Nothing Special   »   [go: up one dir, main page]

CN106591488A - 一种检测粪便中具核梭杆菌的核酸组合及其应用与试剂盒 - Google Patents

一种检测粪便中具核梭杆菌的核酸组合及其应用与试剂盒 Download PDF

Info

Publication number
CN106591488A
CN106591488A CN201710101308.9A CN201710101308A CN106591488A CN 106591488 A CN106591488 A CN 106591488A CN 201710101308 A CN201710101308 A CN 201710101308A CN 106591488 A CN106591488 A CN 106591488A
Authority
CN
China
Prior art keywords
fusobacterium nucleatum
nucleic acid
probe
test kit
detection
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201710101308.9A
Other languages
English (en)
Inventor
张良禄
董兰兰
姚希辉
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Wuhan Aimisen Life Technology Co Ltd
Original Assignee
Wuhan Aimisen Life Technology Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Wuhan Aimisen Life Technology Co Ltd filed Critical Wuhan Aimisen Life Technology Co Ltd
Priority to CN201710101308.9A priority Critical patent/CN106591488A/zh
Publication of CN106591488A publication Critical patent/CN106591488A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/166—Oligonucleotides used as internal standards, controls or normalisation probes

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

一种检测粪便中具核梭杆菌的核酸组合及其应用与试剂盒，属于生物医学检验技术领域。本发明提供的检测具核梭杆菌的核酸组合能特异地检测出具核梭杆菌，利用该核酸组合制备检测粪便中具核梭杆菌的试剂盒及制备检测癌症的试剂盒，有效提高检测的精度，能方便快捷的应用于检测具核梭杆菌，具有较高的灵敏度和特异性。本发明提供的技术方法，不仅能更方便地从粪便中提取具核梭杆菌基因组，对具核梭杆菌进行定量检测，且操作简单，利于推广应用。

