CN106539812A - 环二核苷酸cGAMP在抗结直肠癌肝转移中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于医药技术领域，具体为环二核苷酸cGAMP在治疗结直肠癌肝转移中的应用。本发明研究表明，cGAMP可以显著抑制结直肠癌转移到肝脏，具有明显的抗肿瘤作用，可用于制备抗肿瘤转移药物。经C57BL/6小鼠结直肠癌转移模型表明，cGAMP对结直肠癌细胞株MC38具有显著的抑制作用，阻止肿瘤细胞转移到肝脏,激活树突状细胞DC细胞、提高免疫应答相关的IL-2、IFN-gamma、IFN-beta表达，因此，cGAMP可用于治疗结直肠癌肝转移。

Description

环二核苷酸cGAMP在抗结直肠癌肝转移中的应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种环二核苷酸（cGAMP）在抗结直肠癌肝转移中以及在制备抗结直肠癌肝转移药物中的应用。

背景技术

结直肠癌，又称为大肠癌、直肠癌、或肠癌，为源自结肠或直肠的癌症，是胃肠道中常见的恶性肿瘤。由于细胞非正常的生长，可侵犯或转移至身体其他部位。早期症状包括粪便中带血、排便习惯改变、体重减轻、以及疲倦感。大部分的结直肠癌起因为生活习惯不良及组织老化，少部分则属于遗传疾病。其风险因子包括饮食、肥胖、抽烟、运动量不足。增加罹癌风险的饮食包含红肉或加工肉品、以及酒精等。其他风险因子包含发炎性肠道疾病（分为克隆氏症和溃疡性大肠炎）。一些可能造成结直肠癌的遗传疾病包括家族性结直肠瘜肉综合症和遗传性非瘜肉症结直肠癌，这些遗传性疾病占结直肠癌所有病例中的比例不到5%。结直肠癌通常源自良性肿瘤，随时间进展最终变成恶性肿瘤。结直肠癌其发病率和病死率在消化系统恶性肿瘤中仅次于胃癌、食管癌和原发性肝癌。整体来说，结直肠癌为第三常见癌症，总比例约占10%。在2012年，有140万例新诊断的结直肠癌，共造成69.4万人死亡。结直肠癌在发达国家较为常见，占全世界总案例数的65％，而在女性中较男性少见。在美国，结直肠癌五年存活率约65%。中国在世界上属于低发地区，但其发生率在不少地区有程度不等的增加趋势。结直肠癌多发生在中年以上的男性，以40～70岁最为多见，但20世纪末发现30岁以下者亦不少见。男女两性发病比例约为2:1。结肠直肠癌，其他恶性肿瘤一样，发病原因仍不清楚，可以发生在结肠或直肠的任何部位，但以直肠、乙状结肠最为多见，其余依次见于盲肠、升结肠、降结肠及横结肠。癌瘤大多数为腺癌，少数为鳞状上皮癌及粘液癌。结直肠癌的根治性治疗方法迄今仍首推外科治疗。

肝脏是恶性肿瘤最易发生转移的器官之一，肝转移瘤是肝脏最常见的恶性肿瘤。由于肝脏接受肝动脉和门静脉双重血供，血流量异常丰富，全身各脏器的恶性肿瘤大都可转移至肝脏。消化道、盆腔等部位的恶性肿瘤均可以转移到肝脏，其中以消化道肿瘤发生转移的比率较高（依次为胆囊癌、结直肠癌、胃癌以及胰腺癌），其次为胸部肿瘤（肺癌以及食管癌）、乳腺癌、血液系统肿瘤以及一些其他类型的肿瘤。肝转移瘤的转移途径主要有三种方式，分别是：直接蔓延、淋巴转移和血源性转移。结直肠癌肝转移是结直肠癌治疗的重点和难点之一。约有50%～60%的结直肠癌患者在初诊时或根治术后发生肝转移，其中绝大多数患者（80%～90%）的肝转移灶无法获得根治性切除。结直肠癌肝转移也是结直肠癌患者最主要的死亡原因，肝转移灶无法切除患者的中位生存期仅6～9月，5年生存率为0%，而肝转移灶能根治性切除患者的中位生存期为30月，5年生存率达30%～40%。因此，只有通过积极的综合治疗才有可能预防结直肠癌肝转移的发生、提高肝转移灶手术切除率和术后5年生存率。

免疫疗法就是通过刺激人体受损的免疫机能，达到防治疾病的目的。免疫疗法在癌症的治疗中取得效果，而且副作用较小。和外科手术、化疗和放疗一样，免疫治疗已成为多种癌症治疗的一部分。在感染的哺乳动物细胞中，微生物和病毒DNA能通过刺激干扰素分泌诱导內源强有力的免疫应答。内质网（ER）受体蛋白（STING）对胞质DNA的免疫应答是必需的因素。最近的研究表明，环化cGMP-AMP二核苷酸合成酶（cGAS）在结合DNA后的活化条件下，内源性地催化cGAMP的合成。cGAMP是一种胞质DNA传感器，它作为第二信使通过STING刺激INF-β的感应，介导TBK1和IRF-3的活化，进而启动INF-β基因的转录。cGAMP结合STING，使转录因子IRF3激活并产生β干扰素。此为，还能激活效应T细胞，树突状细胞等。因此，通过STING通路，cGAMP可被作为免疫调节剂，用于激活免疫系统抗肿瘤。cGAMP可以通过结合STING，调节树突状细胞活性，激活T细胞、B细胞，作为一种可能的免疫治疗药物，具备潜在的抗肿瘤活性。

