CN106084043B - 一种ZnT8特异性单链抗体scFv‑C22及其应用 - Google Patents
一种ZnT8特异性单链抗体scFv‑C22及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN106084043B CN106084043B CN201610520742.6A CN201610520742A CN106084043B CN 106084043 B CN106084043 B CN 106084043B CN 201610520742 A CN201610520742 A CN 201610520742A CN 106084043 B CN106084043 B CN 106084043B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- znt8
- scfv
- antibody
- specific single
- seq
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 29
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 6
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 6
- 206010067584 Type 1 diabetes mellitus Diseases 0.000 abstract description 36
- 241000486679 Antitype Species 0.000 abstract description 11
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 abstract description 10
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 abstract description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 2
- 230000009182 swimming Effects 0.000 description 28
- -1 amino carboxyl Chemical group 0.000 description 15
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 13
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 13
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 description 12
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 11
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 11
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 10
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 9
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 7
- 238000011160 research Methods 0.000 description 7
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 6
- 108010021466 Mutant Proteins Proteins 0.000 description 6
- 102000008300 Mutant Proteins Human genes 0.000 description 6
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 6
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 6
- 238000000034 method Methods 0.000 description 6
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 6
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 5
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 5
- 238000009739 binding Methods 0.000 description 5
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 5
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 5
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 5
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 4
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 4
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 210000000227 basophil cell of anterior lobe of hypophysis Anatomy 0.000 description 4
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 4
- 210000004153 islets of langerhan Anatomy 0.000 description 4
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 4
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 4
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 4
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 4
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 4
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 4
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 4
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 4
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- PTFCDOFLOPIGGS-UHFFFAOYSA-N Zinc dication Chemical compound [Zn+2] PTFCDOFLOPIGGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091006550 Zinc transporters Proteins 0.000 description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 238000013461 design Methods 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 3
