CN107074903B - 用于核酸合成的修饰的核苷酸、含此类核苷酸的试剂盒及其用于生产合成的核酸序列或基因的用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种旨在用于通过酶法合成长链核酸的修饰的核苷酸，其包含“天然”含氮碱基或天然含氮碱基类似物、核糖或脱氧核糖碳水化合物和至少一个磷酸酯基团，其特征在于所述核苷酸包含至少一个被称为修饰物基团的R基团，所述基团由所述天然含氮碱基或类似物和/或由所述核糖或脱氧核糖分子的3’位置中的氧携带，使其能够在核酸合成期间阻断所述核苷酸的聚合和/或允许所述核苷酸与另一个分子例如蛋白质相互作用，R包含至少一个功能性末端基团。

Description

用于核酸合成的修饰的核苷酸、含此类核苷酸的试剂盒及其 用于生产合成的核酸序列或基因的用途

技术领域

本发明落于生物学重要的功能化共聚物的合成领域。更具体来说，它涉及核酸、特别是非常长的核酸的合成所需的核苷酸，涉及含有这些核苷酸的试剂盒，并涉及它们用于生产合成的核酸序列或基因的用途。

背景技术

到目前为止，存在两种主要类别的体外核酸合成：化学合成和酶法合成。

最常用的体外核酸化学合成方法是由Adams等(1983,J.Amer.Chem.Soc.105:661)和Froehler等(1983,Tetrahedron Lett.24:3171)描述的利用亚磷酰胺的聚合方法。在这种方法中，待添加的每种核苷酸在5’-OH基团上受到保护，以便防止同一类型的几个核苷酸的不受控制的聚合。一般来说，5’-OH基团的保护使用三苯甲基来进行。为了防止由使用强有力试剂造成的任何降解，也可以对所述核苷酸携带的碱基进行保护。一般来说，所使用的保护包括异丁酰基(Reddy等，1997，Nucleosides&Nucleotides 16:1589)。在每次掺入新的核苷酸后，所述链的最后一个核苷酸的5’-OH基团经历去保护反应，目的是使它可用于随后的聚合步骤。构成所述核酸的核苷酸所携带的含氮碱基本身只在完整的聚合完成之后被去保护。

归因于所涉及的试剂的本质，这些化学合成方法被证明使用起来是昂贵和危险的。此外，它们对于长核酸片段(大于约100个核苷酸的片段)的合成来说是低效的。

为了开发核酸合成方法，特别是为了以高得率生产非常长的片段，并且也为了开发与现有的遗传元件例如DNA质粒相容的方法，开发了即使在不存在模板链的情况下也能利用酶催化剂进行核苷酸之间的偶联反应的合成技术。

在这些酶合成方法中的某些方法中，直接向天然核苷酸添加能够进行聚合的酶(Deng等，1983,Meth.Enzymol.100:96)。从被称为引物的初始核酸片段开始，添加聚合酶以及同一种类型的核苷酸。然后开始聚合反应，并通过重复这些产生磷酸二酯键的步骤顺序地生长核酸，直至通过物理或化学方法停止所述聚合。

天然核苷酸(也就是说未修饰和未受保护的核苷酸)的使用引起不受控制的聚合，产生核酸分子的非常不均匀的混合物。这是因为在第一次添加后，无法阻止同一类型的几个核苷酸的添加。在实际中，这种合成方法被证明不可用于合成具有所需序列的核酸片段。

使用受保护的核苷酸有可能在一定程度上解决这种不受控制的聚合现象。所述受保护的核苷酸可以通过在所需磷酸二酯键之后完全或部分阻止磷酸二酯键的产生来停止所述合成。

核苷酸是用于核酸合成的“单体”。它们的化学性质以及它们反应或不反应的能力保证了所需的合成正确发生。重要的是能够将所述核苷酸以所需顺序一个接一个地聚合，以便能够合成包含所需序列的核酸片段。这种聚合等同于以必须严格坚持的顺序一个接一个地添加核苷酸。特别需要小心的是包含相同含氮碱基并在同时引入的几个核苷酸不成串反应，导致寡聚链的不受控制的生长并且作为结果导致错误核酸序列的产生。

存在与天然核苷酸相比包含某些结构修饰的修饰核苷酸，当它们被用于核酸合成时所述结构修饰为它们提供了某些优点。它们通常通过细胞中天然存在的核苷酸的化学或酶修饰来获得。一些修饰的核苷酸被称为是受保护的，因为它们包含阻止待保留的化学功能在其他反应期间被修饰的化学基团。所述保护性基团可以位于所述核苷酸分子的各种不同位点处。

一种特定类型的受保护的核苷酸具有终止聚合反应的功能。这些“链终止”核苷酸的作用在于防止引入到反应介质中的核苷酸的过量且不想要的聚合。当终止核苷酸被掺入到核酸分子中时，它阻碍另一个核苷酸的后续聚合。因此，在延伸步骤期间可以向每个核酸分子添加单个核苷酸。即使构成所述待合成核酸片段的各种不同核苷酸被顺序引入，也必需使用“终止”核苷酸以便防止不想要的重复现象。

“终止”核苷酸的使用保证了核酸合成方法的可靠性和可重复性，不论所述方法是化学法还是酶法。它们可能对给定方法的合成性能水平具有极大影响。

用于核酸化学合成的受保护的核苷酸在5’-OH位置中包含通过共价键合到DMT(4,4’-二甲氧基三苯甲基)基团而提供的保护，并在3’-OH位置中包含充当核苷酸彼此之间的聚合反应的催化剂的亚磷酰胺基团。这些包含DMT和亚磷酰胺基团的核苷酸被称为受保护的亚磷酰胺核苷酸。针对不受控制的聚合的保护由保护5’-OH的DMT基团提供。在核酸化学合成期间，发生被称为去三苯甲基化的第一个去保护阶段，以便除去DMT基团并获得可用于与待插入的核苷酸反应的5’-OH基团。特别重要的是获得可能的最高效的去保护反应，以便在所有情况下允许添加下一个核苷酸。

在核酸的化学合成期间专一地使用受保护的亚磷酰胺核苷酸。它们的“终止”功能事实上由键合到5’-OH的DMT基团提供。由于化学合成以3’至5’反应进行，因此保护5’-OH的DMT基团的存在使得可以阻止任何过度的聚合直至下一个去保护步骤。

