CN106032525A - 一种合成白藜芦醇的基因工程菌及其构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种合成白藜芦醇的基因工程菌,该基因工程菌是在E.coli BW25113中敲除限制葡萄糖合成酪氨酸的基因tyrR和trpED,并其染色体重组有粘红酵母的酪氨酸脱氨酶基因tal、欧芹的4-香豆酸:辅酶A连接酶基因4cl和葡萄的芪合酶基因sts;该基因工程菌以葡萄糖为底物合成白藜芦醇。
Description
技术领域
本发明属于合成生物学与代谢工程领域,具体涉及利用基因敲除与基因重组等技术构建能够合成白藜芦醇的大肠杆菌工程菌及其构建方法。
背景技术
白藜芦醇是一种非黄酮类多酚化合物,化学名为3,4’,5-三羟基二苯乙烯(3,4’,5-trihydroxystilbene),主要存在于葡萄、花生、桑树和虎杖等植物中。大量研究表明,白藜芦醇具有抗癌、抗炎、保护心血管等多种药理作用[1]~[5]。白藜芦醇还可以作为化妆品与保健品的添加剂,目前市场上也有相关产品,如嘉康利(Shaklee)VIVIX天然植物萃取液、美国斯旺森红酒精华营养胶囊和红酒素等。
白藜芦醇合成方法有植物提取法、化学合成法及微生物合成法。从天然植物中提取白藜芦醇面临着提取工作繁杂、时间周期长、产量低和资源短缺等问题,而化学合成具有合成路线长、能耗高,且易造成环境污染等问题。微生物合成法具有在短时间内得到大量目的产物的特点,并且环境污染小、自然资源破坏少、操作相对简便等优点。因此,构建高产白藜芦醇的工程菌株合成白藜芦醇具有极大的市场价值。
目前的研究报道主要是将白藜芦醇合成途径的关键基因与质粒进行重组,进而将重组载体导入重组菌株细胞内,最后重组菌株以对香豆酰、苯丙氨酸或酪氨酸等为底物发酵合成白藜芦醇[6]~[13]。中国专利CN102605006A和CN103540561A记载的技术方案中,将苯丙氨酸羟化酶基因、酪氨酸氨解酶基因、4-香豆酰:辅酶A连接酶基因和白藜芦醇合酶基因或将表达酪氨酸脱氨酶TAL、4-香桂酸:辅酶A连接酶4CL、芪合酶STS、丙二酸转运酶matC以及丙二酸吸收酶matB的基因分别转化到菌种中,得到用于表达白藜芦醇的重组工程菌种;但这些研究面临着2个问题:1)质粒表达具有不稳定性,即遗传不稳定性和环境不稳定性,如在高温发酵的环境下,质粒容易丢失;2)对香豆酰、苯丙氨酸或酪氨酸等底物价格高昂,不利于生产工艺的产业化。
参考文献如下:
[1]Schuster S,Penke M,Gorski T,et al.Resveratrol differentially regulates NAMPT and SIRT1inhepatocarcinoma cells and primary human hepatocytes[J].PLoS One,2014,9(3):e91045.
[2]Tomé-Carneiro J,Larrosa M,Yanez-Gascon MJ,et al.One-year supplementation with a grape extractcontaining resveratrol modulates inflammatory-related microRNAs and cytokines expression in peripheral bloodmononuclear cells of type 2diabetes and hypertensive patients with coronary artery disease[J].Pharmacol Res,2013,72:69-82.
[3].Ferretta A,Gaballo A,Tanzarella P,et al.Effect of resveratrol on mitochondrial function:Implications inparkin-associated familiar Parkinson's disease[J].Biochim Biophys Acta,2014,1842(7):902-915.
[4].Gu XS,Wang ZB,Ye Z,et al.Resveratrol,an activator of SIRT1,upregulates AMPK and improvescardiac function in heart failure[J].Genet Mol Res,2014,13(1):323-335.
[5].Yao R,Yasuoka A,Kamei A,et al.Nuclear receptor-mediated alleviation of alcoholic Fatty liver bypolyphenols contained in alcoholic beverages[J].PLoS One,2014,9(2):e87142.
[6].Becker JV,Armstrong GO,van der Merwe MJ,et al.Metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiaefor the synthesis of the wine-related antioxidant resveratrol[J].FEMS Yeast Res,2003,4(1):79-85.
