CN1065682A

CN1065682A - 转拼核酶

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Publication number: CN1065682A
Application number: CN92100298A
Authority: CN
Inventors: J·哈塞尔福; H·M·古德曼
Original assignee: General Hospital Corp
Current assignee: General Hospital Corp
Priority date: 1991-01-17
Filing date: 1992-01-17
Publication date: 1992-10-28
Also published as: EP0567568A1; US5874414A; WO1992013090A1; NZ314629A; NZ241310A; HUT69966A; PT100017A; JPH06504444A; IE920124A1; CA2100068A1; US6015794A; AU1234492A; AU654330B2; HU218161B; KR100235792B1; ZA92348B; IL100682A0; HU9302044D0; IL135219A0; EP0567568A4

Abstract

本发明介绍了根据Ⅰ组内含子的催化活性而设计的能够进行自我催化的转拼的新核酶。利用这一设计，有可能构建出能够以非常精确的方式将新的 3′外显子序列有效地拼接至任何选定的靶RNA序列中去的核酶。还介绍了无活性的核酶原形式。

Description

本发明涉及新的能够进行转拼反应的核酶。

Ⅰ.Ⅰ组内含子

具有催化活性的RNA分子称为核酶或RNA酶（Cech，T.R.，Ann. Rev. Biochem. 59：543-568（1990））。嗜热四膜虫（Tetrahy-mena thermophila）前体rRNA含有能够催化其自身切割的内含子（核酶）。该核酶是一组结构上相关的Ⅰ组内含子中的一种。

修饰过的嗜热四膜虫内含子的拼接活性需要有鸟苷辅因子和二价阳离子（Mg⁺⁺或Mn⁺⁺）存在，并且是通过两个连续的转酯反应（图1）发生的。首先，游离的鸟苷与核酶结合且其3′羟基被置于攻击5′拼接位点的磷原子的位置。鸟苷共价连接于内含子序列并释放出5′外显子。接着，新释放出的5′外显子的3′羟基与位于3′拼接位点的磷酸二酯键反应，从而产生连接的外显子序列。然后，切除的内含子通过一系列的转酯反应（涉及其3′羟基和内部序列）形成缩短了的环形分子。

从化学上讲，这些连续反应是相似的并且都发生在单一活性位点。自拼反应的特征在于交替RNA结构的形成，因为不同的RNA链均在高度保守的内含子周围形成了类似的构象。拼接需要对准位于称作“内部指导序列”（或IGS）的互补序列内含子一外显子接点。

在5′拼接位点进行的首次切割需要在IGS和与拼接位点相邻的序列之间形成碱基配对的螺旋（P1）。该螺旋中U：G“变位”碱基对的存在可限定将在核酶的催化反应中破坏磷酸二酯键。该键断裂后，部分P1螺旋被取代，且由于IGS和与3′拼接位点相邻的序列之间的互补性而形成了新螺旋（P10）。不变的鸟苷残基位于3′拼接位点处的磷酸二酯之前，如同P1序列中被取代的部分一样。因此，外显子的连接仅在新的外显子序列取代了内含子序列之处以与第一次切割反应相反的方向发生。应当指出，紧接外显子连接反应的内含子环化反应同样也涉及5′序列与IGS的碱基配对，而且反应是由内含子末端鸟苷残基的3′羟基介导的（Been，M.D.et al.，“Selection of Circularization Sites In A Group I IVS RNA Requires Multiple Alignments of An Internal Template-Like Sequence，”Cell 50：951（1987））。

Ⅱ.催化活性

为了更好地确定Ⅰ组内含子的结构和催化性质，已从嗜热四膜虫内含子“核心”中剥去外显子序列。Cech，T.R，等（WO 88/04300）曾指出，嗜热四膜虫内含子核酶至少具有三种催化活性：（1）脱磷酸活性，它能够以序列特异性方式除去RNA3′末端的磷酸，（2）RNA聚合酶活性（核苷酸基转移酶），它能够催化寡核糖核苷酸转化为多核糖核苷酸，（3）序列特异性核糖核酸内切酶活性。

分离的核酶活性能够与底物RAN进行相互转移作用，且已对这类反应进行过鉴定。例如，当将平末端形式的内含子和对应于5′拼接点的序列一起保温时，该位点受到类似于拼接第一步的鸟苷依赖性切割。底物与核糖核酸内切的内含子RNA进行碱基配对，形成螺旋P1，且切割发生在第4-6位的U：G碱基对之后。通过系统发育比较和突变分析发现，只要维持了P1螺旋的碱基配对，紧接5′拼接位点处保守尿嘧啶残基的序列的性质对催化作用并不重要（Doudna，J.A.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：7402-7406（1989））。

选择3′拼接位点所需的序列似乎主要位于内含子本身的结构内，它包括螺旋I9.0以及随后的确定3′内含子边界的鸟苷残基。但是，如同突变分析所显示的一样，3′外显子内的侧翼序列是形成螺旋P10以及进行有效拼接所必需的（Suh，E.R.et al.，Mol.Cell.Biol.10：2960-2965（1990））。另外，利用平末端形式的内含子和“外部”指导序列以及已被5′鸟苷残基延长的寡核苷酸，已将寡核苷酸转移连接。在连接之前，通过在外部模板上形成类似于P10的螺旋而单独对准对应于3′外显子序列的底物寡核苷酸（Doudna，J.A.et al.，Nature 339：519-522（1989））。

通过将分散的“杂交”区操纵至核酶而将核酶的切割活性对准于特定的RNA，该杂交区能够与所需的RNA特异杂交。例如，Ger-lach，W。L等（EP321 201）构建出一种含有与靶RNA互补的序列的核酶。通过增加该互被序列的长度可提高该序列对靶RNA的亲和性。但是，该核酶的杂交区和切割区彼此整合。通过互补区与靶RNA杂交后，核糖酶的催化区切割该靶。它提示核酶将可在体内用于灭活或切割靶RNA，从而可用于例如治疗由于外源宿主RNA的产生所引起的人体疾病。但是，由核酶指导的转拼（与转切相反）则未曾提到或揭示过。

已对各种天然存在的核酶的核糖核酸内切酶活性（切割活性）进行过广泛研究。对这些核酶的结构和序列进行分析后发现，切割位点周围的某些核苷酸非常保守，而其侧翼序列则并非如此。这一情况导致人们设计出自然界尚未发现的新的核糖核酸内切酶活性。例如，Cech等人已构建出改变了底物序列特异性的新核酶（Cech，T.R.et al.，WO 88/04300;Koizumi，M.et al.，FEBS Lett.239：295-288（1988）;Haseloff，J.et al.，Nature 334：585-591（1987）;及Heus，H.A.et al.，Nucl Acids Res.18：1103-1108（1990））。根据自身切割植物类病毒和卫星RNA方面的早期研究（Buzayan，J.M.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83：8859-8862（1986）），已为能够以高度序列特异性方式转移切割其它RNA分子的核酶的设计建立了指南（Haseloff，J.et al.，Nature 334：585-591（1988））。但是，这些构建物并不能够有效地催化针对转拼的反应。

分离RNA上含有的外显子的连接（即转拼）在自然界发现于snRNP介导的以及自我催化的Ⅰ组和Ⅱ组内含子中。在锥虫及Caenorhabditis eleqans mRNA中，共同的5′前导序列是由各自的基因上转录并被拼接到mRNA的3′部分（Agabian，N.，Cell 61：1157-11600（1990）;Hirsh，D.et al.，Mol.Biol.Rep.14：115（1990））。这些小的“拼接前导”RNA（slRNA）由已融合至在哺乳动物snRNA拼接提取物中能够从功能上取代U1 snRNA的序列的5′外显子构成。

