂酸；花生四烯酸；油酸；载有磺化的单糖、二糖、寡糖或多糖的脂质；具有醚和酯联脂肪酸的脂质、聚合的脂质、二乙酰磷酸酯、硬脂胺、心磷脂、磷脂、具有不对称酰基链的合成的磷脂；和具有共价结合的聚合物的脂质；和

其中，所述脂质体包含选自下组的磷脂：磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、磷脂酰丙三醇、磷脂酸、磷脂酰丝氨酸，及其混合物；其中，所述磷脂以与改性剂的共混物形式提供，所述改性剂选自下组：胆固醇、十八胺、硬脂酸、生育酚，及其混合物；并且其中，所述脂质体是单层的或多层的；并且

其中，所述脂质体包含HSPC和胆固醇；并且

其中，所述脂质双层包含HSPC和胆固醇；

冻干保护剂选自下组：蔗糖和海藻糖；

所述表面活性剂选自下组：聚山梨醇酯20和BRIJ 20；且

所述药物是环丙沙星。

本发明还包括本文所述的任何应用或制剂，其中，脂质体包含以1:10-10:1(w/w)的比例存在的多元醇和磷脂酰胆碱富含型磷脂；和/或

其中，脂质体包含以1:1-5:1(w/w)的比例存在的多元醇和磷脂酰胆碱富含型磷脂；和/或

其中，所述表面活性剂存在的量是0.01％-1％；和/或

其中，所述表面活性剂存在的量是0.05％-0.4％；和/或

其中，所述感染是所述患者肺部中的生物膜上的感染，并且，所述脂质体在一段时间内且以有效治疗生物膜感染的速率释放药物。

本发明还包括治疗患者中的抗生素抗性感染的任何应用或方法，包括：

使制剂气溶胶化，所述制剂包含游离环丙沙星和包封在脂质体中的环丙沙星；和

将该气溶胶吸入所述患者的肺，由此，90％或更多的所述脂质体在经过气溶胶化之后保持结构完整性，

其中，所述抗生素抗性感染包括生物膜中的微生物或吞噬在巨噬细胞中的微生物；

其中，所述感染是生物膜中的微生物感染；和/或

其中，所述感染是吞噬在巨噬细胞中的浮游态的微生物感染；和/或

其中，所述感染是选自下组的微生物的感染：分枝杆菌、铜绿假单胞菌和土拉弗朗西斯菌；和/或

所述脂质体包含冷冻保护剂和表面活性剂，且平均粒径为约75nm-约120nm，并且是单层的；和/或

所述脂质体以约30比70(加或减10％)的比例包含胆固醇和氢化大豆磷脂酰-胆碱(HSPC)-一种半合成的完全氢化的天然大豆卵磷脂衍生物；和/或

所述制剂还包含适于肺部递送的赋形剂，该赋形剂包含乙酸钠，和，等张缓冲剂；和/或

90％或更多的所述脂质体在气溶胶化时保持完整性，并且在接触肺部组织之后提供0.5％-10％/小时的环丙沙星释放速率；和/或

95％或更多的所述脂质体在气溶胶化时保持完整性，并且在接触肺部组织之后，提供1％-8％/小时的环丙沙星释放速率；和/或

所述脂质体以29.4比70.6的比例包含胆固醇和氢化大豆磷脂酰-胆碱(HSPC)，并且是单层的，并且其中，98％或更多的所述脂质体在气溶胶化时保持完整性，并且提供2％-6％/小时的环丙沙星释放速率。

本发明包括本文所述的制剂应用或方法，其中：

所述脂质体还包含0.1-0.3％的聚山梨醇酯20，和200-400mg/mL的蔗糖；和/或

所述气溶胶化和吸入在七天或更长的时程内每天重复一次；和/或

所述气溶胶化和吸入在7天-56天的时程内每天重复一次；和/或

所述制剂包含50mg-500mg的环丙沙星；和/或

所述制剂包含75mg-300mg的环丙沙星；和/或

所述制剂是雾化的，且包含150mg的环丙沙星。

阅读以下更完整描述的制剂和方法细节，本领域技术人员将明白本发明的这些和其他目的、优点和特征。

附图的简要说明

结合附图，本发明的方面和实施方式将通过如下详细描述来得到最好的理解。需要强调，按照惯例，附图的各个特征不成比例。相反，各种特征的尺寸被任意放大或者缩小以清楚显示。附图部分包括如下的附图：

图1是供于吸入的脂质体环丙沙星的制造流程图(HSPC/Chol-10L批式)。

发明详述

在描述本发明的配制环丙沙星包封的脂质体和递送所述脂质体来预防和/或治疗NTM感染和其它医学病症的方法，和与所述方法联用的装置和制剂之前，应理解，本发明不限于所述的具体方法、装置和制剂，因为，显见地，所述方法、装置和制剂可以变化。还应理解，本文所用术语的目的仅是描述具体实施方式，不应用来限制本发明的范围，本发明的范围仅受所附权利要求书的限制。

提供数值范围时，也应视作具体公开了该范围的上限和下限之间以下限单位十分之一为间隔的各中间数值，除非上下文另有明确说明。本发明还包括设定范围内任何设定数值或中间数值和该设定范围内任何其它设定数值或中间数值之间的各较小范围。所述范围可独立地包含或排除这些较小范围的上限、下限，本发明也包括这些较小范围不包含限值、包含任一或两个限值的各范围，以设定范围内任何限值的明确排除为准。设定范围包含一个或两个限值时，本发明也包括排除所述限值之一个或两个的范围。

