CN107033069B - 一种新型布鲁顿酪氨酸激酶不可逆抑制剂 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种布鲁顿酪氨酸激酶的抑制剂，其是式(I)的化合物、或其药学可接受的盐、溶剂化物、酯、酸、代谢物或前体药物。本发明还提供包含所述化合物的药物组合物。本发明还提供使用该布鲁顿酪氨酸激酶抑制剂来抑制酪氨酸激酶活性或者治疗从布鲁顿酪氨酸激酶活性的抑制中获益的疾病、障碍或病症的方法和用途。

Description

一种新型布鲁顿酪氨酸激酶不可逆抑制剂

技术领域

本申请涉及一类作为布鲁顿酪氨酸激酶(Bruton's tyrosine kinase，Btk)的抑制剂的化合物、包含这些化合物的药物组合物、以及使用这些化合物或组合物抑制布鲁顿酪氨酸激酶活性的方法和用途。

背景技术

布鲁顿酪氨酸激酶是非受体酪氨酸激酶Tec家族的成员，它由PH结构域、TH结构域、SH3结构域、SH2结构域和催化结构域5部分组成。Btk参与多种信号通路，对细胞的增殖、分化和凋亡起着重要的调控作用，是在除了T淋巴细胞和自然杀伤细胞之外的所有造血细胞类型中表达的关键信号酶。Btk在连接细胞表面B细胞受体(B-cel1receptor，BCR)刺激至下游细胞内应答的B细胞信号传导途径中扮演至关重要的角色。

Btk是B细胞发育、激活、信号传导和存活的关键调节物(Kurosaki,Curr Op Imm,2000,276-281；Schaeffer和Schwartzberg,Curr Op Imm,2000,282-288)。另外，Btk在众多其它造血细胞信号传导途径中起作用，例如在巨噬细胞中的Toll样受体(Toll likereceptor，TLR)和细胞因子受体介导的TNF-α产生、在肥大细胞中的免疫球蛋白E受体(FcεRI)信号传导、在B-谱系淋巴样细胞中抑制Fas/APO-1细胞凋亡的信号传导以及胶原刺激的血小板聚集。参见例如C.A.Jeffries等(2003),Journal of Biological Chemistry 278:26258-26264；Vassilev等(1999),Journal of Biological Chemistry 274(3):1646-1656；Quek等(1998),Current Biology 8(20):1137-1140。

发明内容

本发明涉及布鲁顿酪氨酸激酶的抑制剂。具体而言，本发明的化合物包括式(I)的化合物、或其药学可接受的盐、溶剂化物、异构体、酯、酸、代谢物或前体药物：

其中，

R₁和R₂各自独立地选自氢、

R₃选自氢、C1-C8烷基、卤素、羟基、硝基、氰基、C1-C8卤代烷基、氨基、C1-C8烷基氨基、和-(CO)-R₇；

R₄、R₅和R₆各自独立地选自氢、卤素、羟基、氨基、硝基、氰基、C1-C8烷基、C3-C8环烷基、C1-C8卤代烷基、C1-C8烷氧基、C1-C8烷基氨基、杂环烷基、芳基和杂芳基，或者相邻的R₄、R₅和R₆中的任意两个一起构成C3-C8环烷基或者杂环烷基；

R₇选自C1-C8烷氧基、C1-C8烷基氨基、C3-C8环烷基氨基、C2-C8杂烷基氨基、C3-C8杂环烷基氨基、和任选地被卤素、羟基、氨基、硝基、氰基、C1-C8烷基、C1-C8烷氧基、或氨基保护基取代的杂环烷基。

在另一方面，本申请提供一种药物组合物，其包括治疗有效量的至少一种本文提供的化合物或其药学可接受的盐、溶剂化物、酯、酸、代谢物或前体药物，以及药学可接受的载体或赋形剂，以及任选的其它治疗剂。

上述药物组合物用于通过适当的途径和方式给药，该药物组合物包含有效浓度的本文提供的一种或多种化合物、或其药学可接受的盐、溶剂化物、酯、酸、代谢物或前体药物，其可释放有效量用于治疗、预防或改善由酪氨酸激酶活性调节的、或者受其影响的、或者其中涉及酪氨酸激酶活性的疾病、障碍或病症的一种或多种症状。所述有效量和浓度对于改善本文公开的任一种疾病、障碍或病症的症状是有效的。

在另一方面，本申请提供通过给予本文提供的化合物或药物组合物来治疗患者的方法。在一些实施方式中，本文提供用于抑制布鲁顿酪氨酸激酶(Btk)活性或者治疗从布鲁顿酪氨酸激酶(Btk)活性的抑制中获益的疾病、障碍或病症的方法，该方法包括对所述患者施用治疗有效量的、本文提供的至少任一种化合物或其药学可接受的盐、溶剂化物、酯、酸、代谢物或前体药物、或药物组合物。

在进一步方面中，上述由酪氨酸激酶活性调节的、或者受其影响的、或者其中涉及酪氨酸激酶活性的疾病、障碍或病症包括癌症，例如实体肿瘤的存在或发展、肉瘤、淋巴瘤(如B-细胞淋巴瘤)、白血病、腺癌(如乳腺导管癌、小叶癌)、黑色素瘤、或类似疾病、或其组合。在一个实施方式中，癌症是B细胞增生性疾病，例如弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、慢性淋巴细胞淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、B细胞前淋巴细胞性白血病、淋巴浆细胞淋巴瘤/瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(

acroglobulinemia)、脾边缘区淋巴瘤、浆细胞性骨髓瘤、浆细胞瘤、结外边缘区B细胞淋巴瘤、淋巴结边缘区B细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤(mantle cell lymphoma)、纵隔(胸腺)大B细胞淋巴瘤、血管内大B细胞淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、伯基特淋巴瘤(Burkitt lymphoma)或淋巴瘤样肉芽肿病、或类似疾病、或它们的组合。在一些实施方式中，本发明特别优选治疗急性髓系白血病(AML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)及其它B细胞增生性疾病例如慢性淋巴细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、滤泡性淋巴瘤、或类似疾病，或者它们的组合。

在一些实施方式中，本发明治疗有需要的受治疗者罹患自身免疫性疾病，例如关节炎、风湿性关节炎、骨关节炎、狼疮、类风湿性关节炎、炎性肠病、银屑病性关节炎、骨关节炎、斯蒂尔病(Still's disease)、青少年关节炎、糖尿病、重症肌无力症、桥本甲状腺炎(Hashimoto's thyroiditis)、奥德甲状腺炎(Ord's hyroiditis)、格雷夫斯病(Graves'disease)、类风湿性关节炎综合征(

syndrome)、多发性硬化症、传染性神经元炎(Guillain-Barrésyndrome)、急性播散性脑脊髓炎、阿狄森病(Addison's disease)、视性眼阵孪-肌阵孪综合征、强直性脊椎炎、抗磷脂抗体综合征、再生障碍性贫血、自身免疫性肝炎、乳糜泻(coeliac disease)、古德帕斯彻综合征(Goodpasture's syndrome)、特发性血小板减少性紫癜、视神经炎、硬皮病、原发性胆汁性肝硬化、莱特尔综合征(Reiter'ssyndrome)、高安动脉炎(Takayasu's arteritis)、颞动脉炎、温型自身免疫性溶血性贫血、韦格纳肉芽肿病(Wegener's granulomatosis)、银屑病、全身脱毛、贝赫切特病(Behcet'sdisease)、慢性疲劳、家族性自主神经功能异常、子宫内膜异位、间质性膀胱炎、神经肌强直、硬皮病或外阴痛。

另一方面，以上提及的被抑制的酪氨酸激酶包括布鲁顿酪氨酸激酶、布鲁顿酪氨酸激酶同源物或其Btk酪氨酸激酶半胱氨酸同源物，它们可与本发明的抑制剂共价结合。在具体的实施方式中，所述抑制剂与酪氨酸激酶上的半胱氨酸残基共价结合。

在进一步方面中，本申请提供通过对有需要的对象施用包含治疗有效量的本发明化合物的组合物，以治疗由布鲁顿酪氨酸激酶活性调节的或者受其影响的或者其中涉及酪氨酸激酶活性的疾病、障碍或病症(例如癌症)的方法，其中所述化合物与布鲁顿酪氨酸激酶形成共价键。在一个实施方式中，所述化合物与激活型的布鲁顿酪氨酸激酶形成共价键。在进一步或替代的实施方式中，所述化合物不可逆地抑制与其以共价键连接的布鲁顿酪氨酸激酶。在进一步或替代的实施方式中，所述化合物与布鲁顿酪氨酸激酶或布鲁顿酪氨酸酸激酶同源物的半胱氨酸残基形成共价键。在一个实施方式中，所述化合物选择性地和不可逆地结合Btk。在另一个实施方式中，所述化合物选择性地和不可逆地结合酪氨酸激酶Jak3(Janus Kinase 3，Jak3)。在另一个实施方式中，所述化合物选择性地和不可逆地结合染色体X上的骨髓酪氨酸激酶(bone marrow X kinase，BMX)。在另一个实施方式中，所述化合物选择性地和不可逆地结合表皮生长因子受体(Epidermal Growth Factor Receptor，EGFR)。

另一方面，本申请涉及调节(包括不可逆地抑制)哺乳动物的Btk或其它酪氨酸激酶的活性的方法，其中所述其它酪氨酸激酶可以具有半胱氨酸残基(包括Cys481残基)并可以与本文描述的至少一种不可逆抑制剂形成共价键而与Btk共享同源性。该方法包括对该哺乳动物施用至少一次有效量的至少一种式(I)的化合物或其药学可接受的盐、溶剂化物、酯、酸、代谢物或前体药物、或包括式(I)的化合物的药物组合物。

另一方面，本申请涉及式(I)的化合物或其药学可接受的盐、溶剂化物、酯、酸、代谢物或前体药物在制备用于治疗上述疾病、障碍或病症的药物中的用途。本申请还涉及式(I)的化合物或其药学可接受的盐、溶剂化物、酯、酸、代谢物或前体药物在制备用于调节(包括不可逆地抑制)哺乳动物的Btk或其它酪氨酸激酶活性的药物中的用途。

