CN106047893A - OsCOL16基因在控制水稻抽穗期中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供OsCOL16基因在控制水稻抽穗期中的应用，基因OsCOL16来自水稻品种日本晴，其cDNA序列如SEQ ID NO:1所示，该基因编码具有448个氨基酸的B‑box/CCT锌指蛋白，属于CONSTANS‑like转录因子基因家族，遗传转化实验表明，过表达OsCOL16基因在短日照和长日照条件下均抑制水稻抽穗。进一步研究发现OsCOL16基因表现为昼夜节律表达，定位在细胞核中并具有转录自激活活性，通过上调Ghd7来抑制Ehd1、Hd3a和RFT1的表达，最终延迟抽穗。

Description

OsCOL16基因在控制水稻抽穗期中的应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体地说，涉及OsCOL16基因在控制水稻抽穗期中的应用。

背景技术

抽穗期(作物中称为开花时间)是一个控制品种地区适应性的重要的农艺性状，精确控制开花时间对于品种的生殖转化十分重要，从而影响作物产量(Cockram et al.(2007)J Exp Bot,58(6):1231-1244)。在合适的生长季节，晚抽穗导致长的营养生长期从而促进种子中干物质的积累，然而太晚抽穗可能导致收获时较低的种子成熟度。另一方面，对于生长季较短的作物来说，提前抽穗对其有利，然而过早抽穗会缩短营养生长期从而导致减产。因此干物质积累和压力避免之间的平衡对于作物的产量十分重要(Roux et al.(2006)Trends Plant Sci,11(8):375-381；sun et al.(2014)Protein Cell,2014,5(12):889-898)。

水稻抽穗同时由遗传和环境决定，光周期敏感性是决定开花时间和地区适应性的重要因素，并且构成了一个复杂的网络(Tsuji et al.(2011)Curr Opin Plant Biol,(2011)14(1):45-52.)。水稻是一个典型的短日照作物，在短日照下提前开花，目前为止，在水稻光周期开花途径中有超过35个基因/QTLs被克隆(Tsuji et al.(2013)Curr OpinPlant Biol.16(2):228–235；Sun et al.(2014)Protein Cell,2014,5(12):889-898)。水稻中有3个光周期开花途径，包括短日照促进通路，交汇于Hd1和Ehd1；长日照促进和长日照抑制通路，主要交汇于Ehd1(Tsuji et al.(2011)Curr Opin Plant Biol,(2011)14(1):45-52.)。Hd1是拟南芥开花激活子CONSTANS(CO)的同源基因，编码一个锌指转录因子，包含两个B-box结构域和一个CCT结构域，在短日照条件下通过激活Hd3a促进开花，然而在长日照条件下抑制Hd3a从而延迟抽穗(Hayama et al.(2003)Nature,422(6933):719-722)。Ehd1编码一个B型响应调节因子，在短日照和长日照条件下通过促进Hd3a和RFT1的表达来促进抽穗(Doi et al.(2004)Genes Dev,18(8):926-936)。

