CN106566880A - 遗传性耳聋基因突变检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明用于定性检测基因组DNA中与耳聋相关的基因20个位点的突变检测试剂盒。该试剂盒包括DNA稀释液、杂交反应液、耳聋探针混合液A，耳聋探针混合液B、连接反应液A、连接酶，连接反应液B、聚合酶、PCR扩增引物混合液，阳性对照，阴性对照。本发明提供的试剂盒，主要采用多重连接探针扩增技术（MLPA）与毛细管电泳结合的方法进行基因突变检测，不仅可以同时对多个突变位点进行检测，两管同时准确判断20个位点的野生型、纯合突变型和杂合突变型，还同时设计引物探针，有很高的准确度与特异度。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，主要体现的是MLPA方法与测序结合技术的应用，尤其涉及一种非综合性遗传性耳聋基因多态性位点检测。
背景技术
据发达国家统计，每1000个新生儿中，就有1名听力障碍患者。在我国，听力言语残疾者达2780万以上，占残疾人总数的24.16%，每年新生3万聋儿。研究推测60%的耳聋发病与遗传有关，且有120多个耳聋基因已经被鉴定。也因此，越来越多的国家都在开展新生儿耳聋基因筛查工作。随着2011年国务院印发的《中国妇女发展纲要(2011-2020年)》和《中国儿童发展纲要(2011-2020年)》的颁布，耳聋筛查更是进一步成为各级卫生部门和医疗机构的重要工作，从而力争实现2020年前新生儿听力筛查率达到60%以上。在这一计划的实施过程中，各种耳聋基因检测方案不断出现，并通过医院合作，政府买单的形式在不同地区先后落地。据统计，目前每年的耳聋基因检测量约100余万，在未来5年实现年检测量1000万新生儿（60%筛查率）意味着每年60%的复合增长率。技术的演进、临床操作的对比，让更多的医院希望寻求到升级的检测产品，以实现最大的检测销量、最低的检测成本、最高的检出率，以及最全面的后续分析和最先进的高通量测序技术支持。
根据相关文献及国家耳聋项目研究团队学术会议汇报，大约21%的耳聋患者带有GJB2 基因突变，14.5%的耳聋患者带有SLC26A4基因突变，另外分别有3.8%和0.6%的耳聋患者带有线粒体DNAA1555G和C1494T突变。这一结果揭示了中国耳聋患者常见耳聋突变的发生频率，确定了GJB2、SLC26A4、线粒体基因12SrRNA（A1555G和C1494T突变）是导致中国大部分遗传性耳聋发生的三个最为常见的基因，约70-80%的遗传性耳聋个体由这三个基因的突变导致。在大量的临床检测数据支持下，我们统计出中国人群中最高频的耳聋基因突变位点。在此基础上，列为检测靶点的20个耳聋基因突变位点不仅可以覆盖绝大多数的耳聋基因突变位点，同时也是目前学术界认可的与遗传性耳聋相关的致病突变位点，此外还加入了GJB3基因上的2个突变位点。GJB3基因与后天高频感音神经性耳聋有关，是我国本土克隆的第一个遗传疾病基因，突变比率在耳聋人群中约为1.2%。
近年来，国内相继报道了先天性耳聋基因或者易感性耳聋基因的基因诊断试剂盒及其检测方法，以满足对耳聋相关基因突变进行广泛的筛查的需要，目前检测耳聋基因DNA的方法主要基于芯片技术、测序技术和荧光检测技术，存在操作复杂，耗时长，成本高及对操作人员要求高等不足问题。无锡中德美联生物技术有限公司于2013年申请了一种遗传性耳聋基因荧光检测试剂盒，该发明是一种可以同时检测四个耳聋相关基因17个热点突变的检测试剂盒。其采用的主要方法是荧光标记和ARMS-PCR，采用多重PCR体系进行检测，该方法具有快速、简便的特征，但是该试剂针对临近突变位点判断不准确，同时由于采用四色荧光标记，在仪器需求上增加了难度，这些特点限制了其应用的广泛性。