因此，受保护的亚磷酰胺核苷酸不适合于酶合成方法。

还已经开发了一些用于“第二代”测序方法的“终止”核苷酸。然而，除了完全不适合于核酸合成之外，用于所述测序的的终止核苷酸具有某些完全不可接受的限制。

主要的限制是它们被延伸酶类利用的能力。这是因为键合到用于所述测序的终止核苷酸的荧光标记物具有相当大的尺寸。然而，延伸酶类在其活性位点中具有极小量的空间，因此几乎没有机会能够接受拥有庞大荧光基团例如包含共轭芳香环的基团的终止核苷酸以便聚合它们。

现代DNA测序技术是基于模板链、即被测序链与经历延伸的链之间的互补相互作用。一般来说，用于测序的修饰的核苷酸必须具有与其互补核苷酸配对的完整性质。所述修饰的核苷酸应该保留这些对于它们的用途来说必不可少的相互作用性质。然而，构成所述用于测序的修饰核苷酸的含氮碱基是天然含氮碱基例如腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶和胞嘧啶的类似物，因此不具有相同的化学结构：某些原子被其他原子代替，并且一些基团被添加或缺失。这些非天然含氮碱基可能具有许多缺点，例如不被活生物体识别。

一旦掺入后，将终止核苷酸去保护以便允许添加下一个核苷酸。所述去保护步骤包括可以删除负责终止功能的基团的物理或化学手段。与所述修饰的核苷酸相关的其他官能团在类似的去保护步骤期间被删除。因此，在各种不同的测序方法中，几个去保护步骤通常是必需的，以便能够移动到下一个核苷酸的确定。这些各种不同的去保护步骤积累并放大了强有力试剂或极端物理条件的使用，它们促进反应介质中存在的各种物质的降解，特别是核酸的降解。此外，大量去保护步骤相当大地降低了方法的快速性及其性能水平。

在用于测序的修饰核苷酸的使用期间遇到的另一个主要问题是在去保护步骤之后出现伤痕。充当官能团与核苷酸之间的联系的各种不同化学结构在所述去保护步骤期间能够断裂。然而，这种断裂不能分开所有的化学键合结构。因此，尽管经历各种不同的去保护步骤，但这些结构的或大或小的部分保持附连于所述核苷酸。这些残留物对测序过程和总的来说所述核酸的任何用途或修饰具有非常有害的影响。

不论保留何种核苷酸结构，现有的修饰核苷酸不能满足酶合成方法的期望。它们被延伸酶类的不佳的使用，各种不同官能团的定位，修饰的含氮碱基的系统性使用，保留与互补核苷酸的相互作用的限制，大量的去保护步骤和残留伤痕的存在，都阻止了将这些核苷酸用于核酸的酶法合成。

因此，到目前为止，尚未提出与核酸的酶法合成相容、特别是用于非常长的核酸片段的酶法合成的受保护的核苷酸的令人满意的技术解决方案。

发明概述

本发明的第一个目的是提供适合于核酸的酶法合成的修饰的核苷酸。

本发明的另一个目的是提供用各种不同官能团修饰的天然核苷酸，以便可以使它们与它们在核酸合成过程中的用途相容。

本发明的另一个目的是提供修饰的核苷酸，其可以合成非常长的核酸，也就是说至少几百个或几千个核苷酸的核酸，并且更具体来说按照在同一申请人尚未公布的专利申请FR 14-53455中所描述的方法。

发明描述

为此，本发明提供了旨在用于核酸例如长链核酸的酶法合成的修饰的核苷酸，其包含“天然”含氮碱基或天然含氮碱基类似物、核糖或脱氧核糖碳水化合物和至少一个磷酸酯基团，其特征在于它包含至少一个被称为修饰物基团的R或R’基团，所述基团：

-由所述天然含氮碱基或类似物携带，

-和/或由所述核糖或脱氧核糖分子的3’位置中的氧携带，使其能够在核酸合成期间阻断所述核苷酸的聚合(所述修饰物基团此时是保护基团)和/或能够使所述核苷酸与不同于另一个核苷酸的另一个分子例如蛋白质相互作用，R包含至少一个功能性末端基团(其也可以被称为效应基团)。

更具体来说，在有利情况下，所述修饰物基团不是大的基团例如包含共轭芳香环的基团，以便特别是允许接近酶的反应位点。

本发明的核苷酸可以是单磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯，所述磷酸酯基团是游离的，也就是说未修饰的。

本发明的核苷酸采取下列式(I)、(III)和(IV)之一的形式：

其中：

(PP)PO表示单、二或三磷酸酯基团，

(OH)描述了核糖或脱氧核糖分子的可能性，

T是氢或选自下列的可切割原子团：-NH₂；-N₃；-(C＝O)H；-C_nH_2n+1，其中n在1至30之间，优选在1至12之间；-三甲基甲硅烷基；-磷酸酯；-SO₃；-(C＝O)OC_nH_2n+1，其中n在1至30之间，优选在1至12之间；-(C＝O)SC_nH_2n+1，其中n在1至30之间，优选在1至12之间；-硝基苯；-苯甲基；-卤代苯甲基；-酰胺；-碳酸酯；-苯甲酰基；-过氧基；-腈；-硫醇；-酰亚胺；-氨基甲酸酯；-氰酸酯；-炔；-苯基；-卤代苯基；-吡啶甲基；

任选地存在的M是共价键合到Q和Z的基团，M选自烷基、烯基、炔基、芳基、烷芳基、杂芳基、酰基、烷氧基、烷基氨基、烷氧基氨基、酰胺基、烷基酰亚胺基、烯基酰亚胺基、芳基酰亚胺基、氟代烷基、烷基磷酸酯、烷基硫基、硫代酰基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、烷基亚磺酰基、烷基铵、烷基锍、烷基甲硅烷基、烷基羰基、烷基carbanyl、烷基氨甲酰基或烷基羟基氨基，

Z是可切割基团，选自–O-、-S-、＝SH-、＝S＝、≡S-、-SiH₂-、＝SiH-、＝Si＝、≡Si-、-Se-、＝SeH-、≡Se-、＝Se＝、-SeH₂-、-PH-、＝P-、＝PH＝、≡P＝、≡PH-、-PH₃-、-AsH-、＝As-、＝AsH＝、≡As＝、≡AsH-、-ASH₃-、胺、酯、甲硅烷基、烷基、苯甲基、硝基苯甲基、酰胺、碳酸酯、苯甲酰基、过氧基、腈、硫醇、酰亚胺、氨基甲酸酯、氰酸酯、羟胺、亚砜、磺酸酯、硫代亚磺酸酯、硫酯、酰基卤、次碘酸基(hypoiodyl)、炔、卤代苯基、卤代苯甲基、吡啶甲基、二醇或二硫化物，或者当M是–硝基苯甲基-、–硝基甲苯基-、–硝基二甲苯基-、–硝基萘基-或–硝基苯基-时，选自-CH₂或–NH-，

