CN106350485B - 一种快速高效分离单个抗原特异性b细胞的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种快速高效分离单个抗原特异性B细胞的方法，本方法具体包括以下步骤：步骤一，从感染抗原的人或动物的外周血全血分离获得外周血单核细胞悬液；步骤二，制备偶联抗原配体的活化免疫磁珠，所述配体是对应抗原的人工抗原；步骤三，使用未偶联未活化磁珠去除步骤一获得的外周血单核细胞悬液中的非特异性吸附细胞，使用步骤二获得的偶联抗原的活化免疫磁珠从步骤三获得的混合物中分离获得单个抗原特异性B细胞。本方案提供一种具有不依赖骨髓瘤细胞、操作复杂度低、且成本较低的通用性方法，获得针对单个抗原的特异性B细胞的方法，单细胞分离效果更佳。
Description
技术领域
本发明涉及一种分离抗原特异性B细胞的方法。
背景技术
在血液中B细胞约占淋巴细胞总数的15％。固定在B细胞膜表面的免疫球蛋白(主要是单体IgM和IgD)是抗原的特异性受体。当它们初次与某一个抗原接触而被致敏时，一部分B细胞即分化成熟为浆细胞，浆细胞即开始生成对该抗原特异的免疫球蛋白并将它们释放到周围的组织液中，这就是免疫抗体。
分离、培养及鉴定产生特异性结合某目标抗原的抗体的B细胞的方法在免疫技术领域非常重要。现有技术中获得免疫系统中针对某种抗原的B细胞，并制备单克隆抗体的方法主要为杂交瘤方法，是一种使用永生的骨髓瘤细胞(myeloma cells，或者fusionpartner)和经过免疫动物的脾脏细胞经过融合(fusion，将两个细胞合二为一的过程)，获得单克隆抗体的方法。但是这种方法存在诸多不足：抗原特异性B细胞在脾脏细胞中的“丰度”使分离抗原特异性克隆变得随机性很大；必须有一个骨髓瘤细胞。小鼠的骨髓瘤细胞(如sp2/0细胞)比较容易获得，因此比较常用此方法。但是对于一些其他种属的动物很难或无法获得骨髓瘤细胞，而实验证明，例如兔单克隆抗体和骆驼单克隆抗体有更多的优点，而这类免疫动物的骨髓瘤细胞较难获得，从而造成了传统杂交瘤方法获得单克隆抗体的局限性。
流式细胞术(FCM)是近几年新兴的一种可以用来分离B细胞的方法。因为分离的细胞较纯，得到了很多科研工作的认可。但是，该方法有如下几个缺点：需要用到昂贵的流式细胞仪，从几十万到上百万不等。除此之外，需要至少2～3种不同的标记试剂，这些标记试剂通常也比较昂贵。操作复杂。根据实验需求可以选择不同的标记试剂，通常标记试剂越多结果越好。但是，越多的标记试剂需要越复杂的操作。复杂的操作不可避免的会影响到B细胞的质量和活性。
因此亟需一种具有不依赖骨髓瘤细胞、操作复杂度低、且成本较低的通用性方法，获得针对单个抗原的特异性B细胞的方法。
发明内容
本发明是为了解决上述现有技术的不足，提供了一种利用免疫磁珠法分离单个抗原特异性B细胞的方法。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明提供的一种快速高效分离单个抗原特异性B细胞的方法具体包括以下步骤：步骤一，从感染抗原的人或动物的外周血全血分离获得外周血单核细胞悬液；步骤二，制备偶联抗原配体的活化免疫磁珠，所述配体是对应抗原的人工抗原；步骤三，使用未偶联未活化磁珠去除步骤一获得的外周血单核细胞悬液中的非特异性吸附细胞，使用步骤二获得的偶联抗原的活化免疫磁珠从步骤三获得的混合物中分离获得单个抗原特异性B细胞。
作为优选，步骤二的制备偶联抗原的活化免疫磁珠的步骤包括：对偶联抗原的活化免疫磁珠进行封闭的步骤，所述封闭的步骤是使用Glycine甘氨酸对偶联抗原的活化免疫磁珠进行封闭。