发明内容

本发明的目的是提供一种二核苷酸cGAMP及衍生物作为抗结直肠肝转移药物及其应用。

本发明的免疫佐剂cGAMP，其特征在于可作为药物，能够显著提高抑制结直肠癌肝转移、激活树突状细胞DC细胞、提高免疫应答相关的IL-2、IFN-gamma、IFN-beta表达。

发明的再一方面涉及本发明中所述的cGAMP及衍生物在制备抗结直肠肝转移药物中的用途。

本文提及二核苷酸cGAMP，如不加特殊说明，均指2’,5’-3’,5’-cGAMP Cyclic [G(2’,5’)pA(3’,5’)p] cGAMP(2’-5’) c[G(2’,5’)pA(3’,5’)p], CAS号为1441190-66-4，分子式为C₂₀H₂₂N₁₀O₁₃P₂ .2NH4。

具体实施方法

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例 1 ： cGAMP 的制备

cGAMP （环化-GMP-AMP）按文献方法在结合DNA后的活化条件下，由环化cGMP-AMP二核苷酸合成酶（cGAS）催化合成。纯度在98％以上。（Pingwei Li，et al., Immunity, 2013, 39(6), 1019-1031.）

实施例 2 ： cGAMP （环化 -GMP-AMP ）的抗肿瘤作用采用荷瘤鼠模型进行检测 cGAMP 对动物结直肠癌肝转移的抑制作用。

受试药物

名称：cGAMP

性状：白色粉末

溶媒：生理盐水。

配制方法：临用前用生理盐水溶液配制成所需浓度的溶液。

受试药物浓度：1 mg/ml、2 mg/ml。

动物

种属、品系、性别、体重、来源、合格证

C57小鼠，雄性，体重16-18g，6-8周龄，购于上海斯莱克实验动物有限责任公司[实验动物质量合格证号：SCXK （沪）2007-0005 ] 。

饲养条件

所有小鼠，均自由觅食和饮水，在室温（23±2）℃，饲养于中国人民解放军某军医大学实验动物中心。饲料及水均经高压灭菌处理，全部实验饲养过程及实验均参照相关实验标准执行。

剂量设置

cGAMP腹腔注射小鼠，设置2个剂量组：10 mg/kg，20 mg/kg

试验对照

阴性对照：生理盐水溶液

阳性对照：5-氟尿嘧啶（5-FU），剂量20 mg/kg

给药方法

给药途径：腹腔注射给药

给药体积：10 ml/kg

给药次数：每天1次，连续14天

每组动物数：10只

肿瘤细胞株

MC38小鼠大肠癌细胞，购自中国科学院细胞库。

试验主要步骤

1 ．结直肠癌肝转移模型的建立与干预

细胞培养，传代，在细胞对数期收集细胞，做成浓度为1.0×10⁷/ml细胞悬液，C57鼠右前肢腋下注射0.2-0.5 ml细胞悬液 (细胞数目为2-5×10⁶个/只)，8-10 d左右肿瘤长至直径约4-5 mm。取瘤块，用手术剪剪成小块，并研磨成单个细胞，用滤网滤过单个细胞。取细胞用1640培养基重悬，并静置5分钟，丢弃沉淀。1000 rpm离心，弃上清，再用1640培养基重悬，做成浓度为1.0×10⁷/ml细胞悬液。麻醉小鼠，用手术刀剪开小鼠的腹腔，取出脾脏，注射0.1 ml细胞悬液，用抗生素消毒，防止手术感染。

手术后，随机均分为4组：A:阴性对照组（腹腔注射生理盐水组）、B:5-FU组(腹腔注射5-FU 20mg/kg组)、C：cGAMP低剂量组(腹腔注射cGAMP)10 mg/kg、D：cGAMP组高剂量组(腹腔注射cGMP-AMP 组)20 mg/kg。每天给药1次，连续给药14天。14天后，处死小鼠并称肝脏重量，计算结直肠癌细胞转移效率和抑制结直肠癌细胞肝转移效率。肝脏转移瘤重=实验组平均肝脏重(B、C、D组为实验组)-正常小鼠肝脏重。结直肠癌细胞肝转移效率= [实验组平均肝脏重(B、C、D组为实验组)-正常小鼠肝脏重]／A组平均肝脏重-正常小鼠肝脏重)。抑瘤率=1-[实验组平均肝脏重(B、C、D组为实验组)-正常小鼠肝脏重]／A组平均肝脏重-正常小鼠肝脏重)×100％。