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 3
- 102200096326 rs761839638 Human genes 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- OOIBFPKQHULHSQ-UHFFFAOYSA-N (3-hydroxy-1-adamantyl) 2-methylprop-2-enoate Chemical compound C1C(C2)CC3CC2(O)CC1(OC(=O)C(=C)C)C3 OOIBFPKQHULHSQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 6-methoxy-1,2,3,4-tetrahydroquinoline Chemical compound N1CCCC2=CC(OC)=CC=C21 FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 2
- 102000008214 Glutamate decarboxylase Human genes 0.000 description 2
- 108091022930 Glutamate decarboxylase Proteins 0.000 description 2
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 2
- 206010057249 Phagocytosis Diseases 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 206010042566 Superinfection Diseases 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 230000005611 electricity Effects 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 230000000799 fusogenic effect Effects 0.000 description 2
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 2
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 2
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000008782 phagocytosis Effects 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 description 2
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- DWNBOPVKNPVNQG-LURJTMIESA-N (2s)-4-hydroxy-2-(propylamino)butanoic acid Chemical compound CCCN[C@H](C(O)=O)CCO DWNBOPVKNPVNQG-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 102100023374 Forkhead box protein M1 Human genes 0.000 description 1
- 101000911390 Homo sapiens Coagulation factor VIII Proteins 0.000 description 1
- 101000907578 Homo sapiens Forkhead box protein M1 Proteins 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 241000712431 Influenza A virus Species 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 1
- 229920002594 Polyethylene Glycol 8000 Polymers 0.000 description 1
- 108091006556 SLC30A8 Proteins 0.000 description 1
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 1
- 239000000370 acceptor Substances 0.000 description 1
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 1
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 206010064097 avian influenza Diseases 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 102000057593 human F8 Human genes 0.000 description 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 1
- 230000009610 hypersensitivity Effects 0.000 description 1
- 230000002998 immunogenetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 230000002055 immunohistochemical effect Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 230000010189 intracellular transport Effects 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L magnesium chloride Substances [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 238000005374 membrane filtration Methods 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 210000004923 pancreatic tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 230000009465 prokaryotic expression Effects 0.000 description 1
- 229940047431 recombinate Drugs 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 102000035160 transmembrane proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091005703 transmembrane proteins Proteins 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
- C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