Description

一种检测粪便中具核梭杆菌的核酸组合及其应用与试剂盒
技术领域
本发明涉及生物医学检验技术领域，且特别涉及一种检测粪便中具核梭杆菌的核酸组合及其应用与试剂盒。
背景技术
结直肠癌(Colorectal cancer，CRC)为常见多发的消化道恶性肿瘤，其发病率和死亡率均位于全世界常见恶性肿瘤的第3位。在中国，近年结直肠癌发病率逐年上升，估计每年约有40万新发病例，目前在我国消化系统恶性肿瘤中位列第2位。早期结直肠癌患者手术5年生存率可高达90％以上，而中、晚期患者5年生存率仅10％左右，临床诊断的结肠癌约80％为中晚期，这是导致其死亡率无明显改善的关键因素之一。而有效的早期直结肠癌患者可使直结肠癌发病率降低60％，病死率降低80％，因此结直肠癌的早期发现、早期诊断及早期治疗显得尤为重要。
目前，直结肠癌非侵入式检测方法用于疾病的筛查有效力非常低下，因为需要患者每年收集粪便样本便潜血试验或粪便免疫化学荧光检测，假阳性比率高，结果稳定性差，总体受检率小于3％。尽管乙状结肠镜检查或结肠镜检查检出率较高，是直结肠癌检查的金标准，但是需要患者做清理肠道准备、依靠麻醉并且侵犯隐私，患者会产生恐惧心理，检查出血或者感染等情况，总体依从性较差，受检率小于5％。因此，高特异性、高灵敏度、依从性好、非侵入式的直结肠癌早期诊断技术亟待解决。
具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum,Fn)是常见的革兰氏阴性无芽胞厌氧杆菌，以口腔牙垢中最为多见。2011年10月两支独立的研究团队证实具核梭杆菌也存在于肠道中，并且具核梭杆菌的丰度与结直肠癌有关。2013年哈佛医学院与凯斯西储大学证实具核梭杆菌通过诱导炎性反应、促癌信号通路开放，促进结直肠癌增殖。
目前，对具核梭杆菌的应用主要集中在口腔类疾病以及常见癌症方面；也不能进行定量检测，粪便中具核梭杆菌及其具体检测方法也未见报道。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种检测粪便中具核梭杆菌的核酸组合，该核酸组合能特异的、高灵敏度检测具核梭杆菌。
本发明的第二目的在于提供上述核酸组合在检测粪便中具核梭杆菌的应用。
本发明的第三目的在于提供上述核酸组合在制备检测癌症的试剂盒中的应用。
本发明的第四目的在于提供上述核酸组合在制备检测具核梭杆菌的试剂盒中的应用。
本发明的第五目的在于提供一种检测粪便具核梭杆菌的试剂盒，该试剂盒能方便快速应用于检测粪便中具核梭杆菌，方便操作，利于推广应用。
本发明解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。
本发明提供一种检测粪便中具核梭杆菌的核酸组合，核酸组合包括引物组合和探针；引物组合包括第一引物对、第二引物对和第三引物对，第一引物对的碱基序列如SEQ IDNO.1-2所示，第二引物对的碱基序列如SEQ ID NO.3-4所示，第三引物对的碱基序列如SEQIDNO.5-6所示；探针包括第一探针、第二探针和第三探针，第一探针的碱基序列如SEQ IDNO.7所示，第二探针的序列如SEQ ID NO.8所示，第三探针的序列如SEQ ID NO.9所示；探针的5'端标记有荧光基团，探针3'端标记有淬灭基团，荧光基团为FAM、VIC、TET、JOE、HEX、CY3、CY5、ROX、RED610、TEXASRED、RED670、NED中的一种，所述淬灭基团为6-TAMRA、BHQ-1～3、和结合分子沟的非荧光淬灭剂中的一种。
进一步，上述第一引物对为具核梭杆菌检测引物，上游检测引物包括SEQ IDNO.1所示的核苷酸序列，SEQ IDNO.1所示的核苷酸序列为5’-TCTCCTTTCAATAAA AGTGGC-3’；
具核梭杆菌下游检测引物包括SEQ IDNO.2所示的核苷酸序列，SEQ IDNO.2所示的核苷酸序列为：5’-AAGAAGTAGGATGAAAATCAGTTA-3’；
进一步具核梭杆菌探针包括SEQ IDNO.7所示的核苷酸序列，SEQ IDNO.7所示的核苷酸序列为5’-AGACCGATGCTCTACC-3’；
进一步，检测探针的5'端标记有荧光基团，检测探针的3'端标记有淬灭基团。
上述探针5'端标记的荧光基团为：FAM、VIC、TET、JOE、HEX、CY3、CY5、ROX、RED610、TEXASRED、RED670、NED中的一种；其3'端标记的淬灭基团为：6-TAMRA、BHQ-1～3、和结合分子沟的非荧光淬灭剂(Minor Groove Binder nonfluorescent quencher,MGB NFQ)中的一种。优选地，荧光标记物选择FAM，淬灭剂选择MGB。
进一步，第二引物对和第二探针为内参(Internal reference,IR)引物对和内参探针；
内参引物对包括内参上游引物和内参下游引物，为用于扩增细菌的16SrDNA基因；
内参IR上游引物的核苷酸序列SEQ IDNO.3所示，SEQ IDNO.3的核苷酸序列为5’-CCTGGACGAAGACTGACGCTC-3’；
内参IR上游引物的核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示，SEQ IDNO.4的核苷酸序列为5’-CTCAAGGGCACAACCTCCAAG-3’；
内参IR探针的核苷酸序列SEQ IDNO.8所示，SEQ IDNO.8所示的核苷酸序列为5’-CGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGG-3’；
上述内参IR探针在其5'端的标记的荧光基团为：FAM、VIC、TET、JOE、HEX、CY3、CY5、ROX、RED610、TEXASRED、RED670、NED中一种，3'端标记的淬灭基团为：6-TAMRA、BHQ-1～3、和结合分子沟的非荧光淬灭剂(Minor Groove Binder nonfluorescent quencher,MGB NFQ)中的一种。优选地，荧光标记物选择NED，淬灭剂选择BHQ-2。
第三引物对和第三探针为过程控制对照基因(processing control，PC)引物对和过程控制对照基因PC探针；其目的是监控从核酸提取到扩增的整个检测过程。
PC引物对包括PC上游引物和PC下游引物，为用于扩增枯草芽孢杆菌的基因；
PC上游引物的核苷酸序列SEQ IDNO.5所示，SEQ IDNO.5所示的核苷酸序列为5’- GATGAATATCCGCATCTACC-3’；
PC下游引物的核苷酸序列SEQ IDNO.6所示，SEQ IDNO.6所示的核苷酸序列为5’- TTTGGCGGATCAGGTTTTTC-3’；
PC探针的核苷酸序列SEQ IDNO.9所示，SEQ IDNO.9所示的核苷酸序列为5’- CACGCCATTCAGATTCCGACGGATCT-3’；
上述PC探针的5'端标记的荧光基团为：FAM、VIC、TET、JOE、HEX、CY3、CY5、ROX、RED610、TEXASRED、RED670、NED中的一种；3'端标记的淬灭基团为：6-TAMRA、BHQ-1～3、和结合分子沟的非荧光淬灭剂(Minor Groove Binder nonfluorescent quencher,MGB NFQ)中的一种。优选地，荧光基团选择VIC，淬灭基团选择BHQ-2。
提供上述核酸组合在检测粪便中具核梭杆菌的应用。
提供上述核酸组合在制备检测癌症的试剂盒中的应用。
提供上述核酸组合在制备检测具核梭杆菌试剂盒中的应用。
本发明还提供一种用于检测粪便中具核梭杆菌试剂盒，包括上述的检测粪便中具核梭杆菌的核酸组合。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明提供的检测具核梭杆菌的核酸组合能特异地检测出具核梭杆菌，利用该核酸组合制备检测粪便中具核梭杆菌的试剂盒及制备检测癌症的试剂盒，有效提高检测的精度，能方便快捷的应用于检测具核梭杆菌，具有较高的灵敏度和特异性。本发明提供的技术方法，不仅能更方便地从粪便中提取具核梭杆菌基因组，对具核梭杆菌进行定量检测，且操作简单，利于推广应用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明实验例2提供的验证试剂盒线性分析的qPCR结果图；
