CN106868142A

CN106868142A - 检测山核桃干腐病病菌的环介导等温扩增方法

Info

Publication number: CN106868142A
Application number: CN201710124909.1A
Authority: CN
Inventors: 张传清; 童琪; 张佳星; 戴德江
Original assignee: Zhejiang A&F University ZAFU
Current assignee: Zhejiang A&F University ZAFU
Priority date: 2017-03-03
Filing date: 2017-03-03
Publication date: 2017-06-20
Anticipated expiration: 2037-03-03
Also published as: CN106868142B

Abstract

本发明公开了一种用于检测山核桃干腐病病菌的环介导等温扩增方法和引物，LAMP引物组合物由4条引物组成。本发明还同时公开了一种用于检测山核桃干腐病病菌的环介导等温扩增试剂盒，除了包含上述LAMP引物组合物之外，还包括10×ThermoPol Buffer、dNTPs、MgCl₂、甜菜碱、羟基萘酚蓝、8U/μL Bst DNA聚合酶、ddH₂O。本发明以β‑tubulin基因保守区片段序列设计LAMP引物，并进行快速分子检测技术体系和反应条件的优化，能对山核桃干腐病病菌进行LAMP检测，反应过程简便、检测周期短、特异性强、灵敏度高，可用肉眼观察检测结果。

Description

检测山核桃干腐病病菌的环介导等温扩增方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及环介导等温扩增(LAMP)技术检测山核桃干腐病病菌的环介导等温扩增引物组及其使用方法，属于植物病害检测、鉴定及防治的早期预警技术领域。

背景技术

山核桃干腐病从2002年开始在临安、淳安、桐庐等山核桃产区普遍发生，受害面积逐步扩大，目前发生面积达27万亩，发生严重的整株枯死，轻的影响生长造成落果，据测算发生区平均产量减少24％左右，成为山核桃产业发展的瓶颈。有不同的研究报道或推测不同的因素和山核桃干腐病的发生有关。本实验室研究发现茶藨子葡萄座腔菌(Botryosphaeria dothidea)，即，山核桃干腐病菌(B dothidea)是引起山核桃干腐病的主要病原，且山核桃的发生严重程度主要与其生物学和流行特性有关。连续5年的观察发现，该病原菌以菌丝体在病组织内越冬，第二年春季气温上升病菌开始活跃，在树皮表面形成子实体并释放孢子，进行再侵染。孢子借风雨传播，侵入树皮细胞或树体伤口后表现明显的“潜伏侵染”特性，从3月下旬开始到11月都有不同程度的病害发生。4月中旬至6月中旬气温在25℃—30℃是孢子释放侵染的高峰期的高峰，7～8月气温30℃以上的高温天气不利于病菌的发展，秋季气温下降至30℃以下又会产生病菌的发展(未报道资料)。因为该病菌长期处于“潜伏侵染”状态，一旦等其潜伏的共生状态转变到腐生致病状态，形成肉眼可见的病斑，再采取防治措施，已经为时已晚。防治效果会很不理想。所以，要高效地防治山核桃干腐病，在其潜伏的共生状态期的早期快速检测就非常重要。

随着核酸相关的鉴定方法不断发展，基于普通PCR的方法已经成功用于检测山核桃干腐病菌，但PCR法特异性等检测耗时偏长，需要6～8h，同时PCR方法需要昂贵仪器PCR仪，且检测灵敏度偏低，检测过程较繁杂。

环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是日本荣研株式会社发明的一种新的核酸扩增技术，因为其扩操作简便、快速、特异性高、成本低等优点，成为可以替代PCR的新的核酸扩增技术。它是针对靶基因的6个区域设计4对特异性引物，在Bst大片段聚合酶的作用下引起自循环链置换反应，60-65℃范围60min内，能大量合成目标DNA。由于LAMP扩增过程依赖识别靶序列6个独立区域，所以反应特异性很强，并且核酸扩增过程是在恒温条件下进行，普通水浴锅或者等温保温瓶就能满足反应要求，检测成本降低，所需时间短。但是，引物的设计不容易获得。

