CN106701800B - 一种出芽短梗霉聚酮合成酶基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种聚酮合成酶基因，尤其涉及一种真菌黑色素合成相关的聚酮合成酶基因及其应用，属于基因工程技术领域。一种聚酮合成酶基因，核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。该基因编码的聚酮合成酶，氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。本发明所述聚酮合成酶基因可用于体外合成黑色素。经检测，体外酶反应液中黑色素含量为35.6g/L。

Description

一种出芽短梗霉聚酮合成酶基因及其应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种出芽短梗霉(Aureobacidiumpullulans)聚酮合成酶基因及其应用。

背景技术

黑色素是生物体中广泛存在的保护性色素，具有生物半导体、清除自由基、防紫外线辐射、螯合重金属离子等功能，在日用化妆品工业、食品工业、医药工业、农业等众多领域有重要的用途。按照来源，黑色素可分为动物黑色素、植物黑色素和微生物黑色素；按照化学组成可分为真黑色素(eumelanin)、棕黑色素(phaeomelanin)和异黑色素(allomelanin)。真黑色素含碳、氢、氧、氮，不含硫原子，颜色为深棕色或黑色，主要存在于动物、家禽黑羽或蓝羽、眼、皮肤以及相关的组织中，是酪氨酸经由多巴(Dopa)途径转化聚合生成。棕黑色素含碳、氢、氧、氮、硫原子，颜色为略带红色的棕色和黄色，主要存在于家禽红棕色、浅黄色羽毛、头发和绒毛等组织中，合成途径与真黑色素接近，不同在于胱氨酸或谷胱甘肽参加了合成过程。异黑色素含碳、氢、氧，不含氮、硫原子，颜色为棕色或黑色，主要存在于植物和微生物中，是酚类物质在聚合酶和氧化酶作用下经聚合和氧化形成，研究表明植物和真菌中黑色素多数以二羟基萘(DHN)型黑色素为主要结构骨架。

目前黑色素制备主要是从黑豆、黑芝麻等种皮和动物毛发、表皮分离提取，产量低、纯度低、成本高。随着人们对黑色素了解的不断加深，其功能研究与应用范围也日益广阔，使得人们对黑色素的需求量日益增加，仅靠有限的提取不能满足市场需求，迫切需要开发新的获得方法。黑酵母发酵提取与酶法体外合成黑色素具有周期短，能克服气候和产地限制，大大降低生产成本，因而受到广泛关注。

聚酮合成酶(polyketide synthase)是一类复杂的多酶体系，目前已发现的聚酮合成酶可大致分为3型，即I型模块型，II型迭代型，III型其他型。III型聚酮合成酶包括1,3,6,8-四羟基萘合成酶、查尔酮合成酶等。DHN型黑色素合成的第一步为聚酮合成酶中的1,3,6,8-四羟基萘合成酶催化丙二酰辅酶A合成1,3,6,8-四羟基萘，1,3,6,8-四羟基萘依次在小孢柱酮脱水酶(scytalone dehydratase)、羟萘还原酶(HN reductase)及多酚氧化酶(polyphenol oxidase)作用下合成DHN型黑色素。

但聚酮合成酶基因与DHN黑色素合成相关的报道多集中于细菌中，真菌中有关聚酮合成酶基因与DHN黑色素合成的报道很少，出芽短梗霉在生物分类学上属于霉菌，为真菌的一种，目前很少有关于出芽短梗霉中DHN黑色素合成相关的聚酮合成酶的报道。而且国际上进行黑色素生产研究的聚酮合成酶较少，来源有限，因此，需要开发新的高效合成黑色素的酶源。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的一个目的是提供一种出芽短梗霉聚酮合成酶基因。

本发明提供的出芽短梗霉聚酮合成酶基因，为如下(1)或(2)的DNA分子：

(1)序列表中SEQ ID NO.1所示的DNA分子；

(2)在严格条件下与SEQ ID NO.1所示的DNA序列杂交且编码聚酮合成酶的DNA分子。

上述聚酮合成酶基因来源于出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)3.3984(购于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种编号为3.3984)，基因全长为6492bp。

本发明的另一目的是提供由上述出芽短梗霉聚酮合成酶基因编码的聚酮合成酶。

本发明提供的聚酮合成酶，是如下(a)或(b)的蛋白质：

(a)由序列表中SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)将SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有聚酮合成酶活性的由序列1衍生的蛋白质。

SEQ ID NO.2所示的蛋白由2163个氨基酸残基组成。

含有上述出芽短梗霉聚酮合成酶基因的重组表达载体也属于本发明的保护范围。

所述重组表达载体可用现有的表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。

所述重组表达载体具体可为将上述出芽短梗霉聚酮合成酶基因插入到pGAPZα-A表达载体的多克隆位点得到重组质粒。

含有上述出芽短梗霉聚酮合成酶基因的表达盒、转基因细胞系及重组菌均属于本发明的保护范围。

所述重组菌可为将所述重组表达载体转化毕赤酵母SMD1168H得到的重组菌。

本发明还提供上述出芽短梗霉聚酮合成酶基因和/或聚酮合成酶在黑色素体外合成中的应用。

本发明的第三个目的是提供一种黑色素体外合成的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：发酵培养所述重组菌，收集发酵上清液，沉淀上清液中的蛋白质，再对蛋白沉淀进行脱盐和浓缩，即得聚酮合成酶粗酶液；将聚酮合成酶粗酶液与出芽短梗霉粗酶液、丙二酰辅酶A混合，调节pH至8.0，38～40℃条件下反应，反应期间进行充分供氧，反应40～60分钟；反应结束后，调节pH至2.0～3.0，离心，收集沉淀，得到黑色素粗产物。

所述出芽短梗霉粗酶液为出芽短梗霉新鲜菌体经液氮研磨破壁，50mM磷酸钠缓冲液(pH8.0)重溶菌粉，4000rpm离心5分钟获得的上清液。由于DHN黑色素合成涉及到很多反应步骤，聚酮合成酶粗酶液催化合成1,3,6,8-四羟基萘是反应的第一步，而出芽短梗霉粗酶液包含DHN黑色素合成所需要的多种酶，通过加入出芽短梗霉粗酶液，目的是提供DHN黑色素后续合成所需要的酶，使1,3,6,8-四羟基萘转化为黑色素。