- C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Immunology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明公开了一种抗1型糖尿病ZnT8特异性单链抗体scFv‑C22及其应用。所述的抗1型糖尿病ZnT8特异性单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，其编码基因序列如SEQ ID NO.6所示。本发明成功构建了T1D scFv噬菌体库，筛选并鉴定了ZnT8特异性scFv，该ZnT8特异性scFv可用于1型糖尿病诊断、治疗和/或预后判断试剂的制备。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，涉及一种抗1型糖尿病ZnT8特异性单链抗体scFv-C22及其应用。
背景技术
锌转运体(ZnT)是一组将锌离子由胞内转运出胞外的跨膜蛋白，与ZIP家族蛋白共同维护细胞内外锌离子的平衡。2004年，Cheimienti等首次在ZnT家族中发现ZnT8蛋白，它由SLC30A8基因编码，高度特异的表达在胰腺中，后进一步研究发现ZnT8特异的表达在胰岛β细胞上，在INS-1细胞中过表达ZnT8可促使锌离子的聚集并增强糖刺激后的胰岛素释放。这些研究表明ZnT8在胰岛素的合成和分泌中发挥重要作用。
1型糖尿病(T1D)是由T淋巴细胞介导，以选择性破坏胰岛β细胞为特征的器官特异性自身免疫性疾病。胰岛β细胞上存在着多种自身抗原，如胰岛素，谷氨酸脱羧酶(GAD)，酪氨酸磷酸酶和ZnT8。其中，ZnT8被认为是T1DM的一个重要的自身抗原，Wenzlau等发现部分T1D高危患者发病前2年即可检测到ZnT8自身抗体且长期维持在较高水平。我们前期研究发现ZnT8存在着多个抗原表位可被1型糖尿病患者自身反应性T细胞识别，且ZnT8抗体水平与T1D的发展存在着显著相关性。早期检测ZnT8抗体和ZnT8特异性CD8+T细胞是预测和诊断T1D的重要手段。针对ZnT8靶点的特异性治疗将成为阻止T1D进展的潜在方法。
抗体研究迄今已有100多年历史，1975年Kohler和Milstein创立B淋巴细胞杂交瘤技术，鼠源单克隆抗体被广泛应用于疾病的诊断和治疗，但由于鼠源单克隆抗体对人体有免疫原性，易产生人抗鼠抗体反应(human anti-mouse antibody，HAMA和超敏反应，且由于其分子量较大，难以穿膜等缺点，限制了其在疾病治疗领域的应用。自20世纪八十年代中期，随着分子生物学的技术进展，国外学者建立了噬菌体抗体库技术。由于噬菌体表达的scFv抗体分子量较小，仅为完整抗体分子的六分之一，且具有较好的血管或组织屏障穿透性、半衰期短、结构稳定、不含Fc段，减少了与体内Fc受体结合而带来的不利影响等优势，已广泛地应用于分子生物学及免疫学、药理学等医学领域，是目前的研究热点。但目前尚未见抗1型糖尿病ZnT8特异性单链抗体的相关报道。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种抗1型糖尿病ZnT8特异性单链抗体。
本发明的另一目的是提供该单链抗体的应用。
本发明的目的可通过以下技术方案实现：
抗1型糖尿病ZnT8特异性单链抗体scFv-C22，包括轻链和重链，
所述的轻链的可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
所述的重链的可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；
所述的抗1型糖尿病ZnT8特异性单链抗体scFv-C22的氨基酸序列优选如SEQ IDNO.5所示。
一种编码本发明所述的抗1型糖尿病ZnT8特异性单链抗体scFv-C22的基因，其中，
编码轻链的可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
编码重链的可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
编码本发明所述的抗1型糖尿病ZnT8特异性单链抗体scFv-C22的基因的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.6所示。
本发明所述的抗1型糖尿病ZnT8特异性单链抗体scFv-C22在制备1型糖尿病诊断、治疗和/或预后判断试剂中的应用。
本发明所述的编码编码权利要求1所述的抗1型糖尿病ZnT8特异性单链抗体scFv-C22的基因在制备1型糖尿病诊断、治疗和/或预后判断试剂中的应用。
有益效果：
本发明首次从T1D病人外周血基因中构建了一个库容达1×108的scFv噬菌体抗体库。我们招募了50例初发的T1D患者以保证库的特异性、多样性和代表性。从该库中，我们可以筛选T1D的各种自身抗体。
ZnT8抗原是T1D的重要自身抗原，具有六次跨膜结构，它由SCL30A8基因编码，定位于人第8号染色体q24.11上，包含8个外显子，编码369个氨基酸。ZnT8自身抗体在T1D的发生发展中发挥了重要作用。目前，ZnT8蛋白的氨基末端(1-74aa)和羧基末端(268-369aa)被认为是自身反应性T细胞识别的主要区域。由于ZnT8蛋白影响着胰岛素的合成与分泌，所以对其抗体作用机制的深了解对治疗T1D具有重大意义。本发明成功筛选了ZnT8特异性scFv。为保证筛选结果的多样性，我们选择了ZnT8蛋白的氨基羧基融合肽进行scFv的筛选。已经有大量报道发现T1D患者中ZnT8抗原325位氨基酸存在着点突变，由精氨酸(Arg)突变为酪氨酸(Trp),该位点突变与ZnT8抗体的识别密切相关，ZnT8羧基末端的突变二聚体(Arg325Trp)对检测ZnT8抗体具有高度的特异性和敏感性。所以我们进一步使用ZnT8羧基末端的二聚体(Arg325Trp)鉴定了scFv，结果表明scFv-C22能与该二聚体结合。免疫组化结果进一步显示scFv能特异性识别胰岛细胞，具有良好的生物学活性。
本发明成功构建了T1D scFv噬菌体库，筛选并鉴定了ZnT8特异性scFv，该ZnT8特异性scFv可用于1型糖尿病诊断、治疗和/或预后判断试剂的制备。
附图说明
图1.重组ZnT8基因构建.M:核酸标准品；泳道1:ZnT8氨基末端基因(1-74aa)约250bp；泳道2:ZnT8羧基末端基因(268-369aa)约350bp；泳道3:ZnT8氨基羧基融合基因(1-74aa,268-369aa)约550bp；泳道4:ZnT8羧基端二聚突变体基因(Arg325Trp)约650bp。图2.重组ZnT8蛋白的表达纯化及鉴定.
A:ZnT8氨基羧基融合蛋白的Western blotting检测(泳道1:蛋白纯化前；泳道2:纯化后的蛋白；泳道3:流穿)；B:ZnT8氨基羧基融合蛋白的SDS-PAGE检测(M:蛋白标准品；泳道1:蛋白纯化前；泳道2:纯化后的蛋白；泳道3:流穿)；C:ZnT8羧基端二聚突变体蛋白Western blotting检测(泳道1:蛋白纯化前；泳道2:纯化后的蛋白；泳道3:流穿)；D:ZnT8羧基端二聚突变体蛋白SDS-PAGE检测(M:蛋白标准品；泳道1:蛋白纯化前；泳道2:纯化后的蛋白；泳道3:流穿)。
ZnT8氨基羧基融合蛋白和羧基端二聚突变体蛋白分子量分别约20kD和25kD。
图3.ELISA检测氨基羧基融合蛋白与商品化ZnT8抗体的结合能力。
图4.T1D scFv基因扩增.M:核酸标准品；泳道1:VλPCR产物(～350bp)；泳道2:VκPCR产物(～350bp)；泳道3:VH PCR产物(～450bp)；泳道4:scFv PCR产物(～800bp)。
图5.scFv-C22的纯化及鉴定.
A.SDS-PAGE检测scFv(M:蛋白标准品；泳道1:scFv-C22纯化前；泳道2:纯化后的scFv-C22；泳道3:scFv-C22流穿。)；B.Western blotting analyze检测scFv(泳道1:scFv-C22纯化前；泳道2:纯化后的scFv-C22；泳道3:scFv-C22流穿)。
图6.Western blotting检测scFv与ZnT8氨基羧基融合蛋白的结合能力.
泳道1:scFv-C22检测ZnT8氨基羧基融合蛋白；泳道2:阴性对照。
图7.scFv-C22与ZnT8氨基羧基融合蛋白的亲和力检测。
图8.ELISA检测scFv-C22对ZnT8羧基端二聚突变体蛋白的结合能力。
图9.免疫组化检测scFv抗体对人胰腺组织的识别能力
A:胰岛细胞HE染色结果；B:C22检测胰岛细胞结果。行1:放大40倍；行2:放大200倍.