Q是R或R’基团的末端官能团或效应基团，Q选自生物素、蛋白质、序列确定的多核苷酸、碳水化合物、抗原、激素、神经递质、糖苷例如地高辛、含硫特别是带有硫醇官能团的原子团例如谷胱甘肽或双配位基配体例如邻苯二酚，

R和R’可能独立或同时存在，并且当R和R’同时存在时：

Z基团也许相同或不同，

M基团也许相同或不同，

Q基团也许相同或不同，

“碱基”表示选自腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤或尿嘧啶的“天然”含氮碱基或天然含氮碱基类似物，例外的是当R’存在并且Q包含生物素时不表示胸腺嘧啶。

优选地，T在其不是氢时，以及R和R’，构成了提供核酸合成过程的延伸步骤的链终止的基团。

术语“可切割原子团或基团”打算意味着共价键合到核糖分子的3’或2’位置中或脱氧核糖分子的3’位置中的氧或键合到含氮碱基的原子的原子团或基团，所述键可以通过化学或光化学方法打断。有利情况下，本发明的核苷酸分子的可切割原子团或基团T和Z的所有键的断裂完全并且同时进行，也就是说在同一个“去保护”步骤期间进行，特别是通过施加同一种条件或通过同一种试剂的组合作用。

修饰物基团的这种删除优选是完全的，以便导致产生不含任何修饰物基团的核苷酸，也就是说与天然核苷酸一致(除了含氮碱基的结构之外)。

正如前面指明的，R和R’基团是在有利情况下提供核酸合成过程的延伸步骤的链终止的基团。这些R和R’基团可以具有利用置于R和R’的游离末端处的官能团Q而附连到不同于核酸的另一个分子例如支持物上的分子的性质。

这是因为在核酸合成过程中，例如在上面提到的FR 14-53455所描述的过程中，某些步骤假定所使用的修饰的核苷酸可以与固相支持物相互作用。这些固相支持物在其表面处包含与本发明的核苷酸的修饰物基团相容的分子、蛋白质或化学官能团。修饰的核苷酸的这种功能对于核酸合成过程正确发生来说是必不可少的。在一个优选实施方式中，所述修饰的核苷酸包含允许它们例如通过与存在于固相支持物表面处的分子形成解离常数非常低、特别是低于10^-6mol/l的合并复合物而变得与固相支持物合并以便纯化的基团。在去保护步骤后，提供这种合并功能的基团能够被破坏，由此消除核苷酸与固相支持物之间的相互作用。在这种情况下，本发明的核苷酸具有双重优点，即在同一个核苷酸上存在允许纯化的基团和与其他修饰物基团同时地破坏所述基团的能力。

优选地，修饰物基团R由所述含氮碱基携带并形成下述结构(V)之一：

在所述结构中：

“糖”表示所述核苷酸分子的含氮碱基与核糖或脱氧核糖分子之间的连接(bond)，

Z₁和Z₂是相同或不同的可切割Z基团。

Z、M和Q基团具有前面描述的意义。

在本发明的这个实施方式中，所述核苷酸被含氮碱基的通常参与Watson-Crick配对机制的原子、也就是说由通常参与互补核苷酸配对的胺官能团的氮原子所携带的基团修饰。各种不同修饰物基团与构成含氮碱基的原子的附连，总是利用可切割类型的Z基团通过共价类型的键来进行。

在腺嘌呤类型的含氮碱基的情况下，本发明的一个优选实施方式包括将所述修饰物基团键合到伯胺基团6-NH₂(结构V_a)。

在胸腺嘧啶类型的含氮碱基的情况下，本发明的另一个优选实施方式包括将所述修饰物基团键合到仲胺基团3-NH(结构V_t)。

在胞嘧啶类型的含氮碱基的情况下，本发明的另一个优选实施方式包括将所述修饰物基团键合到伯胺基团4-NH₂(结构V_c)。

在尿嘧啶类型的含氮碱基的情况下，本发明的另一个优选实施方式包括将所述修饰物基团键合到仲胺基团3-NH(结构V_u)。

在鸟嘌呤类型的含氮碱基的情况下，本发明的另一个优选实施方式包括利用可切割基团将所述修饰物基团键合到两个胺基之一或同时键合到两个胺基，一个是仲胺基1-NH，另一个是伯胺基2-NH₂(结构V_g)。在两个胺基1-NH和2-NH₂被同时用于携带所述修饰物基团的特定情况下，可能在各个不同的分开的子基团之间出现优选由6个原子构成的环。这个环任选地引起所述修饰物基团的结构的稳定。

在所述修饰物基团由含氮碱基携带的这些实施方式中，所述核苷酸的3’OH和/或2’OH位点是自由的，促进了它们在核酸合成期间用作延伸酶类的底物。

可能存在分子间氢键。事实上，由所述含氮碱基携带的修饰物基团R可以形成下列结构(VI)之一：

其中：

“糖”表示所述核苷酸分子的含氮碱基与核糖或脱氧核糖分子之间的连接，

X₁和X₂也许相同或不同，表示由M携带并能够与所述修饰的核苷酸的含氮碱基形成分子内氢键(这些氢键类似于在互补核苷酸之间的常规配对期间观察到的分子间氢键)的氮、氧或硫原子。

这种构型加强了修饰的核苷酸的稳定性。它也影响修饰物基团的紧实度，并允许它们被通常依赖于模板链的存在的延伸酶类利用。

在腺嘌呤类型的含氮碱基的情况下，本发明的一个优选实施方式包括将所述修饰物基团键合到伯胺基团6-NH₂(结构VI_a)。存在的X₁基团促进与嘌呤环的1位氮原子产生分子内氢键。因此，模拟了互补的胸腺嘧啶的存在。

在胸腺嘧啶类型的含氮碱基的情况下，本发明的一个优选实施方式包括将所述修饰物基团键合到仲胺基团3-NH(结构VI_t)。存在的X₁基团促进与嘧啶环的4位中的氧原子产生分子内氢键。因此，模拟了互补的腺嘌呤的存在。