在进一步或替代的实施方式中，式(I)的化合物或其药学可接受的盐、溶剂化物、酯、酸、代谢物或前体药物是布鲁顿酪氨酸蛋白激酶(Btk)的不可逆抑制剂。在再进一步或替代的实施方式中，这些不可逆抑制剂针对Btk有选择性。在甚至再进一步或替代的实施方式中，这些抑制剂在Btk酶的测定试验中的EC₅₀为10μM以下。在一个实施方式中，Btk不可逆抑制剂的EC₅₀小于1μM，在另一个实施方式中，EC₅₀小于0.3μM。

在进一步或替代的实施方式中，相对于Itk(白介素-2(IL-2)_诱导型T-细胞激酶，还称为Emt或Tsk)而言，式(I)化合物是Btk的选择性不可逆抑制剂。在进一步或替代的实施方式中，相对于Lck(lymphocyte-specific protein tyrosine kinase，淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶)而言，式(I)的化合物是Btk的选择性不可逆抑制剂。在进一步或替代的实施方式中，相对于ABL(Abelson tyrosine-protein kinase1，Abelson非受体酪氨酸激酶)而言，式(I)的化合物是Btk的选择性不可逆抑制剂。在进一步或替代的实施方式中，相对于CMET(也称为Hepatocyte growth factor receptor，即HGFR，是人肝细胞生长因子受体)而言，式(I)的化合物是Btk的选择性不可逆抑制剂。在进一步或替代的实施方式中，相对于EGFR而言，式(I)的化合物是Btk的选择性不可逆抑制剂。在进一步或替代的实施方式中，相对于Lyn(V-yes-1Yamaguchi sarcoma viral related oncogene homolog，Lyn激酶)而言，式(I)的化合物是Btk的选择性不可逆抑制剂。

在进一步或替代的实施方式中，所述不可逆Btk抑制剂也是JAK3的抑制剂。

在进一步或替代的实施方式中，所述不可逆Btk抑制剂也是EGFR的抑制剂。

在进一步或替代的实施方式中，所述不可逆Btk抑制剂也是BMX的抑制剂。

根据下文的详细描述，本文描述的化合物、组合物、方法和用途的其它目的、特征和优势将会是显而易见的。但是，应该理解的是：具体实施方式仅仅是出于举例说明的目的给出，并且从这一详细描述出发，各种在本公开内容的精神和范围内的变化和修改对本领域技术人员而言将会是显而易见的。在本申请中所引用的所有文件或文件部分，包括但不限于专利、专利申请、文章、书籍、手册和论文，通过将其全部内容引入本文作为参考。

附图说明

图1a-1e示出化合物1、化合物6及化合物35对Btk的体外抑制活性以及不可逆性研究，其中图1a和图1b分别显示化合物1对BTK WT和BTK C481S的抑制作用；图1c示出化合物6对上述两种激酶的抑制作用；图1d和图1e示出化合物35对BTK WT和BTK C481S的抑制作用。

图2a-2f示出化合物1及化合物35在不同细胞中对BTK Y223及其下游信号通路的蛋白的影响，其中图2a显示化合物1在MEC-2细胞系中的结果；图2b显示化合物1在Pfeiffer细胞系中的结果；图2c显示化合物1在RAMOS细胞系中的结果；图2d显示化合物1在TMD8细胞系中的结果；图2e显示化合物1在U2932细胞系中的结果；图2f显示化合物35在MEC-1细胞系中的结果。

图3a-3b示出化合物1在不同细胞中对Btk不可逆性抑制作用的验证，其中图3a显示Pfeiffer细胞系中的结果；图3b显示U2932细胞系中的结果。

图4a-4b示出化合物1对Pfeiffer(图4a)和U2932(图4b)两种细胞系的细胞周期的影响。

具体实施方式

术语

除非另外定义，所有本文使用的科技术语都具有与要求保护的主题所属领域的技术人员一般理解相同的含义。

除非另有说明，本发明采用本领域技术范围内的质谱、NMR、HPLC、蛋白质化学、生物化学、重组DNA技术和药理学等常规方法。除非提供具体的定义，否则与本文描述的分析化学、合成有机化学、以及医学和药物化学等化学上相关的命名和实验室操作和技术，是本领域技术人员已知的。一般而言，前述技术和步骤可以通过本领域众所周知的和在各种一般文献和更具体文献中描述的常规方法来实施，这些文献在本说明书中被引用和讨论。

“烷基”是指脂肪族烃基团，可以是支链或直链的烷基。根据结构，烷基可以是单价基团或双价基团(即亚烷基)。在本发明中，烷基优选是具有1-8个碳原子的“低级烷基”，更优选1-6个碳原子或1-4个碳原子。典型的烷基包括但不限于甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基、己基等。

“烷氧基”是指-O-烷基，其中烷基如本文中定义。典型的烷氧基包括但不限于甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、戊氧基、己氧基等。

“烷氧基烷基”是指本文定义的烷基被本文定义的烷氧基取代。

术语“芳香基”是指平面环具有离域的π电子系统并且含有4n+2个π电子，其中n是整数。芳香基环可以由五、六、七、八、九或多于九个原子构成。芳香基可以是任选取代的。术语“芳香基”包括碳环芳基(例如苯基)和杂环芳基(或“杂芳基”或“杂芳香基”)基团(例如吡啶)。该术语包括单环或稠环多环(即共用相邻的碳原子对的环)基团。

本文使用的术语“芳基”是指芳香基环中每一个构成环的原子都是碳原子。芳基环可以由五、六、七、八、九或多于九个原子构成。芳基可以是任选取代的。芳基的实例包括但不限于苯基、萘基、菲基、蒽基、芴基和茚基。根据结构，芳基可以是单价基团或双价基团(即亚芳基)。

“烷基(芳基)”是指本文定义的烷基被本文定义的芳基取代。非限制性的烷基(芳基)包括苄基、苯乙基等。

术语“环烷基”是指单环或多环基，其仅含有碳和氢。环烷基包括具有3-10个环原子的基团。根据结构，环烷基可以是单价基团或双价基团(例如亚环烷基)。在本发明中，环烷基优选是具有3-8个碳原子的环烷基，更优选具有3-6个碳原子的“低级环烷基”。

“烷基(环烷基)”是指本文定义的烷基被本文定义的环烷基取代。非限制性的烷基(环烷基)包括环丙基甲基、环丁基甲基、环戊基甲基、环己基甲基等。

本文使用的术语“杂烷基”是指本文定义的的烷基中的一个或多个骨架链原子是杂原子，例如氧、氮、硫、硅、磷或它们的组合。所述杂原子(一个或多个)可以位于杂烷基内部的任意位置或在杂烷基与分子的其余部分相连的位置。

术语“杂芳基”是指芳基中包括一个或多个选自氮、氧和硫的环杂原子。含N“杂芳基”部分是指芳香基中环上至少有一个骨架原子是氮原子。根据结构，杂芳基可以是单价基团或双价基团(即亚杂芳基)。杂芳基的实例包括但不限于吡啶基、咪唑基、嘧啶基、吡唑基、三唑基、吡嗪基、四唑基、呋喃基、噻吩基、异噁唑基、噻唑基、噁唑基、异噻唑基、吡咯基、喹啉基、异喹啉基、吲哚基、苯并咪唑基、苯并呋喃基、吲唑基、吲嗪基、酞嗪基、哒嗪基、异吲哚基、蝶啶基、嘌呤基、噁二唑基、噻二唑基、呋咱基、苯并呋咱基、苯并噻吩基、苯并噻唑基、苯并噁唑基、喹唑啉基、萘啶基和呋喃并吡啶基等。

本文使用的术语“杂环烷基”是指非芳香基环中一个或多个构成环的原子是选自氮、氧和硫的杂原子。杂环烷基环可以由三、四、五、六、七、八、九或多于九个原子构成。杂环烷基环可以是任选取代的。杂环烷基的实例包括但不限于内酰胺、内酯、环亚胶、环硫代亚胺、环氨基甲酸酯、四氢噻喃、4H-吡喃、四氢吡喃、哌啶、1,3-二噁英、1,3-二噁烷、1,4-二噁英、1,4-二噁烷、哌嗪、1,3-氧硫杂环己烷、1,4-氧硫杂环己二烯、1,4-氧硫杂环己烷、四氢-1,4-噻嗪、2H-1,2-噁嗪、马来酰亚胺、琥珀酰亚胺、巴比妥酸、硫代巴比妥酸、二氧代哌嗪、乙内酰脲、二氢尿嘧啶、吗啉、三噁烷、六氢-1,3,5-三嗪、四氢噻吩、四氢呋喃、吡咯啉、吡咯烷、咪唑烷，吡咯烷酮、吡唑啉、吡唑烷、咪唑啉、咪唑烷、1,3-二氧杂环戊烯、1,3-二氧杂环戊烷、1,3-二硫杂环戊烯、1,3-二硫杂环戊烷、异噁唑啉、异噁唑烷、噁唑啉、噁唑烷、噁唑烷酮、噻唑啉、噻唑烷和1,3-氧硫杂环戊烷。根据结构，杂环烷基可以是单价基团或双价基团(即亚杂环烷基)。

术语“烷基(杂芳基)”是指本文定义的烷基被本文定义的杂芳基取代。

术语“烷基(杂环烷基)”是指本文定义的烷基被本文定义的杂环烷基取代。

术语“卤”或“卤素”是指氟、氯、溴和碘。

术语“卤代烷基”、“卤代烷氧基”和“卤代杂烷基”包括烷基、烷氧基或杂烷基的结构，其中至少一个氢被卤原子置换。在某些实施方式中，如果两个或更多氢原子被卤原子置换，所述卤原子彼此相同或不同。

本文使用的术语“氰基”是指式-CN基团。

术语“酯基”是指具有式-COOR的化学部分，其中R选自烷基、环烷基、芳基、杂芳基(通过环碳连接)和杂脂环基(通过环碳连接)。

术语“氨基”是指基团-NH₂。

术语“烷基氨基”是指进一步被一个或两个烷基取代的氨基取代基，具体是指基团-NRR’，其中R和R’各自独立地选自氢或低级烷基，条件是-NRR’不是-NH₂。术语“环烷基氨基”是指进一步被一个或两个本文所定义的环烷基取代的氨基取代基。术语“杂烷基氨基”是指进一步被一个或两个本文所定义的杂烷基取代的氨基取代基。本文的术语“芳烷基氨基”是指其中R是低级芳烷基且R’是氢、低级烷基、芳基或低级芳烷基的基团-NRR’。术语“氨基烷基”是指进一步被一个或多个氨基取代的烷基取代基。术语“羟烷基”或“羟基烷基”是指进一步被一个或多个羟基取代的烷基取代基。术语“氰基烷基”是指进一步被一个或多个氰基取代的烷基取代基。术语“烷基羰基”是指进一步被一个烷基取代的羰基。术语“烷基羰基烷基”是指进一步被一个烷基羰基取代的烷基。术语“烷氧基羰基”是指进一步被一个烷氧基取代的羰基。烷基氨基、环烷基氨基、杂烷基氨基、芳烷基氨基、氨基烷基、羟基烷基、氰基烷基、烷基羰基、烷基羰基烷基、以及烷氧基羰基中的烷基或芳基部分可以任选地被一个或多个取代基取代。

