CN106190934A - 一种生产普鲁兰酶的重组枯草芽孢杆菌及其构建 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种生产普鲁兰酶的重组枯草芽孢杆菌及其构建，属于微生物发酵生产普鲁兰酶的技术领域。本发明将长野芽孢杆菌CCTCC NO：M 2012388普鲁兰酶基因pul插入到穿梭载体pMA0911中，并将得到的重组质粒体pMA0911‑PHpaII‑pul电转化B.subtilis WB800构建出重组菌B.subtilis WB800/pMA0911‑PHpaII‑pul，其胞外普鲁兰酶活性为39.6U/mL。通过使用强启动子P43替换原有启动子PHpaII，重组菌B.subtilis WB800/pMA0911‑P43‑pul胞外酶活提高到87.3U/mL；将构建的重组质粒pMA0911‑PHpaII‑pul和pMA0911‑P43‑pul转化宿主菌B.subtilis WB600，得到的重组菌B.subtilis WB600/pMA0911‑PHpaII‑pul和B.subtilis WB600/pMA0911‑P43‑pul的胞外酶活分别达到213.5U/mL和245.7U/mL。
Description
技术领域
本发明涉及一种生产普鲁兰酶的重组枯草芽孢杆菌及其构建，属于微生物发酵生产普鲁兰酶的技术领域。
背景技术
普鲁兰酶(pullulanase，EC 3.2.1.1.41)又名支链淀粉6-葡聚糖水解酶，是一类能够以内切方式专一性水解支链淀粉分支点中的α-1,6糖苷键，从而切下整个分支结构，使其形成直链淀粉的淀粉脱支酶。普鲁兰酶能分解支链的特性使其在淀粉糖化过程中，可以和α-淀粉酶、β-淀粉酶等糖化酶共同使用，将最小单位的支链切开，从而提高淀粉利用率，加速糖化过程，提高产品质量并减少淀粉酶的使用总量，据报道在淀粉糖化过程中添加普鲁兰酶，能够使淀粉糖的转化率DE值提高到97％以上。因此，普鲁兰酶在以淀粉为原料的食品加工行业有着重要的用途和良好的市场前景。随着生物技术的发展，普鲁兰酶已经应用于环糊精，医药生产以及烘焙等行业中。
目前已发现多种产普鲁兰酶的微生物，但大部分都无法应用于工业生产，主要原因有：1)由于淀粉的糖化过程要求糖化酶在55-65℃，pH 4.5-5.5的条件下稳定，尽管有很多微生物来源的普鲁兰酶被发现，但是最适温度和最适pH满足糖化反应所需条件的普鲁兰酶种类很少；2)野生菌中普鲁兰酶的表达量较低，不能满足工业应用；3)尽管有研究实现了普鲁兰酶在大肠杆菌胞外的大量表达，但是作为革兰氏阴性菌，大肠杆菌细胞壁中存在内毒素，对食品安全存在威胁。目前国际上能够实现工业化生产普鲁兰酶的公司仅有丹麦的Novo公司和美国Genencor公司，其中Novo公司生产的普鲁兰酶占据了中国乃至世界95％以上的市场份额。利用基因工程技术，通过选择合适的宿主、表达载体、并结合启动子和信号肽等的分子优化，使目的蛋白在优化的异源系统中得到更高水平的表达，是一种有效提高普鲁兰酶表达水平的方法。随着基因工程应用于普鲁兰酶的研究中，很多普鲁兰酶基因在大肠杆菌、毕赤酵母等宿主中得到异源表达。2006年，Xu等人在P.pastoris中成功表达了B.naganoensis来源的普鲁兰酶。Nie等人将该酶在大肠杆菌表达系统中利用自诱导培养基得到了大量表达，且通过在培养基中补加0.6％甘氨酸，大部分的普鲁兰酶被分泌到胞外。尽管目前的研究结果显示，普鲁兰酶在大肠杆菌中得到了大量的表达，但在实际工业应用中尤其是应用到淀粉的食品加工行业，大肠杆菌细胞壁中含有被认为是内毒素的脂多糖(LPS)，对产品的安全性产生威胁。因此，将具有优良特性的普鲁兰酶在公认安全(GRAS)的枯草芽孢杆菌中进行有效表达，在工业应用中将具有更重要的价值和意义。
发明内容
为了解决上述问题，本发明利用基因工程技术，构建了适用于普鲁兰酶表达分泌的枯草芽孢杆菌重组菌，并通过对重组菌的启动子和宿主进行优化，从而有效提高胞外普鲁兰酶的表达量，为解决国内对进口普鲁兰酶的依赖问题提供有价值的菌株。
本发明首先构建表达长野芽孢杆菌(Bacillus naganoensis)CCTCC M 2012388普鲁兰酶基因的重组枯草芽孢杆菌，将来源于长野芽孢杆菌的普鲁兰酶基因在枯草芽孢杆菌中进行重组分泌表达，在此基础上，通过使用强组成型启动子P43和宿主菌B.subtilisWB600分别替换原始启动子PHpaII和宿主菌B.subtilis WB800，有效提高了重组枯草芽孢杆菌生产胞外普鲁兰酶的能力。
