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CN106701761A - 长链非编码rna nr‑027469.1及制剂或诊断剂或药物或试剂盒和应用 - Google Patents

长链非编码rna nr‑027469.1及制剂或诊断剂或药物或试剂盒和应用 Download PDF

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CN106701761A
CN106701761A CN201611123967.4A CN201611123967A CN106701761A CN 106701761 A CN106701761 A CN 106701761A CN 201611123967 A CN201611123967 A CN 201611123967A CN 106701761 A CN106701761 A CN 106701761A
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long
coding rna
chain non
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medicine
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CN201611123967.4A
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李晓梅
杨毅宁
翟慧
马依彤
刘芬
陈邦党
廖武
陈清杰
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Original Assignee
First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University
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Abstract

本发明涉及基因工程技术领域，是一种长链非编码RNA NR‑027469.1及制剂或诊断剂或药物或试剂盒及检测其的方法及其应用；该长链非编码RNA NR‑027469.1的序列如SEQ ID NO:1所示。本发明利用长链非编码表达谱芯片技术，通过差异分析，筛选到一条在稳定型心绞痛患者血液中显著低表达的长链非编码RNA NR‑027469.1，进一步丰富了稳定型心绞痛发病机制的研究。

Description

长链非编码RNA NR-027469.1及制剂或诊断剂或药物或试剂 盒和应用
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，是一种长链非编码RNA NR-027469.1及制剂或诊断剂或药物或试剂盒及检测其的方法及其应用，即长链非编码RNA NR-027469.1及制剂或诊断剂或药物或试剂盒和应用。
背景技术
稳定型心绞痛(stable angina pectoris,SAP)是指心绞痛发作的程度、频度、性质及诱发因素在数周内无显著变化的患者，是冠心病中较为常见的类型。在我国，随着人民生活水平的提高，生活方式的改变以及生活节奏的加快，心绞痛的发病率逐年增高。稳定型心绞痛的早期诊断对于预防心绞痛发展为临床心血管事件具有重要价值，可以提高心绞痛患者的生存率并能够改善长期预后。血清心肌标志物对评估SAP危险性可提供有价值的信息，非ST段抬高的SAP患者约30％cTnI或cTnT升高，目前仍然缺乏有效SAP的血清标志物。因此，寻找能够早期诊断SAP患者并有较高敏感性及特异性的新的生物标志物显得尤为必要。
长链非编码RNA(long non-coding RNAs，lncRNA)是一类转录本长度超过200nt的RNA分子，一般不编码蛋白，由RNA聚合酶II转录并经可变剪切形成，转录水平低于蛋白质编码基因，曾一度被认为是基因组转录的“噪音”。已证实，长链非编码RNA在表观遗传学、转录调控、转录后调控等多种层面调控基因表达，在多种生物学进程中发挥重要作用，包括脂肪代谢、动脉粥样硬化形成、胚胎发育及肿瘤的发生等。
发明内容
本发明提供了一种长链非编码RNA NR-027469.1的制剂或诊断剂或药物或试剂盒，克服了上述现有技术之不足，其能有效解决稳定型心绞痛的早期诊断对于预防心绞痛发展为临床心血管事件具有重要价值，可以提高心绞痛患者的生存率并能够改善长期预后，寻找能够早期诊断稳定型心绞痛患者并有较高敏感性及特异性的新的生物标志物显得尤为必要的问题，本发明发现其表达或功能异常与人类心血管疾病的发生和发展密切相关，长链非编码RNA有望成为心血管疾病诊断、预测预后的标志物，同时也为心血管病的治疗提供了新的靶点。
本发明的技术方案之一是通过以下措施来实现的：一种在稳定型心绞痛患者血液中低表达的长链非编码RNA NR-027469.1，该长链非编码RNA NR-027469.1的序列如SEQ IDNO:1所示。
下面是对上述发明技术方案之一的进一步优化或/和改进：
上述该长链非编码长链非编码RNA NR-027469.1为NR-027469.1:1的全长或片段。
本发明的技术方案之二是通过以下措施来实现的：一种体外检测血液中长链非编码RNA NR-027469.1的制剂或诊断剂或药物或试剂盒，该制剂或诊断剂或药物或试剂盒包括特异性引物对、标准DNA模板、PCR反应液，其中，特异性引物对包括上游引物和下游引物，上游引物的核苷酸序列为SEQ ID No:2，下游引物的核苷酸序列为SEQ ID No:3。
下面是对上述发明技术方案之二的进一步优化或/和改进：
上述该试剂盒为荧光定量PCR检测试剂盒。
上述特异性引物对用于SYBR Green、Taqman探针、分子信标、双杂交探针、复合探针的检测。
上述PCR反应液为荧光定量PCR反应液。
上述荧光定量PCR反应液包括dNTP、Mg2+、Taq酶。
上述还包括荧光染料。
本发明的技术方案之三是通过以下措施来实现的：一种检测根据技术方案之一所述的长链非编码RNA NR-027469.1的方法，按下述步骤进行：第一步，提取血液总RNA；第二步，制备cDNA；第三步，定量扩增长链非编码RNA NR-027469.1。
本发明的技术方案之四是通过以下措施来实现的：一种根据技术方案之一所述的长链非编码RNA NR-027469.1在制备用于检测稳定型心绞痛的试剂盒或用作检测稳定型心绞痛药物的新靶点的应用。
本发明利用长链非编码表达谱芯片技术，通过差异分析，筛选到一条在稳定型心绞痛患者血液中显著低表达的长链非编码RNA NR-027469.1，进一步丰富稳定型心绞痛发病机制的研究，同时，本发明所述的体外检测稳定型心绞痛相关基因即长链非编码RNA NR-027469.1的试剂以及本发明所述的体外检测稳定型心绞痛相关基因即长链非编码RNA NR-027469.1的试剂盒能够用于本发明所述的长链非编码RNA NR-027469.1的表达水平的检测，通过本发明所述的长链非编码RNA NR-027469.1的表达水平的检测结果获知稳定型心绞痛的筛查结果，为稳定型心绞痛的诊断和治疗提供了新方向。
附图说明
附图1为本发明中长链非编码RNA表达谱芯片检测NR-027469.1在健康对照组与稳定型心绞痛组中的检测信号值。
附图2为本发明中针对长链非编码RNA NR-027469.1的序列设计的一对特异性引物PCR扩增后行琼脂糖凝胶电泳测试引物的效果。
附图3为本发明中qRT-PCR检测RNA NR-027469.1在健康对照组与稳定型心绞痛组中的相对表达量。
具体实施方式
本发明不受下述实施例的限制，可根据本发明的技术方案与实际情况来确定具体的实施方式。
在本发明中，为了便于描述，各部件的相对位置关系的描述均是根据说明书附图1的布图方式来进行描述的，如：上、下、左、右等的位置关系是依据说明书附图的布图方向来确定的。
本发明利用长链非编码表达谱芯片技术，通过差异分析，筛选到一条在稳定型心绞痛患者血液中显著低表达的长链非编码RNA NR-027469.1，其转录区域位于1号染色体，起始位置为143,718,512-143,744,587，全长26,076bp。与健康人的血液含量相比，长链非编码RNA NR-027469.1在稳定型心绞痛患者血液中显著低表达，并在样本的荧光定量实验中进一步证实长链非编码RNA NR-027469.1在稳定型心绞痛患者血液中显著低于健康人。这一新型的长链非编码RNA NR-027469.1将进一步丰富稳定型心绞痛发病机制的研究，也为稳定型心绞痛的早期诊断及预后监测提供了新的血液分子标志物和治疗靶点。
