CN106256196B - 高效诱导哥伦比亚型拟南芥愈伤组织的方法及诱导培养基 - Google Patents
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Abstract
本发明属于植物愈伤组织诱导及培养技术领域，具体涉及一种高效诱导哥伦比亚型拟南芥愈伤组织的方法及诱导培养基，诱导培养基成分包括MS粉2.2‑4.4g/L、2,4‑二氯苯氧乙酸1‑2mg/L、蔗糖20‑30g/L、琼脂6‑8g/L，pH值为5.6‑5.8，将哥伦比亚型拟南芥的子叶作为外植体接种于该诱导培养基上，放在温室中，一定条件下培养，可得到淡黄色、结构松脆的颗粒状愈伤组织，诱导率为100％，极大的缩减了拟南芥愈伤组织形成时间，提高了诱导率，为以拟南芥愈伤组织为基础的高效扩繁体系及遗传转化体系研究提供重要的技术平台和支持。
Description
技术领域
本发明属于植物愈伤组织诱导及培养技术领域，具体涉及一种高效诱导哥伦比亚型拟南芥愈伤组织的方法及诱导培养基。
背景技术
愈伤组织是植物的薄壁细胞，具有高效的分化及再生能力，愈伤组织的快速高效诱导对植物通过愈伤途径进行再生及遗传转化体系的建立具有重要意义。一般通过选取植物的器官或组织进行愈伤组织诱导就可以快速获得愈伤组织，在节约诱导培养时间的同时获得较高的出愈率，为以愈伤组织为基础的植株再生体系和遗传转化体系奠定基础。
拟南芥属于十字花科，具有植株小、生活周期短、种子丰富、易于繁殖和突变等优点，是植物研究中最热门的模式植物。拟南芥在植物进化中处于相当高的位置，在拟南芥中发现的一些重要调节及功能基因都能在其它植物中找到它们的同源基因。目前关于拟南芥组织培养的报道很多，但拟南芥的一个重要的生态型—哥伦比亚型拟南芥的愈伤组织诱导仍处于探索建立阶段，多是以种子或带柄叶片进行愈伤诱导25～30天左右，围绕愈伤诱导培养基配方中植物生长调节剂等物质的浓度和比例的改变进行探索，但出愈率不高且出愈时间过长。如何能在提高出愈率的同时提高出愈速度是技术瓶颈，因此，急需一种愈伤组织诱导方法来在短期内高效获取优良哥伦比亚型拟南芥愈伤组织。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供了一种高效诱导哥伦比亚型拟南芥愈伤组织的方法及诱导培养基，解决了现有技术中诱导哥伦比亚型拟南芥时间长、出愈率低的问题，填补了技术空白，将利用该方法制备的哥伦比亚型拟南芥愈伤组织应用于相关的研究和生产工作中，为转基因研究提供了重要的技术平台和支持。
本发明是这样实现的，根据本发明的一个方面，提供了一种高效诱导哥伦比亚型拟南芥愈伤组织的培养基，其成分包括MS粉2.2-4.4g/L、2,4-二氯苯氧乙酸1-2mg/L、蔗糖20-30g/L、琼脂6-8g/L，pH值为5.6-5.8。
进一步地，诱导培养基其成分包括MS粉4.4g/L、2,4-二氯苯氧乙酸1.0mg/L、蔗糖20-30g/L、琼脂6-8g/L，pH值为5.6-5.8。
根据本发明另外一个方面，提供了一种高效诱导哥伦比亚型拟南芥愈伤组织的方法，包括如下步骤：
1)按照上述配方配置诱导培养基；
2)外植体预处理及接种，在超净工作台上，用镊子将生长良好的无菌实生拟南芥用解剖刀切下叶片，并将切下的叶片置于步骤1)中配置的诱导培养基中；
3)愈伤组织的诱导，将步骤2)中接种好拟南芥子叶的诱导培养基置于温室中，温室培养温度为24-26℃、湿度为50-70％、光照强度为1500-2000lux、光照时间为16h，培养7-10天后获得淡黄色、颗粒状的愈伤组织团块。
进一步地，上述诱导方法还包括增殖步骤，将培养10-15天后的愈伤组织在超净工作台上用镊子剔除老化部分，挑取部分愈伤组织接种到新的所述诱导培养基上，在一个培养基上接种多次并置于温室中培养，培养温度为24-26℃、湿度为50-70％、光照强度为1500-2000lux、光照时间为16h，培养10-15天后，即获得大量淡黄色、颗粒状的愈伤组织。
进一步地，上述方法中生长良好的无菌实生拟南芥的培养方法包括如下步骤：