图2为本发明实验例2提供的验证试剂盒最低检出限的qPCR结果图；
图3为本发明实验例2提供的验证试剂盒精密度的qPCR结果图；
图4为本发明实验例2提供的电泳结果图；
图5为本发明实验例2提供的电泳结果图；
图6为本发明实验例3提供的具核梭杆菌表达丰度统计图；
图7为本发明实验例3提供的具核梭杆菌表达ROC曲线分析图；
图8为本发明实验例3提供的qPCR结果图；
图9为本发明实验例3提供的qPCR结果图；
图10为本发明实验例4提供的qPCR结果图；
图11为本发明实验例4提供的qPCR结果图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
上述核酸组合在赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific))公司合成。
UNG酶、Taq酶、dNTPs和Mg2+购自TAKARA；HSTaq酶、甜菜碱、DMSO均购自国药集团；BSA购自Sigma公司。
下面实施例对本发明提供的一种检测粪便中具核梭杆菌的核酸组合及其应用与试剂盒进行具体说明。
一种检测粪便中具核梭杆菌的核酸组合，核酸组合包括引物组合和探针；引物组合包括第一引物对、第二引物对和第三引物对，第一引物对的碱基序列如SEQ ID NO.1-2所示，第二引物对的碱基序列如SEQ ID NO.3-4所示，第三引物对的碱基序列如SEQ ID NO.5-6所示；探针包括第一探针、第二探针和第三探针，第一探针的碱基序列如SEQ ID NO.7所示，第二探针的序列如SEQ ID NO.8所示，第三探针的序列如SEQ ID NO.9所示；探针的5'端标记有荧光基团，探针3'端标记有淬灭基团，荧光基团为FAM、VIC、TET、JOE、HEX、CY3、CY5、ROX、RED610、TEXASRED、RED670、NED中的一种，淬灭基团为6-TAMRA、BHQ-1～3、和结合分子沟的非荧光淬灭剂中的一种。
PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。
进一步地，荧光基团优选FAM，淬灭基团优选MGB。
上述核酸组合在检测粪便中具核梭杆菌的应用。
检测样本中是否含有具核梭杆菌的时候，应用上述的引物组合，能快速准确的区分出样本是否含有具核梭杆菌。
进一步地，上述具核梭杆菌的检测引物组合在检测具核梭杆菌中的应用，其包括：以待检样本的DNA为模板，加入上述检测具核梭杆菌的引物组合，进行PCR扩增反应，PCR扩增反应的程序为：第一阶段：50℃UNG酶消化10min；第二阶段：95℃预变性2min；第三阶段：95℃20s、60℃30s，退火延伸30s，收集FAM/NED/VIC信号，40个循环。
PCR反应中，将退火和延伸两个反应步骤合并，有利于缩短反应时间，合理的控制反应的退火温度和和时间，更有利于反应的进行，避免实验结果被非特异条带干扰；40个反应循环，更有利于获得清晰准确的检测结果。
检测结果分析方法如下：以荧光信号达到设定的阈值所需的循环数Ct作为判断标准，当目的基因与内标基因均呈现S型扩增曲线表明样本中含有具核梭杆菌，否则为不含具核梭杆菌，且当CtFn-CtIC≥19时，结果判断为阴性，当CtFn-CtIC＜19时，结果判断为阳性，同时根据标准曲线,可以计算出每mg粪便标本中具核梭杆菌的拷贝数，从而定量分析标本中具核梭杆菌的含量。
上述核酸组合在制备检测癌症的试剂盒中的应用。
进一步地，癌症包括结直肠癌、高风险癌前息肉。
上述核酸组合检测的癌症包括但不限于结直肠癌、高风险癌前息肉，还可以是其他相关的类型的癌症的检测。
上述的检测具核梭杆菌的引物组合在制备检测具核梭杆菌的试剂盒中的应用。
应用上述的检测的引物组合制备的试剂盒，使检测的结果更加准确可靠。
一种检测粪便中具核梭杆菌的试剂盒，包括上述的用于检测粪便中具核梭杆菌的核酸组合。
进一步地，上述检测粪便中具核梭杆菌的试剂盒还包括样品保存液、核酸提取液、PCR反应液、阳性质控品、阴性质控品、内标对照、标准品中的一种或多种。
进一步地，样品保存液包括0.1-1mol/L的EDTA、0.5-3mol/L的Tris·HCl和0.05-0.15mol/L的NaCl。
较高浓度的EDTA能够有效的抑制酶的作用，从而防止基因被酶切降解，避免因为样本的问题，导致检测失败，或者导致检测结果出现问题或者误差。
进一步地，核酸提取液包含核酸裂解液、PVPP、蛋白酶K、RNA酶、DNA漂洗液和DNA洗脱液中的一种或多种。
进一步地，核酸裂解液包括100-500mM Tris·HCl、20-100mMEDTA、0.4-1M NaCl和体积分数为1％-4％的SDS。
DNA漂洗液主要成分4-10M的盐酸胍和0-4M的Tris·HCl；DNA漂洗液在细菌基因组DNA提取的过程中，洗去蛋白质及盐离子等杂质，留下纯净的DNA的分子，起到除杂的作用。
PVPP(交联聚乙烯吡咯烷酮)，又称交联聚维酮，呈白色或近白色，具有吸湿性易流动的粉末，无臭或微臭，不溶于水、碱、酸及常用有机溶剂，具有很强的膨胀性能和与多类物质的络合能力。
RNA酶是一类核酸内切酶，能够降解反应体系中的RNA分子；由于RNA分子在序列上可能与DNA有相似的片段，降解掉RNA，能避免RNA分子对反应的影响。
蛋白酶K是一种枯草蛋白酶类的丝氨酸蛋白酶，是一种高活性蛋白酶，用于生物样品中蛋白质的一般降解。蛋白酶K能够降解细菌菌体中的蛋白质，避免蛋白质对实验的影响。
DNA洗脱液在细菌基因组DNA提取的过程中，最后需要将DNA分子从吸附柱上洗脱出来，形成溶液，方便进一步的实验操作。
进一步地，PCR反应液中包括PCR反应缓冲液、dUTP、dATP、dCTP、dGTP、热启动TaqDNA聚合酶、UNG酶、BSA、甜菜碱、DMSO和Mg2+中的一种或多种。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供一种检测粪便中具核梭杆菌的核酸组合，核酸组合包括引物组合和探针；引物组合包括第一引物对、第二引物对和第三引物对，第一引物对的碱基序列如SEQID NO.1-2所示，第二引物对的碱基序列如SEQ ID NO.3-4所示，第三引物对的碱基序列如SEQ IDNO.5-6所示，第一引物对的序列如下：
上游引物SEQ ID NO.1：
5’-TCTCCTTTCAATAAA AGTGGC-3’；
下游引物SEQ ID NO.2：
5’-AAGAAGTAGGATGAAAATCAGTTA-3’；
第二引物对的序列如下；
上游引物SEQ ID NO.3：
5’-CCTGGACGAAGACTGACGCTC-3’
下游引物SEQ ID NO.4：
5’-CTCAAGGGCACAACCTCCAAG-3’；
第三引物对的序列如下；
上游引物SEQ ID NO.5：
5’-GATGAATATCCGCATCTACC-3’
下游引物SEQ ID NO.6：
5’-TTTGGCGGATCAGGTTTTTC-3’；
探针包括第一探针、第二探针和第三探针，第一探针的序列如SEQ ID NO.7所示，第二探针的序列如SEQ ID NO.8所示，第三探针的序列如SEQ ID NO.9所示；探针的5'端标记有荧光基团，探针3'端标记有淬灭基团。
探针的序列如下：
第一探针SEQ ID NO.7：
FAM-5’-AGACCGATGCTCTACC-3’-MGB；
第二探针SEQ ID NO.8：
FAM-5’-CGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGG-3’-MGB；
第三探针SEQ ID NO.9：
FAM-5’-CACGCCATTCAGATTCCGACGGATCT-3’-MGB；
在本发明的其他的实施例中，荧光基团还可以是VIC、TET、JOE、HEX、CY3、CY5、ROX、RED610、TEXASRED、RED670、NED中的一种，淬灭基团还可以是6-TAMRA、BHQ-1～3、和结合分子沟的非荧光淬灭剂(Minor Groove Binder nonfluorescent quencher，MGBNFQ)中的一种。