发明人提供的稳定型心绞痛患者和健康人的血液标本各5个，共10例。通过ABI公司的Trizol试剂(货号15596-026)所需步骤提取总RNA后，采用北京博奥生物工程有限公司的芯片产品(Agilent human lncRNA+mRNA Array V4.0)进行检测，筛选出一条在稳定型心绞痛患者血液中显著低表达的长链非编码RNA NR-027469.1，其核酸序列如SEQ ID No.1所示。后期经过对样本进行荧光定量PCR验证，发现6个样本中稳定型心绞痛患者显著低于健康人。长链非编码RNA NR-027469.1作为稳定型心绞痛的新靶点，为稳定型心绞痛的临床治疗和药物开发提供理论基础。
实施例1，一种在稳定型心绞痛患者血液中低表达的长链非编码RNA NR-027469.1，该长链非编码RNA NR-027469.1的序列如SEQ ID NO:1所示。该长链非编码RNANR-027469.1可丰富稳定型心绞痛发病机制的研究，并可对其进行早期诊断。
实施例2，作为实施例1的优化，该长链非编码长链非编码RNA NR-027469.1为NR-027469.1:1的全长或片段。
实施例3，一种体外检测血液中根据实施例1和实施例2所述的长链非编码RNA NR-027469.1的制剂或诊断剂或药物或试剂盒，该制剂或诊断剂或药物或试剂盒包括特异性引物对、标准DNA模板、PCR反应液，其中，特异性引物对包括上游引物和下游引物，上游引物的核苷酸序列为SEQ ID No:2，下游引物的核苷酸序列为SEQ ID No:3。该长链非编码RNA NR-027469.1的制剂或诊断剂或药物或试剂盒能够更方便的对稳定型心绞痛的血清标志物进行诊断和预测。
实施例4，作为实施例3的优化，该试剂盒为荧光定量PCR检测试剂盒。
实施例5，作为实施例3或实施例4的优化，特异性引物对用于SYBR Green、Taqman探针、分子信标、双杂交探针、复合探针的检测。
实施例6，作为实施例3、实施例4和实施例5的优化，PCR反应液为荧光定量PCR反应液。
实施例7，作为实施例6的优化，荧光定量PCR反应液包括dNTP、Mg2+、Taq酶。
实施例8，作为实施例3、实施例4、实施例5、实施例6和实施例7的优化，该试剂盒还包括荧光染料。
该体外检测稳定型心绞痛的染料类荧光定量PCR试剂盒的使用方法，荧光定量PCR体系：
上游引物、下游引物各0.25ul(10uM)；DNA模板cDNA 0.5ul；Power SYBR GreenPCR Master(2×)5ul，加Nuclease-Free Water4ul，总容量10ul。荧光定量PCR程序：第一步95℃10分钟；第2步，95℃15S，60℃1分钟；第三步，95℃15S，60℃1分钟，95℃15S，共40个循环。
实施例9，一种检测根据实施例1和实施例2所述的长链非编码RNA NR-027469.1的方法，按下述步骤进行：第一步，提取血液总RNA；第二步，制备cDNA；第三步，定量扩增长链非编码RNA NR-027469.1。
所述方法具体包括如下步骤：
一、提取血液总RNA：按照ABI公司的Trizol试剂(货号15596-026)所需试剂及步骤提取总RNA，再用7300real time PCR system核酸定量仪定量(Applied Biosystems AB)定量所提取的的纯度和浓度。
二、制备样品cDNA：采用北京天根生化科技公司FastQuant cDNA第一链合成试剂盒试剂盒(货号KR106)对提取的总RNA反转录合成cDNA。
1、将模板RNA在冰上解冻；5×gDNA Buffer、FQ-RT Primer Mix、10×Fast RTBuffer、RNase-Free ddH2O在室温(15-25℃)解冻，解冻后迅速置于冰上。使用前将每种溶液涡旋振荡混匀，简短离心以收集残留在管壁的液体。
2、打开二级结构，反应体系及条件如表1所示；
将上述组分的基因组DNA的去除体系配制混合液，彻底混匀。简短离心，并置于42℃，孵育3min。然后置于冰上放置。
3、反转录反应，反应体系及条件如表2所示；
将反转录反应中的Mix，加到gDNA去除步骤的反应液中，充分混匀。42℃，孵育15min。95℃，孵育3min之后放于冰上，得到的cDNA可用于后续实验，或低温保存。
三、扩增长链非编码RNA NR-027469.1：采用ABI公司的Power SYBR Green PCRMaster Mix荧光定量试剂盒(货号4367659)，以反转录的cDNA为模板进行荧光定量PCR扩增。
荧光定量PCR体系如表3所示；
荧光定量PCR程序：第一步95℃10分钟；第2步，95℃15S，60℃1分钟；第三步，95℃15S，60℃1分钟，95℃15S，共40个循环。
实施例10，一种根据实施例1和实施例2所述的长链非编码RNA NR-027469.1在制备用于检测稳定型心绞痛的试剂盒或用作检测稳定型心绞痛药物的新靶点的应用。
用于检测稳定型心绞痛的方法，所述方法包括以下步骤：
第一步，提取血液总RNA；
第二步，制备样品cDNA；
第三步，扩增长链非编码RNA NR-027469.1，并根据相对定量结果进行判断。
实施例11：稳定型心绞痛患者与健康人血液的长链非编码RNA芯片表达分析。
一、材料和方法
1.材料
血液样本来自于稳定型心绞痛患者与健康人血液样本各5个。
2.方法
(1)稳定型心绞痛患者与健康人血液样本总RNA的提取：按照博奥生物技术有限公司提供的“用于基因芯片分析的血液样品的准备步骤”提取稳定型心绞痛患者与健康人血液样本总RNA。具体实验材料包括：淋巴细胞分离液(天津TBD生物技术发展中心)；灭菌生理盐水(普通0.9％生理盐水灭菌即可)；Trizol试剂(Invitrogen公司)。
(2)lncRNA+mRNA表达谱芯片检测以待检测样品的总RNA为起始，进行体外扩增和荧光标记，标记过程采用生物芯片通用标记试剂盒。主要包括如下步骤：
1)反转录合成第一链cDNA：以Total RNA起始，含有T7启动子序列的T7 Oligo(dT)Primer和T7-随机引物，既可以结合带poly(A)的mRNA，也可以结合除rRNA以外其它不带poly(A)的RNA，使用第一链Enzyme Mix合成第一链cDNA。
2)合成第二链DNA：用第二链Enzyme Mix将DNA-RNA杂合体中的RNA链转化为第二链cDNA，合成双链DNA。
3)体外转录合成cRNA：以第二链cDNA为模板，利用T7Enzyme Mix合成cRNA。
4)cRNA纯化：使用RNA纯化柱纯化cRNA，除去反应中的盐、酶等试剂，并对cRNA进行定量、质控。
5)反转录：以cRNA为模板，Random Primer为引物，CbcScriptⅡ酶进行反转录。纯化回收反转录得到的cDNA并定量。
6)标记：以反转录的cDNA产物为模板，Random Primer为引物，用Klenow Fragment酶合成cDNA互补链并掺入带有荧光基团的dNTP(Cy3-dCTP、Cy5-dCTP)，纯化并定量标记产物。带有荧光基团DNA即可用于芯片杂交。
7)芯片杂交及清洗：取1μLcDNA溶于杂交液，45℃杂交过夜。取出芯片在博奥SlideWasher8芯片洗干仪进行清洗，清洗程序如下：洗液I：0.2％SDS，2×SSC,42℃120S清洗2遍。洗液II：0.2％SDS，2×SSC,42℃80S清洗3遍。
清洗程序完成后，离心甩干，待扫描。
8)芯片扫描，数据分析，差异基因筛选：使用Agilent芯片扫描仪(G2565CA)对清洗后的芯片进行扫描，得到杂交图片。使用Agilent Feature Extraction(v10.7)软件对杂交图片进行分析并提取数据。然后使用Agilent GeneSpring软件对数据进行归一化和差异分析，并用GeneSpring GX软件进行差异基因筛选。
二、结果
长链非编码表达谱芯片检测NR-027469.1在健康对照组与稳定型心绞痛组中的检测信号值如附图1所示。芯片筛查发现多条表达上调和表达下调的lncRNAs。其中长链非编码RNA NR-027469.1显示出在稳定型心绞痛患者中表达显著下调，Fc值为1.557倍，其中，由图上可知，P小于0.05，具有统计学意义。鉴于其可能在稳定型心绞痛患者中存在特异性表达，本发明通过以下实施例采用芯片检测的样本进行指标的重复验证。
实施例12：qRT-PCR重复验证长链非编码RNA NR-027469.1在稳定型心绞痛患者和健康人中的差异表达。
一、实验材料