此外，普通PCR反应对产物进行凝胶电泳很容易造成产物扩增，这是实验室污染的一个主要来源；而且溴化乙锭(EB)有巨毒，可累积致癌，对人体产生巨大危害；长期观察紫外灯也会对实验人员健康造成一定程度的伤害。而LAMP反应只需在恒温水浴锅中进行，在扩增前加入染料HNB(羟基萘酚蓝)作为反应指示剂，以HNB的颜色变化做为结果判定标准即可，达到快速检测的目的。

靶标基因的选择是LAMP检测的重要因素之一。普通PCR常用的靶标基因有β微管蛋白基因，后逐步发展起来成为分子标记，其优点在于：具有高拷贝数；同时包含保持与变异序列；能根据保守序列中的变异位点设计特殊引物进行特异性扩增比较。虽然真菌的β-tublin总的说来是相对保守的，但其间有足够的变异位点可以用于鉴别性比较，而且其多拷贝数使鉴别性的扩增更加灵敏。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种检测山核桃干腐病病菌的环介导等温扩增(LAMP)引物组合物；本发明还提供该引物组合的应用；本发明还提供一种检测山核桃干腐病病菌的LAMP试剂盒。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种用于检测山核桃干腐病病菌的环介导等温扩增引物：LAMP引物组合物由上下游外引物，上下游内引物四条引物组成，引物序列如下：

上游外引物F3：5’—CGCGTTCAGAAGATTGCCATA—3’；

下游外引物B3：5’—TTGTTGCCAAAACACCCGC—3’；

上游内引物FIP：5’—GCGTGGGAGAACATCAATGAC-GCTCGAGCTGAAGGTCCG—3’；

下游内引物FIB：5’—CTTACACGCCAGAGCCGT-AACGCGAATCGACACCACAG—3’。

本发明还同时提供了一种用于检测山核桃干腐病病菌的环介导等温扩增试剂盒，包含上述LAMP引物组合物。

作为本发明的试剂盒的改进：LAMP引物组合物为：1.6μM的正内向引物FIP，1.6μM的反向内引物BIP、0.2μM正向外引物F3、0.2μM反向外引物B3。

作为本发明的试剂盒的进一步改进：试剂盒还包含如下：10×ThermoPol Buffer、dNTPs(1mM)、MgCl₂(4mM)、甜菜碱(0.6M)、羟基萘酚蓝(150μM，HNB)、8U/μL Bst DNA聚合酶、ddH₂O。

备注：上述成分组成了环介导等温扩增反应预混液。

本发明还同时提供了一种用于检测山核桃干腐病病菌的环介导等温扩增方法，25μL反应体系由以下成分组成：8U/μL Bst DNA聚合酶0.5μL(4U)、10×ThermoPol Buffer2.5μL、20μM FIP 2.0μL、20μM BIP 2.0μL、10μM F3 0.5μL、10μM B3 0.5μL、25mM MgCl₂4.0μL、10mM dNTPs 2.5μL、5M甜菜碱3.0μL、3.75mM羟基萘酚蓝(HNB)1μL、DNA模板1μL，ddH₂O(双蒸水)补足至25μL。

作为本发明的环介导等温扩增方法的改进：利用所述25μL检测反应体系进行LAMP扩增反应，选择以下任一方法：

方法一、先在扩增前加入染料羟基萘酚蓝(HNB)作为反应指示剂，以羟基萘酚蓝(HNB)的颜色变化做为结果判定标准，然后进行LAMP扩增反应，反应结束后，颜色发生变化，即显色结果观察到天蓝色判断为阳性，判定显示检测到山核桃干腐病病菌；颜色没有发生变化，显色结果仍为蓝紫色判断为阴性，判定显示样品无山核桃干腐病病菌，或所含山核桃干腐病病菌含量未达检测的最低检测浓度；

方法二、取5μL扩增产物，用2％琼脂糖凝胶电泳检测，如果出现梯形条带判断为阳性，即显示检测到山核桃干腐病病菌；无扩增条带则判断为阴性，即显示无山核桃干腐病病菌，或所含山核桃干腐病病菌未达最低检测浓度。