另外，Ⅰ组和Ⅱ组自拼内含子均能够在人工系统中转移连接外显子（Been，M.D.et al.，Cell 47：207-216（1986）;Galloway-salvo，J.L.et al.，J.Mol.Biol.211：537-549（1990）;Jacquier，A.et al.，Science 234：1099-1194（1986）;和Jarrell，K.A.et al.，Mol.Cell Biol.8：2361-2366（1988））。Ⅱ组内含子的体内转拼发生在叶绿体的拼接基因中（Kohchi，T.et al.，Nucl.Acids Res.16：10025-10036（1988）），且Ⅰ组内含子的体内转拼在大肠杆菌的人工拼接基因中得到显示（Galloway-Salvo，J.L.et al.，J.Mol.Biol.211：537-549（1990））。在后一情况下，含有Ⅰ组内含子的噬菌体T₄胸苷酸合成酶基因（td）在连接内含子螺旋p6a的环处被断开。已证实td基因片段的转录物经过体外转拼拼营救发生机能障碍的大肠杆菌宿主细胞。已知的碱基配对（p3、p6和p6a）和内含子片段之间可能的三级反应使得基因片段能够正确装配和加工。

在体外，四膜虫核酶能够催化单链寡核糖核苷酸底物的转拼。其中有四个成分是必需的：核酶、3′单链RNA、5′外显子和GTP。在该反应中使用了缩短形式的四膜虫核酶（L-21 Sca I IVS RNA（起始于内部指导序列并终止于U₄₀₉）（Flanegan，J.B.et al.，J.Cell.Bicchem.（Supp.）12 part D：28（1988））。由GTP在5′拼接位点所进行的攻击释放5′外显子，接着，该5′外显子在3′拼接位点进行的转酯反应中被核酶连接至3′外显子。

已有人提出在体内用核酶代替反义RNA对准和破坏特定的RNA（Gerlach，W.L.et al.，EP2，21，201;Cotten，M.，Trends Biotechnol.8：174-178（1990）;Cotten，M.et al.，EMBO J.8：3861-3866（1989）;Sarver，N.et al.，Science 247：1222-1225（1990））。例如，已有人提出，对于HIV-1感染期间所表达出的RNA具有核酸内切催化活性的核酶的表达可作为一种抵抗1型人免疫缺陷病毒（HIV-1）感染的可能治疗方法（Sarver，N.et al.，Science 247：1222-1225（1990）;Cooper，M.，CDC AIDS Weck-ly，April 3，1989，page2;Rossi，J.J.，Abstract of Grant No.IROIAI29329 in Dialog’s Federal Research in Progress File 265）。但是，这一想法并未获得成功。

在为调查核酶作为治疗1型人体免疫缺陷病毒（HIV-1）感染的治疗剂的替在应用而进行的研究中，hammerhead motif核酶（Hutchins，C.J.et al.，Nucl.Acids Res.14：3627（1986）;Keese，P.et al.，in Viroids and Viroid-like Pathogens，J.S.Se-mancik，ed.，CRC Press，Boca Raton，FL，1987，PP1-47）所作用的是HIV-1 gag转录本。作用于gag的核酶在人细胞培养物中的表达导致HIV-1 gag RNA及抗原p24水平的下降（但不是完全丧失）（Sarver，N.et al.，Science 247：1222-1225（1990））。因此，Sarver氏核酶的医疗效果受其低效所限，因为任何逃脱的致病RNA都会给宿主带来问题。

在体内应用核酶的另一个问题是，为了在核提取物中发挥核酶的抑制功能需要有高比值的核酶/底物，而这一比值难以达到。Cot-ton等通过显微注射法获得了高比值的核酶/底物，它是将含有与强tRNA启动子（聚合酶Ⅲ启动子）可操纵连接的核酶产生基因的表达盒与含有核酶切割序列的底物RNA一起注射进蛙卵母细胞中（Cotton，M.et al.，EMBO J.8：3861-3866（1089））。但是，对于多细胞生物来说显微注射不是一种合适的给药方法。

抗编码大肠杆菌β-半乳糖苷酶的mRNA的核酶体内活性已有报道（Chuat，J.-C.et al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.162：1025-1029（1989））。但是，这一活性只有当核酶和靶被转染至细菌细胞内的同一分子上时才能观察到。当作用于自具有β-半乳糖苷酶基因的靶部分的细菌F游离基因转录的mRNA时，核酶的活性无效。

因此，目前对核酶活性的技术应用仅限于利用核酶的切割活性以破坏靶RNA的活性。不幸的是，为了保证其效力这类应用常常需要完全破坏所有的靶RNA分子和/或需要相对高比值的核酶/底物，而这一高比值难得达到。更重要的是，现有技术中修饰过的核酶不能够有效、定向地转拼。

因此需要开发高度有效的核酶和核酶表达系统。尤其是，现有技术中没有提到通过将新RNA序列转拼至宿主RNA来破坏已有的RNA序列或改变已有RNA的编码序列的有效方法。

鉴于设计新核酶的可能性以及对在体内改变高等真核生物遗传特征的有效方法的需要的认识，本发明人对利用核酶在体内改变天然RNA遗传信息进行过研究。这些努力的结果是开发出高度有效的转拼核酶并为其操作建立了指南。

按照本发明，首先提供了一种RNA或DNA分子，该分子编码转拼核酶，而该核酶能够在体外或体内以高度精确的方式将新的3′外显子序列有效地拼接至任何选定的靶RNA序列中，并且这种RNA或DNA分子在调节任何选定的靶RNA或3′外显子序列的能力以及在加进了增强该核酶特异性的互短序列方面是新的。

按照本发明，也提供了一种编码核酶的RNA或DNA分子，而为该核酶编码的序列是一融合RNA，该融合RNA产生出可以使核酶与靶RNA杂交的第一RNA序列以及能够转位至靶RNA中去的第二RNA序列，且该第二RNA序列编码出一种异源于靶RNA序列的RNA序列。

按照本发明，也提供了一种RNA或DNA分子，它编码的是构象被破坏的本发明核酶（核酶原），该核酶原由底物激活，即，该核酶原在与靶RNA发生特异性反应而被重新激活之前只有微不足道的或没有自切或转拼活性。

按照本发明，也提供了含有核酶或核酶原表达盒的RNA或DNA分子。该表达盒能够稳定地插入至宿主基因组中，该表达盒产生能够在宿主中起作用的启动子序列，而该序列与本发明的核酶或核酶原序列可操纵地连接。

按照本发明，也提供了一种体外转拼的方法，该方法包括以下步骤：（1）在体外提供本发明的核酶或核酶原以及适合于该核酶或核酶原的底物，（2）提供促进所需的该核酶或核酶原催化活性的体外反应条件，（3）使该核酶或核酶原与该底物在该条件下反应。

按照本发明，也提供了一种体内转拼的方法，该方法包括以下步骤：（1）将本发明的RNA或DNA分子提供给宿主细胞，（2）在该宿主细胞中表达由该分子所编码的核酶或核酶原，（3）在该宿主细胞中表达该核酶或核酶原底物，（4）将该核酶或核酶原与该底物在该宿主细胞中反应。

按照本发明，也提供了一种灭活靶RNA活性的方法，该方法包括（1）提供本发明的核酶或核酶原，该核酶或核酶原对靶RNA具有催化活性，（2）提供该靶RNA，和（3）提供使该核酶或核酶原表达其作用于靶RNA的催化活性的条件。

按照本发明，也提供了一种在体内为宿主细胞提供所需遗传序列的方法，该方法包括（1）为所需宿主细胞提供本发明的核酶或酶原，该核酶或核酶原在该宿主细胞中对靶RNA具有催化活性，（2）提供编码该所需遗传序列的该核酶或核酶原，（3）提供条件使得该核酶或核酶原将该所需的遗传序列转拼至靶RNA序列中。

按照本发明，也提供了一种对农业上重要的植物种进行雄性或雌性不育处理的方法，该方法包括为该物种所需细胞提供本发明的核酶或核酶原，该核酶或核酶原作用于细胞内表达的受精所需的任何RNA，且该核酶或核酶原提供一个对转拼RNA具有毒性的产物的编码序列。