作为优选，所述配体为重组蛋白或多肽-BSA(多肽-KLH，多肽-OVA等多肽与载体蛋白的交联物)或小分子人工抗原。
本发明的技术方案从免疫生物或人的外周血全血分离获得外周血单核细胞，再应用免疫磁珠从外周血单核细胞中分离针对单个抗原的特异性B细胞。不依赖于骨髓瘤细胞，种属适应性更广。理论上可以从任何动物或者人的外周血中分离得到目的特异性B细胞；适应性强，简单易行，无需昂贵的设备和试剂，只要有合适的配体，如含有羧基、氨基等可反应的基团就可以与磁珠进行交联，用于B细胞的分离，也不需要昂贵的大型设备，全部操作可在超净工作台上完成；操作步骤少，与流式细胞术方法相比，无需进行多重标记，降低对B细胞的影响，使得最后得到的细胞质量好，成活率高；与传统杂交瘤技术相比，无需亚克隆，按照杂交瘤6-8周的时间，本方案只需要1周。极大地缩短了开发周期。
在制备偶联抗原的活化免疫磁珠的步骤中使用Glycine甘氨酸代替BSA牛血清白蛋白对偶联抗原的活化免疫磁珠进行封闭。由于甘氨酸分子较小，空间位阻小，不仅封闭效果更佳，而且不与配体竞争空间可以使配体更充分的展示表位，更有利于磁珠与细胞的结合。同时甘氨酸封闭后的免疫磁珠能够极佳的解决减少磁珠间的自交联，磁珠的分散性更好、更有利于磁珠与细胞的结合，并且能够提高磁珠的分散状态。在磁珠孵育步骤中加入EDTA乙二胺四乙酸、Arginine精氨酸和PEG聚乙二醇有效降低了非特异性吸附和细胞成团的问题，使细胞与磁珠的结合更充分，单细胞分离效果更佳。
说明书附图
图1是本发明实施例的第一流程图。
图2是未经封闭处理的偶联配体的活化免疫磁珠的状态图。
图3是现有技术中经BSA牛血清白蛋白封闭处理的偶联配体的活化免疫磁珠的状态图。
图4是本发明技术方案中经甘氨酸封闭处理的偶联配体的活化免疫磁珠的状态图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明做进一步描述。
实施例一：如图1所示，本发明提供的一种快速高效分离单个抗原特异性B细胞的方法具体包括以下步骤：
步骤一，从感染抗原的人或动物的外周血全血分离获得外周血单核细胞悬液。
步骤二，制备偶联抗原的活化免疫磁珠，所述配体是对应抗原的人工抗原。
具体的，制备偶联抗原的活化免疫磁珠的步骤主要包括：
(1)免疫磁珠的活化的步骤；
(2)免疫磁珠与配体混合孵育的步骤；
具体的，所述配体为重组蛋白或多肽-BSA(多肽-KLH，多肽-OVA等多肽与载体蛋白的交联物)或小分子人工抗原。配体的选择属于本领域通用技术，这些配体可以是购买的商品化成品或半成品，或是自行设计后委托第三方生产的产品，因此关于对应抗原的配体选择在此不再赘述。
(3)对偶联抗原的活化免疫磁珠进行封闭的步骤，所述封闭的步骤是使用Glycine甘氨酸对偶联抗原的活化免疫磁珠进行封闭。
本步骤中使用Glycine甘氨酸代替现有技术中的BSA牛血清白蛋白对偶联抗原的活化免疫磁珠进行封闭。由于甘氨酸分子较小，空间位阻小，不仅封闭效果更佳，而且不与配体竞争空间可以使配体更充分的展示表位，更有利于磁珠与细胞的结合。同时甘氨酸封闭后的免疫磁珠能够极佳的解决减少磁珠间的自交联，磁珠的分散性更好、更有利于磁珠与细胞的结合，并且能够提高磁珠的分散状态。
如图2所示，在磁珠与配体交联后若未进行封闭处理，磁珠将进行自交联，磁珠形成链状或者聚集成团。自交联的磁珠因为表面积减小，将极大地的影响磁珠与细胞的结合，从而影响分离效果。
如图3所示，磁珠经现有技术中BSA牛血清白蛋白封闭后显著降低了自交联的发生，约有一半的磁珠可以较好的分散，但仍有约一半的磁珠聚集成团。从实际分离效果来看仍不够理想。