[7].Beekwilder J,Wolswinkel R,Jonker H,et al.Production of resveratrol in recombinant microorganisms[J].Appl Environ Microbiol,2006,72(8):5670-5672.
[8].Huang LL,Zhu QQ.Method for the production of resveratrol in a recombinant oleaginousmicroorganism[P].WO2006125000A2,2006.
[9].Shin SY,Jung SM,Kim MD,et al.Production of resveratrol from tyrosine in metabolically engineeredSaccharomyces cerevisiae[J].Enzyme Microb Technol,2012,51(4):211-216.
[10].Watts KT,Lee PC,Schmidt-Dannert C.Biosynthesis of plant-specific stilbene polyketides inmetabolically engineered Escherichia coli[J].BMC Biotechnol,2006,6:22.
[11].Huang LL,Zhu QQ.Method for the production of resveratrol in a recombinant bacterial host cell[P].US2007/0031951A1,2007.
[12].Lim CG,Fowler ZL,Hueller T,et al.High-yield resveratrol production in engineered Escherichia coli[J].Appl Environ Microbiol,2011,77(10):3451-3460.
[13].Wu J,Liu P,Fan Y,et al.Multivariate modular metabolic engineering of Escherichia coli to produceresveratrol from L-tyrosine[J].J Biotechnol,2013,167(4):404-411.
发明内容
本发明针对上述的现有问题,采用以染色体的整合的方式,将白藜芦醇合成途径的关键基因重组到大成杆菌染色体上,得到能够以葡萄糖为底物合成白藜芦醇的重组菌种,藉此解决重组质粒表达不稳定的问题并解决原料成本高不利于产业化的问题。
本发明一方面提供了一种合成白藜芦醇的基因工程菌,该基因工程菌是在E.coli BW25113中敲除限制葡萄糖合成酪氨酸的基因tyrR和trpED,并其染色体重组有酪氨酸脱氨酶基因tal、4-香豆酸:辅酶A连接酶基因4cl和芪合酶基因sts;该基因工程菌以葡萄糖为底物合成白藜芦醇。
其中,上述基因可以通过密码子优化,所述的酪氨酸脱氢酶基因tal的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示;所述4-香豆酸:辅酶A连接酶基因4cl的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示;所述的芪合酶基因sts核苷酸序列如SEQ INNO:3所示。
本发明还涉及构建合成白藜芦醇的基因工程菌的方法,步骤如下:
1)分别获取芪合酶基因sts、酪氨酸脱氢酶基因tal和4-香豆酸:辅酶A连接酶基因4cl,并构建重组质粒pET-sts和pET-tal-4cl;
2)以步骤1)中重组质粒pET-sts和pET-tal-4cl为模板分别PCR扩增出携带有T7启动子和终止子的sts基因片段和tal-4cl基因片段,然后将所述扩增后的基因片段导入质粒pTKIP-cat中并构建重组质粒pTKIP-sts和pTKIP-tal-4cl;
3)以线性化的质粒pTKS/CS为模板,分别用含有基因tyrR和trpED同源重组序列的引物PCR扩增出带有上述同源重组序列的四环素抗性基因tetA序列;
4)将步骤3)携带有基因tyrR同源重组序列的tetA序列转化于携带pTKRed质粒的E.coli BW25113菌株细胞中,并筛选出阳性菌株E.coli BW25113(△tyrR::tetA)/pTKRed;其中,所述携带pTKRed质粒的E.coli BW25113菌株在转化前经IPTG诱导;