目前临床上对耳聋基因的检测主要集中在基因DNA分子水平，具有很高的特异识别能力。本发明结合MLPA方法和测序技术的诸多检测优势，在GJB2、GJB3、SLC26A4和线粒体基因上同时挑选一些在中国地区热点突变的多态性位点位点，构成优化操作系统，具有检测位点数量多、高检出、低成本、易操作等优点。
发明内容
本发明的目的是：利用MLPA方法提供一种高通量、准确度高、特异性强遗传性耳聋基因检测试剂盒。
本发明所采取的技术方案是：
MLPA技术具有极强的应用潜力和广阔的发展前景。连接酶检测反应是一种高特异性基因检测技术，其主要基于核酸特异杂交原理，只有在SNP位点上下游两条寡核苷酸探针与待测DNA序列完全互补，且两条探针之间没有碱基空隙时，才能在TaqDNA连接酶的作用下发生连接反应，之后通过荧光检测设备扫描探针上所带的荧光信号确定片段长度，实现对SNP位点的检测。基于MLPA技术原理，通过设计不同长度的探针结合荧光检测分析可以实现1~20个位点的SNP分型要求。每个MLPA探针包括两个寡核苷酸片段，每个探针都包括一段引物序列和一段特异性序列。在MLPA反应中，两个寡核苷酸片段都与靶序列进行杂交，之后使用连接酶连接两部分探针。连接反应高度特异，只有当两个探针与靶序列完全杂交，即靶序列与探针特异性序列完全互补，连接酶才能将两段探针连接成一条完整的核酸单链；反之，如果靶序列与探针序列不完全互补，即使只有一个碱基的差别，就会导致杂交不完全，使连接反应无法进行。连接反应完成后，用一对通用引物扩增连接好的探针，每个探针的扩增产物的长度都是唯一的，范围在130～480bp。最后，通过毛细管电泳分离扩增产物，软件分析，得出结论。只有当连接反应完成，才能进行随后的PCR扩增并收集到相应探针的扩增峰，如果检测的靶序列发生点突变或缺失、扩增突变，那么相应探针的扩增峰便会缺失、降低或增加，因此，根据扩增峰的改变就可判断靶序列是否有拷贝数的异常或点突变存在。
一种遗传性耳聋基因检测试剂盒及应用，其特征在于：包括有如下20个多态性位点的探针:35delG，G1975C，GIVS15+5A，T2027A，299-300delAT，167delT，176-191del16，235delC，C538T，AIVS7-2G，C1229T，G1226A，A1174T，A2168G，C1494T，A1555G，C2162T，G598A，
C281T，G547A。
更进一步地，试剂盒可以包括有如下表1中20个多态性位点的探针：
表1各位点探针序列
以上探针，每个位点都包括有四条等位基因特异性非标记探针，分别用于杂交产生野生型和突变型目的基因碱基序列，另外还有一条通用引物，用于扩增目标基因碱基序列，获得大量目标基因序列。表1中，“W”编号指等位基因杂交探针野生型，“M”编号指等位基因杂交探针突变型，“F”编号指左侧杂交探针，“R”编号指右侧杂交探针。
所述的20个多态性位点的探针分为二组。
第一组：299_300delAT，C538T，C2162T，AIVS7-2G，G589A，GIVS15+5A，167delT，G1226A，G1975C，235delC，A1555G第二组：T2027A，C1229T，176_191de116，G547A，A1174T，C281T，35delG，A2168G，C1494T。这样做的优点在于避免非特异性扩增的可能性。
本发明所涉及的DNA稀释液包括10mMpH8.2Tris-HCl，0.1mMEDTA。
杂交反应液包括1.5M KCl，300mM pH8.5Tris–HCl，1mM EDTA。
连接反应液A包括0.2mM辅酶NAD。