选取芯片测试的样本，对长链非编码RNA NR-027469.1的表达差异进行qRT-PCR验证。
二、实验方法和结果
1.引物特异性鉴定
(1)特异性引物的设计：从Ensemble数据库提取长链非编码RNA NR-027469.1相关的转录本序列，并用根据转录本的序列通过NCBI的引物设计工具(Primer BLAST)设计引物；
设计后的引物序列如下：
上游引物：SEQ ID No:2
下游引物：SEQ ID No:3
(2)将稳定型心绞痛患者与健康人血液按照ABI公司的Trizol试剂(货号15596-026)所需试剂及步骤提取总RNA，再用7300real time PCR system核酸定量仪定量(Applied Biosystems AB)定量所提取的的纯度和浓度。
采用北京天根生化科技公司FastQuant cDNA第一链合成试剂盒试剂盒(货号KR106)对提取的总RNA反转录合成cDNA。
第一步将模板RNA在冰上解冻；5×gDNA Buffer、FQ-RT Primer Mix、10×Fast RTBuffer、RNase-Free ddH2O在室温(15-25℃)解冻，解冻后迅速置于冰上。使用前将每种溶液涡旋振荡混匀，简短离心以收集残留在管壁的液体。
第二步打开二级结构，反应体系及条件如表4所示，
将上述组分的基因组DNA的去除体系配制混合液，彻底混匀。简短离心，并置于42℃，孵育3min。然后置于冰上放置。
第三步反转录反应，反应体系及条件如表5所示：
将反转录反应中的Mix，加到gDNA去除步骤的反应液中，充分混匀。42℃，孵育15min。95℃，孵育3min之后放于冰上，得到的cDNA可用于后续实验，或低温保存。
(3)扩增长链非编码RNA NR-027469.1：采用ABI公司的Power SYBR Green PCRMaster Mix荧光定量试剂盒(货号4367659)，以反转录的cDNA为模板进行荧光定量PCR扩增。
荧光定量PCR体系如表6所示；
荧光定量PCR程序：第一步95℃10分钟；第2步，95℃15S，60℃1分钟；第三步，95℃15S，60℃1分钟，95℃15S，共40个循环。
电泳检测，选用0120000Marker(北京康为世纪生物科技有限公司，货号CW0632)结果如附图2所示：扩增片段大小与预期相同，扩增产物只有一个条带。该引物对符合上述标准。上游的特异性引物，其序列见序列表SEQ ID No.2，下游的特异性引物，其序列见序列表SEQ ID No.2。
2.标准DNA模板的制备
根据长链非编码RNA NR-027469.1碱基序列(其核酸序列如序列表SEQ ID No.1所示)，委托上海生工合成。
取样2ul合成产物，连接到Puc-TTA克隆载体(北京康为世纪生物科技有限公司，货号CW0801)，随后转化到DH5a感受态细胞中。通过序列为SEQ ID No.2和SEQ ID No.3的特异性引物筛选阳性克隆，提取质粒DNA，质粒DNA用7300real time PCR system核酸定量仪定量，并做10倍系列稀释作为标准曲线(标准DNA模板浓度范围在102-106拷贝/ul)。
3.敏感性实验将标准
将标准DNA模板质粒按比例稀释为102、103、104、105、106拷贝/ul，进行荧光定量PCR检测灵敏度。最低检出浓度为102拷贝/ul。
4.合成cRNA模板
取上述稳定型心绞痛和健康人的总RNA各5个，采用北京天根生化科技公司FastQuant cDNA第一链合成试剂盒试剂盒(货号KR 106)对提取的总RNA反转录合成cDNA。
第一步将模板RNA在冰上解冻；5×gDNA Buffer、FQ-RT Primer Mix、10×Fast RTBuffer、RNase-Free ddH2O在室温(15-25℃)解冻，解冻后迅速置于冰上。使用前将每种溶液涡旋振荡混匀，简短离心以收集残留在管壁的液体。
第二步打开二级结构，反应体系及条件如表7所示：
将上述组分的基因组DNA的去除体系配制混合液，彻底混匀。简短离心，并置于42℃，孵育3min。然后置于冰上放置。
第三步反转录反应，反应体系及条件如表8所示：
将反转录反应中的Mix，加到gDNA去除步骤的反应液中，充分混匀。42℃，孵育15min。95℃，孵育3min之后放于冰上，得到的cDNA可用于后续实验，或低温保存。
5.荧光定量PCR检测长链非编码RNA NR-027469.1
采用ABI公司的Power SYBR Green PCR Master Mix荧光定量试剂盒(货号4367659)，以反转录的cDNA为模板进行荧光定量PCR扩增。
荧光定量PCR体系如表9所示：
荧光定量PCR程序：第一步95℃10分钟；第2步，95℃15S，60℃1分钟；第三步，95℃15S，60℃1分钟，95℃15S，共40个循环。
qRT-PCR检测稳定型心绞痛患者中长链非编码RNA NR-027469.1的相对表达量如附图3所示。根据qRT-PCR的相对定量公式：2-△△ct，分别计算出长链非编码RNA NR-027469.1在稳定型心绞痛患者和健康人中的表达水平，结果所示稳定型心绞痛患者与健康人的长链非编码RNA NR-027469.1表达水平比较，其2-△△ct平均值为0.53。以上结果说明，长链非编码RNA NR-027469.1在稳定型心绞痛患者血液中普遍低表达，这与前面所述的长链非编码RNA芯片结果NR-027469.1下调1.557倍相一致，其中，由图中可知，P小于0.05，具有统计学意义。因此，长链非编码RNA NR-027469.1可以作为稳定型心绞痛诊断的新的血液生物标志物，用于稳定型心绞痛的筛查。
以上技术特征构成了本发明的实施例，其具有较强的适应性和实施效果，可根据实际需要增减非必要的技术特征，来满足不同情况的需求。
表1
试剂 用量
5×gDNA Buffer 2ul
总RNA 1-2ug
DEPC水 补足至10uL
表2
试剂 用量
10×Fast RT Buffer 2ul
RT Enzyme Mix 1ul
FQ-RT Primer Mix 2ul
RNase-Free ddH2O 补足到10μl
表3
试剂 用量
Power SYBR Green PCR Master(2×) 5ul
cDNA样品 0.5ul
Forward Primer(10μM) 0.25ul
Reverse Primer(10μM) 0.25ul
Nuclease-Free Water 4ul
总容量 10ul
表4
试剂 用量
5×gDNA Buffer 2ul
总RNA 1-2ug
DEPC水 补足至10uL
表5
试剂 用量
10×Fast RT Buffer 2ul
RT Enzyme Mix 1ul
FQ-RT Primer Mix 2ul
RNase-Free ddH2O 补足到10μl
表6
试剂 用量
Power SYBR Green PCR Master(2×) 5ul
cDNA样品 0.5ul
Forward Primer(10μM) 0.25ul
Reverse Primer(10μM) 0.25ul
Nuclease-Free Water 4ul
总容量 10ul
表7
试剂 用量
5×gDNA Buffer 2ul
总RNA 1-2ug
DEPC水 补足至10uL
表8
试剂 用量
10×Fast RT Buffer 2ul
RT Enzyme Mix 1ul
FQ-RT Primer Mix 2ul
RNase-Free ddH2O 补足到10μl
表9
试剂 用量
Power SYBR Green PCR Master(2×) 5ul
cDNA样品 0.5ul
Forward Primer(10μM) 0.25ul
Reverse Primer(10μM) 0.25ul
Nuclease-Free Water 4ul
总容量 10ul
序列表
<110> 新疆医科大学第一附属医院
<120>长链非编码RNA NR-027469.1及制剂或诊断剂或药物或试剂盒和应用
<130>
<160>
<170>
<210> 1
<211> 26076
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
AGAAGAACTAGACAGAAAACTAGGCATCTGGGAACCCTGAAATCCCAGGAGAAGTAGCAT
CATCATGACCCTCTGTGTTCCTTTTGGCAAAGGACTTGCTTCGTTTGTACAATTGTTTGT
GTTTGTTAAATAAATAAAACCCTTTTCATGTATCTTTGAAAGTACATTGGCTCTATTATT
