CN106592007B - 石墨烯微米纤维、制备方法、神经组织支架及修复系统 - Google Patents

Abstract

本发明提供改性还原氧化石墨烯微米纤维及制备方法、神经组织支架及自驱动神经修复系统。所述微米纤维包括还原氧化石墨烯和导电高分子聚合物聚乙撑二氧噻吩，所述微米纤维是连续的，并具有规整的表面多孔纳米结构。所述改性还原氧化石墨烯微米纤维的制备方法包括：配置掺杂聚乙撑二氧噻吩的氧化石墨烯混合溶液，用该溶液制备改性还原氧化石墨烯微米纤维。所述神经组织支架由改性还原氧化石墨烯微米纤维构成。所述自驱动神经修复系统包括所述神经组织支架和自驱动的分离式摩擦纳米发电机。本发明提出的微米纤维具有形状和表面形貌好、电导率好的特点，对骨髓间充质干细胞具有良好的贴附和增殖能力，能促进骨髓间充质干细胞的神经分化。

Description

石墨烯微米纤维、制备方法、神经组织支架及修复系统

技术领域

本发明涉及神经组织支架领域，特别涉及用作神经纤维的人工还原氧化石墨烯微米纤维、其制备方法、包含上述还原氧化石墨烯微米纤维的神经组织支架及包含所述神经组织支架的神经修复系统。

背景技术

神经损伤是临床常见并且多发的损伤类型之一，仅在我国，神经损伤病例每年新增近百万例。随着科学技术的不断发展，神经损伤修复材料得到了不断完善和改进。迄今为止，神经损伤修复采取的主要的方式有：(1)对短的神经缺损进行手术，对受损神经进行缝合，然后自行愈合；(2)使用替代物移植代替较长的受损神经；(3)注射神经营养因子或者外加物理治疗。

可植入支架是提供细胞支撑的有效策略。临床上最常用的移植材料是自体神经，但是供体直径细，可取数量极为有限，难以满足临床需求；已知的人工合成支架材料包括胶原蛋白、纤连蛋白、聚乳酸、聚羟基乙酸等材料，但是这些材料的降解速度快且不可控、降解产生酸性有害物质、不导电，也无法满足神经支架基本要求。这些方法的治疗效果都不是很理想，不能完全恢复受损神经的功能，且治疗周期长，治疗成本高。因此，发展一种更加优良的材料和方法便成为医疗研究领域亟待解决的问题。

神经组织支架的目的在于解决组织器官移植供求不平衡之间的矛盾以及更有效的解决损伤修复难题。构建全新的支架代替损伤或者缺损的组织，从而成功解决因为神经损伤移植物缺乏和替代物导致的后遗症等不良后果，是一种有效的方法和根本途径。理想的神经组织支架材料应具有模拟神经组织形状的三维结构，并且要求其满足生物相容性好、高电导率、无抗原性、容易获得且成本低廉等基本条件。这也正是本领域的科研人员长期以来最热门、最重要的研究方向之一。

近年来，不少科研机构和企业投入了大量的人力、物力与财力对神经修复材料进行研究。但是已有报道的神经修复策略中缺乏一种理想的神经修复材料，能为神经再生提供最佳的生物学和理化微环境，实现加速促进神经修复的目的。

即，需要一种改性的类似神经纤维结构的、细胞相容性好、高电导率的制作神经支架的材料，并应该能让该材料构成一种自驱动神经修复系统，为神经修复提供更好的解决方案。

发明内容

鉴于上述背景技术的问题，特提出本发明。

本发明中：

“还原氧化石墨烯”的含义为：氧化石墨烯表面有大量的官能团，如羧基、羟基、环氧基，经还原后变成还原氧化石墨烯，还原氧化石墨烯的性质和原始石墨的性质相似，和氧化石墨烯的区别在于没有了或者去除了大本分官能团。

“神经组织支架”的含义为：神经组织支架是指能与活体神经细胞结合并能植入生物体内，可替代神经组织的功能的材料。

本发明目的之一在于提供一种制备改性还原氧化石墨烯微米纤维的方法，其具有操作简便，成本低，改性效果好等优点。

本发明目的之二在于提供一种改性还原氧化石墨烯微米纤维及其构成的神经组织支架，其细胞相容性好，表面比表面积大，高电导率，能很好的模拟天然神经纤维，并能有效促进干细胞分化，可应用于诱导骨髓间充质干细胞定向分化为神经细胞，在组织工程方面具有广阔的应用前景。