Ehd1作为一个水稻开花整合因子，很多开花抑制因子(如Ghd7,DTH8/Ghd8,OsCOL4和Hd16/EL1)和开化促进因子(如RID1/OsID1/Ehd2,Ehd3,Ehd4,OsMADS50,OsMADS51,Hd17/OsELF3和OsFKF1)交汇于Ehd1(Sun et al.(2014)Protein Cell,2014,5(12):889-898)。Ghd7编码一个CCT结构域蛋白，在抑制通路中起重要作用(Xue et al.(2008)Nat Genet,40(6):761-767)。Ghd7同时接收多个来自其他基因的信号如Hd16/EL1,Ehd3,Hd17/OsELF3和OsFKF1来调节Ehd1的表达(Sun et al.(2014)Protein Cell,2014,5(12):889-898)。Hd16/EL1编码一个蛋白激酶I，在长日照条件下通过磷酸化Ghd7抑制开花(Dai et al.(2010)Embo J,29(11):1916-1927；Hori et al.(2013)Plant J,76(1):36-46；Kwon et al.(2013)Plant Cell Environ,37(1):101-112)。Ehd3编码一个植物同源异形域锌指蛋白，在长日照条件下下调Ghd7从而促进开花(Matsubara et al.(2011)Plant J,66(4):603-612)。Hd17/OsELF3是拟南芥ELF3的同源基因，在长日照条件下负调Ghd7促进开花(Matsubara et al.(2012)Plant Cell Physiol,53(4):709-716；Yang et al.(2013)MolPlant,6(1):202-215)。OsFKF1是拟南芥FKF1的同源基因，在短日照和长日照条件下通过下调Ghd7从而激活Ehd1来促进开花(Han et al.(2015)Plant Cell Environ,38(12):2527-2540)。DTH8编码一个CCAAT-box结合蛋白的HAP3亚基，在长日照条件下通过下调Ehd1表达延迟开花(Wei et al.(2010)Plant Physiol,153(4):1747-1758；Yan et al.(2011)MolPlant,4(2):319-330)。OsCOL4属于CO家族基因，位于OsphyB和Ehd1之间抑制开花(Lee etal.(2010)Plant J,63(1):18-30)。RID1编码一个C2H2锌指转录因子，在短日照和长日照条件下均强烈促进开花(Wu et al.(2008)Proc Natl Acad Sci U S A,105(35):12915-12920；Park et al.(2008)Plant J,56(6):1018-1029；Matsubara et al.(2008)PlantPhysiol,148(3):1425-1435)。Ehd4编码一个CCCH锌指蛋白，通过Ehd1上调成花素基因的表达(Gao et al.(2013)PLoS Genet,9(2):e1003281)。OsMADS50和OsMADS51属于MADS蛋白，位于Ehd1上游，分别是长日照和短日照特异的开花促进子(Lee et al.(2004)Plant J,38(5):754-764；Kim et al.(2007)Plant Physiol,145(4):1484-1494)。因此在水稻光周期开花途径中，Ghd7-Ehd1-Hd3a/RFT1是一条重要的开花通路。

发明内容

本发明的目的是提供OsCOL16基因在控制水稻抽穗期中的应用。

本发明的另一目的是提供OsCOL16基因的等位基因及其在水稻品种改良中的应用。

水稻中共有19个CO-like基因，在进化上可以分为4支，部分基因属于第I、II和IV组已经被克隆，然而第II组的基因研究的较少(Wu et al,(2013)Proc Natl Acad Sci U SA,2013,110(8):2775-2780)。OsL(RAP-DB数据库中登录号为Os06g0264200，RGAP数据库中登录号为LOC_Os06g15330.1)，属于第II组CO-like蛋白，与拟南芥COL16基因具有40.4％的氨基酸一致性，将其重命名为OsCOL16。

本发明提供的控制水稻抽穗期OsCOL16基因，来自水稻品种日本晴，其cDNA序列见SEQ ID NO:1，长度为1854bp，其编码区(CDS)序列见SEQ ID NO:2。该基因编码具有448个氨基酸的B-box/CCT锌指蛋白，包含一个B-box结构域和一个CCT结构域，属于CONSTANS-like转录因子基因家族，进一步研究发现在短日照和长日照条件下，OsCOL16基因通过上调Ghd7来抑制Ehd1、Hd3a和RFT1的表达，最终延迟抽穗。

为了实现本发明目的，本发明提供OsCOL16基因在控制水稻抽穗期中的应用。

本发明还提供OsCOL16基因在延迟水稻抽穗期中的应用。

前述的应用，通过在水稻中过表达OsCOL16基因，以延迟水稻植物的抽穗期。

在本发明的一个具体实施方式中，通过将OsCOL16基因构建到载体pCAMBIA2300上，用所得重组载体转化水稻，筛选阳性转基因水稻植株。

携带有所述目的基因的表达载体可通过使用Ti质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、微注射、电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞中(Weissbach，1998，Method forPlant Molecular Biology VIII，Academy Press，New York，第411-463页；Geiserson和Corey，1998，Plant Molecular Biology，2^nd Edition)。

优选地，采用农杆菌介导的遗传转化法转化水稻，转化后的材料经过共培养-筛选-分化-生根-转基因苗的锻炼和移栽，筛选阳性转基因水稻植株。

更优选地，所用农杆菌为EHA105。

本发明进一步提供OsCOL16基因在水稻品种改良中的应用。

本发明涉及的OsCOL16基因的cDNA序列为：

i)SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；或

ii)SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列；或

iii)在严格条件下与SEQ ID NO:1所示序列杂交且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列，所述严格条件为在含0.1％SDS的0.1×SSPE或含0.1％SDS的0.1×SSC溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜；或

iv)与i)、ii)或iii)的核苷酸序列具有90％以上同源性且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列。