5)将步骤2)中构建的重组质粒pTKIP-sts转化于步骤4)中阳性菌种E.coliBW25113(△tyrR::tetA)/pTKRed的菌株细胞中,然后涂布于含有抗生素的固体培养基上后培养;
6)将步骤5)中培养基上的重组菌种置于含有大观霉素和氨苄霉素的M9培养基中活化,后接种于只含有大观霉素的M9培养基中,待OD600≈0.6时加入IPTG和L-阿拉伯糖诱导过夜后,再加入氯霉素培养后,涂布于含有氯霉素抗性平板中培养过夜;
7)挑取步骤6)中菌落中分别点于四环素抗性平板、氨苄霉素抗性平板及氯霉素抗性平板上后培养,选择四环素抗性平板和氨苄霉素抗性平板不生长,而氯霉素抗性平板上生长的菌落再经过PCR验证后,进一步经测序验证后,得到阳性菌种E.coli BW25113(ΔtyrR::sts-cat);然后,敲除菌种E.coliBW25113(ΔtyrR::sts-cat)中基因sts下游的氯霉素基因cat,获得菌种E.coliBW25113(ΔtyrR::sts);
8)利用步骤7)制备的菌种E.coli BW25113(ΔtyrR::sts)导入质粒pTKRed并构建E.coli BW25113(△tyrR::sts)/pTKRed菌种,然后将带有基因trpED同源重组序列的tetA序列采用步骤4)中同样的方法导入上述菌种中并构建得到E.coli BW25113(ΔtyrR::sts,ΔtrpED::tetA)/pTKRed菌种;
9)将步骤2)中所述的重组质粒pTKIP-tal-4cl转入步骤8)中构建的E.coliBW25113(ΔtyrR::sts,ΔtrpED::tetA)/pTKRed菌种中并获得菌种E.coliBW25113(△tyrR::sts,△trpED::tetA)/pTKRed/pTKIP-tal-4cl,并采用步骤5)-7)中同样的方法获得阳性菌种E.coli BW25113(ΔtyrR::sts,ΔtrpED::tal-4cl-cat);随后采用步骤7)中同样的方法敲除tal-4cl基因下游的氯霉素基因cat,获得合成白藜芦醇的基因工程菌E.coli BW25113(ΔtyrR::sts,ΔtrpED::tal-4cl)。
本发明解决的技术问题是以E.coli BW25113为起始菌株,敲除限制葡萄糖合成酪氨酸的2个基因(tyrR和trpED),提高葡萄糖到酪氨酸的产量;并且将涉及从酪氨酸到白藜芦醇合成的基因(酪氨酸解氨酶基因tal、4-香豆酸辅酶A连接酶基因4cl及芪合酶基因sts)重组到菌株染色体上。这样达到从葡萄糖经酪氨酸途径合成白藜芦醇的目的,并且重组到染色体上的目的基因能够稳定表达相关产物,实现白藜芦醇真正工业化的产出。
附图说明
图1为实施例2中E.coli BW25113(ΔtyrR::sts)构建成功的琼脂糖凝胶电泳图;其中,
泳道1为E.coli BW25113,
泳道2为E.coli BW25113(ΔtyrR::tetA),
泳道3为菌株E.coli BW25113(ΔtyrR::sts-cat),
泳道4为E.coli BW25113(ΔtyrR::sts),
M:分子量Marker DL5000。
图2为E.coli BW25113(ΔtyrR::sts,ΔtrpED::tal-4cl)成功构建的琼脂糖凝胶电泳图;其中,
泳道1为E.coli BW25113(ΔtyrR::sts),
泳道2为E.coli BW25113(ΔtyrR::sts,ΔtrpED::tetA),
泳道3为E.coli BW25113(ΔtyrR::sts,ΔtrpED::tal-4cl-cat),
泳道4为E.coli BW25113(ΔtyrR::sts,ΔtrpED::tal-4cl),
M:分子量Marker DL5000。
图3为E.coli BW25113(△tyrR::sts,△trpED::tal-4cl)菌种诱导SDS-PAGE电泳图;其中,
泳道1为IPTG诱导4h的E.coli BW25113;泳道2为IPTG诱导前的E.coli BW25113(△tyrR::sts,△trpED::tal-4cl);泳道3为诱导3.5h后的E.coliBW25113(△tyrR::sts,△trpED::tal-4cl);泳道4为诱导4h后的E.coliBW25113(△tyrR::sts,△trpED::tal-4cl);泳道5为诱导4.5h后的E.coliBW25113(△tyrR::sts,△trpED::tal-4cl);M表示Marker,单位KDa。