在胞嘧啶类型的含氮碱基的情况下，本发明的一个优选实施方式包括将所述修饰物基团键合到伯胺基团4-NH₂(结构VI_c)。存在的X₁和X₂基团促进与嘧啶环的3位中的氮原子和2位中的氧原子产生分子内氢键。因此，模拟了互补的鸟嘌呤的存在。

在鸟嘌呤类型的含氮碱基的情况下，本发明的一个优选实施方式包括利用可切割的Z₁和Z₂基团将所述修饰物基团键合到两个胺基，第一个是仲胺基1-NH，第二个是伯胺基2-NH₂(结构VI_g)。存在的X₁基团促进与嘌呤环的6位中的氧原子产生分子内氢键。因此，模拟了互补的胞嘧啶的存在。

在尿嘧啶类型的含氮碱基的情况下，本发明的一个优选实施方式包括将所述修饰物基团键合到仲胺基团3-NH(结构VI_u)。存在的X₁基团促进与嘧啶环的4位中的氧产生氢键。因此，模拟了互补的腺嘌呤的存在。

本发明的修饰的核苷酸的使命不必定是与由任何模板链所携带的可能的互补核苷酸配对。在使用作为本发明的主题的修饰的核苷酸产生核酸期间，所述核苷酸不必定打算通过与可能的模板链的互补相互作用而掺入。

作为本发明的主题的修饰的核苷酸具有允许它们在特定步骤期间失去它们的修饰物基团的特性。在失去它们的所有修饰物基团后，本发明的核苷酸由此被转化，然后恢复它们与模板链所携带的互补核苷酸配对的能力。

根据一个特定实施方式，本发明的核苷酸随后可以在即使不存在互补链的情况下，用作通常依赖于与正经历合成的链互补的模板核酸链的存在的聚合酶的底物。

R或R’基团的功能性末端原子团Q优选地能够在核酸合成期间利用附连到固相支持物表面的核酸之外的分子例如蛋白质，允许所述核苷酸附连到所述支持物，并且更优选地，能够根据下述相互作用对中的一者或另一者，与核酸之外的分子相互作用：抗原/抗体，激素/受体，生物素/(链)亲和素，神经递质/受体，聚合酶/启动子，地高辛/抗地高辛抗体，碳水化合物/凝集素，含硫原子团/金属例如金，谷胱甘肽/谷胱甘肽S-转移酶，或双配位基配体/金属氧化物。

所述金属氧化物可以是例如TiO₂、ZrO₂、CeO₂、Fe₃O₄、Ga₂O₃、In₂O₃、Cr₂O₃、Al₂O₃、ZnO、CuO、Cu₂O₃、Mn₃O₄、Mn₂O₃、V₂O₃、MoO₂。

所述双配位基配体可以是邻苯二酚、异羟肟酸或羟基羧酸。

所述T原子团被称为“阻断物”，因为它保护碳水化合物的3’羟基或2’羟基以防任何其他核苷酸的添加。

优选地，在核酸合成期间，T和Z或Z₁、Z₂是通过利用波长在10^-3至10^-11米之间的电磁辐射辐照所述核苷酸、特别是通过暴露于紫外辐射而可切割的。

本发明的有利实施方式涉及下述核苷酸：

-一种核苷酸，其中X₁和X₂是–NH，T是–NH₂，Z是–CH₂，M是甲基硝基苯甲基-，并且Q是–生物素，

-一种核苷酸，其中X₁和X₂是–NH，T是–NH₂，Z、Z₁和Z₂各自是–O-，M是–硝基萘基-，并且Q是–生物素，

-一种仅带有R’基团的式(I)的核苷酸，其中：Z是–(C＝O)-，M是–C₈H₁₆-，并且Q是–NH-生物素基，

-一种具有特定结构(V)的核苷酸，其中Z,Z₁和Z₂各自是–(COO)-，M是–叔丁基硝基苯甲基-，并且Q是–NH-生物素基。

本发明还涉及如上所描述的核苷酸的用途，其用于基因、合成的核酸序列、DNA、RNA或核酸聚合物的生产过程中，特别是按照酶法合成方法。

一种有利的用途是用于将所述核苷酸并入到先前固定化在固相支持物上的多核苷酸链中，更特别是当所述多核苷酸链通过其5’末端附连并且所述核苷酸的并入通过所述多核苷酸链的3’末端进行时。

然而，本发明的核苷酸处于游离形式，如果需要的话与平衡离子组合。尽管它们具有附连到固相支持物的能力，但这些核苷酸在并入到多核苷酸链中时从任何支持物上脱离。因此它们的化学结构不连接到任何固相支持物。所述修饰的核苷酸的游离本性对于它们在尚未公布的专利申请FR 14-53455中所描述的方法中的使用来说是特别重要的，因为所述核苷酸被添加到本身被固定化的核酸片段。这些片段被释放，然后凭借刚刚并入的核苷酸的效应基团，随后通过相反末端附连到第二固相支持物。因此，附连到固相支持物的是所需序列的完整核酸链或多核苷酸，而不是用于构建所述多核苷酸的本发明的核苷酸。

本发明还涉及一种试剂盒，其包含至少一种本发明的修饰的核苷酸，更具体来说，所述试剂盒可以包含各种不同的修饰的核苷酸、延伸酶以及能够附连至少一种所述核苷酸的固相支持物。

附图简述

本发明将结合附图并利用下面的说明性实施例进行更详细描述，在所述附图中：

图1示出了作为本发明的主题的修饰的核苷酸的各种不同的通用结构；

图2呈现了式(V)的修饰的核苷酸的特定结构；

图3呈现了天然含氮碱基腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和鸟嘌呤的结构式；

图4示出了能够发生分子内氢键类型的相互作用的式(VI)的修饰物基团的实例；

图5图示描述了化合物NH₂-dTTP-NitroB-Biot的合成；

图6图示描述了化合物NH₂-dGTP-NitroN-Biot的合成；

图7图示描述了化合物FA-Biot-dNTP的合成；

图8图示描述了化合物dATP-NitroB-Biot的合成；

图9图示描述了化合物dCTP-NitroB-Biot的合成；

图10示出了聚合的化合物NH₂-dT-NitroB-Biot的去保护的实例；

图11示出了聚合的化合物NH₂-dG-NitroB-Biot的去保护的实例；

图12示出了聚合的化合物FA-Biot-dNTP的去保护的实例；

图13示出了聚合的化合物dA-NitroB-Biot的通过光切割的去保护的实例；

图14示出了聚合的化合物dC-NitroB-Biot的通过化学切割的去保护的实例；

图15呈现了符合本发明的修饰的核苷酸的实例，所述Q基团是邻苯二酚；

图16图示描述了化合物FA-Cat-dNTP的合成。

实施例

修饰的(受保护的)核苷酸的合成–说明性实施例1至6

实施例1–化合物NH₂-dTTP-NitroB-Biot的合成(图5)