作为本发明的环介导等温扩增方法的进一步改进：LAMP扩增反应程序为：65℃扩增60min；80℃灭活10min。

作为本发明的环介导等温扩增方法的进一步改进：所述方法一、方法二中的最低检测浓度均为0.01ng/μL。

本发明提供了LAMP引物组合物在检测山核桃干腐病病菌LAMP试剂盒中的应用，以及提供了一种用于检测山核桃干腐病病菌的LAMP试剂盒，包含本发明所述的引物组合物。

本发明中，检测溶液共24μL，加入待测DNA模板1μL，构成25μL检测反应体系。

本发明的方案具体如下：

1、引物的设计：

所述的用于检测山核桃干腐病菌的特异性引物组是通过扩增获得山核桃干腐病菌大量菌株的β-Tublin基因核酸序列，并和其它茶藨子葡萄座腔菌的β-Tublin基因核酸序列进行比对，针对保守区片段序列进行设计。其中由一对上下游外引物和一对上下游内引物，共四条引物组成，内引物和外引物的终浓度以8:1的比例进行配制。

为检测引物特异性为目的，通过分别以山核桃干腐病菌(B dothidea)作为阳性对照，以苹果链格孢菌(Alternaria mali)、可可毛色二孢菌(Lasiodiplodia therbromae)、拟盘多毛孢(Pestalotiopsis theae)、立枯丝核菌(Rhizoctonia Solani)、藤仓赤霉(Gibberella fujikuroi)和齐整小核菌(Sderotium rolfsii)、胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)七种病原菌作为阴性对照，并以双蒸水作为空白对照进行测试，发现该引物具有对山核桃干腐病检测的特异性(图1)。

2、反应程序的优化：

以建立能检测山核桃干腐病病菌的LAMP最佳反应温度为目的。利用上述引物组合，同反应预混液构成检测液，加入山核桃干腐病病菌DNA模板1μL，将反应温度分别设置为59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃，扩增反应结束后，观察反应管颜色变化，近一步用2％琼脂糖凝胶电泳检测作为验证。

反应结果显示(图2)，在反应温度为65℃时，反应管颜色变化最明显，电泳LAMP条带最清晰。

以建立能检测山核桃干腐病病菌的LAMP最佳反应时间为目的。利用用上述引物组合，同反应预混液构成检测液，加入山核桃干腐病病菌DNA模板1μL，将反应时间设置为30min、45min、60min、75min，扩增反应结束后，观察反应管颜色变化，近一步用2％琼脂糖凝胶电泳检测作为验证。

反应结果显示(图3)，在反应时间达到60min及更长时，反应管颜色变化明显，电泳LAMP条带清晰，为节省检测时间，即60min为扩增时间。

根据上述反应程序优化结果所述，本发明中反应程序为65℃，60min。

在本发明中，通过山核桃干腐病病菌β-tubulin基因的保守区片段序列进行LAMP引物特异性设计，筛选出特异性强、灵敏度高、适用于LAMP快速分子检测的引物，进而建立可供该菌快速分子检测的技术。本发明以β-tubulin基因保守区片段序列设计LAMP引物并进行快速分子检测技术体系和反应条件优化，对山核桃干腐病病菌进行LAMP检测，反应过程简便(65℃恒温)、检测周期短(仅需60min)、特异性强、灵敏度高，可用肉眼观察检测结果。

本发明与现有技术相比，具有以下技术优势：

1)、实用性好。传统的病原菌检测的方法主要是通过分离培养病原菌，然后进行形态学鉴定，该方法检测需要较高的技术专业要求，且存在一定的不确定性。普通PCR反应对病原菌DNA进行扩增、回收和测序，需要溴化乙锭(EB)染色并在紫光灯下观察才可判别结果，且检测时间长，检测成本高昂，不能满足经济高效检测的需求。而LAMP反应只需在恒温(65℃)下进行，反应结束后可通过肉眼在常光下直接判断结果，能快速检测出病原菌，从而增加了其在田间检测的应用价值。

2)、恒温扩增。不像PCR法必须要热循环，这样就摆脱了对热循环仪器的依赖，只要有稳定的热源如恒温水浴锅LAMP反应就可以完成，不需要昂贵的仪器设备，因而便于基层农业生产单位推广应用。LAMP之所以能在恒定的热源下发生反应是因为在LAMP反应液中添加了甜菜碱，使双链DNA处于解链的动态平衡中，在Bst DNA聚合酶的作用下实现扩增。

