CN107002097B - 改进的hvt作为载体的nd-ibd疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明涉及针对目标动物的新的和改进的HVT作为载体的ND‑IBD疫苗，其含有包含来自IBDV的VP2基因和来自NDV的F基因的重组HVT。重组HVT可用于家禽疫苗中，所述家禽疫苗相对于现有技术构建体展现NDV F‑和IBDV VP2基因的良好的病毒载体复制、有效表达，针对ND和IBD的改进的免疫保护以及改善的遗传稳定性。

Description

改进的HVT作为载体的ND-IBD疫苗

本发明涉及兽医疫苗、即基于重组火鸡疱疹病毒(HVT)作为病毒载体的针对ND和IBD的家禽疫苗的领域。具体而言，本发明涉及重组DNA表达盒，包含重组DNA表达盒的重组HVT，基于重组HVT或包含重组HVT的宿主细胞的家禽疫苗。此外，本发明涉及表达盒、重组HVT和宿主细胞用于疫苗的制备和使用的方法和用途。

马立克氏病(MD)是世界范围内发生的高度传染性的家禽疾病，并且其特征在于在几种器官和神经中存在T细胞淋巴瘤。这导致各种症状，尤其是麻痹和死亡。新生雏鸡可以被来自免疫母体的母体来源的抗体(MDA)保护。MD由马立克氏病病毒(MDV)引起，所述马立克氏病病毒(MDV)属于α疱疹病毒亚科和马立克病毒属。病毒粒子是有包膜的，并且大小约160 nm。在衣壳内包含大小为100和200 kbp之间的线性双链DNA的大基因组。

存在不同血清型的MDV，其各自具有不同的特征。尽管MDV血清型1(MDV1)和MDV2对家禽致病，但MDV3没有。MDV3更通常被称为：Meleagrid疱疹病毒1，火鸡疱疹病毒，但通常为：火鸡疱疹病毒(HVT)。HVT在1970年被描述为对鸡不致病(apathogenic)的火鸡疱疹病毒(Witter等人, 1970, Am. J. Vet. Res., vol. 31, p. 525)。自那时起HVT毒株例如PB1或FC-126已通常用于针对由MDV1或MDV2引起的MD接种鸡。并且在需要针对毒力更强的MDV1变体的保护的情况下，HVT与MDV2疫苗毒株例如SB1组合使用，如在Nobilis™ MarexineCA126+SB1 (MSD Animal Health)中，或与减毒MDV1疫苗毒株例如Rispens组合，例如在Nobilis™ RISMAVAC+CA126 (MSD Animal Health)中。

HVT在鸟类的外周血淋巴细胞(PBL)中复制，并且因此是诱导主要针对细胞免疫系统的长持续时间的免疫反应的全身性病毒。

HVT疫苗作为冷冻的HVT感染的细胞市售，并且可以在早期应用于鸡，因为它们对于针对HVT的抗体相对不敏感(例如MDA中)。因为新出生的雏鸡从其第一天起面临MDV的感染压力，因此HVT疫苗尽可能早地(例如在其从蛋中孵化的当天(第一天)，或甚至在孵化前仍在蛋中时)接种到雏鸡内。该后一种方法，所谓的‘卵内接种(in ovo vaccination)’，是胚胎接种的形式，其通常在胚胎发育(ED)的第18天(在孵化前约3天)应用。

除了用作疫苗本身之外，HVT还被用作用于将各种免疫原性蛋白表达和递送给家禽的病毒载体疫苗，参见例如，WO 87/04463。通常，表达的基因编码对需要针对其接种的家禽致病的微生物的保护性抗原(的一部分)。多年来，许多异源基因已经在HVT载体中表达，例如来自：新城疫病毒(NDV) (Sondermeijer等人, 1993, Vaccine, vol. 11, p. 349-358)、传染性法氏囊病病毒(IBDV) (Darteil等人, 1995, Virology, vol. 211, p. 481-490)和寄生虫抗原(Cronenberg等人, 1999, Acta Virol., vol. 43, p. 192-197)。

HVT载体疫苗向家禽的施用因此生成针对所表达的异源基因、以及针对HVT(其针对MD进行保护)的免疫反应。这应用于多种商业HVT载体疫苗产品中，例如：NDV F蛋白基因：Innovax™-ND(MSD Animal Health)，和Vectormune™ HVT-NDV(Ceva)；或IBDV VP2基因：Vaxxitek™ HVT+IBD(Merial；先前命名为：Gallivac™ HVT-IBD)、和Vectormune™ HVT-IBD(Ceva)。

或者，HVT载体可用于表达和递送治疗性蛋白，例如细胞因子，以操纵鸡的免疫反应(WO 2009/156.367; Tarpey等人, 2007, Vaccine, vol. 25, p. 8529-8535)。

HVT的基因组核苷酸序列例如可作为：AF291866(毒株FC-126)得自GenBank™。已描述了用于将异源基因插入HVT内的几种方法，例如通过使用同源重组(Sondermeijer等人，同上)、粘粒再生(US 5,961,982)或杆粒(细菌人工染色体)(Baigent等人，2006，J. ofGen. Virol.，vol. 87，p. 769-776)。

用于将异源基因构建体插入HVT基因组内的许多遗传位置已进行研究，并且几个合适的非必需基因座已得到描述，例如在HVT基因组的独特短(Us)区(unique shortregion)中(EP 431.668)；或在HVT独特长(UL)区(unique long region)中(EP 794.257)。

不同启动子已用于驱动异源基因在HVT的表达盒中的表达，例如：PRV gpX启动子(WO 87/04.463)，劳斯肉瘤病毒LTR启动子、SV40早期基因启动子，鸡β-肌动蛋白基因启动子(EP 1.298.139)或来自人(hCMV IE1)或鼠(mCMV IE1)巨细胞病毒的立即早期1基因启动子，参见：EP 728.842。近来，描述了HVT载体疫苗，其表达来自单一构建体的NDV和IBDV的抗原：WO 2013/057.235。

对于重组载体的构建，待插入载体的基因组内的异源核酸通常包含至少一个异源基因或编码区，其编码抗原(的至少免疫原性部分)。而且，构建体可以包含启动子序列以驱动异源基因的表达和调节信号例如增强子或转录终止子。此组合的插入片段通常称为‘表达盒’。

表达盒插入载体的基因组内的作用不同，这取决于其插入的位置和方式：载体基因组的大小可以变得更大、相同或更小，这取决于对基因组的净结果是否分别是遗传材料的添加、替换或缺失。插入位置也可以具有作用：置于基因组的编码区、非编码区或调节区内。其中，这些选择影响了所得载体疫苗在其复制和表达能力及其遗传稳定性方面的特征。

无论构建体多么精确，插入的表达盒必须允许活的重组病毒载体克服对其稳定性和功效的许多生物应激：首先，在已接受异源插入片段后复制和生成后代的能力。这指示尽管插入其基因组内，但重组载体病毒本身仍是活的。接下来，在体外在宿主细胞系中复制多个循环，同时正确地和完全地保持异源插入片段的复制和表达的能力。这指示重组体未由于插入而在其复制方面减弱，并且插入的表达盒是稳定维持且表达的。第三，体内复制和表达。这指示重组病毒可以克服活动物中例如由其免疫系统造成的强选择压力。在这个环境中，载体对异源基因的表达丧失会有利于在动物中的更快速复制；此类‘逃避突变体(escape mutants)’可以具有在外源基因或在其调节序列中的获得性突变或主要缺失，并且该突变体可以使完整病毒载体过度生长。最后且最重要的是，在目标中的载体的复制和异源基因的表达需要能够生成有效的针对微生物的免疫反应，所述微生物是载体表达的异源插入片段的供体。

因而，重组载体疫苗必须提供载体及其插入片段在体外和体内的良好复制，和一种或多种异源基因在体内的有效表达，其优选为高水平并随着时间保持一致，以诱导且维持目标中的保护性免疫反应。

这个特征组合将允许在体外的大量轮次的复制(这是大规模生产必需的)以及当载体疫苗在接种的目标动物中复制时插入的外源基因的持续表达和呈递给宿主的免疫系统。此外，这在复制和表达方面的稳定性是载体疫苗符合非常高的安全性和生物稳定性标准所需的，在获得来自政府或监管当局的上市许可后，待作为商业产品引入领域内的重组病毒必须满足所述标准。

新城疫(ND)和传染性法氏囊病(IBD)是重要的家禽疾病，其在全世界发生且可以引起养禽业中关于动物福利和经济运行的严重负面效应。这被描述例如于手册中，如：‘TheMerck veterinary manual (2010, 第10版, 2010, C.M. Kahn编, ISBN:091191093X)和：‘Disease of poultry’ (2008, 第12版, Y. Saif编, Iowa State Univ. press, ISBN-10:0813807182)。

ND由新城疫病毒(NDV)引起，所述新城疫病毒(NDV)属于单股反链病毒目(Mononegavirales)，具体为副粘液病毒科(Paramyxoviridae)，并且可以根据其毒力分组成不同致病型：非致病性弱毒型(lentogenic)NDV在家禽中几乎不引起症状。相比之下，中毒型(mesogenic)(中等致病性)和高毒型(velogenic)(高致病性)NDV毒株引起广泛疾病和死亡率，并且因此是许多国家中的法定传染病。疾病症状包括呼吸和神经异常，并且喘息(gasping)和‘斜颈’是最值得注意的体征。

在商业家禽操作中，针对由致病性NDV毒株引起的感染和/或疾病的保护通过家禽的常规接种来实现，通常在孵化当天，使用活的弱毒型NDV毒株，例如Nobilis™ ND Clone30(MSD Animal Health)。

NDV具有非节段、负义、单链RNA基因组，其大小为约15 kb，并且含有六种基因，在其中有融合(F)糖蛋白的基因。F蛋白参与NDV附着宿主细胞和进入宿主细胞内，并且作为免疫优势蛋白，其可以是针对NDV的有效免疫反应的基础。NDV F蛋白作为天然F0蛋白表达，所述F0蛋白在通过细胞外肽酶切割后被活化。

IBD由传染性法氏囊病病毒(IBDV)(也被称作‘禽肾病病毒’，双核糖核酸病毒科的成员)引起。这些病毒具有由双链RNA的两个节段(A和B)组成的基因组。较大节段A编码110kDa的多蛋白，其随后通过自体蛋白水解切割，以形成成熟病毒蛋白VP2、VP3和VP4。在这些中，VP2和VP3是病毒粒子的结构衣壳蛋白，并且VP2是主要宿主保护性免疫原。

在IBDV的情况下，存在两种血清型，血清型1和2。两种血清型可以通过病毒中和(VN)测试加以区分。血清型1病毒已显示对鸡是致病性的，而血清型2 IBDV仅在火鸡中引起亚急性疾病。

历史上，IBDV血清型1病毒仅由称为“经典” IBD病毒的一种类型组成。更近来，出现所谓的“变体” IBDV毒株，其可以通过使用单克隆抗体实验对象组的病毒中和测试或通过RT-PCR来鉴定并区分；这由Wu等人(2007，Avian Diseases，vol. 51，p. 515-526)综述。众所周知的经典IBDV毒株是：D78、Faragher 52/70和STC。

IBDV引起鸟类的淋巴组织的急性、高度接触传染性病毒感染，具有鸟类的基本免疫器官：法氏囊作为它的主要目标。易感群体中的死亡率高，伴随快速体重减轻和中至高的死亡率。由于法氏囊(部分)的破坏，从该疾病恢复的鸟类可能具有免疫缺陷。这使得它们易受继发感染影响。

针对IBD的常规接种使用减毒IBDV毒株在家禽寿命中尽可能早地进行，但这些仅在针对IBDV的MDA水平已足够降低时(其通常在孵化后15-20天之间的某处)才可以适用。许多‘活的’或灭活的IBDV疫苗是市售的，例如‘活’疫苗例如Nobilis™ Gumboro D78(MSDAnimal Health)。

