CN106676119A - 细菌无痕遗传操作载体及其构建方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种细菌无痕遗传操作载体，所述载体包括抗毒素开关控制的毒素反筛元件和抗生素抗性基因。还提供了该载体的构建方法及应用该载体进行细菌无痕基因敲除、敲入、替换、点突变及大片段DNA插入和删除(大于194kb)的方法。本发明利用组成型启动子持续表达毒素蛋白，并利用诱导型启动子诱导表达抗毒素蛋白，建立了抗毒素开关控制的毒素反筛元件(TCCRAS)，解决了现有革兰氏阳性菌的遗传操作系统特异性不高、系统不稳定且筛选困难的问题。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体来说涉及细菌无痕遗传操作载体及其构建方法与应用。
背景技术
遗传操作系统是指在分子水平上对细胞基因组进行精确修饰(包括基因敲除、敲入、替换和点突变等)的一种生物工程技术，不仅是研究生命基础问题的重要手段，也是人工育种和改良品种的有力工具。目前，多种适用于原核和真核生物的遗传操作方法已经被开发出来，使得研究者能够在多种细胞中进行生理功能和代谢工程研究。
现有的遗传操作系统主要包括两大类：一类是基于核酸酶的ZFNs、TALENs以及CRISPER/Cas9等技术；另一类是基于重组酶的Red、Red/ET和Cre/loxP等技术。前一类技术主要应用于真核生物染色体DNA的修饰，其中应用最为广泛的是最近发现的利用原核生物II型适应性免疫系统介导的CRISPER/Cas9技术，能够应用于酿酒酵母、拟南芥、水稻、小麦、线虫、果蝇、斑马鱼、小鼠等真核生物中。虽然有文献报道CRISPER/Cas9技术能够应用于一些细菌基因组的修饰，但是该技术的基因编辑效率在不同细菌中有较大差异，如在肺炎链球菌中的基因编辑效率接近100％，而在大肠杆菌中的基因编辑效率则降至60％左右(Jiang W.Y.,Bikard D.,Cox D.,Zhang F.,Marraffini L.A.2013.RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems.Nat Biotechnol 31:233-239)。此外，包括CRISPER/Cas9技术在内的基于核酸酶的基因编辑技术均存在一个共同的致命缺陷，即“脱靶效应”，显著降低了基因编辑的特异性和准确性。因此，基于核酸酶原理的CRISPR/Cas9等技术难以有效地对原核生物进行精确地遗传修饰和改造。
在原核生物研究领域中，主要采用的是基于重组酶的遗传操作技术，包括依赖噬菌体重组酶和自身重组酶的遗传操作技术。该类技术需要借助外源DNA的同源序列与染色体的靶序列发生同源重组，从而定向地改变细胞的遗传结构和特性。因此，该类方法均需要构建含有同源序列和筛选标记的外源DNA片段或非复制型质粒。早期的操作方法都是在染色体中引入抗性基因，由于可作为抗性筛选标记的抗生素基因的数目有限，难以进行染色体多个位点的改造，且抗性片段的插入可能会影响细胞的生理功能。随着分子生物学与基因工程的发展，通过引入毒性元件作为反筛标记发展成为细菌有效的无抗性标记或无痕敲除策略。例如利用果聚糖蔗糖酶SacB作为反向筛选标记已经在大肠杆菌(Escherichia coli)、黄色黏球菌(Myxococcus xanthus)及流感杆菌(Haemophilus influenzae)等革兰氏阴性细菌中建立了无痕遗传操作系统(Lalioti,M.D.,Heath,J.K.2001.A new method for generating point mutations in bacterial artificial chromosomes by homologous recombination in Escherichia coli.Nucl Acids Res 29:e14；Wu,S.S.,Kaiser,D.1996.Markerless deletions of pil genes in Myxococcus xanthus generated by counterselection with the Bacillus subtilis sacB gene.J Bacteriol 178,5817-5821；Johnston,J.W.2012.An improved counterselection cassette for use in Haemophilus influenzae.Gene 492,325-328)。由于革兰氏阳性细菌的细胞壁结构复杂，细胞抗压、抗辐射以及抵抗毒性能力强。因而，目前常用的反向筛选标记无法有效地应用于芽胞杆菌(Bacillus)等大多数的革兰氏阳性细菌中。
自20世纪60年代以来，枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)作为革兰氏阳性细菌的模式菌种，其遗传操作系统能够广泛应用于多种革兰氏阳性细菌的代谢机理和信号调控等研究中。虽然已有研究者利用一些新的毒蛋白作为反筛标记建立了无抗性标记的遗传操作方法，如尿嘧啶磷酸核糖转移酶UPP、β-内酰胺酶阻遏蛋白BlaI和鸡蛋清溶菌酶Hewl等。但是这些方法需要构建毒蛋白编码基因缺失的突变株，且靶位点附近留下的重复序列会影响多重突变菌株的稳定性。最近有报道利用诱导表达的毒素蛋白MazF作为反向筛选标记构建了敲除/整合载体pDGREF，能够对枯草芽胞杆菌染色体基因进行点突变和无痕敲除，但该系统的反筛效率较低(25％-65％)、筛选困难(Haojie Y.,YanX.,Shen W.,Shen Y.,Zhang J.,Li S.2010.Efficient and precise construction of markerless manipulations in the Bacillus subtilis genome.J Microbiol Biotechnol 20:45-53.)。综合目前研究可知，由于芽胞杆菌等革兰氏阳性细菌的抗毒性能力强，且诱导型启动子难以完全抑制毒素蛋白的渗漏表达，极易使重组菌对毒素蛋白产生抗毒性，从而导致已有的遗传操作技术在芽胞杆菌等革兰氏阳性细菌中的特异性不强、系统不稳定且筛选困难。因此，亟需建立一套新型、高效的革兰氏阳性细菌的无痕遗传操作系统。
发明内容
本发明提供了一种细菌无痕遗传操作载体及其构建方法与应用，解决了现有革兰氏阳性菌的遗传操作系统特异性不强、系统不稳定且筛选困难的问题。
本发明的一个方面，提供一种细菌无痕遗传操作载体，所述载体包括抗毒素开关控制的毒素反筛元件TCCRAS(Toxin Counter-selectable Cassette Regulated by AntitoxinSwitch)和抗生素抗性基因。
以上所述载体，所述抗毒素开关控制的毒素反筛元件包括抗毒素蛋白编码基因、诱导表达抗毒素蛋白编码基因的诱导型启动子、毒素蛋白编码基因和持续表达毒素蛋白编码基因的组成型启动子。
以上所述载体，所述毒素蛋白-抗毒素蛋白包括：
RelE-RelB、MazF-MazE、ParE-ParD、Doc-Phd、YafQ-DinJ、VapC-VapB、HicA-HicB、CcdB-CcdA、Axe-Txe、YefM-YoeB、RelJ-RelK、HigB-HigA和HipA-HipB；
优选为RelE-RelB和MazF-MazE；
最优选为RelE-RelB。
以上所述载体，所述诱导型启动子为PxylA或Ptac启动子；所述组成型启动子为Pliag或P45启动子。
以上所述载体，所述毒素蛋白-抗毒素蛋白编码基因来源于大肠杆菌Escherichia coli、嗜热古菌Pyrococcus horikoshii、结核分枝杆菌Mycobacterium tuberculosis、詹氏甲烷球菌Methanococcus jannaschii、嗜线虫致病杆菌Xenorhabdus nematophila、肠道沙门氏菌Salmonella enterica、嗜甲烷细菌Methylomicrobium alcaliphilum、唾液乳杆菌Lactobacillus salivarius或弧菌Vibrio nigripulchritudo中的一种细菌；
优选地，为大肠杆菌Escherichia coli或肠道沙门氏菌Salmonella enterica。
以上所述载体，所述细菌为革兰氏阳性菌；
优选地，为芽胞杆菌属Bacillus、李斯特氏菌属Listeria、葡萄球菌属Staphylococcus、链球菌属Streptococcus、肠球菌属Enterococcus、梭菌属Clostridium或放线菌Actinomycete中的一种细菌；