除非另有说明，本文所用的所有科技术语与本发明所属领域普通技术人员所理解的通常含义相同。虽然可采用与本文所述类似或等同的任何方法和材料实施或测试本发明，但现在描述优选的方法和材料。本文提及的所有出版物均通过引用纳入本文，与所引用出版物相关联来公开和描述这些方法和/或材料。

应注意到，本文和所附权利要求书所用的单数形式“一个”、“一种”和“这种”包括复数含义，除非另有明确说明。因此，例如，提到“一种制剂”则包括多种这样的制剂，且提到“所述方法”则包括本领域技术人员已知的一种或多种方法及其等同物等等。

提供本文讨论的出版物仅针对其在本申请提交日之前的公开。本文中所有内容均不应解释为承认本发明不能凭借在先发明而先于这些出版物。此外，所提供的出版日期可能与实际公开日期不同，这可能需要单独确认。

本文中所用的抗感染剂指：具有抵抗感染，例如细菌、病毒、真菌、分枝杆菌，或原生动物感染的作用的物质。

本发明涵盖的抗感染剂包括但不限于：喹诺酮(例如萘啶酸、西诺沙星、环丙沙星和诺氟沙星等)、磺胺类(例如，磺胺、磺胺嘧啶、磺胺甲噁唑、硫代异噁唑、磺乙酰胺等)、氨基糖甙类(例如，链霉素、庆大霉素、妥布霉素、阿米卡星、奈替米星、卡那霉素等)、四环素(例如氯四环素、氧四环素、甲烯土霉素、强力霉素、二甲胺四环素等)、对氨基苯甲酸、二氨基嘧啶(例如，甲氧苄氨嘧啶，常与磺胺甲恶唑联用、吡嗪酰胺等)、青霉素(例如，青霉素G、青霉素V、氨苄青霉素、阿莫西林、巴氨西林、羧苄青霉素、卡茚西林、羟基噻吩青霉素、阿洛西林、美洛西林、哌拉西林等)、青霉素酶抗性青霉素(例如，甲氧西林、苯甲异噁唑青霉素、氯洒西林、双氯青霉素、萘夫西林等)，第一代头孢菌素(例如，头孢羟氨苄、头孢氨苄、头孢拉啶、先锋霉素、头孢匹林、头孢唑啉等)、第二代头孢菌素(例如，头孢克洛、头孢羟唑、头孢尼西、头孢西丁、头孢替坦、头孢呋辛、头孢呋辛酯、头孢美唑、头孢罗齐、氯碳头孢、头孢雷特等)、第三代头孢菌素(例如，头孢吡肟、头孢哌酮、头孢噻肟、头孢唑肟、头孢曲松钠、头孢他啶、头孢克肟、头孢泊肟、头孢布坦等)、其它β-内酰胺类(例如，亚胺培南、美罗培南、氨曲南、克拉维酸、舒巴坦、他唑巴坦等)、β-内酰胺酶抑制剂(例如，克拉维酸)、氯霉素、大环内酯类(例如，红霉素、阿奇霉素、克拉霉素等)、洁霉素、克林霉素、壮观霉素、多粘菌素B、多粘菌素(例如，多粘菌素A、B、C、D、E.亚类.1(粘菌素A)，或E.亚类.2、粘菌素B或C等)粘菌素、万古霉素、杆菌肽、异烟肼、利福平、乙胺丁醇、乙硫异烟胺、氨基水杨酸、环丝氨酸、卷曲霉素、砜(例如，氨苯砜、阿地砜钠等)、氯法齐明、萨力多胺，或可被脂质包封的任何其它抗细菌剂。抗感染剂可包括抗真菌剂，包括多烯抗真菌剂(例如，两性霉素B、制真菌素、游霉素等)、氟胞嘧啶、咪唑类(例如，咪康唑、克霉唑、益康唑、酮康唑等)、三唑类(例如，依曲康唑、氟康唑等)、灰黄霉素、特康唑、布康唑环吡司、环吡酮胺、卤普罗近、托萘酯、萘替芳、特比萘芬，或可被脂质包封或复合的任何其它抗真菌剂，及其药学上可接受的盐，及其组合。讨论和实施例主要涉及环丙沙星，但不意在将本发明的范围限于该抗感染剂。可以使用药物的组合。

生物膜是任何微生物的组，其中，细胞在某一表面上彼此粘连。这些贴壁细胞常常包埋在胞外聚合物质(EPS)的自产基质中。生物膜胞外聚合物质，其也称作粘菌(slime)(尽管并不是被称为粘菌的所有物质都是生物膜)，是一种聚合聚集物，其一般包含胞外DNA、蛋白质和多糖。生物膜可在活体(living)或非活体(non-living)表面上形成，并且可普遍出现于自然环境、工业或医院设施上。在生物膜中生长的微生物细胞与相同生物体的浮游细胞(planktonic cell)存在生理学差异，与之相对，浮游细胞是可以在液体介质中飘浮或游动的单个细胞。