本发明还提供OsCOL16基因的等位基因，所述等位基因的CDS序列如SEQ ID NO.3所示。该等位基因来自水稻品种9311。

本发明还提供上述等位基因在延迟水稻抽穗期中的应用。

本发明通过在水稻中过表达OsCOL16基因，导致明显的晚抽穗表型，该基因在短日照和长日照条件下均抑制开花。在杭州自然长日照条件下，共得到18个T₁转基因家系，与转基因阴性植株相比，转基因阳性植株晚抽穗19-20天左右，株高变高，单株产量也显著增加。在海南自然短日照条件下，转基因阳性植株的表型与在杭州时一样，也表现为抽穗延迟，株高变高，产量增加。通过节律表达模式分析发现，OsCOL16基因呈现明显的昼夜节律表达。组织表达研究发现，OsCOL16基因主要在叶片和叶鞘中表达，并且在幼嫩的叶片中表达量较高，GUS染色分析也证实了这个结果。瞬时表达实验发现，OsCOL16-GFP融合蛋白定位在细胞核中。转录自激活实验发现OsCOL16基因具有很强的转录自激活活性，并且自激活结构域位于锌指结构域和CCT结构域之间。qRT-PCR实验发现OsCOL16基因位于水稻开花抑制因子Ghd7的上游，通过促进Ghd7的表达从而抑制Ehd1的表达，最终抑制开花，该结果进一步丰富了水稻光周期开花调控网络。

附图说明

图1为本发明实施例1中OsCOL16基因过表达植株的表型。其中，A-E表示自然长日照条件下，OsCOL16过表达转基因阳性株(左边)和转基因阴性株(右边)的抽穗期表型(A),主茎(B),剑叶(C),主穗(D),单株总籽粒(E)。照片摄于转基因阳性株抽穗后1周。F为在自然短日照和自然长日照条件下，OsCOL16过表达T₁植株的抽穗期。P¹指双尾t检测的P值，P²指威尔科克森符号秩检验的P值。实验中检测的植株数在柱中显示，平均值±s.e.m.。

图2为本发明实施例2中OsCOL16基因的表达模式分析。其中，A,B表示在短日照和长日照条件下，OsCOL16基因的节律表达模式。C表示长日照条件下80天时的野生型植株。D为通过qRT-PCR的方法分析OsCOL16基因在各组织中的表达水平。L,叶片；LS,叶鞘；ASA,茎尖。E-J表示各组织中GUS染色结果。叶片(E),叶鞘(F),穗(G),茎(H),茎横截面(I),根(J)。图A、B和D中，OsCOL16基因的转录水平是与水稻UBQ(Ubiquitin)基因的比值。白色和黑色的方框分别表示光期和暗期。平均值±s.d.由两次生物学重复和三次技术重复获得。比例尺1mm。

图3为本发明实施例3中OsCOL16蛋白定位于细胞核中并具有转录激活结构域。其中，A-D为OsCOL16蛋白的亚细胞定位。(A)明场,(B)OsCOL16-GFP融合蛋白,(C)一个核标记基因OsMADS3-mCherry融合蛋白,(D)在(A)背景下融合了(B)和(C)的图片。比例尺10um。(E)OsCOL16基因在酵母菌株AH109中的转录活性分析。左图显示了用于转录活性分析的各种构图。BD,GAL4-DNA结合结构域；MCS,多克隆位点；ZF,锌指；MR(Middle region),中间区域。空载体pGBKT7用于阴性对照。β半乳糖活性(β-gal)使用chlorophenol red-β-D-galactopyranoside(CPRG；Roche Biochemicals)作为反应底物。平均值±s.d.由三次独立实验获得。

图4为本发明实施例4和5中在短日照(A,C,E,G,I和K)和长日照(B,D,F,H,J和L)条件下，Hd3a,RFT1,OsMADS14,OsMADS15,Ehd1和Ghd7在OsCOL16的OX-(+)以及OX-(–)植株中的节律表达模式。白色和黑色的方框分别表示光期和暗期。平均值±s.d.由两次生物学重复和三次技术重复获得。OX-(+),OsCOL16的转基因阳性株；OX-(–),OsCOL16的转基因阴性株。