为了实现成本效益，常见方法是设计包含抗原组合的兽医疫苗。以这种方式，单个接种轮次可以使动物针对许多疾病一次性免疫。这不仅节省时间和劳力成本，它还减少对接种动物的不适和应激，所述不适和应激否则将由于必须接受反复接种而发生。这甚至更适用于需要通过单次注射来施用的疫苗，例如基于重组HVT作为病毒载体的疫苗，因此在这种情况下的组合疫苗也是非常需要的，并且一次性地防止几种不同的疾病的能力 - 除了来自HVV载体本身的MDV保护外 - 将有很大的益处。然而，在过去，仅仅两种单独的HVT载体与单个异源基因插入片段的组合证明是不成功的：复制载体之间的干扰引起一个或另一个在接种的目标中变得被抑制。因此，研究已集中于来自单一重组HVT载体的多于一种异源抗原的组合表达和递送。

几篇出版物描述了包含多基因插入片段的HVT载体构建体，例如于：WO 93/025.665和WO 96/005.291，其描述二价和三价‘疫苗’。类似地：EP 719.864和EP1.026.246。然而，仅提出了所描述的多基因构建体的大部分，并且仅实际上构建和分离了具有多个插入片段的一些重组载体。非常少曾经在鸡中测试过。总体上没有给出关于它们在复制后的稳定性或外来基因的表达水平的结果，更不用说关于在目标动物中诱导有效免疫保护的任何数据。

事实上，从关于多基因HVT作为载体的疫苗的许多现有技术出版物中，已经被彻底测试并被证明是针对多于两种禽类病原体的有效载体疫苗的唯一构建体是如WO 2013/057.235中所述的包含NDV F基因和IBDV VP2基因的HVT构建体以及如WO 2013/057.236中所述的HVT作为载体的ILT-ND疫苗。

遗憾的是，在产品开发期间的长时间测试后，如WO 2013/057.235中所述的命名为HVP309的主要构建体之一没有展现异源插入片段的足够遗传稳定性和持续表达。该HVP309重组HVT载体包含表达盒，其具有由人巨细胞病毒立即早期1基因核心启动子驱动的NDV F基因，随后下游为由鸡β-肌动蛋白基因核心启动子驱动的IBDV VP2基因。

HVP309载体构建体的不稳定性在其体外和体内复制后变得明显，因为1％至3％的HVP309病毒展现它们不再表达异源基因的一者或两者。这从疫苗效力观点来看是不合需要的，并且它是获得政府当局的营销授权的障碍。因此，目前仍然没有具有一致和可靠的遗传稳定性的针对ND和IBD两者的安全且有效的HVT载体疫苗。

本发明的一个目的在于适应领域中的该需要，并且首次提供重组HVT载体疫苗，其允许针对ND和IBD的家禽的有效免疫，并且具有一致和可靠的遗传稳定性。

最初，本发明人失望地得知，HVP309构建体具有这种固有的遗传不稳定性，导致其异源基因插入片段的表达的丧失。没有现有技术关于克服这种不稳定性(同时保持疫苗效力和病毒复制水平)的方式的指导，他们必须完全重新设计载体疫苗。

这根本不是直截了当的，并且需要做出不明显的选项和选择。这从制备和测试的许多重组HVT构建体显而易见，但没有显示期望的有利特征的组合。尽管偶尔，但新构建体之一在特定方面例如病毒血症或插入基因之一的表达水平方面更好；然而，这然后被发现缺乏其他性质，或者没有足够的遗传稳定性。下面描述实例。

因此，发明人令人惊讶地发现，一种特异性重组HVT疫苗表现出良好的病毒载体复制、持续的NDV F-和IBDV VP2基因表达以及针对ND和IBD的有效免疫保护，并且与现有技术构建体相比，也具有改善的遗传稳定性。事实上，稳定性现在使得不会再发现不表达的病毒蚀斑，甚至在细胞培养中15次连续传代之后和在鸟类中一次传代之后。此外，相对于先前的载体构建体，针对ND和IBDV的疫苗效力水平略微(ND)或甚至显著(IBDV)改善。

鉴于此载体疫苗可用于家禽生产行业中的潜在大规模，这些影响和改善是重要的，并且代表具有很大的商业意义的令人惊讶的技术效果。因此，以这种方式，可以满足本发明的目的，因此可以克服现有技术的缺点。

目前不知道为什么新的重组HVT作为载体的ND-IBD疫苗具有改善的效力和改善的稳定性特征。

尽管本发明人不想受可能解释这些观察的任何理论或模型的束缚，但他们推测，所用元件的选择和它们在该HVT病毒中包含的表达盒中的特定布局以一种方式或其他方式允许新的重组HVT载体更好地容纳异源基因的表达，同时在体外或体内复制。这可以使得新载体在遗传上稳定和免疫上有效。

因此，在第一方面，本发明涉及重组DNA表达盒，其以5'至3'方向且按该顺序包含：

a. 鼠巨细胞病毒立即早期1基因(mCMV-IE1)启动子，

b. 传染性法氏囊病病毒(IBDV)病毒蛋白2(VP2)基因，

c. 转录终止子，

d. 人巨细胞病毒立即早期1基因(hCMV-IE1)启动子，

e. 新城疫病毒(NDV)融合(F)蛋白基因。

根据本发明的重组DNA表达盒可用于生成重组HVT载体病毒疫苗，其当在体外和体内传代时有效地预防或减少IBDV和NDV的感染或相关疾病体征，并且具有一致和可靠的遗传稳定性。

“重组体”是其遗传材料已相对于其起始或天然条件进行修饰以导致它最初不具有的遗传构成的核酸分子或微生物。

用于本发明的“表达盒”包含如本文所述和定义的基因和调控元件。任选地，表达盒还可以含有可以帮助其生成和操作的其他DNA元件，例如用于限制性酶识别或PCR引物的位点，以实现分子克隆。尽管表达盒可以以DNA或RNA形式存在，但由于其在HVT载体中的预期用途，因此表达盒用作DNA。

如技术人员显而易见，表达盒是自我包含的表达模块，因此其在载体病毒基因组中的取向通常不是关键的。这意味着该盒作为整体可以例如以两个取向中任一者整合在HVT基因组的Us区域中：朝向TR读取或朝向IRs读取。图1在这方面仅展现这两种可能取向之一。然而，如果期望特定取向，表达盒可以与来自载体基因组的侧接区段(其可以引导其以期望取向整合在载体基因组的特定位点)一起使用。

根据本发明的重组DNA表达盒和本文所述的其他遗传元件的生成、构建和组装可以通过众所周知的分子生物学技术(涉及克隆、转染、重组、选择和扩增)进行。这些和其他技术非常详细地解释于标准教科书，如Sambrook & Russell: “Molecular cloning: alaboratory manual” (2001, Cold Spring Harbour Laboratory Press; ISBN:0879695773); Ausubel等人, : Current Protocols in Molecular Biology (J. Wileyand Sons Inc, NY, 2003, ISBN: 047150338X); C. Dieffenbach & G. Dveksler: “PCRprimers: a laboratory manual” (CSHL Press, ISBN 0879696540);和J. Bartlett和D.Stirling的“PCR protocols” (Humana press, ISBN: 0896036421)。

如本文使用的术语“包含(comprising)”(以及变化诸如“包含(comprise)”、“包含(comprises)”、和“包含(comprised)”)意在指由在其中使用该术语的正文部分、段落、权利要求等覆盖或包括于其中的，对于本发明可设想的所有要素和以任何可能组合的所有要素，即使此类要素或组合并未明确叙述；并且不指排除任何的此类一种或多种要素或组合。

因此，任何此类正文部分、段落、权利要求等因此还可以涉及其中术语“包含(comprising)”(或其变体)替换为术语例如“由……组成(consist of)”、“由……组成(consisting of)”、或“基本上由……组成(consist essentially of)”的一个或多个实施方案。

术语“以5'至3'方向上，也被称为：“以下游方向”，是本领域众所周知的。

其连同术语“按该顺序”一起用于指示其后概括的元件需要关于彼此以便宿主细胞的基因表达机制有功能而具有的相对方向，包含根据本发明的表达盒的重组HVT将在所述宿主细胞中复制且表达。如技术人员将认识到，该方向涉及来自HVT的双链DNA基因组的为‘编码链’的DNA链，并且其涉及在‘+ ’或‘有义’方向上编码的mRNA分子。

虽然如此，并且对上文部分无偏差：在HVT ds DNA基因组的互补链(‘模板’链)上，所列元件的相对顺序是相同的，但在该DNA链上，这些元件的方向是3'至5'。

术语“基因”用于指示能够编码蛋白的DNA区段。用于本发明的基因优选编码完整的蛋白。然而，基因还可以编码蛋白的区段，例如仅编码成熟形式的蛋白，即不含‘前导区’、‘锚’或‘信号序列’。在该方面，如本文所用的基因对应于开放阅读框或ORF。基因甚至可以编码蛋白的特定区段，例如包含免疫保护性表位的区段。

在该方面，本发明的“蛋白”是氨基酸的分子链。蛋白可以是天然或成熟蛋白、前蛋白(preprotein)或蛋白原(proprotein)、或蛋白的功能片段。尤其地：肽、寡肽和多肽包括在蛋白的定义内。

本发明的“启动子”众所周知是在生物的基因组上的功能区，其指导下游编码区的转录。启动子因此位于基因的上游。

启动子引导的mRNA合成从‘转录起始位点’(TSS)开始。产生的mRNA依次从基因的起始密码子开始翻译成蛋白，所述起始密码子是开放阅读框中的第一个ATG序列(mRNA中的第一个AUG)。通常，TSS位于起始密码子上游30-40个核苷酸处。TSS可以通过例如经由RACE技术测序基因mRNA的5'端进行测定。

一般而言，启动子包含在起始密码子的A位置上游约1000个核苷酸内，所述A位置一般指示为A+1，并且大多数启动子位于核苷酸-500和A+1之间。

启动子的命名法通常基于它控制其表达的基因。例如，术语‘mCMV-IE1基因启动子’指在自然界中驱动来自mCMV的IE1基因表达，并且因此位于该基因紧密上游的启动子。因为IE1-基因是如此充分记录且可明确识别的基因，并且因为几种mCMV的基因组已(整体或部分)进行测序，所以此类启动子可以容易地通过常规技术进行鉴定。例如，在基本方案中，启动子可以简单地通过大致亚克隆在两个连续基因之间的区域获得，所述区域例如从上游基因的polyA信号到下游基因的TSS。启动子随后可以通过标准测试进行鉴定，例如通过怀疑的启动子的进行性更小区段表达标记基因。

通常，启动子含有一些可识别的调节区，例如增强子区，其参与结合影响转录的时间、持续时间、条件和水平的调节因子。尽管增强子区通常位于上游，但启动子还含有更下游的区域，其参与结合转录因子并引导RNA聚合酶本身。该下游区通常含有许多保守的启动子序列元件，例如TATA盒、CAAT盒和GC盒。

包含增强子区域和下游区域的启动子被称为“完全”启动子；仅包含下游区域的启动子被称为“核心”启动子。

用于在(病毒)载体中表达(异源)基因的启动子需要能够有效地驱动该下游编码区的转录。这通常被称为启动子与基因“可操作地连接”，使得该基因在启动子的“控制”下，或“由启动子”驱动。这通常意味着在表达盒中，启动子和基因有效邻近地连接在相同DNA上，并且在它们之间没有会干扰有效转录的信号或序列。

因此，在根据本发明的重组DNA表达盒中，本发明的mCMV-IE1基因启动子和hCMV-IE1基因启动子与其下游基因(分别为IBDV VP2基因和NDV F基因)“可操作连接”。

“转录终止子”是参与将编码区转录为RNA的终止的调节性DNA元件。通常此元件编码具有可以引起RNA聚合酶复合物终止转录的二级结构(例如发夹)的区段。因此，转录终止子总是位于来自待翻译的区域的终止密码子的下游，3'非翻译区。终止子还可以包含聚腺苷酸化信号或polyA信号。这诱导对于大多数真核细胞mRNA发生且与mRNA分子的转运和稳定有关的聚腺苷酸化。