已发现，身体中的许多微生物感染均涉及生物膜，估计占全部感染的80％。其中可能牵涉生物膜的感染性过程包括一些常见问题，例如尿道感染、导尿管感染、中耳感染、牙菌斑形成、齿龈炎、被覆隐形眼镜，和较不常见但更致命的过程，例如，心内膜炎、囊性纤维化中的感染，和永久留置装置(例如人工关节和心脏瓣膜)中的感染。更近期地，注意到，细菌的生物膜可能会损害皮肤创伤的愈合，并且降低感染皮肤创伤的愈合或治疗中的局部抗细菌功效。

本文中所用的“制剂”指：干粉形式或悬浮或溶解于液体中的形式的，脂质体-包封的抗感染剂，其中，伴随任何赋形剂或其它活性成分。

术语“对象”、“个体”、“患者”和“宿主”在本文中可互换使用，并且指任何脊椎动物，具体地是任何哺乳动物，且最具体地，包括人类对象、农场动物，和哺乳动物宠物。所述对象可以但不必处于医疗保健专业人员(例如，医生)的护理之下。

“稳定的”制剂是，在储存和暴露至相对高的温度之后，其中的蛋白质或酶基本保持它们的物理和化学稳定性和完整性的制剂。用于检测肽稳定性的多种分析技术是本领域可获得的，并且在如下文献中有综述：《肽与蛋白质药物递送》(Peptide and Protein DrugDelivery)，247-301，Vincent Lee编，纽约州纽约的马塞尔·德克尔公司(Marcel Dekker,Inc.)出版(1991)，和Jones,A.(1993)Adv.Drug Delivery Rev.10:29-90。可以在所选温度下储存所选时间，以测定稳定性。

可被治疗的“哺乳动物”是指可被分类为哺乳动物的任何动物，其中包括人、家畜、以及动物园动物、竞技动物或宠物，如狗、马、猫、牛等。优选的哺乳动物是人。

“紊乱”是，能够从采用本文所述的方法和组合物的治疗受益的状况。

发明通述

环丙沙星是成熟建立且广泛使用的广谱氟喹诺酮抗生素，其指示用于治疗下呼吸道感染，例如，归因于铜绿假单胞菌的下呼吸道感染，其在患有囊性纤维化的患者中常见。吸入的抗微生物剂的主要益处在于，它们将抗生素递送靶向至主要感染区域，并且避免GI相关的副作用；然而，药物的较差溶解性和苦味限制了适用于吸入的制剂的开发。此外，环丙沙星的快速组织分布意味着肺部中的较短药物停留时间，因此限制了口服或静脉药物给予的治疗益处。本文所述的脂质体-包封的环丙沙星制剂通过改良的生物药学特性和机理减小了上述限制，并且促进了对于因NTM所致的肺部感染的控制，所述改良的生物药学特性和机理例如，雾化后囊泡大小和包封的保留、改变的药物PK和生物分布、从运载体的持续药物释放、向疾病位置包括胞内感染的增强的递送，由此，提高了胞内空间中的药物浓度。

本发明不限于治疗患有NTM感染的患者。事实上，许多患者和适应症均可受益于该治疗，包括胞内感染，且尤其是肺泡巨噬细胞和/或气道中的生物膜中的那些感染。然而，其特别有用于抵抗分枝杆菌感染，因为其有效杀灭存在于生物膜中的复制性和非复制性细菌。如McNabe等(2012)所述，鸟分枝杆菌在抗生素(例如，链霉素和四环素)的存在下形成越来越多的量的生物膜，这刺激了该细菌中生物膜相关的基因表达。一旦形成，生物膜由2种不同细菌群组成，固着型(更具抗性的表型)，和浮游型(易感表型)。着实令人吃惊的是，吸入型脂质体环丙沙星同时有效杀灭两种细菌群，包括更具抗性的固着型。这与未包封的环丙沙星不同，未包封的环丙沙星的功效弱得多。脂质体和包封的环丙沙星针对NTM的活性的差异可能在体内更为显著，因为在气道和肺部中，未包封的环丙沙星比包封的环丙沙星消失得快得多。

本发明的制剂可采用一次性包装和便携式、手持式、电池供电装置，例如AERx装置(美国专利号5,823,178，加利福尼亚州海沃德阿拉迪姆)给予患者。或者，本发明的制剂可采用机械(非电子)装置施用。可用于递送所述制剂的其它吸入装置包括传统喷射式喷雾器、超声喷雾器、柔雾吸入器、干粉吸入器(DPI)、定量雾化吸入器(MDI)、压缩气溶胶生成器，等系统。显示游离环丙沙星与包封的环丙沙星的比例在雾化后保持恒定；即，在可能会导致包封的抗生素的一部分的过早释放的雾化过程中没有造成对脂质体的损坏。该发现基于现有文献报道(Niven RW和Schreier H，1990)而言是预料之外的，但确保吸入该气溶胶的动物或人类将会获得整个肺中沉积的、游离药物与包封药物的可再生比例。

气溶胶可通过施加压力使药物通过膜上的孔来产生，所述孔的大小在约0.25-6微米范围内(美国专利5,823,178)。当孔具有该大小时，通过这些孔逸出以产生气溶胶的颗粒将具有0.5-12微米范围内的直径。药物颗粒可以随着意在将所述颗粒保持在该大小范围内的气流中释放。可以通过利用振动装置来促进小颗粒的产生，所述振动装置提供约800-约4000千赫范围内的振动频率。本领域技术人员应理解，可对参数进行一些调节，例如通过其释放的孔的大小、振动频率、压强，和基于所述制剂的密度和粘度的其它参数，但应注意，一些实施方式的目标是提供具有约0.5-12微米范围内的直径的气溶胶化的颗粒。