图5为本发明实施例4和5中在短日照(A,C,E,G,I,K,M,O,Q和S)和长日照(B,D,F,H,J,L,N,P,R和T)条件下，Hd1,Ehd2,Ehd3,Ehd4,DTH8,OsCOL4,OsMADS50,OsMADS51,Hd16和Hd17在OsCOL16的OX-(+)以及OX-(–)植株中的节律表达模式。白色和黑色的方框分别表示光期和暗期。平均值±s.d.由两次生物学重复和三次技术重复获得。OX-(+),OsCOL16的转基因阳性株；OX-(–),OsCOL16的转基因阴性株。

图6为本发明实施例4和5中在短日照和长日照条件下，通过qRT-PCR分析OsCOL16在用CRISPR-Cas9技术得到的各种开花基因的突变体和野生型植株中的转录水平。包括hd3a(A),rft1(B),osmads14(C),osmads15(D),hd1(E),ehd1(F),ghd7(G),ehd3(H),ehd4(I),dth8(J),oscol4(K),osmads50(L),osmads51(M),hd16(N)和野生型植株。平均值±s.d.由两次生物学重复和三次技术重复获得。

图7为本发明实施例6中OsCOL16基因的自然变异和网络分析结果。A表示在水稻核心种质中，OsCOL16基因编码区序列的核苷酸多态共分成22种单倍型。B为126个栽培稻和野生稻中OsCOL16基因的单倍型分析。单倍型频率与圆圈的大小成正比，线上的数字代表两个单倍型之间的进化距离。C表示来自80个水稻地方品种的单倍型Hap_1,Hap_15和Hap_22在杭州自然长日照条件下的抽穗期。P¹(Hap_1和Hap_22之间)为双尾t检测的P值，P²为威尔科克森符号秩检验的P值，平均值±s.e.m.。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1过表达OsCOL16基因延迟抽穗

1、过表达载体的构建

为了得到水稻过表达OsCOL16基因的表型，本实施例中构建了一个过表达载体。具体构建方法如下：种植野生型品种日本晴(英文名Nipponbare，已完成全基因组测序)至两周苗左右，利用plant RNA mini kit(购自天根生物技术有限公司)提取RNA，然后反转录成cDNA，利用引物2300-OsCOL16-XmaI-F(SEQ ID NO:4)和2300-OsCOL16-XmaI-R(SEQ ID NO:5)进行PCR扩增得到OsCOL16的全长cDNA序列(SEQ ID NO:1)。然后通过同源重组的方法将该片段重组至质粒pCAMBIA2300(购自加拿大Fermentas公司)的Xma I位点。

2、农杆菌介导的水稻遗传转化

将得到的测序正确的重组质粒，通过农杆菌菌株EHA105(购自CAMBIA公司)介导的水稻遗传转化体系，转入隐性基因型亲本NIL(DTH2)的愈伤组织中。经过愈伤组织诱导，继代，预培养、侵染、共培养、筛选具有潮霉素抗性的愈伤组织、分化、生根、炼苗移载，得到转基因植株。农杆菌介导的粳稻遗传转化体系主要应用Hiei等人报道的方法(Hiei et al,(1996)Plant J 6:271–282)，并在此基础上稍作改进。

3、转基因植株的检测和基因功能验证

结果发现，在水稻过表达OsCOL16基因，导致明显的晚抽穗表型。在杭州自然长日照条件下，共得到18个T₁转基因家系，利用引物2300-F(SEQ ID NO:6)和OsCOL16-JC-R(SEQID NO:7)进行PCR分子检测，与转基因阴性植株相比，转基因阳性植株晚抽穗19-20天左右，株高变高，单株产量也显著增加(图1，表1)。在海南自然短日照条件下，转基因阳性植株的表型与在杭州时一样，也表现为抽穗延迟，株高变高，产量增加(图1F，表1)。