本发明提供的方法，还包括：将黑色素粗产物进行纯化的步骤，具体如下：将黑色素粗产物溶于1mol/L NaOH中，加入2倍体积酸性甲醇(pH＝2)，静置4h，6000r/min离心10min后，收集沉淀，将沉淀用蒸馏水洗涤至中性，60℃烘干，即得黑色素。

本发明的有益效果：

(1)本发明首次从出芽短梗霉中分离得到聚酮合成酶基因，该聚酮合成酶基因经克隆到pGAPZα-A表达载体上，转化毕赤酵母SMD1168H，获得聚酮合成酶，可用于黑色素体外合成，为黑色素体外合成提供了新的酶源和合成方法。

(2)本发明还提供了一种体外合成黑色素的方法，通过发酵含有本发明聚酮合成酶基因的重组菌株，得聚酮合成酶粗酶液；再进一步与出芽短梗霉粗酶液、丙二酰辅酶A混合反应，并通过对反应条件的优化，大大提高了体外酶反应合成的黑色素的产量。

(3)本发明的聚酮合成酶具有广泛的应用范围，可用于制药、化妆品、食品等领域。

附图说明

图1：本发明所述重组聚酮合成酶体外黑色素合成反应产物图；

其中，反应前：重组聚酮合成酶粗酶液和出芽短梗霉粗酶液混合后加入0.5mol/L丙二酰辅酶A，反应0分钟。

对照组：含空载体pGAPZα-A的毕赤酵母SMD1168H发酵液粗酶液和出芽短梗霉粗酶液混合后加入0.5mol/L丙二酰辅酶A，38℃反应60分钟；

实验组：重组聚酮合成酶粗酶液和出芽短梗霉粗酶液混合后加入0.5mol/L丙二酰辅酶A，38℃反应60分钟。

具体实施方式

下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法。

实施例1：出芽短梗霉聚酮合成酶基因的PCR扩增

将中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CMGCC)，菌种编号为As3.3984的出芽短梗霉培养液5mL，用RNA提取试剂盒进行总RNA提取，提取步骤参照Takara公司的RNA提取试剂盒说明书。以提取的总RNA为模板用反转录试剂盒进行反转录，得到cDNA，反转录步骤参照Takara公司的反转录试剂盒说明书。

从GenBank中检索同属不同菌株聚酮合成酶基因的核苷酸序列，设计一对引物F-I和R-I。引物序列如下：

F-I：5’-ATGTCTAACGTTCTTCTTTT-3’ SEQ ID NO.3；

R-I：5’-GATCTGAAGACCTTCTTGGA-3’ SEQ ID NO.4；

以cDNA为模板进行扩增，采用上述引物进行扩增。总体积为50μL，超纯水18μL，10×LAtaq buffer(含MgCl₂)5μL，dNTP(各2.5mmol/L)4μL，引物(20μmol/L)各1μL，cDNA25ng，TaKaRa LA Taq酶2.5U。PCR扩增条件：95℃预变性5分钟，反应30个循环(95℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸6.5分钟)，30个循环结束后72℃延伸10分钟。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，紫外分析仪检测，用Bioflux凝胶回收试剂盒进行PCR片段切胶回收，测序大小为6492bp。所得产物即为出芽短梗霉聚酮合成酶基因片段，测得序列如SEQ IDNo.1。

该段核苷酸序列全长6492bp，是一个完整的ORF，编码2163个氨基酸。该6492bp的ORF即为出芽短梗霉聚酮合成酶基因，其核苷酸序列及编码的氨基酸序列分别为SEQ IDNo.1和SEQ ID No.2。

实施例2：出芽短梗霉聚酮合成酶基因在毕赤酵母SMD1168H中的表达

根据SEQ ID No.1所示序列设计引物F-I-A和R-I-A，分别引入能插入pGAPZα-A质粒(购自美国Invitrogen公司)的SacII、XbaI酶切位点(下划线所示)，序列如下

F-I-A：5’-GCGCCGCGGCATGTCTAACGTTCTTCTTTT-3’ SEQ ID NO.5；

R-I-A：5’-GCGTCTAGAATGATCTGAAGACCTTCTTGGA-3’ SEQ ID NO.6；

以反转录的出芽短梗霉cDNA为模板，采用上述引物进行PCR扩增。PCR扩增条件和PCR产物回收方法同实施例1。PCR产物回收后加NdeI、SalI(NEB，USA)于37℃酶切1小时，进行DNA纯化，采用同样酶切方法处理pGAPZα-A质粒载体。将制备好的酶基因片段与pGAPZα-A载体按一定比例混合，采用T4连接酶(NEB，USA)于16℃连接18小时，然后采用CaCl₂转化法转化宿主菌大肠杆菌Top10，转化菌液涂布zeocin(25μg/mL)抗性LB平板，37℃过夜培养。挑取生长良好的单菌落至LB液体培养基中37℃培养10小时，提取质粒，通过酶切法和PCR法验证阳性转化子，得到重组质粒pGAPZα-A-alb。

将上述重组质粒pGAPZα-A-alb用AvrII内切酶(NEB，USA)于37℃酶切1小时，进行DNA纯化。然后将线性化的pGAPZα-A-alb采用电转化方法转化宿主毕赤酵母SMD1168H，转化菌液涂布zeocin(100μg/mL)抗性YPD平板，30℃培养3天。挑取生长良好的单菌落至YPD液体培养基中30℃培养3天，提取基因组，通过PCR法验证阳性转化子，得到重组毕赤酵母SMD1168H-alb。

上述LB培养液成分：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 5g/L，pH7.0～7.5，121℃灭菌20分钟。

上述YPD培养液成分：蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L，葡萄糖20g/L，自然pH，115℃灭菌30分钟。其中葡萄糖单独配制灭菌，115℃灭菌30分钟，取出后与其他成分混合。

实施例3：出芽短梗霉聚酮合成酶体外催化合成黑色素

将实施例2中获得的重组毕赤酵母SMD1168H-alb接种到YPD液体培养基中，30℃摇床培养3天，转速200rpm。培养好的发酵液8000rpm离心5分钟收集上清液，上清液中缓慢添加硫酸铵至80％浓度，8000rpm离心5分钟收集蛋白沉淀。蛋白沉淀用50mM磷酸钠缓冲液(pH8.0)重溶后用100KD超滤管进行脱盐和浓缩，最终使蛋白溶液与上述发酵上清液相比体积浓缩1000倍。经过脱盐和浓缩获得的蛋白溶液即为重组聚酮合成酶粗酶液。