本发明的第一个目的是提供一种胞外分泌耐酸耐热普鲁兰酶的重组枯草芽孢杆菌，所述重组枯草芽孢杆菌以B.subtilis WB800或者B.subtilis WB600为宿主，以质粒pMA0911或者将质粒pMA0911中的启动子PHpaII用P43启动子替换后得到的重组质粒为载体，表达长野芽孢杆菌(B.naganoensis)CCTCC M 2012388来源的普鲁兰酶基因pul。
在本发明的一种实施方式中，普鲁兰酶基因pul受启动子PHpaII或者P43调控。
在本发明的一种实施方式中，所述重组枯草芽孢杆菌以B.subtilis WB600为宿主构建得到的。
在本发明的一种实施方式中，所述重组枯草芽孢杆菌以B.subtilis WB600为宿主，以将质粒pMA0911中的启动子PHpaII用P43启动子替换后得到的重组质粒为载体，表达CCTCC M2012388来源的普鲁兰酶基因pul。
在本发明的一种实施方式中，所述CCTCC M 2012388来源的普鲁兰酶基因pul的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
在本发明的一种实施方式中，所述CCTCC M 2012388来源的普鲁兰酶基因pul的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明的第二个目的是提供一种提高CCTCC M 2012388来源的普鲁兰酶基因pul在枯草芽孢杆菌中分泌表达的方法，所述方法是构建重组枯草芽孢杆菌B.subtilisWB600/pMA0911-PHpaII-pul或者B.subtilisWB600/pMA0911-P43-pul，以重组枯草芽孢杆菌为生产菌株分泌表达普鲁兰酶。
在本发明的一种实施方式中，所述B.subtilis WB600/pMA0911-PHpaII-pul是以B.subtilis WB600为宿主，以质粒pMA0911为载体，表达氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的普鲁兰酶基因pul。
在本发明的一种实施方式中，所述B.subtilis WB600/pMA0911-P43-pul是以B.subtilis WB600为宿主，以将质粒pMA0911中的启动子PHpaII用P43启动子替换后得到的重组质粒为载体，表达氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的普鲁兰酶基因pul。
本发明还要求保护所述重组枯草芽孢杆菌及其所产的普鲁兰酶的应用。
所述应用，包括在以淀粉为原料的食品加工行业的应用。
所述应用，是应用于环糊精，医药生产以及烘焙等行业中。
本发明的有益效果：
(1)本发明不仅将具有优良的耐酸耐热性能的长野芽孢杆菌普鲁兰酶基因在枯草芽孢杆菌中获得重组分泌表达，而且通过优化启动子和宿主菌的策略有效提高了重组枯草芽孢杆菌生产胞外普鲁兰酶的能力，为解决国内对进口普鲁兰酶的依赖问题提供有价值的菌株，同时也为枯草芽孢杆菌有效表达其他外源蛋白提供了思路。
(2)成功扩增了长野芽孢杆菌(Bacillus naganoensis)CCTCC NO：M 2012388普鲁兰酶编码基因pul，并将其克隆到穿梭载体pMA0911上，将构建的重组表达载体pMA0911-PHpaII-pul电转化B.subtilis WB800，从而构建出重组菌B.subtilis WB800/pMA0911-PHpaII-pul且发酵50h后重组菌的胞外普鲁兰酶活性为39.6U/mL。
通过使用强启动子P43替换原有启动子PHpaII，重组菌B.subtilisWB800/pMA0911-P43-pul胞外酶活提高到87.3U/mL，是原始菌株的2.2倍；将构建的重组质粒pMA0911-PHpaII-pul和pMA0911-P43-pul转化宿主菌B.subtilis WB600，得到的重组菌B.subtilis WB600/pMA0911-PHpaII-pul和B.subtilis WB600/pMA0911-P43-pul的胞外酶活分别达到213.5U/mL和245.7U/mL，分别是原始菌株的5.4和6.2倍，说明P43启动子和宿主菌B.subtilis WB600更适合普鲁兰酶的有效表达。枯草芽孢杆菌普鲁兰酶表达系统的构建和优化过程不仅成功提高了普鲁兰酶的胞外表达，为解决国内普鲁兰酶的实际问题提供有价值的菌株，也为枯草系统有效表达其他外源蛋白提供了思路。