术语“任选取代的”或“取代的”是指所提及的基团可以被一个或多个额外的基团取代，所述额外的基团各自并且独立地选自烷基、环烷基、芳基、杂芳基、羟基、烷氧基、氰基、卤素、酰胺基、硝基、卤代烷基、氨基、氨基保护基等。

本文使用的术语“布鲁顿酪氨酸激酶”，是指来自智人(Homo sapiens)的布鲁顿酪氨酸激酶，其已公开在例如美国专利第6326469号(GenBank登录号NP_000052)。

本文使用的术语“布鲁顿酪氨酸激酶同源物”，是指布鲁顿酪氨酸激酶的直向同源物，例如来自小鼠(GenBank登录号AAB47246)、狗(GenBank登录号XP_549139)、大鼠(GenBank登录号NP_001007799)、鸡(GenBank登录号NP_989564)或斑马鱼(GenBank登录号XP_698117)的直向同源物，和前述任一的融合蛋白，其对一个或多个布鲁顿酪氨酸激酶底物(例如具有氨基酸序列“AVLESEEELYSSARQ”的肽底物)展示出激酶活性。

本文使用的术语“同源半胱氨酸”表示所提及的半胱氨酸残基处于与布鲁顿酪氨酸激酶的半胱氨酸481的位置同源的序列位置上。例如，半胱氨酸482是布鲁顿酪氨酸激酶的大鼠直向同源物的同源半胱氨酸；半胱氨酸479是鸡直向同源物的同源半胱氨酸；而半胱氨酸481是斑马鱼直向同源物中的同源半胱氨酸。具有同源半胱氨酸的激酶的其它实例见下表1。也参见在万维网kmase.com/human/kinome/phylogeny.html中公开的酪氨酸激酶(TK)的序列比对。

表1.Btk与其它酪氨酸激酶的序列对比

本文在提及激酶时提及的术语“抑制”、“抑制的”或“抑制剂”，是指磷酸转移酶活性被抑制。

本文使用的术语“不可逆抑制剂”是指当化合物与靶蛋白(例如激酶)接触时，引起与蛋白质或在蛋白质中形成新共价键，从而使一种或多种靶蛋白的生物活性(例如磷酸转移酶活性)降低或消除，尽管随后存在或不存在不可逆抑制剂。

本文使用的术语“不可逆Btk抑制剂”是指Btk抑制剂，其能与Btk的氨基酸残基形成共价键。在一个实施方式中，Btk的不可逆抑制剂能与Btk的Cys残基形成共价键；在具体实施方式中，所述不可逆抑制剂能与Btk的Cys481残基(或其它半胱氨酸)或与另一酪氨酸激酶的同源的相应位置中的半胱氨酸残基(同源半胱氨酸)(如表1所示)形成共价键。

本文公开的化合物的“代谢物”是当该化合物被代谢时形成的化合物的衍生物。术语“活性代谢物”是指当该化合物被代谢时形成的化合物的生物活性衍生物。本文使用的术语“被代谢”，是指特定物质被生物体改变的过程总和(包括但不限于水解反应和由酶催化的反应，例如氧化反应)。因此，酶可以产生特定的结构转变为化合物。例如，细胞色素P450催化各种氧化和还原反应，同时二磷酸葡萄糖甘酸基转移酶催化活化的葡萄糖醛酸分子至芳香醇、脂肪族醇、羧酸、胺和游离的巯基的转化。新陈代谢的进一步的信息可以从《ThePharmacological Basis of Therapeutics》，第九版，McGraw-Hill(1996)获得。本文公开的化合物的代谢物可以通过将化合物给予宿主并分析来自该宿主的组织样品、或通过将化合物与肝细胞在体外孵育并且分析所得化合物来鉴别。这两种方法都是本领域已知的。在一些实施方式中，化合物的代谢物是通过氧化过程形成并与相应的含羟基化合物对应。在一些实施方式中，化合物被代谢为药物活性代谢物。本文使用的术语“调节”，是指直接或间接与靶标相互作用，以改变靶标的活性，仅仅举例来说，包括增强靶标的活性、抑制靶标的活性、限制靶标的活性或者延长靶标的活性。

本文使用的术语“靶蛋白”是指能被化合物选择性地结合的蛋白质分子或部分蛋白质。在某些实施方式中，靶蛋白是Btk。在某些实施方式中，靶蛋白是Jak3。在某些实施方式中，靶蛋白是BMX。在某些实施方式中，靶蛋白是EGFR。

本文使用的IC₅₀是指在测量某一效应的分析中获得最大效应的50％抑制时特定测试化合物的量、浓度或剂量。

本文使用的EC₅₀是指测定化合物的剂量、浓度或量，其引起特定测定化合物诱导、刺激或加强的特定反应的50％的最大表达的剂量依赖反应。

本发明的布鲁顿酪氨酸激酶抑制剂

本发明涉及布鲁顿酪氨酸激酶的抑制剂。具体而言，本发明的化合物包括式(I)的化合物、或其药学可接受的盐、溶剂化物、酯、酸、代谢物或前体药物：

其中，

R₁和R₂各自独立地选自氢、

R₃选自氢、C1-C8烷基、卤素、羟基、硝基、氰基、C1-C8卤代烷基、氨基、C1-C8烷基氨基、和-(CO)-R₇；

R₄、R₅和R₆各自独立地选自氢、卤素、羟基、氨基、硝基、氰基、C1-C8烷基、C3-C8环烷基、C1-C8卤代烷基、C1-C8烷氧基、C1-C8烷基氨基、杂环烷基、芳基和杂芳基，或者相邻的R₄、R₅和R₆中的任意两个一起构成C3-C8环烷基或者杂环烷基；

R₇选自C1-C8烷氧基、C1-C8烷基氨基、C3-C8环烷基氨基、C2-C8杂烷基氨基、C3-C8杂环烷基氨基、和任选地被卤素、羟基、氨基、硝基、氰基、C1-C8烷基、C1-C8烷氧基、或氨基保护基取代的杂环烷基。

在优选的实施方式中，所述氨基保护基独立地选自新戊酰基(Piv)、叔丁氧羰基(Boc)、苄氧羰基(Cbz)、9-芴甲氧羰基(FMOC)、苄基(Bn)、对甲氧苄基(PMP)、烯丙氧羰基(Alloc)、和三氟乙酰基(Tfa)。

在又一优选的实施方式中，R₃选自氢、C1-C6烷基(例如甲基等)、和-(CO)-R₇；且R₇选自C1-C6烷氧基(例如甲氧基等)、C1-C6烷基氨基(例如二甲基氨基等)、C3-C6环烷基氨基(例如环丙基氨基等)、C2-C6杂烷基氨基(例如N-(2-甲氧基乙基)氨基、N,N-双(2-乙氧基乙基)氨基等)、C3-C6杂环烷基氨基(例如四氢吡喃-4-基氨基等)、和任选被取代的杂环烷基(例如吡咯烷基、杂环上的碳任选被羟基或烷氧基取代的哌啶基、吗啉基、氮任选被烷基或Boc取代的哌嗪基等)。

在另外优选的实施例方式中，R₄、R₅和R₆各自独立地选自氢、C1-C6烷基(例如甲基、乙基、叔丁基等)、C1-C6卤代烷基(例如三氟甲基等)、C1-C6烷氧基(例如甲氧基等)、C1-C6烷基氨基(例如二甲基氨基等)、杂环烷基(例如吗啉基、吡咯烷基等)，或者相邻的R₄、R₅和R₆中的任意两个一起构成C3-C6环烷基(例如环己基等)或者杂环烷基(例如二氧杂环戊基、二氧杂环己基等)。

在进一步优选的实施方式中，本发明的化合物包括式(II)的化合物、或其药学可接受的盐、溶剂化物、酯、酸、代谢物或前体药物：

其中，R₁、R₂、R₃、R₄、R₅和R₆如上文所定义。

优选地，在式(II)的化合物中，R₁为氢；R₂选自

且R₂更优选为

R₃为-(CO)-R₇，且R₇选自C1-C6烷基氨基、C3-C6环烷基氨基、C3-C6杂环烷基氨基、和任选被取代的杂环烷基，且R₇更优选为吗啉基；R₄选自C1-C6烷基、C1-C6烷基氨基、和杂环烷基，且R₅和R₆各自为氢，或者相邻的R₄、R₅和R₆中的任意两个一起构成C3-C6环烷基或杂环烷基，且R₄更优选地选自甲基、叔丁基、二甲基氨基、和吡咯烷基，或者R₄与相邻的R₅或R₆一起构成环己基或二氧杂环己基。

另外优选地，本发明涉及布鲁顿酪氨酸激酶的不可逆抑制剂，其包括上式(I)的化合物、或其药学可接受的盐、溶剂化物、酯、酸、代谢物或前体药物，其中R₁、R₃、R₄、R₅和R₆如上文所定义，R₂选自