最优选地，为芽胞杆菌属Bacillus或棒杆菌属Corynebacterium中的一种细菌；
所述芽胞杆菌属的细菌为枯草芽胞杆菌Bacillus subtilis、蜡样芽胞杆菌Bacillus cereus、巨大芽胞杆菌Bacillus megaterium、解淀粉芽胞杆菌Bacillus amyloliquefaciens、短小芽胞杆菌Bacillus pumilus或地衣芽胞杆菌Bacillus licheniformis中的一种细菌；
所述棒杆菌属的细菌为谷氨酸棒状杆菌Corynebacterium glutamicum、北京棒杆菌Corynebacterium pekinense、钝齿棒杆菌Corynebacterium crenatum或产氨棒杆菌Corynebacterium aminogenes中的一种细菌。
本发明的另一个方面，提供以上任一所述的载体的构建方法，包括如下步骤：
1)扩增毒素蛋白编码基因、抗毒素蛋白编码基因和持续表达毒素蛋白编码基因的组成型启动子，按照持续表达毒素蛋白编码基因的组成型启动子-毒素蛋白编码基因-抗毒素蛋白编码基因的顺序融合形成重组基因片段；
2)将上述步骤1)中获得的重组基因片段与载体连接，获得含有毒素-抗毒素蛋白表达元件的靶基因无痕遗传操作通用载体；所述载体带有诱导表达抗毒素蛋白编码基因的诱导型启动子及抗生素抗性基因。
以上所述的载体的构建方法，所述步骤1)中扩增毒素蛋白编码基因、抗毒素蛋白编码基因和持续表达毒素蛋白编码基因的组成型启动子的融合是通过SOE-PCR方法进行。
本发明的再一个方面，提供一种应用以上任一所述的载体进行细菌无痕基因敲除的方法，包括如下步骤：
1)构建待敲除的靶基因的上游同源臂及下游同源臂的融合片段；
2)将步骤1)中所述融合片段插入以上任一所述的载体，携带有所述待敲除的靶基因的上游同源臂及下游同源臂的融合片段与靶细菌染色体DNA以单交换的形式发生同源重组，在抗生素选择压力和诱导剂同时存在的条件下筛选有抗生素抗性的重组子，得到将以上任一所述的载体整合到靶细菌染色体的阳性转化子；
3)将步骤2)中获得的阳性转化子转接于含有诱导剂的液体培养基中，促使同源臂之间发生第二次单交换，然后将培养的菌液稀释涂布不含诱导剂的平板上进行反筛，获得靶基因无痕遗传改造的重组菌。
本发明的再一个方面，提供一种应用以上任一所述的载体进行细菌无痕基因点突变的方法，包括如下步骤：
1)构建含有突变的基因及其靶基因上游同源臂和下游同源臂的融合片段；
2)将步骤1)中所述融合片段插入以上任一所述的载体，携带有所述突变的基因及其靶基因上游同源臂和下游同源臂的融合片段与靶细菌染色体DNA以单交换的形式发生同源重组，在抗生素选择压力和诱导剂同时存在的条件下筛选有抗生素抗性的重组子，得到将以上任一所述的载体整合到靶细菌染色体的阳性转化子；
3)将步骤2)中获得的阳性转化子转接于含有诱导剂的液体培养基中，促使同源臂之间发生第二次单交换，然后将培养的菌液稀释涂布不含诱导剂的平板上进行反筛，获得靶基因无痕遗传改造的重组菌。
本发明的再一个方面，提供一种应用以上任一所述的载体进行细菌无痕基因插入的方法，包括如下步骤：
1)构建含有待插入的基因及其靶基因上游同源臂和下游同源臂的融合片段；
2)将步骤1)中所述融合片段插入以上任一所述的载体，携带有所述待插入的基因及其靶基因上游同源臂和下游同源臂的融合片段与靶细菌染色体DNA以单交换的形式发生同源重组，在抗生素选择压力和诱导剂同时存在的条件下筛选有抗生素抗性的重组子，得到将以上任一所述的载体整合到靶细菌染色体的阳性转化子；
3)将步骤2)中获得的阳性转化子转接于含有诱导剂的液体培养基中，促使同源臂之间发生第二次单交换，然后将培养的菌液稀释涂布不含诱导剂的平板上进行反筛，获得靶基因无痕遗传改造的重组菌。
本发明的再一个方面，提供一种应用以上任一所述的载体进行细菌无痕基因替换的方法，包括如下步骤：
1)构建含有替换基因及其靶基因上游同源臂和下游同源臂的融合片段；
2)将步骤1)中所述融合片段插入以上任一所述的载体，携带有所述替换基因及其靶基因上游同源臂和下游同源臂的融合片段与靶细菌染色体DNA以单交换的形式发生同源重组，在抗生素选择压力和诱导剂同时存在的条件下筛选有抗生素抗性的重组子，得到将以上任一所述的载体整合到靶细菌染色体的阳性转化子；
3)将步骤2)中获得的阳性转化子转接于含有诱导剂的液体培养基中，促使同源臂之间发生第二次单交换，然后将培养的菌液稀释涂布不含诱导剂的平板上进行反筛，获得靶基因无痕遗传改造的重组菌。
本发明将抗毒素开关控制的毒素作为反筛标记，建立高效、稳定的细菌无痕遗传操作载体。该载体利用组成型启动子持续表达毒素蛋白，并利用诱导型启动子诱导表达抗毒素蛋白，建立了毒素-抗毒素蛋白的精确表达元件。在添加诱导剂的条件下，抗毒素蛋白大量表达，完全抑制毒素蛋白的毒性，细胞正常生长；在不添加诱导剂的条件下，抗毒素蛋白不表达或表达水平低，不能抑制或不能完全抑制毒素蛋白的毒性，细胞不能生长，可作为无痕遗传操作的高效反筛标记。因而，通过对抗毒素蛋白进行精确调控能够有效地提高毒素蛋白作为反筛标记的作用效果。本发明的遗传操作载体能用于芽胞杆菌和棒杆菌(Corynebacterium)等革兰氏阳性细菌的无痕基因敲除、敲入、替换、点突变以及大片段DNA插入和删除(大于194kb)等遗传操作，其反筛效率高于98％，突变效率最高能够达到100％，具有简便、快捷、高效和用途广泛的特征。
附图说明
参考以下附图，将有助于更好地理解本发明的方案及有益效果。
图1为利用RelB-RelE构建抗毒素开关控制的毒素反筛元件(TCCRAS)的示意图。
图2为重组质粒pWYE448和pWYE585的PliaG-relE-relB和relB-relE-P45基因片段PCR鉴定图。
图3为重组质粒pWYE448图谱。
图4为重组质粒pWYE585图谱。
图5为TCCRAS在枯草芽胞杆菌中的有效性验证图。
图6为TCCRAS在谷氨酸棒杆菌中的有效性验证图。
图7为pWYE469的质粒图谱。
图8为pWYE486的质粒图谱。
图9为pWYE587的质粒图谱。
图10为利用本发明的载体进行无痕敲除过程的示意图。
图11为利用本发明的载体进行点突变过程的示意图。
图12为利用本发明的载体进行基因插入过程的示意图。
图13为利用本发明的载体进行基因替换过程的示意图。
图14为pWYE469转化枯草芽胞杆菌W168后与菌体基因组发生第一次单交换的PCR验证图。
图15为pWYE493转化枯草芽胞杆菌W168后与菌体基因组发生第一次单交换的PCR验证图。
图16为pWYE857转化枯草芽胞杆菌W168后与菌体基因组发生第一次单交换的PCR验证图。
图17为枯草芽胞杆菌amyE基因的无痕敲除的反筛效率统计图。
图18为枯草芽胞杆菌pps操纵子无痕敲除的反筛效率统计图。
图19为枯草芽胞杆菌染色体大片段dltA-rocR无痕敲除的反筛效率统计图。
图20为pWYE469转化枯草芽胞杆菌W168后与菌体基因组发生第二次单交换删除了TCCRAS和抗生素抗性基因的PCR验证图。
图21为pps操纵子上游同源臂和pps部分序列(片段1)、pps操纵子及其上下游同源臂(片段2)和pps操纵子上游同源臂序列(片段3)示意图。
图22为参照图21的pps操纵子删除的PCR验证图。
图23为pps操纵子及其上下游同源臂(片段1)、pps操纵子上游同源臂和pps操纵子前22kb序列(片段2)以及pps操纵子后16kb序列和pps操纵子下游同源臂序列(片段3)示意图。
图24为参照图23的pps操纵子删除的PCR验证图。
图25为dltA-rocR上游同源臂和dltA-rocR部分序列(片段1)、dltA-rocR及其上下游同源臂(片段2)和dltA-rocR上下游同源臂序列(片段3)示意图。
图26为参照图25的dltA-rocR删除的PCR验证图。
图27为枯草芽胞杆菌amyE基因无痕敲除的功能验证图。
图28为pWYE491转化枯草芽胞杆菌W168后与菌体基因组发生第一步单交换菌株PCR验证图。
图29为枯草芽胞杆菌recU基因定点突变的反筛效率统计图。
图30为枯草芽胞杆菌recU基因定点突变的测序验证图。
图31为枯草芽胞杆菌recU基因定点突变的功能验证图。
图32为pWYE549转化枯草芽胞杆菌BS097后与菌体基因组发生第一次单交换后的的PCR验证图。
图33为枯草芽胞杆菌pps位点无痕插入12.3-kb trp-thrABC操纵子的反筛效率统计图。
图34为枯草芽胞杆菌pps位点无痕插入trp-thrABC操纵子的PCR验证图。
图35为pWYE595转化谷氨酸棒杆菌ATCC13032后与菌体基因组发生了第一次单交换的PCR验证图。
