CN106755179A - 一种适于细菌纤维素发酵的培养基 - Google Patents
一种适于细菌纤维素发酵的培养基 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于发酵技术领域，具体涉及一种适于细菌纤维素发酵的培养基。所述培养基以玉米粉、黄豆粉、豆粕粉作为主料，不仅降低了成本，而且原料廉价易得、营养丰富全面、加工工艺简单，较常规细菌纤维素发酵培养基成本降低5‑7倍，且经过136‑144小时培养即可完成24g/L及以上的细菌纤维素发酵产量，提高了纤维素的生产效率。
Description
技术领域
本发明属于发酵技术领域，具体涉及一种适于细菌纤维素发酵的培养基。
技术背景
细菌纤维素是某类群微生物(细菌)经合成分泌的纤维素统称，工业生产中多以木醋杆菌作细菌纤维素发酵的菌种。作为一种新型生物材料，细菌纤维素以其独特性能受到广泛关注。细菌纤维素具有高纯度、超细性、透水透气性、良好的生物相容性、可降解性以及生物合成可调控性，在医疗器械领域、食品添加剂领域、造纸领域、纺织领域以及环保领域有广阔的应用前景。
微生物发酵是一个复杂的、系统的生物学过程，期间受多种因素的影响，如培养基组份、配比、培养温度、培养方式。其中，培养基的组成及配比是关键因素之一，国内外均进行了大量研究。
国内细菌纤维素生产最初以椰子水为主要原料，如申请号为201110223884.3的发明申请中公布了一种细菌纤维素发酵培养基，该培养基中含有占培养基总重量30-90％的椰子粕加水混匀后得到的浆液。该方法受地域限制而不便于广泛推广应用。科研及生产人员先后开发出果蔬汁、植物浸提物以及各类农副产品下脚料等作为细菌纤维素发酵主料。当前培养基主要存在以下缺点：1)原料制备工艺复杂，耗费较大的人力和物力。2)原材料受地域限制，不利于推广。3)细菌纤维素产率较低，增加了单位生产成本，高昂的生产成本限制了细菌纤维素的推广应用，当前细菌纤维素主要限定在附加值较高的产品领域。
我国是产粮大国，拥有丰富的耕地资源，玉米是我国第三大粮食作物，资源丰富，物美价廉。玉米含有丰富的淀粉、蛋白质以及微量元素，是非常理想的培养基原料，如中国发明专利ZL201110110794.3一种细菌纤维素的制备方法公布了一种在培养基中添加玉米芯酶解液来制备细菌纤维素的方法，该方法用纤维素酶、半纤维素酶和木聚糖酶酶解玉米芯制成玉米芯酶解液，并将其加入到制备细菌纤维素的培养基中，可以使玉米芯中富含的木聚糖酶解成具有良好保健功能的低聚木糖，并被包裹或吸附在细菌纤维素中，提高细菌纤维素的保健功能。但尚未发现使用玉米全粉生产细菌纤维素的技术。
大豆是我国重要粮食作物之一，含有丰富的蛋白质，能够为微生物提供优质的碳源、氮源等营养原料。豆类加工的副产物--豆粕，因为含有丰富的碳水化合物和蛋白质以及微量元素，亦是理想的微生物发酵原材料。
目前没有玉米全粉、黄豆粉以及豆粕应用于细菌纤维素发酵的报道。
发明内容
本发明目的在于：提供一种显著提高细菌纤维素产量的适用培养基，培养基所用原料廉价易得、营养丰富全面、加工工艺简单。在降低原料成本的同时，显著提高了细菌纤维素产率，大幅度降低细菌纤维素的生产成本，有效促进细菌纤维素的推广应用。本发明用玉米粉、黄豆粉、豆粕粉作为细菌纤维素发酵培养的主料，不仅降低了成本，而且营养全面，易与产物分离，有利于细菌纤维素的增产和收集。