对于本发明，在两个异源基因之间使用转录终止子提供它们的表达的有效分离，防止RNA转录的可能的通读(read-through)。

对于本发明，如果基因不存在于用于生成重组HVT载体的亲本HVT中，则基因与携带其的重组HVT载体“异源”。

mCMV-IE1-或hCMV-IE1基因启动子是本领域众所周知的，并且可以容易地获得自多种商业来源，例如得自用于克隆和表达的商业质粒的供应商。IE1基因也被称作‘主要IE基因’。

mCMV-IE1蛋白也称为pp89。在1985年描述了mCMV IE1基因启动子(K. Dörsch-Häsler,等人, 1985, PNAS, vol. 82, p. 8325)。该启动子在异源表达中的用途描述于WO87/03.905和EP 728.842中。完整mCMV IE基因座的核苷酸序列可以acc. nr. L06816.1得自GenBank (2004年3月起)。mCMV本身可最初以acc. nr. VR-194得自ATCC，并且更近来，这已经以acc. nr. VR-1399继续。

hCMV-IE1基因启动子在其完整版本大小约1.5 kb，并且由增强子、核心启动子和内含子组成，由此启动子活性进行到内含子区内，参见Koedood等人 (1995, J. ofVirol., vol. 69, p. 2194-2207)。

通过使用常规分子生物学工具和方法亚克隆IE1基因之前的基因组区域，可以从hCMV病毒的基因组(可广泛获得)获得hCMV-IE1基因启动子。或者，启动子可以源自例如表达型质粒，例如由Cox等人(2002, Scand. J. Immunol., vol. 55, p. 14-23)描述的pI17，或哺乳动物表达载体例如pCMV (Clontech)或pCMV-MCS系列(Stratagene; GenBank™ acc. nr. AF369966)。

从hCMV-IE1基因启动子，许多高度相似的版本，是已知的，例如，来自GenBank。此类同系物和变体在本发明的范围内。

本发明的“NDV F蛋白基因”是众所周知的，并且序列信息在现有技术中广泛可用。F蛋白基因可以获得自各种常用的质粒构建体。或者，其可以使用用于操纵RNA病毒的常规技术从分离自自然界的NDV获得。可以使用血清学或分子生物学容易地鉴定NDV。

对于本发明，NDV F蛋白基因的同系物以及变体例如来自弱毒型、中毒型或强毒型NDV的变体同样适用，因为F蛋白基因序列本身在这些不同的NDV病原体中是高度保守的。

在根据本发明的表达盒的一个实施方案中，mCMV-IE1基因启动子是mCMV-IE1基因的完整启动子，其包含核心启动子区以及增强子区。完整的mCMV-IE1基因启动子大小为约1.4kb。

如技术人员清楚地知道的，可以出现mCMV-IE1基因启动子以及其他元件的长度中的一些变化，所述其他元件构成根据本发明的重组DNA表达盒。这可以由用于克隆和构建的确切条件中的差异所产生；例如由使用不同限制性酶位点、PCR克隆引物、或用于适应使用的克隆分子端的不同条件所产生。因此，可发生组成元件的长度的一些变化(更小或更大)，而不影响整个表达盒的稳定性和效力。在该情况下，这些长度差异是不重要的，并且在本发明的范围内。

因此，关于本发明的mCMV-IE1基因启动子，“约1.4kb”是：1.4kb±约25％，优选±约20、15、12、10、8、6、5、4、3、2或甚至±约1％，按该优先顺序。

类似地，可以使用同样有效和稳定的启动子元件的同系物或变体。

因此，在一个实施方案中，本发明的mCMV-IE1基因启动子是约1.4kb的DNA分子，其包含与SEQ ID NO:1的核苷酸630-2020的区域的全长具有至少95％核苷酸序列同一性的核苷酸序列。更优选的是至少96、97、98或甚至99％的核苷酸序列同一性，按该优先顺序。

在一个实施方案中，mCMV-IE1基因启动子是SEQ ID NO:1的核苷酸630-2020的区域。

在根据本发明的表达盒的一个实施方案中，本发明的IBDV VP2基因编码来自为经典型的IBDV的VP2蛋白。此类基因是众所周知的，并且它们的序列信息是现有技术中可容易获得的，参见例如GenBank acc. nr：D00869(F52/70)、D00499(STC)或AF499929(D78)。或者，这种基因可以使用用于操作双RNA病毒的常规技术得自从自然界中分离的经典IBDV的基因组。经典型IBDV可以使用血清学或分子生物学容易地鉴定。

因为IBDV VP2基因的同系物或变体可以具有相等的效力和稳定性，因此在一个实施方案中，本发明的IBDV VP2蛋白基因与SEQ ID NO:1的核苷酸2052-3410的区域的全长具有至少90％核苷酸序列同一性。优选地，至少92、94、95、96、97、98或甚至99％的核苷酸序列同一性，按该优先顺序。

在一个实施方案中，本发明的IBDV VP2蛋白基因源自经典IBDV毒株Faragher 52/70。

在一个实施方案中，本发明的IBDV VP2蛋白基因是SEQ ID NO:1的核苷酸2052 -3410的区域。

对于根据本发明的表达盒，特定类型的转录终止子的选择不是关键的，只要提供RNA转录的有效终止。

在根据本发明的表达盒的实施方案中，转录终止子包含终止区和polyA区。

在一个实施方案中，转录终止子源自猿猴病毒40(SV40)，优选源自SV40晚期基因。该终止子及其在异源表达中的用途已多年应用于分子病毒学，并由Clontech以他们的‘pCMVß’克隆质粒商业化，其自1980年代末以来可商购。

在一个实施方案中，转录终止子源自SV40晚期基因，且大小为约0.2kb。

因为确切大小不是关键的，因此，关于本发明的转录终止子，“约0.2kb”是：0.2kb±约25％，优选±约20、15、12、10、8、6、5、4、3、2或甚至±约1％，按该优先顺序。

在一个实施方案中，源自SV40晚期基因且大小为约0.2kb的转录终止子包含与SEQID NO:1的核苷酸3441 - 3650的区域的全长具有至少95％核苷酸序列同一性的核苷酸序列。更优选的是至少96、97、98或甚至99％的核苷酸序列同一性，按该优先顺序。

在一个实施方案中，来自SV40晚期基因的转录终止子是SEQ ID NO:1的核苷酸3441 - 3650的区域。

在根据本发明的表达盒的一个实施方案中，hCMV-IE1基因启动子是核心启动子。此核心启动子通常将大小小于1kb；优选大小约0.4kb。

如所述，确切大小不是关键的，因此，关于本发明的hCMV-IE1基因核心启动子，“约0.4kb”是：0.4kb±约25％，优选±约20、15、12、10、8、6、5、4、3、2或甚至±约1％，按该优先顺序。

在一个实施方案中，本发明的hCMV-IE1基因启动子是约0.4kb的DNA分子，其包含与SEQ ID NO:1的核苷酸3789 - 4149的区域的全长具有至少95％核苷酸序列同一性的核苷酸序列。更优选的是至少96、97、98或甚至99％的核苷酸序列同一性，按该优先顺序。

在一个实施方案中，hCMV-IE1基因核心启动子是SEQ ID NO:1的核苷酸3789 -4149的区域。

在根据本发明的表达盒的一个实施方案中，NDV F蛋白基因来自弱毒型的NDV。

优选地，来自弱毒NDV毒株的NDV F蛋白基因来自NDV毒株克隆30。

在一个实施方案中，本发明的NDV F蛋白基因与SEQ ID NO:1的核苷酸4174-5835的区域的全长具有至少90％核苷酸序列同一性。优选地，至少92、94、95、96、97、98或甚至99％的核苷酸序列同一性，按该优先顺序。

在一个实施方案中，本发明的NDV F蛋白启动子是SEQ ID NO:1的核苷酸4174 -5835的区域。

在一个实施方案中，根据本发明的表达盒包含位于NDV F蛋白基因下游的额外转录终止子。

位于NDV F蛋白基因下游的额外转录终止子可以在IBDV VP2蛋白基因和hCMV-IE1启动子之间与根据本发明的表达盒中的转录终止子相比相同或不同，只要提供适当的转录终止，并且稳定性和表达不受影响。

在一个实施方案中，额外转录终止子源自hCMV-IE1基因。优选地，额外转录终止子大小为约0.3kb。

因为确切大小不是关键的，因此，关于源自hCMV-IE1基因的额外转录终止子，“约0.3kb”是：0.3kb±约25％，优选±约20、15、12、10、8、6、5、4、3、2或甚至±约1％，按该优先顺序。

在一个实施方案中，源自hCMV-IE1基因且大小为约0.3kb的额外转录终止子包含与SEQ ID NO:1的核苷酸5847 - 6127的区域的全长具有至少95％核苷酸序列同一性的核苷酸序列。更优选的是至少96、97、98或甚至99％的核苷酸序列同一性，按该优先顺序。

在一个实施方案中，源自hCMV-IE1基因的额外转录终止子是SEQ ID NO:1的核苷酸5847 - 6127的区域。

在根据本发明的重组DNA表达盒的一个实施方案中，选自以下的条件中的一种或多种或全部适用：

- mCMV-IE1基因启动子是完整的启动子，

- IBDV VP2基因编码来自经典型IBDV的VP2蛋白，

- 转录终止子包含终止区和polyA区两者，

- 转录终止子源自猿猴病毒40(SV40)，

- hCMV-IE1基因启动子是核心启动子，

- NDV F基因来自弱毒NDV毒株，

- 表达盒包含位于NDV F基因下游的额外转录终止子，且

- 额外转录终止子源自hCMV-IE1基因。

在一个实施方案中，根据本发明的重组DNA表达盒包含来自HVT的基因的5'和/或3'侧接区。这些侧接区允许同源重组以引导插入至载体的基因组上的靶基因插入基因座，且呈期望的取向。

在一个优选实施方案中，根据本发明的重组DNA表达盒在两侧侧接HVT Us2基因的区段。

一个实例是如SEQ ID NO:1所示的DNA序列。

表 1：SEQ ID NO:1的元件：

在一个实施方案中，根据本发明的重组DNA表达盒大小为约5.5kb。因为-如所述-确切大小不是关键的，因此，关于根据本发明的重组DNA表达盒，其大小为约5.5kb，意指5.5kb±约25％，优选±约20、15、12、10、8、6、5、4、3、2或甚至±约1％，按该优先顺序。

如所述，根据本发明的重组DNA表达盒的元件的同系物或变体可以同样安全、稳定和有效。

因此，在一个实施方案中，根据本发明的重组DNA表达盒是约5.5kb的DNA分子，其包含与SEQ ID NO:1的核苷酸630 - 6127的区域的全长具有至少95％核苷酸序列同一性的核苷酸序列。更优选的是至少96、97、98或甚至99％的核苷酸序列同一性，按该优先顺序。

在一个实施方案中，根据本发明的重组DNA表达盒是SEQ ID NO:1的核苷酸630 -6127的区域。

为了便于方便构建、操作和使用根据本发明的重组DNA表达盒，其本身可以包含在DNA分子中。

因此，在一个进一步方面，本发明涉及包含根据本发明的重组DNA表达盒的重组DNA分子。

在一个实施方案中，根据本发明的重组DNA分子由包含根据本发明的重组DNA表达盒的克隆质粒组成。普通克隆质粒的实例是例如来自pBR322或pUC系列的质粒。这些是广泛商业可得的。

在作为根据本发明的重组DNA分子的质粒的一个实施方案中，该质粒可以含有允许大插入片段的稳定维持，并且在细菌中扩增至少量后控制质粒的拷贝数的调控序列。此类用于大插入片段的克隆质粒通常被称为：粘粒或杆粒。

当根据本发明的重组DNA分子用于转染方案时，其通常被称为“转移载体”、“穿梭载体”或“供体质粒”。在该情况下，根据本发明的重组DNA分子包含根据本发明的重组DNA表达盒，并且该盒可以在两侧侧接源自载体的基因组的序列以引导插入。

通常，用于转染的转移载体本身并不整合至载体的基因组中，其仅促进其携带的表达盒的整合。

在一个实施方案中，根据本发明的重组DNA分子包含SEQ ID NO:1的核苷酸630-6127的区域。

在一个实施方案中，根据本发明的重组DNA分子包含如SEQ ID NO:1所示的DNA分子。

根据本发明的重组DNA表达盒优选用于生成重组HVT载体病毒疫苗。

因此，在一个进一步方面，本发明涉及包含根据本发明的重组DNA表达盒的重组火鸡疱疹病毒(HVT)，由此将表达盒插入重组HVT的基因组的Us区域。

术语“火鸡疱疹病毒”(HVT)是指病毒微生物，其展现其分类组-成员的表征特征例如形态学、基因组学和生物化学特征以及该组的生物学特征例如其生理、免疫学或病理行为。这还包括以任何方式细分，例如细分为亚种、毒株、分离株、基因型、变体、亚型、病理型或亚类等的HVT。