如图4所示，经甘氨酸封闭的磁珠90％以上程均匀的分散状态，基本观察不到自交联的现象。均匀分散的磁珠，表面的配体得以自由和充分的展示，极大提高了磁珠与细胞结合的效率，从而提高磁珠的分离效果。
步骤三，使用未偶联未活化磁珠去除步骤一获得的外周血单核细胞悬液中的非特异性吸附细胞。
步骤四，使用步骤二获得的偶联抗原的活化免疫磁珠从步骤三获得的混合物中分离获得单个抗原特异性B细胞。
封闭条件的改进是本发明方案中的关键步骤，采用甘氨酸对偶联配体的活化磁珠进行封闭，一方面降低非特异性吸附，使磁珠结合的细胞都是特异性的；另一方面，降低磁珠间的自交联维持磁珠的分散状态，使后磁场分离和细胞计数成为可能，解决了本领域内细胞分离技术的一大难题。使利用磁珠分离单个抗原特异性B细胞的方法的操作难度大大降低，并且实现分离高通量的目的。从而使本方案具备了极高的商业应用价值。
实施例二，本实施例中选用羟基磁珠、兔外周血、抗原为CRP多肽-KLH偶联物、配体为CRP重组蛋白的实例，具体说明本发明技术方案的实施方式。
步骤一：
(a)取50ml离心管，加入5～20ml兔血，加入5～25ml PBS，混匀；
(b)另取-50mL离心管，加入5～20mL淋巴细胞分离液；
(c)将PBS稀释过的兔血平均加入到两只装有淋巴细胞分离液的离心管中，转速900～1400rpm，离心处理15～30min；
(d)小心取出离心管，用1ml移液器缓慢吸取第二层淋巴细胞，并加入DPBS定容至45ml。转速900～1400rpm，离心处理5～15min；
(e)弃上清，用DPBS洗涤一次；
(f)重悬细胞，并进行细胞计数。
步骤二：
(a)取1mg羧基磁珠(约100μl磁悬液，取用前超声充分混匀)于1.5ml Ep管中，涡旋振荡5-10min；
(b)将Ep管放置于磁分架上，待磁珠完全被吸附，用移液器小心吸去上清；
(c)加入15mM MES(PH 6.0)，涡旋振荡30s。然后放置于磁分架上吸掉上清。重复洗涤一次；
(d)使用预冷的100μl 15mM MES(PH 6.0)重悬磁珠，再加入100μl(10mg/ml)碳二亚胺(EDC)溶液；
(e)混合均匀，室温条件，在样品混合仪上活化30min
(f)使用1ml的15mM MES(PH 6.0)洗涤活化后的磁珠1遍，磁分离，弃上清
(g)加入含50ugCRP重组蛋白的15mM MES(PH 6.0)，室温反应过夜
(h)加入0.1～1.5M的Glycine，室温反应2～5个小时进行封闭
(i)将免疫磁珠至于磁分架上，待磁珠完全吸附，去上清
(j)加入1ml PBST洗涤2次
(k)用含1％FBS的PBS 4℃封闭2小时
步骤三：
(a)同时取未偶联未活化的磁珠和偶联后的磁珠用1ml含有0.1～1M arginine和0.1％～5％PEG200或PEG400或PEG600的RPMI重悬；
(b)用未偶联未活化的磁珠50～500ug与1～5M的淋巴细胞混合，室温或37℃孵育15min；
(c)将离心管放置在磁力架上，待未偶联未活化的磁珠和非特异性细胞聚集后，将上清液；
(d)将上清液转移至偶联后的磁珠管里，室温或37℃孵育15min；
(e)将离心管放置在磁力架上，待单个抗原特异性B细胞和偶联配体的活化免疫磁珠聚集后，弃上清液。
(f)用1640培养基洗涤IMB-淋巴细胞2次，用含含有0.1～1M arginine和0.1％～5％PEG200或PEG400或PEG600的1640培养基重悬，重新计数，调整细胞浓度为5～500cells/mL。