且R₂更优选为

本文描述的是抑制酪氨酸激酶例如Btk活性的化合物。本文也描述了此化合物的药学可接受的盐、溶剂化物、酯、酸、药物活性代谢物和前体药物。

在另外的或进一步的实施方式中，将本文描述的化合物给予有需要的生物体后在其体内代谢产生代谢物，所产生的代谢物然后用于产生期望的效果，包括期望的治疗效果。

本文描述的化合物可以被制成和/或被用作药学可接受的盐。药学可接受的盐的类型包括但不限于：(1)酸加成盐、通过将化合物的游离碱形式与药学可接受的无机酸反应形成，所述无机酸如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、偏磷酸等；或与有机酸反应形成，所述有机酸如乙酸、丙酸、己酸、环戊烷丙酸、羟基乙酸、丙酮酸、乳酸、丙二酸、苹果酸、柠檬酸、琥珀酸、马来酸、酒石酸、反丁烯二酸、三氟乙酸、苯甲酸、3-(4-羟基苯甲酰基)苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲烷磺酸、乙烷磺酸、1，2-乙二磺酸、2-羟基乙磺酸、苯磺酸、甲苯磺酸、4-甲基双环-[2.2.2]辛-2-烯-1-甲酸、2-萘磺酸、叔丁基乙酸、葡庚糖酸、4,4'-亚甲基双-(3-羟基-2-烯-1-甲酸)、3-苯基丙酸、三甲基乙酸、十二烷基硫酸、葡糖酸、谷氨酸、水杨酸、羟基萘酸、硬脂酸、粘康酸等；(2)碱加成盐，其在母体化合物中的酸性质子被金属离子置换时形成，例如碱金属离子(例如锂、钠、钾)、碱土金属离子(例如镁或钙)或铝离子；或与有机碱配位。可接受的有机碱包括乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、三甲胺、N-甲基葡萄糖胺，等等。可接受的无机碱包括氢氧化铝、氢氧化钙、氢氧化钾、碳酸钠、氢氧化钠等。

药学可接受的盐的相应的平衡离子可以使用各种方法分析和鉴定，所述方法包括但不限于离子交换色谱、离子色谱、毛细管电泳、电感耦合等离子体、原子吸收光谱、质谱或它们的任何组合。

使用以下技术的至少一种回收所述盐：过滤、用非溶剂沉淀接着过滤、溶剂蒸发，或水溶液的情况下使用冻干法。

筛选和表征药学可接受的盐、多晶型和/或溶剂化物可以使用多种技术完成，所述技术包括但不限于热分析、X射线衍射、光谱、显微镜方法。使用的各种光谱技术包括但不限于Raman、FTIR、UVIS和NMR(液体和固体状态)。各种显微镜技术包括但不限于IR显微镜检术和拉曼(Raman)显微镜检术。

本发明的药物组合物

本申请还提供药物组合物，其包含至少一种式(I)的化合物或所述化合物的药学可接受的盐、溶剂化物、酯、酸、药物活性代谢物或前体药物，以及药学可接受的载体或赋形剂，以及者任选的其它治疗剂。

在治疗过程中，可以根据情况单独或与一种或多种其它的治疗剂组合使用。可以通过注射、口服、吸入、直肠和经皮施用中的至少一种将包含本发明化合物的药物施用给患者。其它的治疗剂可以选自以下药物：免疫抑制剂(例如他克莫司、环孢菌素、雷帕霉素、甲氨蝶呤、环磷酰胺、硫唑嘌呤、巯嘌呤、麦考酚酯或FTY720)、糖皮质激素类药(例如泼尼松、醋酸可的松、泼尼松龙、甲泼尼龙、地塞米松、倍他米松、曲安西龙、氢羟强的松龙、倍氯米松、醋酸氟氢可的松、醋酸脱氧皮质酮、醛固酮)、非甾体抗炎药(例如水杨酸盐、芳基烷酸、2-芳基丙酸、N-芳基邻氨基苯甲酸、昔康类、考昔类或硫酰替苯胺)、变态反应疫苗、抗组胺药、抗白三烯药、β-激动剂、茶碱、抗胆碱药或其它选择性激酶抑制剂(例如mTOR抑制剂、c-Met抑制剂)或her2抗体-药物。另外，所提及的其它治疗剂还可以是雷帕霉素(Rapamycin)、克唑替尼(Crizotinib)、他莫昔芬、雷洛昔芬、阿那曲唑、依西美坦、来曲唑、赫赛汀^TM(曲妥珠单抗)、格列卫^TM(伊马替尼)、紫杉醇^TM(紫杉醇)、环磷酰胺、洛伐他汀、美诺四环素(Minosine)、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶(5-FU)、甲氨蝶呤(MTX)、紫杉特尔^TM(多西他赛)、诺雷德^TM(戈舍瑞林)、长春新碱、长春碱、诺考达唑、替尼泊苷、依托泊苷、健择^TM(吉西他滨)、埃博霉素(Epothilone)、诺唯本、喜树碱、柔红霉素(Daunonibicin)、更生霉素、米托蒽醌、安吖啶、多柔比星(亚德里亚霉素)、表柔比星或伊达比星。或者，其它治疗剂也可以是细胞因子例如G-CSF(粒细胞集落刺激因子)。或者，其它治疗剂也可以组合用于同一治疗方案，例如但不限于，CMF(环磷酰胺、甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶)、CAF(环磷酰胺、亚德里亚霉素和5-氟尿嘧啶)、AC(亚德里亚霉素和环磷酰胺)、FEC(5-氟尿嘧啶、表柔比星和环磷酰胺)、ACT或ATC(亚德里亚霉素、环磷酰胺和紫杉醇)或CMFP(环磷酰胺、甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶和泼尼松)。

在本发明的实施方式中，在根据本发明对患者进行治疗时，给定药物的量取决于诸多因素，如具体的给药方案、疾病或病症类型及其严重性、需要治疗的受治疗者或宿主的独特性(例如体重)，但是，根据特定的周围情况，包括例如已采用的具体药物、给药途径、治疗的病症、以及治疗的受治疗者或宿主等，施用剂量可由本领域已知的方法常规决定。通常，就成人治疗使用的剂量而言，施用剂量典型地在0.02-5000mg/天，例如约1-1500mg/天的范围。该所需剂量可以方便地被表现为一剂、或同时给药的(或在短时间内)或在适当的间隔的分剂量，例如每天二、三、四剂或更多分剂。本领域技术人员可以理解的是，尽管给出了上述剂量范围，但具体的有效量可根据患者的情况并结合医师诊断而适当调节。

式(I)的化合物能不可逆地抑制Btk，并可以用于治疗罹患依赖布鲁顿酪氨酸激酶的或由布鲁顿酪氨酸激酶介导的病症或疾病的患者，这些病症或疾病包括但不限于癌症、自身免疫性疾病和其它炎性疾病。上述病症或疾病选自，B-细胞淋巴癌、肉瘤、淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、慢性淋巴细胞淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、B细胞前淋巴细胞性白血病、淋巴浆细胞淋巴瘤/瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(

acroglobulinemia)、脾边缘区淋巴瘤、浆细胞性骨髓瘤、浆细胞瘤、结外边缘区B细胞淋巴瘤、淋巴结边缘区B细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤(mantle cell lymphoma)、纵隔(胸腺)大B细胞淋巴瘤、血管内大B细胞淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、伯基特淋巴瘤(Burkittlymphoma)、白血病、淋巴瘤样肉芽肿病、乳腺导管癌、小叶癌、腺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、黑色素瘤、B-细胞淋巴癌、肉瘤、淋巴瘤、B细胞增生性疾病、B细胞增生性疾病、或类似疾病、或其组合。特别优选治疗急性髓系白血病(AML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、B细胞增生性疾病，例如慢性淋巴细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、滤泡性淋巴瘤或慢性淋巴细胞白血病、或类似疾病、或其组合。

化合物的制备

使用本领域技术人员已知的标准合成技术或使用本领域已知的方法与本文描述的方法组合，可以合成式(I)的化合物。另外，本文给出的溶剂、温度和其它反应条件可以根据本领域技术而调整。作为进一步的指导，也可以利用以下的合成方法。

所述反应可以按顺序使用，以提供本文描述的化合物；或它们可以用于合成片段，所述片段通过本文描述的方法和/或本领域已知的方法随后加入。

可以使用各种亲电子试剂或亲核试剂修饰本文描述的化合物，以形成新的官能团或取代基。表2列出了选择的共价键和前体官能团的实例，其制备并可以作为对可得的亲电子试剂和亲核试剂组合的种类的指引。前体官能团表示为亲电子基团和亲核基团。

表2.共价键及其前体的实例

在某些实施方式中，本文提供的是本文描述的酪氨酸激酶抑制剂化合物的制备方法及其使用方法。在某些实施方式中，本文描述的化合物可以使用以下合成的方案合成。可以使用与下述类似的方法，通过使用适当的可选择的起始原料，合成化合物。

用于合成本文描述的化合物的起始原料可以被合成或可以从商业来源获得。本文描述的化合物和其它相关具有不同取代基的化合物可以使用本领域技术人员已知的技术和原料合成。制备本文公开的化合物的一般方法可以来自本领域已知的反应，并且该反应可以通过由本领域技术人员所认为适当的试剂和条件修改，以引入本文提供的分子中的各种部分。

如果需要，反应产物可以使用常规技术分离和纯化，包括但不限于过滤、蒸馏、结晶、色谱等方法。这些产物可以使用常规方法表征，包括物理常数和图谱数据。

制备式(I)的化合物的合成方案的非限制性实施例参见方案I。

方案I

实施例1

N-(3-(5-((3-丙烯酰胺-4-(吗啉-4-羰基)苯基)氨基)-1-甲基-6-氧-1,6-二氢吡啶-3-基)-2-甲基苯基)-4-(叔丁基)苯甲酰胺1的合成：

第一步：化合物c的合成：

在N,N-二甲酰胺DMF中加入化合物a(1.00g,5.49mmol)，之后加入碳二亚胺EDCI(2.10g,10.95mmol)、1-羟基苯并三唑HOBt(0.74g,5.49mmol)室温搅拌30分钟，再加入化合物b(2.40ml,27.45mmol)。混合物室温搅拌8小时。旋蒸去除N,N-二甲酰胺DMF。加水后，乙酸乙酯萃取3次，再用饱和氯化钠溶液洗有机相1次。有机相使用无水硫酸镁干燥。过滤，滤液浓缩，柱层析得化合物c(1.13g，4.5mmol)，产率82％。

第二步：化合物d的合成：

在密封管中依次加入化合物c(1.00g,3.98mmol)、1,4-二氧六环(15ml)、4,5-双二苯基膦-9,9-二甲基氧杂蒽(346mg,0.597mmol)、三(二亚苄基丙酮)二钯Pd₂(dba)₃(364mg,0.398mmol)、碳酸铯Cs₂CO₃(3.89g,11.94mmol)、3,5-二溴-1-甲基吡啶-2(1H)-酮(1.27g,4.78mmol)。混合物在氩气保护下，在120℃下反应8小时。旋蒸去除1,4-二氧六环，加水后，用二氯甲烷萃取3次。有机相用饱和氯化钠溶液洗1次。有机相使用无水硫酸镁干燥。过滤，滤液浓缩，柱层析得化合物d(1.27g，2.9mmol)，产率73％。