所述培养基具体如下：
(1)种子培养基：按重量1000份计，玉米粉5-15份，黄豆粉5-12份，白砂糖5-10份，酵母浸膏1-3份，胰蛋白胨1-3份，磷酸二氢钾3份，硫酸镁1份，余量为水，pH至6.8，121℃灭菌20分钟；
(2)发酵培养基：按重量1000份计，玉米粉8-20份，豆粕粉5-20份，白砂糖5-15份，磷酸二氢钾2份，硫酸镁2份，氯化钙1份，余量为水，pH至6.8，121℃灭菌20分钟；
所述玉米粉由整粒玉米粉碎至60目及以下；
所述黄豆粉由黄豆粒粉碎至60目及以下；
所述豆粕粉为一浸豆粕，粉碎至60目及以下；
所述白砂糖为食用级合格品；
所述酵母浸膏、胰蛋白胨、磷酸二氢钾、硫酸镁、氯化钙为市售常规试剂；
本发明还提供一种采用上述培养基发酵制备细菌纤维素的方法：
(1)将菌种经过常规扩繁转管后，接入上述种子培养液中；
所述菌种可以是木糖葡糖酸醋杆菌(Gluconacetobacter xylinus)、醋化醋杆菌(Acetobacter aceti)巴氏醋杆菌(Acetobacterpasteutinus)、汉森醋杆菌(Acetobacterhansenii)或白膜醋酸杆菌(Acetobacter acetosus)；
(2)种子培养条件为：恒温摇床中25℃、120-150rpm培养40-48小时得种子液；
(3)细菌纤维素发酵生产采用三段式控制：
第一阶段：按5-10％的接种量将种子液接种至发酵培养基中，26-28℃，120-180rpm培养24小时；
第二阶段：将培养温度调整为28-30℃，150-240rpm培养48小时；
第三阶段：28-30℃、80-160rpm继续培养48小时，得到细菌纤维素动态发酵颗粒；
(4)将发酵培养获得的细菌纤维素动态发酵颗粒经去离子水冲洗、1％NaOH溶液浸煮、去离子水冲洗至中性，冷冻干燥后得目标产物。
有益效果：
(1)本发明提供的培养基所用原料廉价易得、营养丰富全面、加工工艺简单；在降低原料成本的同时，显著提高了细菌纤维素产量至24g/L及以上，有效提高了细菌纤维素的产率，大幅度降低细菌纤维素的生产成本，有效促进细菌纤维素的推广应用；
(2)本发明用玉米粉、黄豆粉、豆粕粉作为细菌纤维素发酵培养的主料，较常规细菌纤维素发酵培养基成本降低5-7倍，而且营养全面，易与产物分离，有利于细菌纤维素的清洗和收集；
(3)本发明所提供的培养基不仅成本低、产率高，而且提高了纤维素的生产效率，经过136-144小时培养即可完成24g/L及以上的细菌纤维素发酵产量。
(4)本发明的细菌纤维素发酵方法，首次采用三段式变温变速的发酵方法，根据菌种的接种量及代谢变化调节温度及转速，操作简便，有效提高了细菌纤维素的产率。
附图说明：
图1：细菌纤维素生产流程图
具体实施方式：
以下实施例中所用菌种均为木糖葡糖酸醋杆菌(Gluconacetobacter xylinus)CCTCC AB2040512；
实施例发酵罐动态培养过程中每隔24小时取样观察并测定单位体积生物量一次，采用革兰氏染色法涂片显微镜下观察。
实施例1一种适于细菌纤维素发酵的培养基及发酵生产细菌纤维素的方法
种子培养基：以1000份计，玉米粉15份，黄豆粉5份，白砂糖5份，胰蛋白胨1份，酵母浸膏2份，磷酸二氢钾3份，硫酸镁1份，余量为水，调节pH至6.8，121℃灭菌20分钟；