图4为白藜芦醇标准品(100mg/L)的检测图谱;
图5为E.coli BW25113(ΔtyrR::sts,ΔtrpED::tal-4cl-cat)菌种发酵后样品的检测图谱;
图6为对照菌种E.coli BW25113的发酵后样品的检测图谱;
具体实施方式
本申请中将与白藜芦醇合成相关的基因---粘红酵母(Rhodotorula glutinis)的酪氨酸脱氨酶基因tal、欧芹(Petroselinum crispum)的4-香豆酸:辅酶A连接酶基因4cl和葡萄(Vitis vinifera)的芪合酶基因sts重组于大肠杆菌的染色体上,并且替换敲除了大肠杆菌染色体上限制葡萄糖合成酪氨酸的基因tyrR和trpED,同时上述相关基因在T7启动子的控制下,在IPTG的诱导下即可完成表达。
根据Kuhlman等发表的方法(Site-specific chromosomal integration of largesynthetic constructs[J],Nucleic Acids Research,2010,38(6),e92),利用lambda-Red重组酶和I-SceI核酸酶完成外源基因在大成杆菌染色体上的整合;在IPTG诱导其lambda-Red表达后,具有线性着落区片段(linear landing pad fragments)的基因片段(扩增于来自质粒pTKS\CS)同源整合到大肠杆菌的染色体上;L-阿拉伯糖诱导的I-SceI表达后,I-SceI识别位于供体质粒(带有目的基因的pTKIP)和菌种染色体上的识别区并将其进行剪切;然后再次加入IPTG诱导表达lambda-Red(λ-Red),将来源于供体质粒的目的基因片段整合到经过剪切的染色体上完成整合。
本申请中,采用质粒pTKRed、pTKIP-cat和pTKS/CS,其具体信息可参照Addgene组织公布质粒信息;其中pTKRed包含λ-Red重组酶表达框(乳糖操作子控制)和I-SceI核酸酶表达框(阿拉伯糖操纵子控制),同时携带大观霉素抗抗性基因;pTKS/CS包含四环素抗性基因,其中四环素抗性基因两侧含有25bp的染色体着落区片段(Landing pad region)和I-SceI识别位点;pTKIP-cat含有氨苄霉素抗性基因和多克隆位点(可插入目的基因),其氨苄霉素抗性基因和多克隆位点两侧也具有染色体着落区片段(Landing pad region)和I-SceI识别位点,插入目的基因下游为氨苄霉素抗性基因,cat抗性基因的一侧(位于抗性基因下游)具有flippse识别位点(FRT)。本申请中,将相应的目的基因置换敲除限制葡萄糖合成酪氨酸的基因tyrR和trpED;首先,pTKRed质粒导入到大肠杆菌中,诱导表达出λ-Red重组酶,含有重组序列的tetA基因在λ-Red重组酶的作用下置换tyrR基因;随后将携带目的基因的pTKIP导入上述含有tetA基因的菌种中,诱导表达出I-SceI核酸酶;I-SceI核酸酶剪除位于染色体上的tetA基因和水解出位于质粒pTKIP上的目的基因,然后再次诱导表达的λ-Red重组酶将目的基因sts替换染色体上的tetA基因;同时完成基因sts的替换重组后,利用相同的方法和工艺将目的基因tal-4cl替换染色体上的trpED基因。总之,利用tetA作为中间过度基因片段完成目的基因sts替换大肠杆菌染色体上限制葡萄糖合成酪氨酸的基因tyrR。
pTKIP-cat质粒在其插入片段包含抗性基因,正如上述的pTKIP质粒结构,插入的目的基因下游为cat的抗性基因,同时目的基因和抗性基因的两侧为同源序列、染色体着落区片段和识别片段(包括I-SceI核酸酶识别位点),最终染色体上插入的片段包括目的基因和抗性基因,但可以在抗性基因cat的两侧引入flippse识别位点(flippase recognition target site),根据文献(One-stepinactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12using PCR products,Proc.Natl Acad.Sci.USA 2000;97:6640-6645)中的记载,利用pCP20质粒转化菌种,质粒pCP20诱导表达出的FLP(flippase recombination enzyme)可识别cat抗性基因的两侧的flippse识别位点,从而去除位于染色体上的抗性基因。
结合以下实施例对本申请做进一步的说明;
其中:LB培养基、M9培养基为生物技术实验的常规基础培养基,另外某些实验技术步骤可以参照《分子克隆实验指南》和分子生物学实验手册。