本发明目的之三在于提供一种自驱动神经修复系统，其包括本发明的改性还原氧化石墨烯微米纤维构成的神经组织支架和分离式自驱动摩擦纳米发电机，。其为促进神经损伤修复提供一种新思路和新方法。因为该本发明的纤维具有高电导率，可以传递摩擦纳米发电机的脉冲信号，可以进一步促进干细胞向神经分化。此外，本发明提供的自驱动神经修复系统，在神经组织工程方面具有良好的应用前景。

为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括：

提供一种改性还原氧化石墨烯微米纤维，包括还原氧化石墨烯和导电高分子聚合物聚乙撑二氧噻吩，所述微米纤维是连续的，所述微米纤维具有规整的表面多孔纳米结构。

进一步地，所述改性还原氧化石墨烯微米纤维包含质量比0.1％～2％：1的聚乙撑二氧噻吩和还原氧化石墨烯。

进一步地，所述改性还原氧化石墨烯微米纤维的直径在40μm和100μm之间。

进一步地，所述改性还原氧化石墨烯微米纤维由含有氧化石墨烯和聚乙撑二氧噻吩的混合溶液经高温水热处理后制得。

本发明还提供一种神经组织支架，其包含上述改性还原氧化石墨烯微米纤维，所述神经组织支架用于骨髓间充质干细胞定向诱导神经分化。

本发明进一步提供一种包含上述神经组织支架的自驱动神经修复系统，该系统包括：所述神经组织支架和自驱动的分离式摩擦纳米发电机；所述自驱动的分离式摩擦纳米发电机发电刺激促进骨髓间充质干细胞向神经分化。

进一步地，上述自驱动神经修复系统中，所述自驱动摩擦纳米发电机的电流输出为20μA～70μA。

本发明还提供一种制备所述的改性还原氧化石墨烯微米纤维的方法，包括以下步骤：

1)配置掺杂聚乙撑二氧噻吩的氧化石墨烯混合溶液：

秤取氧化石墨烯粉末，将其溶解于水中，配置氧化石墨烯溶液；

将聚乙撑二氧噻吩粉末加入到已配置好的氧化石墨烯溶液中，振荡混合；

所述氧化石墨烯在所述氧化石墨烯溶液中的浓度为5mg/ml～10mg/ml；加入到所述氧化氧化石墨烯溶液中的所述聚乙撑二氧噻吩的质量为所述氧化石墨烯质量的0.1wt％～2wt％；

2)制备改性还原氧化石墨烯微米纤维：

将上述步骤配置好的混合聚乙撑二氧噻吩和氧化石墨烯的混合溶液注入毛细长玻璃管中；

将所述毛细长玻璃管两端封口后放入烘箱中，进行水热反应，温度为160℃～260℃之间，时间为2小时～12小时之间；

将水热反应后得到的微米纤维从所述毛细长玻璃管中用氮气吹出；

将吹出后的纤维放置于室温下自然干燥，之后便获得改性还原氧化石墨烯微米纤维。

进一步地，上述方法使用的水可为超纯水。

进一步地，上述方法中，所述毛细长玻璃管的内径为0.4mm～1.0mm之间。

与现有技术相比，本发明的有益效果包括：

本发明利用导电高分子聚合物聚乙撑二样噻吩与还原氧化石墨烯制成了功能化的复合微米纤维，即高导电石墨烯微米纤维(一下简称“微米纤维”)。其细胞相容性好，能生物降解，直径分布在40μm和100μm。该微米纤维所具有的电导率高，且与神经组织中的神经纤维相似，因此利于细胞的贴附、增殖、分化，特别是能够促进干细胞分化，例如骨髓间充质干细胞定向诱导分化为神经细胞。可见，其能够在神经组织工程方面广泛使用。