出芽短梗霉As3.3984菌株接种到YPD液体培养基中，30℃摇床培养2天，转速200rpm。培养好的发酵液8000rpm离心5分钟，弃上清，收集菌体沉淀置于研钵中。在研钵加入适量液氮，快速研磨菌体，待液氮挥发完毕后重新加入液氮，继续研磨至菌体呈粉末状。用1/1000发酵液体积的50mM磷酸钠缓冲液(pH8.0)重溶菌粉，4000rpm离心5分钟，上清液即为出芽短梗霉粗酶液。

取上述重组聚酮合成酶粗酶液1mL、出芽短梗霉粗酶液1mL、2.5mol/L丙二酰辅酶A0.5mL混合，NaOH调pH至8.0，38℃保温60分钟进行反应，期间进行充分供氧。反应混合液颜色逐渐变深直至黑色。待反应结束后，用6mol/L HCl调pH至2.5，6000r/min离心10min后，收集沉淀，得到黑色素粗产物。将黑色素粗产物溶于1mol/L NaOH中，加入2倍体积酸性甲醇(pH＝2)，静置4h，6000r/min离心10min后，收集沉淀，将沉淀用蒸馏水洗涤至中性，60℃烘干，即得黑色素，黑色素的产量为35.6g/L。

实验例：对照组体外酶反应

设置该实验例目的为通过对照组实验验证体外黑色素的合成与聚酮合成酶相关。

实验组体外反应酶液和反应条件同实施例3。

对照组与实验组相比区别在于：用含有空载体pGAPZα-A的毕赤酵母SMD1168H发酵液粗酶液与实施例3中所述出芽短梗霉粗酶液混合代替重组聚酮合成酶粗酶液与出芽短梗霉粗酶液。

上述含有空载体pGAPZα-A的毕赤酵母SMD1168H发酵液粗酶液制备方法为：将空载体pGAPZα-A用AvrII内切酶线性化后电转化毕赤酵母SMD1168H，获得重组菌，重组菌接种YPD液体培养基培养3天后收集上清液，经硫酸铵沉淀、超滤管脱盐浓缩后即得。具体操作步骤参照实施例2和实施例3。

反应结束后，观察对比对照组和实验组的反应液颜色情况，对照组颜色为浅灰色，实验组颜色为黑色(图1)。对反应液中黑色素进行纯化干燥后称重，对照组获得黑色素2mg，实验组获得黑色素89mg。体外反应体系为2.5mL，换算后体外反应液中黑色素含量分别为对照组0.8g/L，实验组35.6g/L。

结果分析：对照组体外反应也生成了少量黑色素，这是由于出芽短梗霉粗酶液中含有少量的聚酮合成酶，在体外酶反应条件下可以催化合成黑色素。实验组中通过添加重组聚酮合成酶，体外酶反应合成的黑色素产量为35.6g/L，是对照组的44.5倍。

对比例1：

以NCBI中记载的Aureobasidium melanogenum strain XJ5-1polyketidesynthase gene作为对比，该基因的Sequence ID:KT429644.1，序列长度为6498bp。按实施例2的方法将该基因在毕赤酵母SMD1168H中表达；按实施例3的方法在体外催化合成黑色素。经检测，黑色素的产量为14.6g/L。

对比例2：

以NCBI中记载的Aureobasidium namibiae CBS 147.97polyketide synthasepartial mRNA作为对比，该基因的Sequence ID:XM_013576562.1，序列长度为6495bp。按实施例2的方法将该基因在毕赤酵母SMD1168H中表达；按实施例3的方法在体外催化合成黑色素。经检测，黑色素的产量为0.9g/L。

由对比例1和对比例2可以看出，本发明的出芽短梗霉聚酮合成酶基因所编码的聚酮合成酶具有非常高的催化活性，通过将本发明的出芽短梗霉聚酮合成酶基因经重组表达，并用于体外合成黑色素，可以显著提高黑色素的产量。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术的技术人员在本发明批露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东大学；山东福瑞达医药集团公司