按照本发明，也提供了一种对作物进行遗传修饰的方法，该方法包括给该作物的胚细胞提供本发明的核酶，该核酶所编码的序列能够为该植物提供所需的遗传修饰。

按照本发明，也提供了一种对植物进行抗病原菌免疫的方法，该方法包括构建能够表达本发明的植物病原菌特异性融合核酶或核酶原的转基因植株，该核酶能够破坏或抑制该病原体。

按照本发明，也提供了一种转化的、抗病原菌微生物，该微生物被本发明的核酶或核酶原所转化，而该核酶或核酶原对该病原体所表达的核酸分子具有催化活性。

按照本发明，还提供了一种能够将所需的核酶活性传递给所需宿主的病毒病原体，该核酶活性由本发明的核酶传递。

图1是Ⅰ组内含子的核酶拼接机制示意图。

图2是（A）嗜热四膜虫rRNA内含子;（B）本发明靶mRNA和转拼核酶的结构示意图。

图3（A）是CAT-LacZ α-肽转拼核酶的设计图;（B）是CAT-LacZ核酶的完整DNA编码序列。

图4表示黄瓜花叶病毒（CMV）RNA4转拼核酶的序列。A：病毒RNA靶序列;B：寡核苷酸靶序列;C：CMV RNA4-白喉毒素A链转拼核酶。

图5是黄瓜花叶病毒3/4序列的比较。

图6表示野生型DTA和DTA3′及外显子突变体的部分序列。图6（C）是具有异亮氨酸取代基的Gal4-DTA核酶的完整编码序列。

图7表示了“核酶原”设计的基本原理。箭头显示核酶切割位点，“反义”区用黑色表示，辐射状阴影表示催化区，浅阴影表示3′“外显子”序列。在没有靶mRNA的情况下，转拼核酶可进行瞬时碱基配对，并与异源序列（包括其自身）反应。另外，在“3′外显子”连接区将发生剪切。所构建的无活性“核酶原”含有额外的自身互补序列，该序列引起核酶的催化中心误叠。只有当与所需的靶mRNA进行碱基配对并且干扰二级结构接着被取代后，才会形成具有活性的核酶。

图8显示了CAT-LacZ转拼核酶的序列及其估计的二级结构。核酶“核心”序列被涂成阴影（按照Cech，Gene 73：259-271（1988））。其中显示了未修饰核酶和核酶原1和2所作用的螺旋p8，它们分别具有13和18个核苷酸的互补于“反义”区（已标明）的序列。

图9（1）显示了活化的CAT-LacZ核酶，反义，具有螺旋p8和3′“外显子”序列的核酶区;（2）（a）显示了在修饰过的螺旋p8的序列与“反义”区之间进行了碱基配对的无活性CAT-LacZ核酶原2;（b）与CAT mRNA碱基配对以取代螺旋p1-“反义”配对并重新形成螺旋p1后具有活性的核酶原。

图10显示了CAT-LacZ核酶原转录本的稳定性。用EcoRI切割含有CAT-LacZ核酶和核酶原序列的质粒，并利用T7或SP6 RNA聚合酶及〔³²p〕UTP进行转录。在7M尿素和25%的甲酰胺中通过5%聚丙烯酰胺凝胶电泳对放射性标记的转录本进行分级分离。核酶转录本受到深度水解（主要在“3′外显子”连接处）。而核酶原则明显地很少反应。

图11显示了CAT-LacZ核酶原的核糖核酸内切酶活性。用ScaI切割含有CAT-LacZ核酶和核酶原序列的质粒，并用T7或SP6 RNA聚合酶进行转录。在40mM Tris-HCl（PH7.5）、6mM MgCl₂、2n′M亚精胺、10mM NaCl、2mM GTP中将转录本与放射性标记的CAT RNA（由T7 RNA聚合酶自PuvⅡ切割的质粒转录）一起分别于37℃、45℃和50℃保温30分钟。然后在7M尿素和25%甲酰胺中通过5%聚丙烯酰胺凝胶电泳对产物进行分级分离，并放射自显影。由RNA介导的173核苷酸CAT RNA的切割产生分别为76和97个核苷酸的5′和3′片段。

图12显示了用于核酶原设计的“野生型”和修饰过的螺旋p8，它具有图示的可能的碱基配对。与相应核酶原的“反义”部分互补的碱基以黑体形式表示。在每一螺旋边列出了互补碱基的数目。螺旋由相应的核酶转录本的稳定性控制，如同通过体外转录过程中“3′外显子”水解程度所测定的一样。

图13显示了GAL4-DTA核酶原的稳定性。用XhoI使含有核酶和核酶原序列的质粒开环，并利用T7 RNA聚合酶进行转录。将转录本于50℃在40mM Tris-HCl（PH7.5）、6mM MgCl₂、2mM亚精胺、10mM NaCl、1mM GTP中保温60分钟，然后在7M尿素及25%甲酰胺中通过5%聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分级分离，并进行放射自显影。在上述条件下核酶转录本大量水解，而核酶原1水解较少，核酶原2则很稳定。

1.定义

在以下的叙述中，使用了重组DNA（rDNA）技术领域所广泛利用的各种术语。为了对本发明的说明书和权利要求书（包括这些术语的给定范围）有一个清楚和一致的理解，下面对其进行定义。

核酶：遗传上具有催化活性的RNA分子。

转拼：一种遗传操作形式，由此，第一多核苷酸的核酸序列被共同线性连接至或插入至第二核苷酸的序列中，并保留了这些多聚核苷酸之间的3′→5′磷酸二酯键。“定向”转拼或“底物特异性”转拼指需要特定RNA（即专用于拼接转换序列的RNA）作为转拼反应底物的转拼反应。如果设计出针对于相应套RNA上出现的靶序列的核酶或核酶原，则定向转拼可作用于一个以上的RNA。

靶RNA：作为本发明核酶或核酶原催化活性底物的RNA分子。

表达盒：为本发明核酶或核酶原的表达提供所需序列的遗传序列。

稳定：将序列“稳定地”插入基因组是指以导致该序列在该基因组的拷贝中遗传的方式进行插入。

可操纵的连接：指将一序列与另一序列相连以改变该序列功能的发挥的连接。例如，通过将核酶或核酶原编码序列可操纵地连接于启动子，就可将核酶或核酶原编码序列的表达置于该启动子的控制之下。如果启动子功能的诱导导致核酶或核酶原编码序列的转录且如果这两个序列之间键合的性质没有（1）导致移码突变的引入（2）影响指导核酶表达的表达调节序列的能力，则可将这两个核酸序列（如核酶或核酶原编码序列及在编码序列5′端的启动子区序列）称作被可操纵的连接。因此，如果启动子能够引起该核酸序列的合成，则启动子区是与核酸序列可操纵地连接的。

Ⅱ.本发明核酶的操纵

本发明的转拼核酶、核酶原和方法首次提供了能够定向转拼至任何RNA序列，尤其是成熟（不含内含子）的mRNA中的核酶。这里所述的与靶的互补性得到延长的转拼核酶与现有技术中所述的得自嗜热四膜虫的核糖核酸内切酶活性极不相同。本发明核酶互补性的增加提高了它对靶的亲和性和特异性，且该互补性并不是催化活性不可缺少的部分。另外，在无变性剂和含有高浓度Mg⁺⁺的情况下切割有效而精确地发生。

这里所述的设计转拼核酶的准则是保守的，它基于Ⅰ组自拼内含子的突出性质，其目的是为任何定向转拼核酶的设计提供一个总方案。因此，这里所提出的准则并不限于嗜热四膜虫前mRNA的Ⅰ组内含子，本领域技术人员可根据这些准则和已有知识设计出具有其它的Ⅰ组内含子的本发明核酶。

在下面的嗜热四膜虫染色体外rDNA序列中，天然嗜热四膜虫核酶（内含子序列）位于53-465碱基之间。

TGACGCAATT CAACCAAGCG CGGGTAAACG GCGGGAGTAA CTATGACTCT

CTAAATAGCA ATATTTACCT TTGGAGGGAA AAGTTATCAG GCATGCACCT

CCTAGCTAGT CTTTAAACCA ATAGATTGCA TCGGTTTAAA AGGCAAGACC

GTCAAATTGC GGGAAAGGGG TCAACAGCCG TTCAGTACCA AGTCTCAGGG

GAAACTTTGA CATGGCCTTG CAAAGGGTAT GGTAATAAGC TGACGGACAT

GGTCCTAACC ACGCAGCCAA GTCCTAAGTC AACAGATCTT CTGTTGATAT

GGATGCAGTT CACAGACTAA ATGTCGGTCG GGGAAGATGT ATTCTTCTCA

TAAGATATAG TCGGACCTCT CCTTAATGGG AGGTAGCGGA TGAATGGATG

CAACACTGGA GCCGCTGGGA ACTAATTTGT ATGCGAAAGT ATATTGATTA

GTTTTGGAGT ACTCGTAAGG TAGCCAAATG CCTCGTCATC TAATTAGTGA

CGCGCATGAA TGGATTA [SEQ ID NO.1]

（Kan，N.C.et al.，Nucl.Acids Res.10：2809-2822（1982））.