步骤A1：向溶解在吡啶中的5g 2’-脱氧胸苷添加2.2ml Et₃N(三乙胺)和175mgDMAP(4-二甲基氨基吡啶)，然后添加5.25g DMTCl(4,4’-二甲氧基三苯甲基氯化物)，在室温下过夜。然后向混合物添加2.4ml Et₃N和1.27ml MsCl(甲磺酰氯)。在室温下温浴2h后，将混合物过滤并用乙酸乙酯洗涤。将滤液浓缩并溶解在75ml乙醇中，向其添加1M NaOH。在回流1.5h后，将混合物冷却到室温并添加1M HCl。在旋转蒸发仪中蒸发掉乙醇并将残留物用CH₂Cl₂萃取。在硅胶柱纯化后，获得产物dTTP-A1。

步骤A2：在0℃下，向2.237mmol产物dTTP-A1、2.1g三苯基膦和1.3g N-羟基苯邻二甲酰亚胺在50ml四氢呋喃中的溶液添加1.75ml N,N’-二异丙基偶氮二甲酸酯。在室温下重新加热过夜后，将反应产物用0.3ml水处理，并在真空下蒸发掉溶剂。大多数杂质通过层析消除，由此给出产物dTT-A2。

步骤A3：在室温下向1当量化合物dTT-A2添加DMF中的10当量LiH。将混合物反应30min。通过添加3-氨基-4-(溴甲基)-5-硝基苯基生物素继续进行反应，然后将混合物搅拌几小时。获得产物dTT-A3。

步骤A4：将化合物dTTP-A3重悬浮在甲醇中并用浓盐酸水溶液处理。将溶液冷却至-20℃过夜，得到产物dTTP-A4。

步骤A5：向溶解在2ml吡啶和1.7ml二噁烷中的425mg 5’-OH核苷类似物dTTP-A4添加130mg 2-氯-4H-1,2,3-苯并二氧磷-4-酮在1.3ml二噁烷中的溶液。将所述混合物在室温下留置20min。添加DMF中的1.4mmol三丁基焦磷酸铵和3.2mmol三丁基胺的混合物。20min后，添加180mg碘和0.28ml水在14ml吡啶中的溶液。30min后，通过添加5％Na₂SO₃水溶液停止反应。在真空下蒸发掉溶剂。添加25ml水和20ml CH₃CN。将混合物过滤并通过反相HPLC纯化，给出三磷酸酯化合物，在所讨论的情况下是dTTP-A5。

步骤A6：在-5℃下，向无水CH₃Cl₂中的3.725mmol化合物dTTP-A5添加0.385ml冷甲基肼。10min后，形成1,2-二氢-4-羟基-2-甲基-1-氧酞嗪的沉淀物。将混合物在室温下搅拌1h。通过过滤除去所述沉淀物并用CH₂Cl₂洗涤。然后将滤液在旋转蒸发仪中浓缩并通过层析纯化，给出产物NH₂-dTTP-NitroB-Biot。

实施例2–化合物NH₂-dGTP-NitroN-Biot的合成(图6)

步骤B1：向1.845mmol 2’-脱氧鸟苷和326mg咪唑在无水DMF中的搅拌的溶液添加2.4mmol叔丁基二甲基甲硅烷基氯化物。将所述反应在室温下搅拌温育20h。在真空下除去溶剂并将残留物通过层析进行纯化，给出产物dGTP-B1。

步骤B2：在0℃下，向2.237mmol产物dGTP-B1、2.1g三苯基膦和1.3g N-羟基苯邻二甲酰亚胺在50ml四氢呋喃中的溶液添加1.75ml N,N’-二异丙基偶氮二甲酸酯。在室温下重新加热过夜后，将反应产物用0.3ml水处理，并在真空下蒸发掉溶剂。通过层析除去大部分杂质，然后给出产物dGTP-B2。

步骤B3：使用10ml吡啶和真空下蒸发将3.785mmol化合物dGTP-B2干燥几次。将残留物溶解在12.5ml CH₂Cl₂中。添加9mmol二异丙基乙基胺和7.57mmol 6-氨基-4,5-双(碘氧基)-3-硝基萘-1-基-5-生物素。当反应完成时，将混合物在100ml CH₂Cl₂中稀释，并将有机相用50ml碳酸氢钠和50ml水洗涤。然后将它在硫酸钠上干燥。在真空下蒸发掉溶剂并将产物通过层析进行纯化，给出dGTP-B3。

步骤B4：将3.75mmol化合物dGTP-B3溶解在20ml THF中，并用THF中的1M TBAF(四正丁基氟化铵)处理。反应在搅拌约2h后完成。将混合物用CH₂Cl₂萃取并通过层析进行纯化，给出dGTP-B4。

步骤B5：与实施例1的步骤A5类似地对425mg 5’-OH核苷类似物进行处理。将最终的混合物过滤并通过反相HPLC进行纯化，以给出三磷酸酯化合物，在所讨论的情况下是dGTP-B5。

步骤B6：在-5℃下，向无水CH₂Cl₂中的3.725mmol化合物dGTP-B5添加0.385ml冷甲基肼。在10min后，形成1,2-二氢-4-羟基-2-甲基-1-氧酞嗪的沉淀物。将混合物在室温下搅拌1h。通过过滤除去所述沉淀物并用CH₂Cl₂洗涤。然后将滤液在旋转蒸发仪中浓缩并通过层析进行纯化，给出产物NH₂-dGTP-NitroN-Biot。

实施例3–化合物FA-Biot-dNTP的合成(图7)

步骤C1：将100μl 1Mω1-生物素壬酸的DMF溶液与100μl 1M羰基二咪唑的DMF溶液混合。咪唑离子的形成在室温下在30s内发生。然后向混合物添加100μl 50mM脱氧核糖核苷酸5’-三磷酸酯的水溶液。产物在室温下在12h内形成。然后将它用丙酮沉淀并溶解在水中，以便最终通过层析进行纯化，给出产物FA-Biot-dNTP。

实施例4–化合物dATP-NitroB-Biot的合成(图8)