技术人员显而易见的是，本文描述的微生物(例如本发明的HVT、MDV、NDV或IBDV)的当前分类学分类法可随时间而改变，因为新的见解导致重新分类为新的或不同的分类组。然而，由于这不改变微生物本身或其生物学行为，但仅其科学名称或分类，此类重新分类的微生物仍然在本发明的范围内。

对于本发明，“包含重组DNA表达盒”涉及将根据本发明的重组DNA表达盒插入HVT的基因组中。这种插入原则上可以通过任何可用技术进行，并且相对于HVT载体的基因组可以导致插入、取代或缺失，只要所得重组HVT能够展现其安全、稳定和有效多价抗原表达的有利效果。在本文下面描述细节和实例。

根据本发明的重组HVT在单个遗传基因座中且在其基因组的区域(被称为独特短(Unique Short)区域，或Us)中包含根据本发明的重组DNA表达盒。HVT的Us区域是众所周知的且易于识别；其位于HVT基因组中的两个众所周知的重复元件(IRS和TRS)之间。

HVT Us区域的几个插入基因座是已知的，并且原则上这些都适用于本发明，条件是插入的表达盒和所得重组HVT能够展现其稳定和有效的特性。

在一个实施方案中，根据本发明的重组HVT包含插入重组HVT的基因组的Us2或Us10基因中的根据本发明的重组DNA表达盒。

可以通过采用HVT基因组的Us2基因作为本发明的单个遗传插入基因座来制备用于本发明的特别稳定和有效的重组HVT载体。

因此，在根据本发明的重组HVT的一个实施方案中，将根据本发明的重组DNA表达盒插入重组HVT的基因组的Us2基因中。

对于本发明，术语“在Us2基因中”或“在Us10基因中”意在指示在分别包含Us2或Us10基因的HVT基因组的区域中已进行插入；这可以指基因的启动子或其编码区。此外，相对于HVT基因组的插入的净效应(netto effect)可以是如所述的插入、取代或缺失。此插入的预期后果是Us2或Us10基因的正常编码功能被干扰，或者在所得重组HVT中甚至完全消除。

在一个实施方案中，重组DNA表达盒在HVT Us区域中的插入是插入；即除了作为克隆过程的结果可能缺失或被替换的几个核苷酸之外，不存在Us基因组区域中的实质缺失。因此，随着大小的净增加，以该方式，所得重组HVT具有大于其亲本的基因组的基因组大小。

在一个实施方案中，根据本发明的重组HVT包含约5.5kb的DNA分子，其包含与SEQID NO:1的核苷酸630 - 6127的区域的全长具有至少95％核苷酸序列同一性的核苷酸序列。更优选的是至少96、97、98或甚至99％的核苷酸序列同一性，按该优先顺序。

在一个实施方案中，根据本发明的重组HVT包含SEQ ID NO:1的核苷酸630-6127的区域。

在一个实施方案中，根据本发明的重组HVT包含如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。

为了使根据本发明的重组HVT安全用于疫苗使用，重组HVT可以基于这样的亲本HVT，其为复制良好的已建立的HVT疫苗毒株，并且已知适合于接种幼鸟或胚胎，例如HVT疫苗毒株PB1或FC-126。这些通常可用：来自ATCC：VR # 584-C的FC-126，并且PB1是市售的，例如来自MSD Animal Health。根据本发明的重组DNA表达盒的并入不增加亲本HVT的毒力或致病性(相反地)，并且预期不会回复至毒力，因为HVT是天然无致病性的。

因此，在一个实施方案中，用于生成根据本发明的重组HVT的亲本HVT是HVT疫苗毒株；优选地PB1或FC-126毒株的HVT疫苗毒株。

根据本发明的重组HVT是活重组载体微生物或“载体”病毒，其可有利地用于家禽的接种。其组合作为针对ND和IBD的安全且有效的疫苗的特征，此外还是遗传稳定的。

对于本发明是“遗传稳定的”意味着根据本发明的重组HVT的遗传构成在随后的病毒复制轮次中不改变，或者至少不会在可检测的程度上改变。在替代方案中，不稳定的构建体可导致插入的异源基因中的一者或两者的表达的丧失。这种稳定性可以用常规技术方便地监测，例如通过使根据本发明的重组HVT在细胞培养物中随后传代，随后在动物中传代。在这些步骤期间重新分离的病毒可以铺板在细胞培养皿中，用琼脂覆盖，并且孵育，直到HVT特异性蚀斑变得可见；都使用常规技术。接下来，可以在免疫荧光测定(IFA)方案中使用合适的抗体制备物以及足够的阳性和阴性对照来针对F或VP2蛋白的表达染色蚀斑。可以记录不显示荧光的蚀斑的数量，由此应当监测特定样品的至少100个个体蚀斑。

根据本发明的重组HVT的遗传稳定性的严格测试是应用15个连续的组织培养传代，随后接种至目标动物中，重新分离和攻击-感染。下面描述详情。

令人惊讶地发现，如上所述的严格稳定性测试中的根据本发明的重组HVT在所有测试的蚀斑中保持NDV F和IBDV VP2蛋白基因两者的存在和表达，并且持续15次细胞-培养传代，以及持续一次动物传代。在实施例中描述详情。

与用现有技术HVT重组体发现的结果相比以及与在本发明的实验过程中制备和测试的其他重组体相比，这是强大且高度显著的改进。

根据本发明的重组HVT可以通过常见技术扩增，主要通过在原代鸡细胞、通常鸡胚成纤维细胞(CEF)的体外培养中扩增。这些可以通过鸡胚的胰蛋白酶消化进行制备，其都是本领域众所周知的。将CEF铺为单层并且用HVT感染。该方法可以将规模扩大到工业规模的生产。

通常，通过收获含有其细胞相关形式的重组HVT的感染的宿主细胞来收集重组HVT。将这些细胞吸收于适当的载体组合物中以在冷冻和储存期间提供稳定作用。接下来，受感染细胞通常被装填到玻璃安瓿内，将所述玻璃安瓿密封、冷冻且储存于液氮中。

尽管优选HVT的细胞相关的冷冻储存，但在液氮的使用不可行的情况下，替代方案是使用冷冻干燥：这采用HVT的有利特征，其可以通过细胞-破碎(例如通过弗氏压碎器或超声波仪)使用整个培养物从其宿主分离。这可以通过离心来澄清，然后将其吸收至稳定剂中，并冷冻干燥用于延长储存。

因此，在一个进一步方面，本发明涉及包含根据本发明的重组HVT的宿主细胞。

用于本发明的“宿主细胞”是易被HVT感染和复制的细胞。此类细胞的实例是禽类细胞，特别是淋巴细胞或成纤维细胞。

在一个实施方案中，根据本发明的宿主细胞是原代禽类细胞；即直接源自动物或动物器官、而非源自细胞系的细胞。通常，原代细胞只能进行小量且有限数量的细胞分裂，而来自细胞系的细胞是有效地永生的，并且 - 在正确的条件下 - 可以继续分裂。

在一个实施方案中，根据本发明的原代禽类宿主细胞是原代鸡胚成纤维细胞(CEF)。

在一个实施方案中，根据本发明的宿主细胞是永生化的禽类细胞。已经描述了几种永生化的禽类细胞，例如在WO 97/044.443和WO 98/006.824中。

在一个优选实施方案中，根据本发明的永生化禽类宿主细胞是永生化CEF；优选如EP 14196345中所述的永生化CEF。

通过克隆和转染的不同方法，可以使用根据本发明的重组DNA表达盒来获得根据本发明的重组HVT，其包含稳定整合在重组HVT的基因组的Us区中的表达盒。

因此，本发明的一个进一步方面涉及用于构建根据本发明的重组HVT的方法，所述方法包括将根据本发明的重组DNA表达盒插入重组HVT的基因组的Us区域。

根据本发明的重组DNA表达盒插入HVT基因组以生成根据本发明的重组HVT，可以以本领域都已知的不同方式进行。一种方便的方式是使用转移载体；在一个实施方案中，这可以是根据本发明的重组DNA分子。

根据本发明的重组DNA表达盒直接插入HVT基因组内是生成根据本发明的重组HVT的优选方法。然而，存在其中可以生成此类重组HVT的其他众所周知的方法。例如通过间接插入，由此表达盒的一部分在单次或多次转染中插入HVT中。这些部分可以以这样的方式设计，使得在所有部分都整合后，全部插入片段形成完整表达盒，例如通过采用重叠区以控制部分的顺序和取向。一种替代方案是使用杆粒，如EP 996.738中所述。

用于生成根据本发明的重组HVT的优选插入技术是通过使用粘粒再生，例如，如WO93/25.665中所述。该技术基本上采用HVT基因组的一组大的重叠亚基因组片段，以通过共转染至宿主细胞中来重构完整的HVT基因组。由于制备一种粘粒以包含根据本发明的重组DNA表达盒，这变得稳定地整合至重组HVT的基因组中。

如所述，根据本发明的重组HVT的优选用途是在用于家禽疫苗中。

因此，在进一步方面，本发明涉及用于家禽疫苗，其包含根据本发明的重组HVT和/或根据本发明的宿主细胞、和药学上可接受的载体。

“疫苗”众所周知是在药学上可接受的载体中包含免疫活性化合物的组合物。“免疫活性化合物”或“抗原”是由接种目标的免疫系统识别且诱导免疫反应的分子。反应可以源于先天性或获得性免疫系统，并且可以是细胞和/或体液类型。

根据本发明的疫苗提供针对ND和IBD的鸡的安全和早期保护。这种效果通过预防或减少在其各自目标器官中通过NDV或IBDV的野外感染的生产性感染的建立或增殖而获得。这例如通过降低病毒载量或缩短病毒复制的持续时间来实现。进而，这导致目标动物中由病毒感染引起的疾病的数量、强度或病变和相关临床体征的严重程度的减少。此疫苗被通俗地称为‘针对’NDV或IBDV的疫苗。

除了针对ND和IBD的疫苗效力之外，因为HVT本身的接种能力，根据本发明的疫苗对于MD也是有效的。这通过将根据本发明的重组DNA表达盒插入Us区中而减少。然而，根据MDV野外病毒在特定区域中的毒力，可能必需添加如所述的其他MD疫苗组分，以便作为针对MDV的疫苗是完全有效的。

根据本发明的疫苗的有效性的确定完全在常规操作者的技术之内，并且可以如下进行：例如通过监测接种后的免疫反应或通过测试攻击感染后的临床症状的出现或死亡率，例如通过监测目标的疾病的体征、临床评分、血清学参数，或通过攻击病原体的重新分离，且将这些结果与模拟接种的动物中看到的接种-攻击反应进行比较。为了评估针对ND的疫苗效力，攻击存活是一种方便的测量；对于IBD，可以方便地使用粘液囊中的疾病的临床体征。

下面将概述根据本发明的疫苗的各个实施方案、优选项和实例。

用于本发明的术语“家禽”涉及与兽医实践相关且对用HVT接种敏感的鸟类物种；优选的家禽物种是：鸡、火鸡和鹌鹑。鸡是最优选物种。

对于本发明，家禽可以是任何类型、品种或种类，例如：下蛋鸡、育种鸡、肉鸡、组合品种或任何此类品种的亲本品系。优选的类型是：肉鸡、育种鸡和下蛋鸡。最优选的是肉鸡，对于这种类型的鸟类，针对ND和IBD的早期保护导致存活率、生长速率和饲料转化率的改善。

“药学上可接受的载体”意在帮助疫苗的稳定和施用，同时无害且被目标良好耐受。此类载体可以例如是无菌水或无菌生理盐溶液。在更复杂的形式中，载体可以例如是缓冲液，其可以包含进一步的添加剂，例如稳定剂或防腐剂。细节和实例例如在众所周知的手册中描述，例如：“Remington：the science and practice of pharmacy”(2000，Lippincott，USA，ISBN：683306472)，和：“Veterinary vaccinology”(P. Pastoret等人编辑，1997，Elsevier，Amsterdam，ISBN 0444819681)。