<120> 一种出芽短梗霉聚酮合成酶基因及其应用

<130> 2016

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 6492

<212> DNA

<213> 出芽短梗霉（Aureobasidium pullulans）

<400> 1

atgtctaacg ttcttctttt cggcgaccag accgccgagc agtaccctct gctccgcaag 60

gtggtcctga gaactaagaa tgctctcgtt ctcaacttcc tggagcgcac cgtcgtcgct 120

ctgcgaggag aaattgccca actctctcgc cctcagcgcg atgccattcc ggatttcatg 180

accctcaaca acttggtcga tctctactac gagaagggat tgaagcttcc tcaccttgag 240

agtgccctgg tcactatcgc ccagcttggc cactacatcg gatacttctc cgagaagact 300

aacgagcttc ctcctgctgc caacactcgc attcttgctc tctgcactgg atcactcgcc 360

gctgccgctg tcgcttccgc cagaactctt gatgagctcg tcactcttgg tgtcgagacc 420

gtccgcatcg ccttccgcac tggtgtccgc gtcaatgaag ccagaactgc tttgggccag 480

gacctcatgt ccagggagag ctggtctact attgtcactg gcattaacga gcagtccgcc 540

aaggaggctc tcaacgcttt ccacgagtct gctggcattc ccactaccag ccacgcttac 600

atcagcgctg ttagcaccat ggccatcact atcagtggtc ctcccaccat cactaagcgc 660

ttcttcgagg agtctgaggc tgttcgcaag aacaaccgtg ttaagatccc cgtttacgct 720

ccttaccacg ccgagcacct ctacagcagt gccgatatcg agaccgtcat tggcgaggag 780

tctgctaagc tcctccaggc ttaccagcct cgttcgttgg tccactccgg ctcatctggc 840

atgtgccaca ttgccgagaa caccttcgag ctgttcaagt tgtccctgaa cgacatgctc 900

agatcccctg ttggctggaa caacctcctc gaggagagtg tttcgcagat caccgccaac 960

accaacgctc ctgctaaggt cttctgcatt ggtgtcagca acgtatccaa cagcctcgtc 1020

tcggccatca aagctggtgg ccaggcctcg gtctccctcg ttgaccactc tgcctgggag 1080

tctgccgtca ctgatgccag ccacggtcgc acccagaacg acaagattgc catcgttggt 1140

atgtctggtc gtttccccag cgctgccagc accgaggctc tttgggaact tctcgagaag 1200

ggtctcgatg tccaccgcaa gattccctct gaccgtttcg atgccgacgc tcactgcgac 1260

ccctctggca agggcaagaa caagtcgcac actccttacg gttgctttat cgacgagcct 1320

ggtcttttcg accctcgctt cttcaacatg tctcctcgtg aggctgcaca gactgatcct 1380

atgggtcgtc tggctctcgt caccgcttac gaggctcttg agcaatctgg ttacgtcccc 1440

aaccgtactc cctccaccaa gcttcaccgc atcggtacct tctacggtca gacctctgac 1500

gattggcgtg agatcaacgc ttccgagaat gttgacacct acttcatcac tggtggtgtg 1560

cgtgctttcg cacctggtcg catcaactac tacttcaagt tcagtggtcc ttcgttctcg 1620

atcgatactg cttgttcgtc atctttggct gctattcagc ttgcctgcac ttcgctgtgg 1680

gccggtgact gcgacactgc ctgtgctggt ggtctgaacg tccttaccaa ccctgacatt 1740

ttctctggtc tttccaaggg tcaattcttg tccaagacag gttcttgcaa gacttacgac 1800

aacgctgccg atggttactg ccgtggtgat ggttgtggta ccgttgtcct caagagatac 1860

gaggatgcgc ttgccgacaa ggacaacatc ctcggatgca ttcttggcgc tgctaccaac 1920

cactctgctg aggctgtttc tattactcac cctcacgctg gcgctcagga gttcctttac 1980

aagaaggtcc tcgccaacgc tggtgtcgat gcccatgaga ttagctacgt cgagatgcac 2040

ggtactggta cccaggctgg tgatggtatt gagatgacct cagtcaccaa cgtcttcgct 2100

ccccgtcacc gccagcgcaa gcctgaggag aagctccacc ttggtgccat caaggccaac 2160

atcggccacg gtgaagccgc ttctggtatc aactccctct gcaaggtctt gatgatgatg 2220

aagaagaacg ccattcctgc caacgttggt atcaagggcg agatcaacaa gactttcccc 2280

aaggacttga aggaccgcaa tgtccacatt cctcagcagc agatcgactt cccccgcaac 2340

ggtgctgaga agcgcaagat cttcctcaac aacttctccg ctgctggtgg taacaccgcc 2400

atcctcctcg aggatggtcc tcttcgtgag gctcctaagg ctgttgaccc tagaggcact 2460

cttcccgtca ctgtaactgc ccgttcgatc gctgccttga agaacaacat tcagcgtctg 2520

cagggatacc tccgcgagaa ccccgagacc actcttccca gcttgtccta cacttcgact 2580

gcccgccgca tccagcacaa ctaccgcatc gccttcccca ttgctgatat tgccaaggtc 2640

agcgatgctc tgcaggccca aactaaggac acctacagcc cagtccccat ggtttctacc 2700

aagaccgcct tctgcttcac cggacagggc tcacagtaca ctgctcttgg tcagaagctc 2760

taccaagacc tcaagtcttt ccgtgacgac atcaaccagc tcgacaacat ggccaccatt 2820

cagggccttc cttcgttcat tgagctgctt gacggcactg atgtcgctac tctttcccct 2880

gtcaaggttc agctgggtat ggcttgtatt caggttgctc tcgctcgcat gtgggcttca 2940

tggggtatca ctcctaccgc tgtcattggc cacaacttgg gcgagtacgc tgctctccac 3000

gttgctggtg tcatctctgc cagcgacatg atcaccctcg ttggtcgtcg tgctgagctc 3060

cttgtcaagg actgcactcc tcacacccac ggtatgctcg ctgtcaaggg tggcgctgaa 3120

gccatccgtg acgtcctcgg ctccaagatg accgagattg cctgcatcaa cggtcctgag 3180

gagactgtac tttgcggtag tggcgaggtt gttagtgctg ccaacgagac tctttccgct 3240

cgcggcttca aggccaccaa gctcaatgtt cccttcgcct tccactcggc ccaggtcgac 3300

cctatcctcg agtccttcaa gaaggttgct tcctgcgtca ccttcaacaa gcccgctgtc 3360

cctgtcctct ctcccctttc cggagatgtc attcgcgagg ctggtgttat tggcccagac 3420

tacctcgcta gacacgccag agagactgtc aacttctgga ccgctctgac cactggtcag 3480

aaggagaaga tcttcgatga gaagactgct tggctcgagg ttggcgctca ccccgtctgc 3540

tctggcatgg tcaaggcttc tgtcggtgcc accgtcaccg ctccttcgct ccgtcgcaac 3600

gaggacccct ggaagactat cgccaccagt gtttgcgccc tcttcaacgc tggtgtccag 3660

atcaacttcg atgagtacca ccgtgaattc aatgctgctc aggaacttct tcctctgccc 3720

acctactctt tcgacaacaa gaagtactgg ctcgactacc agaacaactg gactcttacc 3780

aaaggtgagg cccgcgaggt ccagaagact attgaggccg cccctcaagc tgcccctgtc 3840

gtcgagaagc ccgctaagcg cctctccact tcctgtcaga aggttatcca cgaggagttc 3900

gaggccaact ctggtaccgt tgtcattcag tccaacgttg ccgagcccaa gctcttccag 3960

gctgtcattg gtcaccaagt caacgacact gccctctgcc cctcgtccct gtacgctgac 4020

atggcattga ctgtctgcga ctacctttac aagcagctca gaccctctgc ccccaagatt 4080

ggcatgaacg tctgcgagat ggaggtccct aagcccttca tcgccaagat ggagcagccc 4140

gctgaaggtc agcacatcca actcgaggcc aaggctgacc tcgacgaggg tgtcgctcat 4200

ttgaagttca gaagtgtcac tcccgatggc aagctcatcc aagaccatgc tcactgcctc 4260

gtcaagttcg aggacatcaa ctcctggaac gaggactggg agcgtatcaa cttcatggtc 4320

aagtctcaag tcgatgttct caaggctaag actaagactc aggaggctca tgtcatgcag 4380

cgcggtatgg cttacaagct cttcaagtgc ttcgtcaact acaacgagaa gtaccgtggt 4440

atggaggagg tcattgtcaa cagccagacc actgaggcta ctgcctccat caagttccag 4500

aacggcccca acgacggtga ctggtaccaa gccccttacc agattgacag catgtgccac 4560

atctcgggtt tcattgtcaa cgctactgac ctgattgact ctgacaacaa cgtctgcatc 4620

tcgcacggct ggggttcgat gagaattgcc aagcagatga ctcctgaggg caactatcgc 4680

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gagggagatg agatcgttgc cgtctgcggt ggtcttaagt tccagcagat ctttcgccgt 4800