3)、准确性高。传统的病原菌鉴定，鉴定方法耗时长、易受人为及环境等诸多因素的干扰。LAMP反应通过4条引物特异性识别靶序列上的6个独立区域，相对于普通PCR引物识别靶序列的2个独立区域而言，特异性和灵敏度都显著提高。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1为引物特异性测定对比图；

上图：为LAMP显色变化图；

下图：为LAMP琼脂糖凝胶电泳图；

M表示DL 2000DNA Marker，检测样品分别为山核桃干腐病菌(B dothidea)、苹果链格孢(Alternaria mali)、可可色二孢(Lasiodiplodia therbromae)、拟盘多毛孢(Pestalotiopsis theae)、立枯死核菌(Rhizoctonia Solani)、藤仓赤霉(Gibberellafujikuroi)、齐整小核菌(Sderotium rolfsii)、胶孢炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides)和空白对照双蒸水。

图2为反应温度优化图；

上图：为LAMP显色变化图；

下图：为LAMP琼脂糖凝胶电泳图；

M表示DL 2000DNA Marker，显示64℃、65℃的LAMP琼脂糖凝胶电泳条带较为明亮。

图3为反应时间优化图；

上图：为LAMP显色变化图；

下图：为LAMP琼脂糖凝胶电泳图；

M表示DL 2000DNA Marker，显示在45min后都具有明亮的LAMP琼脂糖凝胶电泳图条带。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。

以下实施例中使用的主要试剂及仪器Bst DNA聚合酶(New England Biolabs、MgCl₂(Sigma)，dNTPs，甜菜碱、DEPC水、分子质量标准DNA Maker(TaKaRa生物工程公司基因组)、真菌基因组DNA快速抽提试剂盒(生工生物工程股份有限公司)，eppendorf普通PCR扩增仪、上海精宏实验仪器厂DK-8D型电加热恒温水浴锅。

以下所用的所有病菌，均已事先检测证明了其定性的正确性。

实施例1、一种用于检测山核桃干腐病病菌环介导等温扩增试剂盒，包括用于检测山核桃干腐病病菌的环介导等温扩增引物，

该LAMP引物组合物由以下4条引物组成：

上游外引物(F3)：5’—CGCGTTCAGAAGATTGCCATA—3’；

下游外引物(B3)：5’—TTGTTGCCAAAACACCCGC—3’；

上游内引物(FIP)：5’—GCGTGGGAGAACATCAATGAC-GCTCGAGCTGAAGGTCCG—3’；

下游内引物(FIB)：5’—CTTACACGCCAGAGCCGT-AACGCGAATCGACACCACAG—3’。

试剂盒包含：10×ThermoPol Buffer、1mM dNTPs、4mM MgCl₂、0.6mM甜菜碱、150μM羟基萘酚蓝(HNB)、8U/μL Bst DNA聚合酶、ddH₂O、1.6μM的正内向引物FIP，1.6μM的反向内引物BIP、0.2μM正向外引物F3、0.2μM反向外引物B3。

试验使用的25μL反应体系由以下成分配制而成：8U/μL Bst DNA聚合酶0.5μL(4U)、10×ThermoPol Buffer 2.5μL、20μM FIP 2.0μL、20μM BIP 2.0μL、10μM F3 0.5μL、10μM B30.5μL、25mM MgCl₂ 4.0μL、10mM dNTPs 2.5μL、5M甜菜碱3.0μL、3.75mM羟基萘酚蓝(HNB)1μL、DNA模板1μL，双蒸水补足至25μL。

即，待测DNA模板1μL，检测溶液共24μL，从而构成了上述25μL检测反应体系。

实施例2、一种用于检测山核桃干腐病病菌的环介导等温扩增方法：

利用所述25μL检测反应体系进行LAMP扩增反应，选择以下任一方法：

方法一、先在扩增前加入染料羟基萘酚蓝(HNB)作为反应指示剂，以羟基萘酚蓝(HNB)的颜色变化做为结果判定标准，然后进行LAMP扩增反应，反应结束后，颜色发生变化，即显色结果观察到天蓝色判断为阳性，即显示检测到山核桃干腐病病菌；颜色没有发生变化，显色结果仍为蓝紫色判断为阴性，即显示样品无山核桃干腐病病菌，或所含山核桃干腐病病菌含量未达检测限；