对于本发明，当疫苗是细胞相关的HVT时，则药学上可接受的载体优选是培养基与约10 %血清和约6% DMSO的混合物。血清可以是常规用于细胞培养的任何血清，例如胎牛血清或新生小牛血清。

根据本发明的疫苗通过如本文描述的方法从根据本发明的重组HVT制备，所述方法可容易地由本领域技术人员应用。例如，根据本发明的重组HVT通过经由转染和重组而插入根据本发明的重组表达盒进行构建。接下来，选择期望的重组HVT，并且在工业上以更小或更大的体积进行扩增，优选在体外细胞培养物中，例如在CEF中扩增。从此类培养物收获包含病毒的悬浮液，作为完全感染的细胞或作为通过细胞-破碎获得的无细胞制备物。将这种悬浮液配制成疫苗且将最终产品包装。然后将细胞相关的疫苗储存在液氮中，并且将冷冻干燥的疫苗储存在-20℃或+4℃。在对质量、数量和无菌度的广泛测试后，将疫苗产品投放出售。

适用于疫苗制备的一般技术和考虑是本领域众所周知的，并且例如在政府法规(药典)和手册例如“Veterinary vaccinology”和“Remington”(两者同上)中描述。

在一个实施方案中，根据本发明的疫苗是细胞相关的疫苗。

“细胞相关的”意味着包含根据本发明的宿主细胞，其被根据本发明的重组HVT感染。因此，这种类型的疫苗包含均根据本发明的宿主细胞以及重组HVT。

在一个实施方案中，根据本发明的疫苗是无细胞的病毒疫苗。

“无细胞的”意味着包含根据本发明的重组HVT，并且基本上不含根据本发明的宿主细胞。然而，无细胞的疫苗可以含有(非常)少量的宿主细胞-碎片，其从细胞-破碎过程中残留。无细胞的疫苗优选为冷冻干燥的形式。用于冷冻干燥的程序是本领域技术人员已知的，且用于以不同规模冷冻干燥的设备是可商购的。

因此，在一个实施方案中，根据本发明的无细胞的病毒疫苗是冷冻干燥形式。

为了重构冷冻干燥的疫苗，将其悬浮于生理上可接受的稀释剂中。这通常在临施用前进行，以验证疫苗的最佳质量。稀释剂可以例如是无菌水或生理盐溶液。待用于重构疫苗的稀释剂本身可以含有额外化合物，例如佐剂。

在冷冻干燥的根据本发明的无细胞的疫苗的一个进一步实施方案中，用于疫苗的稀释剂与包含活性疫苗组合物的冷冻干燥饼分开供应。在该情况下，冷冻干燥的疫苗和稀释剂组合物形成一起实施根据本发明的疫苗的部件试剂盒。

因此，在冷冻干燥的根据本发明的无细胞的疫苗的一个优选的实施方案中，疫苗是具有至少两种类型的容器的部件试剂盒，一种容器包含冷冻干燥的疫苗，一种容器包含水性稀释剂。

根据本发明的疫苗的目标动物原则上可以是健康的或患病的，并且对于存在NDV或IBDV的存在或针对NDV或IBDV的抗体可以是阳性或阴性的。此外，目标可以具有其易于接种的任何体重、性别或年龄。然而，接种健康、未被感染的目标且尽可能早地接种以防止任何野外感染及其后果显然是有利的。

因此，根据本发明的疫苗可以用作预防性或治疗性治疗或两者，因为其均干扰NDV或IBDV的感染的建立和进展。

在该方面，通过根据本发明的疫苗降低病毒载量的进一步有利的效果是预防或减少脱落，从而预防或减少病毒垂直地扩散至后代，并且水平地在群或群体内和在地理区域内扩散。因此，使用根据本发明的疫苗导致NDV或IBDV的流行率降低。

因此，本发明的另外的方面是：

- 根据本发明的疫苗用于减少群体或地理区域内NDV或IBDV的流行率的用途，和

- 根据本发明的疫苗，其用于减少群体或地理区域内NDV或IBDV的流行率。

根据本发明的疫苗原则上可以通过不同应用途径和在其寿命的不同点时给予目标家禽，只要接种的重组HVT可以建立保护性感染。

然而，因为由NDV或IBDV的感染可以已在超幼龄时建立，所以尽可能早地应用根据本发明的疫苗是有利的。因此，根据本发明的疫苗可以在孵化当天时(“第1天”)或在卵内例如在ED18天时应用。

因此，在一个实施方案中，卵内施用根据本发明的疫苗。

在工业规模上用于将疫苗自动注射到蛋内的设备是商购可得的。这提供了最早的可能保护，同时使劳力成本降到最低。不同的卵内接种途径是已知的，例如向卵黄囊中、向胚胎中或向尿囊液腔中；这些可以根据需要进行优化。优选地，进行卵内接种，使得针实际上接触胚胎。

在一个实施方案中，通过胃肠外途径施用根据本发明的疫苗。优选地通过肌肉内或皮下途径。

根据本发明的疫苗可以适于施用于家禽目标且与期望的应用途径和期望效果匹配的形式制备。

优选地，根据本发明的疫苗被配制为适合于注射(卵内或肠胃外注射)的可注射液体；例如作为：悬浮液、溶液、分散体或乳液。通常此类疫苗被制备为无菌。

依赖根据本发明的疫苗的应用途径，可能需要改变疫苗组合物。这完全在技术人员的能力内，并且一般涉及疫苗功效或安全性的细调。这可以通过下述来完成：改变疫苗剂量、数量、频率、途径，通过使用以另一种形式或制剂的疫苗，或通过改变疫苗的其他组成成分(例如稳定剂或佐剂)。

例如，为了适合于在卵内应用，疫苗组合物需要是非常安全的，以便不降低蛋的孵化率。然而，即使这样，仍可以出现孵化率中的一些降低，例如由通过接种自身或感染等对胚胎的机械损害导致。

根据本发明的疫苗的每动物剂量的根据本发明的重组HVT的确切量不是像它对于灭活型疫苗那样关键的；这因为重组HVT可以复制，并且从而在目标动物中繁殖直到生物学上可以忍受的病毒血症水平。原则上，疫苗剂量仅需要足以起始此类产毒性感染。更高的接种物剂量并不缩短其在宿主中达到最佳病毒血症感染花费的时间。因此，非常高的剂量是无效的，并且另外由于经济原因也不具有吸引力。

优选的接种物剂量因此是每动物剂量1x10^1至1x10^5蚀斑形成单位(pfu)的根据本发明的重组HVT，更优选1x10^2至1x10^4pfu/剂量，甚至更优选500至5000 pfu/剂量；最优选约1000至约3000 pfu/剂量。

当根据本发明的疫苗是细胞相关的时，这些量的重组HVT包含在受感染的宿主细胞中。

计数根据本发明的重组HVT的病毒颗粒的方法是众所周知的。

根据本发明的重组HVT的每个动物剂量的体积可以根据预期的施用途径进行优化：卵内接种通常以约0.01至约0.5ml/卵的剂量施用，并且肠胃外注射通常以约0.1至约1ml/鸟的剂量进行。

何者为根据本发明的疫苗的免疫有效量的确定或每剂量的疫苗的体积的优化两者完全在技术人员的能力之内。

用于将根据本发明的疫苗应用于目标生物的给药方案可以在单个或多个剂量中，以与疫苗制剂相容的方式，以及以此类将是免疫学有效的量。

优选地，将施用根据本发明的疫苗的方案整合至目标家禽可需要的其他疫苗的现有接种时间表中，以减少对动物的应激并降低劳动力成本。这些其他疫苗可以以与其注册用途相容的方式以同时、并发或依次方式施用。

不言而喻的是将其他化合物例如稳定剂、载体、佐剂、稀释剂、乳化剂等与根据本发明的疫苗混合也在本发明的范围内。此类添加剂描述于众所周知的手册例如：“Remington”和“Veterinary Vaccinology”(两者同上)。

通过这种方式，可以进一步优化根据本发明的疫苗以超幼龄的单次接种来针对ND、IBD和MD保护家禽的效力。

根据本发明的疫苗有效地是对于NDV和IBDV的‘标记疫苗’，因为它生成的免疫仅针对来自这些病毒的一种蛋白。这允许“区分受感染和接种的动物”，所谓的DIVA法。这可以方便地通过血清学测定例如ELISA或免疫荧光测定进行检测。

根据本发明的疫苗已经提供了多种免疫：通过异源插入片段的表达来针对NDV和IBDV提供免疫，并且另外通过HVT载体本身也针对MDV提供免疫。尽管如此，通过额外的免疫活性组分来进行进一步组合可能是有利的。这可以用于增强已经提供的免疫保护，或扩展至其他病原体。

因此，在一个实施方案中，根据本发明的疫苗包含至少一种额外的免疫活性组分。

此类“额外的免疫活性组分”可以是抗原、免疫增强物质、细胞因子、疫苗或其任何组合。这提供了在成本、效率和动物福利方面的优点。或者，根据本发明的疫苗自身可以加入疫苗中。

在一个实施方案中，所述至少一种额外的免疫活性组分是免疫刺激化合物；优选细胞因子或免疫刺激性寡脱氧核苷酸。

免疫刺激性寡脱氧核苷酸优选为免疫刺激性的含非甲基化CpG的寡脱氧核苷酸(INO)。优选的INO是禽类Toll样受体(TLR) 21激动剂，例如WO 2012/089.800 (X4家族)、WO2012/160.183 (X43家族)或WO 2012/160.184 (X23家族)中所述。

在一个实施方案中，至少一种额外的免疫活性组分是来源于对家禽致病性的微生物的抗原。这可以以任何合适的方式，例如作为“活”减毒、灭活或亚单位抗原‘衍生’自对家禽致病的该微生物。

源自对家禽致病的微生物的额外抗原优选源自一种或多种选自以下组的微生物：

- 病毒：传染性支气管炎病毒、NDV、腺病毒、减蛋综合征病毒、IBDV、鸡贫血病毒、禽脑脊髓炎病毒、禽痘病毒、火鸡鼻气管炎病毒、鸭瘟病毒(鸭病毒性肠炎)、鸽痘病毒、MDV、禽白血病病毒、ILTV、禽肺病毒和呼肠孤病毒；

- 细菌；大肠杆菌、沙门氏菌属(Salmonella)、鼻气管鸟杆菌(Ornitobacteriumrhinotracheale)、副鸡嗜血杆菌(Haemophilus paragallinarum)、多杀巴斯德杆菌(Pasteurella multocida)、红斑丹毒丝菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)、丹毒种(Erysipelas)、支原体属(Mycoplasma)和梭菌属(Clostridium)；

- 寄生虫：艾美虫属(Eimeria)；和

- 真菌：曲霉属(Aspergillus)。

额外抗原可以是其他HVT-载体疫苗。

所有这些组合都是可能的，条件是根据本发明的疫苗的效力、安全性和稳定性不受负面影响。

在根据本发明的疫苗的一个实施方案中，源自对家禽致病的微生物的额外抗原是‘活’减毒MDV、NDV或IBDV疫苗毒株。这用于改进且扩展根据本发明的疫苗的免疫原性，并且这在其中MDV、NDV或IBDV的超强毒野生株流行的那些情况下或地理区域中是有利的。

在这点上，HVT与MDV1、MDV2或HVT的组合是已知的；对于本发明，MDV毒株Rispens(MDV1)、毒株SB1(MDV2)或毒株FC-126或PB1(HVT)优选作为额外的免疫活性组分。

为了改进针对NDV的反应，根据本发明的重组HVT可以与NDV疫苗毒株例如温和的活NDV疫苗毒株C2组合。

类似地，为了改进针对IBDV的反应，根据本发明的重组HVT可以与温和的活IBDV疫苗毒株例如D78、PBG98、Cu-1、ST-12或89-03组合。

如技术人员将理解的，这些‘组合’还包括其中根据本发明的重组HVT和额外的免疫活性组分不同时、但并发或依次应用的接种时间表；例如重组HVT可以在卵内应用，NDVC2可以在第一天应用，且IBDV89-03毒株可以在第17天应用。

因此，在根据本发明包含至少一种额外的免疫活性组分的疫苗的一个实施方案中，所述至少一种额外的免疫活性组分是选自下述疫苗毒株的微生物：MDV、NDV和IBDV，或其任何组合。