本发明的制备微米纤维的方法，可通过简单的水热反应进行，操作简单，成本低廉，可以实现大量生产。

本发明利用导电高分子聚合物聚乙撑二样噻吩与还原氧化石墨烯制成了功能化的复合微米纤维，即高导电石墨烯微米纤维(以下简称“微米纤维”)，该微米纤维具有高电导率，可以与一种分离式自驱动摩擦纳米发电机结合使用，构成自驱动神经修复系统，实现促进在微米纤维上的骨髓间充质干细胞向神经分化。

附图说明

图1a-1h分别是本发明一实施例中利用水热法制备得到的还原氧化石墨烯微米纤维(下文中也称“参考微米纤维”)和改性还原氧化石墨烯微米纤维(下文中也称“改性微米纤维”)的SEM(扫描电子显微镜)照片。

图2是本发明一实施例中利用水热法制备得到的参考微米纤维和改性微米纤维的拉曼(Raman)光谱图。

图3是本发明一实施例中利用水热法制备得到的参考微米纤维和改性微米纤维的电导率测试(I-V)图。

图4是本发明一实施例中利用水热法制备得到的参考微米纤维和改性微米纤维的骨髓间充质干细胞的贴附实验时测定细胞毒性的CCK-8图。

图5是本发明一实施例中利用水热法制备得到的参考微米纤维和改性微米纤维的骨髓间充质干细胞在分化培养21天后所表达神经标志基因Tuj1和GFAP的qPCR图。

图6是本发明一实施例中自驱动神经修复系统的示意图。

图7是本发明一实施例中利用水热法制备得到的参考微米纤维和改性微米纤维的骨髓间充质干细胞在经一种分离式自驱动摩擦纳米发电机电刺激诱导分化培养21天后所表达神经标志基因Tuj1和GFAP的qPCR图。

具体实施方式

下面结合附图具体说本发明的实施方式。

鉴于本领域对于解决神经或其他器官的组织损伤修复这一类疑难问题的需要，并考虑到现有神经代替材料等不足，本案发明人经长期研究和实现，提出了本发明的技术方案。

概括的讲，本发明提供了一种用于骨髓间充质干细胞定向诱导神经分化的改性还原氧化石墨烯微米纤维及其制备方法、基于该微米纤维的神经组织支架和自驱动神经修复系统。

具体的讲，本发明的一个方面提供了一种改性还原氧化石墨烯微米纤维，其主要由还原氧化石墨烯与聚乙撑二氧噻吩仪器构成连续的微米纤维，且所述微米纤维具有规则的表面多孔纳米结构。

进一步的，所述还原氧化石墨烯改性微米纤维的直径在几十到一百微米之间，与神经纤维的形状相近，因此可以更好的作为神经移植替代物。

进一步的，在本发明中，所采用的导电高分子聚合物聚乙撑二氧噻吩具有优异的导电性能，得到的改性还原氧化石墨烯微米纤维比不改性的还原氧化石墨烯微米纤维具有更高的电导率，可以更好的传输一种分离式自驱动摩擦纳米发电机的电刺激输出，促进骨髓间充质干细胞向神经分化的效率。

本发明的另一方面提供了一种制备前述改性微米纤维的方法，其中一种较为优选的方式包括：取含聚乙撑二氧噻吩和氧化石墨烯的混合溶液经水热处理，获得所述改性微米纤维。

进一步的，在一优选的具体实施方案之中，可以首先配置不同浓度的氧化石墨烯溶液；然后将聚乙撑二氧噻吩添加到上述优化后的氧化石墨烯溶液中震荡，使其混合均匀；最后经水热反应得到所述改性微米纤维。可通过优化水热反应条件，得到形貌良好、纤维表面具有规则纳米多孔结构和纤维直径均匀的微米纤维。

前述氧化石墨烯溶液可采用如下方式获取：取氧化石墨烯粉末溶于超纯水中。

优选的，所述混合溶液可包含质量比为0.1％～2％：1的聚乙撑二氧噻吩和还原氧化石墨烯。

本发明再一个方面提供了前述改性微米纤维的制备方法，其包括：取含聚乙撑二氧噻吩和氧化石墨烯的混合溶液经水热处理，获得所述改性微米纤维。

在一优选方案之中，所述溶液包含浓度为5mg/ml～10mg/ml的氧化石墨烯，含量为所述氧化石墨烯的含量的0.1wt％～2wt％的聚乙撑二氧噻吩以及对氧化石墨烯具有良好溶解能力的超纯水。

