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CN106916816B - 靶向EMS1/cortactin的多靶位siRNA分子及应用 - Google Patents

靶向EMS1/cortactin的多靶位siRNA分子及应用 Download PDF

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CN106916816B CN201710041201.XA CN201710041201A CN106916816B CN 106916816 B CN106916816 B CN 106916816B CN 201710041201 A CN201710041201 A CN 201710041201A CN 106916816 B CN106916816 B CN 106916816B
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Abstract

本发明属于靶向肿瘤相关基因的siRNA分子的技术领域，涉及靶向EMS1/cortactin的多靶位siRNA分子及应用，包括如下序列：EMS1/cortactin siRNA‑5的正义链和反义链；EMS1/cortactin siRNA‑6的正义链和反义链；EMS1/cortactin siRNA‑7的正义链和反义链，通过转染人肝癌（HCC）SMMC‑7721细胞系以抑制EMS1/cortactin表达，基因水平约为80%，下调水平较为稳定和准确，多靶位siRNA联合作用于HCC基因芯片检测、EMS1/cortactin表达对HCC转移调控分子机制研究和靶向EMS1/cortactin的抗转移核酸药物制备。

Description

靶向EMS1/cortactin的多靶位siRNA分子及应用
技术领域
本发明属于靶向肿瘤相关基因的siRNA分子的技术领域，涉及靶向EMS1/cortactin的多靶位siRNA分子及应用。
背景技术
原发性肝癌(HCC)是一种多基因改变的复杂和异构肿瘤，多数病人死于术后的复发和远处转移。肝癌细胞的侵袭性在HCC复发和远处转移中发挥重要作用。研究表明，细胞膜下存在一层0.2-0.5微米厚的透明区域，称为细胞皮层。该层结构主要由肌动蛋白微丝相互交联构成，与细胞骨架重组，细胞运动，信号转导等重要生理活动密切相关[1]。EMS1基因定位于人类染色体11q13，其编码蛋白具有与细胞皮质区内肌动蛋白结合的能力，故称之为皮动蛋白(actin-binding protein，cortactin)。EMS1/cortactin在肌动蛋白聚合过程中发挥关键性作用，并且调节细胞骨架和运动[2-3]。有关EMS1/cortactin与HCC迁移、侵袭密切相关的文献报道较多，但具体机制尚未研究清楚。
核酸干扰技术(RANi)经典作用在于特异性敲除或敲低某一特定基因片段，从而阐明该基因功能，并将其用于疾病治疗。由于EMS1/cortactin mRNA基因全长3319bp，单一靶点siRNA有时存在沉默效果不佳，性能不稳定，脱靶效应等问题，不利于下游实验开展，故本发明拟将RNAi的作用靶点选择在靶基因启动子下游75位碱基之后，同时进行多个RNAi靶点的联合抑制。通过多靶位siRNA联合作用，稳定敲低HCC细胞中EMS1/cortactin水平。
申请人拟将同时靶向EMS1/cortactin多个位点的siRNA联合转染入HCC细胞，通过RT-qPCR实验、人类全转录组cDNA基因芯片(Affymetrix Human Prime view)检测等，研究EMS1/cortactin水平下调后，HCC细胞中下游基因的具体变化，并将此实验结果与使用单一靶点siRNA的作用效果相对比，分析多靶位siRNA在抑制率和稳定性等方面是否具有有益效果。同时通过分析HCC细胞中EMS1/cortactin水平下调后，细胞中变化基因对应生物过程、分子功能等，进一步阐述EMS1/cortacitin表达与HCC迁移侵袭信号转导的具体关系，并明确其机制。研究结果为稳定抑制人HCC EMS1/cortacitin水平和研发靶向EMS1/cortactin抗转移的核酸药物提供有益的探索，为探讨HCC转移机制和临床控制HCC转移提供更有针对性的思路。
[1]喻丹，张培军.皮动蛋白及微丝相关蛋白2/3复合物介导的细胞运动的分子机制[J].生命的化学2005，25(3)：226-228.
[2]Uruno T，Liu J，Zhang P，et al.Activation of Arp2/3complex-mediatedactin polymerization by Cortactin[J].Nature cell biology 2001，3：259-266.
[3]Bryce NS，Clark ES，Leysath JL，et al.Cortactin promotes cellmotility by enhancing lamellipodial persistence[J].Current Biology 2005，15：1276-1285.
