CN106902347A - 亲环孢素抑制剂的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及亲环孢素抑制剂的用途，具体提供了亲环孢素抑制剂或其药学上可接受的盐或溶剂合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗和/或预防乙型肝炎病毒感染引起的疾病。

Description

亲环孢素抑制剂的用途

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体而言，本发明涉及亲环孢素抑制剂的用途。

背景技术

乙型肝炎(乙肝)是由乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus)感染引起的传染病，全球大约有3亿人感染乙肝病毒，其中中国有1亿人。急性乙型肝炎病毒感染后常常转化为慢性感染，甚至转化为肝硬化、肝功能障碍和肝癌等。全世界由慢性乙型肝炎引发的肝癌占了肝癌总发病率的60％-80％，慢性乙型肝炎已经成为一种严重威胁人类健康的疾病。

HBV隶属于嗜肝病毒科，其基因组为3.2kb不完全闭合双链环状DNA。完整病毒颗粒由核衣壳和包膜组成。核衣壳主要由病毒的核心抗原蛋白包裹着DNA和病毒的逆转录酶及末端蛋白组成，包膜的主要成分跟宿主的细胞膜相同。乙肝病毒主要通过母婴传播、性传播、血液传播。

HBV在宿主细胞中的复制过程可被简单的分为三个时期：(1)病毒颗粒进入细胞，将包含有核衣壳的RC-DNA释放到细胞质里，RC-DNA随后被运输到细胞核内，形成cccDNA。(2)由RNA聚合酶II转录出不同的基因组及亚基因组RNAs，其中pgRNA被选择性作为新的模板并合成核衣壳蛋白及病毒DNA聚合酶。(3)合成的病毒基因组与病毒蛋白组合包装形成子代病毒颗粒，进入高尔基体形成包膜，最后通过出芽释放到细胞外，进行下一轮感染及复制。

HBV在宿主中的生命周期主要表现为四个阶段。第一个阶段是免疫耐受期。在健康的成年人中，这个潜伏期通常为二到四个星期，而在新生儿中，潜伏期可长达数十年。第二个阶段，机体的免疫反应开始或提高，刺激产生大量的细胞因子和炎症因子。处于此阶段的感染者血清中HBV DNA下降，但分泌HBeAg。HBV感染的急性患者，此阶段通常持续4周期左右，但对慢性感染者来说，第二阶段持续的时间很长，可能导致肝硬化及并发症。当宿主的免疫能力被触发后，有能力大大减少或者消除被感染的细胞，病毒的复制减弱至消失，这意味着第三阶段的开始。第三阶段，感染已消除，机体内的转氨酶水平恢复至正常水平，然而，HBsAg仍呈阳性，可能的原因是S基因整合到宿主的基因组中了。第四阶段称为免疫阶段。此阶段大多数感染者的生理特征为乙肝表面抗原抗体呈阳性而乙肝表面抗原呈阴性。在这个阶段，检测不到HBV DNA的存在。很多因素影响着这四个阶段的进程，如宿主的遗传易感性、其它病毒的存在、HBV突变体的出现、性别、免疫抑制剂的治疗等等。

目前，对乙肝患者的用药主要分为保肝降酶、抗病毒、抗肝纤维化和调节免疫等几个大类，取得较大进展的还是在抗病毒药物治疗研究方面。目前对于病毒性乙肝的治疗方案只能达到抑制HBV复制和继发感染，并不能直接破坏病毒体，甚至清除病毒。用于治疗慢性肝炎的药物有两类：一类是通过直接干扰HBV复制，一类是调节HBV特异性的免疫反应。前者主要为核苷酸或核苷类似物，如拉米夫定、阿德福韦、恩替卡韦等，通过直接抑制逆转录酶的活性来抑制病毒复制。后者主要是干扰素及聚乙二醇干扰素-2a，它们具有很强的免疫调节作用。但是干扰素治疗易发生较为严重的不良反应，导致很多病人不能耐受而退出治疗；核苷类似物治疗易出现病毒变异及耐药，且停药后常发生反弹。而近年来一系列作用于HBV病毒复制周期的新型抗病毒药物不断涌现，其中，靶向宿主因素的亲环孢素(CyP)抑制剂也正受到越来越多的重视。

