CN106755293B - 一种与肺癌辅助诊断相关的lncRNA标志物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种与肺癌辅助诊断相关的lncRNA标志物，其核苷酸序列为SEQ ID No.1，本发明还涉及该lncRNA标志物的外周血中的检测方法及其应用，与现有技术相比，本发明的优点在于本发明人从人血液中分离和检测到肺癌特异性长链非编码RNA LOC389023并命名为mini‑DPP10‑AS1呈显著高表达，发现人血液中的mini‑DPP10‑AS1来源于肺癌细胞，并分泌释放入血，此外，mini‑DPP10‑AS1的表达与肺癌的病理类型呈显著正相关，mini‑DPP10‑AS1对区分肺癌患者和健康人的灵敏度高达91.7％和特异度高达85％，为此，长链非编码RNA mini‑DPP10‑AS1能作为新型的肺癌血液分子诊断标记物。

Description

一种与肺癌辅助诊断相关的lncRNA标志物及其应用

技术领域

本发明涉及一种长链非编码RNA，具体涉及一种外周血中特征性长链非编码RNA作为制备诊断肺癌药物的应用。

背景技术

肺癌发病率和死亡率在我国长期居各恶性肿瘤的首位，其发病时间短，转移快，预后不理想，总的五年生存率仅为15％。大量研究和资料表明，早期诊断和早期治疗是防治肺癌和降低其死亡率的最有效办法。由于缺乏理想的早期诊断方法，肺癌的早期诊断率仅14％左右。然而，传统肿瘤标志物(如癌胚抗原)的灵敏度和特异性均不够高。目前简单的胸透和痰液细胞学化验对肺癌早期诊断的敏感性非常低，而支气管镜检查是深入肺部的入侵式检查，具创伤性。因此，找到一种微创而又特异灵敏的肺癌诊断标志物是当务之急。

人体外周血的循环肿瘤细胞和肿瘤相关的DNA、RNA都可以被用作体外诊断。研究发现，来自血浆和血清中循环核酸相对比较稳定，一些肿瘤组织中会出现表达异常，且和肿瘤有着密不可分的关系。长链非编码RNA(简称lncRNA)是一种长度大于200个核苷酸的RNA分子，没有编码蛋白质功能，部分可编辑一些肽类。lncRNA可通过表观遗传学、转录调控和转录后调控等多个层面调节细胞内基因的表达。研究已发现lncRNA 可与蛋白质或RNA分子形成复合物，调节肿瘤细胞的生长，与癌症发生密切相关，进入循环系统的lncRNA在正常条件下能被定量RT-PCR检测到。

血液是最常见的临床检验材料，采集血液也是微小创伤性、无痛苦和极易于被人们接受的取材方法。因此，基于外周血筛选肺癌特异性lncRNA，并用作为分子标志物具有重要的检测诊断价值。

发明内容

本发明所要解决的一个技术问题是提供一种与肺癌辅助诊断相关的lncRNA标志物。

本发明所要解决的另一个技术问题是提供一种上述lncRNA标志物的应用。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：该作为诊断肺癌分子标记物的长链非编码RNA，其特征在于：所述长链非编码RNA为lncRNA mini-DPP10-AS1，其核苷酸序列为SEQ ID No.1。

进一步地，所述lncRNA mini-DPP10-AS1在肺癌患者血清中的特异性表达上调。

本发明还提供一种检测外周血作为诊断肺癌分子标记物长链非编码RNA的方法，其特征在于所述的方法包括如下步骤：

1)采集血液，提取血浆中的总RNA；

2)将总RNA逆转录成cDNA；

3)利用mini-DPP10-AS1的特异性扩增上下游引物对步骤2)的cDNA溶液进行荧光定量PCR检测。

进一步地，所述的mini-DPP10-AS1的特异性扩增上下游引物为：

P1:5’aacagccacctgaaggcact3’；

P2:5’ttggaaacaccaatgcaacag3’。

进一步地，所述PCR反应体系如下：

Premix ExTaqTM II 10μl，上游引物1μl，下游引物1μl，cDNA模板1μl，ddH₂O 7μl，总体系为20μl，反应程序为95℃10s，95 ℃5s，60℃20s，72℃20s，45个循环，最后4℃保存，在荧光定量PCR仪MX3500 上检测，记录Ct值。