gtcctgaacg tcttcctgcc tcctcagaag gctggagcac ctgccaaggc tgctgcccct 4860

gctgcccccg ctgctgcacc caaggcagtc gctgccccca aggctgccgc tcctaaggcc 4920

caggccccta agcctgttgt caaggctgct aaggctccca agaaggtcgc tgccaagaag 4980

cctcaaggcg ctaccatcac ttctcgtgtt atgcaaatca ttgctaccga gaccgatgtt 5040

gagcagtctg agcttgttga tgaggctgca ttcgagaatc ttggtgtcga ctccctcatg 5100

tccctgaccg tctctgcgaa gttcagagag gatcttgaca tggagatcag ctctactctt 5160

ttcactgact accctaccgt tggtgagatg aagaagtact tctctcagtt cgatggaaac 5220

gtcggcccag ttgaggatga ctctgaggac gagtctgagc cttcggacat cgccactcct 5280

tacgaggacg acctcagcac tcccgccagc tctgctccta gcactgctcc cagtgatgca 5340

ggaaagcctg acattgactc tcccactcgt gagatccctg actccgaggt tggtgaagtc 5400

agcctggctc gccacatcat cgttcaggag atgggaattg acagctccga acttactgac 5460

gaggctgacc tttctgagct cggtatggac tctttgatga gcttgaccat ccttagtgag 5520

cttcgcgaga agacgggtat cgatcttccc tcgaccttcc tctccaccaa ctctaccatc 5580

ttggacattg agaatgctct cggtatgcgc ccaaagccca aggccaaggc tgctgctgcc 5640

cccaaggccg caaagcagac ttcgcctcaa cttgacaaag tcaacgccaa gcttaccgat 5700

gtctccaagt tccccgccgc aacctcagtt cttctccagg gcaatgctaa gattgctacc 5760

aagaagatct tcttcctgcc cgacggttct ggctctgcta catcctatgt cagcattcct 5820

aacattggtc ctgatgttgc tgcctttgga ctcaactgcc ctttcatgaa gagccccact 5880

gactggactt gtggtatcga gactgtctct ctcctctacc ttgctgagat caagagacgc 5940

cagcctcaag gcccctacat catcggtggt tggtctgctg gtggtgtcat tgcctacgcc 6000

gttgctcagg ctctgcttgc caacggtgaa gaagtcgagc gcctgcttct tcttgactct 6060

ccttgccctg tcaaccttgc acctcttcct caacgtctcc acgtcttctt caacgagatt 6120

ggtctccttg gtactggtga cccgtccaag actcccaagt ggttgcttcc ccacttcagc 6180

gccgccattc gttcgctctc tgattacgag cctcaacctt cgttgaagcc tatcaagacc 6240

tacgctatct ggtgccgtga tggtgtcgct ggtaaccccg gtgaccctcg ccctccacca 6300

gctgaggagg aggaccctgc acccatgaag tggctgttga accaccgcac tgacttcact 6360

gacaacggtt gggctcagct ctgcggcaat gagatgaagt tcggtgttat gggcggcaac 6420

cacttcacca tgatgaagga gcctcatgca caagaactcg gcaagctcat ccaagaaggt 6480

cttcagatct aa 6492

<210> 2

<211> 2163

<212> PRT

<213> 出芽短梗霉（Aureobasidium pullulans）

<400> 2

Met Ser Asn Val Leu Leu Phe Gly Asp Gln Thr Ala Glu Gln Tyr Pro

1 5 10 15

Leu Leu Arg Lys Val Val Leu Arg Thr Lys Asn Ala Leu Val Leu Asn

20 25 30

Phe Leu Glu Arg Thr Val Val Ala Leu Arg Gly Glu Ile Ala Gln Leu

35 40 45

Ser Arg Pro Gln Arg Asp Ala Ile Pro Asp Phe Met Thr Leu Asn Asn

50 55 60

Leu Val Asp Leu Tyr Tyr Glu Lys Gly Leu Lys Leu Pro His Leu Glu

65 70 75 80

Ser Ala Leu Val Thr Ile Ala Gln Leu Gly His Tyr Ile Gly Tyr Phe

85 90 95

Ser Glu Lys Thr Asn Glu Leu Pro Pro Ala Ala Asn Thr Arg Ile Leu

100 105 110

Ala Leu Cys Thr Gly Ser Leu Ala Ala Ala Ala Val Ala Ser Ala Arg

115 120 125

Thr Leu Asp Glu Leu Val Thr Leu Gly Val Glu Thr Val Arg Ile Ala

130 135 140

Phe Arg Thr Gly Val Arg Val Asn Glu Ala Arg Thr Ala Leu Gly Gln

145 150 155 160

Asp Leu Met Ser Arg Glu Ser Trp Ser Thr Ile Val Thr Gly Ile Asn

165 170 175

Glu Gln Ser Ala Lys Glu Ala Leu Asn Ala Phe His Glu Ser Ala Gly

180 185 190

Ile Pro Thr Thr Ser His Ala Tyr Ile Ser Ala Val Ser Thr Met Ala

195 200 205

Ile Thr Ile Ser Gly Pro Pro Thr Ile Thr Lys Arg Phe Phe Glu Glu

210 215 220

Ser Glu Ala Val Arg Lys Asn Asn Arg Val Lys Ile Pro Val Tyr Ala

225 230 235 240

Pro Tyr His Ala Glu His Leu Tyr Ser Ser Ala Asp Ile Glu Thr Val

245 250 255

Ile Gly Glu Glu Ser Ala Lys Leu Leu Gln Ala Tyr Gln Pro Arg Ser

260 265 270

Leu Val His Ser Gly Ser Ser Gly Met Cys His Ile Ala Glu Asn Thr

275 280 285

Phe Glu Leu Phe Lys Leu Ser Leu Asn Asp Met Leu Arg Ser Pro Val