a)拟南芥种子消毒，在无菌超净台上，将哥伦比亚型拟南芥种子置于离心管中，首先用体积分数75％的乙醇消毒30-60s后,使用灭菌水清洗一次，再使用体积分数11％的次氯酸钠振荡消毒10-15min，最后用灭菌水洗3-5次；
b)生长培养基的配制，其成分包括MS粉2.2-4.4g/L、MES 0.5-1g/L、蔗糖20-30g/L、琼脂6-8g/L，pH值为5.6-5.8；
c)哥伦比亚型拟南芥的培养，将消毒完成的种子点于所述生长培养基上，置于4℃冰箱春化2-3d后移到温室中，温室培养温度为24-26℃、湿度为50-70％、光照强度为1500-2000lux、光照时间为16h，9-10d后获得哥伦比亚型拟南芥无菌实生苗。
进一步地，上述诱导哥伦比亚型拟南芥愈伤组织所选的无菌实生拟南芥为已长出两片完整叶子的拟南芥。
进一步地，上述诱导哥伦比亚型拟南芥愈伤组织的方法中，用解剖刀切下拟南芥叶片时，切割位置在距两片叶子结合处0.1cm的叶柄上。
进一步地，上述诱导哥伦比亚型拟南芥愈伤组织的方法中，将拟南芥叶片接种到所述诱导培养基中时，叶面朝下接种。
与现有技术相比，本发明的优点在于：以哥伦比亚型拟南芥子叶为外植体，可获得达到100％的愈伤组织诱导率，且愈伤组织获得时间为7-10d，并且具有污染率低、愈伤组织状态良好的优点，与现有技术诱导哥伦比亚型拟南芥愈伤组织需要25-30天相比，本发明建立的哥伦比亚型拟南芥愈伤组织快速高效诱导体系能够极大的缩减拟南芥愈伤形成时间，为以愈伤组织为基础的高效扩繁体系及遗传转化体系研究提供重要的技术平台和支持。
附图说明
下面结合附图及实施方式对本发明作进一步详细的说明：
图1为利用本发明的方法制得的单个哥伦比亚型拟南芥愈伤组织；
图2为利用本发明的方法增殖得到到多个哥伦比亚型拟南芥愈伤组织。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合附图实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。
为了解决现有技术中诱导哥伦比亚型拟南芥愈伤组织时间长、诱导率低的问题，本发明提供了一种拟南芥诱导培养基和诱导方法，以哥伦比亚型拟南芥子叶为外植体，在8-10d培育出淡黄色、结构松脆的颗粒状愈伤组织，参考图1，并且诱导率为100％；以该方法培育出的愈伤组织为母体进行增殖培养，能够获得大量淡黄色、结构松脆的颗粒状愈伤组织，参考图2。本发明所用材料、药品均为市售。
实施例1
哥伦比亚型拟南芥植株的培育
a)拟南芥种子消毒，在无菌超净台上，将哥伦比亚型拟南芥种子置于1.5mL的离心管中，首先用体积分数75％的乙醇消毒30-60s后,使用灭菌水清洗一次，再使用体积分数11％的次氯酸钠振荡消毒10-15min，最后用灭菌水洗3-5次；
b)生长培养基的配制，其成分包括MS粉2.2-4.4g/L、MES 0.5-1g/L、蔗糖20-30g/L、琼脂6-8g/L，pH值为5.6-5.8；
c)哥伦比亚型拟南芥的培养，将消毒完成的种子点于所述生长培养基上，置于4℃冰箱春化2-3d后移到温室中，温室培养温度为24-26℃、湿度为50-70％、光照强度为1500-2000lux、光照时间为16h，9-10d后获得哥伦比亚型拟南芥无菌实生苗。
实施例2
哥伦比亚型拟南芥愈伤组织的诱导及增殖培养
1)配置诱导培养基，在1升蒸馏水中溶解MS粉2.2g，再加入2,4-二氯苯氧乙酸1mg、蔗糖20g、琼脂6g，加热完全溶解，调节培养基pH值为5.6-5.8之间，高压灭菌，待温度降低至60℃时倒平板，冷却备用，上述操作均在无菌状态下进行；
2)外植体预处理及接种，在超净工作台上，用镊子将实施例1中获得的生长良好的无菌实生拟南芥整株取出，为了防止拟南芥子叶萎蔫，将其置于放有少量无菌水的培养皿中，用解剖刀在距两片叶子结合处0.1cm的叶柄上切下叶片，并将切下的叶片置于步骤1)中配置的诱导培养基中；
3)愈伤组织的诱导，将步骤2)中接种好拟南芥子叶的诱导培养基置于温室中，温室培养温度为24-26℃、湿度为50-70％、光照强度为1500-2000lux、光照时间为16h，培养7-10天后获得淡黄色、结构松脆的颗粒状愈伤组织团块；