具体实施方式
实施例1重组ZnT8原核表达质粒的构建与表达
设计引物ZF和LR(表1)，以ZnT8质粒(购自北京义翘神州生物技术有限公司,HG11621-M)为模板，扩增人ZnT8氨基末端(1-74aa)基因，设计引物LF和CR(表1)，以ZnT8质粒为模板，扩增人ZnT8羧基末端(269-368aa)基因,，PCR产物胶回收后用引物ZF和CR通过overlap构建氨基羧基融合基因。
参考US9023984(B2)序列表中的SEQ ID No.55设计ZnT8羧基末端二聚突变体基因，如SEQ ID No.7所示，并委托生物公司合成，该二聚体含2个人ZnT8羧基末端基因，第一个在325为氨基酸为精氨酸(Arg),第二个在325位为酪氨酸(Trp),该二聚体中2个人ZnT8羧基末端基因通过一段柔性肽链接。设计引物CF和CR用于扩增ZnT8羧基端二聚突变体基因。
表1.引物序列
引物ZF和LR用于扩增ZnT8氨基末端基因(1-74aa),引物LF和CR用于扩增ZnT8羧基末端基因(268-369aa),引物ZF和CR用于overlap扩增ZnT8氨基羧基融合基因，引物CF和CR用于扩增ZnT8羧基端二聚突变体基因。
上述两个重组基因分别经SacI和XbaI双酶切后插入pcoldⅡ质粒中。连接产物转化入大肠杆菌BL21(DE3)培养后挑选阳性克隆进行测序。将测序正确的克隆在LB培养基中37℃扩增至D(600)值达1.0后加入IPTG诱导剂至终浓度为1mM/L，15℃诱导表达24h。4℃，10000×g离心后收集菌体-80℃保存。
将纯化的人ZnT8氨基羧基融合蛋白包被ELISA板，从1.6ug/孔倍比稀释至0.1ug/孔，检测融合蛋白与商品化的ZnT8抗体结合的量效变化。
ZnT8氨基羧基融合基因约550bp,羧基二聚突变体基因约650bp,PCR产物电泳结果见图1，均成功插入pcoldⅡ载体，测序结果与理论相符。
抗原经表达纯化复性后电泳结果见图2，可见纯化后ZnT8氨基羧基融合肽分子量约20kD，羧基二聚突变体分子量约25kD。
ELISA检测显示ZnT8氨基羧基融合蛋白能与商品化的ZnT8抗体特异性结合，可用于ZnT8特异性scFv的筛选(图3)。
实施例2T1D scFv噬菌体抗体库的构建
实验标本为50位初发的T1D志愿者的外周血。其中31位志愿者血清ZnT8抗体阳性。血清ZnT8抗体水平通过放射免疫配体法进行检测(详细方法参见Gu Y,Zhang M,Chen H,Wang Z,Xing C,Yang H,et al.Discordant association of islet autoantibodieswith high-risk hla genes in chinese type 1diabetes.Diabetes/metabolismresearch and reviews 2011；27:899-905)。所有患者均签署知情同意书。分选T1D志愿者外周血PBMC。提取T1D志愿者外周血PBMC RNA，接着反转录合成cDNA，具体操作步骤按说明书进行。通过RT-PCR方法，用人源单链抗体(scFv)通用引物(表2)扩增重链和轻链，通过overlap PCR链接成scFv,经Sfi I酶切后插入pcomb3XSS质粒(购自BioVector NTCC保藏中心)中。连接产物经过多次电转化入大肠杆菌XL1-Blue(购自Stratagene,Cat.#200228)，用SB培养基扩大培养后加辅助噬菌体VCSM13超感染。次日收集上清经PEG-8000/NaCl沉淀后获得T1D scFv噬菌体抗体库。
表2.人源scFv通用引物序列
注表2中：R＝A or G Y＝C or C M＝A or C K＝G or T S＝C or G W＝A or T H＝A or C or T B＝C or G or T V＝A or C or G D＝A or G or T N＝A or C or G orT扩增VH链引物组合如下:
扩增Vκ引物组合如下:
扩增Vλ引物组合如下:
上述经RT-PCR后成功扩增抗体重链及轻链，大小约400bp，单链抗体基因条带在750bp左右(图4)，胶回收后插入pcomb3XSS载体中，电转化入大肠杆菌XL1-Blue,经VCSM13超感染后获得噬菌体抗体库，经检测库容为1×108。
1.2.4ZnT8特异性scFv的筛选
将纯化的ZnT8氨基羧基融合蛋白按1μg/孔包被ELISA板，经过4轮的“吸附”、“洗脱”、“扩增”后(Zhang X,Qi X,Zhang Q,Zeng X,Shi Z,Jin Q,et al.Human 4f5single-chain fv antibody recognizing a conserved ha1epitope has broad neutralizingpotency against h5n1 influenza a viruses of different clades.Antiviralresearch 2013；99:91-9)，phage-ELISA进行检测。挑选OD值高的阳性克隆提取质粒并送测序，测序结果与人类免疫球蛋白序列(IMGT数据库)(Ehrenmann F,Kaas Q,LefrancMP.Imgt/3dstructure-db and imgt/domaingapalign:A database and a tool forimmunoglobulins or antibodies,T cell receptors,mhc,igsf and mhcsf.Nucleicacids research 2010；38:D301-7.Lefranc MP,Giudicelli V,Duroux P,Jabado-Michaloud J,Folch G,Aouinti S,et al.Imgt(r),the international immunogeneticsinformation system(r)25years on.Nucleic acids research 2015；43:D413-22.)进行比对并进行CDR区的划分。