290 295 300

Gly Trp Asn Asn Leu Leu Glu Glu Ser Val Ser Gln Ile Thr Ala Asn

305 310 315 320

Thr Asn Ala Pro Ala Lys Val Phe Cys Ile Gly Val Ser Asn Val Ser

325 330 335

Asn Ser Leu Val Ser Ala Ile Lys Ala Gly Gly Gln Ala Ser Val Ser

340 345 350

Leu Val Asp His Ser Ala Trp Glu Ser Ala Val Thr Asp Ala Ser His

355 360 365

Gly Arg Thr Gln Asn Asp Lys Ile Ala Ile Val Gly Met Ser Gly Arg

370 375 380

Phe Pro Ser Ala Ala Ser Thr Glu Ala Leu Trp Glu Leu Leu Glu Lys

385 390 395 400

Gly Leu Asp Val His Arg Lys Ile Pro Ser Asp Arg Phe Asp Ala Asp

405 410 415

Ala His Cys Asp Pro Ser Gly Lys Gly Lys Asn Lys Ser His Thr Pro

420 425 430

Tyr Gly Cys Phe Ile Asp Glu Pro Gly Leu Phe Asp Pro Arg Phe Phe

435 440 445

Asn Met Ser Pro Arg Glu Ala Ala Gln Thr Asp Pro Met Gly Arg Leu

450 455 460

Ala Leu Val Thr Ala Tyr Glu Ala Leu Glu Gln Ser Gly Tyr Val Pro

465 470 475 480

Asn Arg Thr Pro Ser Thr Lys Leu His Arg Ile Gly Thr Phe Tyr Gly

485 490 495

Gln Thr Ser Asp Asp Trp Arg Glu Ile Asn Ala Ser Glu Asn Val Asp

500 505 510

Thr Tyr Phe Ile Thr Gly Gly Val Arg Ala Phe Ala Pro Gly Arg Ile

515 520 525

Asn Tyr Tyr Phe Lys Phe Ser Gly Pro Ser Phe Ser Ile Asp Thr Ala

530 535 540

Cys Ser Ser Ser Leu Ala Ala Ile Gln Leu Ala Cys Thr Ser Leu Trp

545 550 555 560

Ala Gly Asp Cys Asp Thr Ala Cys Ala Gly Gly Leu Asn Val Leu Thr

565 570 575

Asn Pro Asp Ile Phe Ser Gly Leu Ser Lys Gly Gln Phe Leu Ser Lys

580 585 590

Thr Gly Ser Cys Lys Thr Tyr Asp Asn Ala Ala Asp Gly Tyr Cys Arg

595 600 605

Gly Asp Gly Cys Gly Thr Val Val Leu Lys Arg Tyr Glu Asp Ala Leu

610 615 620

Ala Asp Lys Asp Asn Ile Leu Gly Cys Ile Leu Gly Ala Ala Thr Asn

625 630 635 640

His Ser Ala Glu Ala Val Ser Ile Thr His Pro His Ala Gly Ala Gln

645 650 655

Glu Phe Leu Tyr Lys Lys Val Leu Ala Asn Ala Gly Val Asp Ala His

660 665 670

Glu Ile Ser Tyr Val Glu Met His Gly Thr Gly Thr Gln Ala Gly Asp

675 680 685

Gly Ile Glu Met Thr Ser Val Thr Asn Val Phe Ala Pro Arg His Arg

690 695 700

Gln Arg Lys Pro Glu Glu Lys Leu His Leu Gly Ala Ile Lys Ala Asn

705 710 715 720

Ile Gly His Gly Glu Ala Ala Ser Gly Ile Asn Ser Leu Cys Lys Val

725 730 735

Leu Met Met Met Lys Lys Asn Ala Ile Pro Ala Asn Val Gly Ile Lys

740 745 750

Gly Glu Ile Asn Lys Thr Phe Pro Lys Asp Leu Lys Asp Arg Asn Val

755 760 765

His Ile Pro Gln Gln Gln Ile Asp Phe Pro Arg Asn Gly Ala Glu Lys

770 775 780

Arg Lys Ile Phe Leu Asn Asn Phe Ser Ala Ala Gly Gly Asn Thr Ala

785 790 795 800

Ile Leu Leu Glu Asp Gly Pro Leu Arg Glu Ala Pro Lys Ala Val Asp

805 810 815

Pro Arg Gly Thr Leu Pro Val Thr Val Thr Ala Arg Ser Ile Ala Ala

820 825 830

Leu Lys Asn Asn Ile Gln Arg Leu Gln Gly Tyr Leu Arg Glu Asn Pro

835 840 845

Glu Thr Thr Leu Pro Ser Leu Ser Tyr Thr Ser Thr Ala Arg Arg Ile

850 855 860

Gln His Asn Tyr Arg Ile Ala Phe Pro Ile Ala Asp Ile Ala Lys Val

865 870 875 880

Ser Asp Ala Leu Gln Ala Gln Thr Lys Asp Thr Tyr Ser Pro Val Pro

885 890 895

Met Val Ser Thr Lys Thr Ala Phe Cys Phe Thr Gly Gln Gly Ser Gln

900 905 910

Tyr Thr Ala Leu Gly Gln Lys Leu Tyr Gln Asp Leu Lys Ser Phe Arg

915 920 925

Asp Asp Ile Asn Gln Leu Asp Asn Met Ala Thr Ile Gln Gly Leu Pro

930 935 940

Ser Phe Ile Glu Leu Leu Asp Gly Thr Asp Val Ala Thr Leu Ser Pro

945 950 955 960

Val Lys Val Gln Leu Gly Met Ala Cys Ile Gln Val Ala Leu Ala Arg

965 970 975

Met Trp Ala Ser Trp Gly Ile Thr Pro Thr Ala Val Ile Gly His Asn

980 985 990

Leu Gly Glu Tyr Ala Ala Leu His Val Ala Gly Val Ile Ser Ala Ser

995 1000 1005

Asp Met Ile Thr Leu Val Gly Arg Arg Ala Glu Leu Leu Val Lys

1010 1015 1020