发明内容
根据EMS1mRNA(GenBank基本信息：NM_005231,3319bp,Homo sapiens cortactin,transcript variant 1,mRNA)及南通麦杰生物有限公司提供的设计原则，筛选出3条特异性siRNA靶序列：siRNA-5、siRNA-6和siRNA-7，分别靶向EMS1mRNA基因序列ccaacatcgagatgat tga(序列13，1765bp-1783bp)、cggtatcg acaaggacaa a(序列14，804bp-1783bp)和gaatatca gtcgaaactt t(序列15，514bp-532bp)。设计并制备的特异性靶向序列如下：
EMS1/cortactin siRNA-5的正义链：5’-CCAACAUCGAGAUGAUUGAdTdT-3’；
EMS1/cortactin siRNA-5的反义链：5’-UCAAUCAUCUCGAUGUUGGdTdT-3’；
EMS1/cortactin siRNA-6的正义链：5’-CGGUAUCGACAAGGACAAAdTdT-3’；
EMS1/cortactin siRNA-6的反义链：5’-UUUGUCCUUGUCGAUACCGdTdT-3’；
EMS1/cortactin siRNA-7的正义链：5’-GAAUAUCAGUCGAAACUUUdTdT-3’；
EMS1/cortactin siRNA-7的反义链：5’-AAAGUUUCGACUGAUAUUCdTdT-3’；
阴性对照序列如下：
siRNA-NC的正义链：5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT-3’；
siRNA-NC的反义链：5’-ACGUGACACGUUCGGAGAAdTdT-3’。
通过将siRNA-5、siRNA-6和siRNA-7转染入人肝癌细胞系SMMC-7721，通过RT-qPCR方法测定其基因水平变化，通过WS方法和免疫荧光方法检测其蛋白水平变化予以验证。
实验结果发现，多靶位联合使用siRNA-5、siRNA-6和siRNA-7可使SMMC-7721细胞内EMS1/cortactin在基因水平明显沉默，沉默效率为83.97％(区间范围81.14％-84.94％)，转染siRNA-NC未见EMS1/cortacin明显下降。蛋白水平western blot实验和免疫荧光检测支持以上实验结果。
将提取同批次转染后SMMC-7721之mRNA并送人类全转录组cDNA基因芯片(Affymetrix Human Prime view)检测，实验结果发现，当敲低EMS1/cortactin水平后，细胞内改变基因591种，其中上调389种，下调202种(见表1)。通过GO分析和KEGG分析，发现变化基因涉及的主要细胞组分为细胞质、胞浆基质等部位，实验结果与文献中关于EMS1/cortactin细胞膜下皮质区定位相符合，实验中检测出多个经典家族或分子，如interleukin家族IL6，IL1A，MAPK家族MAP2K6和EGR1，FGF2等，这些家族或分子被报道与细胞间黏附、侵袭和迁移密切相关，本次实验检测发现沉默HCC细胞中EMS1/cortactin后，这些家族或分子变化明显，FOLD值大于2，说明EMS1/cortactin发挥作用主要与其相关，除经典通路外，本次实验检测发现沉默EMS1/cortactin后，细胞内变化的基因还与ERK1和ERK2负反馈调节，NF-kappa B信号转导通路，TNF信号转导通路相关，与heparin binding，cholesterol biosynthetic process，protein homodimerization activity等生物过程相关，EMS1/cortactin与这些家族通路或生物过程的相关性为本实验首次发现，其他文献尚未见报道。
表1细胞内全基因水平变化
*按FOLD值>2计算
综上所述，本实验进一步明确了EMS1/cortactin在HCC迁移侵袭过程中的作用通路，拓展了对EMS1/cortactin功能的理解和认识，同时为临床控制HCC转移提供更有针对性的思路。
为对实验结果进行验证，在变化基因中随机选取8种，设计合成引物，通过RT-qPCR方法检测siRNA转染后其变化水平。实验结果发现其中7种基因RT-qPCR结果与基因芯片结果一致，符合度为85.00％。
仅将siRNA5转染SMMC-7721，下调水平在36.86％(区间范围31.95％-41.41％)，采取与上文同样的方法进行Affymetrix Human Prime view检测，实验结果发现改变基因1336种，上调基因1273种，下调63种，实验结果不符合一般规律。在变化基因中随机选取8种，设计合成引物，通过RT-qPCR方法检测siRNA转染后其变化。实验结果发现其中4种与RT-qPCR结果一致，符合度为50.00％。
本发明与现有技术相比，具有以下有益效果：本次合成靶向EMS1/cortactin的siRNA-5、siRNA-6和siRNA-7，用于同时转染人HCC细胞株SMMC-7721，在基因水平下调效率约为80％，反复验证后下调水平较为稳定和准确。单一使用siRNA-5，下调水平较低，仅为40％左右。将siRNA-5、siRNA-6和siRNA-7联合应用于基因芯片检测实验，经实验结果分析和PCR验证，效果准确，为研发靶向EMS1/cortactin抗转移的核酸药物提供依据。