经过4轮的筛选,ZnT8特异性scFv得以富集。每一轮噬菌体滴度见表3。将最后一轮洗脱的噬菌体感染大肠杆菌XL1-Blue后，随机选择160个克隆。Phage ELISA结果显示有23个阳性克隆，其中有11个克隆OD值较高，经测序得到7株scFv。我们对这7株scFv进行了CDR区的划分，均符合人源scFv抗体特征。其中,scFv C27和C22OD值最高，因此我们选择scFv-C22进行了进一步研究。
表3.ZnT8特异性噬菌体抗体的富集
得率(％)＝洗脱后的噬菌体密度(pfu)×100/吸附前的噬菌体密度(pfu)
将测序正确的阳性克隆转化入大肠杆菌Top10F’，挑单克隆菌落接种于含20mMMgCl2的SB培养基中，37℃振摇8h后加入IPTG至终浓度1mM，37℃诱导表达24h。4℃，10 000×g离心后收集菌体-80℃保存。
细菌沉淀用含8M尿素的磷酸盐缓冲液重悬,置于冰上，用超声破碎细胞仪进行裂解。10000×g 4℃离心30min,上清经0.22μm滤膜过滤后用HisTrap亲和层析柱纯化蛋白。洗脱下的目的蛋白通过浓度梯度透析复性至尿素小于0.125mM,超滤浓缩后得到高浓度蛋白。Western与SDS-PAGE结果表明我们成功表达并纯化了scFv-C22，其分子量约30kD(图5)
实施例3ZnT8特异性scFv的特性分析
Western blot检测：将纯化的重组ZnT8氨基羧基融合蛋白经12％蛋白质胶电泳后转至PVDF膜上，5％牛奶封闭后，用纯化的scFv作为一抗，HRP标记的HA抗体作为二抗，检测scFv-C22与ZnT8的结合活性。结果显示scFv-C22可检测到氨基羧基融合蛋白，在20kD左右可见明显条带，与预期相符，而阴性对照未见条带，说明scFv-C22与ZnT8蛋白具有良好的结合能力(图6)。
亲和力检测:由苏州百拓生物技术有限公司完成。亲和力结果显示scFv-C22与ZnT8氨基羧基融合蛋白具有较高的亲和力，亲和力为5.953×10-8kD(M)(图7)。
ELISA检测：将纯化的ZnT8羧基末端二聚突变体蛋白按0.5μg/孔包被ELISA板，scFv-C22从1:10倍比稀释至1:20480，检测scFv-C22与ZnT8结合的量效变化。如图8所示,随着scFv-C22浓度的倍比稀释，其与ZnT8羧基端二聚突变体蛋白的结合能力逐渐降低，说明scFv-C22以浓度依赖方式与ZnT8抗原肽结合。
免疫组化：我们将C22抗体作为一抗，通过间接标记的方法进行免疫组化实验，抗体孵育后的人胰腺组织切片的胰岛细胞呈强阳性，说明C22抗体具有良好的生物活性，能够特异的识别人胰岛β细胞表达的ZnT8蛋白。
以上结果均表明scFv-C22能够与人ZnT8特异性结合。
Claims (2)
1.ZnT8特异性单链抗体scFv-C22，其特征在于：
轻链的可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；
重链的可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；
所述的ZnT8特异性单链抗体scFv-C22的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。
2.一种编码权利要求1所述的ZnT8特异性单链抗体scFv-C22的基因，其特征在于：
编码轻链的可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.3 所示；
编码重链的可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.4 所示；
其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201610089779 | 2016-02-17 | ||
| CN2016100897798 | 2016-02-17 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN106084043A CN106084043A (zh) | 2016-11-09 |
| CN106084043B true CN106084043B (zh) | 2018-03-02 |
Family
ID=57211997
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201610520742.6A Expired - Fee Related CN106084043B (zh) | 2016-02-17 | 2016-07-04 | 一种ZnT8特异性单链抗体scFv‑C22及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN106084043B (zh) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2017189483A1 (en) | 2016-04-25 | 2017-11-02 | The Johns Hopkins University | Znt8 assays for drug development and pharmaceutical compositions |