实施例1:重组载体pTKIP-sts和pTKIP-tal-4cl的构建;
(1)从NCBI网站获得已报道的粘红酵母(Rhodotorula glutinis)的tal、欧芹(Petroselinum crispum)的4cl和葡萄(Vitis vinifera)的sts,经密码子优化后全合成这3个基因(由上海捷瑞生物工程有限公司提供),得到克隆载体pUC57-tal、pUC57-4cl和pUC57-sts;基因tal、4cl和sts的序列如SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示。
(2)分别以携带目的基因的pUC57为模板扩增基因sts、tal和4cl,基因片段sts与载体pETDuet-1经限制性内切酶BamH I和Xho I酶切、连接后,构建重组载体pET-sts;基因片段tal与载体pETDuet-1经限制性内切酶Nco I和Hind III酶切、连接后,构建重组载体pET-tal;基因片段4cl与pET-tal经限制性内切酶Nde I和Avr II酶切、连接后,构建重组载体pET-tal-4cl。
(4)利用引物Duet-F与Duet-R,分别以重组载体pET-sts和pET-tal-4cl为模板扩增包含T7启动子和T7终止子的sts、tal-4cl基因片段,将其分别与载体pTKIP-cat经过限制性内切酶Apa I与Nhe I酶切、连接后,构建重组载体pTKIP-sts和pTKIP-tal-4cl。
上游引物Duet-F:ATATCGATCCCGCGAAATTAAT(SEQ IDNO:4);划线加粗序列为Apa I酶切位点;
下游引物Duet-R:
TGCCTTTCAGCAAAAAACCCCT(SEQ ID NO:5);划线加粗序列为Nhe I酶切位点,斜体加粗序列为FRT序列。
实施例2E.coli BW25113(ΔtyrR::sts)的构建
(1)将质粒pTKS/CS双酶切线性化后作为模板,tyrR-CS1/tyrR-CS2为引物扩增四环素抗性基因(tetA)。
tyrR-CS1:GTGTCATATCATCATATTAATTGTTCTTTTTTCAGGTGAAGGTTCCCATG(SEQ ID NO:6);
tyrR-CS1:TGGTGTTGCACCATCAGGCATATTCGCGCTTACTCTTCGTTCTTCTTCTG(SEQ ID NO:7);
其中,引物中,划线加粗为tetA基因两端的序列,划线加粗序列上游为大肠杆菌染色体上tyrR基因的两侧的同源序列。
(2)E.coli BW25113/pTKRed的构建:利用电转法将质粒pTKRed导入E.coli BW25113(Novagen)菌株细胞内,涂布100mg/L大观霉素抗性平板,30摄氏度下培养12~16h。
(3)tetA重组到菌株染色体上替代tyrR基因,达到tyrR敲除的目的:E.coli BW25113/pTKRed菌株按照1%的比例接种于50mL的LB液体培养基内,待OD600≈0.3时,加IPTG至终浓度为2mM;待OD600≈0.6时制备电转化感受态细胞;感受态细胞制备完成后,加10μL步骤(1)制备的tetA片段与100μL感受态细胞进行混合电转,复苏后,涂布于含100mg/L大观霉素与10mg/L四环素的LB固体培养基,置于30摄氏度温箱培养12~16h。
(4)次日经过菌落PCR验证并挑选出阳性菌株E.coli BW25113(△tyrR::tetA)/pTKRed。
(5)E.coli BW25113(△tyrR::tetA)/pTKRed/pTKIP-sts的构建:利用电转化将质粒pTKIP-sts导入步骤(4)构建的重组菌株细胞内,复苏后的重组菌株涂布于含10mg/L四环素、100mg/L大观霉素和100mg/L氨苄霉素的LB固体培养基,30摄氏度下温箱培养12~16h。
(6)将(5)构建的重组菌株挑于M9培养基(100mg/L大观霉素与100mg/L氨苄霉素)内进行活化,次日按2%接种于20mL新鲜的M9培养基内(只加100mg/L大观霉素)。待OD600≈0.6时加IPTG至终浓度2mM,L-阿拉伯糖至终浓度0.2%(质量比),诱导过夜。次日上午加入34mg/L氯霉素,待下午稀释菌液10-5,取100μL稀释菌液涂布于34mg/L氯霉素抗性平板,37摄氏度的温箱培养12~16h。