图36为谷氨酸棒杆菌upp基因无痕敲除的反筛效率统计图。
图37为谷氨酸棒杆菌无痕敲除upp基因的重组菌的PCR验证图。
图38为谷氨酸棒杆菌upp基因无痕敲除的功能验证图。
图39为pWYE590转化谷氨酸棒杆菌ATCC13032后与菌体基因组发生第一次单交换的PCR验证图。
图40为谷氨酸棒杆菌lysE基因无痕替换为大肠杆菌cadA基因的反筛效率统计图。
图41为谷氨酸棒杆菌lysE基因无痕替换为大肠杆菌cadA基因的PCR验证图。
图42为谷氨酸棒杆菌lysE基因无痕替换为大肠杆菌cadA基因的功能验证图。
图43为pWYE848的质粒图谱。
图44为利用MazF-MazE表达元件作为反筛标记无痕敲除枯草芽胞杆菌amyE基因的反筛效率统计图。
具体实施方式
以下结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式进行更加详细地说明，以便能够更好地理解本发明的方案以及其各个方面的优点。然而，以下描述的具体实施方式和实施例仅是说明的目的，而不是对本发明的限制。具体来说，以下描述均以(野生型)枯草芽胞杆菌W168和谷氨酸棒杆菌ATCC13032为例。然而本领域技术人员应理解，本发明对枯草芽胞杆菌和谷氨酸棒杆菌的遗传操作系统可用于其他合适的菌株。
以下通过具体实施例进一步说明本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
如未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，可参见《分子克隆实验指南(第3版)》(科学出版社)、《微生物学实验(第4版)》(高等教育出版社)以及相应仪器和试剂的厂商说明书等。
实施例中所用仪器设备和试剂为市售的常用仪器、试剂。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例1抗毒素开关控制的毒素反筛元件(TCCRAS)的构建
(1)基因扩增
以枯草芽胞杆菌W168(购自美国Bacillus Genetic Stock Center，货号1A308)基因组DNA为模板，P1/P2为引物PCR扩增PliaG启动子基因(片段1，图1，SEQ IDNO：3)；以大肠杆菌W3110(购自美国Coli Genetic Stock Center，货号4474)基因组DNA为模板，P3/P4为引物扩增毒素蛋白relE基因(片段2，图1，SEQ ID NO：1)；以大肠杆菌W3110基因组DNA为模板，P5/P6为引物扩增抗毒素蛋白relB基因(片段3，图1，SEQ ID NO：2)；以谷氨酸棒杆菌ATCC13032(购自美国典型微生物保藏中心ATCC，货号534)基因组DNA为模板，P9/P10为引物扩增P45启动子基因(片段4，图1，SEQ ID NO：4)；PCR扩增结束后，将四个PCR产物进行琼脂糖凝胶回收后，作为模板进行SOE-PCR反应:以片段1、片段2、片段3作为模板，P1/P6为引物进行重叠延伸聚合酶链(SOE-PCR)反应，扩增得到PliaG-relE-relB(片段5，见图1，SEQ ID NO：5)；以片段2和片段3作为模板，P7/P8为引物，扩增得到片段6；最后，以片段4和片段6为模板、以P7/P10为引物，扩增得到relB-relE-P45(片段7，图1，SEQ ID NO：6)。
(2)酶切、连接与转化
PCR扩增结束后，将步骤(1)所得的PCR片段5进行琼脂糖凝胶回收后，用限制性内切酶BamHI/SacII进行酶切，与同样酶切的整合载体pAX01(含有红霉素和林可霉素抗性基因，购自美国Bacillus Genetic Stock Center，货号ECE137)进行连接，得到图1A所示的RelB-RelE毒素-抗毒素系统在枯草芽胞杆菌中的共表达元件。将步骤(1)所得的片段7进行琼脂糖凝胶回收后，用限制性内切酶HindIII和SalI进行酶切，与同样酶切的载体pXMJ19(含有氯霉素抗性基因)进行连接，得到图1B所示的RelB-RelE毒素-抗毒素系统在谷氨酸棒杆菌中的共表达元件。
采用CaCl2法制备大肠杆菌EC135感受态细胞，连接产物转入大肠杆菌EC135感受态细胞中，分别在加有氨苄青霉素(100μg/ml)或氯霉素(20μg/ml)的LB平板上筛选能够在含有TCCRAS的枯草芽胞杆菌或谷氨酸棒杆菌中表达TCCRAS的转化子。
(3)PCR与测序验证
以步骤(2)获得的转化子菌落为模板，分别以P3/P6或P7/P10为引物进行PCR扩增，鉴定转化子携带的PliaG-relE-relB或relB-relE-P45基因片段。
用引物P3/P6对转化子进行PCR扩增，得到大约668bp大小的目的条带(图2,泳道2)，经质粒提取获得含有TCCRAS的重组质粒pWYE448(图3)。重组质粒pWYE448携带的PliaG-relE-relB基因片段经测序得到SEQ ID NO：5所述的核苷酸序列，为668bp。大肠杆菌RelB-RelE毒素-抗毒素系统在芽胞杆菌中共表达的核苷酸序列为SEQ IDNO：5。
利用引物P7/P10对转化子进行PCR扩增，得到大约733bp(图2，泳道3)目的产物，经质粒提取获得含有TCCRAS的重组质粒pWYE585(图4)。重组质粒pWYE585携带的relB-relE-P45基因片段经测序得到SEQ ID NO：6所述的核苷酸序列，为733bp。大肠杆菌RelB-RelE毒素-抗毒素系统在谷氨酸棒杆菌中共表达的核苷酸序列为SEQ IDNO：6。
上述所用的引物序列(5’-3’)如下：
P1：TCCCCGCGGCAAAAATCAGACCAGACAAAAG(SacII)
P2：AAGAGCATTCACCACCTTTTCATTCATTCTATTATAAAGGAAAA
P3：AAAGGTGGTGAATGCTCTTATGGCGTATTTTCTGGATTTTGACG
P4：TGAACTCTGATCAGAGAATGCGTTTGACCGCCTCG
P5：CATTCTCTGATCAGAGTTCATCCAGCGTCACACGT
P6：GGAGGATCCATGGGTAGCATTAACCTGCGTAT(BamHI)
P7：TCGCAAGCTTAAAGGAGGAACCGAATGGGTAGCATTAAC(HindIII)
P8：TTAAAAGCAAAGGAGGACAACCATGGCGTATTTTCTGGAT
P9：GGTTGTCCTCCTTTGCTTTTAAAACCATGCATT
P10：CTAGGTCGACGTGTTTTTCTGTGATCCTCATTCGC(SalI)
实施例2抗毒素开关控制的毒素反筛元件TCCRAS作为反筛标记的有效性验证
(1)TCCRAS在枯草芽胞杆菌中的有效性验证
将质粒pAX01和上述重组质粒pWYE448分别转化枯草芽胞杆菌W168自然感受态细胞，得到的重组菌株BS048(W168ΔlacA::PxylA-erm)和BS084(W168ΔlacA::PliaG-relE-PxylA-relB-erm)。将菌株BS048和BS084分别在含有和不含有木糖的MLS(0.5μg/mL红霉素+12.5μg/mL林可霉素)平板上划线培养，检测毒素蛋白RelE芽胞杆菌的毒性。结果显示，BS084菌株在添加1％木糖的MLS平板上能够生长，在不含有木糖的平板上不能生长(图5)。因此，在枯草芽胞杆菌中单独表达毒素蛋白编码基因relE能够抑制菌株的生长，TCCRAS能够作为枯草芽胞杆菌无痕遗传操作的有效反筛标记。
(2)TCCRAS在谷氨酸棒杆菌中的有效性验证
将质粒pXMJ19(购自于Biovector Science Lab,Inc,货号SMD1168H)和上述重组质粒pWYE585分别转化谷氨酸棒杆菌ATCC13032，得到的重组菌株13032/pXMJ19和13032/pWYE585。分别将重组菌株在含有与不含有IPTG的氯霉素平板上划线培养，检测毒素蛋白RelE谷氨酸棒杆菌的毒性。结果显示，13032/pWYE585菌株在添加1mMIPTG的氯霉素平板上能够生长，在不添加IPTG的氯霉素平板上不能生长(图6)。因此，在谷氨酸棒杆菌中单独表达毒素蛋白编码基因relE能够抑制菌株的生长，TCCRAS能够作为谷氨酸棒杆菌无痕遗传操作的有效反筛标记。
实施例3利用TCCRAS构建枯草芽胞杆菌的无痕遗传操作载体
(1)基因的扩增
以枯草芽胞杆菌W168基因组DNA为模板，以P11/P12为引物扩增淀粉酶基因amyE的上游同源臂，大小为516bp；以P13/P14为引物扩增淀粉酶基因amyE的下游同源臂，大小为766bp。PCR扩增结束后，将上述两个PCR产物进行琼脂糖凝胶回收，并以回收的DNA产物作为模板进行SOE-PCR反应，将所得的PCR片段进行琼脂糖凝胶回收，并利用普通PCR Taq酶对其末端进行加A。