在使用的时候，第一探针与第一引物对配合使用，第二探针与第二引物对配合使用，第三探针与第三引物对配合使用。
上述检测粪便中具核梭杆菌的核酸组合的使用，具体方法如下：
以待检样本DNA为模板，加入上述引物对进行PCR扩增反应，PCR反应体系为25μL；模板DNA0.5μL、Taq DNA聚合酶0.5μL，10×buffer缓冲液2.5μL、dNTPs(10mM each)1μL、MgSO41μL以及ddH2O 17.5μL，上游引物0.5μL，下游引物0.5μL。
PCR反应程序为：第一阶段：50℃UNG酶消化10min；第二阶段：95℃预变性2min；第三阶段：95℃20s、60℃30s，退火延伸30s，收集FAM/NED/VIC信号，40个循环。
实施例2
本实施例提供一种检测具核梭杆菌的试剂盒，该试剂盒包括如实施例1提供的核酸组合。
当然，本试剂盒还包括可以直接进行PCR反应的试剂，包括PCR反应缓冲液、TaqDNA聚合酶、dNTPs和Mg2+中的一种或多种。
试剂盒的使用方法，参考实施例1提供的PCR扩增反应体系以及PCR反应程序，区别在于PCR反应的时候，退火延伸的合并温度为65℃。
实施例3
本实施例提供本实施例提供一种检测具核梭杆菌的试剂盒，该试剂盒包括如实施例1提供的检测具核梭杆菌的检测引物组合。
本实施例提供的试剂盒还包括样品保存液，样品保存液包括0.1mol/L的EDTA、3mol/L的Tris·HCl和0.15mol/L的NaCl。
当然，本试剂盒还包括可以直接进行PCR反应的试剂，包括PCR反应缓冲液、TaqDNA聚合酶、dNTPs和Mg2+中的一种或多种。
试剂盒的使用方法，参考如下步骤：
1.1粪便收集将患者的粪便收集到样品保存液中，常温或4℃保存2周，-20℃保存6个月；向200mg(或200uL稀便)收集的粪便样本中，加入100μL蛋白酶K，0.5mL的核酸裂解液，充分混匀；
1.2在70℃条件下孵育10min；
1.3加入100mg的PVPP进行粗提，去除粗提液中的如色素或蛋白质等杂质；
1.4再加入RNA酶100μL，37℃水浴1小时，完全去除溶液中的RNA杂质；
1.5将样品加入到带吸附膜的离心柱中，13000rpm离心1min，弃收集管中的废液；
1.6加入500μL的DNA漂洗液1，13000rpm离心1min，弃废液；
1.7加入漂洗液2洗涤，13000rpm离心1min，弃废液，重复操作一次；
1.8将吸附柱放到新的收集管中，加入50μL的DNA洗脱液(也可以根据实际的DNA浓度适当调整DNA洗脱液的加入量)，然后13000rpm离心1min，得到基因组。
试剂盒的PCR扩增方法，参考实施例1提供的PCR扩增反应体系以及PCR反应程序。
实施例4
本实施例提供本实施例提供本实施例提供一种检测具核梭杆菌的试剂盒，该试剂盒包括如实施例1提供的具核梭杆菌的检测引物组合。
本实施例提供的试剂盒还包括样品保存液，样品保存液包括1mol/L的EDTA、0.5mol/L的Tris·HCl和0.05mol/L的NaCl。
当然，本试剂盒还包括可以直接进行PCR反应的试剂，包括PCR反应缓冲液、TaqDNA聚合酶、dNTPs和Mg2+中的一种或多种。
本实施例提供的检测试剂盒的样品收集处理的方法参考实施例3提供的方法，PCR反应程序参考实施例1。
实施例5
本实施例提供本实施例提供本实施例提供一种检测具核梭杆菌的试剂盒，该试剂盒包括如实施例1提供的检测具核梭杆菌的检测引物组合。
本实施例提供的试剂盒还包括样品保存液，样品保存液包括0.5mol/L的EDTA、1mol/L的Tris·HCl和0.1mol/L的NaCl；以及细菌裂解液、PVPP、蛋白酶K、RNA酶、DNA漂洗液和DNA洗脱液。
当然在本发明的其他的实施例中也可以是包括细菌裂解液、PVPP、蛋白酶K、RNA酶、DNA漂洗液和DNA洗脱液中的至少一种。
当然，本试剂盒还包括可以直接进行PCR反应的试剂，包括PCR反应缓冲液、TaqDNA聚合酶、dNTPs和Mg2+中的至少一种。
实验例1
本实验例提供实施例的试剂盒的使用，具体使用如下：
1、PCR反应混合液
PCR反应液各组分与浓度组成如下：Taq DNA聚合酶1.5U，UNG酶0.2U，dUTP 0.6μM、dATP、dCTP、dGTP各0.2μM，2mM的Mg2+，Fn上游引物、下游引物、探针、IR上游引物、下游引物、探针以及PC上游引物、下游引物、探针均为0.2μM，25mM的甜菜碱、0.1μg/ul BSA以及5％的DMSO，补足H2O到24μL。
阳性对照包括灭活的具核梭杆菌标准菌株，浓度为107CFU/μL。
阴性对照包括非具核梭杆菌样本DNA溶液。
标准品包括SEQIDNO.10所示的核苷酸序列的DNA片段质粒，标准品浓度分别为1×107拷贝/μL、1×106拷贝/μL、1×105拷贝/μL、1×104拷贝/μL、1×103拷贝/μL。
过程控制对照包括灭活的枯草芽孢杆菌，浓度为106CFU/μL。
2、荧光实时定量PCR反应与检测
荧光定量PCR反应条件如上表所示：第一阶段：50℃UNG酶消化10min；第二阶段：95℃预变性2min；第三阶段：95℃20s、60℃30s，退火延伸30s，收集FAM/NED/VIC信号，40个循环。
3、结果判断
反应结束后，根据各反应管中样本的扩增曲线与循环数Ct作为具核梭杆菌基因存在与否的判断依据。
第一步，样本的IR及PC的检测信号呈现S扩增曲线且Ct值小于38，表明本次扩增有效；当PC呈现S扩增曲线且Ct值小于38，而IR无扩增或Ct大于等于38时，表明样本核酸量低于检测下限；当PC无S扩增曲线，表明本次扩增无效。
第二步，在扩增有效的前提下：
若待测样本产生S型扩增曲线且Ct值小于38，则所述样本中存在具核梭杆菌基因；若待测样本扩增Ct值大于或等于38，待测样本中不存在具核梭杆菌基因；
根据各反应管中样本的具核梭杆菌基因扩增Ct与16SrDNA扩增Ct的差值，作为判断结直肠癌与癌前息肉的标准。
当具核梭杆菌与内标基因正常扩增时，且当CtFn-CtIR＞19时，结果判断为结直肠癌与癌前息肉阴性，当CtFn-CtIR≤19时，结果判断为结直肠癌与癌前息肉阳性。
其中CtFn表示具核梭杆菌基因扩增Ct值，CtIR表示16SrDNA扩增Ct值。
另外，根据Fn标准曲线,可以计算出每mg粪便标本中具核梭杆菌的拷贝数，并定量分析标本中具核梭杆菌的含量。
实验例2
本实验例提供实施例2中的检测粪便中具核梭杆菌的核酸组合的性能评估。
具体步骤如下：
参考品DNA核酸的制备
1.1作为标准品的包含具核梭杆菌基因片段的质粒构建
以核梭杆菌基因序列为模板，由武汉金开瑞生物技术公司合成SEQIDNO.10核酸序列。将SEQIDNO.10连接到pUC57载体，并测序校对。将构建的质粒梯度稀释为浓度分为1×107拷贝/μL、1×106拷贝/μL、1×105拷贝/μL、1×104拷贝/μL、1×103拷贝/μL的DNA溶液。
1.2作为内参包含16SrDNA基因片段的质粒构建
以16SrDNA基因序列为模板，由武汉金开瑞生物技术公司合成SEQIDNO.11核酸序列。将SEQIDNO.11连接到pUC57载体，并测序校对。
1.3阳性对照包括灭活的具核梭杆菌标准菌株，浓度为107CFU/μL。
1.4阴性对照包括非具核梭杆菌样本DNA溶液。
1.5过程控制对照品包括灭活的枯草芽孢杆菌，浓度为106CFU/μL。
用于检测具核梭杆菌基因引物与探针的性能分析
2.1不同浓度的参考品制备
将上述步骤合成的具核梭杆菌基因片段重组质粒进行定量，并定量为1010拷贝/μL，并梯度稀释，得到1×107拷贝/μL、1×106拷贝/μL、21×105拷贝/μL、1×104拷贝/μL、1×103拷贝/μL、1×102拷贝/μL、1×101拷贝/μL等不同浓度梯度稀释液,作为标准品DNA。
2.2反应体系配制具体参见实施例1，每个反应管中加入1μL一种梯度稀释的质粒模版。
2.3荧光实时定量PCR反应与检测具体参见实施例1。
结果判断
结果如图1所示，图中的6条曲线分别表示具核梭杆菌质粒按十倍稀释为107、106、105、104、103、102个拷贝，扩增结果均有明显的S型扩增曲线，反应体系在107-102之间呈线性分布，R2≥0.99。根据扩增曲线Ct值判断，浓度与扩增循环数Ct结果具有很好的线性关系。