所述脂质体制剂可以是低粘度液体制剂。所述药物单独或联合运载体的粘度应足够低，从而该制剂可受压从开口挤出，以形成气溶胶，例如，采用20-200psi以形成气溶胶，其优选具有约0.5-12微米范围内的颗粒大小。

在一个实施方式中，将低沸点、高挥发性的推进剂与本发明的脂质体和药学上可接受的赋形剂相联合。所述脂质体可以推进剂中的干粉形式或悬液形式提供，或者，在另一个实施方式中，所述脂质体溶解于推进剂中的溶液中。这些制剂均可以容易地包括在容器中，其具有阀作为其唯一开口。因为所述推进剂是高度挥发性的，即，具有低沸点，该容器的内容物将处于压力之下。

在另一制剂中，包含环丙沙星的脂质体以其单独的干粉形式提供，并且在另一制剂中，包含环丙沙星的脂质体以溶液制剂形式提供。对于每次递送，通过仅允许以相同的吸气流速和吸气体积吸入，来直接吸入所述干粉。所述粉末可以在水性溶剂中溶解，以产生溶液，该溶液移动通过多孔膜，以产生供于吸入的气溶胶。允许产生包含环丙沙星的脂质体的气溶胶化形式的、可通过肺内途径被吸入或递送至患者的任何制剂，均可与本发明联用。关于可与气溶胶化的递送装置联用的制剂的具体信息描述于《雷明顿药物科学》(Remington’s Pharmaceutical Sciences)，A.R.Gennaro编(最新版本)麦克出版公司(MackPublishing Company)。关于胰岛素制剂，Sciarra等(1976)的发现也有利于参考。当采用低沸点推进剂时，该推进剂装在装置的加压罐中，并保持在液体状态。当开动阀门时，推进剂被释放，并且将活性成分连同推进剂一起从所述罐推出。推进剂在接触周围环境时将会“突溢(flash)”，即，所述推进剂立即蒸发。该突溢极快速地发生，以至于实际递送至患者的肺的活性成分是基本纯的。

基于上文内容，本领域技术人员应理解，可采用多种不同的治疗和给予手段来治疗单一患者。因此，已接受所述药物(例如，静脉内环丙沙星或抗生素等形式的药物)的患者可通过吸入本发明的制剂而受益。一些患者可通过吸入仅接受包含环丙沙星的脂质体制剂。所述患者可被诊断为患有NTM肺部感染，或具有一些身体状况的症状，该症状可通过给予所述患者抗生素(例如，环丙沙星)而受益。本发明的制剂还可用于诊断。

患者通常将接受约0.01-10mg的环丙沙星/kg/天，±20％或±10％的剂量。该剂量通常将通过至少一次，优选数次“气鼓(puff)”从该气溶胶装置给予。每天的总剂量优选以每天至少一次给予，但可分成每天2个或更多个剂量。一些患者可通过如下方式受益：使所述患者在数天或数周的时程中“携载”更高剂量的环丙沙星或者更高给予频率，随后给予减小的或维持的剂量。因为NTM是难以治疗的病症，希望患者在一段延长的时间中接受所述治疗。

本发明包括治疗非结核分枝杆菌的方法，其中，本发明的制剂通过任何已知给药途径(例如，注射、吸入、鼻部给予、口服和静脉输注)来给予。尽管优选的给予方法是通过吸入，其中，本发明特别适合用于治疗肺中的生物膜形式的感染。本发明的制剂特别适于根除因多种原因以生物膜形式在肺中形成的感染。首先，本发明的脂质体特别耐受气溶胶化之后的破裂，其中，90％或更多、95％或更多、98％或更多的脂质体保持其结构完整性，由此，在通过喷雾器或移动通过多孔膜的孔而经气溶胶化之后，药物制剂保持装载于脂质体中。在所述制剂到达肺部组织之后，于相对较低的pH(例如，6.5或更小、6.0或更小、5.5或更小、5.0或更小)溶解于溶剂运载体(其可以是水性运载体)中的药物提供立即释放且与细菌接触。之后，脂质体溶解或变得更具透过性，并且提供包封在脂质体内的制剂的释放。之后，当存在于脂质体内部时，纳米晶体缓慢溶解。因此，本发明的制剂可以一天一次为基础进行递送，并且提供用于药物(例如，环丙沙星)在一段较长时间内的控释。

归因于多种因素，生物膜难以通过抗生素根除。首先，它们通常被密集的表多糖基质环绕，该基质抑制了一些抗生素(包括氨基糖甙类)扩散进入生物膜。第二，较快速生长的细菌细胞的外层也“保护”生物膜内部的细胞不接触抗生素。第三，生物膜内部的细胞缺乏氧气，从而是生长缓慢或静止的，因此本质上对抗生素接触较不敏感。最后，有证据显示，存在顽固得难以杀灭的“持留(persister)”细胞，并且也可能存在其它未知的抗性机理。

实验部分

提供以下实施例的目的是向本领域普通技术人员完整地公开和描述如何制备和使用本发明，这些实施例不意在限制发明人认为的发明范围，也不表示下述实验是所实施的仅有的实验。努力保证所用数值(如量、温度等)的准确性，但应允许一些实验误差和偏差。除非另有说明，份数是重量份数，分子量是重量平均分子量，温度是摄氏度，压力是大气压或接近大气压。