Asp Cys Thr Pro His Thr His Gly Met Leu Ala Val Lys Gly Gly

1025 1030 1035

Ala Glu Ala Ile Arg Asp Val Leu Gly Ser Lys Met Thr Glu Ile

1040 1045 1050

Ala Cys Ile Asn Gly Pro Glu Glu Thr Val Leu Cys Gly Ser Gly

1055 1060 1065

Glu Val Val Ser Ala Ala Asn Glu Thr Leu Ser Ala Arg Gly Phe

1070 1075 1080

Lys Ala Thr Lys Leu Asn Val Pro Phe Ala Phe His Ser Ala Gln

1085 1090 1095

Val Asp Pro Ile Leu Glu Ser Phe Lys Lys Val Ala Ser Cys Val

1100 1105 1110

Thr Phe Asn Lys Pro Ala Val Pro Val Leu Ser Pro Leu Ser Gly

1115 1120 1125

Asp Val Ile Arg Glu Ala Gly Val Ile Gly Pro Asp Tyr Leu Ala

1130 1135 1140

Arg His Ala Arg Glu Thr Val Asn Phe Trp Thr Ala Leu Thr Thr

1145 1150 1155

Gly Gln Lys Glu Lys Ile Phe Asp Glu Lys Thr Ala Trp Leu Glu

1160 1165 1170

Val Gly Ala His Pro Val Cys Ser Gly Met Val Lys Ala Ser Val

1175 1180 1185

Gly Ala Thr Val Thr Ala Pro Ser Leu Arg Arg Asn Glu Asp Pro

1190 1195 1200

Trp Lys Thr Ile Ala Thr Ser Val Cys Ala Leu Phe Asn Ala Gly

1205 1210 1215

Val Gln Ile Asn Phe Asp Glu Tyr His Arg Glu Phe Asn Ala Ala

1220 1225 1230

Gln Glu Leu Leu Pro Leu Pro Thr Tyr Ser Phe Asp Asn Lys Lys

1235 1240 1245

Tyr Trp Leu Asp Tyr Gln Asn Asn Trp Thr Leu Thr Lys Gly Glu

1250 1255 1260

Ala Arg Glu Val Gln Lys Thr Ile Glu Ala Ala Pro Gln Ala Ala

1265 1270 1275

Pro Val Val Glu Lys Pro Ala Lys Arg Leu Ser Thr Ser Cys Gln

1280 1285 1290

Lys Val Ile His Glu Glu Phe Glu Ala Asn Ser Gly Thr Val Val

1295 1300 1305

Ile Gln Ser Asn Val Ala Glu Pro Lys Leu Phe Gln Ala Val Ile

1310 1315 1320

Gly His Gln Val Asn Asp Thr Ala Leu Cys Pro Ser Ser Leu Tyr

1325 1330 1335

Ala Asp Met Ala Leu Thr Val Cys Asp Tyr Leu Tyr Lys Gln Leu

1340 1345 1350

Arg Pro Ser Ala Pro Lys Ile Gly Met Asn Val Cys Glu Met Glu

1355 1360 1365

Val Pro Lys Pro Phe Ile Ala Lys Met Glu Gln Pro Ala Glu Gly

1370 1375 1380

Gln His Ile Gln Leu Glu Ala Lys Ala Asp Leu Asp Glu Gly Val

1385 1390 1395

Ala His Leu Lys Phe Arg Ser Val Thr Pro Asp Gly Lys Leu Ile

1400 1405 1410

Gln Asp His Ala His Cys Leu Val Lys Phe Glu Asp Ile Asn Ser

1415 1420 1425

Trp Asn Glu Asp Trp Glu Arg Ile Asn Phe Met Val Lys Ser Gln

1430 1435 1440

Val Asp Val Leu Lys Ala Lys Thr Lys Thr Gln Glu Ala His Val

1445 1450 1455

Met Gln Arg Gly Met Ala Tyr Lys Leu Phe Lys Cys Phe Val Asn

1460 1465 1470

Tyr Asn Glu Lys Tyr Arg Gly Met Glu Glu Val Ile Val Asn Ser

1475 1480 1485

Gln Thr Thr Glu Ala Thr Ala Ser Ile Lys Phe Gln Asn Gly Pro

1490 1495 1500

Asn Asp Gly Asp Trp Tyr Gln Ala Pro Tyr Gln Ile Asp Ser Met

1505 1510 1515

Cys His Ile Ser Gly Phe Ile Val Asn Ala Thr Asp Leu Ile Asp

1520 1525 1530

Ser Asp Asn Asn Val Cys Ile Ser His Gly Trp Gly Ser Met Arg

1535 1540 1545

Ile Ala Lys Gln Met Thr Pro Glu Gly Asn Tyr Arg Ser Cys Val

1550 1555 1560

Arg Met Leu Pro Lys Pro Gly Asn Ile Tyr Gln Gly Asp Val Tyr

1565 1570 1575

Ile Met Glu Gly Asp Glu Ile Val Ala Val Cys Gly Gly Leu Lys

1580 1585 1590

Phe Gln Gln Ile Phe Arg Arg Val Leu Asn Val Phe Leu Pro Pro

1595 1600 1605

Gln Lys Ala Gly Ala Pro Ala Lys Ala Ala Ala Pro Ala Ala Pro

1610 1615 1620

Ala Ala Ala Pro Lys Ala Val Ala Ala Pro Lys Ala Ala Ala Pro

1625 1630 1635

Lys Ala Gln Ala Pro Lys Pro Val Val Lys Ala Ala Lys Ala Pro

1640 1645 1650

Lys Lys Val Ala Ala Lys Lys Pro Gln Gly Ala Thr Ile Thr Ser

1655 1660 1665

Arg Val Met Gln Ile Ile Ala Thr Glu Thr Asp Val Glu Gln Ser

1670 1675 1680

Glu Leu Val Asp Glu Ala Ala Phe Glu Asn Leu Gly Val Asp Ser

1685 1690 1695

Leu Met Ser Leu Thr Val Ser Ala Lys Phe Arg Glu Asp Leu Asp

1700 1705 1710