连接反应液B包括2.6mM MgCl2，5mM pH8.5Tris–HCl，0.013%非离子去污剂。
耳聋探针混合液A包含11个位点的探针混合液。
耳聋探针混合液B包含9个位点的探针混合液。
PCR扩增引物混合液2.5nmoldNTPs，10pmolPCR通用扩增引物。
阳性对照耳聋20个突变型位点的质粒混合物。
阴性对照耳聋20个野生型位点的质粒混合物。
连接酶是指购于NEB的Taq DNA连接酶，这是一种热稳定性酶且具有高特异性，因为只有在上下游两条寡核苷酸探针与待测DNA序列完全互补，且两条探针之间没有碱基空隙时，才能在Taq DNA连接酶的作用下发生连接反应。
聚合酶是指购于NEB的Therminator™DNA Polymerase，主要用于PCR扩增。
本发明还提供了上述试剂盒的使用方法，具体的技术流程是：
样本的采集与保存。
样本的提取。
样本的稀释。
DNA变性。
DNA与探针杂交反应。
探针连接反应。
PCR扩增反应。
上机测序。
结果分析。
利用MLPA技术，针对同一个突变位点分别设计未突变和突变的探针，根据设计的产物长度不同区分不同探针。采用同一样本进行2管PCR同时扩增，能同时检测20个位点，并确定其突变型和野生型。
本发明的有益效果：本发明提供了一种检测位点数量多、准确度高，特异性强且简便有效的方法。利用连接酶的核酸特异性杂交原理，采用同一样本进行2管PCR扩增的方法，能同时检测耳聋相关基因的20个多态性位点，并确定其突变型与野生型。检测所使用范围广，适用于成人或儿童患者的病因诊断、遗传咨询以及产前诊断，各种不明原因的耳聋，包括先天性耳聋和后天性耳聋人群，听力正常，但有耳聋家族遗传史的人群，大众人群即隐性致病遗传突变携带情况筛查。能够在24小时内同时检测20个遗传性耳聋突变位点，通过毛细管电泳分离扩增产物，进行软件分析，得出结论进而对耳聋基因遗传性进行辅助诊断。
附图说明
图1是MLPA方法检测原理。
图2是第一组阴性对照品（野生型），纵坐标表示峰高，横坐标表示基因片段大小，横坐标数字表示基因的位点，“1”代表299_300delAT，片段大小为109nt。“2”代表C538T，片段大小为122nt。“3”代表C2162T，片段大小为134nt。“4”代表AIVS7-2G，片段大小为147nt。“5”代表G589A，片段大小为158nt。“6”代表GIVS15+5A，片段大小为169nt。“7”代表167delT，片段大小为184nt。“8”代表G1226A，片段大小为199nt。“9”代表G1975C，片段大小为214nt。“10”代表235delC，片段大小为219nt。“11”代表A1555G，片段大小为295nt。
图3是第一组阳性对照品（突变型），纵坐标表示峰高，横坐标表示基因片段大小，横坐标数字表示基因的位点，“1”代表299_300delAT，片段大小为103nt。“2”代表C538T，片段大小为116nt。“3”代表C2162T，片段大小为128nt。“4”代表AIVS7-2G，片段大小为141nt。“5”代表G589A，片段大小为152nt。“6”代表GIVS15+5A，片段大小为163nt。“7”代表167delT，片段大小为178nt。“8”代表G1226A，片段大小为193nt。“9”代表G1975C，片段大小为208nt。“10”代表235delC，片段大小为223nt。“11”代表A1555G，片段大小为289nt。