(2)连接、转化与PCR验证
纯化步骤(1)中的加A反应结束的DNA片段，并与pMD19T-simple vector(购自于中国的宝生物工程(大连)有限公司,货号6013)连接。采用CaCl2法制备大肠杆菌EC135(菌种保藏号CGMCC NO.5925，专利号CN201210080124.6)感受态细胞，将连接产物转入大肠杆菌EC135感受态细胞中，并在加有氨苄青霉素(100μg/ml)的LB平板上筛选转化子。以转化子菌落为模板，以P11/P14为引物PCR扩增淀粉酶基因amyE的同源臂，筛选能够扩增得到大小为1282bp的含有amyE基因同源臂的阳性转化子。
(3)淀粉酶基因无痕敲除载体构建
利用限制性内切酶ClaI对质粒pWYE448进行酶切，琼脂糖凝胶回收获得大小约为3900bp的TCCRAS的基因片段。进一步提取上述步骤(2)中的阳性转化子的质粒DNA，用ClaI进行酶切，酶切产物纯化与同样酶切处理的TCCRAS的基因片段进行连接。连接产物转入到大肠杆菌中，得到含有TCCRAS的amyE基因无痕敲除质粒，命名为pWYE469(图7)。
(4)芽胞杆菌无痕遗传操作质粒构建
利用限制性内切酶KpnI对pWYE469用进行酶切，琼脂糖凝胶回收获得大小约为6600bp的载体片段。将酶切获得的载体片段进行自连，得到可用于枯草芽胞杆菌无痕遗传操作的通用型载体pWYE486(SEQ ID NO：7)，该载体含有多克隆位点(ApaI、NcoI、KpnI、NheI和SphI等)、TCCRAS和红霉素抗性编码基因(图8)。
上述所用的引物序列(5’-3’)如下：
P11：GGGCCCACGCGTCCATGGGGTACCCGGCATTATGTTTGAATTTCC(ApaI-MluI-NcoI-KpnI)
P12：TTTGTCTGATTCAAACCGATGTGAAGACTGGAGAAT
P13：ACATCGGTTTGAATCAGACAAAACTTTTCTCTTGC
P14：ATCGATGCATGCGCTAGCGGTACCCATCTACAATTTGGTCCAGCTCCT(ClaI-SphI-NheI-KpnI)
实施例4利用TCCRAS构建谷氨酸棒杆菌无痕遗传操作载体
(1)基因扩增
以质粒pWYE585为模板，以P10/P15为引物PCR扩增得到大小为2976bp的目的片段，该片段含有氯霉素抗性编码基因cat、转录调节蛋白编码基因lacIq、Ptac启动子、TCCRAS和P45启动子。
(2)酶切、连接与验证
PCR扩增结束后，将步骤(1)所得的PCR片段进行琼脂糖凝胶回收后，用限制性内切酶SalI和PstI进行酶切，并与同样酶切的pUC19载体(购自于中国的宝生物工程(大连)有限公司,货号3219)进行连接。连接产物转化大肠杆菌EC135感受态细胞，并在含有氨苄青霉素(100μg/ml)的LB平板上筛选转化子。以转化子菌落为模板，以P10/P15为引物PCR扩增。筛选的阳性转化子能够扩增得到大小约为3000bp的目的条带。提取阳性转化子的质粒DNA，进一步经测序鉴定得到序列正确的含有TCCRAS的质粒pWYE587(SEQ ID NO：8)，该质粒为谷氨酸棒杆菌无痕遗传操作的通用型载体(见图9)。
上述所用的引物序列(5’-3’)如下：
P10：CTAGGTCGACGTGTTTTTCTGTGATCCTCATTCGC(SalI)
P15：TCGCCTGCAGGAAGGGCACCAATAACTGCCTTA(PstI)
实施例5枯草芽胞杆菌淀粉酶编码基因amyE的无痕敲除、制磷脂菌素合成操纵子(ppsEDCBA)和染色体大片段dltA-rocR的无痕删除
参照图10所示的利用RelB-RelE作为反筛标记进行基因替换的过程原理，构建amyE、ppsEDCBA和dltA-rocR无痕敲除突变株，具体步骤如下：
(1)载体构建
以枯草芽胞杆菌W168染色体DNA为模板、以P16/P17为引物PCR扩增含有pps操纵子上游同源臂的片段，获得大小为738bp的扩增片段；以枯草芽胞杆菌W168染色体DNA为模板，以P18/P19为引物PCR扩增含有pps操纵子下游同源臂的片段，获得大小为962bp的扩增片段。
以P16/P19为引物，以上述两个PCR纯化回收片段作为模板进行SOE-PCR。进一步用限制性内切酶NheI对纯化的重叠延伸PCR产物进行酶切，并与相同酶切并去磷酸化处理的pWYE486载体进行连接。连接产物转入大肠杆菌中，得到用于pps基因无痕敲除突变的质粒pWYE493(pWYE486-Δpps)。
以枯草芽胞杆菌W168染色体DNA为模板、以P23/P24为引物PCR扩增dltA-rocR上游同源臂，获得大小为690bp的扩增片段；以枯草芽胞杆菌W168染色体DNA为模板，以P24/P26为引物PCR扩增dltA-rocR操纵子下游同源臂，获得大小为658bp的扩增片段。
以P23/P26为引物，以上述两个PCR纯化回收片段作为模板进行SOE-PCR。进一步用限制性内切酶NheI对纯化的重叠延伸PCR产物进行酶切，并与相同酶切并去磷酸化处理的pWYE486载体进行连接。连接产物转入大肠杆菌中，得到用于dltA-rocR基因片段无痕敲除突变的质粒pWYE857(pWYE486-ΔdltA-rocR)。
(2)转化和PCR验证
将实施例3的步骤(3)中所构建amyE基因无痕敲除载体pWYE469、pps操纵子无痕敲除载体pWYE493和dltA-rocR无痕敲除载体pWYE857分别转化枯草芽胞杆菌W168感受态细胞，并在含有1％木糖和MLS(0.5μg/mL红霉素+12.5μg/mL林可霉素)的LB平板上筛选发生第一次单交换的转化子(图10，步骤2)。继续以筛选得到的将转化子在LB+MLS(0.5μg/mL红霉素+12.5μg/mL林可霉素)+1％木糖连续三次传代培养之后，用转化pWYE469所得转化子的菌体作为模板，以P11/P14为引物进行PCR验证，筛选能够扩增得到大约1282bp目的条带的转化子(图14)，即获得了通过为发生了第一次单交换，整合含有RelE-RelB表达元件、抗生素基因和amyE同源臂的宿主重组菌，命名为BS087(W168ΔamyE::pWYE469)；用转化pWYE493所得转化子的菌体为模板，以P16/P19为引物进行PCR验证，筛选能够扩增得到大约1700bp目的条带的转化子(图15)，即获得了通过为发生了第一次单交换，整合含有TCCRAS、抗生素基因和pps同源臂的宿主重组菌，命名为BS095(W168Δpps::pWYE493)；用转化pWYE857所得转化子的菌体为模板，以P23/P26为引物进行PCR验证，筛选能够扩增得到大约1348bp目的条带的转化子(图16)，即获得了通过为发生了第一次单交换，整合含有TCCRAS、抗生素基因和dltA-rocR同源臂的宿主重组菌，命名为BS214(W168ΔdltA-rocR::pWYE857)。
(3)TCCRAS和抗生素基因的删除
将上述所得的转化子BS087、BS095和BS214在含有1％木糖的LB液体培养基中过夜培养；培养液稀释10-4-10-8倍后，取200μl涂布在LB平板上过夜培养；培养所得的单菌落为发生第二次单交换删除了TCCRAS和抗生素基因的重组菌。
(4)TCCRAS作为反筛标记的反筛效率检测
将本实施例步骤(3)获得的重组菌BS087同时在含有与不含有1％木糖和MLS(0.5μg/mL红霉素+12.5μg/mL林可霉素)的LB平板上进行传代培养。结果显示，所有重组菌都能在LB平板生长，不能在含有1％木糖和MLS(0.5μg/mL红霉素+12.5μg/mL林可霉素)的LB平板上生长(图17)。将本实施例步骤(3)获得的重组菌BS095同时在含有与不含有1％木糖和MLS(0.5μg/mL红霉素+12.5μg/mL林可霉素)的LB平板上进行传代培养。结果显示，所有重组菌都能在LB平板生长，99.4％的重组菌不能在含有1％木糖和MLS(0.5μg/mL红霉素+12.5μg/mL林可霉素)的LB平板上生长(图18)。将本实施例步骤(3)获得的重组菌BS214同时在含有与不含有1％木糖和MLS(0.5μg/mL红霉素+12.5μg/mL林可霉素)的LB平板上进行传代培养。结果显示，所有重组菌都能在LB平板生长，98.7％的重组菌不能在含有1％木糖和MLS(0.5μg/mL红霉素+12.5μg/mL林可霉素)的LB平板上生长(图19)。以上结果表明TCCRAS和抗生素基因已成功从BS087,BS095及BS214的染色体上删除，TCCRAS的反筛效率分别为100％,99.4±1.1％和98.7±1.1％。