第三步：化合物f的合成：

在无水二氯甲烷中加入化合物e(500mg,3.03mmol)，加入20μLN,N-二甲酰胺，然后缓慢加入草酰氯，室温搅拌2小时。混合物旋干得化合物f(526mg,2.88mmol)，产率95％。

第四步：化合物h的合成：

在乙醇中加入化合物g(500mg，2.32mmol)，加入二氯化锡水合物(2.62g，11.63mmol)，80℃下反应3小时。旋蒸去除乙醇，之后用饱和碳酸氢钠水溶液调节pH值到8左右。用硅藻土过滤，乙酸乙酯洗滤饼，收集滤液，乙酸乙酯萃取3次。旋干滤液得化合物h(410mg，2.20mmol)，产率95％。

第五步：化合物i的合成：

在无水二氯甲烷中加入化合物h(410mg，2.20mmol)，0℃下加入化合物f(409mg，2.20mmol)，加入DIPEA(380μL，2.20mmol)，搅拌1小时。加水萃灭，用二氯甲烷萃取。有机相用饱和氯化钠溶液洗1次。有机相使用无水硫酸镁干燥。过滤，滤液浓缩，柱层析得化合物i(696mg，2.09mmol)，产率96％。

第六步：化合物j的合成：

在1,4-二氧六环(80ml)中加入化合物i(600mg，1.80mmol)、1,1-双(二苯基膦)二茂铁二氯化钯(147mg,0.18mmol)、醋酸钾(530mg,5.4mmol)、联硼酸频那醇酯(914mg,3.6mmol)。在氩气保护下，在90℃搅拌8小时。旋蒸去除1,4-二氧六环，加水后，用二氯甲烷萃取3次。有机相用饱和氯化钠溶液洗1次。有机相使用无水硫酸镁干燥。过滤，滤液浓缩，柱层析得化合物j(554mg，1.46mmol)，产率81％。

第七步：化合物k的合成：

在1,4-二氧六环(80ml)中加入化合物j(554mg，1.46mmol)、化合物d(638mg，1.46mmol)、四(三苯基膦)钯Pd(PPh₃)₄(169mg,0.146mmol)、碳酸钠(442mg,4.38mmol)、水(5ml)，氩气保护下，在100℃搅拌8小时。旋蒸去除1,4-二氧六环，加水后，用二氯甲烷萃取3次。有机相用饱和氯化钠溶液洗1次。有机相使用无水硫酸镁干燥。过滤，滤液浓缩，柱层析得化合物k(454mg，0.745mmol)，产率51％。

第八步：化合物l的合成：

在甲醇中加入化合物k(400mg，0.655mmol)，加钯/碳(40mg)，氢气氛围下室温搅拌4小时。硅藻土过滤，滤液旋干得化合物l(353mg,0.609mmol)，产率93％

第九步：化合物1的合成：

在无水二氯甲烷中加入化合物l(50mg，0.086mmol)，0℃下加入丙烯酰氯(8.2μL，0.10mmol)，加入N,N-二异丙基乙胺DIPEA(15ul，0.086mmol)，搅拌10分钟。加水萃灭，用二氯甲烷萃取。有机相用饱和氯化钠溶液洗1次。有机相使用无水硫酸镁干燥。过滤，滤液浓缩，柱层析得化合物1(41mg，0.065mmol)，产率76％。Exact Mass(计算值):647.3108；MS(ESI)m/e(M+1)+:648.3113；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.97–9.79(m,2H),8.18–8.00(m,1H),7.99–7.86(m,2H),7.64–7.52(m,3H),7.35(d,J＝7.6Hz,1H),7.27(t,J＝7.6Hz,2H),7.24–7.18(m,2H),7.16(s,1H),7.10(d,J＝8.3Hz,1H),6.47(dd,J＝17.0,10.2Hz,1H),6.22(d,J＝16.8Hz,1H),5.70(d,J＝10.5Hz,1H),3.61(s,3H),3.56(s,4H),3.39(s,4H),2.21(s,3H),1.34(s,9H)。

实施例2

N-(3-(5-((3-氯乙酰胺-4-(吗啉-4-羰基)苯基)氨基)-1-甲基-6-氧-1,6-二氢吡啶-3-基)-2-甲基苯基)-4-(叔丁基)苯甲酰胺2的合成

化合物2的合成通过使用类似于实施例1中所述的步骤完成。Exact Mass(计算值):669.2718；MS(ESI)m/e(M+1)+:670.2736。

实施例3

N-(3-(5-((3-丙烯酰胺-4-(4-甲基哌嗪-1-羰基)苯基)氨基)-1-甲基-6-氧-1,6-二氢吡啶-3-基)-2-甲基苯基)-4-(叔丁基)苯甲酰胺3的合成

化合物3的合成通过使用类似于实施例1中所述的步骤完成。Exact Mass(计算值):660.3424；MS(ESI)m/e(M+1)+:661.3454。

实施例4

N-(3-(5-((2-丙炔酰胺-4-(吗啉-4-羰基)苯基)氨基)-1-甲基-6-氧-1,6-二氢吡啶-3-基)-2-甲基苯基)-4-(叔丁基)苯甲酰胺4的合成

化合物4的合成通过使用类似于实施例1中所述的步骤完成。Exact Mass(计算值):645.2951；MS(ESI)m/e(M+1)+:646.3001。

实施例5

N-(3-(5-((3-氯乙酰胺-4-(4-甲基哌嗪-1-羰基)苯基)氨基)-1-甲基-6-氧-1,6-二氢吡啶-3-基)-2-甲基苯基)-4-(叔丁基)苯甲酰胺5的合成

化合物5的合成通过使用类似于实施例1中所述的步骤完成。Exact Mass(计算值):682.3034；MS(ESI)m/e(M+1)+:683.3064。

实施例6

N-(3-(5-((3-丙酰胺-4-(吗啉-4-羰基)苯基)氨基)-1-甲基-6-氧-1,6-二氢吡啶-3-基)-2-甲基苯基)-4-(叔丁基)苯甲酰胺6的合成

化合物6的合成通过使用类似于实施例1中所述的步骤完成。Exact Mass(计算值):649.3264；MS(ESI)m/e(M+1)+:650.3234。

实施例7

4-(叔丁基)-N-(5-(2-氯乙酰胺)-2-甲基-3-(1-甲基-5-((4-(吗啉-4-羰基)苯基)氨基)-6-氧-1,6-二氢吡啶-3-基)苯基)苯甲酰胺7的合成

化合物7的合成通过使用类似于实施例1中所述的步骤完成。Exact Mass(计算值):669.2718；MS(ESI)m/e(M+1)+:670.2738。

实施例8

4-(叔丁基)-N-(5-(2-丙烯酰胺)-2-甲基-3-(1-甲基-5-((4-(吗啉-4-羰基)苯基)氨基)-6-氧-1,6-二氢吡啶-3-基)苯基)苯甲酰胺8的合成

化合物8的合成通过使用类似于实施例1中所述的步骤完成。Exact Mass(计算值):647.3108；MS(ESI)m/e(M+1)+:648.3118。

实施例9

N-(3-(5-((3-丙烯酰胺-4-(吗啉-4-羰基)苯基)氨基)-1-甲基-6-氧-1,6-二氢吡啶-3-)-2-甲基苯基)-4-(甲基)苯甲酰胺9的合成：

化合物9的合成通过使用类似于实施例1中所述的步骤完成。Exact Mass(计算值):605.2638；MS(ESI)m/e(M+1)+:606.2648。

实施例10

N-(3-(5-((3-丙酰胺-4-(吗啉-4-羰基)苯基)氨基)-1-甲基-6-氧-1,6-二氢吡啶-3-基)-2-甲基苯基)-4-(甲基)苯甲酰胺10的合成：

化合物10的合成通过使用类似于实施例1中所述的步骤完成。Exact Mass(计算值):607.2795；MS(ESI)m/e(M+1)+:608.2785。

实施例11

N-(3-(5-((3-氯乙酰胺-4-(吗啉-4-羰基)苯基)氨基)-1-甲基-6-氧-1,6-二氢吡啶-3-基)-2-甲基苯基)-4-(甲基)苯甲酰胺11的合成：

化合物11的合成通过使用类似于实施例1中所述的步骤完成。Exact Mass(计算值):627.2248；MS(ESI)m/e(M+1)+:628.2238。

实施例12

N-(3-(5-((3-丙烯酰胺-4-(吗啉-4-羰基)苯基)氨基)-1-甲基-6-氧-1,6-二氢吡啶-3-基)-2-甲基苯基)苯甲酰胺12的合成

化合物12的合成通过使用类似于实施例1中所述的步骤完成。Exact Mass(计算值):591.2482；MS(ESI)m/e(M+1)+:592.2442。

实施例13

N-(3-(5-((3-氯乙酰胺-4-(吗啉-4-羰基)苯基)氨基)-1-甲基-6-氧-1,6-二氢吡啶-3-基)-2-甲基苯基)苯甲酰胺13的合成

化合物13的合成通过使用类似于实施例1中所述的步骤完成。Exact Mass(计算值):613.2092；MS(ESI)m/e(M+1)+:614.2102。

实施例14

N-(3-(5-((3-丙酰胺-4-(吗啉-4-羰基)苯基)氨基)-1-甲基-6-氧-1,6-二氢吡啶-3-基)-2-甲基苯基)苯甲酰胺14的合成

化合物14的合成通过使用类似于实施例1中所述的步骤完成。Exact Mass(计算值):593.2638；MS(ESI)m/e(M+1)+:594.2653。

实施例15

N-(3-(5-((3-丙烯酰胺-4-(吗啉-4-羰基)苯基)氨基)-1-甲基-6-氧-1,6-二氢吡啶-3-基)-2-甲基苯基)-4-吗啉苯甲酰胺15的合成

化合物15的合成通过使用类似于实施例1中所述的步骤完成。Exact Mass(计算值):676.3009；MS(ESI)m/e(M+1)+:677.3001。

实施例16

N-(3-(5-((3-氯乙酰胺-4-(吗啉-4-羰基)苯基)氨基)-1-甲基-6-氧-1,6-二氢吡啶-3-基)-2-甲基苯基)-4-吗啉苯甲酰胺16的合成

化合物16的合成通过使用类似于实施例1中所述的步骤完成。Exact Mass(计算值):698.2620；MS(ESI)m/e(M+1)+:699.2701。

实施例17

N-(3-(5-((3-丙酰胺-4-(吗啉-4-羰基)苯基)氨基)-1-甲基-6-氧-1,6-二氢吡啶-3-基)-2-甲基苯基)-4-吗啉苯甲酰胺17的合成

化合物17的合成通过使用类似于实施例1中所述的步骤完成。Exact Mass(计算值):678.3166；MS(ESI)m/e(M+1)+:679.3144。

实施例18

N-(3-(5-((3-丙烯酰胺-4-(吗啉-4-羰基)苯基)氨基)-1-甲基-6-氧-1,6-二氢吡啶-3-基)-2-甲基苯基)-苯并[d][1,3]二氧杂环戊基-5-甲酰胺18的合成