具体实施方式
(1)普鲁兰酶测定方法
将得到的发酵液上清液进行适当稀释后测定胞外普鲁兰酶活性，测定方法如下：在冰水浴中向具塞刻度试管中加入适当稀释的发酵上清液200μL，再加入由乙酸-乙酸钠缓冲液(pH4.5)配制的2％底物普鲁兰200μL，于60℃水浴中反应20min后，立刻放入冰水浴中冷却。对照组的处理方法为在60℃反应前只加酶液200μL，不加底物普鲁兰，反应后再于冰水浴中补加200μL底物。然后，向冷却后的每管反应混合液中加入DNS试剂600μL，并于沸水浴中反应5min后立刻转移到冰水浴中快速冷却。最后，向每管反应液中再补加3mL去离子水，混匀后取200μL加入多孔细胞培养板中，用酶标仪测定每管反应液的OD540。酶活单位定义：在上述指定的条件下，每分钟催化分解普鲁兰多糖生成相当于1μmol葡萄糖的还原糖所需的酶为1个酶活单位(U)。
(2)pMA0911是可购买得到的大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体，比如2013年江南大学硕士毕业论文《特基拉芽孢杆菌β-1,3-1,4-葡聚糖酶的异源表达及其性质研究》中有提及。
(3)长野芽孢杆菌(Bacillus naganoensis)CCTCC NO：M 2012388，是已有的生物材料，比如公开号为CN103555751A的发明专利申请CN201310505664.9中有提及。
实施例1：普鲁兰酶基因pul的获得
长野芽孢杆菌(Bacillus naganoensis)CCTCC M 2012388培养基：CaCl2 0.25g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，(NH4)2SO4 0.2g/L，酵母提取物2g/L，无水葡萄糖5g/L，KH2PO43g/L，无机盐溶液1mL/L，用双蒸水配制，pH 5.0。无机盐溶液：ZnSO4·7H2O 0.1g/L，MnCl2·H2O0.03g/L，H3BO3 0.3g/L，CoCl2·6H2O 0.2g/L，CuCl2·2H2O 0.01g/L，NiCl2·6H2O 0.02g/L，Na2MoO4·2H2O 0.03g/L。
将长野芽孢杆菌菌种接种于含有25mL培养基的250mL摇瓶中，于37℃、200rpm振荡培养72h。培养结束后，将菌体离心并用生理盐水洗涤两次，收集细胞利用基因组DNA提取试剂盒Genomic DNAExtraction Miniprep System(VIOGENE公司)提取基因组DNA。
合成引物1：5’-CGGAATTCGATGGGAACACCACAAACAT-3’(序列如SEQ ID NO.3)，
合成引物2：5’-CGGGATCCCTATTTACCATCAGATGGGCT-3’(序列如SEQ ID NO.4)。
引物1含有EcoRI限制性酶切位点，引物2含有BamHI限制性酶切位点。
PCR反应体系：ddH2O 22μL，引物1(100pmol/μL)1μL，引物2(100pmol/μL)1μL，基因组DNA 1μL，HS(Premix)25μL。
以CCTCC NO：M 2012388基因组DNA为模板，采用PCR方法扩增普鲁兰酶基因。PCR反应过程：98℃预变性30s；98℃变性10s、58℃退火15s、72℃延伸2min 30s，进行30个循环；72℃延伸10min。
利用试剂盒BioSpin PCRPurification Kit(Bioflux公司)纯化DNA片断，纯化所得普鲁兰酶基因pul立即使用或-20℃保存。
实施例2：重组枯草芽孢杆菌B.subtilis WB800/pMA0911-PHpaII-pul的构建
(1)目的基因pul及质粒pMA0911的双酶切
利用质粒提取试剂盒Plasmid Mini Kit(OMEGA BIO-TEK公司)提取质粒pMA0911。
按照水、缓冲液、PCR产物或质粒DNA、限制性内切酶的顺序加到Eppendorf管中，盖好管盖，轻轻混匀后，置于离心机内离心30s使液体集中于管底，37℃水浴3h，在管中加入1/10的Loading Buffer或将管置于65℃保温10min，终止酶切反应。酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳分析并使用胶回收试剂盒Gel extraction Kit(OMEGA BIO-TEK公司)回收目的片段，进行适当浓缩。