多靶位siRNA联合使用，可有效解决单一靶点siRNA沉默效果不佳，性能不稳定，脱靶效应等问题，利于下游实验开展，稳定性和沉默效果好。
附图说明
图1为联合使用siRNA-5、siRNA-6和siRNA-7，RT-qPCR方法检测EMS1/cortactin基因水平下调效果示意图；
图2为联合使用siRNA-5、siRNA-6和siRNA-7，WB分析时上层浓缩胶的配方示意图(A)、蛋白定量检测的吸光度结果示意图(B)和一体式化学发光仪拍摄照片(C)；
图3为联合使用siRNA-5、siRNA-6和siRNA-7，免疫荧光检测EMS1/cortactin蛋白水平沉默示意图；
图4为联合使用siRNA-5、siRNA-6和siRNA-7，Affymetrix Human Prime view基因芯片检测GO数据库-细胞组成(cellular component)(A)、GO数据库-生物过程(biologicalprocess)(B)和GO数据库-分子功能(molecular function)(C)和KEGG数据库通路分析示意图(D)；
图5为单独使用siRNA-5，RT-qPCR方法检测EMS1/cortactin基因水平下调效果。
具体实施方式
为方便起见，在下文中，术语“siRNA”、“siRNA序列”或“siRNA分子”可以互换，它们表示的意思和范围相同。其中，siRNA是正义链和反义链退火形成的双链结构。本发明的siRNA分子来源于针对EMS1/cortactin基因开放阅读框的功能保守区而设计。siRNA的制备可采用多种方法，比如：化学合成法、体外转录、酶切长链dsRNA、载体表达siRNA、PCR合成siRNA表达元件等，这些方法的出现为研究者提供了可选择的空间，可以更好地获得基因沉默效率。
本发明采取化学合成法制备siRNA分子，该分子可用于HCC基因芯片检测、EMS1/cortactin表达对HCC转移调控分子机制研究，也可作为制备调节细胞中EMS1/cortactin基因功能药物的有效成分，下面通过实施例和附图对本发明作进一步地说明。
第一部分：联合使用siRNA-5、siRNA-6和siRNA-7
一、通过RT-qPCR检测siRNA-5、siRNA-6和siRNA-7同时转染后EMS1/cortactin基因的表达
1.实验材料
1.1细胞株
肝癌SMMC-7721细胞株，保存于南通麦杰生物技术有限公司。
1.2主要设备和耗材
二氧化碳恒温培养箱美国Thermo Fisher公司、Real-time检测仪(ABI-7500)美国ABI公司、倒置显微镜日本OLYMPUS公司、细胞培养板美国Corning公司、DMEM培养基美国Life Technologies公司、美国Life Technologies公司、Trizol RNA提取试剂美国Life Technologies公司、SYBRGreen PCR试剂盒F-415XL美国Thermo公司，其他生化试剂均为进口或国产分析纯试剂。
2.实验方法
2.1细胞培养
细胞株SMMC-7721生长于含10％胎牛血清的DMEM培养基中，37℃、5％CO2加湿培养箱中常规培养。
2.2引物设计
在NCBI GenBank检索各基因序列，设计相应引物序列，化学合成siRNA序列，使得对应的正义链和反义链退火形成相应的siRNA。见表2。
表2 siRNA序列
2.3实验分组
(1)提前一天铺板，第二天转染，实验分为3组：
1)siRNA-5#6#7#组(同时转染siRNA-5#6#7#，靶向组)
2)siRNA-NC组(转染siRNA-NC，阴性对照组)
3)normal组(细胞不做任何处理，空白对照组)
(2)转染48hrs后收集样品。
取培养得到的处于对数生长期的细胞，96孔板的接种密度为5×104/孔、24孔板按1.5×105/孔、6孔板为1×106/孔接种细胞，各实验组采用相应的siRNA按操作说明用脂质体(Lipofectamine)2000(Invitrogen公司)转染到细胞内，使siRNA终浓度为50nM，37℃培养4h后，培养液换成含10％FBS的DMEM培养基。
2.4 RT-qPCR检测EMS1/cortactin基因的mRNA水平
(1)提取细胞总RNA：
1)用冷的PBS洗涤细胞数次，并加入1mL RISOTM RNA提取试剂，用细胞刮子将细胞刮下来。
2)将裂解液转移至离心管中，在室温下放置5min，使得核酸蛋白复合物完全分离。
3)12,000g，4℃离心10min，然后小心吸取上清液，移入新的离心管中。
4)向上述步骤得到的匀浆液中加入0.2mL氯仿(每使用1mL RISO加0.2mL氯仿)，盖紧管盖，用手上下振荡15sec，得浑浊液，无分层现象，室温静置2-3min。
5)12,000g，4℃离心15min。离心后，样品分为三层：无色上清水相、中间蛋白层及下层有机相，水相的体积约为所用RISO试剂的60％。小心吸取无色上清液至另一离心管。