图4是第二组阴对照品（野生型），纵坐标表示峰高，横坐标表示基因片段大小，横坐标数字表示基因的位点，“1”代表T2027A，片段大小为108nt。“2”代表C1229T，片段大小为121nt。“3”代表176_191de116，片段大小为135nt。“4”代表G547A，片段大小为146nt。“5”代表A1174T，片段大小为159nt。“6”代表C281T，片段大小为174nt。“7”代表35delG，片段大小为189nt。“8”代表A2168G，片段大小为204nt。“9”代表C1494T，
片段大小为276nt。
图5是第二组阳性对照品（突变型），纵坐标表示峰高，横坐标表示基因片段大小，横坐标数字表示基因的位点，“1”代表T2027A，片段大小为102nt。“2”代表C1229T片段大小为115nt。“3”代表176_191de116，片段大小为127nt。“4”代表G547A，片段大小为140nt。“5”代表A1174T，片段大小为153nt。“6”代表C281T，片段大小为168nt。“7”代表35delG，片段大小为183nt。“8”代表A2168G，片段大小为198nt。“9”代表C1494T,片段大小为270nt。
图6是第一组所得样本的片段分析图谱，纵坐标表示峰高，横坐标表示基因片段大小。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明，但并不局限于此。
检测遗传性耳聋基因探针的设计
本发明前期通过探针设计原则与实际情况结合，设计出大量检测遗传性耳聋基因突变的相关位点的探针，然后通过大量的实验筛选出特异性高、灵敏度高的杂交探针，最终筛选出相关DNA突变效果最佳的探针，且这些位点的突变是发病率最高的人群，达到80%左右。
检测遗传性耳聋试剂盒的方法步骤：
样本的提取：使用无毒灭菌的标准EDTA抗凝真空采血管，在手臂弯曲处或手背，静脉采血1-5mL，旋紧管盖，做好标识并保持采血管直立放置送检验室检测。采用血液基因组DNA提取试剂盒进行提取。
样品的稀释
稀释DNA样品体系
DNA变性
将待测样本的PCR管置于PCR扩增仪内，按下表的程序进行DNA变性反应。
DNA变性程序
DNA与探针杂交反应
根据样本数目，按下表的比例取出各组分，置于一个离心管中混匀后，向每个DNA变性产物中加入3µL。
杂交反应体系
将加入杂交反应混合物的PCR管置于PCR扩增仪内，按下表的程序进行杂交反应。
杂交反应程序
探针连接反应
根据样本数目，按下表的比例取出各组分，置于一个离心管中吹打混匀后，向每个杂交反应产物中加入32µL，加样时保持样本至于PCR上，此时每份杂交反应体系总体积为40µL。
连接反应体系
将加入连接反应混合物的PCR管置于PCR扩增仪内，按下表的程序进行连接反应。
连接反应程序
PCR扩增反应
根据样本数目，按下表的比例取出各组分，置于一个离心管中混匀后，向每个连接反应产物中加入10µL，混匀后瞬时离心。此时每份PCR反应体系总体积为50µL。
PCR反应体系
将加入PCR混合物、待测样本的PCR管置于PCR扩增仪内，按下表的程序进行PCR扩增反应。
PCR反应热循环程序
上机检测：使用ABI3500Dx仪器进行DNA片段分析，在96孔板的每个孔中加入9uL HI-DI，
同时加入内标0.3-0.7µL，依据上样表加入对应样本的PCR扩增产物0.7µL。将配制好的毛
细管电泳上样板参照遗传分析仪毛细管电泳使用说明，95℃变性3min后4℃2min.然后参照遗传分析仪使用说明将上样板加载于载样架。
检测结果分析
反应结束后自动保存结果，对样品所出现峰的位置进行分析，根据软件进行基因位点的分析，利用MLPA技术，针对同一个突变位点分别设计未突变和突变的探针，根据设计的产物长度不同区分不同探针。若同一基因同一位点的未突变和突变探针均出峰，为杂合突变；只有未突变的探针出峰，为野生型；只有突变探针出峰，为纯合突变。