亲环孢素A(CyPA)最初是作为环孢菌素A(CsA)的蛋白受体被发现的，环孢菌素A是一种免疫抑制剂，可用于抗真菌、抗寄生虫、抗炎症以及抗HIV活性。已经报道环孢菌素A和其某些衍生物具有抗HCV活性。近年研究显示环孢菌素A抑制钠-牛黄胆酸转运多肽(NTCP)的转运活性，并阻断NTCP与HBV衣壳蛋白体外结合，从而阻碍HBV进入宿主细胞。环孢菌素A相关复合物(SCYX618806、Alisporivir等)具有比环孢菌素A更强的抗HBV潜力。但是环孢菌素治疗会引起严重的肾毒性，表现为剧烈的肾血管收缩，以致发展成不可逆的肾结构和功能损伤。因此急需要治疗或预防病毒性肝炎的有效方法和组合物药物。

环孢菌素治疗引起的并发症问题随后得到了解决，因为人们惊讶的发现某些3-取代的环孢菌素衍生物具有抗HCV活性，并且具有出乎意料的良好毒理学性质。目前研究表明亲环孢素的免疫缺乏类似物，如NIM811、SCY-635和Alisporivir有希望替代亲环孢素作为抗丙肝化学疗法药物。

如今，我们已知用干扰素单一药物治疗或与利巴韦林(病毒唑)(Ribavirin)，联合治疗能够有效根除HCV，但仍具有较大局限性，因此研究者们多方面开展抗HCV药物的研究来代替干扰素或与干扰素同时使用。其中取得较大突破的要数对环孢菌素衍生物SCY-635的抗病毒研究。环孢菌素衍生物SCY-635诱导丙肝患者的体内免疫反应，促进宿主细胞产生I/II/III型干扰素，其与干扰素联合使用具有更加优良的抗HCV效果。

然而，至今HBV感染引起的乙型肝炎仍是非常难以治愈的，目前对于乙型肝炎的治疗方案只能达到抑制HBV复制和继发感染，并不能完全清除乙肝病毒，这是乙型肝炎相对于丙型肝炎治疗的难点。SCY-635在丙肝病毒相关疾病中发挥的免疫调节功能让我们有理由推测该药物不仅适用于抗RNA病毒，对DNA病毒可能也同样具有抑制作用。而且到目前为止，还没有关于环孢菌素衍生物SCY-635抑制乙肝病毒感染的相关报道。但是我们也要清楚能够治疗丙型肝炎病毒相关疾病的药物并不一定也能够治疗乙型肝炎病毒相关疾病。尽管具有广谱抗病毒作用的干扰素，既能够抗丙肝病毒，也能够抗乙肝病毒，但治疗两种病毒相关疾病的其他药物却有不同的作用机制及不同的疗效。大多数抗乙肝病毒的核苷类药物在体内需要先转化为三磷酸形式才能发挥抗乙肝病毒作用，这些核苷类药物可抑制病毒DNA多聚酶和逆转录酶的活性，并与脱氧胞嘧啶核苷竞争性渗入病毒的DNA链，终止DNA链的延长和合成，使病毒的复制受到抑制而发挥抗DNA病毒作用。三磷酸形式的拉米夫定可插入正在合成的乙肝病毒DNA链中，阻断HBV DNA的合成；阿德福韦则是通过作为DNA链的终止物抑制HBV DNA聚合。而核苷类药物对丙肝病毒是无效的，长效干扰素与广谱抗病毒药物利巴韦林联合使用才有可能将丙肝病毒有效清除。利巴韦林的抗丙肝病毒机制是经细胞内激酶磷酸化后抑制RNA多聚酶活性，并且抑制丙肝病毒复制过程中起关键作用的5’端帽状结构的形成，磷酸化后的利巴韦林又可成为肌苷单磷酸(IAmp)脱氧酶的抑制剂，阻断鸟苷酸的合成，从而抑制丙肝病毒复制，发挥抗丙肝病毒作用。然而利巴韦林抗乙肝病毒的疗效却是较弱的，远远不及核苷类药物对乙肝病毒的抑制效果，因此利巴韦林逐渐从乙肝病毒治疗市场撤出。新的直接抗丙肝病毒的药物则是直接靶向HCV非结构蛋白，特异性抑制NS3/4A蛋白酶、NS5A蛋白和NS5B RNA多聚酶。NS3/4A抑制剂Simeprevir和NS5B抑制剂Sofosbuvir已于近期获批上市。鉴于抗丙肝病毒的药物与抗乙肝病毒的药物并不是通用的，我们研究SCY-635对治疗乙型肝炎病毒相关疾病的疗效仍然是非常有意义和价值的。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决上述技术问题之一或至少提供一种有用的商业选择。为此，本发明的一个目的在于提出一种有效治疗或预防乙型肝炎的药物。