6)加入0.5mL异丙醇(每使用1mL RISO加0.5mL异丙醇)，轻轻混匀，室温静置10min。
7)12,000g，4℃离心10min。弃去上清，加1mL 70％乙醇(每使用1mL RISO试剂至少加1mL 70％乙醇)，涡旋振荡混匀。
8)7,500g，4℃离心5min。弃尽上清，超净工作台干燥沉淀或真空离心干燥(不可太干，否则RNA将会难以溶解)，加入适量DEPC-H2O溶解RNA沉淀，在55-60℃促溶10min。
9)取1μL的RNA样品，进行1.0％甲醛变性琼脂糖电泳检测。
(2)RT-qPCR检测：
用RT-qPCR检测靶基因mRNA表达水平，看家基因GAPDH为内参，引物序列见表3：
表3 RT-qPCR引物序列
F：Forward primer，正向引物；R：Reverse primer，反向引物。
1)总RNA反转录成cDNA：反转录前RNA，70℃热变性5min，后立即置于冰上；建立以下反应体系，以Oligo d(T)n反转录cDNA：RNA～2μg，M-MLV酶1μl，5×M-MLV反应缓冲液4μl，RNase抑制剂0.5μl，dNTP(浓度：2.5mM)4μl，Oligo d(T)15 1μl，DEPC处理H2O至20μl，反应程序：42℃反应1h后；70℃灭活10min，反应结束后：稀释cDNA至100μL后，保存于-80度备用；
2)PCR：以上述2对引物做qPCR，其中GAPDH基因作为内参对照；建立以下qPCR反应体系：cDNA 4.0μL，2×SYBR Green qPCR mix 12.5μL，F或F’(10μM)1.0μL，R或R’(10μM)1.0μL，ddH2O，至25μL，反应程序：95℃5min预变性。95℃30s，55℃30s，72℃30sec，45循环；反应结束后，分析RT-qPCR的扩增曲线，同时观察熔解曲线，按每个反应的Ct值，用2-ΔΔCt法分析实验结果，并作柱形图。
3.实验结果和讨论
检测各基因mRNA水平的表达，如图1，由结果可知：EMS1/cortactin沉默效率为83.97％。实验结果发现，多靶位联合使用siRNA-5、siRNA-6和siRNA-7可使SMMC-7721细胞内EMS1/cortactin在基因水平明显沉默，沉默效率为83.97％(区间范围81.14％-84.94％)。
二、检测siRNA-5、siRNA-6和siRNA-7同时转染后对EMS1/cortactin蛋白水平沉默
(一)Western blot实验
1.实验材料
表4 WB实验材料
2.实验步骤：
(1)取冻存的SMMC-7721细胞系，37℃快速解冻后，1000r/min离心5min，用DMEM培养基清洗1-2次(因为在冷冻的过程中加入了对细胞繁殖生长有害的物质)，用DMEM基础培养基重悬后再离心。
(2)加入DMEM完全培养基进行培养，每天换一次培养基。
(3)观察细胞生长状况，待细胞处于对数生长期时，调整细胞浓度为5×104cells/ml，将细胞分盘铺于6孔板，共9个孔，37℃，5％CO2培养箱内培养24h。
(4)制备siRNA-Lipofectamine 2000复合物。
(5)将上清液吸掉，PBS清洗细胞。
(6)每孔加入600μlsiRNA-Lipofectamine 2000复合物到6孔培养板中，轻轻前后摇匀。
(7)37℃，5％CO2培养箱内培养4-6h后，吸掉上清液，用PBS清洗两次，加入2mL的DMEM完全培养基，于培养箱内培养24h后收集细胞。
(8)每组分别加入500μL的RIPA裂解液，并加入适量的PMSF，置于冰上裂解2h；12000rpm，4℃，离心10min；移上清于新的EP管中，进行蛋白质定量后贮存于-20℃冰箱。(9)蛋白定量
1)标准曲线的绘制：取一块酶标板，按照下表加入试剂
表5蛋白定量试剂
2)将BCA试剂A与试剂B按体积比为50:1配制适量BCA工作液，充分混匀；各孔加入200μL BCA工作液。
3)把酶标板放在振荡器上振荡30sec，37℃放置30min，然后在562nm下测定吸光度。以吸光值为横坐标，蛋白浓度(μg/μL)为纵坐标，绘出标准曲线，如图2。
4)在酶标板中加入2μL待测蛋白和8μL去离子水，加入200μL BCA工作液，把酶标板放在振荡器上振荡30sec，37℃放置30min，然后在562nm下测定吸光度。
5)根据所测样品的吸光值，在标准曲线上即可计算出相应的蛋白浓度(μg/μL)，乘以样品稀释倍数即为样品实际浓度(单位：μg/μL)。如图2所示，根据样品浓度确定上样量。
表6吸光度测定结果
(10)PAGE胶的制备
1)下层分离胶的制备根据目的蛋白的分子量选用12％的胶。不同浓度的分离胶按常规进行配制，待下层胶凝固后进行上次浓缩胶的配制。
2)上层浓缩胶的配制
根据需要按图2配制浓缩胶，并插好梳子。
(11)上样及电泳
根据蛋白定量的结果相对应的加入200μL EP管中，再在每管中加入染液3μL。每孔蛋白上样量为20μL。电泳浓缩胶80V 20min，分离胶100V 1h。
(12)转膜
将胶小心的移入转膜缓冲液中，剪下同样大小的PVDF膜，以甲醇浸泡3min，然后水洗2min，剪下同样大小的6块滤纸与PVDF膜，在转膜缓冲液中平衡15min。在转膜装置上从负极到正极放置垫片、滤纸、胶、膜、滤纸、垫片，除去气泡。电压100V，1.5h左右。