Met Glu Ile Ser Ser Thr Leu Phe Thr Asp Tyr Pro Thr Val Gly

1715 1720 1725

Glu Met Lys Lys Tyr Phe Ser Gln Phe Asp Gly Asn Val Gly Pro

1730 1735 1740

Val Glu Asp Asp Ser Glu Asp Glu Ser Glu Pro Ser Asp Ile Ala

1745 1750 1755

Thr Pro Tyr Glu Asp Asp Leu Ser Thr Pro Ala Ser Ser Ala Pro

1760 1765 1770

Ser Thr Ala Pro Ser Asp Ala Gly Lys Pro Asp Ile Asp Ser Pro

1775 1780 1785

Thr Arg Glu Ile Pro Asp Ser Glu Val Gly Glu Val Ser Leu Ala

1790 1795 1800

Arg His Ile Ile Val Gln Glu Met Gly Ile Asp Ser Ser Glu Leu

1805 1810 1815

Thr Asp Glu Ala Asp Leu Ser Glu Leu Gly Met Asp Ser Leu Met

1820 1825 1830

Ser Leu Thr Ile Leu Ser Glu Leu Arg Glu Lys Thr Gly Ile Asp

1835 1840 1845

Leu Pro Ser Thr Phe Leu Ser Thr Asn Ser Thr Ile Leu Asp Ile

1850 1855 1860

Glu Asn Ala Leu Gly Met Arg Pro Lys Pro Lys Ala Lys Ala Ala

1865 1870 1875

Ala Ala Pro Lys Ala Ala Lys Gln Thr Ser Pro Gln Leu Asp Lys

1880 1885 1890

Val Asn Ala Lys Leu Thr Asp Val Ser Lys Phe Pro Ala Ala Thr

1895 1900 1905

Ser Val Leu Leu Gln Gly Asn Ala Lys Ile Ala Thr Lys Lys Ile

1910 1915 1920

Phe Phe Leu Pro Asp Gly Ser Gly Ser Ala Thr Ser Tyr Val Ser

1925 1930 1935

Ile Pro Asn Ile Gly Pro Asp Val Ala Ala Phe Gly Leu Asn Cys

1940 1945 1950

Pro Phe Met Lys Ser Pro Thr Asp Trp Thr Cys Gly Ile Glu Thr

1955 1960 1965

Val Ser Leu Leu Tyr Leu Ala Glu Ile Lys Arg Arg Gln Pro Gln

1970 1975 1980

Gly Pro Tyr Ile Ile Gly Gly Trp Ser Ala Gly Gly Val Ile Ala

1985 1990 1995

Tyr Ala Val Ala Gln Ala Leu Leu Ala Asn Gly Glu Glu Val Glu

2000 2005 2010

Arg Leu Leu Leu Leu Asp Ser Pro Cys Pro Val Asn Leu Ala Pro

2015 2020 2025

Leu Pro Gln Arg Leu His Val Phe Phe Asn Glu Ile Gly Leu Leu

2030 2035 2040

Gly Thr Gly Asp Pro Ser Lys Thr Pro Lys Trp Leu Leu Pro His

2045 2050 2055

Phe Ser Ala Ala Ile Arg Ser Leu Ser Asp Tyr Glu Pro Gln Pro

2060 2065 2070

Ser Leu Lys Pro Ile Lys Thr Tyr Ala Ile Trp Cys Arg Asp Gly

2075 2080 2085

Val Ala Gly Asn Pro Gly Asp Pro Arg Pro Pro Pro Ala Glu Glu

2090 2095 2100

Glu Asp Pro Ala Pro Met Lys Trp Leu Leu Asn His Arg Thr Asp

2105 2110 2115

Phe Thr Asp Asn Gly Trp Ala Gln Leu Cys Gly Asn Glu Met Lys

2120 2125 2130

Phe Gly Val Met Gly Gly Asn His Phe Thr Met Met Lys Glu Pro

2135 2140 2145

His Ala Gln Glu Leu Gly Lys Leu Ile Gln Glu Gly Leu Gln Ile

2150 2155 2160

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

atgtctaacg ttcttctttt 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

gatctgaaga ccttcttgga 20

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

gcgccgcggc atgtctaacg ttcttctttt 30

<210> 6

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

gcgtctagaa tgatctgaag accttcttgg a 31

Claims (11)

1. 一种出芽短梗霉聚酮合成酶基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2. 由权利要求1所述的出芽短梗霉聚酮合成酶基因编码的聚酮合成酶，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.含有权利要求1所述的出芽短梗霉聚酮合成酶基因的重组表达载体。

4.如权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体为将权利要求1的出芽短梗霉聚酮合成酶基因插入到pGAPZα-A表达载体的多克隆位点得到重组质粒。

5.含有权利要求1所述的出芽短梗霉聚酮合成酶基因的表达盒。

6.含有权利要求3或4所述的重组表达载体的转基因细胞系或重组菌。

7.如权利要求6所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌是将权利要求3或4所述的重组表达载体转化毕赤酵母SMD1168H得到的重组菌。

8.权利要求1所述的出芽短梗霉聚酮合成酶基因和/或权利要求2所述的聚酮合成酶在黑色素体外合成中的应用。

9.一种黑色素体外合成的方法，包括如下步骤：发酵培养权利要求6所述重组菌，收集发酵上清液，沉淀上清液中的蛋白质，再对蛋白沉淀进行脱盐和浓缩，即得聚酮合成酶粗酶液；将聚酮合成酶粗酶液与出芽短梗霉粗酶液、丙二酰辅酶A混合，调节pH至8.0，38~40℃条件下反应，反应期间进行充分供氧，反应40~60分钟；反应结束后，调节pH至2.0~3.0，离心，收集沉淀，得到黑色素粗产物。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述出芽短梗霉粗酶液为出芽短梗霉新鲜菌体经液氮研磨破壁，用磷酸钠缓冲液重溶菌粉，离心，获得的上清液。

11.如权利要求9所述的方法，其特征在于，还包括：将黑色素粗产物进行纯化的步骤，具体如下：将黑色素粗产物溶于NaOH中，加入酸性甲醇，静置，离心，收集沉淀，将沉淀用蒸馏水洗涤至中性，烘干，即得黑色素。