根据本发明的特别发现，提供了以下的实施方案：

本发明涉及用于预防和/或治疗乙型肝炎病毒感染引起的疾病的药物及方法。因此，本发明所述化合物也可用于制备治疗乙型肝炎病毒感染引起的疾病的药物和药剂。在具体方面，此类药物和药剂包括治疗有效剂量的亲环孢素抑制剂和药学上可接受的载体。

根据本发明的实施例，具有式I所示结构的亲环孢素抑制剂或其药学上可接受的盐或溶剂合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗和/或预防乙型肝炎病毒感染引起的疾病：

其中，

A为式IIa或式IIb所示的残基：

B为乙基、1-羟基乙基、异丙基或正丙基；

R1为：

含有一至六个碳原子的直链或支链烷基，其任选地被一个或多个相同或不同的基团R³取代；

含有二至六个碳原子的直链或支链烯基，其任选地被选自卤素、羟基、氨基、单烷基氨基和二烷基氨基的一个或多个相同或不同的基团取代；

含有二至六个碳原子的直链或支链炔基，其任选地被选自卤素、羟基、氨基、单烷基氨基和二烷基氨基的一个或多个相同或不同的基团取代；

含有三至六个碳原子的环烷基，其任选地被选自卤素、羟基、氨基、单烷基氨基和二烷基氨基的一个或多个相同或不同的基团取代；或

含有一至六个碳原子的直链或支链烷氧基羰基；

R2表示异丁基或2-羟基异丁基；

X为硫、-S(O)_n-或氧；

R³选自卤素、羟基、羧基、烷氧基羰基、-NR⁴R⁵和-NR⁶(CH₂)_mNR⁴R⁵；

R⁴和R⁵分别独立地为：

氢；

含有一至六个碳原子的直链或支链烷基，其任选地被一个或多个相同或不同的基团R⁷取代；

包括二至四个碳原子的直链或支链烯基或炔基；

含有三至六个碳原子的环烷基，其任选地被含有一至六个碳原子的直链或支链烷基取代；

取代的苯基，其任选地被选自卤素、烷氧基、烷氧基羰基、氨基、烷基氨基和二烷基氨基的一至五个相同或不同的基团取代；

饱和或不饱和杂环，其含有五个或六个环原子和选自氮、硫和氧的一至三个相同或不同的杂原子；

或者R⁴和R⁵与它们所连接的氮原子一起形成含有四至六个环原子的饱和或不饱和杂环，该环可以任选地含有另一个选自氮、氧和硫的杂原子，该环可以任选地被选自烷基、苯基和苄基的一至四个相同或不同的基团取代；

R⁶表示氢或含有一至六个碳原子的直链或支链烷基；

R⁷为选自卤素、羟基、羧基、烷氧基羰基和-NR⁸R⁹的至少之一；

R⁸和R⁹分别独立地为氢或含有一至六个碳原子的直链或支链烷基；

n为1或2；

m为2、3或4；

卤素为氟、氯、溴或碘。

根据本发明的实施例，所述亲环孢素抑制剂中A为具有式IIa所示的残基，B为乙基。

根据本发明的实施例，所述亲环孢素抑制剂中R1为2-氨基乙基、2-氨基丙基、2-单烷基氨基乙基、2-单烷基氨基丙基、2-二烷基氨基乙基、2-二烷基氨基丙基、2-单环烷基氨基乙基、2-单环烷基氨基丙基、2-二环烷基氨基乙基或2-二烷基氨基丙基，其中烷基为包含一至四个碳原子的直链或支链，环烷基包含三至六个碳原子。

根据本发明的实施例，所述亲环孢素抑制剂中X为氧或硫；根据本发明的具体实施例，所述亲环孢素抑制剂中X为硫时，R1选自二甲基氨基乙基、二乙氨基乙基、甲基-叔丁基氨基乙基和乙基-叔丁基氨基乙基。

根据本发明的实施例，所述药学上可接受的盐为磷酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐、盐酸盐、甲磺酸盐或丙酸盐。