(13)膜的封闭及抗体孵育
1)封闭：5％脱脂奶粉(检测磷酸化蛋白用BSA)室温封闭1h或4℃过夜。
2)一抗：根据说明书稀释抗体，抗体加入封闭液中稀释到所需浓度，和膜孵育2h或4℃孵育过夜。二抗：孵育一抗的膜用TBST洗涤3次，每次10min。随后根据用量，稀释相对应的二抗，与膜37℃孵育1h。用TBST洗涤3次，每次10min。
3实验结果和讨论
一体式化学发光仪拍摄照片如图2，与normal组相比，siRNA-NC转染细胞后，EMS1/cortactin蛋白表达水平有没有差异；与NC组相比，siRNA-5#6#7转染细胞后，EMS1/cortactin蛋白的表达水平有显著的下降。
(二)免疫荧光
1.实验材料及仪器：
1.1实验材料
FBS、DMEM培养基均购自Hyclone，SMMC-7721细胞来源于本实验室保存。
1.2实验仪器
细胞培养箱(Thermo Scientific 8000)，光学显微镜(XDS-1A)，低速离心机(上海卢湘仪TDZ4B-WS)，荧光显微镜(Leica IX71)。
2.实验步骤：
(1)待细胞生长至对数生长期时，调整细胞密度为5×104cells/mL，分别接种至48孔细胞培养板，每孔300μL，每个浓度梯度3个复孔，37℃，5％CO2培养24h。
(2)按照前述步骤进行转染，培养24h后进行后续实验。
1)固定：取出孔板，加入PBS 300μL，静置5min，用手甩去板中液体，在吸水纸上轻轻拍干，每孔加入150μL 4％多聚甲醛固定液，室温固定30min。
2)通透：每孔加入150μL 0.1％Triton x-100，室温静置15min。
3)洗涤：每孔加入300μL的PBS，静置5min，吸出液体，重复3次，在吸水纸上轻轻拍干。
4)封闭：每孔加入200μL 5％BSA封闭液，置于37℃，5％CO2培养箱1h。吸出液体，在吸水纸上轻轻拍干。
5)一抗：每孔加入150μL采用1％BSA稀释的NSE(稀释比例参照说明书)，4℃过夜孵育。
6)洗涤：每孔加入300μL的PBS，静置5min，吸出液体，重复5次，在吸水纸上轻轻拍干。
7)封闭：每孔加入200μL1％BSA封闭液，室温封闭15min。
8)二抗：每孔加入150μL采用1％BSA稀释的对应二抗(稀释比例参照说明书)，37℃孵育1h。
(3)洗涤：每孔加入300μL的PBS，静置5min，吸出液体，重复5次。
(4)染核：每孔加入150μL的Hoechst33258染液，室温避光孵育30min。
(5)拍照：洗涤完毕每孔加入300μL PBS，将细胞置于荧光显微镜下观察，并拍照保存。
3.3实验结果和讨论
实验结果见图3，由上图免疫荧光可知，与normal组相比，siRNA-NC转染细胞后，EMS1/cortactin表达水平没有差异；与NC组相比，siRNA-5#6#7转染细胞后，EMS1/cortactin的表达水平有明显下降。
三、Affymetrix Human Prime view方法检测siRNA-5、siRNA-6和siRNA-7联合转染沉默EMS1/cortactin后细胞内全基因组变化
实验设计合成的siRNA-5、siRNA-6和siRNA-7，经RT-qPCR检测，基因水平下调效率在80％左右，WS和免疫荧光实验支持以上结果，下调效率高，效果稳定。发明人将其用于大通量基因芯片检测，研究当沉默HCC细胞中EMS1/cortactin基因后，细胞内全基因水平变化情况。将siRNA-5、siRNA-6和siRNA-7联合转染肝癌细胞后，提取细胞RNA，送基因芯片Affymetrix Human Prime view检测，具体步骤为：
样品总RNA利用NanoDrop ND-2100(Thermo Scientific)定量并经AgilentBioanalyzer 2100(Agilent Technologies)检测RNA完整性。RNA质检合格后，样本的标记、芯片的杂交以及洗脱参照芯片标准流程。首先，总RNA反转录成双链cDNA，再进一步合成用生物素标记的cRNA。标记好的cRNA和芯片杂交，洗脱和染色后利用Affymetrix Scanner3000(Affymetrix)扫描得到原始图像。
原始图像采用Affymetrix GeneChip Command Console软件(version4.0,Affymetrix)处理提取原始数据。接着利用Genespring软件(version 12.5；AgilentTechnologies)进行RMA标准化和后续处理。差异基因利用FoldChange的倍数变化值进行筛选，筛选的标准为上调或者下调倍数变化值>＝2.0。接着，对差异基因进行GO和KEGG富集分析，以判定差异基因主要影响的生物学功能或者通路。