结果如图2所示，将IR质粒依次稀释为106、105、104、103、102、101个拷贝的浓度梯度溶液，扩增结果均有明显的S型扩增曲线，反应体系在106-101之间呈线性分布，最低检出1拷贝/μL的模板。以上结果说明该引物、探针具有较高的扩增灵敏度，并在最低检出限实验中表明反应体系最低检出1拷贝/μL的模板。
结果如图3所示，由上述线性关系选取Fn质粒浓度选择1×107拷贝/μL、1×104拷贝/μL、1×102拷贝/μL等三个浓度检测制备参考品溶液，扩增结果均有明显的S型扩增曲线，每浓度重复10次，CV＜5％，以上结果说明该引物、探针扩增精密度良好。
电泳结果如图4和图5所示，(图中M表示DNA Marker：DL500，1-8表示8个实验样本)，本实施例提供的试剂盒能扩增出128bp大小的目的条带，且条带清晰、均一而没有杂带；说明试剂盒能准确快速的扩增出条带，且具有较高的特异性和灵敏度。
实验例3
本实验例使用实施例4提供的检测粪便中具核梭杆菌的试剂盒对结直肠癌患者粪便样本中的具核梭杆菌的检测；并且对结直肠癌患者粪便中具核梭杆菌的ROC曲线分析。
1.1样本准备收集2014-2016期间结直肠癌患者82例，健康对照148例。其中结直肠癌患者年龄范围在34-76岁之间，女患者37例，男患者45例。病例的具体详细情况见表1到表5。
表1病例的基本情况
总病例 82
男性患者 45
女性患者 37
年龄范围 34-76
平均年龄 56.5
表2结肠癌的不同类型分布
表3肿瘤病理分类及分化情况
肿瘤病理分类 病例数 肿瘤分化程度 病例数
腺癌 37 高分化 17
粘液腺癌 25 中分化 30
印戒细胞癌 20 低分化 35
表4肿瘤浸润情况
肿瘤浸润程度 病例数 淋巴结分期 病例数
Tis 18 N0 17
T1 20 N1 19
T2 15 N2 43
T3 16 NX 3
T4a 13
表5病理分期及远处转移
从表1到表5可以看出，肿瘤患者涵盖升结肠癌、横结肠癌、降结肠癌、乙状结肠与直肠癌等，肿瘤平均大小3.4cm，病理分类包含腺癌、粘液腺癌、印戒细胞癌，病理分期包含0-Ⅳ等，具体信息见表1结直肠癌信息表。健康对照年龄范围34-67岁，为肠镜确诊非结直肠癌或息肉患者。
1.2粪便收集将患者的粪便收集到样品保存液中，常温或4℃保存2周，-20℃保存6个月。
1.3粪便基因组提取向200mg(或200uL稀便)收集的粪便样本中，加入0.5mL的核酸裂解液，充分混匀；70℃孵育10min；加入50mg的PVPP进行粗提，去除粗提液中的如色素或蛋白质等杂质；再依次加入蛋白酶K100μL和RNA酶100μL，完全去除溶液中的蛋白质杂质和RNA杂质；将样品加入到带吸附膜的离心柱中，加入500μL的DNA漂洗液洗涤，然后13000rpm离心1min，重复操作一次；加入50μL的DNA洗脱液(也可以根据实际的DNA浓度适当调整DNA洗脱液的加入量)，然后13000rpm离心1min，得到基因组。
1.4PCR扩增反应PCR扩增反应体系及扩增程序具体参考实施例1。
具核梭杆菌表达量的数据处理方法为ΔCt法。Ct为反应达到阈值时所需的循环数，每种具核梭杆菌相对于标准内参的表达量用方程2-ΔCt表示，其中ΔCt＝Ct待测样品-Ct内参。本发明粪便中16SrDNA作为内参。数据分析采用SPSS20.0软件进行，数据表示方法为均值±标准误差(means±S.E.M)，组间比较采用t检验，P<0.05认为有统计学差异。
如图6所示，结直肠癌患者粪便中的具核梭杆菌相对表达量均显著高于正常对照组(14.8±6.4vs23.3±4.3)，差异具有统计学意义(p<0.05)。
具核梭杆菌的特异性和灵敏性通过ROC曲线下面积和选定的cut-off值进行计算。检测结果如图7和表6所示。
表6具核梭杆菌检测数据
标志物 阈值 灵敏度 特异性 AUC
具核梭杆菌 524288 76％ 89％ 0.9
当ΔCt＝19时，具核梭杆菌检测结直肠癌的ROC曲线下面积最大，且AUC＝0.9，此时对应的灵敏度与特异性分别为76％和89％。
实验例4
本实验例中提供实施例3提供的检测粪便中具核梭杆菌的试剂盒在检测结直肠癌、癌前息肉的灵敏度与特异性。
本实施例中设置77个结直肠癌病人样本，包括26例中分化腺癌、13例高分化腺癌、15例部分腺体高级别上皮内瘤变、23例低分化腺癌以及34个其他肿瘤样本，包括7例胃管状腺癌、12例胃腺鳞癌、10例胃溃疡癌变、5例胰小细胞癌以及102例健康对照，内参IR为细菌的16SrDNA，进行PCR反应扩增，PCR反应扩增体系和反应程序参考实施例1。
结果显示，对于中分化腺癌，其检测敏感性为84.3％，特异性为88.2％。
对于高分化腺癌，其检测敏感性为73.9％，特异性为85.3％。
对于腺体高级别上皮内瘤变，其检测敏感性为49.6％，特异性为89.3％。
对于低分化腺癌，其检测敏感性为83.5％，特异性为87.7％。
部分结果如图10、图11所示，其中图10为具核梭杆菌的扩增曲线，图11为第二引物对的扩增曲线。图中12个结直肠癌病人样本△Ct值都在19个扩增循环以内，其他肿瘤样本和空白对照中除有一例胰小细胞癌和一例胃腺鳞癌的△Ct值小于19个循环之外，其余样本△Ct值均大于19个循环。
从上述的实验可以看出本发明提供的核酸组合的引物对和探针针特异性很强、灵敏度很高。
综上所述，本发明实施例提供的检测粪便中的具核梭杆菌的核酸组合能特异的识别具核梭杆菌的基因组序列，快速高效的检测出具核梭杆菌，结果准确可靠；应用该核酸组合并制备具核梭杆菌的检测试剂盒，能方便快捷的帮助检测出样本中的具核梭杆菌，检测结果准确，使用方便，有利于实际应用和推广。
以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 武汉艾米森生命科技有限公司
<120> 一种检测粪便中具核梭杆菌的核酸组合及其应用与试剂盒
<160> 9
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> Fusobacterium nucleatum
<400> 1
tctcctttca ataaaagtgg c 21
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> Fusobacterium nucleatum
<400> 2
aagaagtagg atgaaaatca gtta 24
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> Fusobacterium nucleatum
<400> 3
cctggacgaa gactgacgct c 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> Fusobacterium nucleatum
<400> 4
ctcaagggca caacctccaa g 21
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Fusobacterium nucleatum
<400> 5
gatgaatatc cgcatctacc 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Fusobacterium nucleatum
<400> 6
tttggcggat caggtttttc 20
<210> 7
<211> 16
<212> DNA
<213> Fusobacterium nucleatum
<400> 7
agaccgatgc tctacc 16
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> Fusobacterium nucleatum
<400> 8
cgaaagcgtg gggagcaaac agg 23
<210> 9
<211> 26
<212> DNA
<213> Fusobacterium nucleatum
<400> 9
cacgccattc agattccgac ggatct 26