根据本发明的实施例，所述亲环孢素抑制剂为下列之一结构或下列之一的药学上可接受的盐：

3-甲氧基环孢菌素；

3-(2-氨基乙氧基)环孢菌素；

3(2-N，N-二甲基氨基乙氧基)环孢菌素；

3-(异丙氧基)环孢菌素；

3-(2-乙基丁氧基)环孢菌素；

3-(2，2-二甲基丙氧基)环孢菌素；

3-(2-羟基乙氧基)环孢菌素；

3-(3-羟基丙氧基)环孢菌素；

3-[2-(N-甲基氨基)乙氧基]环孢菌素；

3-[2-(N-甲基-N-异丙基氨基)乙氧基]环孢菌素；

3-[2-(哌啶-1-基)乙氧基]环孢菌素；

3-[2-(N-吗啉)乙氧基)环孢菌素；

3-乙氧基环孢菌素；

3-(2-甲氧基乙基硫基)-4-(γ-羟基甲基亮氨酸)环孢菌素；

3-[(R)-2-(N，N-二甲基氨基)乙基硫基-Sar]-4-(γ-羟基甲基亮氨酸)环孢菌素；

3-乙硫基环孢菌素；

3-丙烯基硫代环孢菌素；

3-[(2-甲氧基)乙基硫基]环孢菌素；

3-(甲基硫基)4-(γ-羟基甲基亮氨酸)环孢菌素；

3-(甲氧基)-4-(γ-羟基甲基亮氨酸)环孢菌素；

3-(丙-2-烯-1-氧)-4-(γ-羟基甲基亮氨酸)环孢菌素；

3-(异丙氧基)-4-(γ-羟基甲基亮氨酸)环孢菌素；

3-(乙氧基)-4-(γ-羟基甲基亮氨酸)环孢菌素；

3-[2-(甲氧基)乙氧基]-4-(γ-羟基甲基亮氨酸)环孢菌素；

3-[3-(甲氧基)丙氧基]-4-(γ-羟基甲基亮氨酸)环孢菌素。

根据本发明的实施例，所述乙型肝炎病毒感染引起的疾病为选自急性乙型肝炎、慢性乙型肝炎、肝纤维化、肝硬性、肝癌中的至少一种。

根据本发明的实施例，所述亲环孢素抑制剂是口服或胃肠外途径用药的。

根据本发明的实施例，所述用药的剂量为1-1000mg/天，优选为50-500mg/天，最优选为100mg/天。根据本发明的具体实施例，乙肝感染模型小鼠给药剂量为10mg/kg Bid，如果小鼠和人的生物利用度差别不大换算成人的给药剂量为10mgx60×2/12＝100mg/天。

根据本发明的实施例，3-[(R)-2-(N，N-二甲基氨基)乙硫基-Sar]-4-(γ-羟基甲基亮氨酸)环孢菌素(SCY-635)、或其药学上可接受的盐或溶剂合物在制备预防和/或治疗慢性乙型肝炎病毒感染的药物中的应用。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

图1显示了根据本发明的实施例4，SCY-635对HBsAg、HBeAg表达的影响的图谱；

图2显示了根据本发明的实施例4，SCY-635对HBV DNA拷贝数的影响的图谱；

图3显示了根据本发明的实施例5，SCY-635对HBsAg、HBeAg表达的影响的图谱；

图4显示了根据本发明的实施例5，SCY-635对HBV DNA拷贝数的影响的图谱；

图5显示了根据本发明的实施例5，SCY-635对HBsAb表达的影响的图谱；

图6显示了根据本发明的实施例6，SCY-635对PBMC细胞分泌IFN-a的影响的图谱。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1 制备3-甲氧基环孢菌素

将3-(巯基苯并噻唑-2-基硫)环孢菌素(0.4g，0.28mmol)和樟脑磺酸(0.7g，3mmol)的干燥四氢呋喃和干燥甲醇溶液在50℃加热2h。将混合物冷却至室温，添加饱和碳酸氢钠、醚和水。分离层，用二乙醚萃取水相。用无水硫酸镁干燥合并的有机萃取物，过滤。在硅胶上重复进行层析，用二氯甲烷和乙酸乙酯的混合物洗脱，获得120mg的3-甲氧基环孢菌素。

实施例2 制备3-(2-甲氧基乙硫基)-4-(γ-羟基甲基亮氨酸)环孢菌素

在氮气下浓缩液体氨(30mL)。添加酰胺钠(1.0g)，然后添加4-(γ-羟基甲基亮氨酸)-环孢菌素(1.22g，1.0mmol)的叔丁基甲醚(20mL)溶液。将混合物在-35℃搅拌90分钟。添加2-甲氧基乙基二硫化物(5.9g)，在-35℃继续再搅拌2小时。添加固体氯化铵(1.5g)，将混合物在-33℃搅拌10分钟。在恢复至室温后，用叔丁基甲醚稀释混合物，用水、盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥。在除去溶剂后，使用硅胶柱层析法纯化残余物，首先用乙酸乙酯/庚烷、然后用甲醇/乙酸乙酯洗脱，获得500mg 3-(2-甲氧基乙硫基)-4-(γ-羟基甲基亮氨酸)环孢菌素。