发酵培养基：以1000份计，玉米粉20份，豆粕粉6份，白砂糖5份，磷酸二氢钾2份，硫酸镁2份，氯化钙1份，余量为水，调节pH至6.8，121℃灭菌20分钟；
所述玉米粉由整粒玉米粉碎至60目及以下；所述黄豆粉由黄豆粒粉碎至60目及以下；所述豆粕粉为一浸豆粕，粉碎至60目及以下；所述白砂糖为食用级合格品；所述酵母浸膏、胰蛋白胨、磷酸二氢钾、硫酸镁、氯化钙为市售常规试剂。
种子制备：超净工作台内将斜面菌种接到种子培养基中，恒温摇床中25℃、150rpm培养48个小时，备用。
细菌纤维素动态发酵第一阶段：将种子按10％的接种量接种至发酵罐中，180rpm、28℃培养24小时；第二阶段：将培养条件调整为30℃、210rpm培养48小时；第三阶段：将转速调整为140，28℃培养48小时后过滤除去菌液得细菌纤维素颗粒材料。
产物处理：用去离子水清洗所得颗粒材料，洗净残留培养基后用质量浓度1％氢氧化钠溶液90℃处理15分钟，去离子水冲洗至中性得BC(细菌纤维素)湿材，将所得材料冷冻干燥得BC干粉，称重并记录。
实施例2一种适于细菌纤维素发酵的培养基及发酵生产细菌纤维素的方法
种子培养基：以1000份计，玉米粉10份，黄豆粉12份，白砂糖6份，酵母浸膏1份，胰蛋白胨1份，磷酸二氢钾3份，硫酸镁1份，余量为水，调节pH至6.8，121℃灭菌20分钟。
发酵培养基：以1000份计，玉米粉14份，豆粕粉8份，白砂糖10份，磷酸二氢钾2份，硫酸镁2份，氯化钙1份，余量为水，调节pH至6.8，121℃灭菌20分钟。
种子制备：超净工作台内将斜面菌种接到种子培养基中，恒温摇床中25℃、150rpm培养48个小时，备用。
细菌纤维素动态发酵：
将种子按6％的接种量接种至发酵罐中，140rpm、27℃培养24小时；第二阶段：将培养条件调整为29℃、转速调整为240rpm培养48小时；第三阶段：将温度调整为30℃、转速调整为80rpm培养48小时后过滤除去菌液得细菌纤维素颗粒材料。
其他处理方式如实施例1。
实施例3一种适于细菌纤维素发酵的培养基及发酵生产细菌纤维素的方法
种子培养基配制：以1000份计，玉米粉5份，黄豆粉10份，白砂糖7份，胰蛋白胨2份，酵母浸膏2份，磷酸二氢钾3份，硫酸镁1份，余量为水，调节pH至6.8,121℃灭菌20分钟。
发酵培养基配制：以1000份计，玉米粉10份，豆粕粉14份，白砂糖12份，磷酸二氢钾2份，硫酸镁2份，氯化钙1份，余量为水，调节pH至6.8,121℃灭菌20分钟。
种子制备：超净工作台内将斜面菌种接到种子培养基中，恒温摇床中25℃、130rpm培养40个小时，备用。
细菌纤维素动态发酵第一价段：将种子按5％的接种量接种至发酵罐中，设定转速为120rpm，培养温度设定为26℃培养24小时；第二阶段：将发酵罐转速调整为180rpm，培养温度调整为28℃培养48小时；第三阶段：将转速调整160rpm，29℃培养48小时后过滤除去菌液得细菌纤维素颗粒材料。
其他处理方式如实施例1。
实施例4一种适于细菌纤维素发酵的培养基及发酵生产细菌纤维素的方法
种子培养基：以1000份计，玉米粉11份，黄豆粉7份，白砂糖10份，酵母浸膏3份，胰蛋白胨3份，磷酸二氢钾3份，硫酸镁1份，余量为水，调节pH至6.8,121℃灭菌20分钟。
发酵培养基：以1000份计，玉米粉8份，豆粕粉20份，白砂糖15份，磷酸二氢钾2份，硫酸镁2份，氯化钙1份，余量为水，调节pH至6.8,121℃灭菌20分钟。