表1比较OsCOL16过表达转基因阳性和转基因阴性植株之间的各种农艺性状

实施例2OsCOL16基因的时空表达模式

为了研究OsCOL16的节律表达模式，我们通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)的方法研究了OsCOL16基因的表达水平，引物序列为qRT-OsCOL16-F(SEQ ID NO:8)和qRT-OsCOL16-R(SEQ ID NO:9)。在光照培养箱短日照(10小时光照，14小时黑暗)和长日照(14小时光照，10小时黑暗)条件下，48小时周期中，每4小时收集一次叶片。在短日照条件下，OsCOL16的表达水平在光期后4小时开始增加，在暗期后10小时达到峰值，随后表达量迅速降低并且在光期后又开始逐步增加(图2A)。相似地，在长日照条件下，OsCOL16的表达水平在光期后即开始增加，在暗期后6小时达到峰值，随后表达量迅速降低并且在光期后又开始逐步增加(图2B)。这些结果说明OsCOL16转录水平表现明显的节律表达。

为了研究OsCOL16的空间表达模式，我们利用qRT-PCR检测了OsCOL16在水稻中各组织如叶片、叶鞘、穗、茎、根和茎尖部位的表达水平(图2C)。利用引物qRT-OsCOL16-F和qRT-OsCOL16-R。结果显示，OsCOL16的表达水平在各种叶片和叶鞘中分别表现明显的梯度，在幼嫩的叶片中表达量最高(图2D)。同时OsCOL16的表达水平也在穗和茎中检测到，但在根和茎尖中几乎检测不到。同时我们构建了pOsCOL16::GUS载体来研究OsCOL16的组织表达模式。载体构建方法如下：以日本晴基因组DNA作为模板，用引物OsCOL16-GUS-EcoRI-F(SEQID NO:10)和OsCOL16-GUS-NcoI-R(SEQ ID NO:11)进行PCR扩增得到OsCOL16基因启动子序列，然后用EcoR I和Nco I酶切载体pCAMBIA1305.1，切掉35S promoter，将OsCOL16基因启动子序列重组至该位点，酶切位点不保留，然后用农杆菌侵染的方法转化水稻日本晴。组织化学染色结果显示，GUS信号主要在叶片、叶鞘、穗和茎中检测到，在根中未检测到，支持qRT-PCR的结果(图2E-J)。

实施例3OsCOL16基因的亚细胞定位和转录自激活活性分析

1、OsCOL16基因的亚细胞定位

根据水稻基因组注释计划数据库(http://rice.plantbiology.msu.edu)，OsCOL16编码一个预测的CCT/B-box锌指转录因子。N端只有一个B-box结构域(21-58aa)，C端有一个CCT结构域(391-433aa)。为了确定OsCOL16是否是一个转录因子并且具有核定位功能，我们进行亚细胞定位实验来验证它的功能。本实施例中构建了一个亚细胞定位载体，载体构建过程如下：用引物OsCOL16-GFP-BamHI-F(SEQ ID NO:12)和OsCOL16-GFP-BamHI-R(SEQ ID NO:13)，以OsCOL16的全长cDNA，即SEQ ID NO:1所示序列为模板进行扩增，然后通过同源重组的方法把该片段重组至pAN580的Bam HI(加拿大Fermentas公司)位点，最终形成OsCOL16-GFP融合构建。瞬时表达实验显示OsCOL16-GFP融合蛋白定位在水稻叶片原生质体的细胞核中(图3A-D)。

2.OsCOL16的转录自激活活性分析

为了进一步分析OsCOL16是否具有转录自激活活性，我们利用pGBKT7载体构建了OsCOL16的全长和各种缺失构建。首先以OsCOL16的全长cDNA，即SEQ ID NO:1所示序列为模板，用引物(表2)扩增OsCOL16CDS和各种缺失片段，然后通过同源重组的方法把这些片段重组至pGBKT7(本实验室保存)的Eco RI(购自加拿大Fermentas公司)位点，并使各片段分别与GAL4DNA结合结构域完全融合，最终构建如下5个载体：BD-OsCOL16，BD-OsCOL16-ΔZF，BD-OsCOL16-ΔMR，BD-OsCOL16-ΔCCT和BD-OsCOL16-ΔZF/CCT。空载体和所有5个载体都转化入酵母菌株AH109中，随后分别在-Trp和-Trp/-His/-Ade的SD培养基上培养。转录自激活活性分析使用Clontech公司的Matchmaker GAL4Two-Hybrid System 3进行。β-半乳糖活性的测定根据Clontech的操作手册进行(略有修改)，用液体培养的方法，使用chlorophenolred-β-D-galactopyranoside(CPRG；Roche Biochemicals)作为反应底物。结果显示，OsCOL16具有很强的转录自激活活性，并且在4个缺失构建中，除了缺失锌指结构域和CCT结构域之间区域的酵母菌株没有转录自激活活性，其余菌株均有较强的转录自激活活性(图3E)。综上，这些结果说明OsCOL16是一个核转录因子并具有转录自激活活性，并且其转录激活域位于中间区域(MR，Middle region)。