实验结果如图4，发现细胞内改变基因591种，其中上调389种，下调202种。通过GO分析和KEGG分析，发现变化基因涉及的主要细胞组分为细胞质、胞浆基质等部位，实验中检测出多个经典家族或分子变化(取FOLD值>2)，如interleukin家族IL6，IL1A，MAPK家族MAP2K6和EGR1，FGF2等，这些家族或分子被报道与细胞间黏附、侵袭和迁移密切相关。除经典通路外，本次实验检测发现沉默EMS1/cortactin后，细胞内变化的基因还与ERK1和ERK2负反馈调节，NF-kappa B信号转导通路，TNF信号转导通路相关，与heparin binding，cholesterol biosynthetic process，protein homodimerization activity等生物过程相关，EMS1/cortactin与这些家族通路或生物过程的相关性为本实验首次发现，其他文献尚未见报道。
第二部分：单独使用siRNA-5
一、RT-qPCR检测EMS1/cortactin基因的mRNA水平
1分组：
(1)siRNA-5组(仅转染siRNA-5，靶向组)
(2)siRNA-NC组(转染siRNA-NC，阴性对照组)
(3)normal组(细胞不做任何处理，空白对照组)
2引物设计及具体实验方法同上，RT-qPCR检测EMS1/cortactin mRNA水平的表达，如图5，由结果可知：EMS1/cortactin沉默效率为36.86％，区间范围(31.95％-41.41％)。
二、Affymetrix Human Prime view方法检测siRNA-5沉默EMS1/cortactin后细胞内全基因组变化
采取与上文同样的方法进行Affymetrix Human Prime view检测，实验结果发现改变基因1336种，上调基因1273种，下调63种，实验结果不符合一般规律(表1)。
第三部分：联合使用siRNA-5、siRNA-6和siRNA-7及单独使用siRNA-5，基因芯片结果与PCR结果对比
一、根据Affymetrix Human Prime view基因芯片结果，在上调基因和下调基因中各选择4
种，设计引物并将siRNA-5、siRNA-6和siRNA-7转染SMMC-7721细胞，通过RT-qPCR方法检测这些基因的变化情况，并与基因芯片结果进行比对。基因引物列表见表7，比对结果见表8。
表7基因引物列表
表8联合使用siRNA-5、siRNA-6和siRNA-7基因芯片结果与RT-qPCR结果对比
二、根据Affymetrix Human Prime view基因芯片结果，在上调基因和下调基因中各选择4种，设计引物(如表9)并将siRNA-5转染SMMC-7721细胞，通过RT-qPCR方法检测这些基因的变化情况，并与基因芯片结果进行比对(表10)。
表9通过RT-qPCR方法检测变化基因引物列表
表10单独使用siRNA-5，基因芯片结果与RT-qPCR结果对比
本发明合成靶向EMS1/cortactin的siRNA-5、siRNA-6和siRNA-7，用于转染人HCC细胞株SMMC-7721，在基因水平下调效率约为80％，反复验证后下调水平较为稳定和准确。单一使用siRNA-5，下调水平较低，仅为40％左右。将siRNA-5、siRNA-6和siRNA-7联合应用于基因芯片检测实验，经实验结果分析和PCR验证，效果准确，为研发靶向EMS1/cortactin抗转移的核酸药物提供依据。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和等同形式的替换，这些改进和等同替换得到的技术方案也应属于本发明的保护范围。
<110> 南通大学杏林学院 南通大学 南通麦杰生物科技有限公司
<120> 靶向EMS1cortactin 的多靶位siRNA分子及应用
<160> 12
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 21
<212> RNA
<213> EMS1/cortactin siRNA-5的正义链
<400> 1
ccaacaucga gaugauugadt dt 21
<210> 2
<211> 21
<212> RNA
<213> EMS1/cortactin siRNA-5的反义链
<400> 2
ucaaucaucu cgauguuggdt dt 21
<210> 3
<211> 21
<212> RNA
<213> EMS1/cortactin siRNA-6的正义链
<400> 3
cgguaucgac aaggacaaadt dt 21
<210> 4
<211> 21
<212> RNA
<213> EMS1/cortactin siRNA-6的反义链
<400> 4
uuuguccuug ucgauaccgdt dt 21
<210> 5
<211> 21
<212> RNA
<213> EMS1/cortactin siRNA-7的正义链
<400> 5
gaauaucagucgaaacuuudtdt 21
<210> 6
<211> 21
<212> RNA
<213> EMS1/cortactin siRNA-7的反义链
<400> 6
aaaguuucgacugauauucdtdt 21
<210> 7
<211> 21
<212> RNA
<213> siRNA-NC的正义链
<400> 7
uucuccgaacgugucacgudtdt 21
<210> 8
<211> 21
<212> RNA
<213> siRNA-NC的反义链