TTATGGTTACAAATAATGCTGCAGTCATCATTCTTGTACACTTCTCATTGGCCACTGGTG
TATTTCTATAGTGTAGAGGCCTGGAGAGCAGTTGCTCCAGCATAGTGTTTACATGGTTTT
TATATCATTCCATTTTCTTTCCTTTCTTGGCTTATTATCTATAACTGTTTCTTTCATCTG
GTCCACCGCTCCCTAGCTTCTTTTCCTGCTTTTGCTTTTTCAGTGATGGCTTTCGGGTTT
CCAGAATACATCTTCATCAGTGCCATCAAGTGACATTATACCTCCCCTTCTGGCCATTAT
GCTAGTGTTGTCATGTAATTTGATTTTAGACATGTTACAAACCCCAGAATCCATTATTAT
TGCTTTTGTTTAATCGGTCAAATTATTTTAAAAGATTTATATAATAAGAACATATATATT
TAACTATGTACATACCAATTTCCAGTACTCTCCATTTCTTTATGTAGATCCAGTTTTCTG
TCTGGTATCCTTATCCTTAGGCCTGGGGGACTCCTTTTGCATTTCTTGCAGTGTGGGTTG
CTGAGTTCTTTCATTTTTTGTATGTCTTTAAATGTCCTCATTTCAGTCACATTCTGGAAA
GATTTTTCATTTCGACATAGAATTCTAGGAAAACTTTATTTCTTTCAGTACTTTAGGATG
TTGCCACTTTGTTTTTGTAAAACTGGCATAAAGTGGGCTTCCTGTACTTGTTATACAATT
TTTGGAATGTGTATTTAAATTAAAAACATTAAAATGGGCTGGACGAGGTTGTTCATGCCT
GTAGTCCCAGCACTTTGGGAGGCGAACACAGGAAGATCAATTGAGGCCCAGAGTTGGAGA
CCAGTGTGGGCAAGATAGCAAGACCCTGTCTCTCATACACACACACACACACACACACAC
ACACACACACACACACATACGTACATACATTGTGAATGTCCTAGATTCATCTTAAGTTCC
ACCAACAGTGCACTTAAAGTAAAATGTGCCCAACCTGAGGGTCAAACCTATCTGCTGATG
TGCAGTCTGTGTTTGTGAGACATTCTCAACAGCATTTGCTTTCCCTAGCATAGCGGTTTT
CGTGTTTTCCTCATACCTGAATGTCTTAAGTGCAAAACCTGTCAGAAATCATTTCCTTTG
CCAAAAGATTCTAAAATACTTTTTTTTTTTTTGAGATCAGCTCACTGCAACTTCCACTTC
CCACGTTCACAGGATTCTCCTGCCTCAGCCTCTGGAGTAGCTGGGACTACAGGCTGCCGC
CACCATGCCCGGCTAATTCTTTTGTATTTTTAGTAGAGATGGGGTTTCACTGTGTTAGCC
AGGATGGTCTCGGTCTCCTGACCTCCTGATCCGCCCGCCTCAGCCTCCCAAAGTGCTGGG
ATTACAGGCGTGAGCCACCATGCATGGCCAAGGTTTGACTTTTATACACTCTTCTGAAAG
GGGGGGTTGGCTAGTTTGAATTGCGTCGCGGGAATTTGCTGGCGCAAAACTCGCTGGGCA
GGCTAGAGGGCTTACAGAAGCAGAAAGAAGGCAGTTAATCAAACTGACAGGTCTTGCAAC
GCAAGCATAGCTGGTGACCTTGCAGCTGCACTGAAGGGAAGTCAGGAACTTACAAAACCA
GAAATGGTAAGGGGGAAAGAGAAGGTAGTAAAGGCATTTGTTGTTTTTTCCTCTTATCCT
TATCCGTGCTAGGGGCGGACTGTGTAGACAGAGTCTCTGGAACTCATTCCCTGGGGCTCT
GTCTTTTCAGACAGTGTTATCAAGGATCTGCTAGGGCTCTATCTATTGCTGGTCTTGGAG
TAAGTCAAGTACTGTGAAGCTCAGTTATGCAGCTGAGCTTCACACATTAGGGGAAACAAC
AAGAGAACAGCACATCTGGAGTGCAATGGATGAGCCTCAAACTTAGGACGAATCACTTTG
GTAACCATAGGATTTCCCCTGCCAGATAAGTGGCAGTCCACATACCTCCGCCCTGCCACA
GCTCCATATGCCTCACCCTTTACACCCACGGTTACTTGCCCTGAGAACCACCCCCGCCTA
TCCCCAACCACCCCAAGCCCTTCTAGCCCTAACACACAGCTGGGACTCTCACATCCACCA
GCGGTCCTGGACTTGCTCCTACAGCACGGGGAATTCTCCCTGGCGAAGCAGCAACCCTGT
GCTGCCTCATCTACACAGAAATGCCCTATCGGTGATGTCACCGACAGTGCCTTTCCCAGT
CCCCTTCTGTTCTTCCGCCCCACCCTCTGCCACTCAGCCGACCAACACGCTGCCGGAGCA
GGCGGGGGAAGTGACGTCTGCCTGTCCCTCCTTTCCTTCCCGCCTTGTCCTTTGGGGAGG
TGCGCCAAGACCCTGCATCTAGTCTCTCCCAAAGAGGTGACTACTTAACCTGTGCCCTGC
GGAGGAACCTTCTGGCGGCCAGCTGGAAGCCTGTGCACCCGTCTTCAAATAAAGGCTTTT
AATTCGCAGACTAGAACGTTTAGGATTACAAAGAAAACTGGTTCCTTTCAAATCTGGTTA
TGTTTGTGAAATAGCATTCCGCTTAAAATTGGAAGCCCTTCAATATCAGGGAGAAATCAT
ATCTATGAAACTAGAGAGGCAAACCAGCCATCCTTACTGGTTTTACCAGTAGTAGTGTTA
TAAAGAAAGTTGTCCAATTTCATGAATCTTGTAGGTTTGGTTTTTTGTTTTTCAAATACA
GTACTGTACAAAAAGGAAGCGGAATGTGGTTGCAGTCTTAATGTAATGCCTCTCTGGGCC
TGAGAATTTGAAAAGGTTCACACTCCTCATAAAAGTTCTCTTCTTCGCCGGGACGGACAG
TGGCTCACGCCTGTAATCCCAGCATTTTGGGAGGCCGAGGCGGGTGGATCACCTGAGGTC
AGGAATTCGAGACCTGCCTGACTAACATGGTGAAACCCCGTCTCTACTGCATGGGAAATA
TTTATGTATATGCAACAAAAGGTATTTGCCACCACACATACATCTCCCTGCTCAGCTAAA
TATGTCATCTAAAGTGATGTGATTATCTAGTACAACCTTAGCCAGTGAATAAATAGCTTT
TTATTGAGCTGCAAAAGAGGCTGCAGTTTCAACAGCAGTGTTTTTCTTTCTTTTTCTTTC
GAAGACAGTGTCTGGCTCTGTGGCCCAGGCTGGAGTGCAGTTGTGCCAGCACAGCTCACT
GCAGCCTCGAACTCCTGGGCTTAAGTGATCCTCCTGCCTCAGCCACAGAGTCACTGGGAT
TACAGGCCAGAGCCACCATGCCTGATTTTCATCAGCAATGTTTCCTGAGGTTACAGAAAG
ATTTGTAATCCTGGGAGGAAACAGTCCCCTGAAGCAAAGTGTTCTCCCCCAAAAATGCAA
AGAGCTATCTTCTTGATAGCGAGGCAGATAATTCTCAGGTTTTGCCCCACAGAATCTCTA
TCTAAAATAGAGCAGTGGTCATGACTAGTGAAAAGTTTGAGGGAACTCGCCCAATGTTGG
GTTTCTTCAGAAATATATATATATTTACATAAATATATATTTATATATATATATAAATAT
ATATCCAAATATCCTAAAAGACACTGCCCTTCATCATTCCATGCTGTTAGACATTTATAG