本发明还提供一种lncRNA标志物在制备肺癌辅助诊断试剂盒中的应用。该试剂盒可以包括PCR反应常用的酶和试剂，如Taq酶、dNTP混合液、Mgcl₂溶液、去离子水等。

本发明提供一种lncRNA标志物在制备肺癌药物中的应用。

具体地，本发明的研究内容包括(1)长链非编码RNA芯片分析获得差异表达lncRNA；(2)肺癌特征性lncRNA mini-DPP10-AS1验证；(3)外周血分离总RNA；(4) 定量RT-PCR分析mini-DPP10-AS1在血液中的表达；(5)mini-DPP10-AS表达与肺癌患者的病理因素之间的关系；(6)利用mini-DPP10-AS1作为血液分子标志物区分肺癌患者和健康人。

与现有技术相比，本发明的优点在于本发明人从人血液中分离和检测到肺癌特异性长链非编码RNA LOC389023并命名为mini-DPP10-AS1呈显著高表达，发现人血液中的mini-DPP10-AS1来源于肺癌细胞，并分泌释放入血，此外，mini-DPP10-AS1的表达与肺癌的病理类型呈显著正相关，mini-DPP10-AS1对区分肺癌患者和健康人的灵敏度高达91.7％和特异度高达85％，为此，长链非编码RNA mini-DPP10-AS1是一种新型的肺癌血液分子诊断标记物，能显著提高诊断的准确性、敏感性和特异性，该分子标志物的成功开发将为肺癌的诊断和治疗开创全新局面，为其它疾病生物标志物的研制提供借鉴，具有重要的应用价值，并作为制备治疗肝癌药物的靶基因药物提供了新的治疗靶点。

附图说明

图1为肺癌组织lncRNA芯片分析(绿色表示低表达；红色表达高表达)。

图2为荧光定量RT-PCR验证肺癌组织异常表达的lncRNA。其中lncRNA mini-DPP10-AS1的表达在扩大标本(n＝51)验证实验中显著上调(P＝0.0024)，其中non 表示癌旁组织，tumor表示肺癌组织。

图3为荧光定量RT-PCR检测肺癌患者和正常人血液中lncRNA mini-DPP10-AS1 的表达。其中正常体检人(非癌症患者，标记为non)17例，肺癌患者(标记为tumor)46 例，mini-DPP10-AS1在患者血液中的表达显著高于正常人(P＝0.043)。

具体实施方式

以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。

实施例1mini-DPP10-AS1在正常肺组织与肺癌组织中的表达情况

1、芯片分析差异性：在单位医学伦理委员会批准通过后，收集患者癌组织和癌旁组织以及血液标本。从4对肺癌组织和癌旁组织中提取总RNA，并评估RNA质量。选择Arraystar人类LncRNA芯片V3.0芯片，RNA标记和芯片杂交根据Agilent One-ColorMicroarray-Based Gene Expression Analysis实验方案(Agilent Technology)执行。

2、获得芯片分析结果如图1所示，结果显示表达上调的lncRNA有817条，下调的lncRNA有734条。按差异表达倍数改变排序，表达上调和下调最高的前十条lncRNA 如表1所示(P<0.05)。其中表达上调倍数最高为LOC389023(又名mini-DPP10-AS1)，提示mini-DPP10-AS1在肺癌中可能作为一个癌基因发挥作用。

表1肺癌组织中差异表达的典型lncRNA(P<0.05)

实施例2

1、肺癌特征性lncRNA mini-DPP10-AS1验证：在芯片筛选出在肺癌组织中特异性高表达的lncRNAs后，发明人特别地在扩大样本(n＝51)中选择了改变倍数最高的 lncRNA进行荧光定量RT-PCR方法扩增DNA来鉴定得到的即为目的 DNA(mini-DPP10-AS1，片段长约245nt，其核苷酸序列为Seq NO.1)，且发现 mini-DPP10-AS1的表达显著上调(P＝0.0024)；结果如图2所示。同时在培养的肺癌细胞中检测mini-DPP10-AS1，其具有高表达而正常细胞中表达降低，以上结果说明 mini-DPP10-AS1是肺癌特征性RNA。