进一步的，所述改性还原氧化石墨烯微米纤维使由含有氧化石墨烯和聚乙撑二氧噻吩的混合水溶液在毛细长玻璃管中经高温水热反应处理后制得。

本案发明人通过大量实验发现，毛细长玻璃管内径为0.4mm～1.0mm之间，水热反应温度控制在160℃～260℃之间，反应时间控制在2h～12h之间时，可得到性能良好的前述改性微米纤维。

此外，本发明还提供所述改性还原氧化石墨烯微米纤维在制备神经组织支架中的应用，所述神经组织支架包括神经损伤修复材料即所述改性微米纤维，构成用于骨髓间充质干细胞定向诱导细胞神经分化的组织工程材料。

本发明进一步提供了用于结合自驱动的分离式摩擦纳米发电机电刺激以促进骨髓间充质干细胞向神经分化的自驱动神经修复系统，其包含本发明的改性还原氧化石墨烯微米纤维。

本发明中，推荐自驱动摩擦纳米发电机的电流输出为20μA～70μA。

概括的讲，本发明利用还原氧化石墨烯本身一定的导电性能和细胞相容性，以及导电高分子聚合物聚乙撑二氧噻吩优异的导电性能，通过简单水热法制备得到导电性能提升的改性还原氧化石墨烯微米纤维。通过水热方法制备得到的微米纤维，与神经纤维结构相似，为细胞提供良好的支撑平台，并显著促进细胞的增殖分化。在结合一种分离式自驱动摩擦纳米发电机后组成自驱动神经修复系统，本发明的改性微米纤维更有效地传输摩擦纳米发电机的电刺激输出，进一步促进细胞的神经分化。

以下结合附图及实施案例对本发明的技术方案作更详细的说明。

实施例

首先，配置掺杂聚乙撑二氧噻吩的氧化石墨烯混合溶液配置两份浓度为5mg/ml的氧化石墨烯溶液：用电子分析天平秤取两份500mg氧化石墨烯粉末，分别溶解在两份10ml超纯水中，备用。

配置两份浓度为8mg/ml的氧化石墨烯溶液：用电子分析天平秤取800mg氧化石墨烯粉末，分别溶解在两份10ml超纯水中，备用。

用电子天平分别取5mg和8mg聚乙撑二氧噻吩粉末，分别加入到已配置好的一份5mg/ml和8mg/ml的氧化石墨烯溶液中，振荡混合。

如上，准备出来四份溶液，两份是没有加聚乙撑二氧噻吩粉末的氧化石墨烯溶液，两份是分别加了5mg和8mg聚乙撑二氧噻吩粉末的混合溶液。

然后，用上述溶液制备参考还原氧化石墨烯微米纤维和用聚乙撑二氧噻吩改性的还原氧化石墨烯微米纤维。

将新鲜配置的上述混合聚乙撑二氧噻吩的四种氧化石墨烯混合溶液分别注入内径为0.8mm的毛细长玻璃管中，然后将毛细长玻璃管的两端封口，之后放入烘箱中，200℃保温4h，进行水热反应。从烤箱中将反应后得到的纤维从毛细玻璃管中用氮气吹出，此时，微米纤维中含有水分，室温下自然干燥，获得两种纯还原氧化石墨烯微米纤维(在本发明的附图中分别以“5-rGO”和“8-rGO”示之)和两种改性微米纤维(在本发明的附图中分别以“5-rGO-PEDOT”和“8-rGO-PEDOT”示之)。

之后，用上述微米纤维制造出自驱动神经修复系统：选择一种分离式自驱动摩擦纳米发电机与改进还原氧化石墨烯微米纤维相连。示意图如图6所示。可见，自驱动神经修复系统主要包括：微米纤维或改性微米纤维1，微米纤维或改性微米纤维与分离式摩擦纳米发电机相连接的铜线2，细胞培养皿3和分离式摩擦纳米发电机4。

最后，对本发明的性能进行测试，以验证本发明的改性还原氧化石墨烯微米纤维(简称“改性微米纤维”)的性能(表征)