(5)突变株筛选、amyE突变株功能验证与突变效率检测
以上述步骤(3)中BS087反筛所得的重组子为模板，以P11/P14为引物进行PCR检测。结果显示amyE基因无痕敲除菌株能够扩增到大约1282bp目的条带，而对照菌株W168用相同引物扩增得到大小约为3407bp的片段(图20)。表明重组菌株的amyE基因已被无痕敲除，并将该重组菌命名为BS089(W168ΔamyE)。
以上述步骤(3)中BS095反筛所得的重组子为模板，以P16/P19/P20为引物进行PCR检测，进一步以对照菌株W168染色体DNA为模板，分别以P16/P19/P20扩增pps操纵子上游同源臂及其ppsE基因428bp片段。W168能够扩增得到1167bp片段(图21，片段1；图22，泳道2)，片段2(图21)太大，无法用当前PCR条件获得；突变株扩增得到1700bp片段(图21，片段3；图22，泳道3)。为进一步验证W168的pps操纵子，以P16/P21PCR扩增pps操纵子上游同源臂和pps操纵子前22kb序列(图23，片段2)，以P19/P22为引物PCR扩增pps操纵子后16kb序列和pps操纵子下游同源臂序列(图23，片段3)。对照菌株PCR扩增时，由于片段1太大，未能成功扩增得到40.1kb目的片段(图23，片段1；图24，泳道1)，所以将其分为23.5kb的片段2(图23，片段2；图24，泳道2)和17.1kb的片段3(图23，片段3；图24，泳道3)进行扩增；突变株用P16/P19扩增得到约为1.7kb的片段(图24，泳道4)。说明删除pps已被无痕敲除，并将该重组菌命名为BS097(W168ΔppsEΔppsDΔppsCΔppsBΔppsA)或BS097(W168ΔppsEDCBA)。随机挑选78个突变子进行PCR检测，统计结果显示upp操纵子无痕删除的突变效率为70.1±4.5％。
以上述步骤(3)中BS214反筛所得的重组子为模板，以P23/P26/P27为引物进行PCR检测，进一步以对照菌株W168染色体DNA为模板，分别以P23/P26/P27扩增dltA-rocR上游同源臂及dltA-rocR内部269bp片段。W168能够扩增得到959bp片段(图25，片段1；图26，泳道2)，片段2(图25)太大，无法用当前PCR条件获得；突变株扩增得到1348bp片段(图25，片段3；图26，泳道3)，并将该重组菌命名为BS215(W168ΔdltA-rocR)。随机挑选78个突变子进行PCR检测，统计结果显示194.9kb的dltA-rocR大片段无痕删除的突变效率为29.5±4.4％。
分别将重组菌BS089与野生型菌株W168接种于含有1％可溶性淀粉的LB平板上进行过夜培养，第二天加碘液显色。结果显示，野生型菌株W168的菌体周围含有白色的淀粉水解圈，而重组菌BS089的菌体周围没有淀粉水解圈(图27)。通过功能验证实验说明重组菌BS089上的淀粉酶已经失活，不能水解淀粉，从而不能形成淀粉水解圈。随机挑选240个突变子进行淀粉酶功能检测，统计结果显示amyE基因无痕敲除的突变效率为89.6±9.0％。
以上结果表明利用TCCRAS作为反筛标记建立的无痕操作系统成功实现了枯草芽胞杆菌染色体基因的无痕敲除和大片段无痕删除。
上述所用的引物序列(5’-3’)如下：
P11：GGGCCCACGCGTCCATGGGGTACCCGGCATTATGTTTGAATTTCC(ApaI-MluI-NcoI-KpnI)
P14：ATCGATGCATGCGCTAGCGGTACCCATCTACAATTTGGTCCAGCTCCT(ClaI-SphI-NheI-KpnI)
P16:CTAGCTAGCACGGAACGGAAATGACAAACG(NheI)
P17:CTGGAGGGAAAGCGGATTAGCGGACAGAGGC
P18:CTAATCCGCTTTCCCTCCAGTTCTCATAATAAG
P19:CTAGCTAGCAAGCACCTAGTTCTTCAGATGTG(NheI)
P20：GAAGTGGCACAGGCTATGGAGC
P21：AATGTAGCCAAACCTCGTCAAGTCG
P22：CAGTGTTTAGTGTCGCACCAGAAGC
P23:CTAGCTAGCGTTAACTGCCAAAGGATCTGCC(NheI)
P24:CCTGCTCCGGAAGTTATTCTCTCTCCAATTAG
P25:AGAGAATAACTTCCGGAGCAGGAAGCCTGATC
P26:CTAGCTAGCTTGTGATGGGTGTAGACGCCTT(NheI)
P27：CGTTCGGACGGAATAGACAGG
实施例6枯草芽胞杆菌霍利迪连结体解离酶编码基因recU的定点突变
参照图11所示的利用RelB-RelE作为反筛标记进行基因点突变的过程原理，构建recUA107C突变株，具体步骤如下：
(1)载体构建
以枯草芽胞杆菌W168染色体DNA为模板、以P28/P29为引物PCR扩增含有recU基因上游同源臂和recU基因突变位点的片段，获得大小为796bp的扩增片段；以枯草芽胞杆菌W168染色体DNA为模板，以P30/P31为引物PCR扩增含有recU基因下游同源臂和recU基因突变位点的片段，获得大小为730bp的扩增片段。
以P28/P31为引物，以上述两个PCR纯化回收片段作为模板进行SOE-PCR。进一步用限制性内切酶NheI对纯化的重叠延伸PCR产物进行酶切，并与相同酶切并去磷酸化处理的pWYE486载体进行连接。连接产物转入大肠杆菌中，得到用于recU基因定点突变的质粒pWYE491(pWYE486-recUA107C)。
(2)转化与PCR验证
将质粒pWYE491转化枯草芽胞杆菌W168感受态细胞，并在含有木糖和MLS(0.5μg/mL红霉素+12.5μg/mL林可霉素)的LB平板上筛选转化子。继续以转化子的菌体作为模板，以P1/P6为引物进行PCR验证，筛选能够扩增得到大小约为668bp目的条带的转化子(图28)。获得了通过第一次单交换整合有TCCRAS、抗生素基因和同源臂的重组菌，命名为BS092(W168ΔrecU::pWYE491)。
(3)TCCRAS和抗生素基因的删除
将上述所得的BS092在含有木糖的LB液体培养基中过夜培养，培养液稀释10-4-10-8倍后，取200μl涂布在LB平板上过夜培养，培养所得的单菌落即为发生第二次单交换删除了TCCRAS和抗生素基因的重组菌。
(4)TCCRAS作为反筛标记的反筛效率检测
将获得的重组菌分别在含有与不含有木糖和MLS(0.5μg/mL红霉素+12.5μg/mL林可霉素)的LB平板上进行传代培养。结果显示，所有菌落都能在LB平板生长，不能在含有木糖和MLS(0.5μg/mL红霉素+12.5μg/mL林可霉素)的LB平板上生长(图29)，表明TCCRAS和抗生素基因已经从BS092的染色体上删除，TCCRAS的反筛效率为100％。
(5)recU点突变菌株筛选、功能验证与突变效率检测
以上述步骤(3)反筛所得到的重组子的染色体DNA为模板,以P28/P31为引物进行PCR扩增，并将扩增得到的片段进行测序。测序结果显示重组子的recU基因发生点突变，即第107位核苷酸由腺嘌呤A突变为胞嘧啶C，对应第36位谷氨酰胺E突变为丙氨酰A，与预期的突变位点一致(图30)。获得recU基因突变的重组菌株，命名为BS093(W168RecUE36A)。
由于甲磺酸甲酯(methyl methanesulfonate，MMS)是一种DNA损伤试剂，能够将鸟嘌呤烷化为7-甲基鸟嘌呤，将腺嘌呤烷化为3-甲基腺嘌呤，从而导致碱基错配和DNA复制终止。recU基因编码的霍利迪连结体解离酶参与DNA损伤修复同源重组,RecUE36A突变导致基因失活，使DNA同源重组和损伤修复不能正常进行，细胞不能在含有MMS的平板上生长。分别将野生型菌株W168与重组菌株BS092培养于含有100μg/ml甲磺酸甲酯的LB平板上，结果显示野生型菌株W168能够在添加MMS的培养基上生长,而点突变菌株BS093(W168RecUE36A)不能生长(图31)。表明重组菌BS093的recU基因已经发生突变，与预期的突变效果相一致。随机挑选156个突变子进行突变功能检测，统计结果显示recU基因点突变的突变效率为64.1±4.8％。
以上结果表明利用TCCRAS作为反筛标记建立的无痕操作系统成功实现了枯草芽胞杆菌染色体基因的点突变。
上述所用的引物序列(5’-3’)如下：
P1：TCCCCGCGGCAAAAATCAGACCAGACAAAAG(SacII)