质控对照：阳性/阴性结果的判定分别选择突变位点/野生位点作为阳性对照/阴性对照，应出现相应突变型/野生型的信号，且峰值经计算被判定有效。（2）空白对照不含有相应位点，应不产生信号，无对应峰值，或峰值极低可以忽略。同时满足以上两项质控标准，实验判定有效可以进行后续分析，否则实验判定无效。
例如：如图2和图3所示，位点1（299_300delAT）的野生型和突变型均出现峰，则该位点为杂合突变；若只有位点1的野生型出现峰而突变型没有峰，则该位点为野生型；若位点1野生型未出现峰而突变型出现峰，该位点为纯合突变。如图4和图5，位点1（T2027A）的野生型和突变型均出现峰，则改为点为杂合突变；若只有位点1的野生型出现峰而突变型没有峰，则该位点为野生型；若位点1野生型未出现峰而突变型出现峰，该位点为纯合突变。以上位点皆同。
判读：实验结果在满足质控结果接受标准的前提下参照以下参考值范围。片段分析完成后，将收集得到的峰值信号进行检测结果分析。DQ（Dosage Quotients）为实验中同一基因位点的突变型峰值信号与野生型峰值信号的比值。
每个基因位点中野生型或突变型中的任意一个必须有峰值信号。质控品的结果必须控制在要求范围之内，否则实验结果不符合可接受范围视为无效；阳性质控结果在相应的基因突变型位点出现信号峰，且DQ值需大于1.5，否则说明实验失败，提示实验杂交或PCR扩增失败；空白对照结果的基因突变位置与野生型位置无信号峰或峰值极低，否则实验有可能有污染。
如图6样本所示，为第一组基因位点峰图，根据位点出峰位置以及野生型和突变型的判断依据可知，只有AIVS7-2G位点在野生型和突变型均出现峰，所以此位点为杂合性突变，而其他位点均在野生型位置出现峰，所以均为野生型。
以上所述为本发明的较佳实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则和精神之内所做的任何修改、等同替换或改进等，均就包含在本发明的保护范围之内。
Claims (24)
1.二十项遗传性耳聋基因突变检测试剂盒，其特征在于：包括有如下信息：DNA稀释液、杂交反应液、20个耳聋基因位点、耳聋探针混合液A、耳聋探针混合液B、连接反应液A、连接酶、连接反应液B、聚合酶、PCR扩增引物混合液、阳性对照、阴性对照。
2.根据权利要求1所述的遗传性耳聋基因突变检测试剂盒，其特征在于，所述的DNA稀释液成分为Tris–HCl、EDTA。
3.根据权利要求1所述的遗传性耳聋基因突变检测试剂盒，其特征在于，所述的杂交反应液成分为：KCl、Tris–HCl、EDTA。
4.根据权利要求1所述的遗传性耳聋基因突变检测试剂盒，其特征在于，所述的20个耳聋基因位点分为两组，第一组：299_300delAT，C538T，C2162T，AIVS7-2G，G589A，GIVS15+5A，167delT，G1226A，G1975C，235delC，A1555G；第二组：T2027A，C1229T，176_191de116，G547A，A1174T，C281T，35delG，A2168G，C1494T。
5.根据权利要求1所述的遗传性耳聋基因突变检测试剂盒，其特征在于，所述的连接酶指的是：购于NEB Taq DNA连接酶（NEB）。
6.根据权利要求1所述的遗传性耳聋基因突变检测试剂盒，其特征在于，所述的连接反应液A指的是：辅酶NAD。
7.根据权利要求1所述的遗传性耳聋基因突变检测试剂盒，其特征在于，所述的连接反应液B指的是：MgCl2，Tris–HCl，非离子去污剂。
8.根据权利要求1所述的遗传性耳聋基因突变检测试剂盒，其特征在于，所述的PCR扩增混合物指的是：FAM上游通用引物,序列为：5'-FAM-GGGTTCCCTAAGGGTTGGA-3'；下游通用引物，序列为：5'-GTGCCAGCAAGATCCAATCTAGA-3'，dNTPs。