步骤D1：向溶解在吡啶中的5g 2’-脱氧腺苷添加2.2ml Et₃N和175mg DMAP，然后添加5.25g DMTCl，在室温下过夜。然后向混合物添加2.4ml Et₃N和1.27ml MsCl。在室温下温育2h后，将混合物过滤并用乙酸乙酯洗涤。将滤液浓缩并溶解在75ml乙醇中，向其添加1MNaOH。在回流1.5h后，将混合物冷却至室温并添加1M HCl。在旋转蒸发仪中蒸发掉乙醇并将残留物用CH₂Cl₂萃取。在硅胶柱纯化后，获得产物dATP-D1。

步骤D2：向1.845mmol dATP-D1和326mg咪唑在无水DMF中的搅拌的溶液添加2.4mmol叔丁基二甲基甲硅烷基氯化物。将反应在室温下搅拌温育20h。通过施加真空除去溶剂并将残留物通过层析进行纯化，给出产物dATP-D2。

步骤D3：将化合物dATP-D2重悬浮在甲醇中并用浓盐酸水溶液处理。将溶液冷却至-20℃过夜，得到产物dATP-D3。

步骤D4：与实施例1的步骤A5类似地对425mg 5’-OH核苷类似物进行处理。将最终的混合物过滤并通过反相HPLC进行纯化，给出三磷酸酯化合物，在所讨论的情况下是dATP-D4。

步骤D5：将200μl pH 8.0的0.1M NaHCO₃中的3.1μmol化合物dATP-D4与200μl二甲基甲酰胺中的3.4μmol 2,2-叔丁基-1-(2-硝基-4-生物素)苯基)己基(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)碳酸酯混合。反应在室温下进行过夜，给出dATP-D5(Olejnik等，PNAS,1995,Vol 92,7590-7594)。

步骤D6：将3.75mmol混合物dATP-D5溶解在20ml THF中，并用1M TBAF(四正丁基氟化铵)的THF溶液处理。反应在搅拌约2h后完成。将混合物用CH₂Cl₂萃取并通过层析进行纯化，给出dATP-NitroB-Biot。

实施例5–化合物dCTP-NitroB-Biot的合成(图9)

步骤E1：向溶解在吡啶中的5g 2’-脱氧胞苷添加2.2ml Et₃N和175mg DMAP，然后添加5.25g DMTCl，在室温下过夜。然后向混合物添加2.4ml Et₃N和1.27ml MsCl。在室温下温育2h后，将混合物过滤并用乙酸乙酯洗涤。将滤液浓缩并溶解在75ml乙醇中，向其添加1MNaOH。在回流1.5h后，将混合物冷却至室温并添加1M HCl。在旋转蒸发仪中蒸发掉乙醇并将残留物用CH₂Cl₂萃取。在硅胶柱纯化后，获得产物dCTP-E1。

步骤E2：向1.845mmol dCTP-E1和326mg咪唑在无水DMF中的搅拌的溶液添加2.4mmol叔丁基二甲基甲硅烷基氯化物。将反应在室温下搅拌温育20h。通过施加真空除去溶剂并将残留物通过层析进行纯化，给出产物dCTP-E2。

步骤E3：将化合物dCTP-E2溶解在无水乙醇中并冷却至0℃。逐滴添加2,2-叔丁基-1-(2-硝基-4-生物素)苯基)丙基苯基碳酸酯在无水乙醇中的等摩尔溶液。将混合物在室温下搅拌过夜。将所述溶液过量，用水洗涤并用CH₂Cl₂萃取，给出dCTP-E3。

步骤E4：将化合物dCTP-E3重悬浮在甲醇中并用浓盐酸水溶液处理。将溶液冷却至-20℃过夜，得到产物dCTP-E4。

步骤E5：与实施例1的步骤A5类似地对425mg 5’-OH核苷类似物进行处理。将最终的混合物过滤并通过反相HPLC进行纯化，给出三磷酸酯化合物，在所讨论的情况下是dCTP-E5。

步骤E6：将3.75mmol混合物dCTP-E5溶解在20ml THF中，并用1M TBAF(四正丁基氟化铵)的THF溶液处理。反应在搅拌约2h后完成。将混合物用CH₂Cl₂萃取并通过层析进行纯化，给出dCTP-NitroB-Biot。

实施例6–化合物FA-Cat-dNTP的合成(图16)

步骤F1：将100μl 1M修饰物邻苯二酚酯的DMF溶液与110μl DMF中的1M二环己基碳二亚胺(DCC)和5μl 100％4-(二甲基氨基)吡啶混合。将混合物在0℃下温育5min。然后向混合物添加500μl 50mM脱氧核糖核苷酸5’-三磷酸酯的DMF溶液。产物在室温下在3h内形成。然后将它用丙酮沉淀并溶解在水中，以便最终通过层析进行纯化，给出产物FA-Cat-dNTP。

去保护

在向核酸链添加核苷酸后，下面的实施例7至11说明了对所述分子进行去保护、也就是说除去所述修饰物基团的实施方式。

实施例7–聚合的核苷酸NH₂-dT-NitroB-Biot的去保护(图10)

在下述过程期间同时进行各种不同修饰物基团的切割：将20mM化合物NH₂-dT-NitroB-Biot的水性溶液用包含350至700mM NaNO₂和1M NaOAc的pH 5.5的溶液进行处理。在室温下暴露于波长为365nm的UV光温育1至2min后，通过添加1M pH 7.0的磷酸盐缓冲液并停止照射来终止反应。所述去保护反应的产物是dT。

实施例8–聚合的核苷酸NH₂-dG-NitroN-Biot的去保护(图11)

在下述过程期间同时进行各种不同修饰物基团的切割：将20mM化合物NH₂-dG-NitroN-Biot的水性溶液用包含350至700mM NaNO₂和1M NaOAc的pH 5.5的溶液进行处理。在室温下暴露于波长为365nm的UV光温育1至2min后，通过添加1M pH 7.0的磷酸盐缓冲液并停止照射来终止反应。所述去保护反应的产物是dG。

实施例9–FA-Biot-dN类型的聚合的核苷酸的去保护(图12)

由3’-OH末端携带的修饰物基团的切割，通过用1至100mM的氨水溶液在室温下对酯官能团水解1h来进行。得到的产物是dN类型的。

实施例10–通过光切割进行的聚合的核苷酸dA-NitroB-Biot的去保护(图13)

含氮碱基上携带的修饰物基团的切割通过光切割来进行。将化合物dA-NitroB-Biot在室温下暴露于波长为300至370nm的UV源。在30至300秒后停止UV源，给出产物dA。