GACCATGGATGGTGATCTCCTCCAGACAAAAATAAATGCTGGTGCAGAACAGGTAAGTGT
ACTATAATTTGAGTACATCAGCTTTTGGGCATTTTAAACCATGGGTCAGACATGTTAGAG
CAAGGGACCAGGTTGATAGCAAGAGGGAGTGTTTTCCTTTTAATTTTCCAATAGCAAAGT
GATGTTTGCCACTGTCATTTCAGAGTGATATGACAATTTGTTGTTGTTGCTTGGTTTTGT
GGGGTTTTTTGTTTGTTTGTTTTTGAGACAAGGTCTCACTGTCACCCAGGCTGGAGTGTG
GTGGCATGATCAGGGTTTACTTCTGCCTTGATCTCACGAATTCAAGCAAACCTCCTTACT
AATCCTCCCAAGTAGCTGGGACTACAGGTGCGTGACACCACACCCTGGGGTGTGAACTGG
GATTTGATGTTTTCAGTTGGCTCCCTAATGGAATAGGTTCCTTTACTATTCTGGAATACA
GATTGTCATTCTCGTGTGCATTATATTTCTACTACCCTGCTAATTTTTTTCTTTTTTTTT
TTTTTCTTTTTAAGATGGAGTCTTGCTGTGTTGCCCAGGCTCTATTGCAGTGGCAGGATC
TCAGCTCACTGCAACATCCACCTCCTGGGTTCAAGTGATTCTTTTGCTTCAGCCTCCTGA
GTAGCCACCCGGCTAATTTTTGTATTTTTAGTAGAGACAGGGTTTCACCATGTTGGCAGG
CCAGTCTCTAACTCCTTACCTCAAGTGATCCACCTGCCTCGGCCTCCCAAAGTGCTGGGA
TTACAGGCATGAGCTACCACGCCTGGCTCTCAAACCATTTTGAGTAAGCAAAGACAGATA
TGTCTGGCTTTTTAGTACGTTGCTGAATTAGCCTCCAATCTATATTTTTAGGAAGGACCT
GGGGAATGGCAACATGGAGATATTTGGCTAAAATGTGAACCTTTCATGTTCTGCTTCAGT
CTCTTTTTGAAAATCCTTCCAATTTGCCTTTTGCAACCAGTTAGTGGCCTTGCCTTCTTC
ACCATCATGTGAATTAATTGATAAAGGTCAGAATATTTGGGCTCAAAGATTTCAACAGTT
AAGTCAAATTTTCTGCCACACCCTGTGGGATCTTGGAGCCTGCTTTAGAAACAGAAGAGC
GAAATGTATTTAAATTTAGATCAGGGAAGTCCTTTATAATCTTAATTCACGTTTTGGTGA
AGCGGTATACACAATGGTAGGCTCCCCTCTTCCTGTGGGTTTGGGTTTTACCTTGAAAGG
GGCTGTCAGAACAGAAGTTTCAGGGAAGGGGCCAGAGCTCTGGGGACTTTCCTCAGGTGA
TGGTAATGGAAGAAGAGGCAAGGCAGGACAGGAAGGCTCAGGTAAGAAAGACTATGCAGG
TGCAGGGGCAGGAGGAAAAGGAGCAGTTGGAGGCGAAAGAGACAAAGCCTCCTCAATATT
TCTCAATTCAGAAAATGTCAGTTTACCTCCTTCAGCTTATTTCCTCAATGGAGGCAATTT
TCTCAGTTCTTTTAGAAATTTAGAAATTTAGAAATTTAGAAATTTCTAGGTCTCATTGGA
AGTAAGTCTCCCATTTAATTTGTCTGGTTGTAAAACCAAATTTCTCTCCCTTTTTTTTTT
TTTTTTTTTTTTTTGAGACATGGTCTCACTATGTCACCCAGACTGGAGTGCAGTAGTGTG
ATCTCAGCTCACTGCACACTGCACTCACTGCTTGCTGCATGACAGCCAGTAAGTCCAGGG
ACAAGGTGTAGGGGCAGGGAAGGTGACTTTATTCCAGAGAGCCACCAAACTGAAGAGATG
GTGAACAAATATTCTAAAGAACCATCTTAAATTAATATGATTTTCAGGCTCCTTGTACGT
TAGGGAAGGGAGGAAGAAGGAGGTGGTTGAGGTGAAGAGGTCTGACAATGACAGACTTAT
GGGCTGCAGTGAGAGCCAAAGGGGATGGTGAAAATTCTTTGTCTTTTGTCAGGTCACAAT
GCTCTTATAAATCTTCAACATAACACTGTTACTTGTGCATACAACCTCTTTATCTTTTCA
GGAGTCAGTTTGGGGAAGGGATTATGATCATCTGTGTTTTAAAGTTAAACTGTAAGCTAA
ATCCCTCCCATAGATAGCTCGGGAGGGGCCTATCTGCAGAAATAAGGAAAAGCAGTTGGC
CTGAAAGATATCACCACAGGGCAGGAAGGGTTAGGAGCAAAATGCAGTTAGTCATGCTAA
GCCTCCTTTTCATTGCTATGTATTTAATTTACTTGAACACATAATTTTAATTTTATATAT
ATATATATATTTTTGAGACAGAGTCTCACTCTGTCACCCAGGCTGGAGTGCAGTGGCATG
ATCTTGGCTCACTGCAACTTCTGCCTCCCTGGTTCAAGCAATTCTCCTGACTCAGCCTTC
TGAGTAACTGGGATTACAGGAGCCCACAACCATGCCTGGCTAATTTTTGTATTTTTAGTA
GAGACAGGGTTTCACCATGTTGGCCAGGCTGGTCTCGAACTCCTGACCTTGGGCTCCCAA
AGTGCTGGGATTACAGGCATGAGCCACTGCGCCCAGCCTAACTAAGATCATTAAACCATT
CTAATTTGTCAAAAGAGTCACACTGATTTTTGAAAAATAATGTAATGGGCTGGGTGCAGT
GGCTCACGCCTGTAATCCCAGCACTTTGGGAAGCCGTAGAGGGCAGATCACAAGGTCAGG
AGTTTGAGACCAGCCGGACCAACATGGTGAAACCCCGTGTCTACTAAAAATACAAAAATT
AGCCAGGTGTGGTAGTGTGTGCCTGTAATCCCAGCTACTCAGGAGGCTGAGGCAGGAGAA
TCACTTGAACCCGGGAGGCAGAGGTTGCAGTGAGCTGAAATTGCACCACTGCACTTCAGC
CTAGGCAACAGAGTGAGAGTCCATCTCAAAAATAAAATAAAATAAAATAAATTAAAAAAA
TAATAACATAATGAATTTTTTCATGTCTTTATATATTAAATATTTACATTATTTAAATTG
TTCAAAAGCATCAAAGATTCCTCTCTATCAACTTCATTTCATTTATTTTATTGTACCAAA
CTATCAAGACCATTAATTTAATCTACAGCTAAATCTATTATTTTTTCATGTTAGAAATTC
CACAAGAAAATTTTTCCCTAATGAAACCTCACATTTCAAGCATCCTAAGTAGGCTGGGCG
AGGTGGCTCACACCTGTAATCCCAGTACTTTGGGATGCTGACAGGTGCATAACTTGAGGT
CAGGAGTTTGAGACCAGCCTGGGAAAAATGGTGAAACCCTGTCTCTACTAAAGCTATAAA
AATTAGCTGGGCATGGTGGCATGCGCCTGTAATCCCAGCTACTCTAGAGGCTGAGGCAGG
GAAATAGCTTCAACCTGGGAGGCGGAGCTTGCAGTGAGCTAAGATCGCACTACTGCACTC
TAGCCTGGGCTACAGAGCAAGACTCTGCCTCAAAAATAAATAAATAAATAATCATAAGTA
GTAAAAAAGTAAAATGAAATAAAAAATAAGGCACAGTGTCTTGCTCTGTTATCCAGGCTA
GAGTGCAGCAGGACAATCATAGCAGACCAACTTGGAACTTCTGGGCTCAGGCAATCCTCC