化合物18的合成通过使用类似于实施例1中所述的步骤完成。Exact Mass(计算值):635.2380；MS(ESI)m/e(M+1)+:636.2351。

实施例19

N-(3-(5-((3-氯乙酰胺-4-(吗啉-4-羰基)苯基)氨基)-1-甲基-6-氧-1,6-二氢吡啶-3-基)-2-甲基苯基)-苯并[d][1,3]二氧杂环戊基-5-甲酰胺19的合成

化合物19的合成通过使用类似于实施例1中所述的步骤完成。Exact Mass(计算值):657.1990；MS(ESI)m/e(M+1)+:658.2001。

实施例20

N-(3-(5-((3-丙酰胺-4-(吗啉-4-羰基)苯基)氨基)-1-甲基-6-氧-1,6-二氢吡啶-3-基)-2-甲基苯基)-苯并[d][1,3]二氧杂环戊基-5-甲酰胺20的合成

化合物20的合成通过使用类似于实施例1中所述的步骤完成。Exact Mass(计算值):637.2536；MS(ESI)m/e(M+1)+:638.2601。

实施例21

N-(3-(5-((3-丙烯酰胺苯基)氨基)-1-甲基-6-氧-1,6-二氢吡啶-3-基)-2-甲基苯基)-4-(叔丁基)苯甲酰胺21的合成

化合物21的合成通过使用类似于实施例1中所述的步骤完成。Exact Mass(计算值):534.2631；MS(ESI)m/e(M+1)+:535.2644。

实施例22

N-(3-(5-((3-氯乙酰胺苯基)氨基)-1-甲基-6-氧-1,6-二氢吡啶-3-基)-2-甲基苯基)-4-(叔丁基)苯甲酰胺22的合成

化合物22的合成通过使用类似于实施例1中所述的步骤完成。Exact Mass(计算值):556.2241；MS(ESI)m/e(M+1)+:557.2265。

实施例23

N-(3-(5-((3-丙酰胺苯基)氨基)-1-甲基-6-氧-1,6-二氢吡啶-3-基)-2-甲基苯基)-4-(叔丁基)苯甲酰胺23的合成

化合物23的合成通过使用类似于实施例1中所述的步骤完成。Exact Mass(计算值):536.2787；MS(ESI)m/e(M+1)+:537.2798。

实施例24

N-(4-丙酰胺-2-甲基-3-(1-甲基-5-((4-(吗啉-4-羰基)苯基)氨基)-6-氧-1,6-二氢吡啶-3-基)-2-甲基苯基)-4-(叔丁基)苯甲酰胺24的合成

化合物24的合成通过使用类似于实施例1中所述的步骤完成。Exact Mass(计算值):647.3108；MS(ESI)m/e(M+1)+:647.3091。

实施例25

N-(3-(5-((3-丙烯酰胺-4-甲基苯基)氨基)-1-甲基-6-氧-1,6-二氢吡啶-3-基)-2-甲基苯基)-4-(叔丁基)苯甲酰胺25的合成

化合物25的合成通过使用类似于实施例1中所述的步骤完成。Exact Mass(计算值):548.2787；MS(ESI)m/e(M+1)+:549.2795。

实施例26

N-(3-(5-((3-氯乙酰胺-4-甲基苯基)氨基)-1-甲基-6-氧-1,6-二氢吡啶-3-基)-2-甲基苯基)-4-(叔丁基)苯甲酰胺26的合成

化合物26的合成通过使用类似于实施例1中所述的步骤完成。Exact Mass(计算值):570.2398；MS(ESI)m/e(M+1)+:571.2406。

实施例27

N-(3-(5-((3-丙酰胺-4-甲基苯基)氨基)-1-甲基-6-氧-1,6-二氢吡啶-3-基)-2-甲基苯基)-4-(叔丁基)苯甲酰胺27的合成

化合物27的合成通过使用类似于实施例1中所述的步骤完成。Exact Mass(计算值):550.2944；MS(ESI)m/e(M+1)+:551.2964。

实施例28

2-丙烯酰胺-4-((5-(3-(4-(叔丁基)苯甲酰胺)-2-甲基苯基)-1-甲基-2-氧-1,2-二氢吡啶-3-基)氨基)-N,N-二甲基苯甲酰胺28的合成

化合物28的合成通过使用类似于实施例1中所述的步骤完成。Exact Mass(计算值):605.3002；MS(ESI)m/e(M+1)+:606.3001。

实施例29

2-氯乙酰胺-4-((5-(3-(4-(叔丁基)苯甲酰胺)-2-甲基苯基)-1-甲基-2-氧-1,2-二氢吡啶-3-基)氨基)-N,N-二甲基苯甲酰胺29的合成

化合物29的合成通过使用类似于实施例1中所述的步骤完成。Exact Mass(计算值):627.2612；MS(ESI)m/e(M+1)+:628.2645。

实施例30

2-丙酰胺-4-((5-(3-(4-(叔丁基)苯甲酰胺)-2-甲基苯基)-1-甲基-2-氧-1,2-二氢吡啶-3-基)氨基)-N,N-二甲基苯甲酰胺30的合成

化合物30的合成通过使用类似于实施例1中所述的步骤完成。Exact Mass(计算值):607.3159；MS(ESI)m/e(M+1)+:608.3180。

实施例31

N-(3-(5-((3-丙烯酰胺-4-(吡咯烷-1-羰基)苯基)氨基)-1-甲基-6-氧-1,6-二氢吡啶-3-基)-2-甲基苯基)-4-(叔丁基)苯甲酰胺31的合成

化合物31的合成通过使用类似于实施例1中所述的步骤完成。Exact Mass(计算值):631.3159；MS(ESI)m/e(M+1)+:632.3178。

实施例32

N-(3-(5-((3-氯乙酰胺-4-(吡咯烷-1-羰基)苯基)氨基)-1-甲基-6-氧-1,6-二氢吡啶-3-基)-2-甲基苯基)-4-(叔丁基)苯甲酰胺32的合成

化合物32的合成通过使用类似于实施例1中所述的步骤完成。Exact Mass(计算值):653.2769；MS(ESI)m/e(M+1)+:654.2796。

实施例33

N-(3-(5-((3-丙酰胺-4-(吡咯烷-1-羰基)苯基)氨基)-1-甲基-6-氧-1,6-二氢吡啶-3-基)-2-甲基苯基)-4-(叔丁基)苯甲酰胺33的合成

化合物33的合成通过使用类似于实施例1中所述的步骤完成。Exact Mass(计算值):633.3315；MS(ESI)m/e(M+1)+:634.3354。

实施例34

N-(3-(5-((3-丙烯酰胺-4-(4-羟基哌啶-1-羰基)苯基)氨基)-1-甲基-6-氧-1,6-二氢吡啶-3-基)-2-甲基苯基)-4-(叔丁基)苯甲酰胺化合物34的合成

化合物34的合成通过使用类似于实施例1中所述的步骤完成。Exact Mass(计算值):661.3264；MS(ESI)m/e(M+1)+:662.3272。

实施例35

N-(3-(5-((3-丙烯酰胺-4-(吗啉-4-羰基)苯基)氨基)-1-甲基-6-氧-1,6-二氢吡啶-3-基)-2-甲基苯基)-4-(二甲基氨基)苯甲酰胺35的合成

化合物35的合成通过使用类似于实施例1中所述的步骤完成。Exact Mass(计算值):656.2514；MS(ESI)m/e(M+1)+:657.2541。实施例36

N-(3-(5-((3-氯乙酰胺-4-(吗啉-4-羰基)苯基)氨基)-1-甲基-6-氧-1,6-二氢吡啶-3-基)-2-甲基苯基)-4-(二甲基氨基)苯甲酰胺36的合成

化合物36的合成通过使用类似于实施例1中所述的步骤完成。Exact Mass(计算值):656.2514；MS(ESI)m/e(M+1)+:657.2523。

实施例37

N-(3-(5-((3-丙酰胺-4-(吗啉-4-羰基)苯基)氨基)-1-甲基-6-氧-1,6-二氢吡啶-3-基)-2-甲基苯基)-4-(二甲基氨基)苯甲酰胺37的合成

化合物37的合成通过使用类似于实施例1中所述的步骤完成。Exact Mass(计算值):636.3060；MS(ESI)m/e(M+1)+:637.3094。

实施例38

4-(2-丙烯酰胺-4-((5-(3-(4-(叔丁基)苯甲酰胺)-2-甲基苯基)-1-甲基-2-氧-1,2-二氢吡啶-3-基)氨基)苯甲酰)哌嗪-1-羧酸叔丁酯38的合成

化合物38的合成通过使用类似于实施例1中所述的步骤完成。Exact Mass(计算值):746.3792；MS(ESI)m/e(M+1)+:747.3802。

实施例39

4-(2-丙酰胺-4-((5-(3-(4-(叔丁基)苯甲酰胺)-2-甲基苯基)-1-甲基-2-氧-1,2-二氢吡啶-3-基)氨基)苯甲酰)哌嗪-1-羧酸叔丁酯39的合成

化合物39的合成通过使用类似于实施例1中所述的步骤完成。Exact Mass(计算值):748.3948；MS(ESI)m/e(M+1)+:749.3985。

实施例40

N-(3-(5-((3-丙烯酰胺-4-(哌嗪-1-羰基)苯基)氨基)-1-甲基-6-氧-1,6-二氢吡啶-3-基)-2-甲基苯基)-4-(叔丁基)苯甲酰胺40的合成