表2用于构建OsCOL16转录自激活载体的引物

实施例4OsCOL16基因下调Ehd1来抑制开花

OsCOL16具有光周期响应和节律表达的特性说明该基因可能参与光周期开花调控。为了研究OsCOL16在水稻光周期开花调控途径中的作用，我们分别在短日照和长日照条件下，利用qRT-PCR的方法检测了参与水稻光周期途径的相关基因在OsCOL16过表达阳性(OX-(+))和阴性(OX-(–))植株中的表达，引物序列见表3。叶片分别选取自短日照处理40天和长日照处理51天的水稻植株。

我们首先检测了两个成花素基因Hd3a和RFT1的表达，分别是水稻短日照和长日照条件下的成花素基因(Tsuji et al.(2011)Curr Opin Plant Biol,14(1):45-52)。结果，在48小时的周期中，与OX-(–)植株相比，Hd3a和RFT1的转录水平在OX-(+)植株中显著降低(图4A-D)。有意思的是，在短日照条件下，Hd3a的表达水平明显比RFT1高，然而在长日照条件下，RFT1的表达水平明显比Hd3a高，该结果与Hd3a是水稻短日照条件下主要的成花素而RFT1是水稻长日照下主要的成花素相一致(Komiya et al.(2009)Development,136(20):3443-3450)。随后我们检测了OsMADS14和OsMADS15的转录水平，两个位于Hd3a和RFT1下游的花分生组织决定基因(Tsuji et al.(2011)Curr Opin Plant Biol,14(1):45-52)。结果显示OsMADS14和OsMADS15的转录水平OX-(+)植株中较低(图4E-H)。另外，我们通过CRISPR-Cas9技术设计出hd3a,rft1,osmads14和osmads15突变体，结果发现在这些突变体和相应的野生型植株中，OsCOL16的表达水平没有显著差异(图6A-D)。

接着进一步研究OsCOL16下调成花素基因的表达是否通过Hd1或Ehd1介导，Hd1和Ehd1是Hd3a和RFT1上游的开花整合基因(Tsuji et al.(2011)Curr Opin Plant Biol,14(1):45-52)。结果显示，Hd1的表达水平在OX-(+)和OX-(–)植株中差异不显著(图5A,B)，然而Ehd1的转录水平在OX-(+)植株中较低(图4I,J)。另外，在hd1和ehd1突变体和相应的野生型植株中，OsCOL16的转录水平几乎一致(图6E,F)。这些结果表明OsCOL16抑制成花素基因的表达来抑制开花，并且该结果是通过Ehd1介导的。

实施例5OsCOL16基因位于Ghd7基因的上游

为了进一步研究OsCOL16-Ehd1参与的光周期开花途径，我们研究Ehd1上游调控基因的表达水平。Ghd7是一个主要的开花抑制因子(Xue et al.(2008)Nat Genet,40(6):761-767)，在短日照和长日照条件下，与OX-(–)植株相比，OX-(+)植株中Ghd7的表达水平显著提高(图4K,L)。同时，OsCOL16的表达也不受Ghd7的影响(图6G)，表明OsCOL16位于Ghd7的上游。而Ehd1上游调节基因，比如Ehd2,Ehd3,Ehd4,DTH8,OsCOL4,OsMADS50和OsMADS51，在OX-(+)和OX-(–)植株中表现相似的表达水平(图5C-P)。相反地，这些Ehd1的调节基因也不影响OsCOL16的表达(图6H-M)。这些结果表明OsCOL16抑制开花独立于Ehd1的这些上游调节因子。