如这里所述，利用该内含子的催化核心对本发明的定向转拼核酶进行操纵。利用已知方法可分离出内含子及其催化核心。内含子的催化核心（即平头内含子）与全长内含子的不同仅在于它在ScaI位点被剪平，从而除去了内含子的最后5个核苷酸。该平头内含子RNA可按已知技术制备或通过商业途径以药盒的形式得到，例如购自US Biochemical，Clevelend，OH的产品＃72000（RNAzyme^TMTei 1.0kit）。该US Biochemical kit提供了核酶以及使用方法。可利用转录的Tet.1 cDNA作为如下所述的聚合酶链反应（PCR）突变的底物以产生合成的转拼酶。

本发明核酶的底物特异性（即核酶“对准”作为底物的特定RNA的能力）是通过将特异于靶（底物）RNA的互补序列融合于核酶的5′末端而产生的。

本发明核酶的定向转拼特异性（即利用靶RNA的序列转拼所需外源序列的特异性）是通过在核酶的3′端产生新的3′外显子而获得的。下面提供了设计的详情。

为了改变Ⅰ组内含子的结构和催化性质，用外显子序列取代该内含子的侧翼序列以使得仅保留了内含子的催化核心（核酶）。所产生的修饰过的核酶能够与底物RNA进行转拼反应。当将平末端形式的内含子（即催化“核心”，在ScaI位点处平切以除去内含子的最后5个核苷酸）与天然核酶5′拼接连接处相应的序列一起保温时，该位点按与拼接第一步相同的方式进行鸟苷依赖性切割。

对本发明的核酶进行操纵需要考虑到以下四个准则。

首先，拼接位点必须选择在靶RNA内。在最后的转拼复合物中，只有P1双螺旋的5′部分受靶RNA的作用。在紧接所需拼接位点的5′端仅需要唯一的一个保守残基（尿嘧啶），这是对靶RNA序列的唯一要求。对靶RNA没有天然结构要求。所作用的可能是成熟的mRNA，并在细胞质中完成转拼反应，而不是在细胞核中作用于前mRNA。从而避免了对细胞核中高浓度核酶的需要。

其次，在选定了特定的靶序列后，必须将补偿序列更换加至核酶的5′部分，以在靶和核酶RNA之间形成合适的螺旋P1。所非常需要的是，螺旋P1应在预期的5′拼接位点处含有U：G碱基对并应位于从螺旋的底部开始的第4、第5（优选）或第6位（Doudna，J.A.，et al.，“RNA Structure，Not Sequence Determines The 5′Splice-Site Specificity of a Group I Intron，”Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：7402-7406（1989），在此引用以作参考））。对于天然嗜热四膜虫内含子，P1比预期的5′拼接位点延长3个碱基对，并且在一优选实施方案中，它在本发明的转拼核酶中被维持。为使转拼有效，底物和核糖核酸内切内含子RNA必须进行碱基配对的形成螺旋P1，并带有所产生的变位U：G碱基对。靶RNA的切割发生在紧接U：G碱基对3′端的磷酸二酯键处。系统发育比较和突变分析表明，只要螺旋P1的碱基配对得以维持，紧接5′拼接位点处保守尿嘧啶残基的序列的性质对催化并不重要。

第三，必须选择3′拼接位点侧翼的外显子序列，并根据需要在核酶的5′部分进行调整以形成稳定的P10螺旋。尽管P10螺旋在某些情况下可以省却，但它的存在可增强拼接，且在本发明核酶的优选实施方案中保留了P10螺旋（Suh，E.R.et al.，“Base pair-ing Betueen The 3′ Exon And An Internal Guide Sequence Increases 3′ Splice Site Specificity in theTetrahymena Self-Splicing rRNA Intron，”Mol.Cell.Biol.10：2960-2965（1990））。螺旋P1和P10沿嗜热四膜虫内含子内含子IGs重叠且紧接5′和3′拼接位点的第二和第三个残基与IGS中的相同残基互补（图2）。虽然这一点可能有某些优越性，但许多天然I组内含子并不受这一约束。因此，对3′外显子序列的选择主要是出于对实验的考虑。这种考虑反映了在选择拼接位点上的广泛灵活性。例如，如果需要将两种序列在某一特定位点进行连接，则该位点处的序列不能因转拼而突变或发生其它变化。如果重叠序列不另外对所需拼接位点进行调节P1或P10均可被缩短。

选择3′拼接位点所需要的序列似乎主要位于内含子（核酶）本身的结构中，其中包括螺旋P9.0和邻接3′端的划定3′内含子边界的鸟苷残基。P9.0完全包含在内含子序列中并帮助确定邻接的3′拼接位点。为设计转拼，P9.0螺旋及内含子中其余的功能RNA成分未被改变。P9.0螺旋的结构特征是已知的（Michael，F.et al.，“The Guanosine Binding Site of the Tetrahymona Ribozyme”Na-ture 342：391-395（1989））。但是，3′外显子中的侧翼序列是形成螺旋P10和有效拼接所必需的，如同突变分析所显出的一样。

第四，将互补序列区置于转拼核酶的5′末端以增加其对靶RNA的亲和性和特异性。如这里所示，使用了约40个残基的任意长度。只要不影响所需效果也可使用其它长度。

例如，由如下嗜热四膜虫自拼内含子开始：

（在上图以及整个申请文本的其它核酶图中，“1”和“2”分别表示第1和第2拼接位点）。

（1）在选定的靶RNA内尿嘧啶残基的相邻处选择“5′”位点;

（2）将与选定的RNA互补的序列融合至自拼Ⅰ组内含子的5′部分。核酶和靶RNA之间的碱基配对导致螺旋P1的形成;

（3）将选定的“3′外显子”融合至核酶的3′部分，并维持保守的螺旋P10;及

（4）如果需要增加对靶RNA的亲和性，将延长序列互补性的部分融进核酶的5′部分以形成30-40个碱基对。

所产生的转拼核酶与其靶RNA的排列用下图显示。顶上行表示靶RNA序列。核酶序列在其下排列，在其下两行5′和3′以及核酶的P1和P10的核苷酸杂交的区域内可看到一连续序列。

按照本发明所设计的转拼核酶将转拼几乎任何RNA序列至任何RNA靶上。并不需要使该靶含有内含子序列或者使该核酶为靶序列中的内含子。例如，用于这一设计的方案可包括（1）鉴定所需的靶RNA，（2）对该所需的靶RNA或其一部分进行克隆和/或序列分析，（3）筛选转拼至靶RNA中去的所需编码序列，（4）利用这里所述的准则构建能够与该靶杂交的本发明核酶，（5）证实本发明的核酶将利用该靶作为所需特定转拼反应的底物，（6）将核酶插入至所需宿主细胞中。