(7)挑取单菌落分别点于10mg/L四环素抗性平板、100mg/L氨苄霉素抗性平板及34mg/L氯霉素抗性平板上。选择四环素抗性平板和氨苄霉素抗性平板不生长,而氯霉素抗性平板上生长的菌落再经过PCR验证,验证正确的菌株进一步经测序验证,阳性菌株E.coli BW25113(△tyrR::sts-cat)进行保藏。
(8)E.coli BW25113(△tyrR::sts)的构建:敲除sts下游的氯霉素基因cat,以免影响后续的重组验证工作。敲除cat的方法:利用电转化将质粒pCP20导入菌株细胞内;电转复苏后涂布于100mg/L氨苄霉素抗性平板,置于30℃温箱培养12~16h,次日菌落PCR验证cat基因的敲除,阳性菌株进行保藏;请见图1。
上述PCR验证的上游引物tyrR-up:CTGTATGGCATTGAACTGGGGTATT(SEQ ID NO:8);
下游引物tyrR-down:GCTGAACATTTTCCCGAGTATTGAT(SEQ IDNO:9);
这两对引物是tyrR两端的序列,参照图1所示,敲除前的扩增序列长度为2.4kb,敲除后(tetA重组)扩增序列长度为2.3kb,sts-cat重组后扩增序列长度为4.0kb,cat敲除后扩增序列长度为2.7kb。
实施例3:E.coli BW25113(△tyrR::sts,△trpED::tal-4cl)的构建
采用实施例2中同样的构建方法,步骤如下:
(1)用于敲除trpED的tetA片段的扩增,所用引物为trpED-CS1与trpED-CS2。
trpED-CS1:CCCGCCTAATGAGCGGGCTTTTTTTTGAACAAAATTAGAGAATAACAATG(SEQ ID NO:10);
trpED-CS2:ACGATTTTCGCTAAAACGGTTTGCATCATTTACCCTCGTGCCGCCAGTGC(SEQ ID NO:11);
其中,引物中,划线加粗为tetA基因两端的序列,划线加粗序列上游为大肠杆菌染色体上trpED基因的两侧的同源序列。
(2)E.coli BW25113(△tyrR::sts)/pTKRed的构建,同实施例2(2)
(3)将步骤(1)获得的tetA重组到trpED基因的位置,并构建E.coliBW25113(△tyrR::sts,△trpED::tetA)/pTKRed,构建方法同实施例2的步骤(3)与(4)。
(4)E.coli BW25113(△tyrR::sts,△trpED::tetA)/pTKRed/pTKIP-tal-4cl的构建:利用电转化将质粒pTKIP-tal-4cl导入(3)构建的重组菌株细胞内。
(5)tetA的敲除与tal-4cl-cat的重组工作,同实施例2(6)。
(6)同实施例2,选择四环素抗性平板和氨苄霉素抗性平板不生长,而氯霉素抗性平板上生长的菌落进行PCR验证,验证正确的菌株进一步经测序验证,阳性菌株E.coli BW25113(△tyrR::sts,△trpED::tal-4cl-cat)进行保藏。
上述PCR验证上游引物trpED-up:CGAGGAACTCACACATTAGC(SEQID NO:12);
下游引物trpED-down:CGGTCAGCACCCCCATCTCC(SEQ ID NO:13);
这两对引物是trpED两端的序列,敲除前扩增序列长度为4.2kb,敲除后(tetA重组)扩增序列长度为2.5kb,tal-4cl-cat重组后扩增序列长度为6.7kb,cat敲除后扩增序列长度为5.4kb。
(7)E.coli BW25113(△tyrR::sts,△trpED::tal-4cl)的构建:敲除tal-4cl下游的cat,同实施例2(8),见图2。
实施例4E.coli BW25113(△tyrR::sts,△trpED::tal-4cl)菌种诱导表达情况
芪合酶sts基因序列长度为1179bp,蛋白STS由392个氨基酸组成,相对分子量为43.12KDa;酪氨酸解氨酶tal基因序列长度为2082bp,蛋白TAL由693个氨基酸组成,相对分子量为76.23KDa;4-香豆酸:辅酶A连接酶4cl基因序列长度为1632bp,4-香豆酸:辅酶A连接酶由543个氨基酸组成,相对分子量为59.73Kda。
将实施例3制备的E.coli BW25113(△tyrR::sts,△trpED::tal-4cl)和E.coliBW25113,分别接种于液体LB培养基内,37℃培养15h后,按1%接种于新鲜液体LB培养基内(100倍扩大),37℃培养近2h后,添加终浓度为1mM的IPTG进行诱导,诱导4.5小时后结束,并行SDS-PAGE电泳检测。菌体中蛋白质表达情况请见附图3所示的电泳图。