TGGTTCAGCTTGCCTTGCATTTTTTTAGAGATGGGGTCTTGCCCTGTTGCCCAGGCTGGT
CTCCAACTGCTGGCCTAAAGCAATCCTTCTGCCTCAGCCTGTTGAGTTGCTGGGAGTACA
GGTGCAAGACATGCAGCCTAGCATTGTAGTAAAACAATTTTCAACAAATTCTTAATTTTC
TTTCTTTTTCTTTTCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGAGTTGGGCGTCTTAC
TCTTTCACCCAGGCTGCAGGGCAGTGGTGCAATAATAGTTCACTGCAGCCTGCCTCAGTC
TCCCTAGTAGCTGAGATTACAGTCATGCATTATCATGCCCAGCCAACTTTAAAAAAATTA
GCTAATACTTAAAAATTTGTAGAGACAGGGGTTTCACTATGTTGCCCAGGCTGGTCTTCA
ACTCCTAACCTCAATTGATTCTCCCTCCTCAGCCTCCTAAAGTGCTGGGATTGCAGCCAT
GAGCCACCATACCTGGCTTAATTTTCTTATTTTAATCTTATGTAAGTGATTATTATTGTT
CCTAAGATAATTGGGGCAGTGACTCCTTTAAAATTTTAGAGACCTAATTTATCTATTCAC
TTCACTGAAAGAGTATGCCAATTTGTTTCATGAGAAAATACCCTACATTCATAAAGCAGG
AAAATTCCTTCCACCAAACTAGGGGGCATTCTAAAGAAACAAATTTTGCTAAGTAACATC
ACTTAAGGTGAAAACAGAGACAATGGTATCTATTAACAATGTTTATCAGTGAAGGAAATA
AACTGAAAATATTAACATCATTAGATCCTTGGAGGGCCTTCATTGCTGAAAAATCTGAGT
AATATTGTGATACCCTTTTGAGTCCGGCAGGACATTCTCTTTCCAGGGCATATAACAATG
GGTGAATAATTTCTTTTCATTCATTTTCATTAAGGGCTGAACTTCCTTAATGTTCTGGAG
ATTATTAAATTTGATTTGTATAGTTGTGAAAAGTGCTCATATTGCTGATTCCATTGCTTA
TATGTGATCATATAAATCTTTTCTCTCCTTTCTGTAGTGTGGTTTAAACTTAATCCTTAA
AGGACGTGTATTTGAATTTTTCAGCTGGTTAGAAACCTGAATATACCAATCAAAGAAAAC
TGCTCCTTACATGCTACAGATTTAGTTTTCTTCTTGTACTAAGATGTCTTTTAGATATAG
TAAATTTGTTAAAGCCAAGAGCTCCTATGGAATGAAGTTGAATGGGAGGGGGGATGTGGA
GTAGTAAGATCACCCTTGTAACAGAGATGCCACTCTTGCAGATTTTGACAACTATTGGGC
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ACAGACCAGATTAGCTGTCCAAACAGGGAGTAGATCCTTATCAACACAACCCAACAGAGA
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TAATGATGCAATAATGAGAGAGAGACAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGACCTGTCCTATAGC
CATACTTAGTGGGTAAAAGCCAAAGAGCTCAATTTCTGCTCATGATACTTAATAGAACAG
AGGGAACATGAGCCAATAGCTCAGTGGGTTCAGATACGCACCAAGTGCCTGTTGGATACA
GGATTCTACTGTCTCCAATAATATGTCTCAGATGGACTAGTTTTTTTGTTTTTTGTCTGT
TTTGTTTTTGTTTTTTATTTTTTGTTTTTGAGAGAGAGTCTCCCTCTGTCGCCCAGGCTG
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CCTGCCTCAGCCTCCCAAGTAGTTGGGACTACAGACGCACACCACCACGTCTGGCTATTT
TTTTTGTTTTGTTTTGTTTTGTTTTGTATTTTTAACAGAGACAGAGTTTCGCCATGTTGG
TCAGGCTGGTCTCGAACTCCTGACCTCAGTTGATCAGAAGTAGGTGAGGTCAGAAAACAT
ACCCTGGGAGAGGCTGGCACAATGCCCAGATCCGCCATCGCTAGGCCTGGGGTTTTCTTC
TGTAGTATTCATGTAGTGCAGGGACAAAACCAATTAGATACTTCTGGGAGTTAAAAAGAG
ATTAATTTGCCGGGCGCGGTGTCTCACGCCTGTAACCCCAGCACTTTGGGAGGGTTCACG
AGGTCAGGAGATCGAGACCATCCTGGCTAACGCGGTGAAACCCCGTCTCTACTAAAAATA
CAAAAAATTAGCCGGGCGTGGTGGCCGGCGCCTGTAGTCCCAGCTACTGGTAGGAGGCTG
AGGCAGGAGAATGGCGTGAACCCGGGAGACTGAGCTTGCAGAGAGTCGAGATCGTGCCAC
TGCACTCCAGCCTGAGCGACAGAGCGAGACTCCGTCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
GATGAATTTACAGTGTCATTTGAGAAGGGGTATTAAGGAATTTGCCAGGGTACTGACGCG
TGTCAGGTGCAAACTGCAGGTTGAGAGAGAGCTAAGTATTTTCTGTCCATGAAGGTGATA
AGCGAGGGCCTGAAGAAAGAGGAAGGGGGGAGGACACTGGCGCCAGAAATAGGAAAGGGC
TGCTTGGGGGTGGGAAGGATGGGTCGGGGTGCTATCTAGAAAGCTGCCTGGCAATGGCTG
TGGGATGCGGAAGCGAGACATCAAACAAGAAGCTGTCGCTTAAATAAAGTCTGAAGAAAG
ACTAGATATGTAAACGGCAGGAGATAGTAGGGAAACTGGACCCGTCTCCTCATAAAACTT
CCCGCCTTATATTTCAGGGAGGATCGCAGCGCATTTCGGCCAAGACAGGTGAGACTGCGG
TTTTGACCTGCGGGCCTCGATGAATTGCGTTAGGACACCTGGGCTCCGGGAGAGCCGTTC
CACTCCGCAAAGTAAGCGTGTTATGTCTACAACCCAACGGGGACGCGCTAAGAGCCCTAA
AGGCCCTGCTTTCATCCCAAAGAACAGCCCCCGCCTGCGTAGTTTGTAGCCGGCTCTATG
AGGTGAGAACACATTCCCCGCTAGCACAGAAATCCTACAGACTCCTGAGGGGGCTGCAGC
TAGAAGCAGAGGCTGTGTGAAATGTGACTGGGGGCTAGGGAAAAACACGTAGATTTTCAC
AGACCCTGAGAACCCAAGAGACTGCAGACCATGGGCAGACAAATCTCTGCAAAAAGCAGC
CCCGCCTAGATAAAGGAAGAGCTGTGCGGCCTTCGCGCTAGCTAGCTTGTGTAAAGGTCG
ACGATTCTTATTTCTCCCGGGGCGGGGAGAAAGCGACATATTACTACTATTTCTCAGCCT
TCGACTGTGAGAGTAACGATTAAGACTAAAACACAAGCCAGTAAAAAAAACAAGTAACCC
TTGCTGTGTAGACTATTCTTTAAACTACAAAAAATCAGGGGAAAGCGCGAACGCAGTCCC
CCACTACCACAAATTATGCAGTCGAGTTTCCCACATTTGGGGAAATCGCAGGGGTCAGCA
CATCCGGAGTGCAATGGATAAGCCTCGCCCTGGGAAAACCACCTTCGTGATCATGGTATC