实施例1

包封的环丙沙星的制备：

将环丙沙星(50mg/mL)包封进入脂质体，所述脂质体由氢化大豆磷脂酰-胆碱(HSPC)(70.6mg/mL)(一种半合成的完全氢化的天然大豆卵磷脂衍生物(SPC))，和胆固醇(29.4mg/mL)组成。所述脂质组织成脂双层，其平均粒径为75-120nM。该无菌悬液悬浮于等张缓冲剂(25mM组氨酸，145mM NaCl，pH 6.0，300mOsm/kg)中，并通过吸入给予。这些脂质体环丙沙星制剂包含约1％的未包封的环丙沙星。

该制造方法包括以下步骤：

1.制备缓冲液。

2.对脂质组分称重。

3.将脂质溶解于溶剂(tBuOH:EtOH:dH2O/49:49:2)中。

4.将脂质的溶剂溶液与甲胺硫酸盐缓冲液(10％v/v溶剂)混合，以形成具有30mg/mL脂质的包封的甲胺硫酸盐缓冲液的多层囊泡(MLV)。

5.通过四叠80nm孔大小的聚碳酸酯滤器挤出，以产生大单层囊泡(LUV)。进行第二挤压通过以产生平均直径为约100nm的脂质体。

6.超滤，以将脂质体浓缩至约55mg/mL总脂质。

7.对10体积的缓冲液(145mM NaCl，5mM组氨酸，pH 6.0)进行渗滤，以去除乙醇，并产生跨膜pH梯度。

8.通过HPLC确定脂质浓度。

9.使脂质体悬液升温至50℃，并在搅拌下缓慢添加粉末状环丙沙星(总脂质质量的60％)。递增地添加环丙沙星(在40分钟期间，每4分钟10％的质量)，并使产物在50℃孵育20分钟，然后添加最后的等分以允许载药过程完成。

10.载有环丙沙星的脂质体对3体积的145mM NaCl、5mM乙酸盐，pH 4.0进行渗滤，以在其中游离环丙沙星可溶的条件下去除未包封的环丙沙星。

11.载有环丙沙星的脂质体对5体积的145mM NaCl、25mM组氨酸，pH 6.0进行渗滤，以去除任何剩余的未包封的环丙沙星，进一步降低残留的溶剂水平，并用希望的最终产物缓冲液交换外部缓冲液。

12.将制剂超滤至50mg/mL(需要进程内的检测)的环丙沙星浓度。

13.将脂质体预过滤通过0.45/0.2μm滤板，以去除可能会阻塞无菌级滤器的微粒。所用的滤器实际是无菌级滤器；然而，它们在与其用于无菌过滤的应用不相容的升高压强下使用。

14.冗余过滤通过0.2μm的无菌级滤器。

15.样品装瓶与包装。

整个制造方案如图1所示。

实施例2：

脂质体环丙沙星针对生物膜中鸟分枝杆菌和脓肿分枝杆菌的活性。

脂质体包封的环丙沙星和游离环丙沙星的制备：制备10mM乙酸钠中浓度为20mg/mL的未包封的或“游离的”环丙沙星溶液(pH 3.2)。根据实施例1，以25mM组氨酸、145mMNaCl，pH 6.0中50mg/mL环丙沙星制备脂质体包封的环丙沙星制剂。

感染模型描述：96孔板上持续4天，在鸟分枝杆菌和脓肿分枝杆菌生物膜模型中评价包含游离环丙沙星和脂质体包封的环丙沙星的制剂，以及空脂质体对照和缓冲液对照。

剂量范围研究的设计：在三种模型中评估一种浓度的游离的或脂质体环丙沙星(50或100mcg/mL)、空脂质体(作为对照)，或仅缓冲液(作为阴性对照)。报告初始时和之后的第4天的定殖。

结果：表1显示各组的定殖。发现，采用脂质体环丙沙星的治疗在这些模型中的每一种中均提供统计学显著效果，而单独的环丙沙星不具有统计学显著效果。

表1：生物膜定殖

结论：仅脂质体环丙沙星制剂显示杀灭生物膜中的分枝杆菌。这是前所未有的，因为其它抗生素，包括其它脂质体抗生素制剂，均未显示减少分枝杆菌感染的生物膜模型中的细菌数量(即，杀死)的能力。难以杀灭固着的细菌，例如，在生物膜中发现的那些，很可能归因于多种因素，由于分枝杆菌生物膜基质的物理保护，以及对于环境胁迫(包括抗生素(Islam等))的表型耐受。因此，分枝杆菌生物膜感染的治疗极难(Islam等)。因此，表1所示的结果是令人吃惊的，因为这些脂质体环丙沙星制剂提供了显著且有效的对于静止或固着细菌的杀灭。这是用于治疗NTM感染的必要元素，其通常包含复制性和非复制性(固着的)细菌。Islam等还表示，多种分枝杆菌菌种，绝大多数是鸟分枝杆菌，已显示在环境(即，生物膜)以及临床设施中以多细胞群落存在。处于其自然生境中的这些分枝杆菌群落的普遍性可通过如下证据被进一步认识到：在不含去污剂的体外培养物中常规地观察到分枝杆菌的聚集物和菌膜，这表示遗传学上程式化地发展出了有序的、药物耐受的群落，即生物膜的关键特征。