4)将培养10-15天后的拟南芥愈伤组织在超净工作台上用镊子或解剖刀剔除褐色老化部分，挑取部分愈伤组织接种到新的诱导培养基上，在一个培养基上接种多次并置于温室中培养，培养温度为24-26℃、湿度为50-70％、光照强度为1500-2000lux、光照时间为16h，培养10-15天后，即获得大量淡黄色、结构松脆的颗粒状愈伤组织。
观察后得知，利用本方法获得的哥伦比亚型拟南芥愈伤组织呈诱导率为100％。
实施例3
与实施例2不同的地方在于，步骤1)配置诱导培养基时，在1升蒸馏水中溶解MS粉3g，再加入2,4-二氯苯氧乙酸1.5mg、蔗糖25g、琼脂7g，其他步骤均与实施例2相同，培育哥伦比亚型拟南芥愈伤组织后观察，诱导率为100％。
实施例4
与实施例2不同的地方在于，步骤1)配置诱导培养基时，在1升蒸馏水中溶解MS粉4.4g，再加入2,4-二氯苯氧乙酸2mg、蔗糖30g、琼脂8g，其他步骤均与实施例2相同，培育哥伦比亚型拟南芥愈伤组织后观察，诱导率为100％。
Claims (8)
1.高效诱导哥伦比亚型拟南芥愈伤组织的培养基，其特征在于，用于将拟南芥子叶诱导培养成愈伤组织，所述诱导培养基成分包括MS粉2.2-4.4g/L、2,4-二氯苯氧乙酸1-2mg/L、蔗糖20-30g/L、琼脂6-8g/L，pH值为5.6-5.8。
2.根据权利要求1所述的高效诱导哥伦比亚型拟南芥愈伤组织的培养基，其特征在于，所述诱导培养基成分包括MS粉4.4g/L、2,4-二氯苯氧乙酸1.0mg/L、蔗糖20-30g/L、琼脂6-8g/L，pH值为5.6-5.8。
3.高效诱导哥伦比亚型拟南芥愈伤组织的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)按照权利要求1或2任一所述的配方配置诱导培养基；
2)外植体预处理及接种，在超净工作台上，用镊子将生长良好的无菌实生拟南芥用解剖刀切下叶片，并将切下的叶片置于步骤1)中配置的诱导培养基中；
3)愈伤组织的诱导，将步骤2)中接种好拟南芥子叶的诱导培养基置于温室中，温室培养温度为24-26℃、湿度为50-70％、光照强度为1500-2000lux、光照时间为16h，培养7-10天后获得淡黄色、颗粒状的愈伤组织团块。
4.按照权利要求3所述的高效诱导哥伦比亚型拟南芥愈伤组织的方法，其特征在于，还包括增殖步骤，将培养10-15天后的愈伤组织在超净工作台上用镊子剔除老化部分，挑取部分愈伤组织接种到新的所述诱导培养基上，在一个培养基上接种多次并置于温室中培养，培养温度为24-26℃、湿度为50-70％、光照强度为1500-2000lux、光照时间为16h，培养10-15天后，即获得大量淡黄色、颗粒状的愈伤组织。
5.按照权利要求3或4任一所述的高效诱导哥伦比亚型拟南芥愈伤组织的方法，其特征在于，所述生长良好的无菌实生拟南芥的培养方法包括如下步骤：
a)拟南芥种子消毒，在无菌超净台上，将哥伦比亚型拟南芥种子置于离心管中，首先用体积分数75％的乙醇消毒30-60s后,使用灭菌水清洗一次，再使用体积分数11％的次氯酸钠振荡消毒10-15min，最后用灭菌水洗3-5次；
b)生长培养基的配制，以MS培养基为基本培养基，成分包括MS粉2.2-4.4g/L、MES 0.5-1g/L、蔗糖20-30g/L、琼脂6-8g/L，pH值为5.6-5.8；
c)哥伦比亚型拟南芥的培养，将消毒完成的种子点于所述生长培养基上，置于4℃冰箱春化2-3d后移到温室中，温室培养温度为24-26℃、湿度为50-70％、光照强度为1500-2000lux、光照时间为16h，9-10d后获得哥伦比亚型拟南芥无菌实生苗。
6.按照权利要求3或4任一所述的高效诱导哥伦比亚型拟南芥愈伤组织的方法，其特征在于，诱导所选的所述无菌实生拟南芥为已长出两片完整叶子的拟南芥。
7.按照权利要求3或4任一所述的高效诱导哥伦比亚型拟南芥愈伤组织的方法，其特征在于，用解剖刀切下拟南芥叶片时，切割位置在距两片叶子结合处0.1cm的叶柄上。
8.按照权利要求3或4任一所述的高效诱导哥伦比亚型拟南芥愈伤组织的方法，其特征在于，将拟南芥叶片接种到所述诱导培养基中时，叶面朝下接种。
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