参照本实施的方法步骤既可以在免疫兔外周血中分离针对抗原的单个抗原特异性B细胞。对比现有技术相比，与流式细胞术方法相比，无需进行多重标记，降低对B细胞的影响，使得最后得到的细胞质量好，成活率高；与传统杂交瘤技术相比，无需亚克隆，按照杂交瘤6～8周的时间，本方案只需要1周。极大地缩短了开发周期。
本方案提供了一种一种快速高效分离单个抗原特异性B细胞的方法，具体通过磁珠封闭条件、磁珠孵育条件等方面的改进，i.一方面降低非特异性吸附，使磁珠结合的细胞都是特异性的；另一方面，降低磁珠间的自交联维持磁珠的分散状态，使后磁场分离和细胞计数成为可能，从而达到易操作和高通量的目的。
Claims (4)
1.一种快速高效分离单个抗原特异性B细胞的方法，其特征是：其包括以下步骤：
步骤一：从感染抗原的人或动物的外周血全血分离获得外周血单核细胞悬液；
步骤二：制备偶联配体的活化免疫磁珠，所述配体是对应抗原的人工抗原；
步骤三：使用未偶联未活化磁珠去除步骤一获得的外周血单核细胞悬液中的非特异性吸附细胞；
步骤四：使用步骤二获得的偶联配体的活化免疫磁珠从步骤三获得的混合物中分离获得单个抗原特异性B细胞，
其中，步骤二的制备偶联配体的活化免疫磁珠的步骤包括：对偶联配体的活化免疫磁珠进行封闭的步骤，所述封闭的步骤是使用Glycine甘氨酸代替BSA牛血清白蛋白对偶联配体的活化免疫磁珠进行封闭，其中，Glycine浓度为0.1～1.5M，室温反应2～5个小时进行封闭，
所述步骤三进一步包括：
(j)将步骤一获得的外周血单核细胞悬液与未偶联未活化的磁珠在离心管内混合孵育；
(k)将步骤j获得的混合液放置在磁力架上，待未偶联未活化的磁珠和非特异性细胞聚集后，取上清液即获得去除非特异性吸附细胞后的混合物，
所述步骤四进一步包括：
(l)将步骤三获得混合物和步骤二获得的偶联配体的活化免疫磁珠在离心管内混合孵育；
(m)将步骤l获得的混合液放置在磁力架上，待单个抗原特异性B细胞和偶联配体的活化免疫磁珠聚集后，弃上清液；
(n)对步骤m中离心管底部的混合物用培养基洗涤一次，重悬并计数，分离获得单个抗原特异性B细胞，
其中，步骤(j)和步骤(l)中的混合物中还加入了含有0.1～1M Arginine精氨酸和0.1％～5％PEG聚乙二醇200或PEG400或PEG600的1640培养基。
2.根据权利要求1所述的一种快速高效分离单个抗原特异性B细胞的方法，其特征是，步骤一中分离获得外周血单核细胞悬液的步骤进一步包括：
(a)使用等量PBS缓冲液稀释外周血全血；
(b)步骤a混合液中加入1/2体积的淋巴细胞分离液；
(c)转速为900～1400rpm，离心处理15～30min，中部云雾层即为外周血单核细胞；
(d)吸取云雾层外周血单核细胞，加入PBS缓冲液重悬，转速为900～1400rpm，离心处理5～15min后，使用PBS缓冲液洗涤，加入培养基重悬，计数，获得外周血单核细胞悬液。
3.根据权利要求1或2所述的一种快速高效分离单个抗原特异性B细胞的方法，步骤二的制备偶联配体的活化免疫磁珠的步骤进一步包括：
(e)使用MES缓冲液洗涤磁珠；
(f)加入EDC碳二亚胺溶液活化磁珠，并用MES缓冲液洗涤；
(g)加入配体，室温反应过液；
(h)使用PBS缓冲液洗涤后，加入Glycine甘氨酸进行封闭；
(i)使用PBS缓冲液洗涤后，获得偶联配体的活化免疫磁珠。
4.根据权利要求1所述的一种快速高效分离单个抗原特异性B细胞的方法，其特征是，所述配体为重组蛋白或多肽与载体蛋白的交联物或小分子人工抗原，其中所述多肽与载体蛋白的交联物为多肽-BSA，多肽-KLH或多肽-OVA。
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