接下来，我们研究OsCOL16是否影响Ghd7的上游调节基因的表达，包括Hd16(Ghd7的正调控因子)和Hd17(Ghd7的负调控因子)。结果显示，Hd16和Hd17的转录水平不受OsCOL16的影响(图5Q-T)。相反地，这些Ghd7的调节基因也不影响OsCOL16的表达(图6N)。综上所述，qRT-PCR结果表明，OsCOL16抑制开花位于Ghd7的上游，然而OsCOL16的上游调控基因还未找到。所用qRT-PCR引物序列见表3。

表3qRT-PCR引物序列

实施例6OsCOL16基因在水稻中的单倍型分析

为了进一步了解OsCOL16基因的自然变异对栽培稻抽穗期变化的影响及其进化机制。又对该基因的编码区在126个样品(包括33个籼稻、48个粳稻和45个野生稻)中进行测序，并将测序结果做序列比对，结果获得1463bp大小的序列(最长单倍型的序列大小为1463bp)。用引物OsCOL16-seq-F(SEQ ID NO:14)和OsCOL16-seq-R(SEQ ID NO:15)进行扩增。共发现42个变异位点，其中6个插入缺失，导致氨基酸变异的位点有18个，蛋白质编码移码的插入缺失有2个，这些变异位点中有7个仅存在于野生稻中。全部36个SNP和6个插入缺失共组成22个单倍型，其中18个单倍型是野生稻特有的，3个单倍型(H1、H15和H22)是栽培稻两个亚种和野生稻共有的，H5只存在于一个籼稻品种中(图7A)。单倍型H1(水稻品种日本晴类型，其CDS序列见SEQ ID NO:2所示)存在于64个品种中，包括45个粳稻(占93.8％的粳稻)，6个籼稻(占18.2％的籼稻)和13个野生稻(占28.9％的野生稻)。单倍型H22(水稻品种9311类型，其CDS序列如SEQ ID NO:3所示)存在于26个品种中，包括2个粳稻(占4.2％的粳稻)，22个籼稻(占66.7％的籼稻)，2个野生稻(占4.4％的野生稻)。单倍型H15存在于9个品种中，包括1个粳稻(占2.1％的粳稻)，4个籼稻(占12.1％的籼稻)和4个野生稻(占8.9％的野生稻)(图7B)。进一步对栽培稻中多于1个品种的单倍型植株抽穗期进行比较，发现单倍型H1(主要存在于粳稻中)和H22(主要存在于籼稻中)之间品种的抽穗期具有显著差异(P＝3.16×10^–4)，在单倍型H1与H15(P＝0.82)及单倍型H22和H15(P＝0.97)之间没有显著差异(图7C)。同时进一步对该基因进行亲缘地理学分析发现三个单倍型并不是姐妹单倍型，而是从不同的野生稻单倍型中进化来的。同时，我们对栽培稻的两个亚种和野生稻群体的遗传多样性和Tajima’D进行计算，也没有发现多样性降低和明显的受选择信号。综合以上分析认为该基因单倍型在栽培稻中的分布是由于瓶颈效应和遗传漂变导致的。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (9)

1.OsCOL16基因在控制水稻抽穗期中的应用，其特征在于，OsCOL16基因的cDNA序列为：

i)SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；或

ii)SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列；或

iii)在严格条件下与SEQ ID NO:1所示序列杂交且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列，所述严格条件为在含0.1％SDS的0.1×SSPE或含0.1％SDS的0.1×SSC溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜；或

iv)与i)、ii)或iii)的核苷酸序列具有90％以上同源性且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列。

2.OsCOL16基因在延迟水稻抽穗期中的应用，其中，OsCOL16基因的cDNA序列同权利要求1所述。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，在水稻中过表达OsCOL16基因。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，将OsCOL16基因构建到载体pCAMBIA2300上，用所得重组载体转化水稻，筛选阳性转基因水稻植株。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，采用农杆菌介导的遗传转化法转化水稻，转化后的材料经过共培养-筛选-分化-生根-转基因苗的锻炼和移栽，筛选阳性转基因水稻植株。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所用农杆菌为EHA105。

7.OsCOL16基因在水稻品种改良中的应用，其中，OsCOL16基因的cDNA序列同权利要求1所述。

8.OsCOL16基因的等位基因，其特征在于，所述等位基因的CDS序列如SEQ ID NO.3所示。

9.权利要求8所述的等位基因在延迟水稻抽穗期中的应用。