对靶RNA的选择将反映出所需转拼反应的目的。如果反应的目的是灭活特定的RNA，则该RNA必须在破坏由该RNA编码的所有功能肽区的位置以及在不导致不需要的遗传序列连续表达的位置被转拼。如果存在一个以上的编码该RNA的基因的等位基因，则所设计的核酶最好能够在所有表达形式所共有的位点灭活靶RNA。或者，给细胞提供一个以上的核酶，而每一核酶被设计成灭活靶RNA的特定等位基因的形式。

当仅需要灭活靶RNA而不需要表达新的所需RNA序列时，并不需要由核酶代表的外源RNA产生能够被宿主细胞翻译的序列，且可利用含有翻译终止密码子的序列作为平末端内含子，例如在ScaI位点切平的内含子核酶。

如果转拼反应的目的是为宿主细胞提供遗传特性，则对靶RNA的选择将反映出所需遗传特性的表达方式。如果需要使遗传特性被宿主连续表达，那么靶RNA也应被连续表达。如果需要使遗传特性仅在所需的生长、内分泌或环境条件下进行选择性表达，那么靶RNA也应在同样条件下被选择性地表达。

如果核酶的底物并不另外存在于宿主中，则不需要使核酶本身的表达专门限于在所需的生长、内分泌或环境条件下，因为核酶本身并不被宿主转译。因此，在发生转拼行为之前由本发明核酶所代表的RNA编码的序列并未在宿主中被翻译，且该转拼行为可被宿主中核酶底物的表达所控制。

如果需要的话，可对核酶的表达进行操纵，使其发生应答于诱导调节的靶表达的相同因素，或对核酶的表达进行操纵以产生另一水平的调节，使得转拼行为的发生仅限于在某些条件下，在该条件下核酶和靶均在细胞中仅被不同因素所选择性地诱导，而这些因素的结合则是不希望有的行为。这种调节将使得宿主细胞在核酶自身不被共同表达的条件下表达核酶靶。

与靶RNA杂交的核酶区的序列是由靶RNA的序列决定的。靶RNA的序列是在克隆编码该RNA的序列之后或在对由该靶RNA编码的多肽进行序列分析并由此推断出编码这种肽的RNA序列之后而确定的。可采用本领域已知的克隆技术对编码靶RNA的序列进行克隆。

可被转拼到靶RNA中的预期序列（在此称为“转拼序列”）的选择可体现转拼的意图。如果期望一种不导致新的基因序列表达的转拼行为，则转拼序列不需要编码可转译的蛋白质序列。如果期望一种确实可导致某一新的基因序列，特别是新的肽或蛋白质序列表达的转拼行为，则转拼序列可进一步提供转译终止密码子，和RNA在宿主细胞内正确转译加工所必需的其它信息。如果期望转拼行为的结果是产生一种特定的蛋白质产物，则在所产生的融合体中保持该氨基酸解读密码将是必不可少的。

对本发明核酶的特异性的鉴定和确证可通过检测推断核酶仅在预期的靶序列存在下催化预期的转拼反应的能力来完成。如果存在的唯一RNA序列是该核酶不应对其敏感（或不太敏感）的非靶序列，则转拼反应不应发生。可借助于一种标记物进行这样的定性，以便可更容易地监测正确（或不正确）的核酶活性。在多数情况下，体外检测对抗其预期靶物的核酶，然后用它转化宿主细胞以研究其体内作用就足够了。

当需要除去宿主的RNA时，这样的删除应该是尽可能完全的。当需要给宿主细胞提供新的基因序列时，本发明的转拼反应不需要是完全的。本发明的优点在于，根据从这样的基因序列转译的肽的生物学活性，转拼活动的效率实际上可以是相当低的，只要发生的转拼可足以为预期的目的提供给宿主足够的mRNA，从而编码多肽即可。

本发明的核酶在宿主细胞中的转录发生在核酶基因引入到宿主细胞之后。如果不需要由宿主细胞稳定保持该核酶，这样的核酶就可被化学合成或酶促合成并用机械方法，例如显微注射、脂质体介导的转染、电击、或磷酸钙沉淀提供给宿主。而当需要稳定保持编码该核酶的基因时，可通过将该核酶的至少一个DNA拷贝稳定地插入宿主的染色体，或通过提供一种该核酶的DNA拷贝于一个由宿主细胞稳定地保持的质粒上而实现。

最好是将本发明的核酶插入宿主的染色体作为表达暗盒的一部分，该暗盒可提供转录调节成分，这些成分可控制核酶在宿主细胞中的转录。这样的成分可包括，但不一定局限于，启动子成分、增强子或UAS成分、和转录终止信号。不转译核酶时，多聚腺苷酸化不是必需的。然而，对于编码被转拼的成分的序列，可提供这样的多聚腺苷酸化信号。

其编码序列已插入宿主染色体的核酶的表达受与核酶编码序列可操纵地连接的启动子序列所控制。可指导核酶表达的启动子可以是任何在宿主细胞中起作用的启动子，原核启动子是在原核细胞中所需要的，真核启动子则是在真核细胞中所需要的。启动子由分立的单元所组成，这些单元可指导启动子在宿主细胞中的转录激活和/或阻遏。在核酶的启动子中可使这样的单元混合和相配以便为核酶在宿主中的适当表达提供条件。真核启动子可以是任何可在真核细胞中发挥作用的启动子，特别是任何具有RNA聚合酶Ⅰ、Ⅱ、或Ⅲ特异性的启动子。如果需在多种真核宿主细胞中表达核酶，则应选择可在多种真核宿主细胞中发挥作用的启动子，例如rRNA或tRNA启动子，或被广泛表达的mRNA的启动子，例如肌动蛋白基因，或糖酵解基因的启动子。如果只需在某一种细胞或组织类型中表达该核酶，则应选择只在该细胞或组织类型中发挥作用的细胞特异性（或组织特异性）启动子成分。

转拼反应无论是在体外还是在体内进行在化学上都是相同的。但在体内，由于辅助因子通常已存在于宿主细胞中，所以靶物和核糖酶的存在将足以导致转拼。

上述实施方案也适于核酶原的构建。如上所述，转拼核酶由三种融合序列成分所组成，即与靶RNA互补的5′“反义”区，基于自拼Ⅰ组内含子的催化区，和3′“外显子”序列。5′区可与所选靶RNA进行碱基配对，使之与Ⅰ组内含子的催化序列接近。Ⅰ组内含子的结构可提供一种适于催化靶RNA与3′“外显子”序列精确拼接的化学环境。然而，在无合适的靶RNA存在下，该核酶序列仍能催化在3′“外显子”连接处的切割（相似的水解可见于Ⅰ组自拼内含子（Zaug et al.，Science 231：470-475（1986）），并且可能能通过核酶与异源RNA序列（可包括它们自身）的瞬时碱基配对催化不正常的拼接活动。这样的副反应和不正常的拼接活动是多余的，或许是有害的。例如，如果要将转拼用于毒素在体内的条件释放，则不正常的转拼可能会导致有毒活性的不期望表达。在3′“外显子”连接处的自发性切割会降低转拼的效率。

为了有助于避免这些问题，已构建了核酶原形式的转拼RNA，例如其中螺旋P8被破坏。构建的核酶原含有额外的自我互补序列，这些序列可导致核酶催化中心误折。在预期靶RNA不存在时，核酶原是无活性的;只有在核酶和靶RNA进行碱基配对一伴随着对核酶内二级结构干扰的取代之后才能形成活性形式。核酶原是指在靶RNA不存在下无催化活性的种类，从而可消除体外和体内多余的自我切割、自拼和不正常的转拼反应（图7）。

这里所述的核酶原是构象受到破坏的且因此成为无转拼活性的形式。该核酶原具有很少的自我切割活性。它们只能通过与靶RNA特异地相互作用重新活化，因而是不大可能催化非预期靶RNA的转拼的底物活化核酶。期望将转拼核酶用于新基因活性在体内的释放，在不希望的副反应或不正常拼接的程度上的任何减少都是可取的，而且可能是必需的。