方法二、取5μL扩增产物，用2％琼脂糖凝胶电泳检测，如果出现梯形条带判断为阳性，即显示检测到山核桃干腐病病菌，无扩增条带则判断为阴性，即显示无山核桃干腐病病菌，或所含山核桃干腐病病菌未达检测限。

LAMP扩增反应程序为：65℃扩增60min；80℃灭活10min。

实验一、

提取山核桃干腐病菌(Botryosphaeria dothidea)基因组的DNA，测量得DNA溶液浓度为200ng/μL。将DNA溶液稀释，梯度为0.0001ng/μL、0.001ng/μL、0.01ng/μL、0.1ng/μL、1ng/μL、10ng/μL、100ng/μL。由下方法配置成25μL反应体系：8U/μL Bst DNA聚合酶0.5μL(4U)、10×ThermoPol Buffer 2.5μL、20μM FIP 2.0μL、20μM BIP 2.0μL、10μM F3 0.5μL、10μM B3 0.5μL、25mM MgCl₂ 4.0μL、10mM dNTPs 2.5μL、5M甜菜碱3.0μL、3.75mM羟基萘酚蓝(HNB)1μL、上述各浓度梯度的DNA模板1μL，以双蒸水1μL作为空白对照，最后用双蒸水各补足至25μL。使用的LAMP扩增反应程序为：65℃扩增60min；80℃灭活10min。

反应完成后，在DNA模板浓度为0.01ng/μL、0.1ng/μL、1ng/μL、10ng/μL、100ng/μL时反应结果均显示为阳性，反应前后反应管的颜色由蓝紫色变为天蓝色，且用2％琼脂糖凝胶电泳检测均具有特异性条带。在浓度低于0.01ng/μL时，反应管的颜色未出现变化变现为阴性，用2％琼脂糖凝胶电泳检测未有特异性条带出现。

结果显示对山核桃干腐病菌(Botryosphaeria dothidea)DNA的检测最低浓度为0.01ng/μL。

实验二、

提取山核桃干腐病菌(B dothidea)、矩园黑盘孢菌(Melanconium oblongum)、拟茎点霉属(Phomopsis juglandina)、可可色二孢(Lasiodiplodia therbromae)、祁连金锈菌(Chrysomyxa qilianensis)、茶褐斑拟盘多毛孢菌(Pestalotiopsis guepini)、山茶炭疽菌(Colletotrichum camelliae)7种树木病害DNA作为模板。

使用25μL反应体系，由以下成分配制而成：8U/μL Bst DNA聚合酶0.5μL(4U)、10×ThermoPol Buffer 2.5μL、20μM FIP 2.0μL、20μM BIP 2.0μL、10μM F3 0.5μL、10μM B30.5μL、25mM MgCl₂ 4.0μL、10mM dNTPs 2.5μL、5M甜菜碱3.0μL、3.75mM羟基萘酚蓝(HNB)1μL、DNA溶液作为模板加1μL，双蒸水补足至25μL。

试验结果除了山核桃干腐病菌(B dothidea)以外的模板都显示为阴性，反应管中反应液颜色未发生变化，经过2％琼脂糖凝胶电泳检测均未有特异性条带出现。表示该引物组合构成的环介导等温扩增体系可以检测出山核桃干腐病菌(Botryosphaeriadothidea)，且具有特异性。

对比例1-1、

以以下引物组合进行试验：

上游外引物(F3-1)：5’—CGCGTTCAGAAGATTGCCTAT—3’；

下游外引物(B3-1)：5’—TTGTTGCCAAAACACCGCG—3’；

下游内引物(FIB)：5’—CTTACACGCCAGAGCCGT-AACGCGAATCGACACCACAG—3’。

使用25μL反应体系，由以下成分配制而成：8U/μL Bst DNA聚合酶0.5μL(4U)、10×ThermoPol Buffer 2.5μL、20μM FIP 2.0μL、20μM BIP 2.0μL、10μM F3-1 0.5μL、10μM B3-1 0.5μL、25mM MgCl₂ 4.0μL、10mM dNTPs 2.5μL、5M甜菜碱3.0μL、3.75mM羟基萘酚蓝(HNB)1μL、以浓度分别为1ng/μL、10ng/μL、100ng/μL的DNA溶液作为模板加1μL，双蒸水补足至25μL。