实施例3 制备3-[(R)-2-(N，N-二甲基氨基)乙硫基-Sar]-4-(γ-羟基甲基亮氨酸)环孢菌素

在惰性气氛中，在低温下，向二异丙基氨基锂(LDA)的干燥四氢呋喃溶液中滴加4-(γ-羟基甲基亮氨酸)环孢菌素(1.22g,1.0mmol)的干燥四氢呋喃溶液。将混合物在-35℃持续搅拌90分钟。添加2-(N,N-二甲基氨基)乙基二硫化物(4.6g)，在-35℃继续再搅拌2小时。添加固体氯化铵(1.5g)，将混合物在-33℃搅拌10分钟。在恢复至室温后，用叔丁基甲醚稀释混合物，用水、盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥。在除去溶剂后，使用硅胶柱层析法纯化残余物，首先用乙酸乙酯/庚烷、然后用甲醇/乙酸乙酯洗脱，获得260mg 3-[(R)-2-(N,N-二甲基氨基)乙硫基-Sar]-4-(γ-羟基甲基亮氨酸)环孢菌素。

实施例4 制备3-[(R)-2-(N，N-二甲基氨基)乙硫基-Sar]-4-(γ-羟基甲基亮氨酸)环孢菌素的盐

将3-[(R)-2-(N，N-二甲基氨基)乙硫基-Sar]-4-(γ-羟基甲基亮氨酸)环孢菌素溶于10ml乙醚中，添加相应的酸，在25℃搅拌2小时，过滤收集沉淀物，用冷醚洗涤，真空干燥。由此分别制得3-[(R)-2-(N，N-二甲基氨基)乙硫基-Sar]-4-(γ-羟基甲基亮氨酸)环孢菌素的磷酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐、盐酸盐、甲磺酸盐、丙酸盐。

实施例5 SCY-635对对乙肝病毒HBsAg、HBeAg水平和HBV DNA拷贝数的影响

1.实验材料

HepG和Huh7肝癌细胞：由武汉大学保藏中心提供(HepG2保藏中心编号为GDC024，Huh7保藏中心编号为GDC134)；

胎牛血清：购买于美国Gibco公司；

DMEM培养基：购买于美国Gibco公司；

Lipo2000转染试剂：购买于美国Life公司；

HBsAg/HBeAg检测试剂盒：购买于上海科华生物工程股份有限公司；

乙型肝炎病毒(HBV)核酸扩增(PCR)荧光定量检测试剂盒：购买于上海科华生物工程股份有限公司。

2.细胞培养条件

HepG2、Huh7细胞用含10％胎牛血清(FBS)的DMEM培养基，在体积分数5％CO₂，37℃，饱和湿度下培养。

3.实验分组

空白对照组：不加细胞和药物，只加等体积含10％FBS的DMEM培养液；

阴性对照组：加细胞不加药物，加等量二甲亚砜(DMSO)，加等体积含10％FBS的DMEM培养基；

SCY-635不同浓度组(简称药物组)：加细胞和不同浓度的SCY-635溶液，SCY-635用二甲亚砜(DMSO)配制，SCY-635的终浓度分别为0.5μmol/L、1μmol/L、2μmol/L，加等体积含10％FBS的DMEM培养基。

4.实验方法

取对数生长期的HepG2细胞或Huh7细胞以4×10⁵个/孔的密度接种于24孔板，每孔0.5ml，置于5％CO₂，37℃，饱和湿度下培养6小时，细胞贴壁且生长良好，吸去培养板中的培养基，加入新鲜培养基。每孔细胞转入0.8μg HBV全基因组质粒(pBlue-HBV1.3)，转染过程如下：将0.8μg质粒与2μL Lipo2000转染试剂加入100μL Opti－MEM无血清培养基，混匀，静置20min，将混合液加入培养的细胞中。培养12小时后，弃去培养基，然后按上述实验分组将培养液或药物溶液分别加入相应孔中，每组设3个复孔，在5％CO₂，37℃，饱和湿度下继续培养48小时。收集细胞培养液，离心5分钟，取上清液检测HBsAg和HBeAg水平。同时收集细胞提取HBV DNA(复制中间体闭合环状DNA，cccDNA)进行荧光定量PCR检测。用ELISA检测试剂盒测定上清液中的HBsAg和HBeAg，酶标仪(检测波长450nm，参考波长630nm)测定OD值。抑制百分率(5)＝【(阴性对照组OD值-药物组OD值)/(阴性对照组OD值-空白对照组OD值)】×100％。