尽管对于转拼核酶原这里已举例说明了螺旋P8的破坏，但也可能已应用了催化活性所需的其它螺旋。

以这样的方式，即只与预期的底物RNA进行碱基配对可形成活性核酶，破坏催化上重要结构的构象的同样方法可应用于其它核酶的设计。例如，“锤头”型核糖核酸内切酶的环序列（Haseloff et al.，Nature 334：585-591（1988））可被扩展并使之与核酶的“反义”臂之一互补一与螺旋P8的以上修饰相似。只有在与所选的靶RNA进行碱基配对，对二级结构的破坏被取代，和催化所需的干环结构重新形成之后才会显示出核糖核酸内切酶活性。这样将有效地增强核酶对其靶物的特异性。

此外，核酶原的激活不需依赖于与底物本身进行碱基配对。附加的碱基配对或RNA与蛋白质间的相互作用可能是活性核酶复合物的形成所需的。这些额外组分的可得性将决定核酶的活性，并可被用来改变核酶的选择性。

本发明的转拼核酶，核酶原和方法可用于产生适用于靶细胞的基因修饰，和/或细胞死亡的基因活性。例如，本发明的转拼反应可用于将具有毒性的蛋白质引入所需细胞，细胞的感受性将由靶RNA和支配核酶的表达的调控物的选择来决定。例如，可操纵一种能使编码某一毒性蛋白的RNA序列转位的核酶，以便该核酶的表达将取决于可操纵连接的启动子的特性。在一个非常优选的实施方案中，白喉毒素肽A是由转位到宿主内预期靶物中的那部分核酶所编码的。核酶和白喉毒素肽A链的有条件表达可导致宿主细胞的死亡。其它有用的肽毒素包括蓖麻毒素、外毒素A，和疱疹胸苷激酶（Evans，G.A.，Genes＆Dev.3：259-263（1989））。此外，各种水解酶具有破坏细胞代谢的潜能。例如，真菌的核糖核酸酶可用于引起植物的雄性不育（Mariani，C.et al.，Nature 347：737-741（1990）。由于靶RNA的有限表达可破坏特定的组织。再者，如果用病毒RNA作为靶物，则可操纵新形式的病毒抗性或治疗。

本发明的核酶或核酶原可被引入任何原核或真核宿主细胞，特别是植物或哺乳动物宿主细胞，尤其是人的细胞，既可是细胞培养物也可是活体细胞，所用的技术是本领域中已知的适合于上述宿主的方法。也可操纵本发明的核酶以破坏病毒。在一个优选的实施方案中，在病毒侵袭之前以一种遗传上稳定的方式将本发明的核酶或核酶原提供给宿主细胞。合适病毒的感染，或潜伏性病毒在这种宿主细胞中的表达（导致宿主细胞中出现核酶或核酶原的靶RNA），将通过可引起病毒感染细胞死亡的转拼激发该核酶的催化活性和病毒RNA靶的破坏和/或毒素的产生。在另一个实施方案中，可操纵核酶或核酶原并包装到病毒自身中。这样的实施方案特别适用于为研究目的所用病毒的设计，其中设计出的核酶或核酶原可破坏特异性病毒RNA的功能，因而可在这种RNA不存在时研究病毒的功能。携带核酶的病毒也可用作转染具有所需核酶或核酶原活性的宿主细胞的载体。

可利用本发明的核酶或核酶原在农学重要性物种中操纵雄性或雌性不育。例如，可通过将TA29或TA13 mRNA（烟草花药特异性基因;Seurinck，J.et al.，Nucl.Acids Res.18：3403（1990））作为对象、用可将DTA3′外显子转拼到那些靶物中的本发明的核酶或核酶原操纵烟草的雄性不育。

可通过用本发明的核酶或核酶原对组织进行选择性破坏或修饰控制农作物的形式。例如，可通过将种子贮存蛋白mRNA作为对象，用可将DTA3′外显子转拼到该靶物中的本发明的核酶或核酶原获得无籽果实。

可通过病毒特异性核酶或核酶原的表达杀死感染细胞而保护转基因植物抵抗感染。这将成为一种人工形式的“超敏反应”。例如，可用本发明的核酶或核酶原（可将DTA3′外显子转拼到靶物中）以黄瓜花叶病毒外壳蛋白mRNA作为对象。

经引入转拼核酶或核酶原可使微生物群体变得耐受特异性病原体。例如，通过将细菌毒素基因或由本发明的核酶或核酶原所提供的3′外显子编码的水解酶作用于噬菌体RNA可使干酪产生细菌耐受噬菌体感染。例如在噬菌体感染后通过引起过早溶菌现象而干扰噬菌体复制。

可构建通过转拼释放有毒活性的病毒病原体。以这种方式，可以特定的细胞类型作为切除的对象，如进行癌症或病毒治疗。例如，可通过携带DTA3′外显子的本发明的核酶或核酶原以HIV mRNA作为对象进行病毒或脂质体释放。

下列实施例只是为说明目的，不能看作是对本发明范围的限制。

实施例1

CAT-LacZ转拼核酶的构建和定性

Ⅰ.本发明核酶的PCR扩增和克隆

按照上述指导路线，设计一种转拼融合核酶，该酶可将大肠杆菌β-半乳糖苷酶（LacZ）mRNA的部分氨基末端编码序列拼接到氯霉素乙酰基转移酶（CAT）mRNA中的某一位点上（图3）。将侧接嗜热四膜虫（T. thermophila）核酶核心和3′外显子的新序列的各区域合成为寡核苷酸。然后通过连续聚合酶链反应，用合成连接寡核苷酸作为引物与核酶和β-半乳糖苷酶DNA模板一起装配完整的核酶序列（尽管存在其它可利用的方法，但该方法是最便利的）。

为了构建一种能够将β-半乳糖苷酶（LacZ）α-肽编码序列拼接到氯霉素乙酰基转移酶（CAT）的5′编码序列中的某一位点上的核酶，合成了三种寡核苷酸。

寡核苷酸1

5’－GGCCA AGCTT CTTTA CGATG CCATT GGGAT ATATC

AACGG TGGTA TAAAC CCGTG GTTTT TAAAA GTTAT CAGGG

ATGCA CC－3’〔SEQ ID No.2〕

寡核苷酸2

5’－GATTA GTTTT GGAGT ACTGG TACGG ATTCA CGGCC

GTCGT TTTAC AA－3’〔SEQ ID No.3〕

寡核苷酸3

5’－GGCCG AATTC TTACA ATTTC CATTC AGGCT GCGCA

ACTGT TGG－3’〔SEQ ID No.4〕

将寡核苷酸2和3（各200pmoles）与0.1μg Pvu Ⅱ切割的pGEM4 DNA（含有LacZ α-肽序列）合并，以100μl的体积进行PCR扩增：

50mM KCl，

10mM Tris-HCl PH8.3

1.5mM MgCl₂，

0.4mM dNTPs

0.1%明胶，和

5U TaqI DNA聚合酶，

并于94℃下保温1分钟，50℃下保温2分钟，72℃下保温2分钟，这一保温循环共进行30次。

质粒pGEM4可购自美国Promega公司（Madison WI，USA）。

用低胶凝温度琼脂糖电泳法纯化210碱基对的扩增产物，并用作第二轮PCR扩增的引物。

在第二轮PCR扩增之后，将2.0μg 210碱基对的扩增产物、200pmoles寡核苷酸1和0.1μg含有嗜热四膜虫IVS的450碱基对的片段混合并采用上述条件进行PCR扩增。用限制性核酸内切酶EcoRI和Hind Ⅲ消化所得到的660碱基对的产物，并克隆到质粒载体pGEM4中。CAT-LacZ α-肽核酶DNA序列的完整序列用SEQ ID No.5表示，并示于图3B。