实施例11–通过化学切割进行的聚合的核苷酸dC-NitroB-Biol的去保护(图14)

含氮碱基上携带的修饰物基团的切割通过化学切割来进行。将0.01mmol化合物dC-NitroB-Biot溶解在0.1ml乙醇中。添加0.02mmol四氯钯酸钠II溶解在乙醇中的溶液。将氢气鼓泡通入混合物中并搅拌20min。得到的产物是dC。

Kobayashi等(Science,2004,304,1305-1308)描述了类似的程序，其使用固定化的钯，并且作为变化形式可以使用THF中的1ml/min的H₂气流。

实施例12–将本发明的核苷酸用于核酸合成

有利的是，作为本发明的主题的修饰的核苷酸可以按照在专利申请FR 14-53455中描述的方法，用于在不存在模板链的情况下进行核酸的酶法合成。被选择用于执行添加修饰核苷酸的步骤的酶是可商购的末端脱氧核苷酸转移酶或TdT。

用于引发所述合成的引物如下给出：

5'-AGCCAAGCGGTCGCGATGAT-3'

Seq N°1

所使用的修饰的核苷酸是按照实施例1制备的NH₂-dTTP-NitroB-Biot。它们可以向呈现的1号序列添加T。正如下面描述的，预期在每个延伸步骤期间仅向每个DNA片段添加一个核苷酸。

使用带有具有下述序列的“捕获”片段的玻璃板来捕获序列1的引物：5′-GTCCGCTTGGCT-3′Seq N°2，所述“捕获”片段通过其3’末端附连到该玻璃板。该玻璃板构成了体积为50μl的平行六面体反应室的底面。捕获使用添加有2pmol引物的缓冲溶液来进行，所述缓冲溶液包含：20mM Tris-HCl(pH＝7.5)，500mM LiCl和1mM EDTA。所述捕获步骤在室温下在30min的过程内进行。在引物被捕获后，通过三次添加和去除50μl下述缓冲溶液对板进行清洗：20mM Tris-HCl(pH＝7.5)，200mM LiCl和1mM EDTA。

合成始于向反应室添加下述试剂：50U TdT，1M二甲胂酸钾，125mM Tris-HCl，0.05％(v/v)Triton X-100，5mM CoCl₂，pH 7.2。接下来添加100μM NH₂-dTTP-NitroB-Biot核苷酸，它们是游离的并且在溶液中含有它们的平衡离子。最后加入2μM酶以便开始添加反应。总反应体积为50μl。将混合物在37℃下温育5min。

在合成反应完成后，将板用下述缓冲溶液清洗3次：20mM Tris-HCl(pH＝7.5)，200mM LiCl和1mM EDTA。这具有确保除去过量引入的NH₂-dTTP-NitroB-Biot核苷酸，保持反应室和固相支持物不含任何未反应的核苷酸的效果。在所述清洗结束时，向反应室添加50μl 20mM Tris-HCl缓冲液(pH＝7.5)并将温度提高到90℃。这具有确保脱下掺有修饰的核苷酸NH₂-dTTP-NitroB-Biot的片段的效果。将这些片段收集并转移到新的Eppendorf管中。

然后按照下述程序纯化掺有受保护的核苷酸NH₂-dTTP-NitroB-Biot的DNA片段。向50μl上面的反应混合物添加按照制造商的流程制备的包被有链亲和素的商品化磁珠(ThermoScientific)。在室温下温育1h后，利用适合的磁铁收集所述磁珠。然后除去上清液。然后将珠子用清洗缓冲液清洗3次：tris缓冲液，pH 7.2，含有0.1％Tween-20。

将附连有已掺入修饰的核苷酸NH₂-dTTP-NitroB-Biot的DNA片段的磁珠重悬浮在包含350至700mM的NaNO₂和1M NaOAc的pH 5.5的溶液中。将所述混合物在室温下，在暴露于UV(365nm)下温育1至2min。通过添加1M pH 7.0的磷酸盐缓冲液并停止照射来终止反应。这一操作能够将DNA片段从它们的支持物(珠子)上脱离。

利用适合的磁铁收集所述磁珠。回收上清液并通过电泳凝胶和MALDI-TOF MS谱仪进行分析，以便验证在超过99％的情况下T碱基正确掺入到1号序列的3’末端处。

随后如有必要，按照相同的流程进行新的延伸步骤。

实施例13–将本发明的核苷酸用于核酸合成的其他实例

有利的是，作为本发明的主题的修饰的核苷酸可以按照在专利申请FR 14-53455中描述的方法，用于在不存在模板链的情况下进行核酸的酶法合成。被选择用于执行添加修饰核苷酸的步骤的酶是可商购的末端脱氧核苷酸转移酶或TdT。

用于引发所述合成的引物如下给出：

5′-AGCCAAGCGGTCGCGATGAT-3′Seq N°1

所使用的修饰的核苷酸是按照实施例2制备的NH₂-dGTP-NitroB-Biot。它们可以向呈现的1号序列添加G。正如下面描述的，预期在每个延伸步骤期间仅向每个DNA片段添加一个核苷酸。

使用带有具有下述序列的捕获片段的玻璃板来捕获序列1的引物：5′-GTCCGCTTGGCT-3′Seq N°2，所述捕获片段通过其3’末端附连到该玻璃板。该玻璃板构成了体积为50μl的平行六面体反应室的底面。捕获使用添加有2pmol引物的缓冲溶液来进行，所述缓冲溶液包含：20mM Tris-HCl(pH＝7.5)，500mM LiCl和1mM EDTA。所述捕获步骤在室温下在30min的过程内进行。在引物被捕获后，通过三次添加和去除50μl下述缓冲溶液对板进行清洗：20mM Tris-HCl(pH＝7.5)，200mM LiCl和1mM EDTA。

合成始于向反应室添加下述试剂：50U TdT，1M二甲胂酸钾，125mM Tris-HCl，0.05％(v/v)Triton X-100，5mM CoCl₂，pH 7.2。接下来添加100μM核苷酸NH₂-dGTP-NitroB-Biot，它们是游离的并且在溶液中含有它们的平衡离子。最后加入2μM酶以便开始添加反应。总反应体积为50μl。将混合物在37℃下温育5min。