P6：GGAGGATCCATGGGTAGCATTAACCTGCGTAT(BamHI)
P28：CTAGCTAGCCTTTCCCAGCCTTATCCTTTCC(NheI)
P29：TAAGTCATCTGCGAGGGTCATT
P30：AATGACCCTCGCAGATGACTTA
P31：CTAGCTAGCAGAAACCATGACGGCAAATGTA(NheI)
实施例7在枯草芽胞杆菌pps位点插入融合操纵子trp-thrABC
参照图12所示的利用TCCRAS作为反筛标记进行基因插入的过程原理，构建thrABC-trp无痕插入ppsEDCBA敲除的突变株，具体步骤如下：
(1)载体构建
以大肠杆菌W3110染色体DNA为模板，以P32/P41为引物PCR扩增大小为5154bp的thrABC操纵子。以谷氨酸棒杆菌ATCC13032染色体DNA为模板，以P34/P35为引物PCR扩增大小为7183bp的trp操纵子。以枯草芽胞杆菌W168染色体DNA为模板，以P36/P37为引物PCR扩增大小为1133bp的pps操纵子上游同源臂ppsU。以枯草芽胞杆菌W168染色体DNA为模板，P38/P39为引物扩增大小为970bp的pps操纵子下游同源臂ppsD。
将扩增得到的thrABC片段用KpnI和SphI进行双酶切，并与同样酶切的pWYE486载体相连接，得到重组质粒pWYE-thrABC。然后，将pps下游同源臂用SphI酶切，并与同样酶切处理的pWYE486-thrABC连接，得到重组质粒pWYE486-thrABC-ppsD。然后，用NheI和ApaI酶切trp操纵子，并与同样酶切处理的pWYE486-thrABC-ppsD载体连接，得到含有重组质粒pWYE486-trp-thrABC-ppsD。最后，将pps上游同源臂用ApaI酶切，并与同样酶切处理的pWYE486-trp-thrABC-ppsD连接，得到重组质粒pWYE486-ppsU-trp-thrABC-ppsD命名为pWYE549。
(2)转化与PCR验证
将质粒pWYE549转化枯草芽胞杆菌BS097(W168ΔppsEDCBA)中，并在含有木糖和MLS(0.5μg/mL红霉素+12.5μg/mL林可霉素)的LB平板上筛选转化子。进一步以转化子的菌体作为模板，以P40/P41为引物进行PCR验证。筛选能够扩增到大约1000bp目的条带的转化子(图32)，即为发生了第一次单交换，含有TCCRAS、抗生素基因、同源臂和trp-thrABC操纵子的重组菌，命名为BS114(W168ΔppsEDCBA::pWYE549)。
(3)TCCRAS和抗生素基因的删除
将上述所得的BS114在含有木糖的LB液体培养基中过夜培养，培养液稀释10-4-10-8倍后，取200μl涂布在LB平板上过夜培养。培养所得的单菌落为发生第二次单交换删除了TCCRAS和抗生素基因的重组菌。
(4)TCCRAS作为反筛标记的反筛效率检测
将获得的重组菌分别在含有与不含有木糖和MLS(0.5μg/mL红霉素+12.5μg/mL林可霉素)的LB平板上进行传代培养。结果显示，所有重组菌都能在LB平板生长，其中97％以上的重组菌不能在含有木糖和MLS(0.5μg/mL红霉素+12.5μg/mL林可霉素)的LB平板上生长(图33)。表明TCCRAS和抗生素基因已成功从BS114的染色体上删除，TCCRAS的反筛效率达到99.4±1.1％。
(5)突变株筛选及PCR验证
以步骤(3)所得的重组菌的染色体DNA为模板，以P40/P41为引物进行PCR验证，筛选能够扩增得到约1000bp目的条带的重组菌，即为整合了trp-thrABC的突变株，命名为BS115(W168ΔppsEDCBA::trp-thrABC)。
进一步以BS097染色体DNA为模板，P36/P39PCR扩增得到约为2.1kb的pps上下游同源臂(图34，泳道2)；以BS115染色体DNA为模板，外源基因引物P34/WB1206为引物扩增得到约为12.3kb的trp-thrABC片段(图34，泳道3)；以BS115染色体DNA为模板，W168染色体引物P36/P39扩增得到约为14.4kb的pps上下游同源臂和trp-thrABC片段(图34，泳道4)。实验结果说明pps位点成功插入了大小为12.3kb的trp-thrABC操纵子。随机挑选78个突变子进行PCR检测，统计结果显示trp-thrABC操纵子无痕插入的突变效率为49.0±3.7％。
以上结果说明利用TCCRAS作为反筛标记建立的无痕操作系统能成功实现枯草芽胞杆菌染色体上大片段DNA插入。
上述所用的引物序列(5’-3’)如下：
P32：CGGGGTACCCTAGCTAGCTGGGGCTTTTAGAGCAACGAGA(KpnI-NheI)
P33：ACATGCATGCATGTGTGCACCAAACCCGGCCTGATTGAGATA(SphI)
P34:ATTAGGGCCCTCCCACTATGTGATAAAGTCCC(ApaI)
P35:CTAGCTAGCTCCAAAACCCTGAGATTTCCTA(NheI)
P36：ATTAGGGCCCTCCATAGGCGGCAACCCAATC(ApaI)
P37：ATTAGGGCCCAGCGGATTAGCGGACAGAGGC(ApaI)
P38：ACATGCATGCTTCCCTCCAGTTCTCATAATAAG(SphI)
P39：ACATGCATGCCACCTAGTTCTTCAGATGTGCTG(SphI)
P40：GGTTCCCGCTGGCGCAATTG
P41：TTGGCGCGGGCCAGTGCGGC
实施例8谷氨酸棒杆菌尿嘧啶磷酸核糖转移酶编码基因upp的无痕敲除
(1)载体构建
以谷氨酸棒杆菌ATCC13032的染色体DNA为模板，以P42/P43为引物扩增upp基因的上游同源臂，获得大小为704bp的扩增片段。进一步以P44/P45为引物扩增upp基因下游同源臂，获得大小为681bp的扩增片段。最后以P42/P45为引物，以上述两个PCR纯化回收片段作为模板进行SOE-PCR反应，获得大小为1385bp的融合片段。
利用限制性内切酶EcoRI和BamHI对纯化的融合片段进行酶切，并与相同酶处理的pWYE587载体相连接。连接产物转入大肠杆菌中，得到用于谷氨酸棒杆菌upp基因无痕敲的质粒pWYE595(pWYE587-Δupp)
(2)转化和PCR验证
将质粒pWYE595转化谷氨酸棒杆菌ATCC13032的感受态细胞，并在含有IPTG和氯霉素的LB平板上筛选转化子。进一步以转化子的菌体为模板，进行PCR验证。筛选能够扩增到大约1403bp目的条带的转化子(图35)，即为发生了第一次单交换，含有TCCRAS、抗生素基因和同源臂的重组菌，命名为CG708(13032Δupp::pWYE595)。
(3)TCCRAS和抗生素基因的删除
将上述所得的CG708在含有IPTG的LB液体培养基中过夜培养，培养液稀释10-4-10-8倍后，取200μl涂布在LB平板上过夜培养。培养所得的单菌落即为发生第二次单交换删除了TCCRAS和抗生素基因的重组菌。
(4)TCCRAS作为反筛标记的反筛效率检测
将上述步骤(3)中获得的重组菌分别在含有与不含有IPTG和氯霉素的LB平板上进行传代培养。结果显示，所有菌落都能在LB平板生长，不能在含有IPTG和氯霉素的LB平板上生长(图36)。表明TCCRAS和抗生素基因已成功从CG708的染色体上删除，TCCRAS的反筛效率为100％。
(5)upp突变株筛选、功能验证与与突变效率检测
以上述步骤(3)所得的重组菌的染色体DNA为模板，以P42/P45为引物进行PCR扩增。结果显示，野生型菌株能够扩增到约2157bp条带，而重组菌能扩增得到大约1403bp的目的条带(图37)，即为无痕敲除upp基因的重组菌，命名为CG709(13032Δupp)。随机挑选78个突变子进行PCR检测，统计结果显示upp基因无痕敲除的突变效率为100％。
upp基因编码尿嘧啶磷酸核糖转移酶，催化尿嘧啶转化为尿嘧啶核苷酸(UMP)，以便细胞对外源尿嘧啶加以利用；同时，尿嘧啶磷酸核糖转移酶还能转化有毒的嘧啶类似物5-氟尿嘧啶(5-Fu)生成5-氟尿嘧啶核苷酸(5-Fu-UMP)，后者进一步代谢生成对胸苷酸合成酶具有强抑制作用的5-氟脱氧尿嘧啶核苷酸(5-Fu-dUMP)，使胸苷合成受阻，从而抑制细胞生长。分别将重组菌CG709与野生型菌株ATCC13032培养在含有5-氟尿嘧啶(5-Fu)的CGX培养基(含有20g/L(NH4)2SO4、0.5g/L KH2PO4、0.5/L K2HPO4、40g/L葡萄糖、0.25g/L MgSO4·7H2O、10mg/L CaCl2、10mg/L MnSO4·H2O、10mg/L FeSO4·7H2O、1mg/L ZnSO4·H2O、0.2mg/L CuSO4、0.02mg/L NiCl2和0.2mg/L生物素，pH7.0)中。结果显示，重组菌CG709能够生长于含有5-Fu的培养基中，而野生型菌株ATCC13032不能生长(图38)。表明重组菌CG709的upp基因被成功敲除，upp基因编码的嘧啶磷酸核糖转移酶已经失活。