Claims (10)

1.一种用于检测粪便中具核梭杆菌的核酸组合，其特征在于，所述核酸组合包括引物组合和探针；所述引物组合包括第一引物对、第二引物对和第三引物对，所述第一引物对的碱基序列如SEQ ID NO.1-2所示，所述第二引物对的碱基序列如SEQ ID NO.3-4所示，所述第三引物对的碱基序列如SEQ ID NO.5-6所示；所述探针包括第一探针、第二探针和第三探针；所述第一探针的碱基序列如SEQ ID NO.7所示，所述第二探针的序列如SEQ ID NO.8所示，所述第三探针的序列如SEQ ID NO.9所示；所述探针的5'端标记有荧光基团，所述探针3'端标记有淬灭基团，所述荧光基团为FAM、VIC、TET、JOE、HEX、CY3、CY5、ROX、RED610、TEXASRED、RED670、NED中的一种，所述淬灭基团为6-TAMRA、BHQ-1～3、和结合分子沟的非荧光淬灭剂中的一种。
2.如权利要求1所述的核酸组合在检测粪便中具核梭杆菌的应用。
3.如权利要求1所述的核酸组合在制备癌症早期检测的试剂盒中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述癌症包括结直肠癌、高风险癌前息肉。
5.如权利要求1所述的核酸组合在制备检测具核梭杆菌试剂盒中的应用。
6.一种检测粪便中具核梭杆菌的试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1所述的用于检测粪便中具核梭杆菌的核酸组合。
7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括样品保存液、核酸提取液、PCR反应液、阳性质控品、阴性质控品、内标对照、标准品中的一种或多种。
8.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述样品保存液包括0.1-1mol/L的EDTA、0.5-3mol/L的Tris·HCl和0.05-0.15mol/L的NaCl。
9.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述核酸提取液包括核酸裂解液、PVPP、蛋白酶K、RNA酶、DNA漂洗液和DNA洗脱液中的一种或多种。
10.如权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述的核酸裂解液包括100-500mMTris·HCl、20-100mM EDTA、0.4-1M NaCl和体积分数为1％-4％的SDS溶液。
CN201710101308.9A 2017-02-23 2017-02-23 一种检测粪便中具核梭杆菌的核酸组合及其应用与试剂盒 Pending CN106591488A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710101308.9A CN106591488A (zh) 2017-02-23 2017-02-23 一种检测粪便中具核梭杆菌的核酸组合及其应用与试剂盒