试验结果都显示为阴性，反应管中反应液颜色未发生变化，经过2％琼脂糖凝胶电泳检测均未有特异性条带出现。表示该引物组合构成的环介导等温扩增体系不能有效检测出山核桃干腐病菌(Botryosphaeria dothidea)，即使将DNA模板的浓度增加至100ng/μL，仍然无法有效区分。

对比例1-2、

以以下引物组合进行试验：

上游外引物(F3-2)：5’—CGCGTTCAGAAGATTGCCATT—3’；

下游外引物(B3-2)：5’—TTGTTGCCAAAACACCCGG—3’；

下游内引物(FIB)：5’—CTTACACGCCAGAGCCGT-AACGCGAATCGACACCACAG—3’。

使用25μL反应体系，由以下成分配制而成：8U/μL Bst DNA聚合酶0.5μL(4U)、10×ThermoPol Buffer 2.5μL、20μM FIP 2.0μL、20μM BIP 2.0μL、10μM F3-2 0.5μL、10μM B3-2 0.5μL、25mM MgCl₂ 4.0μL、10mM dNTPs 2.5μL、5M甜菜碱3.0μL、3.75mM羟基萘酚蓝(HNB)1μL、以浓度分别为1ng/μL、10ng/μL、100ng/μL的DNA溶液作为模板加1μL，双蒸水补足至25μL。

对比例2-1、

以以下引物组合进行试验：

上游外引物(F3-3)：5’—TGCCTGTTCGAGCGTCATTA—3’；

下游外引物(B3-3)：5’—TTCAGAAGGTTCGTCCGGC—3’；

上游内引物(FIP-3)：5’—CCGAGGTCTTTGAGGCGC-GGTATTGGGCACCGTCCTTT—3’；

下游内引物(FIB-3)：5’—GCGTCTTGCCTCAAGCG-GCTCCGAAGCGAGATGTATGT—3’。

使用25μL反应体系，由以下成分配制而成：8U/μL Bst DNA聚合酶0.5μL(4U)、10×ThermoPol Buffer 2.5μL、20μM FIP-3 2.0μL、20μM BIP-3 2.0μL、10μM F3-3 0.5μL、10μMB3-3 0.5μL、25mM MgCl₂ 4.0μL、10mM dNTPs 2.5μL、5M甜菜碱3.0μL、3.75mM羟基萘酚蓝(HNB)1μL、分别以山核桃干腐病菌(B dothidea)、苹果链格孢(Alternaria mali)、可可色二孢(Lasiodiplodia therbromae)、拟盘多毛孢(Pestalotiopsis theae)、立枯死核菌(Rhizoctonia Solani)、藤仓镰刀菌(Fusarium fujikuroi)、齐整小核菌(Sderotiumrolfsii)、胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)和空白对照双蒸水作为DNA模板；ddH₂O(双蒸水)补足至25μL。

试验结果都显示为阳性，反应管中反应液颜色发生变化，经过2％琼脂糖凝胶电泳检测均有特异性条带出现。表示上述引物组合构成的环介导等温扩增体系不能有效检测区分出“茶藨子葡萄座腔菌(Botryosphaeria dothidea)。