<400> 8
acgugacacguucggagaadtdt 21
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> MACF1引物F
<400> 9
ggttccatac tgccctctgt 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> MACF1引物R
<400> 10
cagagtttgc ctccttgtga 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> GAPDH RT-PCR引物F
<400> 11
gaaggtgaaggtcggagtc 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> GAPDH RT-PCR引物R
<400> 12
gaagatggtgatgggatttc 20
<210> 13
<211> 19
<212> RNA
<213> 对应于siRNA-5的EMS1 mRNA基因序列
<400> 13
ccaacatcga gatgattga 19
<210> 14
<211> 19
<212> RNA
<213> 对应于siRNA-6的EMS1 mRNA基因序列
<400> 14
cggtatcgac aaggacaaa 19
<210> 15
<211> 19
<212> RNA
<213> 对应于siRNA-7的EMS1 mRNA基因序列
<400> 15
gaatatcagt cgaaacttt 19
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> EMS1/cortactin引物F
<400> 16
gtgtggaaca agaccgaatg 20
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> EMS1/cortactin引物R
<400> 17
catctggaca ccaaacttgc 20
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> MAP2K6引物F
<400> 18
agagatgggc aagcaagaag 20
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> MAP2K6引物R
<400> 19
gtcatctgcc ttcacctcaa 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> MEOX1引物F
<400> 20
aaccaggaga acagagggaa 20
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> MEOX1引物R
<400> 21
gtccaggttt accgcaatct 20
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> SLC12A3引物F
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caactatggc gtgtgtgtca 20
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> SLC12A3引物R
<400> 23
tagggaatga ggagggtgag 20
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> ITGA2引物F
<400> 24
gcactcactt tgttgctggt 20
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> ITGA2引物R
<400> 25
gtgagcctga ataaccgtga 20
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> FGF2引物F
<400> 26
atgcctctct caccactcct 20
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> FGF2引物R
<400> 27
tgtatcccga gactttgctg 20
<210> 28
<211> 21
<212> DNA
<213> IL6引物F
<400> 28
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<211> 20
<212> DNA
<213> IL6引物R
<400> 29
tctcagctga ttgtcttggg 20
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<211> 20
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caaacttgct gatgatggca 20