2、RT-PCR反应检测具体检测mini-DPP10-AS1在肺癌组织中的表达：

具体实验步骤如下：

(1)全血总RNA提取：①取0.25ml含有RNA保护液(其主要成分是硫氰酸胍，硫氰酸铵，甘油等的混合液，以保护RNA不被降解)的全血加入0.75ml TRIzol，上下颠倒混匀，静置15min；②向上清中加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15秒，室温放置10min；③ 4℃，12000rpm离心15分钟，此时可见裂解液分三层，上层为水相RNA；中层为DNA，脂类等；下层为细胞残渣，蛋白，多糖等；④将上层水相转移到另一焦碳酸二乙酸DEPC 的EP管中，加入等体积的异丙醇，室温放置10分钟；⑤4℃，12000rpm离心10分钟，移去上清；⑥用75％乙醇1ml洗涤RNA沉淀，4℃7500rpm离心5分钟，弃上清；⑦室温放置干燥，大约晾5-10分钟即可。加入20μl无RNase的水，用移液器吸头吹打几次， 56℃放置10分钟使RNA溶解，获得的RNA浓度在400-2000ng/ml。

(2)逆转录成cDNA：先在DEPC处理的PCR管中加入以下试剂：随机引物2μl，dNTPMixture 1μl，RNA模板2μl，DEPC水8μl，混匀后放入金属浴65℃5min，然后冰浴2min 后加入以下试剂

RTase(200U/μl)1μl，

Buffer 4μl，RNase Inhibitor(40U/μl)0.5μl，RNase free H₂O 3.5μl，总体积为20μl；逆转录程序为37℃ 10min，70℃50min，50℃20min，最后4℃保存，最终转移到-80℃冰箱长期保存。

(3)荧光定量PCR检测mini-DPP10-AS1：以GDPHD作为内对照，将步骤(2)的cDNA 作为模板，设计用于扩增mini-DPP10-AS1的PCR引物，即上游引物： 5’aacagccacctgaaggcact3’；下游引物：5’ttggaaacaccaatgcaacag3’)，PCR反应体系如下：

Premix ExTaqTM II 10μl，上游引物1μl，下游引物1μl，cDNA模板1μl，ddH₂O 7μl，总体系为20μl；反应程序为95℃10s，95℃5s，60℃20s，72℃20s，45个循环，最后4℃保存。在荧光定量PCR仪MX3500上检测，记录Ct值。

实施例3分析mini-DPP10-AS1表达与患者病理因素之间的关系

结合临床资料和各种病理因素分析，统计结果如表2所示，从结果可以看出，mini-DPP10-AS1的表达与患者性别(Gender)、年龄(Age)、血清CYFR21、肿瘤数(Tumornumber)、微血管浸润(Microvascular invasion)、是否吸烟(Smoke)都没有显著相关性 (P>0.05)，而与TNM分期显著相关(P＝0.0347)，同时也与病理类型(腺癌和鳞癌)有显著相关性(P＝0.0188)。以上结果表明，mini-DPP10-AS1的高表达与肺癌的发生存在显著相关性，有可能作为新型的血液分子标志物。

表2 lncRNA DPP10-AS1表达与临床病理因素之间的关系

实施例4利用血液mini-DPP10-AS1区分肺癌患者和健康人群

从实施例1中获得血液标本，按照实施例2所示方法，分析患者和正常人血液中mini-DPP10-AS1的表达水平。从结果图3中可以看出，mini-DPP10-AS1在患者中的表达显著高于正常人(P＝0.043)。这表明，mini-DPP10-AS1可在患者血液中检出，并比正常人高。通过分析可知，正常人mini-DPP10-AS1可被检出的Ct值在30-35之间，肺癌患者的Ct值在22-28之间。因此，设肺癌患者Ct值阈值为28，定义血液中检测Ct值小于等于28为阳性，为了进一步验证mini-DPP10-AS1可作为分子标志物区分肺癌患者、其他非癌肺病患者和正常人，另取一个组标本进行验证。其中肺癌患者、肺炎患者和健康对照人数各60例。通过比较血液、组织中的表达和患者的病理报告，分析了该分子标志物的灵敏度。统计结果如表3所示，灵敏度达到91.7％，特异度达到85％，具有较高的可靠性。

表3 mini-DPP10-AS1作为分子标志物检测的特点

Claims (2)

1.检测样本中lncRNA LOC389023表达水平的试剂在制备肺癌辅助诊断试剂盒中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述试剂包括特异性引物为：

P1：5’aacagccacctgaaggcact3’；

P2：5’ttggaaacaccaatgcaacag3’。

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