以上结果说明利用TCCRAS作为反筛标记建立的无痕操作系统成功实现了谷氨酸棒杆菌基因的无痕敲除。
上述所用的引物序列(5’-3’)如下：
P42：CGCGGATCCGCTTCGGCAATCATCAGTC(BamHI)
P43：CCGCTTTTCCGACCGCCCAGAAGAAGACC
P44：TCTTCTGGGCGGTCGGAAAAGCGGTGGT
P45：CCGGAATTCTGGGTATTTTGCGTCCTC(EcoRI)
实施例9谷氨酸棒杆菌L-赖氨酸外排蛋白编码基因lysE无痕替换为大肠杆菌赖氨酸脱羧酶编码基因cadA
参照图13所示的利用RelB-RelE作为反筛标记进行基因替换的过程原理，构建cadA无痕替换lysE的突变株，具体步骤如下：
(1)载体构建
以谷氨酸棒杆菌ATCC13032的染色体DNA为模板，以P46/P47为引物扩增lysE基因上游同源臂lysEU，获得大小为748bp的扩增片段；同时，以P50/P51为引物扩增lysE基因下游同源臂lysED，获得大小为775bp的扩增片段；然后，以大肠杆菌W3110的染色体DNA为模板，以P48/P49为引物，扩增大肠杆菌的赖氨酸脱羧酶cadA基因，获得大小为2148bp的扩增片段。
以纯化的PCR扩增片段lysEU、lysED和cadA为模板，以P46/P51为引物，进行SOE-PCR反应。进一步利用限制性内切酶XmaI和SalI对重叠延伸PCR的纯化产物进行双酶切，并与相同酶切处理的pWYE587载体进行连接，转化于大肠杆菌中，获得用于谷氨酸棒杆菌lysE基因无痕替换为大肠杆菌cadA基因的遗传操作质粒pWYE590(pWYE587-ΔlysE::cadA)
(2)转化和PCR验证
将质粒pWYE590转化谷氨酸棒杆菌ATCC13032的感受态细胞，并在含有IPTG和氯霉素的LB平板上筛选转化子。进一步以转化子的菌体为模板进行PCR验证，筛选能够扩增到大约3682bp目的条带的转化子(图39)，即为发生了第一次单交换，含有TCCRAS、抗生素基因和同源臂的重组菌，命名为CG705(ATCC13032ΔlysE::pWYE595)。
(3)TCCRAS和抗生素基因的删除
将重组菌CG705在含有IPTG的LB液体培养基中过夜培养，培养液稀释10-4-10-8倍后，取200μl涂布在LB平板上过夜培养，培养所得的单菌落即为发生第二次单交换删除了TCCRAS和抗生素基因的重组菌。
(4)TCCRAS作为反筛标记的反筛效率检测
将上述步骤(3)获得的重组菌分别在含有与不含有IPTG和氯霉素的LB平板上进行传代培养。结果显示，所有菌落都能在LB平板生长，不能在含有IPTG和氯霉素的LB平板上生长(图40)。表明TCCRAS和抗生素基因已成功从CG705的染色体上删除，TCCRAS的反筛效率为100％。
(5)lysE无痕替换突变株筛选、功能验证与突变效率检测
以上述步骤(3)所得到的重组菌的染色体DNA为模板，以P34/P47为引物进行PCR扩增。结果显示，野生型菌株13032能够扩增得到大约2224bp的目的条带，重组菌株能扩增得到大约3682bp的目的条带(图41)。表明重组菌的lysE基因无痕替换为cadA基因，将该重组菌命名为CG706(ATCC13032ΔlysE::cadA)。随机挑选78个突变子进行PCR检测，统计结果显示lysE无痕替换为cadA的突变效率为66.7±2.2％。
由于lysE基因编码苏氨酸外排蛋白，能够增加胞内赖氨酸积累量。而来源于大肠杆菌的cadA基因编码赖氨酸脱羧酶，催化赖氨酸脱羧反应，生成戊二胺。为验证lysE基因无痕替换为cadA基因的作用效果，进一步将重组菌CG706培养在含有16g/L蛋白胨和10g/L酵母浸粉的CGX培养基(配方见实施例8，步骤5)中进行发酵培养，检测发酵过程中戊二胺的积累情况(图42)。结果显示，重组菌CG706发酵16h后开始积累戊二胺，30h时戊二胺的积累量达到最高，为4.6mM，而对照菌株不能积累戊二胺。表明重组菌CG706的lysE基因已成功无痕替换为大肠杆菌cadA基因，且lysE基因的敲除和大肠杆菌cadA基因的插入能够实现谷氨酸棒杆生物合成戊二胺。
以上结果说明利用TCCRAS作为反筛标记建立的无痕操作系统能够成功实现谷氨酸棒杆菌基因的无痕敲除、插入或替换。
上述所用的引物序列(5’-3’)如下：
P46：TCCCCCCGGGAATTGCCTCACCAAAACCTTC(XmaI)
P47：CAATAACGTTCATGATCACCATCGTGACCTATGGAAG
P48：CGATGGTGATCATGAACGTTATTGCAATATTGAATC
P49：CCCGCGAAAATTATTTTTTGCTTTCTTCTTTCAATACC
P50：GAAAGCAAAAAATAATTTTCGCGGGTTTTGGAATC
P51：ACGCGTCGACGGATATGTGGCCTGGACCTTATG(SalI)
实施例10利用MazF-MazE构建的TCCRAS系统无痕敲除枯草芽胞杆菌淀粉酶基因
(1)载体构建
以大肠杆菌W3110的染色体DNA为模板，以P52/P53为引物扩增mazF基因(SEQ ID NO：9)，获得大小为336bp的扩增片段；同时，以P54/P55为引物扩增mazE基因(SEQ ID NO：10)，获得大小为249bp的扩增片段；然后，以PliaG启动子(实施例1，片段一)、mazF基因和mazE基因为模板，以P1/P55为引物，SOE-PCR扩增PliaG-mazF-mazE融合片段，获得大小为725bp的扩增片段；以pWYE469为模板，P56/P57为引物，扩增amyE基因同源臂，获得大小为1282bp的扩增片段。
进一步利用限制性内切酶SalII对SOE-PCR的纯化产物进行酶切，并与相同酶切并去磷酸化处理的pAX01载体进行连接，转化于大肠杆菌中，获得含有MazF-MazE共表达载体pAX01-mazEF。然后用ClaI酶切pAX01-mazEF质粒，回收大小为4047bp，含有MazF-MazE表达的TCCRAS元件；用ClaI酶切pWYE486(实施例3，图8)，回收大小为2736bp的载体片段，并用碱性磷酸酶进行去磷酸化处理；将上述两个片段连接，转化大肠杆菌，得到含有MazF-MazE表达的TCCRAS元件的无痕敲除质粒，命名为pWYE848(图43，SEQ ID NO：11)；最后将amyE基因同源臂用NheI进行酶切，与同样酶切并去磷酸化处理的pWYE848连接，得到含有MazF-MazE表达元件的淀粉酶基因无痕敲除质粒，命名为pWYE848-ΔamyE。
(2)转化和PCR验证
将质粒pWYE848-ΔamyE转化枯草芽胞杆菌W168感受态细胞，并在含有1％木糖和MLS(0.5μg/mL红霉素和12.5μg/mL林可霉素)的LB平板上筛选转化子。继续以筛选得到的用转化子的菌体作为模板，进行PCR验证。筛选能够扩增得到大约1300bp目的条带的转化子，即获得了通过为发生了第一次单交换，整合含有MazF-MazE表达的TCCRAS元件、抗生素基因和同源臂的宿主重组菌，命名为BS203(W168ΔamyE::pWYE848-ΔamyE)。
(3)MazF-MazE表达的TCCRAS元件和抗生素基因的删除
将上述所得的转化子在含有1％木糖的LB液体培养基中过夜培养；培养液稀释10-4-10-8倍后，取200μl涂布在LB平板上过夜培养；培养所得的单菌落为发生第二次单交换删除了MazF-MazE表达的TCCRAS元件和抗生素基因的重组菌。
(4)MazF-MazE表达的TCCRAS元件作为反筛标记的反筛效率检测
将获得的重组菌同时在含有与不含有1％木糖和MLS(0.5μg/mL红霉素和12.5μg/mL林可霉素)的LB平板上进行传代培养。结果显示，所有重组菌都能在LB平板生长，不能在含有1％木糖和MLS(0.5μg/mL红霉素+12.5μg/mL林可霉素)的LB平板上生长(图44)。表明MazF-MazE表达的TCCRAS元件和抗生素基因已成功从BS203的染色体上删除，MazF-MazE表达的TCCRAS元件的反筛效率为100％。
(5)amyE突变株功能验证与突变效率检测