<210> 31
<211> 21
<212> DNA
<213> ECM2引物R
<400> 31
tcttctggaa gaatgttccg t 21
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
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<400> 32
ctacccatcc tctcctccag 20
<210> 33
<211> 20
<212> DNA
<213> MAP1B引物R
<400> 33
tctcagctga ttgtcttggg 20

Claims (4)

1.靶向EMS1/cortactin 的多靶位siRNA分子组，其特征在于，包括如下序列：
EMS1/cortactin siRNA-5的正义链：5’- CCAACAUCGAGAUGAUUGAdTdT-3’；
EMS1/cortactin siRNA-5的反义链：5’- UCAAUCAUCUCGAUGUUGGdTdT-3’；
EMS1/cortactin siRNA-6的正义链：5’- CGGUAUCGACAAGGACAAAdTdT -3’；
EMS1/cortactin siRNA-6的反义链：5’- UUUGUCCUUGUCGAUACCGdTdT -3’；
EMS1/cortactin siRNA-7的正义链：5’- GAAUAUCAGUCGAAACUUUdTdT -3’；
EMS1/cortactin siRNA-7的反义链：5’- AAAGUUUCGACUGAUAUUCdTdT -3’。
2.根据权利要求1所述的靶向EMS1/cortactin 的多靶位siRNA分子组，其特征在于，还包括阴性对照序列如下：
siRNA-NC的正义链：5’- UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT-3’；
siRNA-NC的反义链：5’- ACGUGACACGUUCGGAGAAdTdT-3’。
3.权利要求1所述的靶向EMS1/cortactin 的多靶位siRNA分子组在制备降低EMS1/cortactin表达的药物中的用途。
4.权利要求1所述的靶向EMS1/cortactin 的多靶位siRNA分子组在抗HCC迁移核酸药物制备中的用途。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007029249A2 (en) * 2005-09-09 2007-03-15 Quark Pharmaceuticals, Inc. Oligoribonucleotides and methods of use thereof for treatment of cardiovascular diseases
CN103937800A (zh) * 2014-05-13 2014-07-23 南通大学 靶向多基因的siRNA分子及其抑制肿瘤的应用
CN103937801A (zh) * 2014-05-13 2014-07-23 南通大学 多靶向siRNA分子及其抗肿瘤的应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007029249A2 (en) * 2005-09-09 2007-03-15 Quark Pharmaceuticals, Inc. Oligoribonucleotides and methods of use thereof for treatment of cardiovascular diseases
CN103937800A (zh) * 2014-05-13 2014-07-23 南通大学 靶向多基因的siRNA分子及其抑制肿瘤的应用
CN103937801A (zh) * 2014-05-13 2014-07-23 南通大学 多靶向siRNA分子及其抗肿瘤的应用

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Multi-target siRNA: Therapeutic Strategy for Hepatocellular Carcinoma;Tiejun Li等;《Journal of Cancer》;20160625;第7卷(第10期);1317-1327
下调EMS1 /cortactin 对人高转移潜能肝癌细胞株迁移和内吞的影响;周家名等;《临床与实验病理学杂志》;20121130;第28卷(第11期);1235-1238、1242
人类皮层肌动蛋白基因siRNA干预结肠癌细胞侵袭能力的研究;邱烽等;《中华胃肠外科杂志》;20111130;第14卷(第11期);887-891
沉默EMS1 /cortactin 基因对肝癌HepG2 细胞迁移、侵袭和细胞周期的影响;周家名等;《基础医学与临床》;20161231;第36卷(第12期);1664-1669

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