对比例2-2、

以以下引物组合进行试验：

上游外引物(F3-4)：5’—TGCCTGTTCGAGCGTCAAAA—3’；

下游外引物(B3-4)：5’—TTCAGAAGGTTCGTCCGGG—3’；

上游内引物(FIP-4)：5’—CCGAGGTCTTTGAGGCGC-GGTATTGGGCACCGTCCAAA—3’；

下游内引物(FIB-4)：5’—GCGTCTTGCCTCAAGCG-GCTCCGAAGCGAGATGTATTG—3’。

使用25μL反应体系，由以下成分配制而成：8U/μL Bst DNA聚合酶0.5μL(4U)、10×ThermoPol Buffer 2.5μL、20μM FIP-4 2.0μL、20μM BIP-4 2.0μL、10μM F3-4 0.5μL、10μMB3-4 0.5μL、25mM MgCl₂ 4.0μL、10mM dNTPs 2.5μL、5M甜菜碱3.0μL、3.75mM羟基萘酚蓝(HNB)1μL、分别以山核桃干腐病菌(B dothidea)、苹果链格孢(Alternaria mali)、可可色二孢(Lasiodiplodia therbromae)、拟盘多毛孢(Pestalotiopsis theae)、立枯死核菌(Rhizoctonia Solani)、藤仓镰刀菌(Fusarium fujikuroi)、齐整小核菌(Sderotiumrolfsii)、胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)和空白对照双蒸水作为DNA模板；ddH₂O(双蒸水)补足至25μL。

试验结果都显示为阳性，反应管中反应液颜色发生变化，经过2％琼脂糖凝胶电泳检测均有特异性条带出现。表示该引物组合构成的环介导等温扩增体系不能有效检测区分出山核桃干腐病菌(Botryosphaeria dothidea)。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

<110> 浙江农林大学

<120> 检测山核桃干腐病病菌的环介导等温扩增方法

<160> 4

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>上游外引物F3

<400> 1

cgcgttcaga agattgccat a 21

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>下游外引物B3

<400> 2

ttgttgccaa aacacccgc 19

<210> 3

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>上游内引物FIP

<400> 3

gcgtgggaga acatcaatga cgctcgagct gaaggtccg 39

<210> 4

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>下游内引物FIB

<400> 4

cttacacgcc agagccgtaa cgcgaatcga caccacag 38

Claims

1.用于检测山核桃干腐病病菌的环介导等温扩增引物，其特征在于：LAMP引物组合物由以下4条引物组成：

上游外引物F3：5’—CGCGTTCAGAAGATTGCCATA—3’；

下游外引物B3：5’—TTGTTGCCAAAACACCCGC—3’；

上游内引物FIP：5’—GCGTGGGAGAACATCAATGAC-GCTCGAGCTGAAGGTCCG—3’；

下游内引物FIB：5’—CTTACACGCCAGAGCCGT-AACGCGAATCGACACCACAG—3’。

2.用于检测山核桃干腐病病菌的环介导等温扩增试剂盒，其特征在于：包含如权利要求1所述的LAMP引物组合物。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：LAMP引物组合物为：1.6μM的正内向引物FIP，1.6μM的反向内引物BIP、0.2μM正向外引物F3、0.2μM反向外引物B3。

4.根据权利要求2或3所述的试剂盒，其特征在于：试剂盒还包含如下：10×ThermoPolBuffer、dNTPs、MgCl₂、甜菜碱、羟基萘酚蓝、8U/μL Bst DNA聚合酶、ddH₂O。

5.用于检测山核桃干腐病病菌的环介导等温扩增方法，其特征在于：

25μL反应体系由以下成分组成：8U/μL Bst DNA聚合酶0.5μL、10×ThermoPol Buffer2.5μL、20μM FIP 2.0μL、20μM BIP 2.0μL、10μM F3 0.5μL、10μM B3 0.5μL、25mM MgCl₂4.0μL、10mM dNTPs 2.5μL、5M甜菜碱3.0μL、3.75mM羟基萘酚蓝1μL、DNA模板1μL，ddH₂O补足至25μL。

6.根据权利要求5所述的环介导等温扩增方法，其特征在于：利用所述25μL检测反应体系进行LAMP扩增反应，选择以下任一方法：

方法一、先在扩增前加入染料羟基萘酚蓝作为反应指示剂，以羟基萘酚蓝的颜色变化做为结果判定标准，然后进行LAMP扩增反应，反应结束后，颜色发生变化，即显色结果观察到天蓝色判断为阳性，判定显示检测到山核桃干腐病病菌；颜色没有发生变化，显色结果仍为蓝紫色判断为阴性，判定显示样品无山核桃干腐病病菌，或所含山核桃干腐病病菌含量未达检测的最低检测浓度；

7.根据权利要求6所述的环介导等温扩增方法，其特征在于LAMP扩增反应程序为：65℃扩增60min；80℃灭活10min。

8.根据权利要求7所述的环介导等温扩增方法，其特征在于：

所述方法一、方法二中的最低检测浓度均为0.01ng/μL。