发酵检测白藜芦醇的产量;
1)将制备的E.coli BW25113(ΔtyrR::sts,ΔtrpED::tal-4cl-cat)与E.coliBW25113按1%的接种量分别接种于液体LB培养基内,220rpm,30℃,培养12~16h。
取活化后的菌液按1%的接种量接于20mL发酵培养基内,37℃,220rpm,培养2h后,加终浓度为1mM的IPTG,之后转入30℃进行培养,发酵48h后取样检测。
发酵培养基如下:
发酵培养基
另单独配制300g/L的MgSO4·7H2O,400g/L的葡萄糖;每20mL发酵培养基内加300g/L的MgSO4·7H2O 200μL,400g/L的葡萄糖200μL。
2)发酵样品的制备:
取1mL菌液进行离心,8000rpm,10min,去上清,加1mL丙酮后,振荡,再置于超声清洗机内进行超声3h。
超声后的菌液离心,同上。取上清进行旋蒸干燥,再加1mL甲醇进行溶解,即得待测样品。
3)HPLC检测
仪器:依利特P1201高效液相色谱仪(P1201高压恒流泵、UV1201紫外-可见检测器、手动进样阀和EC2006色谱数据工作站)
色谱条件:层析住:Ultimate AQ-C18(55μm)(14×150mm);流动相:42%甲醇,58%水;流速:1mL/min;柱温:35℃;进样量:10μL;紫外检测器波长:306nm;以E.coli BW25113(ΔtyrR::sts,ΔtrpED::tal-4cl-cat)菌种发酵样品为实验检测样品,以E.coli BW25113菌种的发酵样品为对照检测样品。
图4为白藜芦醇标准品(100mg/L)的检测图谱,图5为而E.coliBW25113(ΔtyrR::sts,ΔtrpED::tal-4cl-cat)菌种发酵后样品的检测图谱,图6为对照E.coli BW25113菌种的发酵后样品的检测图谱;白藜芦醇标准品(100mg/L)的峰(图4所示)保留时间为10.67417min,峰面积为8883.54mv.sec,对照菌种的发酵样品(图6所示)的峰的保留时间为峰保留时间10.64917min,峰面积为0.56mv.sec,实施例3制备的E.coliBW25113(ΔtyrR::sts,ΔtrpED::tal-4cl-cat)所得的发酵样品的峰(图5所示)保留时间10.65250min,峰面积65.03mv.sec;所制备的菌种的发酵样品中的白藜芦醇较空白菌种样品中的量有较大提高。
本发明虽然已以较佳实施例公开如上,但其并不是用来限定本发明,任何本领域技术人员在不脱离本发明的精神和范围内,都可以利用上述揭示的方法和技术内容对本发明技术方案做出可能的变动和修改,因此,凡是未脱离本发明技术方案的内容,依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化及修饰,均属于本发明技术方案的保护范围。
Claims (10)
1.一种合成白藜芦醇的基因工程菌,其特征是,该基因工程菌是在E.coliBW25113菌种中敲除限制葡萄糖合成酪氨酸的基因tyrR和trpED,并且其染色体重组有粘红酵母的酪氨酸脱氨酶基因tal、欧芹的4-香豆酸:辅酶A连接酶基因4cl和葡萄的芪合酶基因sts;该基因工程菌以葡萄糖为底物合成白藜芦醇。
2.如权利要求1所述的一种合成白藜芦醇的基因工程菌,其特征是,所述的酪氨酸脱氨酶基因tal置换敲除所述限制葡萄糖合成酪氨酸的基因tyrR;所述4-香豆酸:辅酶A连接酶基因4cl和芪合酶基因sts置换敲除所述限制葡萄糖合成酪氨酸的基因trpED。
3.如权利要求1或2所述的一种合成白藜芦醇的基因工程菌,其特征是,所述的酪氨酸脱氢酶基因tal的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示;所述4-香豆酸:辅酶A连接酶基因4cl的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示;所述的芪合酶基因sts核苷酸序列如SEQ IN NO:3所示。
4.构建权利要求1-3所述合成白藜芦醇的基因工程菌的方法,其特征是,步骤如下:
1)分别获取芪合酶基因sts、酪氨酸脱氢酶基因tal和4-香豆酸:辅酶A连接酶基因4cl,并构建重组质粒pET-sts和pET-tal-4cl;
2)以步骤1)中重组质粒pET-sts和pET-tal-4cl为模板分别PCR扩增出携带有T7启动子和终止子的sts基因片段和tal-4cl基因片段,然后将所述扩增后的基因片段导入质粒pTKIP-cat中并构建重组质粒pTKIP-sts-cat和pTKIP-tal-4cl-cat;