用本领域中已知的技术（Maniatis，Molecular Cloning，ALaboratory Guide，2nd edition，1989，Cold Spring Harbor Laboratory，Publishers），将含有克隆载体序列的克隆载体转化到细菌宿主XL1/Blue（Strategene，La Jolla，California）中并在那里增殖。然而，任何能够稳定维持该载体的细菌宿主均可使用，例如JM109。

为了进一步分析，可用本领域中公知的技术（Maniatis，Molecular Cloning，A Laboratory Guide，2nd，edition，1989，Cold Spring Harbor Laboratory，Publishers）从宿主细胞中提取质粒。

Ⅱ.克隆核酶和靶RNA的体外转录

采用标准方法，从细菌宿主中纯化克隆序列并用不切割核酶序列的限制性核酸内切酶（例如，EcoRI）将质粒线性化，用T₇RNA聚合酶进行转录，体积为100μl，含有：

5μg线性质粒 DNA，

40mM Tris-HCl PH7.5，

6mM MgCl₂，

2mM 亚精胺，

10mM NaCl，

10mM DTT，

1mM NTPs（含有20μCi〔α-³²P〕UTP，如果需要被标记的RNA转录本），

100U RNA酶，和

50U T₇RNA聚合酶，

反应物在37℃下保温2小时。

使用前用5%聚丙烯酰胺凝胶电泳法（TBE，7M尿素凝胶）纯化RNA转录本。含有活性嗜热四膜虫IVA序列的RNA在转录期间经历在3′内含子-外显子连接处某种自发性切割。经电泳纯化移出这些片段用于在后面的转拼测定过程中清楚地进行分析。

Ⅲ.体外转拼反应条件

将靶物和/或转拼核酶在下列条件下保温：0.1-0.5μg RNA组分（其用量取决于实验的类型，通常核酶的量比靶物量多5倍），

30mM Tris-HCl PH7.5，

100mM NaCl，

2mM GTP，

5mM MgCl₂，

体积为5μl，42℃下，60分钟。

用95μl 0.1mM Na₂EDTA，200mM NaCl稀释反应物，并用乙醇沉淀，然后在5%含有TBE缓冲液，7M尿素和25%甲酰胺的聚丙烯酰胺凝胶上分析RNA，并放射自显影。

Ⅳ.核酸内切酶解活性的测定

核酶和靶物进行碱基配对之后，转拼的第一步是鸟苷介导的在预定5′拼接位点靶RNA的切割。退火和转拼可在缓冲液如30mM Tris-HCl（PH7.5），100mM NaCl，5mM MgCl₂，2mM GTP中，在42℃下进行。由于3′拼接位点是这一反应所必需的，所以平末端转拼核酶应表现得如同高度特异性核糖核酸内切酶一样，为了测试这一活性，将上述CAT-LacZ α-肽转拼核酶的缩短了的体外转录本（SEQ ID No.5和图3）与CAT mRNA序列一起保温，CAT-LacZ核酶暗盒在HindⅢ-EcoRI片段上。ScaI切割位点可标明3′拼接位点上游5位碱基。该核酶特异地在所期望的单一位点切割靶RNA以产生所期望大小的片段。

Ⅴ.转拼反应

为了确证CAT-LacZ α-肽核酶催化3′外显子序列在5′拼接位点的连接的能力，将不同的形式与放射标记的CAT RNA一起保温。核酶转录本由DNA模板合成，它在由核酶核心末端至外显子序列之间的几个位置被3′平切。与标记过的CAT一起保温导致预期拼接产物的形成，这些产物的长度依3′外显子序列的长度而异。

此外，一定比例的CAT-LacZ α-肽核酶分子在体外转录期间经历了在3′拼接位点的自发性切割，与完整嗜热四膜虫内含子相似。这些切割形式（在邻近3′拼接位点的鸟苷残基处终止）也与CAT RNA一起保温。在这种情况下，核酶自身可与CAT RNA的3′部分连接，以产生大小约为550个核苷酸的产物。这一反应与完整内含子的自我成环相似，同样的连接反应见于其它转拼反应。

Ⅵ.转拼的精度

将得自CAT-LacZ α-肽转拼反应的产物逆转录，并通过聚合酶链反应，用两种与预定拼接位点任一侧上的序列互补的寡核苷酸通过聚合酶链反应进行扩增。将扩增的序列克隆并进行序列分析。各个重组体从拼接产物的预期序列来看都无变异。如对完整内含子的研究中所见，拼接似乎是相当精确的。

因此，以上研究表明按照本发明的指导路线设计的转拼核酶能够在体外精确、有效的转拼。

实施例2

提供植物病毒抗性的转拼核酶的设计

黄瓜花叶病毒（CMV）是一种有很多已知毒株的广泛流行的病毒。在RNA3和亚基因组mRNA4所编码的病毒外壳蛋白顺反子的起始区域中显示了病毒株的九条序列（SEQ ID Nos.7-25;图4（A）和图5）。已选出两个位点，它们保存在序列中，位于外壳蛋白的AUG起始密码子的下游。用于构建能够将异亮氨酸突变型DTA转拼到CMV外壳蛋白mRNA中的核酶的寡核苷酸示于图4B且在下文中进行了讨论。

以图4C和4D中所示的转拼核酶作用于图4B中所示的CMV病毒序列，不但会导致CMV RNA分子的切割，而且会导致受感染的细胞中白喉毒素A-链的表达。可用本领域中已知的技术将图4所示的转拼暗盒转化到任何CMV感性植物中，并使转基因的子代受到CMV感染。应这样设计核酶，即病毒感染是引发通过RNA转拼产生毒素所必需的，因为核酶本身不被转译。由毒素的表达而造成的被感染细胞的局部死亡可限制病毒在显示人为超敏反应的植物体内的复制和蔓延。

实施例3

突变形式的DTA的构建

成功设计一种可转拼编码毒性产物的序列的核酶的主要标准在于不但有效和精确催化转拼，而且毒性基因的表达不在无转拼的情况下发生。

这些核酶分子可经历在3′拼接位点的自发性切割。假使DTA的毒性极强，任何释放的3′外显子序列都不产生毒性转译产物这一点是重要的。3′外显子在13位含有一个码组内蛋氨酸，设想它可能会产生一种平头但有毒性的多肽。为了消除这种可能性，在两个独立的核酶构建中将野生型序列（Rz-DTAmet）〔SEQ ID No.6（DNA）和SEQ ID No.38（蛋白质）〕该位置上的蛋氨酸改为异亮氨酸（Rz-DTAile）〔SEQ ID No.39〕或亮氨酸（Rz-DTAleu）〔SEQ ID No.40〕（图6）。用DTAile或DTAleu转化宿主细胞的结果是在宿主细胞中无明显平头、毒性的肽产生。

实施例4

用于转拼的核酶原的构建

能够特异性切割靶RNA，并将所选RNA片段拼接到5′部分的催化RNA（核酶）的设计和构建如上所述。下面介绍构建构象被破坏，因而在无靶RNA存在时无活性的转拼核酶的新的手段。

设计

作为一种核酶原的设计试验，修饰了前面描述的CAT-LacZ转拼核酶。系统发育比较和突变分析（参见Cech，Ann Rev.Biochem.59：543-568（1990））已表明Ⅰ组自拼内含子的核心区被高度保留，它对活性是重要的（图8）。为了构建转拼核酶原，紧接在该区旁的螺旋P8被破坏。在最初的实验中，将新序列的13或18个核苷酸引入螺旋P8的5′股和环，分别产生核酶原1和2。额外的核苷酸与核酶的5′“反义”部分互补，同时调整侧翼序列以保留（1）在P8碱基处的真实序列，和（2）在P8内可能的碱基配对的程度（图2）。插入到螺旋P8中的序列与核酶原的5′“反义”区的自我互补程度可期望在新生转录本中优先于螺旋P8形成这种新螺旋，也可期望这一更替螺旋的形成破坏核酶的催化核心内侧面二级或许三级相互作用。因此，核酶原的误折会使它失去催化活性（图9）。然而，核酶原与预期靶RNA的碱基配对可替代P8“反义”碱基配对，隔绝该“反义”序列并允许P8螺旋和活性催化区的重新形成。P8“反义”螺旋的置换可产生更大数目的碱基对和允许催化区的适当折叠，因此应是很受欢迎的。