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710101308.9A CN106591488A (zh) 2017-02-23 2017-02-23 一种检测粪便中具核梭杆菌的核酸组合及其应用与试剂盒

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN106591488A true CN106591488A (zh) 2017-04-26

Family

ID=58587933

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201710101308.9A Pending CN106591488A (zh) 2017-02-23 2017-02-23 一种检测粪便中具核梭杆菌的核酸组合及其应用与试剂盒

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN106591488A (zh)

Cited By (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108103149A (zh) * 2018-03-02 2018-06-01 四川知几未来健康管理有限公司 一种具核梭杆菌的检测核酸组合、试剂盒、芯片及其应用
CN109680083A (zh) * 2019-01-16 2019-04-26 江西普瑞森基因科技有限公司 一种快速检测粪便具核梭杆菌的引物组、方法及其应用
CN109762900A (zh) * 2019-01-14 2019-05-17 深圳微健康基因科技有限公司 结直肠癌标志物及其应用
CN110592246A (zh) * 2019-10-14 2019-12-20 杭州同创越诚基因科技有限公司 一种人肠道菌群定量检测方法及其应用
CN110857450A (zh) * 2018-08-22 2020-03-03 深圳华大生命科学研究院 结直肠癌标志物及其应用
CN110903999A (zh) * 2019-10-23 2020-03-24 上海市第十人民医院 一株人类肠道分离的具核梭杆菌动物亚种菌株及其应用
CN110903997A (zh) * 2019-10-23 2020-03-24 上海市第十人民医院 一株从大肠癌肿瘤组织中获取的具核梭杆菌及其应用
CN111004738A (zh) * 2019-10-23 2020-04-14 上海市第十人民医院 一株具核梭杆菌多形亚种分离株及其应用
CN112980979A (zh) * 2021-04-15 2021-06-18 上海市临床检验中心 具核梭杆菌荧光定量检测试剂盒及其制备方法与检测方法
CN113005173A (zh) * 2019-12-19 2021-06-22 武汉艾米森生命科技有限公司 一种粪便脱落细胞核酸保存试剂及其制备方法与应用
WO2021248779A1 (zh) * 2020-06-12 2021-12-16 广州达安基因股份有限公司 一种拭子样本核酸释放剂及其应用
CN113999843A (zh) * 2021-11-05 2022-02-01 李艳 用于检测火山类芽孢杆菌的核酸组合产品及试剂盒
WO2023059172A1 (ko) * 2021-10-08 2023-04-13 연세대학교 산학협력단 푸조박테리아 표적 펩타이드, 이를 포함하는 암 진단용 조성물 및 약물 전달 조성물

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101270381A (zh) * 2008-05-14 2008-09-24 肖水清 一种口腔致病菌的多重pcr快速检测方法
CN105256048A (zh) * 2015-11-06 2016-01-20 厦门基科生物科技有限公司 一种基于熔解曲线分析的口腔致病菌多重pcr检测方法
CN105256046A (zh) * 2015-11-04 2016-01-20 中国人民解放军疾病预防控制所 具核梭杆菌的恒温检测方法及其专用引物与试剂盒
CN106319048A (zh) * 2016-08-19 2017-01-11 上海基正医药科技有限公司 牙周炎致病菌多重荧光pcr检测试剂盒