TCCCCTGCCAGGTAAGTATGAGATCTTGCACCTCCGCCCCGCCACAGCCTCACACGCTTC
ACCCTTTACACGCACGGTCACTTGCCCCGCGCAGCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCACCCCC
AGCCCTCCTAGCCCTGACACACAGCTGGGACTCTCAGGTCCGACCAGCGGTCCTGAACCC
GCTCCCACGGCACGGGAAATCCTTCGTGGCGCAGCAGCAGGTGGGGAAGCAGCAGCCCCT
GCGCTGCCTCATCTACATAGAAGTCGCCCTATCCGTGATGTCACCGACAGTGCCTTTCCC
AGTCCCCGTCTGCCTTTCTGCCGCTCAGCCTACCAACCCGCTGCCGGAGCCGGCAGGGGG
AAGTGACGTCTGTCTCTCCCTTTTTTCCCTCCCGCCCCGGCATCTGTTCTCGCCCGAAGA
AGCTGGTCCTTAGCCTGCGCTGCGGAGCAACCTTTCAGTGGCCAGCTGGAGCCTGGGCAC
CGTTCTTCAAATAATGGCTTTTAATTCTCAGACGAGAACGTTTAGGATTACAAAAGAAAC
CGGTTCTCTTCACATCCTTATCCTTGTCATGTAGCATTCCGCTTGAAATTGGAAGCCGTT
CAATGTCAGAGAGAAACCATATTTATGAAATGAAAGAGGCTTCTCAGATGACTGCAAACC
AGCCTTCCTTACTGGTTTTATCACTGGTAATGTTATAAAGACAGTTGTCCAGTTTCATGA
ATCTTGTAGGTTTTTGTTTGTTTATTTGTTTGCTTTTGATGTTGTTGTTGTTGCTGTTGT
TTTCCAACTTCAGTATTGTAGAAAAATATGCTGCCCCAGAAGAGATGATTGGACACTCTC
CAGCGTGGTGTTGGACTTTGTCATCTCTTGCACAGCCATCTCCAGACCTTAGTGTTTACC
TCACGTTAGTTTTTTATATTCTGCAAAGACAAAACCAAAATAATCCAAATTTGACACAAA
TACCTGGGATACATCTTATTTGAGATGTTTAACAAATGTCTGGATCATCTTTTCTTACAT
TGGATTATAACGCAGGAAACACTGTGAAGTAAGTAAAGTTGGAATTCCCAAGTCAAAGAC
CATTTGAATATTTACAAGTAGATTTGAGGCAGGAATAATACAGGGTGGCCGCAGGGTAAC
AAATTCTAGGCAGCAGATTTACATGACTTGAGGCTATGGGCTGATAAGACGCTGAAAAAC
CAGGGTGTGGACCAAGCTGGCTAAGACTGACTGGACCCAATGTGGTGCTGGATTTGATGT
AGGTTTTACCGAGGCCCTCATTATATGCTCATTAACATACTAAATCACACACCCACCAGT
GCCATGACAGTTCTGAGACCAATATGTGATGTAAAAATGGATGGCACCACAGTTCCGAGA
AATCTCCACCTTTACCCAGGAATTTTCATGACTATTCCACTCCTTGGTTAGAGAAACCAA
TCAAGATGAAACCCCAGAACCCATTGTTCTCTGTCGGGTATGCCCGAACTCCCCTTTCTT
GAGTGTGTACTTTTTGCTTTGCAATAAATCTCTTCTTTCACTGTTTGCTGACTCATCCTT
GACTTTGTTCTTGAGATGGTGTCAAGAGCCTGGACACCACAGCTGGGGTCGAGATCCCAC
TAGTGTCCGGGGACTTTCCCCAGGCCACCAGTATCAGATTCTATTCCATTGCTCAAATCA
CAAAACATCGAGTGGAGAGTTCTCCTTGGAGACCATAAAGTAAAGATTCTGTGGCATGGT
GGCCAGTTAGGCCACTGGAAGGCATGGCAAAATATTGAAAATGAGAGATTAGGTGACAGT
GTAGTAATAACTGCTGAATACTAAATATTTGAGCCAGGCCCCATTCCCTGGATACTGACA
GGGAGACACATTGTCCAGGTAGTAGTGGAGAAATACTTTCTGGGTATCTGACCAGCCTTT
GTGGAAAGAACTGGCACCATCCTGCAGATGTAACCGCCTGATGGGTTCTTCCTGCCCACT
GTACATACAAAATCAATTCATGGAGACCATGGCATTGAGGTAAAGAGTTTAATTGACACA
GGCCAGCCACGACATGTGGGGGACAGAGTTATTACTCAAATCGATCTCACTGAAGACTTG
GAGGTAAAGGGTTTTCAAAGACAGTTTGGTGGGGAGGGGGCTAGGGTTTGGGCGGTGCTG
ATTGTTGGGGATGAAATCACAGGGGTGTGGAAAATGCCCTCCTGCATTGAGTCAGCTTCT
GGGTGGGAGCTAAGGGACTGGTTGATTTTTGGGCCAAATGGTGCCATCCAGTAGTCAGAA
ATGCAAAAGCCTGAAAAGACATCTCAAGAGGCCAATCTTAGGTTCTACAATAGTGATGTT
CTTCACAGCAGTAATTGGGGAAGCTGCAAATCTTGTGACCTCTGGAATAATGGCTGGTAA
TTATTTAACGAGGCATACATCTTAGTAGAATTCAGGCCCCTTTCATCCTCCTAACTTGGT
GGCCTTTCATTAGTTTTATGGGGTAATTTAGTTTTGGGGAAGGTTATCATTTTAACCAAC
ATTTTTGGCTGTCCCCAACCTTTTTGGCACCTGGGACTGGTTTCACGGAAGACAATTTTT
CCATGGAAGGGGGTGGTGGATGGTTTCTGGATGAAACTGTTCCACCTCAGGTCATCAGGC
ATTAGTTACAGTCTCATAAGGAGTGCGCAATCTGGATCCCTCACATGTGCAGTTCCCAAT
AGGGTCCGAGCTCCTATGAGAATCTAATGCCGATGCTGATCTGACAAGAGGCGGAGCTCA
GGTGGTAATGCTCCAAAGCCTGCAGCTCACCTCCTGCTGTTCAGCTGGGTTCCTAACAGG
CCATGGACCAGTACCTGTCTTGTGGCCCTGGGGGTTGGGGACCCCTGATTTAAACTATAA
ACTCAATTTTTCCCAAAGATAGCTTGGGAGAAATTGCACAGGAACGAGCAAAGACAGCTA
GCCTGTGAGGCTAGAACCAAGATGGAGTCAGCCATGTCAGATTTCTCTGATTGTCATAAT
TTTGCAAAGGTAGTTTCTGAGGGACTACCCTGACACTTGTTAAAAGCATGAGGTGGATTT
TATTGTATGTACTACAGTAGGCAAGAGAGACCAGCAGAGAACCGAGCTCAACCTCAAATA
CAGCAGGAAGAGTTGAAGATTATAGCCAATTGGCAAGATAAGAAAGTCAGTGGATGGAAA
ATTACTAAGAGGAACTTGATTAGCTATCAAAGGTGGTTGGGAGGACTCTTGCTAAACTAG
ACTCAACAGTATTCTTTTCTAAAACTGGACTTAGCAGGCCAAGAACTAATAGAGAAAAGG
GCTCAGAGGAAACTACTAAGGTTTGGTCAAAGATGGAGTCCTTGTCAACTCTAAATTGAA
GCTTCTGCAAATAAACGAAGACCAACCAAATGAAAAAAAGCAAAAGCTATTTATTCTGAG
CTTGCTATGGCAGGGAGTCAGCCACTGTTACTTGTGTTTTGGCAGAGACTTGAAGGCAGT
CAGAAGGGTGAGAAAGCTTTTTAAAAAGAAAGGCTTCAGGTATGCTTGGACTGGAGGCTG