化合物40的合成通过使用类似于实施例1中所述的步骤完成。Exact Mass(计算值):646.3268；MS(ESI)m/e(M+1)+:647.3272。

实施例41

N-(3-(5-((3-丙酰胺-4-(哌嗪-1-羰基)苯基)氨基)-1-甲基-6-氧-1,6-二氢吡啶-3-基)-2-甲基苯基)-4-(叔丁基)苯甲酰胺41的合成

化合物41的合成通过使用类似于实施例1中所述的步骤完成。Exact Mass(计算值):648.3424；MS(ESI)m/e(M+1)+:649.3444。

实施例42

N-(3-(5-((3-丙烯酰胺-4-(吗啉-4-羰基)苯基)氨基)-1-甲基-6-氧-1,6-二氢吡啶-3-基)-2-甲基苯基)-3,4,5-三甲氧基苯甲酰胺42的合成

化合物42的合成通过使用类似于实施例1中所述的步骤完成。Exact Mass(计算值):681.2799；MS(ESI)m/e(M+1)+:682.2809。

实施例43

N-(3-(5-((3-丙烯酰胺-4-(吗啉-4-羰基)苯基)氨基)-1-甲基-6-氧-1,6-二氢吡啶-3-基)-2-甲基苯基)-5,6,7,8-四氢化萘-2-甲酰胺43的合成

化合物43的合成通过使用类似于实施例1中所述的步骤完成。Exact Mass(计算值):645.2951；MS(ESI)m/e(M+1)+:646.3001。

实施例44

N-(3-(5-((3-丙烯酰胺-4-(吗啉-4-羰基)苯基)氨基)-1-甲基-6-氧-1,6-二氢吡啶-3-基)-2-甲基苯基)-2,3-二氢苯并[b][1,4]二噁英-6-甲酰胺44的合成

化合物44的合成通过使用类似于实施例1中所述的步骤完成。Exact Mass(计算值):649.2536；MS(ESI)m/e(M+1)+:650.2564。

实施例45

N-(3-(5-((3-丙烯酰胺-4-(吗啉-4-羰基)苯基)氨基)-1-甲基-6-氧-1,6-二氢吡啶-3-基)-2-甲基苯基)-4-(吡咯烷-1-基)苯甲酰胺45的合成

化合物45的合成通过使用类似于实施例1中所述的步骤完成。Exact Mass(计算值):660.3060；MS(ESI)m/e(M+1)+:661.3091。

实施例46

2-丙烯酰胺-4-((5-(3-(4-(叔丁基)苯甲酰胺)-2-甲基苯基)-1-甲基-2-氧-1,2-二氢吡啶-3-基)氨基)-N-环丙基苯甲酰胺46的合成

化合物46的合成通过使用类似于实施例1中所述的步骤完成。Exact Mass(计算值):617.3002；MS(ESI)m/e(M+1)+:618.3047。

实施例47

N-(3-(5-((3-丙烯酰胺-4-(3-羟基哌啶-1-羰基)苯基)氨基)-1-甲基-6-氧-1,6-二氢吡啶-3-基)-2-甲基苯基)-4-(叔丁基)苯甲酰胺47的合成

化合物47的合成通过使用类似于实施例1中所述的步骤完成。Exact Mass(计算值):661.3264；MS(ESI)m/e(M+1)+:662.3299。

实施例48

N-(3-(5-((3-丙烯酰胺-4-(4-甲氧基哌啶-1-羰基)苯基)氨基)-1-甲基-6-氧-1,6-二氢吡啶-3-基)-2-甲基苯基)-4-(叔丁基)苯甲酰胺48的合成

化合物48的合成通过使用类似于实施例1中所述的步骤完成。Exact Mass(计算值):675.3421；MS(ESI)m/e(M+1)+:676.3447。

实施例49

2-丙烯酰胺-4-((5-(3-(4-(叔丁基)苯甲酰胺)-2-甲基苯基)-1-甲基-2-氧-1,2-二氢吡啶-3-基)氨基)苯甲酸甲酯49的合成

化合物49的合成通过使用类似于实施例1中所述的步骤完成。Exact Mass(计算值):592.2686；MS(ESI)m/e(M+1)+:593.2696。

实施例50

N-(3-(5-((3-丙烯酰胺-4-(哌啶-1-羰基)苯基)氨基)-1-甲基-6-氧-1,6-二氢吡啶-3-基)-2-甲基苯基)-4-(二甲基氨基)苯甲酰胺50的合成

化合物50的合成通过使用类似于实施例1中所述的步骤完成。Exact Mass(计算值):632.3111；MS(ESI)m/e(M+1)+:633.3150。

实施例51

2-丙烯酰胺-4-((5-(3-(4-(二甲基氨基)苯甲酰胺)-2-甲基苯基)-1-甲基-2-氧-1,2-二氢吡啶-3-基)氨基)-N-(四氢-2H-吡喃-4-基)苯甲酰胺51的合成

化合物51的合成通过使用类似于实施例1中所述的步骤完成。Exact Mass(计算值):648.3060；MS(ESI)m/e(M+1)+:649.3078。

实施例52

N-(3-(5-((3-丙烯酰胺-4-(4-甲氧基哌啶-1-羰基)苯基)氨基)-1-甲基-6-氧-1,6-二氢吡啶-3-基)-2-甲基苯基)-4-(二甲基氨基)苯甲酰胺52的合成

化合物52的合成通过使用类似于实施例1中所述的步骤完成。Exact Mass(计算值):662.3217；MS(ESI)m/e(M+1)+:663.3243。

实施例53

2-丙烯酰胺-4-((5-(3-(4-(二甲基氨基)苯甲酰胺)-2-甲基苯基)-1-甲基-2-氧-1,2-二氢吡啶-3-基)氨基)-N-(2-甲氧基乙基)苯甲酰胺53的合成

化合物53的合成通过使用类似于实施例1中所述的步骤完成。Exact Mass(计算值):622.2904；MS(ESI)m/e(M+1)+:623.2941。

实施例54

2-丙烯酰胺-4-((5-(3-(4-(二甲基氨基)苯甲酰胺)-2-甲基苯基)-1-甲基-2-氧-1,2-二氢吡啶-3-基)氨基)-N,N-双(2-乙氧基乙基)苯甲酰胺54的合成

化合物54的合成通过使用类似于实施例1中所述的步骤完成。Exact Mass(计算值):708.3635；MS(ESI)m/e(M+1)+:709.3653。

实施例55

N-(3-(5-((3-丙烯酰胺-4-(3-羟基哌啶-1-羰基)苯基)氨基)-1-甲基-6-氧-1,6-二氢吡啶-3-基)-2-甲基苯基)-4-(二甲基氨基)苯甲酰胺55的合成

化合物55的合成通过使用类似于实施例1中所述的步骤完成。Exact Mass(计算值):648.3060；MS(ESI)m/e(M+1)+:649.3094。

实施例56

N-(3-(5-((3-丙烯酰胺-4-(4-羟基哌啶-1-羰基)苯基)氨基)-1-甲基-6-氧-1,6-二氢吡啶-3-基)-2-甲基苯基)-4-(二甲基氨基)苯甲酰胺56的合成

化合物56的合成通过使用类似于实施例1中所述的步骤完成。Exact Mass(计算值):648.3060；MS(ESI)m/e(M+1)+:649.3094。

实施例57

N-(3-(5-((3-丙烯酰胺-4-(吗啉-4-羰基)苯基)氨基)-1-甲基-6-氧-1,6-二氢吡啶-3-基)-2-甲基苯基)-3-(三氟甲基)苯甲酰胺57的合成

化合物57的合成通过使用类似于实施例1中所述的步骤完成。Exact Mass(计算值):659.2356；MS(ESI)m/e(M+1)+:660.2378。

实施例58

N-(3-(5-((3-丙烯酰胺-4-(吗啉-4-羰基)苯基)氨基)-1-甲基-6-氧-1,6-二氢吡啶-3-基)-2-甲基苯基)-4-甲氧基苯甲酰胺58的合成

化合物58的合成通过使用类似于实施例1中所述的步骤完成。Exact Mass(计算值):621.2587；MS(ESI)m/e(M+1)+:622.2603。

实施例59

N-(3-(5-((3-丙烯酰胺-4-(吗啉-4-羰基)苯基)氨基)-1-甲基-6-氧-1,6-二氢吡啶-3-基)-2-甲基苯基)-3-甲氧基苯甲酰胺59的合成

化合物59的合成通过使用类似于实施例1中所述的步骤完成。Exact Mass(计算值):621.2587；MS(ESI)m/e(M+1)+:622.2603。

实施例60

N-(3-(5-((3-丙烯酰胺-4-(吗啉-4-羰基)苯基)氨基)-1-甲基-6-氧-1,6-二氢吡啶-3-基)-2-甲基苯基)-4-(三氟甲基)苯甲酰胺60的合成

化合物60的合成通过使用类似于实施例1中所述的步骤完成。Exact Mass(计算值):659.2356；MS(ESI)m/e(M+1)+:660.2377。

实施例61

N-(3-(5-((3-丙烯酰胺-4-(吗啉-4-羰基)苯基)氨基)-1-甲基-6-氧-1,6-二氢吡啶-3-基)-2-甲基苯基)-3,4-二甲氧基苯甲酰胺61的合成

化合物61的合成通过使用类似于实施例1中所述的步骤完成。Exact Mass(计算值):651.2693；MS(ESI)m/e(M+1)+:652.2724。

实施例62

N-(3-(5-((3-丙烯酰胺-4-(吗啉-4-羰基)苯基)氨基)-1-甲基-6-氧-1,6-二氢吡啶-3-基)-2-甲基苯基)-4-乙基苯甲酰胺62的合成

化合物62的合成通过使用类似于实施例1中所述的步骤完成。Exact Mass(计算值):619.2795；MS(ESI)m/e(M+1)+:620.2817。

实施例63

N-(3-(5-((3-丙烯酰胺-4-(吗啉-4-羰基)苯基)氨基)-1-甲基-6-氧-1,6-二氢吡啶-3-基)-2-甲基苯基)-4-甲基-3-(三氟甲基)苯甲酰胺63的合成

