CN106800591B - 一种海蛇抗菌肽改造体及其原核表达制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种青环海蛇(Hydrophis cyanocinctus)抗菌肽Hc‑C改造体及其原核表达制备方法和用途。本发明所述的青海海蛇抗菌肽Hc‑C改造体为原始抗菌肽QHA前17个氨基酸组成，保留了母本活性基团，具有广谱的抗菌活性，其基因经过优化后能在大肠杆菌BL21中以融合蛋白的形式高效表达，利用甲酸切割释放Hc‑C保留了原始抗菌活性，且具有好的热稳定性和酸稳定性。在制备抗菌药物中，Hc‑C是一种优良的不易产生耐药性的抗菌药物，具有很高的经济价值和巨大的社会效益。
Description
技术领域：
本发明属于生物技术制药工业中基因工程领域，具体是一种海蛇抗菌肽改造体Hc-C原核表达及其应用。
背景技术：
近年来传统抗生素的大规模滥用导致越来越严重的病原微生物耐药问题，给人类健康带来巨大的威胁。临床上应对耐药微生物感染的措施是使用对耐药微生物尚未使用过的新的或者替代性的抗生素，因此这就需要持续开发新的抗微生物药物。
抗菌肽是生物体基因编码的一种天然小分子多肽，是生物体免疫系统的一种重要分子，对细菌、真菌、病毒甚至原虫均具有直接的杀灭作用。抗菌肽具有分子量小、结构简单、抗菌活性强、杀菌机制独特、毒性低和不易引起耐药性等优点，因此自发现之日起就被认为是具有极大开发潜力的新一代抗生素。到目前为止，已从不同生物体中发现超过1500多种不同的抗菌肽，而且其数目还在增加。改造体抗菌肽的应用，所述改造体抗菌肽用于制备抗菌药物、防感染药物、防腐剂、动物饲料或化妆品前体的用途。
抗菌肽药物原料药获得方式主要有化学合成和基因工程表达，但化学合成的生产管理和质量控制要求高，且生产中引入杂质多具有环境不友好性等缺点，而基因工程天然发酵表达方式成本低，相对引入毒性物质少更易被人们接受。
发明内容：
本发明的目的在于提供一种海蛇抗菌肽改造体及其原核表达载体构建方法及表达产物与制备方法。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种改造体抗菌肽，改造体抗菌肽为青环海蛇(Hydrophis cyanocinctus)抗菌肽QHA改造体Hc-C，其是直链多肽，含有17个氨基酸残基，分子量2151.7Da，等电点12.32。
所述改造体抗菌肽为：Lys1Phe2Phe3Lys4Arg5Leu6Leu7Lys8Ser9Val10Arg11Arg12Ala1 3Val14Lys15Lys16Phe17。
所述改造体抗菌肽基因序列为：5’-aaatttttcaaaaggctgctgaagagcgtgaggcgtgcagtcaagaaattc-3’
所述改造体抗菌肽基因优化后序列为：5’-aaattcttcaaacgtctgctgaaatccgtgcgtcgtgcggttaagaaattt-3’。
一种海蛇抗菌肽改造体Hc-C制备方法如下：
1)扩增带有酶切位点、甲酸识别位点及终止密码子Hc-C基因序列并构建重组载体pET-32a-Hc-C；
2)重组载体转化大肠杆菌E.coliBL21(DE3)工程菌中并进行诱导表达及培养条件优化；
3)融合蛋白经过HisTrapTM FF镍柱亲和层析纯化除盐冻干备用；
4)甲酸切割释放Hc-C后再次镍柱亲和层析收集不挂柱蛋白，除盐冻干后与标准品进行液相图谱比对。
以上所得抗菌肽进行了初步稳定性考察，具有耐热、抗氧化、耐酸性，且保留了较好的抗菌活性，具有非常好的成药前景。
改造体抗菌肽的应用，所述改造体抗菌肽用于制备抗菌药物、防感染药物、防腐剂、动物饲料或化妆品前体的用途。
附图说明
图1为扩增带有甲酸位点和限制性内切酶位点的目的基因的琼脂糖凝胶电泳图
图2为融合蛋白使用甲酸切割后SDS-PAGE电泳图
图3为Hc-C工程菌表达蛋白纯化Tricine SDS-PAGE电泳图，泳道1-3：纯化后杂蛋白，泳道4：过凝胶柱后目的蛋白，泳道5：纯化前杂蛋白，泳道6：离子交换后最终目的蛋白
图4为工程菌发酵纯化产物Hc-C与Hc-C标准品对照HPLC图
具体实施方式:
下面用实施例来进一步说明本发明的实质性内容，但本发明的内容并不局限于此。
实施例1 海蛇抗菌肽改造体重组载体的构建
为增加抗菌肽改造体Hc-C在宿主菌中的表达量，将Hc-C基因进行优化后合成，并设计引物扩增带有甲酸切割位点和限制性内切酶位点的目的基因(79bp，如图1)
Table1.Primer sequence
使用引物P1-Formic及P3-Eco-17扩增目的基因电泳图见图1：
实施例2 HC-C-pET32α融合蛋白的诱导表达优化
在含氨苄的LB培养基中，37℃培养含重组载体BL21工程菌至对数期。加入诱导剂IPTG至终浓度1mmol/L，诱导4h，收集菌体。菌体沉淀(～4.5g)溶解于30mL磷酸盐缓冲液(0.1mol/L，pH 7.4)中，冰浴超声破碎30min分别收集上清及沉淀进行SDS-PAGE检测融合蛋白表达情况。对重组工程均进行诱导表达条件优化，即不同浓度IPTG(0.1-1mM)、不同诱导时间(2-6h)，和不同温度(37℃、30℃、25℃、20℃、15℃)下诱导表达至菌体相同浓度，考察其对融合蛋白表达量的影响。