1、扫描电子显微镜表征

5-rGO微米纤维的表征结果如图1a-图1b所示，8-rGO微米纤维的表征结果如图1c-图1d所示，5-rGO-PEDOT微米纤维的表征结果如图1e-图1f所示，8-rGO-PEDOT微米纤维的表征结果如图1g-图1h所示。

前述SEM表征结果表明：通过毛细管水热反应能得到连续的微米纤维，并且纤维直径统一，纤维表面呈现出规则一致的纳米多孔结构。

2、拉曼光谱表征

图2中的曲线a-d分别对应5-rGO、8-rGO、5-rGO-PEDOT、8-rGO-PEDOT微米纤维。拉曼光谱表明聚乙撑二氧噻吩的介入没有破坏还原氧化石墨烯的化学结构，仅仅是通过物理混合的方式掺杂到微米纤维中。

3、导电测试

将微米纤维做成2cm长的待测电极，测试其I-V曲线。图3中的曲线a-d分别对应5-rGO、8-rGO、5-rGO-PEDOT、8-rGO-PEDOT微米纤维。

由实验结果可见，聚乙撑二样噻吩的介入可以提高还原氧化石墨烯微米纤维的电导率。

4、细胞毒性测试

每组秤取10mg微米纤维，放入24孔板内，细胞的接种数目为300000个/孔，培养时间梯度为1、3、5天。按照CCK-8试剂盒说明书测定细胞的增殖情况。图4显示经过1、3、5天培养后，四组纤维上的细胞增殖能力相当，说明还原氧化石墨烯微米纤维具有良好的细胞相容性，且聚乙撑二氧噻吩的介入并没有影响其细胞相容性。

5、细胞分化qPCR检测

选取最具代表性的神经元Tuj1和神经胶质GFAP为检测神经标志基因，细胞的接种数目和细胞毒性测试步骤相同，细胞分化培养基为普通细胞培养基，测试骨髓间充质干细胞在微米纤维上的自发向神经细胞的分化情况。结果如图所示：5-rGO和8-rGO微米纤维的Tuj1和GFAP基因表达量大致相同，5-rGO-PEDOT和8-rGO-PEDOT微米纤维的Tuj1和GFAP基因表达量也大致相同，但是高于未改性的微米纤维。说明还原氧化石墨烯微米纤维诱导骨髓间充质干细胞向神经分化的能力不够，但是掺入聚乙撑二氧噻吩后，改性微米纤维对骨髓间充质干细胞向神经分化有明显的促进作用。

6、自驱动神经修复系统促进细胞分化的qPCR检测

所选摩擦纳米发电机为一种分离式自驱动摩擦纳米发电机，电流输出为20μA～70μA。每天对细胞的刺激为3000次/天，培养基为普通细胞培养基，连续刺激21天。选取最具代表性的神经元Tuj1和神经胶质GFAP为检测神经标志基因，测试摩擦纳米发电机电刺激对骨髓间充质干细胞在微米纤维上的向神经细胞的分化情况。结果如图7所示：在经摩擦纳米发电机电刺激后，5-rGO和8-rGO微米纤维的Tuj1和GFAP基因表达量大致相同，相较于未加摩擦纳米发电机电刺激的实验组，Tuj1和GFAP基因表达量显著提高；5-rGO-PEDOT和8-rGO-PEDOT微米纤维的Tuj1和GFAP基因表达量也大致相同，相较于未加摩擦纳米发电机电刺激的实验组，Tuj1和GFAP基因表达量也显著提高，同时相较于加摩擦纳米发电机电刺激的5-rGO和8-rGO实验组也有一定的提高。这说明摩擦纳米发电机电刺激可有效促进还原氧化石墨烯微米纤维上骨髓间充质干细胞向神经分化的能力，改性微米纤维可以更有效地传导摩擦纳米发电机的电信号，对骨髓间充质干细胞向神经分化有更明显的促进作用。