3)以线性化的质粒pTKS/CS为模板,分别用含有基因tyrR和trpED同源重组序列的引物PCR扩增出分别带有同源重组序列的四环素抗性基因tetA序列;
4)将步骤3)带有基因tyrR同源重组序列的tetA序列转化于携带pTKRed质粒的E.coli BW25113菌株细胞中,并筛选出阳性菌株E.coli BW25113(△tyrR::tetA)/pTKRed;其中,所述携带pTKRed质粒的E.coli BW25113菌株在转化前经IPTG诱导;
5)将步骤2)中构建的重组质粒pTKIP-sts-cat转化于步骤4)中阳性菌种E.coli BW25113(△tyrR::tetA)/pTKRed的菌株细胞中,然后涂布于含有抗生素的固体培养基上后培养;
6)将步骤5)中培养基上的重组菌种置于含有大观霉素和氨苄霉素的M9培养基中活化,后接种于只含有大观霉素的M9培养基中,待OD600≈0.6时加入IPTG和L-阿拉伯糖诱导过夜后,再加入氯霉素培养后,涂布于含有氯霉素抗性平板中培养过夜;
7)挑取步骤6)中菌落中分别点于四环素抗性平板、氨苄霉素抗性平板及氯霉素抗性平板上后培养,选择四环素抗性平板和氨苄霉素抗性平板不生长,而氯霉素抗性平板上生长的菌落再经过PCR验证后,进一步经测序验证后,得到阳性菌种E.coli BW25113(△tyrR::sts-cat);然后,敲除菌种E.coliBW25113(△tyrR::sts-cat)中基因sts下游的氯霉素基因cat,获得菌种E.coliBW25113(△tyrR::sts);
8)利用步骤7)制备的菌种E.coli BW25113(△tyrR::sts)导入质粒pTKRed并构建E.coli BW25113(△tyrR::sts)/pTKRed菌种,然后将带有基因trpED同源重组序列的tetA序列采用步骤4)中同样的方法导入上述菌种中并构建得到E.coli BW25113(△tyrR::sts,△trpED::tetA)/pTKRed菌种;
9)将步骤2)中所述的重组质粒pTKIP-tal-4cl-cat转入步骤8)中构建的E.coli BW25113(△tyrR::sts,△trpED::tetA)/pTKRed菌种中并获得菌种E.coliBW25113(△tyrR::sts,△trpED::tetA)/pTKRed/pTKIP-tal-4cl-cat,并采用步骤5)-7)的方法获得阳性菌种E.coli BW25113(△tyrR::sts,△trpED::tal-4cl-cat);随后采用步骤7)中同样的方法敲除tal-4cl基因下游的氯霉素基因cat,获得合成白藜芦醇的基因工程菌E.coli BW25113(△tyrR::sts,△trpED::tal-4cl)。
5.如权利要求4所述的构建合成白藜芦醇的基因工程菌的方法,其特征是,所述步骤2)中PCR所用正向引物如SEQ NO ID:4所示,反向引物如SEQ NOID:5所示。
6.如权利要求4所述的构建合成白藜芦醇的基因工程菌的方法,其特征是,所述步骤3)中用于PCR扩增含有基因tyrR同源重组序列的正向引物如SEQ NOID:6所示,反向引物如SEQ NO ID:7所示。
7.如权利要求4或6所述的构建合成白藜芦醇的基因工程菌的方法,其特征是,所述步骤3)中用于PCR扩增含有基因trpED同源重组序列的正向引物如SEQNO ID:10所示,反向引物如SEQ NO ID:11所示。
8.如权利要求4所述的构建合成白藜芦醇的基因工程菌的方法,其特征是,所述步骤4)中携带pTKRed质粒的E.coli BW25113菌种首先接种于LB液体培养基中,待OD600≈0.3时,加IPTG至终浓度为2mM;继续诱导培养,待OD600≈0.6时,制备用于转化的感受态细胞。
9.如权利要求4所述的构建合成白藜芦醇的基因工程菌的方法,其特征是,所述步骤6)中IPTG的终浓度为2mM,L-阿拉伯糖的终浓度为0.2%;所述的大观霉素的浓度为100mg/L,所述氨苄霉素的浓度为100mg/L,所述氯霉素的浓度为34mg/L。
10.如权利要求4所述的构建合成白藜芦醇的基因工程菌的方法,其特征是,步骤7)和步骤9)中所述敲除氯霉素基因cat的方法如下:
将质粒pCP20转化入菌种细胞中并涂布于氨苄霉素抗性平板上,置于温箱中培养后,经菌落PCR验证后筛选得到阳性菌种。
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