分别将淀粉酶敲除菌与野生型菌株W168接种于含有1％可溶性淀粉的LB平板上进行过夜培养，第二天加碘液显色。结果显示，野生型菌株W168的菌体周围含有白色的淀粉水解圈，而重组菌周围没有淀粉水解圈。通过功能验证实验说明重组菌上的淀粉酶已经失活，不能水解淀粉，从而不能形成淀粉水解圈。随机挑选240个突变子进行淀粉酶功能检测，统计结果显示amyE基因无痕敲除的突变效率为89.6±9.0％。以上结果表明利用MazF-MazE表达的TCCRAS元件作为反筛标记建立的无痕操作系统能够有效地实现枯草芽胞杆菌染色体基因的无痕敲除。
上述所用的引物序列(5’-3’)如下：
P1：TCCCCGCGGCAAAAATCAGACCAGACAAAAG(SacII)
P52：AAAGGTGGTGAATGCTCTTATGGTAAGCCGATACGTACCC
P53:AGTCTGGTAACTACCCAATCAGTACGTTAAT
P54:GATTGGGTAGTTACCAGACTTCCTTATCTTTC
P55:TCCCCGCGGATGATCCACAGTAGCGTAAAGC(SacII)
P56:CTAGCTAGCCGGCATTATGTTTGAATTTCC(NheI)
P57:CTAGCTAGCCAATTTGGTCCAGCTCCTCT(NheI)
Claims (12)
1.一种细菌无痕遗传操作载体，其特征在于，所述载体包括抗毒素开关控制的毒素反筛元件和抗生素抗性基因。
2.如权利要求1所述的载体，其特征在于，所述抗毒素开关控制的毒素反筛元件包括抗毒素蛋白编码基因、诱导表达抗毒素蛋白编码基因的诱导型启动子、毒素蛋白编码基因和持续表达毒素蛋白编码基因的组成型启动子。
3.如权利要求1所述的载体，其特征在于，所述毒素蛋白-抗毒素蛋白包括：RelE-RelB、MazF-MazE、ParE-ParD、Doc-Phd、YafQ-DinJ、VapC-VapB、HicA-HicB、CcdB-CcdA、Axe-Txe、YefM-YoeB、RelJ-RelK、HigB-HigA和HipA-HipB；
优选为RelE-RelB和MazF-MazE；
最优选为RelE-RelB。
4.如权利要求3所述的载体，其特征在于，所述诱导型启动子为PxylA或Ptac启动子；所述组成型启动子为Pliag或P45启动子。
5.如权利要求2所述的载体，其特征在于，所述毒素蛋白-抗毒素蛋白编码基因来源于大肠杆菌Escherichia coli、嗜热古菌Pyrococcus horikoshii、结核分枝杆菌Mycobacterium tuberculosis、詹氏甲烷球菌Methanococcus jannaschii、嗜线虫致病杆菌Xenorhabdus nematophila、肠道沙门氏菌Salmonella enterica、嗜甲烷细菌Methylomicrobiumalcaliphilum、唾液乳杆菌Lactobacillus salivarius或弧菌Vibrio nigripulchritudo中的一种细菌；
优选地，为大肠杆菌Escherichia coli或肠道沙门氏菌Salmonella enterica。
6.如权利要求1所述的载体，其特征在于，所述细菌为革兰氏阳性菌；
优选地，为芽胞杆菌属Bacillus、李斯特氏菌属Listeria、葡萄球菌属Staphylococcus、链球菌属Streptococcus、肠球菌属Enterococcus、梭菌属Clostridium或放线菌Actinomycete中的一种细菌；
最优选地，为芽胞杆菌属Bacillus或棒杆菌属Corynebacterium中的一种细菌；
所述芽胞杆菌属的细菌为枯草芽胞杆菌Bacillus subtilis、蜡样芽胞杆菌Bacillus cereus、巨大芽胞杆菌Bacillus megaterium、解淀粉芽胞杆菌Bacillus amyloliquefaciens、短小芽胞杆菌Bacillus pumilus或地衣芽胞杆菌Bacillus licheniformis中的一种细菌；
所述棒杆菌属的细菌为谷氨酸棒状杆菌Corynebacterium glutamicum、北京棒杆菌Corynebacterium pekinense、钝齿棒杆菌Corynebacterium crenatum或产氨棒杆菌Corynebacterium aminogenes中的一种细菌。
7.如权利要求1至6中任一所述的载体的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)扩增毒素蛋白编码基因、抗毒素蛋白编码基因和持续表达毒素蛋白编码基因的组成型启动子，按照持续表达毒素蛋白编码基因的组成型启动子-毒素蛋白编码基因-抗毒素蛋白编码基因的顺序融合形成重组基因片段；
2)将上述步骤1)中获得的重组基因片段与载体连接，获得含有毒素-抗毒素蛋白表达元件的无痕遗传操作通用载体；所述载体带有诱导表达抗毒素蛋白编码基因的诱导型启动子及抗生素抗性基因。
8.如权利要求7所述的载体的构建方法，其特征在于，所述步骤1)中扩增毒素蛋白编码基因、抗毒素蛋白编码基因和持续表达毒素蛋白编码基因的组成型启动子的融合是通过SOE-PCR方法进行。
9.一种应用权利要求1至6中任一所述的载体进行细菌无痕基因敲除的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)构建待敲除的靶基因的上游同源臂及下游同源臂的融合片段；
2)将步骤1)中所述融合片段插入权利要求1至6中任一所述的载体，携带有所述待敲除的靶基因的上游同源臂及下游同源臂的融合片段与靶细菌染色体DNA以单交换的形式发生同源重组，在抗生素选择压力和诱导剂同时存在的条件下筛选有抗生素抗性的重组子，得到将权利要求1至6中任一所述的载体整合到靶细菌染色体的阳性转化子；
3)将步骤2)中获得的阳性转化子转接于含有诱导剂的液体培养基中，促使同源臂之间发生第二次单交换，然后将培养的菌液稀释涂布不含诱导剂的平板上进行反筛，获得靶基因无痕遗传改造的重组菌。
10.一种应用权利要求1至6中任一所述的载体进行细菌无痕基因点突变的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)构建含有突变的靶基因及其上游同源臂和下游同源臂的融合片段；
2)将步骤1)中所述融合片段插入权利要求1至6中任一所述的载体，携带有所述突变的基因及其靶基因上游同源臂和下游同源臂的融合片段与靶细菌染色体DNA以单交换的形式发生同源重组，在抗生素选择压力和诱导剂同时存在的条件下筛选有抗生素抗性的重组子，得到将权利要求1至6中任一所述的载体整合到靶细菌染色体的阳性转化子；
3)将步骤2)中获得的阳性转化子转接于含有诱导剂的液体培养基中，促使同源臂之间发生第二次单交换，然后将培养的菌液稀释涂布不含诱导剂的平板上进行反筛，获得靶基因无痕遗传改造的重组菌。
11.一种应用权利要求1至6中任一所述的载体进行细菌无痕基因插入的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)构建含有待插入的基因及其靶基因上游同源臂和下游同源臂的融合片段；
2)将步骤1)中所述融合片段插入权利要求1至6中任一所述的载体，携带有所述待插入的基因及其靶基因上游同源臂和下游同源臂的融合片段与靶细菌染色体DNA以单交换的形式发生同源重组，在抗生素选择压力和诱导剂同时存在的条件下筛选有抗生素抗性的重组子，得到将权利要求1至6中任一所述的载体整合到靶细菌染色体的阳性转化子；
3)将步骤2)中获得的阳性转化子转接于含有诱导剂的液体培养基中，促使同源臂之间发生第二次单交换，然后将培养的菌液稀释涂布不含诱导剂的平板上进行反筛，获得靶基因无痕遗传改造的重组菌。
12.一种应用权利要求1至6中任一所述的载体进行细菌无痕基因替换的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)构建含有替换基因及其靶基因上游同源臂和下游同源臂的融合片段；
2)将步骤1)中所述融合片段插入权利要求1至6中任一所述的载体，携带有所述替换基因及其靶基因上游同源臂和下游同源臂的融合片段与靶细菌染色体DNA以单交换的形式发生同源重组，在抗生素选择压力和诱导剂同时存在的条件下筛选有抗生素抗性的重组子，得到将权利要求1至6中任一所述的载体整合到靶细菌染色体的阳性转化子；
3)将步骤2)中获得的阳性转化子转接于含有诱导剂的液体培养基中，促使同源臂之间发生第二次单交换，然后将培养的菌液稀释涂布不含诱导剂的平板上进行反筛，获得靶基因无痕遗传改造的重组菌。
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