CAT-LacZ核酶原

用如上所讨论的PCR诱变构建相应于两个CAT-LacZ核酶原的克隆序列，并通过体外转录产生RNA。据观察CAT-LacZ转拼核酶在转录期间经历3′拼接处的切割，这是由内含子序列催化的水解造成的。相似的水解见于未修饰的嗜热四膜虫内含子的体外转录。相比之下，不同的CAT-LacZ核酶原的转录本较稳定，在同样条件下几乎无明显的切割（图10）。这表明核酶原是无活性的，若催化序列误析，便可期望核酶原失活。测试了平末端形式的核酶原针对CAT RNA的特异核糖核酸内切酶活性。由在ScaI位点被平切的模板转录CAT-LacZ核酶原，以删除3′拼接序列和LacZ序列。删除3′拼接位点后，核酶和核酶原都是稳定的。平末端的核酶原与CAT RNA一起保温导致了靶RNA的特异性切割，从而产生预期大小的片段（图11）。在37°，45°和50°下可看出特异的切割活性。

也构建了GAL4-DTA转拼核酶的核酶原形式（图12）。将含20个核苷酸的区域（与“反义”区互补）插入螺旋P8的5′股和环。这两种核酶原在修饰的螺旋P8中可能的碱基配对程度不同，GAL4-DTA核酶原1具有较长的干，在环中有较少（3个）可及的碱基。GAL4-DTA核酶原2的螺旋P8更类似于CAT-LacZ核酶原2的螺旋P8，具有较大的环（14个碱基），环中含有与“反义”区互补的序列。GAL4-DTA核酶原的转录本比未修饰的核酶的转录本稳定。特别是，核酶原2在可导致核酶形式的基本完全的自我切割的条件下保温（50℃下30分钟，10mM MgCl₂，2mM GTP，见图13）之后大体上是完整的。

上面已对本发明作了充分的描述，本领域的技术人员在不影响本发明或其任何实施方案的精神和范围的情况下，可在很宽和等同的条件，参数等范围内完成本发明。

Claims

1、第一多核苷酸分子，该多核苷酸分子包括一种编码转拼核酶的序列，该转拼核酶能够在体内或体外将第二多核苷酸序列转拼至靶RNA序列中，该核酶包括与该靶mRNA序列互补的序列。

2、一种多核苷酸分子，该分子包括编码转拼核酶的序列，该核酶的序列包括一融合RNA，该融合RNA产生（1）第一RNA序列，该第一RNA序列足以作用于该核酶以与靶RNA杂交，和（2）第二RNA序列，该第二RNA序列在该核酶转拼活性的作用下能够被共线性转移至靶RNA中。

3、根据权利要求2所述的多核苷酸分子，其中所说的第二RNA序列包括编码对宿主细胞有毒的肽的序列。

4、根据权利要求3所述的多核苷酸分子，其中所说的肽是DTA肽。

5、根据权利要求4所述的多核苷酸分子，其中所说的DTA肽是突变肽序列。

6、根据权利要求5所述的多核苷酸分子，其中所说的突变肽序列包括由SEQ ID No.39编码的氨基酸。

7、根据权利要求5所述的多核苷酸分子，其中所说的突变肽序列包括由SEQ ID No.40编码的氨基酸。

8、根据权利要求1-7中任一项所述的多核苷酸分子，其中所说的分子是RN。

9、根据权利要求1-7中任一项所述的多核苷酸分子，其中所说的分子是DNA。

10、一种包含核酶表达盒的多核苷酸分子，该盒能稳定地插入至宿主基因组中，且该盒包括能够在宿主中发挥功能且与权利要求1-7任一项的多核苷酸的编码序列可操纵地连接的启动子序列。

11、一种包含权利要求10多核苷酸分子的宿主细胞。

12、根据权利要求11所述的宿主细胞，其中所说的宿主细胞是病毒细胞。

13、根据权利要求11所述的宿主细胞，其中所说的宿主细胞是原核植物细胞。

14、根据权利要求11所述的宿主细胞，其中所说的宿主细胞是真核生物细胞。

15、根据权利要求14所述的宿主细胞，其中所说的真核生物细胞是植物细胞。

16、根据权利要求14所述的宿主细胞，其中所说的真核生物细胞是动物细胞。

17、根据权利要求16所述的宿主细胞，其中所说的动物是哺乳动物。

18、根据权利要求17所述的宿主细胞，其中所说的动物是人。

19、一种用于体外转拼的方法，该方法包括以下步骤：

（1）向转拼反应混合物中提供权利要求1-7中任一项的多核苷酸分子，该多核苷酸分子包括能够与第二多核苷酸杂交的序列;

（2）向该反应混合物中提供所说的第二多核苷酸;

（3）在所说的条件下催化所说的第二多核苷酸的转拼。

20、一种用于体内转拼的方法，该方法包括以下步骤：

（1）为宿主细胞提供权利要求8的多核苷酸;

（2）在所说的宿主细胞中表达由所说分子编码的所说的核酶;

（3）在所说的宿主细胞中表达所说核酶的底物;

（4）在所说的宿主细胞中用该底物催化该核酶的转拼。

21、一种灭活靶RNA活性的方法，该方法包括：

（1）向转拼反应混合物中提供权利要求1-7中任一项的多核苷酸，所说的核酶对靶RNA具有催化活性，该催化活性导致该靶RNA功能的失活;

（2）向该混合物中提供所说的靶RNA;

（3）提供条件，使得该多核苷酸表达该催化活性。

22、一种在体内为宿主细胞提供所需遗传序列的方法，该方法包括：

（1）为该宿主细胞提供权利要求8的多核苷酸，该多核苷酸序列在该宿主细胞中对靶RNA具有催化活性，该核酶能够转拼该所需的遗传序列;

（2）为该宿主细胞提供所说的靶RNA;

（3）提供条件，使得该核酶转拼所需的遗传序列至该靶RNA的序列中。

23、一种对植物雄性或雌性不育进行操纵的方法，该方法包括为该种植物的胚细胞提供权利要求8的多核苷酸，该核酶作用于一RNA，该RNA所表达的蛋白质是该植物受精所必需的。

24、一种给植物提供所需遗传特性的方法，该方法包括给该植物的胚细胞提供权利要求8的多核苷酸，该核酶所编码的转拼序列能够为该植物提供所需的遗传特性。

25、一种对植物进行抗植物病原菌的免疫的方法，该方法包括用权利要求8的多核苷酸转化植物细胞，其中所说的多核苷酸所编码的转拼序列能够给该植物提供抗该病原菌的免疫力。

26、根据权利要求25的方法，其中所说的病原体是黄瓜花叶病毒。

27、构建核酶原的方法，该方法包括破坏螺旋P8。

28、根据权利要求27的方法，其中所说的破坏是通过P8反义碱基配对引起的。

29、根据权利要求1-7中任一项所说的多核苷酸分子，其中所说的核酶是核酶原。

30、根据权利要求1-8中任一项的多核苷酸分子，其中所说的核酶是核酶原。

31、根据权利要求1-9中任一项的多核苷酸分子，其中所说的核酶是核酶原。

32、根据权利要求1-10中任一项的多核苷酸分子，其中所说的核酶是核酶原。

33、根据权利要求11的多核苷酸分子，其中所说的核酶是核酶原。

34、根据权利要求19的宿主细胞，其中所说的核酶是核酶原。

35、根据权利要求20的方法，其中所说的核酶是核酶原。

36、根据权利要求21的方法，其中所说的核酶是核酶原。

37、根据权利要求22的方法，其中所说的核酶是核酶原。

38、根据权利要求23的方法，其中所说的核酶是核酶原。

39、根据权利要求24的方法，其中所说的核酶是核酶原。

40、根据权利要求25的方法，其中所说的核酶是核酶原。