酶切反应体系组成：10×K Buffer 10μL，基因组DNA 80μL，限制性内切酶EcoRI2.5μL，限制性内切酶BamHI 2.5μL，ddH2O将体系补足100μL。
(2)目的基因pul与质粒pMA0911的连接
将目的基因pul与质粒pMA0911连接，反应体系组成如下：质粒pMA0911 3μL，目的基因pul 5μL，10×Buffer 1μL，T4 DNA连接酶1μL。混合连接液，将其置于16℃培养箱中连接反应12-16h，得重组质粒pMA0911-PHpaII-pul。
(3)重组质粒pMA0911-PHpaII-pul转化克隆宿主大肠杆菌E.coli JM109
在100μL大肠杆菌E.coli JM109感受态细胞悬液中加入10μL重组质粒pMA0911-PHpaII-pul，轻轻混匀，冰浴中静置30min。转入42℃水浴中，热击90s。快速转移至冰浴中，冷却2min。加入890μL的LB液体培养基，37℃、100rpm摇床温育培养1h。培养后菌液4000rpm离心2min，弃上清800μL，剩余菌液混匀后涂布到含有100μg/mL氨苄青霉素的LB平板上，37℃倒置培养过夜。获得含有重组质粒pMA0911-PHpaII-pul的重组菌E.coli JM109/pMA0911-PHpaII-pul。
利用质粒提取试剂盒Plasmid Mini Kit(OMEGA BIO-TEK公司)提取质粒pMA0911-PHpaII-pul。
(4)重组质粒pMA0911-PHpaII-pul电转化B.subtilis WB800
在分装的100μL B.subtilis WB800感受态细胞中加入10μL质粒，冰上孵育2min后加入预冷的2mm电转杯中，电击一次(电转仪设置：2500V，电容25μF，电阻200Ω)，电转常数为5.0ms，电击完毕后，取出电转杯并立即加入1mL RM培养基，于37℃，150rpm条件下复苏3h后涂布到含有50μg/mL卡那霉素的固体LB平板上，于37℃倒置培养过夜，获得含有目的普鲁兰酶基因pul的重组菌B.subtilisWB800/pMA0911-PHpaII-pul。
实施例3：启动子优化
(1)P43启动子的基因合成
在NCBI中搜索到P43启动子序列(GenBank：EF473728.1)426bp，并在合成基因的两侧引进了单酶切位点BstxI和EcoRI，将需要合成的序列送到上海生工生物工程有限公司进行基因合成，合成的基因片段克隆在菌株E.coil DH5α/pUC57-P43中。
利用质粒提取试剂盒Plasmid Mini Kit(OMEGA BIO-TEK公司)分别从菌株E.coilDH5α/pUC57-P43和E.coli JM109/pMA0911-PHpaII-pul中提取质粒pUC57-P43和pMA0911-PHpaII-pul。
(2)质粒pUC57-P43及质粒pMA0911-PHpaII-pul的双酶切
按照水、缓冲液、质粒pUC57-P43或者质粒pMA0911-PHpaII-pul、限制性内切酶EcoRI和BstXI(NEB公司)的顺序加到Eppendorf管中，盖好管盖，轻轻混匀后，置于离心机内离心30s使液体集中于管底，37℃水浴3h，在管中加入1/10的Loading Buffer或将管置于65℃保温10min，终止酶切反应。酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳分析并使用胶回收试剂盒Gelextraction Kit(OMEGA BIO-TEK公司)回收目的片段，进行适当浓缩。
酶切反应体系组成：10×EcoRI Buffer 10μL，质粒pUC57-P43或者质粒pMA0911-PHpaII-pul80μL，限制性内切酶EcoRI 2.5μL，限制性内切酶BstXI 2.5μL，ddH2O将体系补足100μL。
(3)质粒片段pMA0911-pul与P43启动子的连接
将质粒片段pMA0911-pul和P43启动子片段连接，反应体系组成如下：质粒pMA0911-pul4μL，P43启动子片段4μL，10×Buffer 1μL，T4 DNA连接酶1μL。混合连接液，将其置于16℃培养箱中连接反应12-16h，得重组质粒pMA0911-P43-pul(仅仅是启动子P43取代pMA0911质粒中的原启动子PHpaII)。