由前述实施例可见本发明的改性还原氧化石墨烯微米纤维及其构成的自驱动神经修复系统具有突出的优点：

聚乙撑二氧噻吩的加入并没有改变微米纤维的化学结构，同时使得纤维的形状和表面形貌保持良好。另一方面，聚乙撑二氧噻吩的加入增强了还原氧化石墨烯微米纤维的电导率。

改性还原氧化石墨烯微米纤维对骨髓间充质干细胞具有良好的贴附和增殖能力。

改性还原氧化石墨烯微米纤维在普通培养条件下同样能促进骨髓间充质干细胞的神经分化。

摩擦纳米发电机电刺激的介入可以更加有效的促进微米纤维上骨髓间充质干细胞向神经的分化，而且改性微米纤维可以更好的传输摩擦纳米发电机的电刺激信号，进一步促进改性微米纤维上骨髓间充质干细胞向神经分化。

此外，本发明的制备方法中，利用毛细玻璃管水热法，并且通过掺杂的方式将聚乙撑二氧噻吩加入到微米纤维种得到复合材料，应用于神经损伤修复的组织工程支架材料领域。由于以上技术对设备要求低，原材料来源广泛廉价，易实现产业化。

应当理解，在本说明书中，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。又及，对于本领域的普通技术人员来说，可以根据本发明技术方案和技术构思做出其他各种相应的改变和变形，而这些改变和变形都应属于本发明权利要求的保护范围。

Claims (9)

1.一种改性还原氧化石墨烯微米纤维，包括还原氧化石墨烯和导电高分子聚合物聚乙撑二氧噻吩，所述微米纤维是连续的，所述微米纤维具有规整的表面多孔纳米结构；所述改性还原氧化石墨烯微米纤维由含有氧化石墨烯和聚乙撑二氧噻吩的混合溶液经高温水热处理后制得。

2.根据权利要求1所述的改性还原氧化石墨烯微米纤维，其特征在于，所述改性还原氧化石墨烯微米纤维包含质量比0.1％～2％：1的聚乙撑二氧噻吩和还原氧化石墨烯。

3.根据权利要求2所述的改性还原氧化石墨烯微米纤维，其特征在于，所述改性还原氧化石墨烯微米纤维的直径在40μm和100μm之间。

4.一种神经组织支架，其包含根据权利要求1至3之一所述的改性还原氧化石墨烯微米纤维，所述神经组织支架能够用于骨髓间充质干细胞的定向诱导神经分化。

5.一种包含权利要求4所述的神经组织支架的自驱动神经修复系统，包括：所述神经组织支架和自驱动的分离式摩擦纳米发电机；所述自驱动的分离式摩擦纳米发电机发电刺激促进骨髓间充质干细胞向神经分化。

6.根据权利要求5所述的自驱动神经修复系统，其特征在于，所述自驱动摩擦纳米发电机的电流输出为20μA～70μA。

7.一种制备如权利要求1至3之一所述的改性还原氧化石墨烯微米纤维的方法，包括以下步骤：

1)配置掺杂聚乙撑二氧噻吩的氧化石墨烯混合溶液：

秤取氧化石墨烯粉末，将其溶解于水中，配置氧化石墨烯溶液；

将聚乙撑二氧噻吩粉末加入到已配置好的氧化石墨烯溶液中，振荡混合；

所述氧化石墨烯在所述氧化石墨烯溶液中的浓度为5mg/ml～10mg/ml；加入到所述氧化氧化石墨烯溶液中的所述聚乙撑二氧噻吩的质量为所述氧化石墨烯质量的0.1wt％～2wt％；

2)制备改性还原氧化石墨烯微米纤维：

将上述步骤1)配置好的混合聚乙撑二氧噻吩和氧化石墨烯的混合溶液注入毛细长玻璃管中；

将所述毛细长玻璃管两端封口后放入烘箱中，进行水热反应，温度为160℃～260℃之间，时间为2小时～12小时之间；

将水热反应后得到的微米纤维从所述毛细长玻璃管中用氮气吹出；

将吹出后的纤维放置于室温下自然干燥，之后便获得改性还原氧化石墨烯微米纤维。

8.根据权利要求7所述的制备改性还原氧化石墨烯微米纤维的方法，其特征在于，所述水为超纯水。

9.根据权利要求7所述的制备改性还原氧化石墨烯微米纤维的方法，其特征在于，所述毛细长玻璃管的内径为0.4mm～1.0mm之间。