经过培养条件的优化，37℃1mM IPTG诱导培养4h产生的融合蛋白量最多，融合蛋白大多位于上清液中。
实施例3 融合蛋白的初步分离与甲酸切割释放目的蛋白
收集融合蛋白初提物，用10mM咪唑的溶解缓冲液A平衡HisTag亲和层析柱至基线稳定，将融合蛋白粗提物上柱HisTag亲和层析柱，上柱结束后，使用300mM/L咪唑的溶解缓冲液B洗脱至基线停止，同时收集目的峰流穿液，采用Bradford检测法测定融合蛋白浓度，计算1L菌液中融合蛋白的含量为1783.8mg/L。将融合蛋白流穿液通过除盐柱除盐，收集洗脱液浓缩至原体积的1/5，真空冷冻干燥，得到初步纯化蛋白(图2)；
甲酸切割释放目的蛋白具体操作为：初步纯化的融合蛋白中加入45％甲酸，40℃避光100r切割24-36h，不同时间采样通过液相HPLC检测融合蛋白的切割情况。液相检测方法：含有1％三氟乙酸(Trifluoroacetic acid，TFA)的去离子水和乙腈，作为流动相线性梯度洗脱(23-68％，1mL/min)，220nm检测吸收峰。
经过SDS-PAGE和活性分析发现，理论条带位置2kD处有一明显蛋白条带，经过分子筛过滤层析和离子交换层析处理后蛋白纯度可达90％以上(图3)。
收集纯化后目的蛋白除盐干燥后，同标准品进行液相检测分析(0.1％TFA乙腈：0.1％TFA水＝23:68，25min)，发现在tR＝10min位置有明显主峰出现，与标准品液相检测图谱一致(图4)。
实施例4 发酵所得Hc-C抗菌活性检测
最小抑菌浓度检测：将纯化后蛋白进行除盐冻干，并进行MIC最小抑菌浓度检测，初步检测Hc-C肽抑菌活性，其中使用标准品作为对照。试验菌株接种到MH液体培养基(青岛海博生物技术有限公司)中，37℃振荡培养到对数生长期，而后用新鲜MH液体培养基将培养至对数生长期的培养液稀释到2×105cfu/ml待用。
在无菌96孔板各孔中预先加入100μl MH液体培养基，然后在第一孔中加入100μl用MH液体培养基稀释到一定浓度的经0.22μm孔滤膜过滤的的抗菌肽Hc-C样品溶液，混匀后取100μl加入第2孔，依次倍比稀释(参见表2)，自第9孔吸出100μl弃去，第10孔系对照管。
表.2稀释方法
将上述各管混匀后放置37℃缓慢振荡培养18小时，于600nm波长处测定光吸收。最小抑菌浓度为看不见细菌生长的最低样品浓度。结果显示发酵纯化后Hc-C与标准品对金黄色葡萄球菌2706及铜绿假单胞菌ZY的MIC值均为6.125-12.5μg/ml之间。
初步稳定性考察：采用强酸碱及氧化和高温处理Hc-C样品，观察其降解状态。其中酸处理为1mol/L的盐酸溶液水浴回流1小时，用1mol/L的氢氧化钠调至6；碱处理为1mg加0.1mol/L的NaOH溶液0.8ml，振摇5分钟，用10mol/L的盐酸溶液调至中性；高温处理为样品水溶液沸水浴0-3h，室温过；氧化处理为加入1％双氧水，水浴加热约5分钟，室温过夜。结果发现其高温处理后样品液相图谱峰几乎没变，对酸和氧化变化较不明显，但是对于碱降解特别敏感。
Claims (6)
1.一种海蛇抗菌肽Hc-C改造体，所述改造体抗菌肽氨基酸序列为：
Lys1Phe2Phe3Lys4Arg5Leu6Leu7Lys8Ser9Val10Arg11Arg12Ala13Val14Lys15Lys16Phe17。
2.根据权利要求1所述的海蛇抗菌肽Hc-C改造体，其特征为所述海蛇抗菌肽Hc-C改造体抗菌肽基因序列为：5’-aaatttttcaaaaggctgctgaagagcgtgaggcgtgcagtcaagaaattc-3’。
3.根据权利要求1所述的海蛇抗菌肽Hc-C改造体，其特征为所述改造体抗菌肽的基因序列为5’-aaattcttcaaacgtctgctgaaatccgtgcgtcgtgcggttaagaaattt-3’。
4.一种重组质粒载体，其特征为包含编码权利要求3所述的海蛇抗菌肽Hc-C改造体的核苷酸。
5.一种根据权利要求4所述的质粒载体在大肠杆菌中的表达方法，包括以下步骤：
1)扩增带有酶切位点、甲酸识别位点及终止密码子Hc-C基因序列并构建重组载体pET-32a-Hc-C；
2)重组载体转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)工程菌中并进行诱导表达及培养条件优化；
3)融合蛋白经过HisTrapTM FF镍柱亲和层析纯化除盐冻干；
4)甲酸切割后镍柱亲和层析收集释放的Hc-C；
5)通过凝胶过滤层析和离子交换层析纯化甲酸切割释放的Hc-C肽。
6.权利要求1-3任一所述海蛇抗菌肽Hc-C改造体在制备抗菌药物、防感染药物、防腐剂、动物饲料或化妆品添加剂中的应用。
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