(4)重组质粒重组质粒pMA0911-P43-pul转化克隆宿主大肠杆菌E.coli JM109
在100μL大肠杆菌E.coli JM109感受态细胞悬液中加入10μL重组质粒pMA0911-P43-pul，轻轻混匀，冰浴中静置30min。转入42℃水浴中，热击90s。快速转移至冰浴中，冷却2min。加入890μL的LB液体培养基，37℃、100rpm摇床温育培养1h。培养后菌液4000rpm离心2min，弃上清800μL，剩余菌液混匀后涂布到含有100μg/mL氨苄青霉素的LB平板上，37℃倒置培养过夜。获得含有重组质粒pMA0911-P43-pul的重组菌E.coli JM109/pMA0911-P43-pul。
利用质粒提取试剂盒Plasmid Mini Kit(OMEGA BIO-TEK公司)提取质粒pMA0911-P43-pul。
(5)重组质粒pMA0911-P43-pul电转化B.subtilis WB800
在分装的100μL B.subtilis WB800感受态细胞中加入10μL质粒，冰上孵育2min后加入预冷的2mm电转杯中，电击一次(电转仪设置：2500V，电容25μF，电阻200Ω)，电转常数为5.0ms，电击完毕后，取出电转杯并立即加入1mL RM培养基，于37℃，150rpm条件下复苏3h后涂布到含有50μg/mL卡那霉素的固体LB平板上，于37℃倒置培养过夜，获得载有P43启动子的重组菌B.subtilis WB800/pMA0911-P43-pul。
实施例4：宿主菌优化
利用质粒提取试剂盒Plasmid Mini Kit(OMEGA BIO-TEK公司)提取质粒pMA0911-PHpaII-pul和质粒pMA0911-P43-pul。
重组质粒pMA0911-P43-pul和pMA0911-P43-pul电转化B.subtilis WB600
在分装的100μL B.subtilis WB600感受态细胞中加入10μL质粒，冰上孵育2min后加入预冷的2mm电转杯中，电击一次(电转仪设置：2500V，电容25μF，电阻200Ω)，电转常数为5.0ms，电击完毕后，取出电转杯并立即加入1mL RM培养基，于37℃，150rpm条件下复苏3h后涂布到含有50μg/mL卡那霉素的固体LB平板上，于37℃倒置培养过夜，获得重组菌株B.subtilis WB600/pMA0911-PHpaII-pul和B.subtilis WB600/pMA0911-P43-pul。
实施例5：重组枯草芽孢杆菌产胞外普鲁兰酶
发酵培养基：10g/L蛋白胨，5g/L酵母膏，10g/L氯化钠，10g/L可溶性淀粉，pH7.0。需要时使用前加入卡那霉素(50μg/mL)。
LB培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，pH7.0。需要时使用前加入卡那霉素(50μg/mL)，固体培养基添加20g/L琼脂粉。
将构建的重组菌B.subtilis WB800/pMA0911-PHpaII-pul、B.subtilis WB800/pMA0911-P43-pul、B.subtilis WB600/pMA0911-PHpaII-pul和B.subtilis WB600/pMA0911-P43-pul分别于含有50μg/mL卡那霉素的LB固体培养基上划线，过夜活化培养，从固体平板上分别挑取各重组菌的单个菌落接种于3mL含有50μg/mL卡那霉素的液体LB培养基中于37℃、200rpm的条件下振荡培养过夜。种子液以1％接种量转接至100mL(500mL的三角瓶)含50μg/mL卡那霉素的发酵培养基中，并在37℃、200rpm振荡发酵培养50h。培养结束后，将发酵液于10000rpm离心10min后得发酵上清液用于菌株胞外酶活的测定。
结果如表1所示。结果显示，使用PHpaII启动子和WB800宿主的重组菌的胞外普鲁兰酶活性为39.6U/mL、使用P43启动子和WB800宿主的重组菌的胞外普鲁兰酶活性为87.3U/mL、使用PHpaII启动子和WB600宿主的重组菌的胞外普鲁兰酶活性达到213.5U/mL、使用P43启动子和宿主菌B.subtilis WB600后的重组菌的胞外普鲁兰酶活性达到245.7U/mL。