实施例3

脂质体环丙沙星针对巨噬细胞中鸟分枝杆菌的活性。

脂质体包封的环丙沙星和游离环丙沙星的制备：制备10mM乙酸钠中浓度为20mg/mL的未包封的或“游离的”环丙沙星溶液(pH 3.2)。根据实施例1，以25mM组氨酸、145mMNaCl，pH 6.0中50mg/mL环丙沙星制备脂质体包封的环丙沙星制剂。将样品在THP-1人类巨噬细胞模型中稀释至合适浓度。

感染模型描述：在THP-1人类巨噬细胞中的鸟分枝杆菌细菌菌株中评价包含游离环丙沙星、脂质体包封的环丙沙星、包含环丙沙星纳米晶体的脂质体，以及缓冲液对照的制剂，并且在4天后检测巨噬细胞中的感染。

研究设计：在2种模型中评价一种浓度的游离环丙沙星或脂质体环丙沙星(20mcg/mL)，或仅缓冲液(作为阴性对照)。报告初始时和随后第4天的细菌定殖。

结果：表2显示各组的定殖。发现，采用脂质体环丙沙星的治疗在这些巨噬细胞感染模型中的每一种中均提供统计学显著效果，而单独的环丙沙星不具有统计学显著效果。

表2：巨噬细胞中鸟分枝杆菌的定殖

结论：两种脂质体环丙沙星制剂针对鸟分枝杆菌巨噬细胞感染模型的活性均优于游离环丙沙星。

实施例4

脂质体环丙沙星针对巨噬细胞中的脓肿分枝杆菌的活性。

脂质体包封的环丙沙星和游离环丙沙星的制备：制备10mM乙酸钠中浓度为20mg/mL的未包封的或“游离的”环丙沙星溶液(pH 3.2)。根据实施例1，以25mM组氨酸、145mMNaCl，pH 6.0中50mg/mL环丙沙星制备脂质体包封的环丙沙星制剂。将样品在THP-1人类巨噬细胞模型中稀释至合适浓度。

感染模型描述：在THP-1人类巨噬细胞中的脓肿分枝杆菌细菌菌株中评价包含游离环丙沙星、脂质体包封的环丙沙星、空脂质体，以及缓冲液对照的制剂，并且在4天后检测巨噬细胞中的感染。

剂量范围研究的设计：在2种脓肿分枝杆菌模型中评价一种浓度的游离环丙沙星或脂质体环丙沙星(10或20mcg/mL)、空脂质体，或仅缓冲液(作为阴性对照)。报告初始时和随后第4天的细菌定殖。

结果：表3显示各组的定殖。发现，采用脂质体环丙沙星的治疗在这些巨噬细胞感染模型中的每一种中均提供统计学显著效果，而单独的环丙沙星不具有统计学显著效果。

表3：巨噬细胞中鸟分枝杆菌的定殖

结论：脂质体环丙沙星制剂针对脓肿分枝杆菌巨噬细胞感染模型的活性优于游离环丙沙星。

实施例5

脂质体环丙沙星针对巨噬细胞中的脓肿分枝杆菌的活性。

脂质体包封的环丙沙星和游离环丙沙星的制备：制备10mM乙酸钠中浓度为20mg/mL的未包封的或“游离的”环丙沙星溶液(pH 3.2)。根据实施例1，以25mM组氨酸、145mMNaCl，pH 6.0中50mg/mL环丙沙星制备脂质体包封的环丙沙星制剂。将样品在THP-1人类巨噬细胞模型中稀释至合适浓度。

感染模型描述：在THP-1人类巨噬细胞中的脓肿分枝杆菌细菌菌株中评价包含游离环丙沙星、脂质体包封的环丙沙星、空脂质体，以及缓冲液对照的制剂，并且在4天后检测巨噬细胞中的感染。

研究设计：在2种脓肿分枝杆菌模型中评价一种浓度的游离环丙沙星或脂质体环丙沙星(200mcg/mL)、空脂质体，或仅缓冲液(作为阴性对照)。报告初始时和随后第4天的细菌定殖。

结果：表4显示各组的定殖。发现，采用脂质体环丙沙星的治疗在这些巨噬细胞感染模型中的每一种中均提供统计学显著效果，而单独的未包封的环丙沙星不具有统计学显著效果。

表4：鸟分枝杆菌或脓肿分枝杆菌在巨噬细胞中的定殖

结论：在脓肿分枝杆菌和鸟分枝杆菌巨噬细胞感染模型中，高浓度的脂质体环丙沙星比游离环丙沙星更有效。

实施例6

脂质体环丙沙星针对C57BL/6小鼠中鸟分枝杆菌的活性。

脂质体包封的环丙沙星和游离环丙沙星的制备：制备10mM乙酸钠，pH 3.2中的浓度为20mg/mL环丙沙星HCl(等同于18mg/mL环丙沙星)的未包封的或“游离的”环丙沙星的溶液。根据实施例1，以25mM组氨酸，145mM NaCl，pH 6.0中50mg/mL环丙沙星HCl(等同于45mg/mL环丙沙星)制备脂质体包封的环丙沙星。游离环丙沙星和脂质体包封的环丙沙星的1:1体积-体积混合物(其中环丙沙星HCl浓度为35mg/mL)的“Pulmaquin”(用于吸入的双重释放环丙沙星，DRCFI)的制剂。样品稀释至合适浓度用于对小鼠给药。因此，Pulmaquin包含约35mg/mL的环丙沙星HCl，其中25mg/mL是包封的形式，且10mg/mL是未包封的或游离形式。这等同于31.5mg/mL环丙沙星，其中22.5mg/mL是包封的环丙沙星且9mg/mL是未包封的或游离环丙沙星。Pulmaquin的pH在4和5之间，介于未包封药物的pH 3.2和包封药物的pH 6.0之间。