5.实验结果

实验结果见附图1-图2：

其中，图1显示了SCY-635对HBsAg、HBeAg表达的影响：结果表明：如表1数据所示，SCY-635可以抑制瞬时转染HBV基因组质粒的肝癌细胞系HepG2和Huh7细胞分泌HBsAg和HBeAg，并且具有剂量依赖性。特别是SCY-635高剂量组对HBsAg/HBeAg的抑制效果非常明显，抑制率高达58％。提示SCY-635对乙型肝炎病毒具有一定的抑制作用，对治疗乙肝病毒相关疾病具有一定潜力。

在Huh7细胞中，SCY-635对HBsAg、HBeAg表达的影响如表1所示：

表1 SCY-635在Huh7细胞中对HBsAg、HBeAg表达的影响

在HepG2细胞中，SCY-635对HBsAg、HBeAg表达的影响如表2所示：

表2 SCY-635在HepG2细胞中对HBsAg、HBeAg表达的影响

图2显示了SCY-635对HBV DNA拷贝数的影响，结果表明：如表2数据所示，SCY-635对乙肝病毒DNA的复制具有比较强的抑制作用，并呈现出剂量依赖关系，尤其是在较高剂量(2μmol/L)时对HBV DNA复制活性的抑制率高达80-90％。提示SCY-635对乙型肝炎病毒复制具有较好的抑制作用。

在Huh7细胞中，SCY-635对HBsAg、HBeAg表达的影响如表3所示：

表3 SCY-635在Huh7细胞中对HBsAg、HBeAg表达的影响

在HepG2细胞中，SCY-635对HBsAg、HBeAg表达的影响如表4所示：

表4 SCY-635在HepG2细胞中对HBsAg、HBeAg表达的影响

实施例6 小鼠模型中SCY-635对HBV DNA及HBeAg/HBsAg/HBsAb表达的影响

1.实验材料

BALB/C小鼠：SPF级，雌性，购买于北京维通利华实验动物技术有限公司；

HBsAg/HBeAg检测试剂盒：购买于上海科华生物工程股份有限公司；

乙型肝炎病毒(HBV)核酸扩增(PCR)荧光定量检测试剂盒：购买于上海科华生物工程股份有限公司；

HBsAb检测试剂盒：购买于上海科华生物工程股份有限公司；

拉米夫定(3TC)：购买于葛兰素史克制药(苏州)有限公司。

2.实验动物模型的建立

高压尾静脉注射慢病毒载体构建的HBV1.3倍体全基因组质粒(paav-HBV1.3)，感染BALB/c小鼠。模型小鼠按0.08×体重(g)/ml注射paav-HBV1.3质粒，5s内完成尾静脉注射，质粒配置浓度为6.5μg/ml(PBS稀释)。小鼠注射质粒后可持续检测到乙肝病毒HBeAg、HBsAg和HBV DNA的表达。灌胃给药，尾静脉取血检测小鼠血液中HBsAg，HBeAg，及病毒核酸的量评价药物对乙肝病毒感染小鼠的治疗作用。

3.实验分组

空白对照组：没有表达HBV全基因组的BALB/C小鼠；

阴性对照组：表达HBV全基因组的BALB/C小鼠，口服相同剂量的生理盐水；

阳性对照组：表达HBV全基因组的BALB/C小鼠，口服3mg/kg或1mg/kg的拉米夫定；

SCY-635不同浓度组(简称药物组)：表达HBV全基因组的BALB/C小鼠，口服不同浓度(10mg/kg和3.3mg/kg)的SCY-635；

4实验结果

实验结果见附图3-图4。

其中，图3显示了SCY-635随着浓度和作用时间的增加对HBsAg、HBeAg的抑制作用增强，尤其是对HBsAg的抑制效果较为明显。阳性对照拉米夫定给药15天期间，小鼠血液中HBsAg表达量持续降低。高浓度SCY-635给药2-6天期间，小鼠血液中HBsAg表达量迅速降低，之后7-15天HBsAg仍然保持在一个较低的表达水平。SCY-635对小鼠血液中HBsAg表达量的抑制效果似乎还略好于拉米夫定。

图4表明SCY-635随着浓度和作用时间的增加有利于降低HBV DNA拷贝数。小鼠给药前6天，血液中HBV DNA表达量在持续增加主要是受转染质粒表达的影响，给药2-6天期间开始表现出药物组对HBV DNA的抑制效果。给药2-15天，阳性对照拉米夫定持续高效地抑制了HBV DNA水平，高浓度SCY-635也比低浓度SCY-635的抑制HBV DNA能力强一些。SCY-635抑制HBV DNA的能力虽没有拉米夫定那么强，但相对于对照组能看出SCY-635也具有明显的抑制HBV DNA的作用。