更优选地，额外的免疫活性组分选自：MDV Rispens、MDV SB1、NDV C2、IBDV D78和IBDV 89-03。

此类组合疫苗可以以多种方式进行制备：通过组合病毒或宿主细胞的制备物，或这些的混合物；全部都在本发明的范围内。在优选实施方案中，此类组合疫苗的组分方便地分开产生，并且随后通过装填到相同的疫苗容器内而组合。

通过上文描述和下文例示的方法，可以制备根据本发明的疫苗。

因此，本发明的进一步方面涉及用于制备根据本发明的疫苗的方法，所述方法包括下述步骤：

- 用根据本发明的重组HVT感染宿主细胞，

- 收获受感染的宿主细胞，和

- 将收获的受感染的宿主细胞与药学上可接受的载体混合。

用于本发明的合适宿主细胞和药学上可接受的载体已在上文得到描述。另外，用于感染、培养和收获的合适方法是本领域众所周知的，并且在本文中描述且例示。

如上文详细概述，根据本发明的重组HVT可以有利地应用于家禽疫苗中，提供针对MD、ND和IBD或相关疾病体征的安全、稳定和有效的接种，并且可以在超幼龄时施用于家禽。

因此，本发明的进一步方面涉及用于家禽疫苗中的根据本发明的重组HVT。

根据本发明的重组HVT的‘用于疫苗中’的不同方面和实施方案已在上文进行概述，并且包含作为无细胞病毒或作为细胞相关的病毒用于用以接种家禽的不同疫苗组合物中。

因而，本发明的不同方面和实施方案可以有利地用于产生安全、稳定和有效的家禽疫苗。

因此，在进一步方面，本发明涉及所有根据本发明的表达盒、重组DNA分子、重组HVT或宿主细胞或其任何组合用于制造家禽疫苗的用途。

如上所述，且如下文所例举，根据本发明的疫苗可以有利地用于通过在超幼龄的单次接种来预防或减少IBDV和/或NDV的感染或相关的疾病体征。

因此，本发明的另外的方面是：

- 根据本发明的疫苗用于预防或减少IBDV和/或NDV的感染或相关疾病体征的用途。

- 用于预防或减少IBDV和/或NDV的感染或相关疾病体征的方法，所述方法包括向家禽施用根据本发明的疫苗。

- 接种家禽的方法，其包括用根据本发明的疫苗接种所述家禽的步骤。

关于根据本发明的疫苗通过接种家禽的用途的细节已在上文描述；具体地，通过一日龄雏鸡的肌肉内接种或皮下接种，以及18日龄胚胎的卵内接种。

本发明现在将参考下述非限制性实施例进行进一步描述。

实施例

1. 测试的不同的表达盒插入

为了寻找表达NDV F和IBDV VP2两者的稳定且有效的重组HVT，本发明人使用不同的元件和取向构建了一系列具有插入Us2的不同表达盒的重组HVT构建体。在图2中，给出(未按比例绘制)测试的代表性数量的类似构建体的相关元件的图形表示。为了比较，还表示现有技术构建体HVP309。

测试的变异为蛋白基因的顺序、所用的不同启动子和所用的插入基因的类型。

更详细地：将IBDV VP2基因连接至以下启动子：

- mCMV IE1基因启动子(包括增强子区和核心区)，

- 来自劳斯肉瘤病毒(Schmidt-Ruppin D毒株)的3'端末端的长末端重复(LTR)启动子，和

- 来自疫苗毒株Bartha (GenBank acc. nr:BK001744)的伪狂犬病病毒的gB基因启动子

此外，使用HVT密码子表以天然和密码子优化的版本测试VP2基因。

此外，在许多构建体中，异源基因彼此顺序相反。

构建、转染和扩增所有这些不同的重组HVT。接下来，通过测试在CEF细胞上体外表达和通过接种至实验动物中来测试体内表达和病毒血症来选择它们。

2. 不同的重组HVT构建体的病毒血症和血清学

在动物试验中，测试了由各种重组体HVT构建体诱导的病毒血症和血清学反应。基本上如WO 2013/057.235中所述进行动物实验。简而言之: 将一日龄SPF层鸡肌肉内接种，并在负压下保持在隔离器中。在接种后10、24和38天，从脾脏(10和38天)或血液样品(24天；外周血淋巴细胞：PBL)中重新分离HVT病毒，以测试病毒血症。在接种后37天采集的血液样品中测定血清反应。结果呈现于表2和图3和4中。

表 2：在1日龄肌肉内接种的SPF层中测试的不同重组HVT构建体的病毒血症和血清学反应。

VP2* = IBDV VP2基因 - 针对HVT优化的密码子

(1)病毒血症以pfu / 5x10^6个脾细胞表示。

所有HVT重组体都在接种的鸡中复制。与其他重组体相比，HVP364及其反映的构建体HVP367的病毒血症水平更低。在10天和24天，来自病毒血症的两种病毒的蚀斑的一部分在IF-测定中未显示VP2和/或F的表达。因此，在38天未测定病毒血症水平，并且从进一步研究排除HVP364和HVP367。

所有其他重组体在测试的所有时间点都显示所有蚀斑中VP2和F的表达。

测定在实验动物中接种后诱导的血清学反应：对于NDV F，Elisa值不具有区分性，因此使用针对NDV(克隆30)的血凝反应(HI)作为选择工具；对于IBDV，使用针对D78的中和(VN)；图4。

尽管HVP364和HVP367显示非表达性蚀斑，但测量抗体诱导。重组HVT HVP362给出优异的病毒血症，但针对IBDV VP2没有血清反应。类似地，HVP361和HVP366确实给出针对NDV的血清转化，但针对IBDV非常小或完全没有。因此，也从进一步研究排除这三种重组体。

令人惊讶地，只有HVP360构建体给出良好的病毒血症和血清学水平，并且因此选择该重组HVT用于进一步研究。

3. 重组HVT：HVP360的表征

3.1. 引言

HVP360是根据本发明的重组HVT，并且表达IBDV VP2基因和NDV F基因两者。使用基于HVT FC-126的粘粒组将其表达盒插入HVT基因组上的Us2基因座。

在HVP360中，IBDV的VP2基因分离自经典型F52/70毒株，并且由来自mCMV毒株ATCCVR-194的IE1基因启动子驱动。F基因源自NDV疫苗毒株克隆30，并且由来自hCMV毒株AD169的IE1基因启动子驱动。HVP360还含有如本文所定义的SV40终止信号和hCMV IE1基因终止子。图1显示HVP360中表达盒(其中所有元件均按比例绘制)和HVT Us2基因的侧接序列的示意图。在该实施例中，描述了HVP360的构建和表征。

3.2 材料和方法

3.2.1. HVP重组体的构建：

对于HVP360的构建，重组DNA表达盒至HVT Us2基因座中的插入用来自HVT疫苗毒株FC-126的一组重叠的粘粒衍生的DNA片段进行，所述DNA片段在转染至CEF中后，再生感染性病毒，如WO 2013/057.235中所述。此外，使用基于pBR322的质粒作为转移载体。在可能的情况下使用独特的限制性酶消化位点；当不可用时，这些通过包含此独特位点的合成接头序列的PCR引导的插入来引入。

通过用适当的限制性酶消化来从粘粒载体和转移质粒切下病毒DNA片段。然后借助磷酸钙沉淀将线性DNA片段转染入CEF细胞中。在DNA已进入细胞后，通过DNA片段的重叠序列之间的同源重组来再生感染性HVT病毒，从而生成包含Us2中的表达盒的完整HVT FC-126基因组。该病毒构建体被称为HVP360。

将转染的培养物的后代在新鲜CEF上扩增一次，并通过使用针对抗原VP2和F的单克隆抗血清的免疫荧光测定(IFA)检查表达VP2和F的HVT的存在。通过单蚀斑纯化分离重组病毒：当HVT CPE清晰可见时，在培养基中用琼脂糖覆盖受感染CEF的单层。随机挑选几个蚀斑，并且在CEF上传代两次，然后作为细胞相关病毒制备物进行收获和储存。

将两个HVP360平行蚀斑分离株(A1和B1)在连续的CEF细胞培养物中各自传代15次，并通过IFA在不同传代水平筛选VP2和F的表达。

3.2.2. DNA分析

对于HVP360构建体的详细表征，对转移载体的质粒DNA和用来自两个平行分离株的FC-126或HVP360第5代感染的CEF培养物的总DNA进行几种DNA分析。进行插入盒的编码核苷酸序列和HVT Us2侧接区的序列分析和Southern印迹分析，以证实正确整合至Us2中，以及传代后的遗传稳定性。还对HVP360的全基因组进行Southern印迹分析，以证实来自用于重构病毒的粘粒组的HVT DNA片段的重叠区域处的正确重组。

HVT DNA分离自用HVP360或对照亲本HVP FC-126感染的CEF细胞培养物，其也已从如用于HVP360、但无Us2表达盒的一组粘粒组装；这在随后实验中被用作对照病毒，并且被称为HVT FC-126/435。将病毒储备物在CEF上传代一次，并且使用Easy-DNA™试剂盒(Invitrogen)分离总DNA。从用转移载体转化的大肠杆菌培养物分离转移载体的质粒DNA，并且使用Quantum Prep™质粒Midiprep试剂盒(Bio-Rad)分离DNA。

3.2.3. 通过Southern印迹的表征

进行Southern印迹用于深入分析HVP360的基因组结构，以验证病毒组装完全如预期，并且在病毒再生期间没有发生无意识的插入或缺失。

用限制性酶PvuI和AatII；或用BamHI、KpnI、BglII和EcoRI消化HVT病毒DNA。转移质粒DNA用限制性酶PvuI和AatII消化。

消化后，将DNA片段上样在0.7％琼脂糖/TAE凝胶上的多个平行泳道中，电泳，并转移至硝酸纤维素膜上。将印迹切成相同片段，并与³²P标记的HVT探针和探测DNA大小标记物的探针(Smartladder™, Eurogentec)之一单独杂交。孵育16小时后，在两个洗涤步骤中除去过量探针，并将印迹暴露于X-射线胶片。显现放射自显影后，与探针特异性杂交的DNA限制性片段是可见的。

为了检测克隆质粒的任何部分是否已并入重组HVT中，通过用HaeIII将质粒pBR322消化成更小片段来制备探针。这些片段用³²P标记。HVT重构中使用的所有克隆载体都是pBR322的衍生物，并且如果存在载体序列，则将通过该探针检测。此外，HVP360转移质粒用于Southern印迹的一个泳道中作为用于检测质粒序列的阳性对照。

为了检查在粘粒插入片段的重叠区域和HVT基因组的重复区域处的正确组装，设计引物对以在这些相关区域中杂交，并且通过对从感染的CEF细胞培养物制备的HVT FC-126病毒DNA的PCR来获得探针。用Sau3AI将扩增子消化成较小片段，用³²P标记，并在Southern印迹杂交中用作探针。

接下来，将各种探针与已经用BamHI、KpnI、BglII或EcoRI消化的HVP360 DNA杂交。

将Southern印迹中检测到的限制性片段长度与基于HVT毒株FC-126的公开序列(GenBank acc. nr. AF291866)预期的那些进行比较。

3.2.4. 通过序列分析的表征

为了证实编码序列的正确插入和稳定性，对表达盒和HVT Us2侧接区进行完整DNA序列分析。

为了允许DNA测序，通过使用特异性引物的PCR扩增HVT的特异性DNA片段。使用Qiaquick™试剂盒(Qiagen)纯化扩增子。接下来，根据制造商的说明书，使用Big DyeTerminator™ v.3.1循环测序试剂盒(Applied Biosystems)对这些扩增子进行PCR测序。使用3500系列Genetic Analyzer™ (Applied Biosystems)进行测序。使用Sequencher™v. 5.0软件(Gene Codes Corporation)分析序列读数。

从重叠序列读数组装连续序列。通过重复测序反应和编译多个序列读数来解决任何歧义。

3.2.5. 通过IFA表征表达

转染、蚀斑纯化和连续传代后，通过IFA监测来自传代水平5、10和15的HVP360的两种平行分离株的分离株的插入基因的维持表达。将CEF单层用重组分离株感染，孵育2-3天，直到CPE清晰可见，然后用80％乙醇固定。IBDV VP2或NDV F的表达用单克隆抗体作为第一试剂和异硫氰酸荧光素(FITC)标记的缀合物作为二抗进行检测，并通过UV显微镜读取。