2 ．统计分析

数据用x±s表示，利用SPSS10.0软件进行处理，采用单因素方差分析（one-way ANOVA）检验比较各组瘤重差异的显著性，显著性水平a=0.05。

结果

C57小鼠脾脏接种MC38结直肠肿瘤细胞后成功制成肝移植瘤模型，5-FU和cGAMP均可明显抑制肿瘤生长，给药14天后的瘤重均显著低于阴性对照组（P<0.05 ，P<0.01），表明cGAMP具有抗结直肠肝转移作用。具体结果见表1-表5。

表 1 cGAMP对C57鼠结直肠癌细胞MC38转移到肝脏的抑制作用

（n=10，mean±SD）

组别 肝脏转移瘤重（g） 平均抑瘤率/转移效率（%）

阴性对照组 1.34±0.21 （g） -

5-FU组 0.42±0.17 （g）** 68.7/31.3

cGAMP低剂量组 0.21±0.08（g）** 84.3/15.7

cGAMP高剂量组 0.02±0.01 （g）** 98.5/1.5

注：*P<0.05 vs 阴性对照组；**P<0.01 vs 阴性对照组。

实施例 3 ：流式细胞仪测试小鼠树突状细胞（ DC 细胞）激活效率

小鼠饲养、结直肠癌转移模型造模参见实施例二。抗CD40、CD80、CD86、MHC II、同型对照抗体等流式抗体均购自eBiosciences公司，CD11c+抗体磁珠均购自Miltenyi Biotech公司，流式细胞仪购自BD公司。分别将给药14天后小鼠处死，取小鼠的脾脏，研磨后捣碎，通过40 um孔膜过滤细胞。1000rpm离心10分钟离心分离脾脏内的免疫细胞，用红细胞裂解液裂解红细胞至红细胞完全溶解，再1000rpm离心10分钟，分离未被裂解的免疫细胞。用CD11c+抗体磁珠分离DC细胞，分别加入抗CD40、CD80、CD86、MHC II FAC抗体（用FACS缓冲液稀释），同型对照抗体作为阴性对照，抗体加入后孵育1小时后离心，用PBS清洗一遍，用流式细胞仪分析样品,用流式分选合适的细胞，测定选定细胞的平均荧光强度（MFI）。流式结果见表二，流式细胞测定结果表明：cGAMP及cGAMP的衍生物包括硫代cGAMP、硒代cGAMP作为免疫佐剂，能明显活化DC细胞，且活化效果比铝佐剂好，显著优于单独使用OVA活化效果。

表 2 流式细胞仪测定cGAMP作为免疫佐剂活化小鼠DC细胞的效果

组名 Anti-CD40 / Anti-CD80/Anti-CD86/Anti-MHC II (MFI)

5-FU组 32.3/11.4/5.8/67.8

cGAMP低剂量组 67.2/40.3/14.2/110.7

cGAMP高剂量组 149.9/101.4/19.7/174.6

阴性对照组 42.6/12.9/6.3/98.7

同型对照抗体组 6.8/6.7/2.3/6.9

实施例 4 ：细胞因子分泌水平测定

小鼠饲养、结直肠癌转移模型造模参见实施例二、小鼠血清采集采用眼眶采血方法采集。ELISA检测试剂盒均购自R&D Systems公司。参见ELISA试剂盒说明书，分别测试细胞因子量的具体方法，包括IFN-beta、IFN-gamma、IL-2。测定结果如表3-5所示，结果表明：cGAMP作为能够上调结直肠癌肝转移C57模型小鼠血液中IFN-beta、IFN-gamma、IL-2等细胞因子的表达量。

表 3 ELISA测定cGAMP治疗结直肠癌肝转移C57模型小鼠后IFN-beta分泌量

（n=10，mean±SD）

组名 IFN-beta表达量（pg/ml）

5-FU组 66±21 **

cGAMP低剂量组 186±37 **

cGAMP高剂量组 276±42 **

阴性对照组 27±14

注：*P<0.05 vs阴性对照组；**P<0.01 vs阴性对照组。

表 4 ELISA测定cGAMP治疗结直肠癌肝转移C57模型小鼠细胞因子IFN-gamma分泌量

（n=10，mean±SD）

组名 IFN-gamma表达量（pg/ml）

5-FU组 10±5 *

cGAMP低剂量组 26±14 **

cGAMP高剂量组 39±17 **

阴性对照组 5±3

注：*P<0.05 vs阴性对照组；**P<0.01 vs阴性对照组。

表 5 ELISA测定cGAMP治疗结直肠癌肝转移C57模型小鼠后细胞因子IL-2分泌量

（n=10，mean±SD）

组名 IL-2表达量（pg/ml）

5-FU组 43±13

cGAMP低剂量组 112±36 **

cGAMP高剂量组 157±28 **

阴性对照组 25±18

注：*P<0.05 vs阴性对照组；**P<0.01 vs阴性对照组。

Claims (4)

1.cGAMP及其衍生物在抗疗结直肠癌肝转移中的应用。

2.cGAMP及其衍生物在制备抗结直肠癌肝转移药物中的应用。

3. 使用cGAMP及其衍生物治疗结直肠癌肝转移。

4. 使用cGAMP及其衍生物预防和治疗癌症转移药物。