图5表明口服SCY-635后有利于HBsAb血清转化。小鼠给药处理15天，停止给药后3天检测HBsAb表达水平。HBsAb是宿主对乙肝病毒免疫调节所产生的保护性抗体，HBsAb的表达量反应了宿主的免疫系统对病毒的调控作用。通过高压静脉注射HBV基因组慢病毒载体质粒使小鼠感染HBV，然后再给药处理15天，检测到阳性对照拉米夫定组和SCY-635高浓度组HBsAb的表达量均有所升高，但因此方法感染病毒时间有限，故所检测到的HBsAb的表达值均偏低。该结果提示SCY-635可能调控宿主免疫反应，从而达到抑制乙肝病毒的效果。

实施例7 SCY-635调节乙型肝炎病人PBMC细胞分泌IFN-a

1.实验材料

乙肝病人血液：来源于武汉市人民医院检验科；

淋巴细胞分离液：购买于北京碧云天生物技术有限公司；

RPMI-1640培养基：购买于美国Gibco公司；

人IFN-a检测试剂盒：购买于北京达科为生物技术有限公司。

2.分离PBMC细胞

将新鲜病人血液用无血清的RPMI-1640培养基等体积稀释，再沿管壁缓慢加入等体积的淋巴细胞分离液，轻轻混匀，室温2000rpm离心15分钟。离心后从管底至液面分四层，依次为红细胞和粒细胞层、分层液层、单个核细胞层、血浆层。小心吸取雾状单个核细胞层至新的离心管中，加入3倍体积的RPMI-1640培养基洗3次，每次2000rpm离心10分钟，最后获得单个核淋巴细胞。将获得的PBMC细胞平均铺在12孔的细胞培养板中。

3.实验分组

空白对照组：不加细胞和药物，只加等体积含10％FBS的RPMI-1640培养液；

阴性对照组：加细胞不加药物，加等量二甲亚砜(DMSO)，加等体积含10％FBS的RPMI-1640培养液；

SCY-635不同浓度组(简称药物组)：加细胞和不同浓度的SCY-635溶液，SCY-635用二甲亚砜(DMSO)配制，SCY-635的终浓度分别为0.5μmol/L、1μmol/L、2μmol/L，加等体积含10％FBS的RPMI-1640培养液。

4.实验结果

实验结果见附图6。

图6表明SCY-635对乙肝病人PBMC细胞分泌的IFN-a量的影响。结果表明不同剂量的SCY-635(0.5μmol/L、1μmol/L和2μmol/L)刺激乙肝病人PBMC细胞分泌IFN-a的量为分别为1.55pg/ml、10.85pg/ml和32.5pg/ml，提示SCY-635能够再次激活乙肝病人的免疫反应，而且随着SCY-635浓度增加而免疫效果增强。

参照SCY-635实施其盐型和溶剂合物的活性检测。显示本发明的亲环孢素抑制剂的盐或溶剂合物也可治疗和/或预防乙型肝炎病毒感染引起的疾病。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (10)

1.具有式I所示结构的亲环孢素抑制剂或其药学上可接受的盐或溶剂合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗和/或预防乙型肝炎病毒感染引起的疾病：