3.3. 结果

3.3.1. Southern印迹杂交的结果

通过使用特异性探针的Southern印迹分析来证实遗传同质性和稳定性。在含有来自毒株HVP360和FC 126的限制性DNA的泳道上与质粒pBR322探针杂交的印迹没有给出质粒探针的信号。然而，质粒探针的确与来自转移质粒的含有限制性DNA的泳道阳性反应，显示如预期的对于质粒骨架特异性的片段。此外，质粒探针对于DNA大小标记物的大多数条带是阳性的。

然后将相同印迹与对于Us2插入基因座特异性的探针杂交，再次显示如预测的限制性片段。

如预期，对于已插入表达盒的基因组区域，观察到不同的预期条带模式。

杂交显示，HVP360的病毒基因组被正确组装，并且与对于亲本HVT粘粒-重构毒株FC-126/435观察到的模式相匹配。

在与检测重叠序列和重复区域的探针的杂交中，发现HVP360和FC-126的模式在很大程度上是相同的，尽管在一些区域中发现的模式与基于HVT FC-126的公开的DNA序列预测的独特长和末端重复区域之间的连接的Southern印迹杂交模式略有不同。然而，这些区域中的模式对于重组和亲本病毒毒株两者是相同的。

因此，这些差异由亲本毒株HVT FC-126的病毒基因组序列和公开的序列的差异引起，而不是由通过粘粒重构技术在病毒基因组的组装期间的重排引起。

3.3.2. 通过序列分析表征结果

通过PCR-测序确定所用转移质粒的插入盒和侧接区的整个DNA序列。对于分离株A1和B1两者比对HVP360的病毒基因组中插入片段的共有序列，并且与转移质粒中的序列以及亲本毒株FC-126的插入区序列进行比较。比对的结果证实，插入HVP360的序列对于分离株A1和B1是相同的。

此外，显示该序列与转移质粒中的原始表达盒相同。此外，HVP360A1和B1以及FC-126的转移质粒的Us2插入基因座的侧接区域都显示在DNA序列中是相同的。

3.3.3. 通过IFA表征表达的结果

通过IFA筛选用于两种平行分离株以及来自所有3个传代水平5、10和15的HVP360的蚀斑纯化病毒的VP2和F的表达。测试的所有蚀斑都显示F和VP2基因的完全表达。这证实最多达(至少)细胞传代水平15的VP2和F的功能和稳定表达。

3.4. 结论

HVP360是表达IBDV VP2和NDV F两者的重组HVT。通过IFA的详细表征、对病毒DNA的Southern印迹分析和插入片段和侧接区的DNA测序证实，两种独立的HVP360分离株A1和B1都在HVT FC-126的Us2区域中正确地整合了表达盒，并且在噬斑纯化后在CEF细胞中15次随后传代期间，在CEF的感染培养物中功能性表达IBDV VP2和NDV F基因。

HVP360分离株A1和B1的表达盒和总基因组是正确的，因为在用一系列HVT特异性基因组探针的Southern印迹杂交后获得的限制性消化模式中没有检测到缺失、重排或额外外来序列。在Us2区域中仅整合一个拷贝的插入片段。

在Us2插入基因座的表达盒和侧接区的详细序列分析后，得出结论：HVP360 A1和B1与彼此、与转移载体中的序列且与亲本病毒FC-126是相同的。

4. 接种 - 用HVP360的攻击试验

用重组HVT HVP360进行接种 - 攻击实验。简而言之: 一日龄SPF层用平行分离株HVP360A1或B1中任一种肌肉内接种。在接种后3或4周时，针对用IBDV或NDV的严重攻击感染测量诱导的保护：对于IBDV，以3000 CID50/0.1 ml，通过至每只眼睛的眼途径，接种攻击毒株CS89；对于NDV，以6 Log 10 ELD50/0.2 ml/动物，通过肌肉内途径，给予毒株Herts 33/56。通过来自接种的动物的脾脏的病毒重新分离来确定疫苗和对照病毒的病毒血症水平。结果呈现于表3中。

攻击保护的水平如下确定：

对于NDV攻击，在接种后3或4周攻击后2周确定活比死亡动物的比率。例如：组中的20只动物中的18只存活者给出90％的NDV保护评分。

对于IBDV攻击，攻击后10天尸检时粘液囊(bursa)的临床症状评分在0和5之间，代表无一达到严重的淋巴细胞耗竭。具有0 – 2的评分的动物被认为是受保护的，而3 - 5的评分不受保护。IBD保护是从组中的动物数量受保护(粘液囊(bursa)临床评分0-2)的动物的百分比。

结果显示，在该实验中，在接种后3周，用HVP360肌肉内接种以59％至73 %针对ND保护一日龄的鸡。在4周时，ND保护率为79％至93％。在接种后3至4周时针对IBD的保护率为93%至100％。

表 3：用HVP360在1日龄肌肉内接种的SPF层中针对IBDV和NDV的病毒血症、血清学和攻击保护。

(1)病毒血症以pfu / 5x10^6个脾细胞表示。

5. 针对ND和IBD的免疫的开始和持续时间

在随后的接种 - 攻击实验中，使用HVP360作为疫苗和用NDV或IBDV进行攻击，确定免疫的开始和免疫的持续时间。HVP360疫苗病毒在传代水平13；动物是SPF层，1日龄；接种途径为：皮下；接种剂量为0.2 ml的1500至2500 pfu /动物剂量。攻击病毒是IBDV CS89或NDV Herts 33/56。对照动物用HVT FC-126/435皮下接种。

表 4：通过用约1500-2500 pfu/动物的剂量皮下接种的1日龄雏鸡中HVP360针对NDV或IBDV的攻击感染的保护。

结果显示，用HVP360接种后，通过皮下途径在1日龄接种后4周，针对NDV攻击获得超过90％保护率。这符合针对活ND疫苗的PhEur 0450专著要求。

甚至更好的是针对IBDV攻击实现的保护：在用HVP360接种后2周，针对攻击获得超过90％保护率。这符合针对IBD疫苗的PhEur 0587专著要求。

此外，这些结果表明，免疫-保护的持续时间进行，直到接种后(至少)8周，针对ND和针对IBD的保护水平为100％。

6. 针对ND的剂量-反应以及不同的施用途径的测试

在动物试验中，应用用不同剂量的HVP360接种，并测试不同的途径：卵内(io)和皮下(sc)，以测试来自这些剂量和这些途径针对NDV的攻击感染的反应。此外，测定在各种处理组中从接种动物重新分离后的HVP360疫苗和FC-126对照病毒的病毒血症水平。

在通过皮下途径接种18日龄的SPF层(io)的含胚卵或一日龄SPF层后，用NDVHerts 33/56在3或4周龄时攻击动物。在4、11或17天从脾脏或血液样品中重新分离疫苗/对照病毒，以确定达到的病毒血症水平。结果呈现于表5中。病毒血症以两种方式呈现：一次作为该组中鸟类的总数中对于疫苗/对照病毒重新分离阳性的鸟类数目，且一次作为每2x10^6个脾细胞的平均病毒pfu。

在“剂量”列中，呈现实际接种剂量，其通过接种后接种物的其余部分的反滴定进行测定。

表 5：用不同剂量的HVP360在卵内或皮下接种的SPF层中的病毒血症和针对NDV的攻击保护。

皮下接种似乎几乎不依赖于使用的剂量；500至2500 pfu/动物之间的剂量都达到令人满意的免疫保护水平。

最终，两种途径(io和sc)可以在3周和4周时分别产生65-70％和84-90％的相同保护。

附图说明

图1

包含表达盒和Us2基因侧接序列的根据本发明的优选重组DNA分子的插入区段的示意图，所述插入区段用于产生HVP360，根据本发明的优选的重组HVT。表达盒的元件按比例绘制。

缩写(从左到右)：5’ US2：来自HVT Us2基因的侧接上游序列；mIE：鼠CMV IE1基因启动子；VP2：IBDV VP2基因；term：SV40转录终止子；hIE：人CMV IE1基因核心启动子；F：NDVF基因；term：hCMV IE1基因终止子；3’ US2：来自HVT Us2基因的侧接下游序列。

图2：

测试的代表性数量的重组HVT构建体的相关元件的图形表示(未按比例绘制)。为了比较，还表示现有技术构建体HVP309。

图3：

作为每组的平均值，接种1日龄SPF层后10、24和38天的不同HVT重组体的病毒血症水平。

图4：

作为每组的平均值，接种1日龄SPF层后37天的不同HVT重组体诱导的血清学反应。

序列表

<110> Intervet International BV

<120> 改进的HVT作为载体的ND-IBD疫苗

<130> 23888

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 6674

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有侧接区的HVP360表达盒

<220>

<221> 基因

<222> (1)..(399)

<223> HVT Us2基因的上游部分; AF291866, nt 140143-140541

<220>

<221> 启动子

<222> (630)..(2020)

<223> 鼠巨细胞病毒立即早期1基因启动子-增强子

<220>

<221> 基因

<222> (2052)..(3410)

<223> IBDV毒株52/70, VP2基因

<220>

<221> polyA_信号

<222> (3441)..(3650)

<223> SV40 polyA信号 + 终止子

<220>

<221> 启动子

<222> (3805)..(4149)

<223> 人巨细胞病毒立即早期1基因核心启动子

<220>

<221> 基因

<222> (4174)..(5835)

<223> NDV克隆30 F-基因

<220>

<221> 终止子

<222> (5815)..(6127)

<223> hCMV IE基因终止子

<220>

<221> 基因

<222> (6156)..(6674)