在合成反应完成后，将板用下述缓冲溶液清洗3次：20mM Tris-HCl(pH＝7.5)，200mM LiCl和1mM EDTA。这具有确保除去过量引入的NH₂-dGTP-NitroB-Biot核苷酸，保持反应室和固相支持物不含任何未反应的核苷酸的效果。在所述清洗结束时，向反应室添加50μl 20mM Tris-HCl缓冲液(pH＝7.5)并将温度提高到90℃。这具有确保脱下掺有修饰的核苷酸NH₂-dGTP-NitroB-Biot的片段的效果。将这些片段收集并转移到新的Eppendorf管中。

然后按照下述程序纯化掺有受保护的核苷酸NH₂-dGTP-NitroB-Biot的DNA片段。向50μl上面的反应混合物添加按照制造商的流程制备的包被有链亲和素的商品化磁珠(ThermoScientific)。在室温下温育1h后，利用适合的磁铁收集所述磁珠。然后除去上清液。然后将珠子用清洗缓冲液清洗3次：tris缓冲液，pH 7.2，含有0.1％Tween-20。

将附连有已掺入修饰的核苷酸NH₂-dGTP-NitroB-Biot的DNA片段的磁珠重悬浮在包含350至700mM的NaNO₂和1M NaOAc的pH 5.5的溶液中。将所述混合物在室温下，暴露于UV(365nm)温育1至2min。通过添加1M pH 7.0的磷酸盐缓冲液并停止照射来终止反应。这一操作允许DNA片段从它们的支持物(珠子)上“脱离”。

利用适合的磁铁收集所述磁珠。回收上清液并通过电泳凝胶和MALDI-TOF MS谱仪进行分析，以便验证在超过99％的情况下T碱基正确掺入到1号序列的3’末端处。

如有必要，随后按照相同的流程进行新的延伸步骤。

工业应用

作为本发明的主题的修饰的核苷酸，通过特别是允许非常长的核酸的非常高品质的合成，提高了核酸合成方法的性能水平。这些核苷酸能够用于以或多或少较大的规模生产合成的核酸序列或基因。这些修饰的核苷酸特别打算用于在生物技术领域或更普遍来说广泛的生物学领域中用于研究、开发或工业化目的的核酸例如DNA或RNA的合成。

序列表

<110> DNA斯克瑞普特公司

<120> 修饰的核苷酸

<130> PN000534

<140> PCT/FR2015/052310

<141> 2015-09-01

<150> FR1458194

<151> 2014-09-02

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> nucleic acid

<400> 1

agccaagcgg tcgcgatgat 20

<210> 2

<211> 12

<212> DNA

<213> nucleic acid

<400> 2

gtccgcttgg ct 12

Claims (9)

1.一种合成核酸聚合物的方法，所述方法包括以下步骤：

在不存在模板链的情况下使用末端脱氧核苷酸转移酶将修饰的核苷酸并入到多核苷酸链中，其中所述修饰的核苷酸包含与固相支持物形成复合物的可切割基团以及与3’-氧共价键合的可切割基团；

通过与固相支持物形成复合物，使用所并入的修饰的核苷酸来捕获所述多核苷酸链；以及

切割所述与固相支持物形成复合物的可切割基团以及所述与3’-氧共价键合的可切割基团，以释放纯化的多核苷酸链，

其中所述修饰的核苷酸包含“天然”含氮碱基或天然含氮碱基类似物、核糖或脱氧核糖碳水化合物以及至少一个磷酸酯基团，

其特征在于它包含被称为修饰物基团的R基团，所述基团：

-由所述天然含氮碱基或类似物携带，

使其能够在核酸合成期间阻断所述核苷酸的聚合和/或允许所述核苷酸与不同于另一个核苷酸的另一个分子相互作用，R包含至少一个功能性末端基团，所述核苷酸采取下面式(III)的形式：

其中：

(PP)PO表示单、二或三磷酸酯基团，

(OH)表示H或OH，

T是可切割原子团-NH₂；

任选地存在的M是共价键合到Q和Z的基团，M选自烷基、烯基、炔基、芳基、烷芳基、杂芳基、酰基、烷氧基、烷基氨基、烷氧基氨基、酰胺基、烷基酰亚胺基、烯基酰亚胺基、芳基酰亚胺基、氟代烷基、烷基磷酸酯、烷基硫基、硫代酰基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、烷基亚磺酰基、烷基铵、烷基锍、烷基甲硅烷基、烷基羰基、烷基氨甲酰基或烷基羟基氨基，

Z是可切割的–硝基苯基-基团，

Q是R基团的末端官能团或效应基团，Q选自生物素或双配位基配体，

“碱基”表示选自腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤或尿嘧啶的“天然”含氮碱基，或天然含氮碱基类似物，

其特征在于所述修饰物基团R由所述含氮碱基携带并形成下述结构(V)之一：

在所述结构中：

“糖”表示所述核苷酸分子的含氮碱基与核糖或脱氧核糖分子之间的连接，

Z₁和Z₂是相同或不同的可切割Z基团。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于由所述含氮碱基携带的所述修饰物基团R形成下列结构(VI)之一：

其中：

“糖”表示所述核苷酸分子的含氮碱基与核糖或脱氧核糖分子之间的连接，

X₁和X₂相同或不同，表示由M携带并能够与所述修饰的核苷酸的所述含氮碱基形成分子间氢键的氮、氧或硫原子。

3.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中所述修饰的核苷酸能被用作通常依赖于与正经历合成的链互补的模板核酸链的存在的聚合酶的底物，即使在不存在互补链的情况下。

4.根据前述权利要求任一项所述的方法，其特征在于所述R基团的功能性末端原子团Q能够根据下述相互作用对中的一者或另一者与核酸之外的分子相互作用：生物素/亲和素，生物素/链亲和素，双配位基配体/金属氧化物。

5.根据权利要求2所述的方法，其中X₁和X₂是–NH，T是–NH₂，Z是–CH₂，M是甲基硝基苯甲基-，并且Q是–生物素。

6.根据权利要求2所述的方法，其中X₁和X₂是–NH，T是–NH₂，Z、Z₁和Z₂各自是–O-，M是–硝基萘基-，并且Q是–生物素。

7.根据前述权利要求任一项所述的方法，其特征在于在核酸合成期间，T和Z或Z₁、Z₂是通过利用波长在10^-3至10^-11米之间的电磁辐射辐照所述核苷酸而可切割的。

8.根据权利要求1至7任一项所述的方法，其中将所述核苷酸并入到先前固定化在固相支持物上的多核苷酸链中。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于所述多核苷酸链通过其5’末端附连，并且所述核苷酸的并入通过所述多核苷酸链的3’末端进行。

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