种子制备：超净工作台内将斜面菌种接到种子培养基中，恒温摇床中25℃、120rpm培养48个小时，备用。
细菌纤维素动态发酵第一阶段：将种子按8％的接种量接种至发酵罐中，160rpm、28℃培养24小时；第二阶段：将培养条件调整为30℃、150rpm培养48小时；第三阶段：29℃、110rpm培养48小时后过滤除去菌液得细菌纤维素颗粒材料。
其他处理方式如实施例1。
实施例5对照试验1
种子培养基：葡萄糖20g/L，蛋白胨5g/L，磷酸二氢钾4.3g，硫酸镁2.5g，氯化钠3g，余量为水，调节pH至6.8；
发酵培养基：自然发酵椰子水1000ml，蔗糖40g，酵母浸膏10g，磷酸二氢钾4.3g，硫酸镁2.5g，氯化钠3g，余量为水，调节pH至6.8。
其他处理方式如实施例1。
实施例6对照试验2
种子培养基及发酵培养基配制同实施例1，种子培养同实施例1，发酵培养采用7％的接种量接种至发酵罐中，30℃、120rpm培养120小时后过滤除去菌液得细菌纤维素颗粒材料。
表1：各试验组发酵培养基成本
| 组别 | 实施例1 | 实施例2 | 实施例3 | 实施例4 | 实施例5 | 实施例6 |
| 培养基成本(元/L) | 0.262 | 0.275 | 0.337 | 0.317 | 1.421 | 0.262 |
| 产量(干重g/L) | 26.73 | 24.88 | 28.69 | 25.66 | 1.95 | 12.31 |
Claims (4)
1.一种适于细菌纤维素发酵的培养基，其特征在于，所述培养基具体如下：
(1)种子培养基：按重量1000份计，玉米粉5-15份，黄豆粉5-12份，白砂糖5-10份，酵母浸膏1-3份，胰蛋白胨1-3份，磷酸二氢钾3份，硫酸镁1份，余量为水，pH至6.8，121℃灭菌20分钟；
(2)发酵培养基：按重量1000份计，玉米粉8-20份，豆粕粉5-20份，白砂糖5-15份，磷酸二氢钾2份，硫酸镁2份，氯化钙1份，余量为水，pH至6.8，121℃灭菌20分钟。
2.一种利用权利要求1所述培养基制备细菌纤维素的方法，其特征在于，具体步骤如下：
(1)种子培养：菌种接种于种子培养基，恒温摇床中25℃、120-150rpm培养40-48小时；
(2)三段式发酵培养：
第一阶段：按5-10％的接种量将种子液接种至发酵培养基中，26-28℃，120-180rpm培养24小时；
第二阶段：将培养温度调整为28-30℃，150-240rpm培养48小时；
第三阶段：28-30℃、80-160rpm继续培养48小时，得到细菌纤维素动态发酵颗粒；
(3)将发酵培养获得的细菌纤维素动态发酵颗粒经去离子水冲洗、1％NaOH溶液浸煮、去离子水冲洗至中性，冷冻干燥后得细菌纤维素产物。
3.如权利要求2所述的制备细菌纤维素的方法，其特征在于，所述菌种选自木糖葡糖酸醋杆菌(Gluconacetobacter xylinus)、醋化醋杆菌(Acetobacter aceti)巴氏醋杆菌(Acetobacterpasteutinus)、汉森醋杆菌(Acetobacterhansenii)或白膜醋酸杆菌(Acetobacter acetosus)。
4.权利要求1所述培养基在发酵生产细菌纤维素中的应用。
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