9.根据权利要求1所述的遗传性耳聋基因突变检测试剂盒，其特征在于，所述的聚合酶指的是：购于NEB Therminator™DNA聚合酶。
10.根据权利要求1所述的遗传性耳聋基因突变检测试剂盒，其特征在于，所述的耳聋探针混合液A指的是:11个位点的探针混合液。
11.根据权利要求1所述的遗传性耳聋基因突变检测试剂盒，其特征在于，所述的耳聋探针混合液B指的是:9个位点的探针混合液。
12.根据权利要求1所述的遗传性耳聋基因突变检测试剂盒，其特征在于，所述的阳性对照指的是：耳聋20个突变型位点的质粒混合物。
13.根据权利要求1所述的遗传性耳聋基因突变检测试剂盒，其特征在于，所述的阴性对照指的是：耳聋20个野生型位点的质粒混合物。
14.根据权利要求2所述的遗传性耳聋基因突变检测试剂盒，其特征在于，所述的DNA稀释液
的浓度是：Tris–HCl：10mM pH 8.2；EDTA：0.1mM。
15.根据权利要求3所述的遗传性耳聋基因突变检测试剂盒，其特征在于，所述的杂交反应液的浓度是：KCl：1.5M；TRIS-HCL：30 mM pH8.5；EDTA：1mM。
16.根据权利要求6所述的遗传性耳聋基因突变检测试剂盒，其特征在于，所述的连接反应液A的浓度是：辅酶NAD浓度：0.2mM。
17.根据权利要求7所述的遗传性耳聋基因突变检测试剂盒，其特征在于，所述的连接反应液B的浓度是：MgCl2浓度：2.6mM；Tris–HCl浓度：5 mM，pH8.5；非离子去污剂浓度：0.013%。
18.根据权利要求8所述的遗传性耳聋基因突变检测试剂盒，其特征在于，所述的PCR扩增混合物的浓度为：10pmol。
19.根据权利要求10所述的遗传性耳聋基因突变检测试剂盒，其特征在于，所述的耳聋探针混合液A的浓度为：1-4fmol。
20.根据权利要求11所述的遗传性耳聋基因突变检测试剂盒，其特征在于，所述的耳聋探针混合液B的浓度为：1-4fmol。
21.根据权利要求12所述的遗传性耳聋基因突变检测试剂盒，其特征在于，所述的阳性对照的浓度为：1-4fmol。
22.根据权利要求13所述的遗传性耳聋基因突变检测试剂盒，其特征在于，所述的阴性对照的浓度为：1-4fmol。
23.根据权利要求1～22任一项所述的遗传性耳聋基因突变检测试剂盒的使用方法，包括如下步骤：DNA稀释（5.00µL）并变性（98℃，5min；25℃，hold）后，进行杂交（DNA与探针杂交反应体系：变性后的DNA稀释液5.00µL、杂交反应液1.5µL、耳聋混合探针(A/B)1.5µL）；杂交反应条件：（95℃，60s；60℃，16-20h），杂交反应后进行连接反应（探针连接反应体系：杂交反应后混合物、dH2O 25µL、连接反应液A 3µL、连接反应液B 3µL、连接酶1µL）；连接反应条件：（54℃，15min；98℃，5min；20℃，hold），连接反应后进行PCR扩增反应（PCR扩增反应体系：PCR扩增引物混合液2.00µL、dH2O 7.5µL、聚合酶0.5µL；PCR扩增反应条件：（（95℃/30s，60℃/30s，72℃/60s，35cycles）、72℃，20min，1cycle、15℃，hold)，PCR扩增反应之后进行上机检测，使用ABI3500Dx仪器进行信号读取和判别，根据扩增曲线的信号情况定性判断是否存在异常。
24.根据权利要求23所述的遗传性耳聋基因检测试剂盒的使用方法，其特征在于：所述的检材是包含有中国人胎儿羊水、人外周血样本、脐血等多种样本。
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