<223> HVT Us2基因的下游部分; AF291866, nt 140541-141059

<400> 1

atctactgtc ttaacgccca tgggaacgga ggcgtcgtcg tcatgtattg gacggcaaca 60

taggcagcaa cacaaattgc gtttaggtgg ggtgcatgtg gactcgatac caagcccctg 120

cagctgggga acgtctggtg gagagccgat aatttgatat acgcacgcca tattactgtc 180

gttgaagtac gccttatctt ctatgttttc aaatttaggt tcccaagtgg acgtgagaag 240

tgtttgtatc tcacatggaa tggcccaagg cattccagcc caggtgcctg gtactttaat 300

ggcaaacaaa cgttttggta gaggtattga ttctattgca gttctgcaga tatctgcagc 360

cccgagtatc cacaggctat acgatacgtt atcggaggca agctgcggcc gctctagaac 420

tagtggatcc cccgggctgc agcccaatgt ggaattcgcc cttgcacatt gttactcctg 480

catcttaaaa atatatcctg tagtaatttt cacagcaatg tcataacatc atctcgctaa 540

agaatgacct gggattggag aagtaatgaa tatttgcaac caatgcattg aataaactaa 600

cattaaacga attcactagt ggatccccca actccgcccg ttttatgact agaaccaata 660

gtttttaatg ccaaatgcac tgaaatcccc taatttgcaa agccaaacgc cccctatgtg 720

agtaatacgg ggacttttta cccaatttcc caagcggaaa gccccctaat acactcatat 780

ggcatatgaa tcagcacggt catgcactct aatggcggcc catagggact ttccacatag 840

ggggcgttca ccatttccca gcataggggt ggtgactcaa tggcctttac ccaagtacat 900

tgggtcaatg ggaggtaagc caatgggttt ttcccattac tggcaagcac actgagtcaa 960

atgggacttt ccactgggtt ttgcccaagt acattgggtc aatgggaggt gagccaatgg 1020

gaaaaaccca ttgctgccaa gtacactgac tcaataggga ctttccaatg ggtttttcca 1080

ttgttggcaa gcatataagg tcaatgtggg tgagtcaata gggactttcc attgtattct 1140

gcccagtaca taaggtcaat agggggtgaa tcaacaggaa agtcccattg gagccaagta 1200

cactgcgtca atagggactt tccattgggt tttgcccagt acataaggtc aataggggat 1260

gagtcaatgg gaaaaaccca ttggagccaa gtacactgac tcaataggga ctttccattg 1320

ggttttgccc agtacataag gtcaataggg ggtgagtcaa caggaaagtc ccattggagc 1380

caagtacatt gagtcaatag ggactttcca atgggttttg cccagtacat aaggtcaatg 1440

ggaggtaagc caatgggttt ttcccattac tggcacgtat actgagtcat tagggacttt 1500

ccaatgggtt ttgcccagta cataaggtca ataggggtga atcaacagga aagtcccatt 1560

ggagccaagt acactgagtc aatagggact ttccattggg ttttgcccag tacaaaaggt 1620

caataggggg tgagtcaatg ggtttttccc attattggca cgtacataag gtcaataggg 1680

gtgagtcatt gggtttttcc agccaattta attaaaacgc catgtacttt cccaccattg 1740

acgtcaatgg gctattgaaa ctaatgcaac gtgaccttta aacggtactt tcccatagct 1800

gattaatggg aaagtaccgt tctcgagcca atacacgtca atgggaagtg aaagggcagc 1860

caaaacgtaa caccgccccg gttttcccct ggaaattcca tattggcacg cattctattg 1920

gctgagctgc gttctacgtg ggtataagag gcgcgaccag cgtcggtacc gtcgcagtct 1980

tcggtctgac caccgtagaa cgcagagctc ctcgctgcag gcggccgctc tagaactcgt 2040

cgatcgcagc gatgacaaac ctgcaagatc aaacccaaca gattgttccg ttcatacgga 2100

gccttctgat gccaacaacc ggaccggcgt ccattccgga cgacaccctg gagaagcaca 2160

ctctcaggtc agagacctcg acctacaatt tgactgtggg ggacacaggg tcagggctaa 2220

ttgtcttttt ccctggattc cctggctcaa ttgtgggtgc tcactacaca ctgcagagca 2280

atgggaacta caagttcgat cagatgctcc tgactgccca gaacctaccg gccagctaca 2340

actactgcag actagtgagt cggagtctca cagtgaggtc aagcacactc cctggtggcg 2400

tttatgcact aaacggcacc ataaacgccg tgaccttcca aggaagcctg agtgaactga 2460

cagatgttag ctacaatggg ttgatgtctg caacagccaa catcaacgac aaaattggga 2520

atgtcctggt aggggaaggg gtcactgtcc tcagcctacc cacatcatat gatcttgggt 2580

atgtgaggct tggtgacccc attcccgcta tagggcttga cccaaaaatg gtagctacat 2640

gcgacagcag tgacaggccc agagtctaca ccataactgc agccgatgat taccaattct 2700

catcacagta ccaaccaggt ggggtaacaa tcacactgtt ctcagccaac attgatgcta 2760

tcacaagcct cagcattggg ggagagctcg tgtttcaaac aagcgtccaa ggccttgtac 2820

tgggcgccac catctacctt ataggctttg atgggactgc ggtaatcacc agagctgtag 2880

ccgcagataa tgggctgacg gccggcaccg acaatcttat gccattcaat cttgtcattc 2940

caaccaatga gataacccag ccaatcacat ccatcaaact ggagatagtg acctccaaaa 3000

gtggtggtca ggcaggggat cagatgtcat ggtcggcaag tgggagccta gcagtgacga 3060

tccatggtgg caactatcca ggggccctcc gtcccgtcac actagtagcc tacgaaagag 3120

tggcaacagg atccgtcgtt acggtcgctg gggtgagtaa cttcgagctg attccaaatc 3180

ctgaactagc aaagaacctg gttacagaat acggccgatt tgacccagga gccatgaact 3240

acacaaaatt gatactgagt gagagggacc gtcttggcat caagaccgtc tggccaacaa 3300

gggagtacac tgattttcgt gagtacttca tggaggtggc cgacctcaac tctcccctga 3360

agattgcagg agcatttggc ttcaaagaca taatccgggc tataaggagg taagcttgat 3420

ctagagcggc cgcggggatc cagacatgat aagatacatt gatgagtttg gacaaaccac 3480

aactagaatg cagtgaaaaa aatgctttat ttgtgaaatt tgtgatgcta ttgctttatt 3540

tgtaaccatt ataagctgca ataaacaagt taacaacaac aattgcattc attttatgtt 3600

tcaggttcag ggggaggtgt gggaggtttt ttcggatcct ctagagtcga caattatttc 3660

atttaataac atatagccca aagacctcta tgaacattta gtttcccgta tactcaacgg 3720

cgcgtgtaca cacaagggcg aattccacag tggatatcaa gcttaattaa gtaccgagct 3780

cgaattggcg cgccaggtca attccctggc attatgccca gtacatgacc ttatgggact 3840

ttcctacttg gcagtacatc tacgtattag tcatcgctat taccatggtg atgcggtttt 3900

ggcagtacat caatgggcgt ggatagcggt ttgactcacg gggatttcca agtctccacc 3960

ccattgacgt caatgggagt ttgttttggc accaaaatca acgggacttt ccaaaatgtc 4020

gtaacaactc cgccccattg acgcaaatgg gcggtaggcg tgtacggtgg gaggtctata 4080

taagcagagc tcgtttagtg aaccgtcaga tcgcctggag acgccatcca cgctgttttg 4140

acctccatag aagacaccgg gcgcgccgga tccatgggcc ccagaccttc taccaagaac 4200

ccagtaccta tgatgctgac tgtccgagtc gcgctggtac tgagttgcat ctgtccggca 4260

aactccattg atggcaggcc tcttgcggct gcaggaattg tggttacagg agacaaagcc 4320

gtcaacatat acacctcatc ccagacagga tcaatcatag ttaagctcct cccgaatctg 4380

cccaaggata aggaggcatg tgcgaaagcc cccttggatg catacaacag gacattgacc 4440

actttgctca ccccccttgg tgactctatc cgtaggatac aagagtctgt gactacatct 4500

ggagggggga gacaggggcg ccttataggc gccattattg gcggtgtggc tcttggggtt 4560

gcaactgccg cacaaataac agcggccgca gctctgatac aagccaaaca aaatgctgcc 4620

aacatcctcc gacttaaaga gagcattgcc gcaaccaatg aggctgtgca tgaggtcact 4680

gacggattat cgcaactagc agtggcagtt gggaagatgc agcagtttgt taatgaccaa 4740

tttaataaaa cagctcagga attagactgc atcaaaattg cacagcaagt tggtgtagag 4800

ctcaacctgt acctaaccga attgactaca gtattcggac cacaaatcac ttcacctgct 4860

ttaaacaagc tgactattca ggcactttac aatctagctg gtggaaatat ggattactta 4920

ttgactaagt taggtgtagg gaacaatcaa ctcagctcat taatcggtag cggcttaatc 4980

accggtaacc ctattctata cgactcacag actcaactct tgggtataca ggtaactcta 5040

ccttcagtcg ggaacctaaa taatatgcgt gccacctact tggaaacctt atccgtaagc 5100

acaaccaggg gatttgcctc ggcacttgtc ccaaaagtgg tgacacaggt cggttctgtg 5160

atagaagaac ttgacacctc atactgtata gaaactgact tagatttata ttgtacaaga 5220

atagtaacgt tccctatgtc ccctggtatt tattcctgct tgagcggcaa tacgtcggcc 5280

tgtatgtact caaagaccga aggcgcactt actacaccat acatgactat caaaggttca 5340

gtcatcgcca actgcaagat gacaacatgt agatgtgtaa accccccggg tatcatatcg 5400

caaaactatg gagaagccgt gtctctaata gataaacaat catgcaatgt tttatcctta 5460

ggcgggataa ctttaaggct cagtggggaa ttcgatgtaa cttatcagaa gaatatctca 5520

atacaagatt ctcaagtaat aataacaggc aatcttgata tctcaactga gcttgggaat 5580

gtcaacaact cgatcagtaa tgctttgaat aagttagagg aaagcaacag aaaactagac 5640

aaagtcaatg tcaaactgac tagcacatct gctctcatta cctatatcgt tttgactatc 5700

atatctcttg tttttggtat acttagcccg attctagcat gctacctaat gtacaagcaa 5760

aaggcgcaac aaaagacctt attatggctt gggaataata ctctagatca gatgagagcc 5820

actacaaaaa tgtgaggatc tctcgaggaa ttctagatcc cacgtcacta ttgtatactc 5880

tatattatac tctatgttat actctgtaat cctactcaat aaacgtgtca cgcctgtgaa 5940

accgtactaa gtctcccgtg tcttcttatc accatcaggt gacatcctcg cccaggctgt 6000

caatcatgcc ggtatcgatt ccagtagcac cggccccacg ctgacaaccc actcttgcag 6060

cgttagcagc gcccctctta acaagccgac ccccaccagc gtcgcggtta ctaacactcc 6120

tctccccgac ctgcaactag tgcggccgca gcttgcctcc gattctagca ttacatagcc 6180

ggtcagtaga tcctgccatt cggtagcgca accggctaca tcttcaaaca gtctcacgat 6240

aaatgcatct ctcgttcctg ccaatccgga accgggcata ccactcccgc ctgccgattt 6300

aattctcaca attgggcgat gccggcgggg caaaacgaat gtggatttgg caaaccgaca 6360

caggtctgct gtacggacta atatgggcac acccacatca ttcttcagat gctccatgca 6420

ttgttctatg agaaagatcc atagggtgga ggcagcgtca cgagatcgcc caggcaatcg 6480

atcgcattcg tctagtaaag tgacgagagt tatcatgcac acacccatgc ccacgccttc 6540

cgaataactg gagctgtgga agatcggaaa cgtctttttg actgccggtc tcgtactact 6600

ttcgcacagg tgtatacccg gacgcgtact atatatttta tatcatccaa cgtcccgaaa 6660

ttacatacgt ggcg 6674

Claims (12)

1.重组DNA表达盒，其以5'至3'方向且以该顺序包含：

a. 鼠巨细胞病毒立即早期1基因(mCMV-IE1)启动子，

b. 传染性法氏囊病病毒(IBDV)病毒蛋白2(VP2)基因，

c. 转录终止子，

d. 人巨细胞病毒立即早期1基因(hCMV-IE1)启动子，

e. 新城疫病毒(NDV)融合(F)蛋白基因。

2.根据权利要求1所述的重组DNA表达盒，其中选自以下的条件中的一种或多种或全部适用：mCMV-IE1基因启动子是完整的启动子；IBDV VP2基因编码来自经典型IBDV的VP2蛋白；转录终止子包含终止区和polyA区两者；转录终止子源自猿猴病毒40(SV40)；hCMV-IE1基因启动子是核心启动子；NDV F基因来自弱毒NDV毒株；表达盒包含位于NDV F基因下游的额外转录终止子；且额外转录终止子源自hCMV-IE1基因。

3.重组DNA分子，其包含根据权利要求1或2中任一项所述的重组DNA表达盒。

4.重组火鸡疱疹病毒(HVT)，其包含根据权利要求1或2中任一项所述的重组DNA表达盒，由此将所述表达盒插入重组HVT的基因组的Us区。

5.宿主细胞，其包含根据权利要求4所述的重组HVT。

6.用于构建根据权利要求4所述的重组HVT的方法，所述方法包括将根据权利要求1或2中任一项所述的重组DNA表达盒插入重组HVT的基因组的Us区。

7.家禽疫苗，其包含根据权利要求4所述的重组HVT和/或根据权利要求5所述的宿主细胞和药学上可接受的载体。

8.根据权利要求7所述的疫苗，其包含至少一种额外的免疫活性组分。

9.用于制备根据权利要求7所述的疫苗的方法，所述方法包括以下步骤：

- 用根据权利要求4所述的重组HVT感染宿主细胞，

- 收获感染的宿主细胞，和

- 将收获的感染的宿主细胞与药学上可接受的载体混合。

10.根据权利要求1或2中任一项所述的表达盒、根据权利要求3所述的重组DNA分子、根据权利要求4所述的重组HVT、根据权利要求5所述的宿主细胞或其任何组合用于制造家禽疫苗的用途。

11.根据权利要求7或8中任一项所述的疫苗用于制造药物的用途，所述药物用于预防或减少IBDV和/或NDV的感染或相关疾病体征。

12.根据权利要求7或8中任一项所述的疫苗用于制造药物的用途，所述药物用于接种家禽。

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