化合物63的合成通过使用类似于实施例1中所述的步骤完成。Exact Mass(计算值):673.2512；MS(ESI)m/e(M+1)+:674.2534。

实施例64

N-(3-(5-(3-(氯乙酰胺-4-(吗啉-4-羰基)苯基)氨基)-1-甲基-6-氧-1,6-二氢吡啶-3-基)-2-甲基苯基)苯甲酰胺化合物64的合成

化合物64的合成通过使用类似于实施例1中所述的步骤完成。Exact Mass(计算值):613.2092；MS(ESI)m/e(M+1)+:614.2101。

实施例65

N-(3-(5-((3-丙烯酰胺-4-(吗啉-4-羰基)苯基)氨基)-1-甲基-6-氧-1,6-二氢吡啶-3-基)-2-甲基苯基)苯甲酰胺化合物65的合成

化合物65的合成通过使用类似于实施例1中所述的步骤完成。Exact Mass(计算值):591.2482；MS(ESI)m/e(M+1)+:592.2492。

实施例66

N-(3-(5-(2-(2-氯乙酰胺-4-(吗啉-4-羰基)苯基)氨基)-1-甲基-6-氧-1,6-二氢吡啶-3-基)-2-甲基苯基)苯甲酰胺化合物66的合成

化合物66的合成通过使用类似于实施例1中所述的步骤完成。Exact Mass(计算值):613.2092；MS(ESI)m/e(M+1)+:614.2101。

实施例67

N-(3-(5-(2-(丙烯酰胺-4-(吗啉-4-羰基)苯基)氨基)-1-甲基-6-氧-1,6-二氢吡啶-3-基)-2-甲基苯基)苯甲酰胺化合物67的合成

化合物67的合成通过使用类似于实施例1中所述的步骤完成。Exact Mass(计算值):591.2482；MS(ESI)m/e(M+1)+:592.2492。

实施例68

N-(3-(5-((3-氯乙酰胺-4-(吗啉-4-羰基)苯基)氨基)-1-甲基-6-氧-1,6-二氢吡啶-3-基)-2-甲基苯基)-4-(叔丁基)苯甲酰胺68的合成

化合物68的合成通过使用类似于实施例1中所述的步骤完成。Exact Mass(计算值):669.2718；MS(ESI)m/e(M+1)+:670.2728。

实施例69

N-(3-(5-((2-丙烯酰胺-4-(吗啉-4-羰基)苯基)氨基)-1-甲基-6-氧-1,6-二氢吡啶-3-基)-2-甲基苯基)-4-(叔丁基)苯甲酰胺69的合成

化合物69的合成通过使用类似于实施例1中所述的步骤完成。Exact Mass(计算值):647.3108；MS(ESI)m/e(M+1)+:648.3115。

实施例70

Btk的体外抑制活性以及不可逆性的验证

如下所述，在无细胞激酶测定中，测定了本文公开的一些化合物对Btk的EC₅₀。

将BTK野生型质粒和突变型质粒(C481S)分别感染SF9细胞(购自invitrogen)中，经过三代病毒扩增后，将P3代病毒感染SF9细胞，培养72h后收集细胞并纯化BTK WT和BTKC481S蛋白。将不同浓度3nM、10nM、30nM、100nM、300nM、1000nM的BTK-M-035分别加入至BTKWT和BTK C481S的蛋白中，室温反应30min后加入100μM ATP 37℃反应20min。结果示于图1a-图1e中，其中“BTK”代指BTK蛋白、“BTK WT”代指野生型BTK蛋白、“BTK C481S”代指C481S突变型BTK蛋白。附图的结果表明，化合物1和化合物35对BTK WT蛋白具有强烈的抑制作用，化合物1的EC50值为4.7nM，化合物35的EC50为16nM。同样的实验中，化合物1及化合物35对BTK C481S的抑制作用明显减弱很多，化合物1的EC50值为185.1nM，化合物35的EC50为186nM。同时，与化合物1结构相近的化合物6(其与化合物1的区别仅在于R₂取代基的末端为单键，为可逆抑制剂)对BTK WT、BTK C481S均无抑制作用。这样的结果说明，化合物1及化合物35是BTK的不可逆抑制剂。

实施例71

Btk抑制剂对细胞中上下游信号通路的影响

通过测定许多细胞生物化学终点和功能性终点，我们进一步表征了化合物的性质。具体地，我们评估了化合物1及化合物35对与Btk抑制相对密切相关的蛋白激酶AKT、ErK的选择性。将不同浓度0nM、1nM、3nM、10nM、30nM、100nM、300nM、1000nM的化合物1分别对MEC-2(慢性B细胞白血病细胞，购自ATCC)、Pfeiffer(人弥漫性大细胞淋巴瘤B淋巴细胞，购自南京科佰生物科技有限公司)、Ramos细胞(人体B淋巴癌细胞，购自ATCC)、TMD8细胞(弥漫性大B细胞淋巴瘤细胞，购自ATCC)、和U2932(B-细胞淋巴癌细胞，购自ATCC)、以及化合物35对MEC-1(人B细胞慢性淋巴细胞白血病细胞株，购自ATCC)进行给药，4小时后，用抗IgM刺激10分钟，收集样品。在此实验中，以PCI32765(购自上海皓元化学)、CGI1746(购自Hao YuanChemexpress公司，上海)和化合物6(本发明制备)作为对照(参见图2a-2f)。

我们测定化合物对BTKY223、BTKY551、PLCγ₁Y783、PLCγ₂Y759、PLCγ₂Y1217、P-NF-κB P65、P-AKT Ser473、Erk Thr202/Tyr204等磷酸化的影响(图2a-2f)。结果表明，化合物1及化合物35能够选择性地抑制Btk上的酪氨酸Y223的磷酸化，并且抑制作用显著(图2a-2f)。

实施例72

新型激酶抑制剂对细胞凋亡的影响

为了证明用药以后细胞的死亡是通过凋亡还是坏死而引起，将0.5μM、1μM、5μM、10μM不同浓度的化合物1对Pfeiffer(人弥漫性大细胞淋巴瘤B淋巴细胞，购自南京科佰生物科技有限公司)和U2932(B-细胞淋巴癌细胞，购自ATCC)进行给药。48小时后，检测化合物1在细胞中对与细胞凋亡密切相关的DNA修复酶聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶PARP、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶Caspase 3蛋白剪切的影响。

实验结果如图3a和3b所示：结果表明化合物1在Pfeiffer和U2932中能够引起细胞的凋亡，在10μM下能够看到明显的DNA修复酶聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶PARP的剪切，而且还能够看到PARP的下游Caspase 3的剪切。

实施例73

新型激酶抑制剂对细胞周期的影响

为了研究用药后细胞被阻止在哪个生长周期，分别在Pfeiffer(人弥漫性大细胞淋巴瘤B淋巴细胞，购自南京科佰生物科技有限公司)和U2932(B-细胞淋巴癌细胞，购自ATCC)细胞中测试了化合物1对这些细胞株的细胞周期分布的影响。用不同浓度的0.5μM、1μM、5μM、10μM的化合物1、10μM的PCI32765以及10μM的化合物6(图4a)或1μM的化合物6(图4b)作用于上述两株细胞作用48小时后，收集细胞，用1X PBS缓冲液洗涤两次，用75％的乙醇于-20℃固定24小时，用1X PBS缓冲液再洗涤两次，加0.5mL 1X PBS缓冲液和0.5mL的PI染色液(购自美国BD Bioscience)到细胞中并将细胞放置于黑暗避光37℃染色15分钟，然后用流式细胞仪(BD FACS Calibur)检测细胞周期分布。结果参见图4a-4b。

实验结果如图4a-4b所示：化合物1对上述两株细胞株的细胞周期均有影响。在10μM化合物1下，细胞周期显著地被阻止在G0-G1期。

实施例74

BTK抑制剂的体外酶活实验验证

采用ATP-Glo试剂盒(购自Progema，美国)，在体外酶活实验测定中测定化合物对BTK的体外酶活。

分别取BTK蛋白激酶9μL(浓度为1.5ng/μL)，将其与三倍梯度稀释的下表中的药物化合物(1μL)于室温反应4小时(药物终浓度为10μM、3μM、1μM、0.3μM、0.1μM、0.03μM、0.01μM、0.003μM)；

加入2μL ATP和3μL底物Poly(4:1Glu,Tyr)Peptide(Promega，美国)(终浓度分别为10μM和0.2μg/μL)，37℃反应1小时；

取5μL反应后的BTK激酶溶液，加入5μL ADP-Glo^TM(Promega，美国)试剂于室温反应40min，以终止激酶反应并消耗完剩余的ATP；

加入10μL激酶检测试剂将ADP转化成ATP，使用偶联的萤光素酶/萤光素反应检测新合成的ATP，利用Envision读数后作图，计算IC50值。

实验结果表3所示：化合物1和35对BTK蛋白具有强烈的抑制作用，IC50分别为7.09nM和5nM。结果还显示，化合物6也有较强的抑制作用，将表3的结果与实施例70的结果结合分析，说明化合物1是很强的BTK抑制剂，而化合物6对BTK的抑制作用较化合物1弱很多，这也可以说明化合物1是BTK不可逆抑制剂，而化合物6是可逆抑制剂。从结构上分析，这是因为BTK481位的半胱氨酸可以加成到化合物1中的丙烯酰胺上的双键上，牢牢地结合在BTK蛋白上，从而抑制BTK蛋白激酶的磷酸化，阻断BTK信号通路；而化合物6没有这样的双键，虽然能够抑制BTK的磷酸化，但是化合物6与BTK的结合是可逆的结合。

表3在体外测试中得到的不同化合物对BTK的IC50

Claims (5)

1.一种化合物或其药学可接受的盐，所述化合物选自以下化合物：

2.一种药物组合物，其包括如权利要求1所述的化合物或其药学可接受的盐，以及药学上可接受的载体或赋形剂，以及任选的其它治疗剂。

3.如权利要求1所述的化合物或其药学可接受的盐或如权利要求2所述的药物组合物，在制备用于抑制布鲁顿酪氨酸激酶活性的药物中的用途。

4.如权利要求1所述的化合物或其药学可接受的盐或如权利要求2所述的药物组合物，在制备用于治疗或预防由布鲁顿酪氨酸激酶活性调节的或者受其影响的疾病、障碍或病症的药物中的用途。

5.如权利要求4所述的用途，其中所述疾病、障碍或病症是癌症。

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