感染模型描述：在通过鼻内滴注鸟分枝杆菌候米瑟氏亚种(subsp hominissuis)(MAH)MAC104菌株(剂量10⁷)感染的C57BL/6小鼠中评价包含游离环丙沙星、脂质体包封的环丙沙星、Pulmaquin，以及空脂质体和盐水对照的制剂，并且允许感染发展1周。

研究设计：感染后一周，通过鼻内滴注盐水、空脂质体对照、游离环丙沙星、脂质体包封的环丙沙星，或Pulmaquin来起始治疗，每日环丙沙星剂量为0.33、0.66和1mg/kg，持续3周。对于空脂质体对照，空脂质体的剂量与1mg/kg剂量的脂质体包封的环丙沙星的脂质含量相匹配。收获小鼠，并将肺和脾置于7H10琼脂上，用于对肺中的细菌载量进行定量。每个实验组中采用十只小鼠。

结果：表5显示肺和脾的细菌载量(集落形成单位，CFU)。相较于盐水对照，尽管空脂质体和游离环丙沙星对于小鼠肺中MAH的生长没有产生显著效果，给予1mg/kg的脂质体包封的环丙沙星或Pulmaquin分别与从(1.06±0.5)×10⁷到(2.25±0.4)×10⁶(-79％)和(2.47±0.6)×10⁶(-77％)的CFU的显著减少相关联(两者对比盐水或空脂质体，p<0.05)。采用0.33mg/kg和0.67mg/kg脂质体包封的环丙沙星或Pulmaquin的治疗也导致肺中的显著CFU减少(-37～-67％)。

表5：MAH感染的小鼠中的肺和脾中的细菌载量(CFU)

*相比盐水/空，p<0.05

**相比游离环丙沙星，

p<0.05

结论：MAH肺部感染的小鼠的采用脂质体包封的环丙沙星或Pulmaquin的三周鼻内治疗导致肺中MAH载量的显著减少。

实施例7

脂质体环丙沙星针对小鼠中脓肿分枝杆菌的活性。

脂质体包封的环丙沙星和游离环丙沙星的制备：制备10mM乙酸钠，pH 3.2中的浓度为20mg/mL(等同于18mg/mL环丙沙星)的未包封的或“游离的”环丙沙星HCl的溶液。根据实施例1，以25mM组氨酸，145mM NaCl，pH 6.0中50mg/mL环丙沙星HCl(等同于45mg/mL环丙沙星)制备脂质体包封的环丙沙星。游离环丙沙星和脂质体包封的环丙沙星的1:1体积-体积混合物(其中环丙沙星HCl浓度为35mg/mL，等同于31.5mg/mL环丙沙星)的“Pulmaquin”(用于吸入的双重释放环丙沙星，DRCFI)的制剂。样品稀释至合适浓度用于对小鼠给药。

感染模型描述：在通过鼻内滴注脓肿分枝杆菌(Mycobacterium abscessus)菌株MA26(剂量为(5.4±0.3)×10⁷，其为来自国立卫生研究院的患者的临床分离物，处于50μL缓冲液(汉克平衡盐溶液)中)感染的C57BL/6J-lysbg-J/J小鼠中评价包含游离环丙沙星、脂质体包封的环丙沙星、Pulmaquin，以及空脂质体和盐水对照的制剂，并且允许感染发展一周。

研究设计：感染后一周，通过鼻内滴注盐水、空脂质体对照、游离环丙沙星、脂质体包封的环丙沙星，或Pulmaquin来起始治疗，每日环丙沙星剂量为1mg/kg，持续3或6周。对于空脂质体对照，空脂质体的剂量与1mg/kg剂量的脂质体包封的环丙沙星的脂质含量相匹配。收获小鼠，并将肺和脾置于7H10琼脂上，用于对肺中的细菌载量进行定量。每个实验组中采用十只小鼠。

结果：表6显示肺和脾的细菌载量(集落形成单位，CFU)。相较于未治疗的对照，尽管空脂质体和游离环丙沙星对于小鼠肺中的脓肿分枝杆菌生长无显著作用，给予脂质体包封的环丙沙星或Pulmaquin持续6周分别与6周时从未治疗(5.4±0.6)×10⁵到(1.4±0.5)×10³(-99.7％)和(3.0±0.4)×10³(-99.4％)的CFU的显著减少相关联(两者对比未治疗的对照，p<0.05)。采用脂质体包封的环丙沙星或Pulmaquin治疗3周也分别与6周时从未治疗(5.4±0.6)×10⁵到(2.6±0.6)×10⁴(-95.2％)和(2.1±0.4)×10⁴(-96.1％)的CFU的显著减少相关联(两者对比未治疗的对照p<0.05)。

表6：脓肿分枝杆菌感染的小鼠的肺和脾中的细菌载量(CFU)

(*)相比对照，p<0.05

结论：脓肿分枝杆菌肺部感染的小鼠的采用脂质体包封的环丙沙星或Pulmaquin的三或六周鼻内治疗导致肺中细菌载量的显著减少。

参考文献

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Claims (16)