其中，

A为式IIa或式IIb所示的残基：

B为乙基、1-羟基乙基、异丙基或正丙基；

R1为：

含有一至六个碳原子的直链或支链烷基，其任选地被一个或多个相同或不同的基团R³取代；

含有二至六个碳原子的直链或支链烯基，其任选地被选自卤素、羟基、氨基、单烷基氨基和二烷基氨基的一个或多个相同或不同的基团取代；

含有二至六个碳原子的直链或支链炔基，其任选地被选自卤素、羟基、氨基、单烷基氨基和二烷基氨基的一个或多个相同或不同的基团取代；

含有三至六个碳原子的环烷基，其任选地被选自卤素、羟基、氨基、单烷基氨基和二烷基氨基的一个或多个相同或不同的基团取代；或

含有一至六个碳原子的直链或支链烷氧基羰基；

R2为异丁基或2-羟基异丁基；

X为-S(O)_n-、硫或氧；

R³选自卤素、羟基、羧基、烷氧基羰基、-NR⁴R⁵和-NR⁶(CH₂)_mNR⁴R⁵；

R⁴和R⁵分别独立地为：

氢；

含有一至六个碳原子的直链或支链烷基，其任选地被一个或多个相同或不同的基团R⁷取代；

包括二至四个碳原子的直链或支链烯基或炔基；

含有三至六个碳原子的环烷基，其任选地被含有一至六个碳原子的直链或支链烷基取代；

取代的苯基，其任选地被选自卤素、烷氧基、烷氧基羰基、氨基、烷基氨基和二烷基氨基的一个至五个相同或不同的基团取代；

饱和或不饱和杂环，其含有五个或六个环原子和选自氮、硫和氧的一至三个相同或不同的杂原子；

或者R⁴和R⁵与它们所连接的氮原子一起形成含有四至六个环原子的饱和或不饱和杂环，所述杂环可以任选地含有另一个选自氮、氧和硫的杂原子，所述杂环可以任选地被选自烷基、苯基和苄基的一至四个相同或不同的基团取代；

R⁶为氢或含有一至六个碳原子的直链或支链烷基；

R⁷为选自卤素、羟基、羧基、烷氧基羰基和-NR⁸R⁹的至少之一；

R⁸和R⁹分别独立地为氢或含有一至六个碳原子的直链或支链烷基；

n为1或2；

m为2、3或4；

卤素为氟、氯、溴或碘。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述亲环孢素抑制剂中A为具有式IIa所示的残基，B为乙基。

3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述亲环孢素抑制剂中R1为2-氨基乙基、2-氨基丙基、2-单烷基氨基乙基、2-单烷基氨基丙基、2-二烷基氨基乙基、2-二烷基氨基丙基、2-单环烷基氨基乙基、2-单环烷基氨基丙基、2-二环烷基氨基乙基或2-二烷基氨基丙基，其中烷基为包含一至四个碳原子的直链或支链，环烷基包含三至六个碳原子。

4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述亲环孢素抑制剂中X为氧或硫；

任选的，X为硫时，R1选自二甲基氨基乙基、二乙氨基乙基、甲基-叔丁基氨基乙基和乙基-叔丁基氨基乙基。

5.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药学上可接受的盐为磷酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐、盐酸盐、甲磺酸盐或丙酸盐。

6.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述亲环孢素抑制剂为下列之一或下列之一的药学上可接受的盐：

3-甲氧基环孢菌素；

3-(2-氨基乙氧基)环孢菌素；

3(2-N，N-二甲基氨基乙氧基)环孢菌素；

3-(异丙氧基)环孢菌素；

3-(2-乙基丁氧基)环孢菌素；

3-(2，2-二甲基丙氧基)环孢菌素；

3-(2-羟基乙氧基)环孢菌素；

3-(3-羟基丙氧基)环孢菌素；

3-[2-(N-甲基氨基)乙氧基]环孢菌素；

3-[2-(N-甲基-N-异丙基氨基)乙氧基]环孢菌素；

3-[2-(哌啶-1-基)乙氧基]环孢菌素；

3-[2-(N-吗啉)乙氧基)环孢菌素；

3-乙氧基环孢菌素；

3-(2-甲氧基乙基硫基)-4-(γ-羟基甲基亮氨酸)环孢菌素；

3-[(R)-2-(N，N-二甲基氨基)乙基硫基-Sar]-4-(γ-羟基甲基亮氨酸)环孢菌素；

3-乙硫基环孢菌素；

3-丙烯基硫代环孢菌素；

3-[(2-甲氧基)乙基硫基]环孢菌素；

3-(甲基硫基)4-(γ-羟基甲基亮氨酸)环孢菌素；

3-(甲氧基)-4-(γ-羟基甲基亮氨酸)环孢菌素；

3-(丙-2-烯-1-氧)-4-(γ-羟基甲基亮氨酸)环孢菌素；

3-(异丙氧基)-4-(γ-羟基甲基亮氨酸)环孢菌素；

3-(乙氧基)-4-(γ-羟基甲基亮氨酸)环孢菌素；

3-[2-(甲氧基)乙氧基]-4-(γ-羟基甲基亮氨酸)环孢菌素；

3-[3-(甲氧基)丙氧基]-4-(γ-羟基甲基亮氨酸)环孢菌素。

7.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述乙型肝炎病毒感染引起的疾病为选自急性乙型肝炎、慢性乙型肝炎、肝纤维化、肝硬性、肝癌中的至少一种。

8.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述亲环孢素抑制剂是口服或胃肠外途径用药的。

9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，所述用药的剂量为1-1000mg/天，优选为50-500mg/天，最优选为100mg/天。

10.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述亲环孢素抑制剂为3-[(R)-2-(N，N-二甲基氨基)乙基硫基-Sar]-4-(γ-羟基甲基亮氨酸)环孢菌素。