| CN111316099A (zh) | 2017-07-12 | 2020-06-19 | 约翰霍普金斯大学 | 用于1型糖尿病诊断的基于脂蛋白体的znt8自身抗原 |
| EP3837286A4 (en) * | 2018-08-16 | 2022-08-10 | The Johns Hopkins University | ANTIBODIES TO HUMAN ZNT8 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101646781A (zh) * | 2006-12-29 | 2010-02-10 | 科罗拉多大学董事会 | 自身免疫病的诊断和治疗靶标及其用途 |
-
2016
- 2016-07-04 CN CN201610520742.6A patent/CN106084043B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101646781A (zh) * | 2006-12-29 | 2010-02-10 | 科罗拉多大学董事会 | 自身免疫病的诊断和治疗靶标及其用途 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 锌转运体8多克隆抗体的制备及功能初步研究;刘宝英;《中国博士学位论文全文数据库（医药卫生科技辑）》;20120615(第06期);参见全文 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN106084043A (zh) | 2016-11-09 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN106084051B (zh) | 一种ZnT8特异性单链抗体scFv‑C27及其应用 | |
| US11912770B2 (en) | Blocking type PD-L1 single-domain camel antibody and application thereof | |
| US20210171611A1 (en) | Antibody that binds to envelope glycoprotein of sever fever with thrombocytopenia syndrome virus and use for same | |
| CN107428832A (zh) | 抗pd‑l1抗体 | |
| CN107353340A (zh) | 抗h7n9全人源单克隆抗体2l11及其制法与应用 | |
| CN111718415B (zh) | 一种抗tigit纳米抗体及其应用 | |
| CN105669864B (zh) | 抗人程序性死亡受体1抗体及其制备方法和用途 | |
| CN102659945B (zh) | 抗C5aR抗体及其应用 | |
| CN106084043B (zh) | 一种ZnT8特异性单链抗体scFv‑C22及其应用 | |
| CN107337732A (zh) | 抗h7n9全人源单克隆抗体2j17及其制法与应用 | |
| CN109232739A (zh) | 一种抗cd38纳米抗体、编码基因及应用 | |
| CN110144011B (zh) | 针对t淋巴细胞免疫球蛋白黏蛋白3的单域抗体 | |
| JP6707660B2 (ja) | 抗ポドカリキシン様タンパク質前駆体サブタイプ２モノクローナル抗体とその生成方法及び使用 | |
| CN110551213A (zh) | 抗丝状病毒单克隆中和抗体及其制备方法和应用 | |
| WO2023143535A1 (zh) | 一种靶向il-18bp的抗体及其应用 | |
| CN109897107B (zh) | 纳米抗体及其制备方法 | |
| CN110655581B (zh) | 一种抗癌胚抗原的抗体及其制备方法和用途 | |
| CN106188298B (zh) | 一种Vsig4纳米抗体及其抗原表位鉴定方法和应用 | |
| WO2023125842A1 (zh) | 一种新型upar单域抗体的开发 | |
| CN117126271A (zh) | 靶向发热伴血小板减少综合征病毒囊膜蛋白的人源中和抗体及双特异性抗体 | |
| Hudson | Structure and application of single-chain Fvs as diagnostic and therapeutic agents | |
| CN117700557B (zh) | 一种特异性结合叶酸受体α的抗体或抗原结合片段 | |
| CN111778269B (zh) | 抗h5n1病毒入胞抗体ptd-3f及其应用 | |
| CN117310163B (zh) | 一种基于重组抗体的呼吸道合胞病毒检测方法 | |
| CN112062848B (zh) | 抗cd47单克隆抗体及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20180302 |