表1四株重组菌产普鲁兰酶胞外酶活的比较
此外，发明人还尝试了其他的载体、启动子构建的重组菌，并检测了在于本发明相同的条件下发酵产普鲁兰酶的胞外酶活的情况。结果如表2所示。
表2不同载体、启动子构建得到的重组菌的产普鲁兰酶胞外酶活的比较
综上，本发明通过采用合适的宿主、载体、启动子，提高了重组菌对CCTCC M2012388来源的普鲁兰酶基因pul的表达效果。其中重组菌B.subtilis WB800/pMA0911-P43-pul、重组菌B.subtilis WB600/pMA0911-PHpaII-pul和B.subtilis WB600/pMA0911-P43-pul的胞外酶活分别达到87.3U/mL、213.5U/mL和245.7U/mL，分别是原始菌株B.subtilis WB800/pMA0911-PHpaII-pul的2.2、5.4和6.2倍。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (10)
1.一种胞外分泌耐酸耐热普鲁兰酶的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述重组枯草芽孢杆菌以B.subtilis WB800或者B.subtilis WB600为宿主，以质粒pMA0911或者将质粒pMA0911中的启动子PHpaII用P43启动子替换后得到的重组质粒为载体，表达长野芽孢杆菌(B.naganoensis)CCTCC M 2012388来源的普鲁兰酶基因pul。
2.根据权利要求1所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述普鲁兰酶基因pul受启动子PHpaII或者P43调控。
3.根据权利要求1所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述重组枯草芽孢杆菌以B.subtilis WB600为宿主构建得到的。
4.根据权利要求1所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述重组枯草芽孢杆菌以B.subtilis WB600为宿主，以将质粒pMA0911中的启动子PHpaII用P43启动子替换后得到的重组质粒为载体，表达CCTCC M 2012388来源的普鲁兰酶基因pul。
5.根据权利要求1所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述CCTCC M 2012388来源的普鲁兰酶基因pul的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
6.权利要求1-5任一所述的重组枯草芽孢杆菌的应用。
7.权利要求1-5任一所述的重组枯草芽孢杆菌生产得到的普鲁兰酶的应用。
8.一种提高CCTCC M 2012388来源的普鲁兰酶基因pul在枯草芽孢杆菌中分泌表达的方法，其特征在于，所述方法是构建重组枯草芽孢杆菌B.subtilis WB600/pMA0911-PHpaII-pul或者B.subtilis WB600/pMA0911-P43-pul，以重组枯草芽孢杆菌为生产菌株分泌表达普鲁兰酶。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述B.subtilis WB600/pMA0911-PHpaII-pul是以B.subtilis WB600为宿主，以质粒pMA0911为载体，表达氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的普鲁兰酶基因pul。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述B.subtilis WB600/pMA0911-P43-pul是以B.subtilis WB600为宿主，以将质粒pMA0911中的启动子PHpaII用P43启动子替换后得到的重组质粒为载体，表达氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的普鲁兰酶基因pul。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20161207 |