TCAGTATGGTGACGCTGTAGATAGATGAAGAAAATAAAAATATTTTACCCCAGAATATAT
TTCTTTGGTATATTTTAAGATGGCTGTCAGAGAGCCAGCAAACAGAAGTAACTCTGCAAA
ACTGTCTTTTGTAGGGGAAATTTACACCTGCAGAGAATCTGCATTAATCCAGCCTTCCCT
TGTCAGGATTGAGAAATAAAAATAAGCCCTAGGCCCTACAACCAACTGAACAGACTCCCT
CTTGGCTGACAGGACCACAGAGAAACCTTGAAAGCTGTTTCTGGCTGTGACAGGATAGGA
GGTCGGACGTGCCCCCTTAAAACCCCTCCCTCACTAACTGCCATTATGAGGCAGGAGAAT
AGCAGAGGGAATTGGAAGTTGGATAAAAGGCAGAATGAGTAAAGGCAGAAACAGAAGCAC
GGTGATGGGGCGGGAGAGCAAGAAGCAAAATAAAAGGCAGAAGTTGAGCAACCTAAACAA
AAAGTAAGATTAAAAAAAGCAAGGAAGACCGGGCACGGTGGCTCACGCCTGTAATCCCAG
CATTTTGGGAGGCCAAGGCGGGCAGATCGCCTGAGGTCAGGAGTTTGAGATCAGCCTGGC
CAACATGGCGAAACCCCATCTCTACTAAAAATACAAAACATTAGCTGGGCATGGTGGTGC
ACTCCTGTACTCCAGGCTACTTAGGAGGCTGAGACAGGAGCATTGCTTGAACCCAGGAGG
CAGAGGTTGCAGTGAGCTGAGATTGCACCACTACACTCCAGACTGGGCAACAGAGAGAGA
CTCTGTCTCAAAAAAAAAAAATAGCAAGCAAGGACCCCATTGCTGGCAAGATCCAAACCA
GTAAAGGGGCAGCTCCTCAGAGACAGACATGTGCATTCAAGAAAAAAAGCATCCTTAACA
TGACTCCATATGATAATCAGCTCATTAAAACTCATGCATATGGACTACATATCTTGCATG
TACTTAAAATTATGGGGTGGAGACAATGTGCAAGCACACGAGGGCCAAAGTAACTAAGCA
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<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 2
aggactgcct gtttgcagtt
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gctcacgatg ttgaatgatgct

Claims (10)

1.一种在稳定型心绞痛患者血液中低表达的长链非编码RNA NR-027469.1，其特征在于长链非编码RNA NR-027469.1的序列如SEQ ID NO:1所示。
2.根据权利要求1所述的在稳定型心绞痛患者血液中低表达的长链非编码RNA NR-027469.1，其特征在于该长链非编码长链非编码RNA NR-027469.1为NR-027469.1:1的全长或片段。
3.一种体外检测血液中根据权利要求1或2所述的长链非编码RNA NR-027469.1的制剂或诊断剂或药物或试剂盒，其特征在于该制剂或诊断剂或药物或试剂盒包括特异性引物对、标准DNA模板、PCR反应液，其中，特异性引物对包括上游引物和下游引物，上游引物的核苷酸序列为SEQ ID No:2，下游引物的核苷酸序列为SEQ ID No:3。
4.根据权利要求3所述的长链非编码RNA NR-027469.1的制剂或诊断剂或药物或试剂盒，其特征在于该试剂盒为荧光定量PCR检测试剂盒。
5.根据权利要求3或4所述的长链非编码RNA NR-027469.1的制剂或诊断剂或药物或试剂盒，其特征在于特异性引物对用于SYBR Green、Taqman探针、分子信标、双杂交探针、复合探针的检测。
6.根据权利要求3或4或5所述的长链非编码RNA NR-027469.1的制剂或诊断剂或药物或试剂盒，其特征在于PCR反应液为荧光定量PCR反应液。
7.根据权利要求6所述的长链非编码RNA NR-027469.1的制剂或诊断剂或药物或试剂盒，其特征在于荧光定量PCR反应液包括dNTP、Mg2+、Taq酶。
8.根据权利要求3或4或5或6或7所述的长链非编码RNA NR-027469.1的制剂或诊断剂或药物或试剂盒，其特征在于还包括荧光染料。
9.一种检测根据权利要求1或2所述的长链非编码RNA NR-027469.1的方法，其特征在于按下述步骤进行：第一步，提取血液总RNA；第二步，制备cDNA；第三步，定量扩增长链非编码RNA NR-027469.1。
10.一种根据权利要求1或2所述的长链非编码RNA NR-027469.1在制备用于检测稳定型心绞痛的试剂盒或用作检测稳定型心绞痛药物的新靶点的应用。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111718988A (zh) * 2020-03-09 2020-09-29 苏州市立医院 一种血浆长链非编码rna在冠心病筛查中的应用
CN114457072A (zh) * 2021-04-19 2022-05-10 苏州系统医学研究所 一种具有抗病毒活性的多核苷酸及其用途
CN118703502A (zh) * 2024-08-28 2024-09-27 内蒙古农业大学 一种绒山羊lncRNA、干扰载体及其在调控绒山羊羊绒生长中的应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104404146A (zh) * 2014-11-25 2015-03-11 温州医科大学附属第一医院 一种心肌缺血再灌注相关的lncRNA的筛选方法及应用
CN104548137A (zh) * 2015-01-27 2015-04-29 青岛大学 一种含lncRNA抑制剂的药物组合物及其用途
CN104548135A (zh) * 2015-01-27 2015-04-29 青岛大学 一种含LncRNA的药物组合物及其用途

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104404146A (zh) * 2014-11-25 2015-03-11 温州医科大学附属第一医院 一种心肌缺血再灌注相关的lncRNA的筛选方法及应用
CN104548137A (zh) * 2015-01-27 2015-04-29 青岛大学 一种含lncRNA抑制剂的药物组合物及其用途
CN104548135A (zh) * 2015-01-27 2015-04-29 青岛大学 一种含LncRNA的药物组合物及其用途

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
张明娇，李珉珉: "冠心病患者血清中lncRNAs表达谱及其临床价值", 《第九届粤桂琼检验医学学术会议暨海南省医学会检验医学专业委员会2015年学术年会》 *
李昱霖: "外周血细胞长链非编码RNAs（lncRNAs）对脓毒症预警诊断价值的初步研究", 《中国优秀硕士论文全文数据库》 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111718988A (zh) * 2020-03-09 2020-09-29 苏州市立医院 一种血浆长链非编码rna在冠心病筛查中的应用
CN111718988B (zh) * 2020-03-09 2023-10-03 苏州市立医院 一种血浆长链非编码rna在冠心病筛查中的应用
CN114457072A (zh) * 2021-04-19 2022-05-10 苏州系统医学研究所 一种具有抗病毒活性的多核苷酸及其用途
CN114457072B (zh) * 2021-04-19 2023-08-15 苏州系统医学研究所 一种具有抗病毒活性的多核苷酸及其用途
CN118703502A (zh) * 2024-08-28 2024-09-27 内蒙古农业大学 一种绒山羊lncRNA、干扰载体及其在调控绒山羊羊绒生长中的应用

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