1. 制剂在制备用于治疗非结核分枝杆菌感染的产品中的应用，其中，所述制剂包含：

药学上可接受的运载体；和

脂质体，其中，所述脂质体包含：

脂质双层；

冷冻保护剂；和

环丙沙星的纳米晶体，其被所述脂质双层围绕，其中，所述纳米晶体的尺寸是100 nm或更小；

其中，所述脂质体还包含：表面活性剂，且所述表面活性剂选自下组：聚山梨醇酯20和BRIJ 20；

其中，所述冷冻保护剂是选自下组的多元醇：蔗糖和海藻糖；并且

其中，所述脂质体经冷冻至-20℃～-80℃，然后融化，从而药物纳米晶体保留在脂质体双层的内部。

2.如权利要求1所述的应用，其还包含：

药学上可接受的运载体中的溶液中的游离未包封的环丙沙星。

3.如权利要求1或2所述的应用，所述药学上可接受的运载体是液体抗感染药物，所述脂质体分散于其中。

4.如权利要求2所述的应用，其中，所述脂质双层包含选自下组的脂质：脂肪酸；溶血脂质；鞘脂类；糖脂；载有磺化的单糖、二糖、寡糖或多糖的脂质；具有醚和酯联脂肪酸的脂质、聚合的脂质、二乙酰磷酸酯、硬脂胺、磷脂、和，具有共价结合的聚合物的脂质。

5.如权利要求2所述的应用，其中，所述脂质双层包含选自下组的脂质：棕榈酸；花生四烯酸；油酸；和，硬脂酸。

6.如权利要求2所述的应用，其中，所述脂质双层包含选自下组的脂质：鞘磷脂；和，鞘糖脂。

7.如权利要求2所述的应用，其中，所述脂质双层包含选自下组的脂质：心磷脂；和，具有不对称酰基链的合成的磷脂。

8.如权利要求2所述的应用，其中，所述脂质双层包含HSPC和胆固醇；

所述冻干保护剂选自下组：蔗糖和海藻糖；并且

其中，脂质体包含以1:10-10:1 w/w的比例存在的冷冻保护剂和磷脂酰胆碱富含型磷脂；并且

其中，所述表面活性剂存在的量是0.01%-1%。

9.如权利要求2所述的应用，其中，所述制剂经气溶胶化以产生气溶胶化的颗粒，所述颗粒的气动学直径在1微米-12微米的范围内，其适于吸入患者的肺，

其中，该气溶胶化的制剂包含药学上可接受的运载体，所述运载体包含：溶液中浓度为20 mg/mL-80 mg/mL环丙沙星的游离环丙沙星，溶液中的脂质体包封的环丙沙星，和包封在脂质体内的纳米晶体形式的环丙沙星。

10.如权利要求9所述的应用，其中，所述气溶胶化的颗粒的气动学直径是2微米-8微米，所述脂质体的直径是20纳米-1微米，并且所述纳米晶体的尺寸是10纳米或更小；并且

其中，所述环丙沙星以30 mg/mL-70 mg/mL的浓度存在于溶液中。

11.如权利要求10所述的应用，其中，所述环丙沙星以40 mg/mL-60 mg/mL的浓度存在于溶液中；

其中，所述脂质体是单层的，并且，在气溶胶化之后，以90%或更高的水平保持结构完整性；并且

其中，所述治疗包括：每天重复吸入所述气溶胶化的制剂，在7天-56天的时程中每天一次，并且其中，所述感染是生物膜感染。

12.如权利要求9-11中任一项所述的应用，其中，气溶胶化所述制剂之后，98%或更多的所述脂质体保持结构完整性并且继续包封环丙沙星的纳米晶体。

13. 如权利要求1所述的应用，其中，所述感染是患者肺中的生物膜上的感染，并且，所述脂质体在一段时间内且以有效治疗生物膜感染的速率释放药物。

14. 如权利要求1所述的应用，其中，所述感染是选自下组的微生物感染：分枝杆菌、铜绿假单胞菌(P. aeruginosa)和土拉弗朗西斯菌(F. tularensis)；并且

其中，所述脂质体还包含以30比70加或减10%的比例存在的胆固醇和氢化大豆磷脂酰-胆碱，该氢化大豆磷脂酰-胆碱是一种半合成的完全氢化的天然大豆卵磷脂衍生物；

其中，所述制剂还包含适于肺部递送的赋形剂，所述赋形剂包含乙酸钠和等张缓冲剂；并且

其中，95%或更多的所述脂质体在气溶胶化时保持完整性，并且在接触肺部组织之后，提供1%-8%/小时的环丙沙星释放速率。

15.如权利要求1所述的应用，其特征在于：

所述脂质体还包含以29.4比70.6的比例存在的胆固醇和氢化的大豆磷脂酰-胆碱，并且是单层的，并且其中，98%或更多的所述脂质体在气溶胶化时保持完整性，并且提供2%-6%/小时的环丙沙星释放速率。

16.如权利要求1所述的应用，其特征在于：

所述脂质体还包含0.1-0.3%的表面活性剂，其中所述表面活性剂是聚山梨醇酯20，和200-400 mg/mL的冷冻保护剂，其中所述冷冻保护剂是蔗糖；

在所述治疗中，经气溶胶化和吸入在7天-56天的时程内每天重复一次；并且

其中，所述制剂包含75 mg-300 mg的环丙沙星。

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