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101270381A (zh) * 2008-05-14 2008-09-24 肖水清 一种口腔致病菌的多重pcr快速检测方法
CN105256046A (zh) * 2015-11-04 2016-01-20 中国人民解放军疾病预防控制所 具核梭杆菌的恒温检测方法及其专用引物与试剂盒
CN105256048A (zh) * 2015-11-06 2016-01-20 厦门基科生物科技有限公司 一种基于熔解曲线分析的口腔致病菌多重pcr检测方法
CN106319048A (zh) * 2016-08-19 2017-01-11 上海基正医药科技有限公司 牙周炎致病菌多重荧光pcr检测试剂盒

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
续薇等: "《医学检验与质量管理》", 31 August 2015 *
郭杨等: "具核梭杆菌生物学特性及检测手段的研究进展", 《国际口腔医学杂志》 *

Cited By (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108103149A (zh) * 2018-03-02 2018-06-01 四川知几未来健康管理有限公司 一种具核梭杆菌的检测核酸组合、试剂盒、芯片及其应用
CN110857450A (zh) * 2018-08-22 2020-03-03 深圳华大生命科学研究院 结直肠癌标志物及其应用
CN109762900A (zh) * 2019-01-14 2019-05-17 深圳微健康基因科技有限公司 结直肠癌标志物及其应用
CN109762900B (zh) * 2019-01-14 2022-07-29 深圳微健康基因科技有限公司 结直肠癌标志物及其应用
CN109680083A (zh) * 2019-01-16 2019-04-26 江西普瑞森基因科技有限公司 一种快速检测粪便具核梭杆菌的引物组、方法及其应用
CN110592246A (zh) * 2019-10-14 2019-12-20 杭州同创越诚基因科技有限公司 一种人肠道菌群定量检测方法及其应用
CN110903997A (zh) * 2019-10-23 2020-03-24 上海市第十人民医院 一株从大肠癌肿瘤组织中获取的具核梭杆菌及其应用
CN111004738A (zh) * 2019-10-23 2020-04-14 上海市第十人民医院 一株具核梭杆菌多形亚种分离株及其应用
CN110903999B (zh) * 2019-10-23 2021-11-23 上海市第十人民医院 一株人类肠道分离的具核梭杆菌动物亚种菌株及其应用
CN110903999A (zh) * 2019-10-23 2020-03-24 上海市第十人民医院 一株人类肠道分离的具核梭杆菌动物亚种菌株及其应用
CN113005173A (zh) * 2019-12-19 2021-06-22 武汉艾米森生命科技有限公司 一种粪便脱落细胞核酸保存试剂及其制备方法与应用
CN113005173B (zh) * 2019-12-19 2023-10-27 武汉艾米森生命科技有限公司 一种粪便脱落细胞核酸保存试剂及其制备方法与应用
US11753672B2 (en) 2020-06-12 2023-09-12 Da An Gene Co., Ltd. Swab sample nucleic acid releaser and use thereof
WO2021248779A1 (zh) * 2020-06-12 2021-12-16 广州达安基因股份有限公司 一种拭子样本核酸释放剂及其应用
CN112980979A (zh) * 2021-04-15 2021-06-18 上海市临床检验中心 具核梭杆菌荧光定量检测试剂盒及其制备方法与检测方法
WO2023059172A1 (ko) * 2021-10-08 2023-04-13 연세대학교 산학협력단 푸조박테리아 표적 펩타이드, 이를 포함하는 암 진단용 조성물 및 약물 전달 조성물
CN113999843A (zh) * 2021-11-05 2022-02-01 李艳 用于检测火山类芽孢杆菌的核酸组合产品及试剂盒

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106591488A (zh) 一种检测粪便中具核梭杆菌的核酸组合及其应用与试剂盒
Wen et al. Comparison of TP53 mutations identified by oligonucleotide microarray and conventional DNA sequence analysis
EP3800273A1 (en) Use of detection reagent for detecting methylation of genes associated with colorectal cancer, and kit
CN107760788A (zh) 一种检测宫颈细胞基因甲基化的核酸组合及试剂盒与应用
CN108048566A (zh) 一种检测septin9基因甲基化的核酸组合及试剂盒
WO2023226938A1 (zh) 甲基化生物标记物、试剂盒及用途
CN106119392A (zh) 一种与食管鳞癌辅助诊断相关的血清miRNA标志物及其应用
CN113699242A (zh) 检测kras基因突变、adamts1与bnc1甲基化的引物探针，试剂盒与方法
CN113881770B (zh) 肺癌诊断的试剂盒和装置
CN113430272B (zh) 一种食管癌或癌前病变的诊断或辅助诊断的试剂、试剂盒及其应用
CN116970705B (zh) 用于尿路上皮癌基因甲基化检测的核酸产品、试剂盒及应用
CN113355416A (zh) 一种用于检测胃癌相关基因甲基化的核酸组合物、试剂盒和检测方法
CN108315426A (zh) 微卫星序列稳定性检测的标志物组合、引物组和试剂盒
US20110097271A1 (en) Colon Cancer Associated Transcript 1 (CCAT1) As A Cancer Marker
CN118685526B (zh) 用于诊断肺癌基因甲基化的pcr引物探针组合、试剂盒及其应用
CN113930505B (zh) 用于肺癌诊断的试剂盒及装置
CN113528657B (zh) 用于检测食管癌的组合物及其试剂盒和应用
CN114672560A (zh) 通过外泌体miRNA标志物鉴定结直肠癌状态的检测试剂盒和方法
CN118186088A (zh) 用于食管癌辅助诊断的miRNA组合物及其应用
CN112626219A (zh) 用于微卫星不稳定性检测的引物组合物、试剂盒及应用
CN115927607A (zh) 生物标志物在胃癌诊断中的应用
CN116287240A (zh) 检测食管癌相关基因甲基化的引物、探针、试剂盒及方法
CN118421800A (zh) 用于宫颈腺癌甲基化检测的产品、试剂盒及应用
CN113005199A (zh) 用于微卫星不稳定性检测的引物组合物、试剂盒及应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination