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CN105999293A - Cd37结合分子及其免疫缀合物 - Google Patents

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CN105999293A CN201610305409.3A CN201610305409A CN105999293A CN 105999293 A CN105999293 A CN 105999293A CN 201610305409 A CN201610305409 A CN 201610305409A CN 105999293 A CN105999293 A CN 105999293A
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Abstract

本发明公开了使用CD37试剂(包括,但不限于,结合CD37的抗体和免疫缀合物)消减B细胞(例如,非癌性B细胞)的用于治疗自身免疫性和炎性疾病的方法。本发明进一步公开了特异结合CD37的抗体的轻链可变区和重链可变区的序列。

Description

CD37结合分子及其免疫缀合物
本申请是申请日为2012年3月30日、中国专利申请号为201280014646.4(国际申请号为PCT/US2012/031648)、发明名称为“CD37结合分子及其免疫缀合物”的发明专利申请的分案申请。
发明领域
本发明的领域总体上涉及结合CD37的抗体、其抗原结合片段、多肽以及免疫缀合物,以及使用所述CD37结合分子用于治疗疾病(如自身免疫性疾病和炎性疾病)的方法。
发明背景
白细胞抗原CD37(“CD37”)(还被称为GP52-40、四次跨膜蛋白(tetraspanin)-26或TSPAN26)是四次跨膜蛋白超家族的跨膜蛋白(Maecker等,1997FASEB J.11:428-442)。它是具有四个跨膜结构域的高度糖基化蛋白,其在前B细胞阶段至外周成熟B细胞阶段的过程中表达于B细胞上,但是据报道在终末分化成浆细胞时不存在。(Link等,1987,J Pathol.152:12-21)。CD37抗原在T细胞、骨髓细胞以及粒细胞上仅被弱表达(Schwartz-Albiez等.1988,J.Immunol.,140(3)905-914)。然而,CD37还表达于恶性B细胞上,如构建非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkin’s lymphoma)(NHL)和慢性淋巴细胞白血病(chronic lymphoid leukemia)(CLL)的那些(Moore等.1986,J Immunol.137(9):3013-8)。
虽然CD37的确切生理作用还不清楚,但是CD37缺陷小鼠中的研究提示了免疫调节功能。虽然缺乏CD37表达的小鼠具有正常的发育(Knobeloch等.2000,Mol Cell Biol.,20(15):5363-9),但是在C57/B16背景下,CD37-/-T细胞是过度增生的(van Spriel等,JImmunol.172,2953(2004)),CD37-/-树突细胞(DC)表现出增加的抗原呈递(Sheng等,Eur JImmunol.39,50(2009)),并且CD37-/-巨噬细胞显示增加的dectin-1诱导的IL-6产生(Meyer-Wentrup等,J Immunol.178,154(2007))。CD37缺陷C57/B16小鼠还包含比野生型小鼠显著更高水平的IgA(van Spriel等,PLoS Pathol.5,e1000338(2009)和Rops等,Am JPathol.176,2188(2010))。所有这些结果提示了CD37在免疫系统中的总体调节作用。有趣的是,CD37抗原由人T细胞上的抗体交联抑制了由CD3刺激诱导的T细胞增殖(van Spriel等,J Immunol.172,2953(2004))。
抗体正成为用于治疗人类疾病(包括自身免疫性疾病)的有希望的方法。当前,被称为利妥昔单抗(rituximab)的抗CD20抗体已被批准用于类风湿性关节炎(RA)治疗(Edwards JC等.2006,Nat Rev Immunol.6:119)。利妥昔单抗在美国与甲氨蝶呤(MTX)联合使用来减少患有中度至重度活动性RA的成人患者中的病征和症状,所述患者对至少一种TNF拮抗剂具有不充分反应。许多研究致力于利妥昔单抗在多种非恶性自身免疫性或炎性病症(包括RA)中的用途,其中B细胞和自身抗体似乎在疾病的病理生理学中起作用。Edwards等,Biochem Soc.Trans.30:824-828(2002)。据报道使用抗CD20抗体靶向CD20可能缓解很多自身免疫性或炎性疾病的病征和症状,所述疾病包括,例如,RA(Leandro等,Ann.Rheum.Dis.61:883-888(2002);Edwards等,Arthritis Rheum.,46(增刊9):S46(2002);Stahl等,Ann.Rheum.Dis.,62(增刊1):OP004(2003);Emery等,ArthritisRheum.48(9):S439(2003))、狼疮(Eisenberg,Arthritis.Res.Ther.5:157-159(2003);Leandro等.Arthritis Rheum.46:2673-2677(2002);Gorman等,Lupus,13:312-316(2004))、免疫性血小板减少性紫癜(D'Arena等,Leuk.Lymphoma 44:561-562(2003);Stasi等,Blood,98:952-957(2001);Saleh等,Semin.Oncol.,27(Supp 12):99-103(2000);Zaja等,Haematologica,87:189-195(2002);Ratanatharathorn等,Ann.Int.Med.,133:275-279(2000))、纯红细胞再生障碍(Auner等,Br.J.Haematol.,116:725-728(2002));自身免疫性贫血(Zaja等,同前(勘误表刊登于Haematologica 87:336(2002))、冷凝集素病(Layios等,Leukemia,15:187-8(2001);Berentsen等,Blood,103:2925-2928(2004);Berentsen等,Br.J.Haematol.,115:79-83(2001);Bauduer,Br.J.Haematol.,112:1083-1090(2001);Zaja等,Br.J.Haematol.,115:232-233(2001))、具有严重胰岛素抵抗的B型综合征(Coll等,N.Engl.J.Med.,350:310-311(2004)、混合型冷球蛋白血症(DeVita等,ArthritisRheum.46增刊9:S206/S469(2002))、重症肌无力(Zaja等,Neurology,55:1062-1063(2000);Wylam等,J.Pediatr.,143:674-677(2003))、韦格纳氏肉芽肿病(Wegener'sgranulomatosis)(Specks等,Arthritis&Rheumatism 44:2836-2840(2001))、显微镜下多血管炎(MPA)、难治性寻常型天疱疮(Dupuy等,Arch Dermatol.,140:91-96(2004))、皮肤肌炎(Levine,Arthritis Rheum.,46(增刊9):S1299(2002))、斯耶格伦氏综合征(Sjogren'ssyndrome)(Somer等,Arthritis&Rheumatism,49:394-398(2003))、活动性II型混合冷球蛋白血症(Zaja等,Blood,101:3827-3834(2003))、寻常型天疱疮(Dupay等,Arch.Dermatol.,140:91-95(2004))、自身免疫性神经病(Pestronk等,J.Neurol.Neurosurg.Psychiatry74:485-489(2003))、副肿瘤性眼阵挛-肌阵挛综合征(paraneoplastic opsoclonus-myoclonus syndrome)(Pranzatelli等.Neurology 60(增刊1)PO5.128:A395(2003))、以及复发-缓解型多发性硬化症(relapsing-remitting multiple sclerosis)(RRMS)。Cross等.(摘要)“Preliminary Results from a Phase II Trial of Rituximab in MS”美国多发性硬化症研究和治疗委员会的第八次年度会议(Eighth Annual Meeting of theAmericas Committees for Research and Treatment in Multiple Sclerosis),20-21(2003)。
在动物模型中,已证明使用抗B细胞抗原(如CD20)的抗体的B细胞消减抑制或改善了一些自身免疫性疾病,包括系统性红斑性狼疮(SLE)、实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE;多发性硬化症的小鼠模型)、1型糖尿病(T1D)以及类风湿性关节炎(RA)。已证明利妥昔单抗在动物模型和患者中在体内消减恶性和正常B细胞(Maloney DG等,Blood.1994;84(8):2457-66;Reff ME,等.Blood.1994;83(2):435-45;C,等.TransplImmunol.2003;12(1):19-28)。它还可以在体外实验中消减来自人外周血单核细胞(PBMC)的正常B细胞(Vugmeyster Y,等,Cytometry A.2003;52(2):101-9;Vugmeyster Y和HowellK.Int Immunopharmacol.2004;4(8):1117-24)。
Campath-1H(阿伦单抗(alumtuzumab))(一种抗CD52嵌合IgG1)结合CD52抗原,所述CD52抗原在所有淋巴细胞上高度表达(Ginaldi L,等,Leuk Res.1998Feb;22(2):185-91;Hale G,等,Tissue Antigens.1990Mar;35(3):118-27)。它用于患者中来消减恶性淋巴细胞并且被批准用于治疗慢性淋巴细胞性白血病。它还显示出在治疗多发性硬化症中的功效并且目前在III期临床测试中(N Engl J Med 2008;359:1786-1801;ClinicalTrials.gov NCT00530348&NCT00548405)。还已经证明它在体外消减正常淋巴细胞(Hale G,等.Blood.1983Oct;62(4):873-82;Waldmann H和Hale G Philos Trans R SocLond B Biol Sci.2005Sep29;360(1461):1707-11)。
CD37结合剂还正在作为用于B细胞恶性肿瘤的潜在治疗剂而进行测试。EmergentBiosolutions(以前的Trubion Pharmaceuticals)研发了CD37结合剂SMIP-016和TRU-016(Zhao等,2007,Blood,110:2569-2577)。SMIP-016是包括来自杂交瘤的可变区和工程改造的人恒定区的单链多肽。TRU-016是抗CD37SMIP蛋白的人源化型式。参见例如美国公布申请号2007/0059306。TRU-016正在针对治疗慢性淋巴细胞性白血病(CLL)进行临床测试。Boehringer Ingelheim还在国际公布申请号WO 2009/019312中公开了CD37结合剂。然而,还没有针对这些结合剂中的任一种描述CDC活性,并且还未在不存在交联剂的情况下描述体外促细胞凋亡活性。
已经在两个单独的试验中使用放射性标记的抗CD37抗体MB-1尝试了放射免疫疗法(RIT)。将131I-MB-1的治疗剂量施用至六名复发的NHL患者(Press等.1989J ClinOncol.7(8):1027-38;Press等.1993,N Engl J Med.329(17):1219-24)。所有六名患者在四至三十一个月的持续时间中实现完全缓解(CR)。在另一个试验中,将131I-MB-1施用至十名复发的NHL患者(Kaminski等.1992J Clin Oncol.10(11):1696-711)。总共四名患者在二至六个月的持续时间范围内具有反应,但是仅报道一例CR。然而,由于放射性标记的不利生物分布(其引起了对重要非靶器官的辐射暴露的关注),不是所有患者都可以被治疗。的确,在这些试验中观察到了RIT相关的毒性,包括严重的骨髓抑制和心肺毒性。虽然这些临床数据表明抗CD37放射性免疫缀合物可能有效,但是这些疗法的施用麻烦,并且由于与高剂量的辐射相关联的风险,在复发时RIT后患者不能用RIT进行再治疗。
为了克服RIT的局限性,已经研发了抗体-细胞毒性剂缀合物(ACC),其还被称为抗体-药物缀合物(ADC)。这些是包含通过化学接头而共价连接至抗体的细胞毒性剂的免疫缀合物,所述免疫缀合物可以允许细胞毒性药物特异性地递送至表达由所述抗体识别的蛋白质的细胞。然而,不良地内化的蛋白质不被认为是对于这类治疗的有利靶标。CD37在结构上与CD20类似,因为两种抗原都包含四个跨膜结构域,但是CD20不是四次跨膜蛋白家族的一部分(Tedder等.1989,J.Immun.142:2560-2568)。已经研究了抗一些B细胞抗原(包括CD37和CD20)的抗体经受内吞和降解的能力(Press等.1989,Cancer Res.49(17):4906-12,和Press等.1994,Blood.83(5):1390-7)。抗CD37抗体MB-1被保留在细胞表面上并且在体外在Daudi淋巴瘤细胞中缓慢内化。MB-1抗体还在体外在NHL患者细胞中具有低速率的内吞作用和细胞内代谢。用抗CD20抗体1F5获得类似结果,所述抗CD20抗体1F5也主要地保留在淋巴瘤细胞表面上并且不良地内化。之前已经对CD20抗体的ADC进行了研究,但是还未证实显著强的效力,尤其是当使用非二硫键或酸稳定性接头时(参见例如Polson等,2009,CancerRes.,69(6):2358-2364)。鉴于这些观察,CD37还未被视为抗体-药物缀合物的有利靶标。
虽然已经对它们在癌症治疗中的作用进行了研究,但是CD37导向的治疗如抗体、抗体衍生物或放射性免疫缀合物对自身免疫性疾病、炎性疾病或免疫系统其它病症中涉及的细胞的潜在作用还未充分了解。此外,以上描述的这些化合物无一被证实诱导这些类型疾病的表现或进展中所涉及的靶细胞的消减。
因此,对于CD37结合剂(包括抗体、其抗原结合片段以及抗体-药物缀合物(免疫缀合物))作为治疗自身免疫性疾病、炎性疾病或免疫系统其它病症的手段存在需要。本发明解决这一需要。
发明概述
一方面,本公开提供一种用于消减B细胞或治疗与异常B细胞活性相关的疾病的方法,所述方法包括对患者施用有效量的本文提供的人源化CD37靶向性抗体或免疫缀合物。在一些实施方案中,所述B细胞是非癌性B细胞。在一些实施方案中,所述B细胞不会过量表达CD37。
在某些实施方案中,与异常B细胞活性相关的疾病是与B细胞自身抗体产生相关的疾病,和/或与结合B细胞通路的不适当的T细胞刺激相关的疾病。
在某些实施方案中,以自身抗体产生为特征的疾病是类风湿性关节炎、多发性硬化症、I型糖尿病、特发性炎性肌病、系统性红斑狼疮(SLE)、重症肌无力、格雷夫斯氏病(Grave's disease)、皮肤肌炎、多发性肌炎或其它自身免疫性疾病。
在某些实施方案中,本公开提供一种用于消减B细胞的方法,所述方法包括将B细胞(例如,呈包含非癌性B细胞的细胞群)与特异性地结合CD37的抗体或其抗原结合片段相接触,其中所述抗体或其片段能够在不存在交联剂的情况下在体外诱导细胞凋亡。在某些实施方案中,本公开提供一种用于治疗患有自身免疫性或炎性疾病的患者的方法,所述方法包括对所述患者施用治疗有效量的特异性地结合CD37的抗体或其抗原结合片段,其中所述抗体或其片段能够在不存在交联剂的情况下在体外诱导细胞凋亡。在一些实施方案中,所述抗体或其抗原结合片段还能够诱导补体依赖性细胞毒性(CDC)。在一些实施方案中,所述抗体或其抗原结合片段还能够诱导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。在一些实施方案中,所述抗体或其抗原结合片段具有长的血清半衰期。
在某些实施方案中,本公开提供一种用于消减B细胞的方法,所述方法包括将B细胞(例如,呈包含非癌性B细胞的细胞群)和与选自由以下组成的组的抗体特异性地结合相同CD37表位的抗体或其抗原结合片段相接触:(a)包含SEQ ID NO:55的多肽和SEQ ID NO:72的多肽的抗体;(b)包含SEQ ID NO:56的多肽和SEQ ID NO:73的多肽的抗体;(c)包含SEQID NO:57的多肽和SEQ ID NO:74的多肽的抗体;(d)包含SEQ ID NO:58的多肽和SEQ IDNO:74的多肽的抗体;(e)包含SEQ ID NO:59的多肽和SEQ ID NO:75的多肽的抗体;(f)包含SEQ ID NO:60的多肽和SEQ ID NO:76的多肽的抗体;(g)包含SEQ ID NO:61的多肽和SEQID NO:77的多肽的抗体;(h)包含SEQ ID NO:62的多肽和SEQ ID NO:78的多肽的抗体;(i)包含SEQ ID NO:63的多肽和SEQ ID NO:79的多肽的抗体;(j)包含SEQ ID NO:64的多肽和SEQ ID NO:80的多肽的抗体;(k)包含SEQ ID NO:65的多肽和SEQ ID NO:81的多肽的抗体;(l)包含SEQ ID NO:66的多肽和SEQ ID NO:82的多肽的抗体;(m)包含SEQ ID NO:67的多肽和SEQ ID NO:83的多肽的抗体;(n)包含SEQ ID NO:68的多肽和SEQ ID NO:84的多肽的抗体;(o)包含SEQ ID NO:69的多肽和SEQ ID NO:85的多肽的抗体;(p)包含SEQ ID NO:70的多肽和SEQ ID NO:86的多肽的抗体;(q)包含SEQ ID NO:71的多肽和SEQ ID NO:87的多肽的抗体;以及(r)包含SEQ ID NO:177的多肽和SEQ ID NO:178的多肽的抗体。
在某些实施方案中,本公开提供一种用于治疗患有自身免疫性或炎性疾病的患者的方法,所述方法包括对所述患者施用治疗有效量的与选自以上所描述的组的抗体特异性地结合相同CD37表位的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中,所述抗体或其抗原结合片段竞争地抑制选自以上所描述的组的抗体。
在某些实施方案中,本公开提供一种用于消减B细胞的方法,所述方法包括将B细胞(例如,呈包含非癌性B细胞的细胞群)与特异性地结合CD37并且特异性地结合SEQ IDNO:184的多肽的抗体或其抗原结合片段相接触。在某些实施方案中,本公开提供一种用于治疗患有自身免疫性或炎性疾病的患者的方法,所述方法包括对所述患者施用治疗有效量的特异性地结合CD37并且特异性地结合SEQ ID NO:184的多肽的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中,所述抗体或其抗原结合片段不会结合SEQ ID NO:185的多肽。
在某些实施方案中,本公开提供一种用于消减B细胞的方法,所述方法包括将B细胞(例如,呈包含非癌性B细胞的细胞群)与特异性地结合CD37并且不会特异性地结合SEQID NO:185的多肽的抗体或其抗原结合片段相接触。在某些实施方案中,本公开提供一种用于治疗患有自身免疫性或炎性疾病的患者的方法,所述方法包括对所述患者施用治疗有效量的特异性地结合CD37并且不会特异性地结合SEQ ID NO:185的多肽的抗体或其抗原结合片段。
在某些实施方案中,本公开提供一种用于消减B细胞的方法,所述方法包括将B细胞(例如,呈包含非癌性B细胞的细胞群)与由选自由以下组成的组的杂交瘤产生的抗体或其抗原结合片段相接触:ATCC保藏名称PTA-10664,2010年2月18日保藏在ATCC;ATCC保藏名称PTA-10665,2010年2月18日保藏在ATCC;ATCC保藏名称PTA-10666,2010年2月18日保藏在ATCC;ATCC保藏名称PTA-10667,2010年2月18日保藏在ATCC;ATCC保藏名称PTA-10668,2010年2月18日保藏在ATCC;ATCC保藏名称PTA-10669,2010年2月18日保藏在ATCC;以及ATCC保藏名称PTA-10670,2010年2月18日保藏在ATCC。在某些实施方案中,本公开提供一种用于治疗患有自身免疫性或炎性疾病的患者的方法,所述方法包括对所述患者施用治疗有效量的由以上所描述的杂交瘤产生的抗体或其抗原结合片段。
在某些实施方案中,本公开提供一种用于消减B细胞的方法,所述方法包括将B细胞(例如,呈包含非癌性B细胞的细胞群)与特异性地结合CD37的抗体或其抗原结合片段相接触,其中所述抗体包含选自由以下组成的组的多肽序列:(a)SEQ ID NO:4、5以及6和SEQID NO:28、29以及30;(b)SEQ ID NO:7、8以及9和SEQ ID NO:31、32以及33;(c)SEQ ID NO:10、11以及12和SEQ ID NO:34、35以及36;(d)SEQ ID NO:13、14以及15和SEQ ID NO:37、38以及39;(e)SEQ ID NO:13、14以及15和SEQ ID NO:37、40以及39;(f)SEQ ID NO:16、17以及18和SEQ ID NO:41、42以及43;(g)SEQ ID NO:19、20以及21和SEQ ID NO:44、45以及46;(h)SEQ ID NO:19、20以及21和SEQ ID NO:44、47以及46;(i)SEQ ID NO:22、23以及24和SEQ IDNO:48、49以及50;(j)SEQ ID NO:22、23以及24和SEQ ID NO:48、51以及50;(k)SEQ ID NO:25、26以及27和SEQ ID NO:52、53以及54;(l)SEQ ID NO:171、172或181以及173和SEQ IDNO:174、175以及176;(m)包含1、2、3或4个保守性氨基酸取代的(a)至(l)的变体。在某些实施方案中,本公开提供一种用于治疗患有自身免疫性或炎性疾病的患者的方法,所述方法包括对所述患者施用治疗有效量的特异性地结合CD37的抗体或其抗原结合片段,其中所述抗体包含选自以上所描述的组的多肽序列。在一些实施方案中,所述抗体或其抗原结合片段包含与以上所描述的多肽序列至少90%相同的多肽序列。在一些实施方案中,所述多肽序列与所述多肽序列至少95%相同。在一些实施方案中,所述多肽序列与所述多肽序列至少99%相同。在一些实施方案中,所述抗体或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO:57和SEQID NO:74的多肽序列至少90%相同、至少95%相同、至少99%相同或完全相同的多肽序列。在一些实施方案中,所述抗体或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO:58和SEQ ID NO:74的多肽序列至少90%相同、至少95%相同、至少99%相同或完全相同的多肽序列。在一些实施方案中,所述抗体或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO:63和SEQ ID NO:79的多肽序列至少90%相同、至少95%相同、至少99%相同或完全相同的多肽序列。在一些实施方案中,所述抗体或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO:65和SEQ ID NO:81的多肽序列至少90%相同、至少95%相同、至少99%相同或完全相同的多肽序列。
在一些实施方案中,所述抗体或其抗原结合片段是鼠的、非人的、人源化的、嵌合的、表面重构的或人的。
在一些实施方案中,所述抗体或抗体片段能够在不存在交联剂的情况下在体外诱导表达CD37的细胞的细胞凋亡。在一些实施方案中,所述抗体或抗原结合片段能够诱导补体依赖性细胞毒性(CDC)。在一些实施方案中,所述抗体能够诱导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。
在某些实施方案中,本公开提供一种用于消减B细胞的方法,所述方法包括将B细胞(例如,呈包含非癌性B细胞的细胞群)与特异性地结合CD37的人或人源化抗体或其抗原结合片段相接触,其中所述抗体或其片段能够在不存在交联剂的情况下在体外诱导表达CD37的细胞的细胞凋亡。在某些实施方案中,本公开提供一种用于治疗患有自身免疫性或炎性疾病的患者的方法,所述方法包括对患者施用治疗有效量的特异性地结合CD37的人或人源化抗体或其抗原结合片段,其中所述抗体或其片段能够在不存在交联剂的情况下在体外诱导表达CD37的细胞的细胞凋亡。在一些实施方案中,所述人或人源化抗体或其抗原结合片段还能够诱导补体依赖性细胞毒性(CDC)。在一些实施方案中,所述人或人源化抗体或其抗原结合片段还能够诱导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。
在一些实施方案中,所述抗体或抗原结合片段结合人CD37和猕猴CD37。
在一些实施方案中,所述抗体是全长抗体。在一些实施方案中,使用抗原结合片段。在一些实施方案中,所述抗体或其抗原结合片段包含Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、单链Fv或scFv、二硫键连接的Fv、V-NAR域、IgNar、胞内抗体、IgGΔCH2、微型抗体、F(ab')3、四链抗体、三链抗体、双链抗体、单域抗体、DVD-Ig、Fcab、mAb2、(scFv)2或scFv-Fc。
在一些实施方案中,所述抗体或其抗原结合片段经由接头(L)连接至细胞毒性剂(C)以形成免疫缀合物。
在某些实施方案中,本公开提供一种用于消减B细胞的方法,所述方法包括将B细胞(例如,呈包含非癌性B细胞的细胞群)与包含具有式(A)-(L)-(C)的免疫缀合物的组合物相接触,其中:(A)是特异性地结合CD37的抗体或抗原结合片段;(L)是不可裂解的接头;并且(C)是细胞毒性剂;并且其中接头(L)连接(A)与(C)。在某些实施方案中,本公开提供一种用于治疗患有自身免疫性或炎性疾病的患者的方法,所述方法包括对所述患者施用治疗有效量的包含具有式(A)-(L)-(C)的免疫缀合物的组合物,其中:(A)是特异性地结合CD37的抗体或抗原结合片段;(L)是不可裂解的接头;并且(C)是细胞毒性剂;并且其中接头(L)连接(A)与(C)。在一些实施方案中,所述免疫缀合物的血清半衰期与裸抗体的血清半衰期相当。
在某些实施方案中,本公开提供一种用于消减B细胞的方法,所述方法包括将B细胞(例如,呈包含非癌性B细胞的细胞群)与包含具有式(A)-(L)-(C)的免疫缀合物的组合物相接触,其中:(A)是特异性地结合CD37的抗体或抗原结合片段;(L)是接头;并且(C)是美登木素(maytansinoid);并且其中接头(L)连接(A)与(C)。在某些实施方案中,本公开提供一种用于治疗患有自身免疫性或炎性疾病的患者的方法,所述方法包括对所述患者施用治疗有效量的包含具有式(A)-(L)-(C)的免疫缀合物的组合物,其中:(A)是特异性地结合CD37的抗体或抗原结合片段;(L)是接头;并且(C)是美登木素;并且其中接头(L)连接(A)与(C)。
在一些实施方案中,所述接头是不可裂解的接头。在一些实施方案中,所述免疫缀合物进一步包含第二(C)。在一些实施方案中,所述免疫缀合物进一步包含第三(C)。在一些实施方案中,所述免疫缀合物进一步包含第四(C)。在一些实施方案中,所述免疫缀合物包含2至6个(C)。在一些实施方案中,所述免疫缀合物包含3至4个(C)。
在一些实施方案中,所述接头选自由以下组成的组:可裂解的接头、不可裂解的接头、亲水性接头以及基于二羧酸的接头。在一些实施方案中,所述接头选自由以下组成的组:4-(2-吡啶基二硫代)戊酸N-琥珀酰亚胺酯(SPP);4-(2-吡啶基二硫代)丁酸N-琥珀酰亚胺酯(SPDB)或4-(2-吡啶基二硫代)-2-磺基丁酸N-琥珀酰亚胺酯(磺基-SPDB);4-(马来酰亚胺基甲基)环己烷羧酸N-琥珀酰亚胺酯(SMCC);4-(马来酰亚胺基甲基)环己烷羧酸N-磺基琥珀酰亚胺酯(磺基SMCC);4-(碘代乙酰基)-氨基苯甲酸N-琥珀酰亚胺酯(SIAB);以及N-琥珀酰亚胺基-[(N-马来酰亚胺基丙酰胺基)-四乙二醇]酯(NHS-PEG4-马来酰亚胺)。在一些实施方案中,所述接头是N-琥珀酰亚胺基-[(N-马来酰亚胺基丙酰胺基)-四乙二醇]酯(NHS-PEG4-马来酰亚胺)。
在一些实施方案中,所述细胞毒性剂选自由以下组成的组:美登木素、美登木素类似物、阿霉素(doxorubicin)、修饰的阿霉素、苯二氮(benzodiazepine)、紫杉烷类(taxoid)、CC-1065、CC-1065类似物、倍癌霉素(duocarmycin)、倍癌霉素类似物、卡奇霉素(calicheamicin)、多拉司他汀(dolastatin)、多拉司他汀类似物、奥利斯他汀(auristatin)、托马霉素(tomaymycin)衍生物、以及来普霉素(leptomycin)衍生物或所述药剂的前药。在一些实施方案中,所述细胞毒性剂是美登木素。在一些实施方案中,所述细胞毒性剂是N(2')-脱乙酰基-N(2')-(3-巯基-1-氧代丙基)-美登素(maytansine)(DM1)或N(2')-脱乙酰基-N2-(4-巯基-4-甲基-1-氧代戊基)-美登素(DM4)。
在一些实施方案中,包含免疫缀合物的组合物包含多个细胞毒性剂(C),其中每个(A)平均约3至约4个(C)。在一些实施方案中,所述免疫缀合物具有每个(A)平均约3.5个(C)。在一些实施方案中,所述免疫缀合物具有每个(A)平均约3.5±0.5个(C)。
在一些实施方案中,包含免疫缀合物的组合物包含抗体、SMCC接头以及DM1,所述抗体包含SEQ ID NO:57和SEQ ID NO:74或SEQ ID NO:58和SEQ ID NO:74。在一些实施方案中,包含免疫缀合物的组合物包含抗体、SMCC接头以及DM1,所述抗体包含SEQ ID NO:63和SEQ ID NO:79。在一些实施方案中,包含免疫缀合物的组合物包含抗体、SMCC接头以及DM1,所述抗体包含SEQ ID NO:65和SEQ ID NO:81。
在一些实施方案中,所述抗体或抗原结合片段能够消减B细胞。在一些实施方案中,所述抗体或抗原结合片段能够抑制T细胞反应。
在一些实施方案中,所述B细胞在进一步包含T细胞的组合物中。在一些实施方案中,所述B细胞在包含外周血单核细胞的组合物中。在一些实施方案中,所述外周血单核细胞从人获得。在一些实施方案中,所述B细胞在全血中。在一些实施方案中,所述全血从人获得。在一些实施方案中,所述B细胞在生物体中。在一些实施方案中,所述B细胞在患有自身免疫性或炎性疾病的患者中。
在一些实施方案中,所述B细胞是自身反应性B细胞。
在一些实施方案中,消减了至少约30%的B细胞。在一些实施方案中,消减了少于约5%的T细胞。
在一些实施方案中,施用第二治疗剂。在一些实施方案中,所述第二治疗剂选自由以下组成的组:甲氨蝶呤、抗CD20治疗剂、抗IL-6受体治疗剂、抗IL-12/23p40治疗剂、化学治疗剂、免疫抑制剂、抗干扰素β-1a治疗剂、醋酸格拉替雷、抗α4-整联蛋白治疗剂、芬戈莫德(fingolimod)、抗BLys治疗剂、CTLA-Fc或抗TNF治疗剂。在一些实施方案中,所述第二治疗剂是针对选自由以下组成的组的抗原的抗体:CD3、CD14、CD19、CD20、CD22、CD25、CD28、CD30、CD33、CD36、CD38、CD40、CD44、CD52、CD55、CD59、CD56、CD70、CD79、CD80、CD103、CD134、CD137、CD138以及CD152。在一些实施方案中,所述第二治疗剂是针对选自由以下组成的组的抗原的抗体:IL-2、IL-6、IL-12、IL-23、IL-12/23p40、IL-17、IFNγ、TNFα、IFNα、IL-15、IL-21、IL-1a、IL-1b、IL-18、IL-8、IL-4、GM-CSF、IL-3以及IL-5。
在一些实施方案中,所述自身免疫性或炎性疾病选自由以下组成的组:类风湿性关节炎、多发性硬化症、I型糖尿病、特发性炎性肌病、系统性红斑性狼疮(SLE)、重症肌无力、格雷夫斯氏病、皮肤肌炎、多发性肌炎、克罗恩氏病(Crohn’s diasease)、溃疡性结肠炎、胃炎、桥本氏甲状腺炎(Hashimoto’s thyroiditis)、哮喘、银屑病、银屑病性关节炎(psoriatic arthritis)、皮肤炎(dertmatitis)、系统性硬皮病和硬化症(systemicsclerodema and sclerosis)、炎性肠病(IBD)、呼吸窘迫综合征(respiratory distresssyndrome)、脑膜炎(meningitis)、脑炎(encephalitis)、葡萄膜炎(uveitis)、肾小球肾炎(glmerulonephritis)、湿疹(eczema)、动脉粥样硬化(atherosclerosis)、白细胞粘附缺陷症(leukocyte adhesion deficiency)、雷诺氏综合征(Raynaud’s syndrome)、斯耶格伦氏综合征(syndrome)、莱特尔氏综合征(Reiter’s disease)、白塞氏综合征(Beheet’s diasease)、免疫复合物性肾炎(immune complex nephritis)、IgA肾病(enphropathy)、IgM多发性神经病(polyneuropathies)、免疫介导的血小板减少症(immune-mediated thrombocytopenias)、急性特发性血小板减少性紫癜(acuteidiopathic thrombocytopenic purpura)、慢性特发性血小板减少性紫癜(chronicidiopathic thembocytopenic purpura)、溶血性贫血(hemolytic anemia)、重症肌无力(myasthenia gravis)、狼疮性肾炎(lupus nephritis)、特应性皮炎(atopicdermatitis)、寻常型天疱疮(pemphigus vulgaris)、眼阵挛-肌阵挛综合征(opsoclonus-myoclonus syndrome)、纯红细胞再生障碍(pure red cell aplasia)、混合型冷球蛋白血症(mixed cryoglobulinermia)、强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis)、丙型肝炎相关的冷球蛋白血症性血管炎(hepatitis C-associated cryoglobulinemic vasculitis)、慢性局灶性脑炎(chronic focal encephalitis)、大疱性类天疱疮(bullous pemphigoid)、甲型血友病(hemophilia A)、膜性增殖性肾小球肾炎(membranoproliferativeglomerulonephritis)、成人和幼年型皮肌炎(adult and juvenile dermatomyositis)、成人多发性肌炎(adult polymyositis)、慢性荨麻疹(chronic urticaria)、原发性胆汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis)、视神经脊髓炎(neuromyelitis optica)、格雷夫斯氏甲状腺机能障碍(Graves’dysthyroid disease)、大疱性类天疱疮(bullous pemphigoid)、膜性增殖性肾小球肾炎(membranoproliferative glomerulonephritis)、丘-施综合征(Churg-Strauss syndrome)、幼年发病型糖尿病(juvenile onset diabetes)、溶血性贫血(hemolytic anemia)、特应性皮炎(atopic dermatitis)、系统性硬化症(systemicsclerosis)、斯耶格伦氏综合征(syndrome)和肾小球性肾炎(glomerulonephritis)、皮肌炎(dermatomyositis)、ANCA、再生障碍性贫血(aplasticanemia)、自身免疫性溶血性贫血(autoimmune hemolytic anemia)(AIHA)、因子VIII缺乏症(factor VIII deficiency)、甲型血友病(hemophilia A)、自身免疫性中性粒细胞减少症(autoimmune neutropenia)、卡斯特氏综合征(Castleman's syndrome)、古德帕斯丘氏综合征(Goodpasture's syndrome)、实体器官移植排斥反应(solid organ transplantrejection)、移植物抗宿主疾病(graft versus host disease)(GVHD)、自身免疫性肝炎(autoimmune hepatitis)、淋巴细胞性间质性肺炎(lymphoid interstitialpneumonitis)、HIV、闭塞性细支气管炎(bronchiolitis obliterans)(非移植)、格林-巴利综合征(Guillain-Barre Syndrome)、大血管性血管炎(large vessel vasculitis)、巨细胞动脉炎(giant cell(高安氏(Takayasu's))arteritis)、中等血管性血管炎(mediumvessel vasculitis)、川崎氏病(Kawasaki's Disease)、结节性多动脉炎(polyarteritisnodosa)、韦格纳氏肉芽肿病(Wegener’s granulomatosis)、显微镜下多血管炎(microscopic polyangiitis)(MPA)、欧门氏综合征(Omenn’s syndrome)、慢性肾功能衰竭(chronic renal failure)、急性传染性单核细胞增多症(acute infectiousmononucleosis)、HIV以及疱疹病毒相关的疾病(herpes virus associated diseases)。
附图简述
图1描绘用人B细胞的流式细胞术实验的FL2-H(PE)直方图重叠。显示了以下条件:对于CD19+B细胞的抗体对照(深色填充的)、同种型对照染色(浅色填充的)、抗CD37染色(粗黑线)以及抗CD20染色(虚线)。
图2描绘使用以10μg/mL的huCD37-3、huCD37-3-SMCC-DM1、huCD37-50、huCD37-50-SMCC-DM1、利妥昔单抗、TRU-016或阿伦单抗处理的纯化的人PBMC样本的体外消减实验的结果。在图A和B中示出来自两种不同供体的结果。
图3描绘使用以不同浓度的huCD37-3-SMCC-DM1处理的纯化的人PBMC样本的体外消减实验的结果。在图A和B中示出来自两种不同供体的结果。图3(C)示出使用huCD37-3、huCD37-38、huCD37-50以及huCD37-56的结果。
图4描绘使用以10μg/mL的huCD37-3、huCD37-3-SMCC-DM1、huCD37-50、huCD37-50-SMCC-DM1、利妥昔单抗、TRU-016或阿伦单抗处理的未纯化的全人血样本的体外消减实验的结果。
图5描绘使用以不同浓度的(A)huCD37-3、huCD37-3-SMCC-DM1以及利妥昔单抗和(B)huCD37-3、huCD37-3-SMCC-DM1、huCD37-50以及利妥昔单抗处理的未纯化的全人血样本的体外消减实验的结果。
图6描绘通过酶联免疫斑点法(ELISpot)测量为每5×10E5外周血单核细胞(PBMC)的斑点数目的IFN-γ(干扰素)、TNF-α(肿瘤坏死因子)以及IL-6(白细胞介素-6)的释放,所述外周血单核细胞来自用2.5ng/mL至250μg/mL浓度下的化合物孵育18至20小时的一个健康人供体。
图7描绘通过ELISpot测量为每5×105外周血单核细胞(PBMC)的斑点数目的IFN-γ(干扰素)、TNF-α(肿瘤坏死因子)以及IL-6(白细胞介素-6)的释放,所述外周血单核细胞来自用2.5ng/mL至250μg/mL浓度下的化合物孵育18至20小时的第二健康人供体。
图8描绘抗muCD37单克隆抗体克隆252-3的结合曲线。
图9示出252-3抗体在C57Bl/6小鼠中消减外周血B细胞(A)和抑制EAE(B)的活性。在(A)中,每个符号代表一只小鼠;为了比较对照小鼠与实验小鼠中的B细胞水平,将B细胞水平用T细胞水平进行标准化并且将对照小鼠中B/T细胞的比视为100%。在(B)中,打开和闭合的符号分别代表对照组(n=10)和252-3抗体治疗组(n=10)中的EAE评分的平均值;箭头指示抗体注射的日期。
图10示出252-3抗体在NOD小鼠中消减外周血B细胞(A)和抑制T1D(B)的活性。在(A)中,每个符号代表一只小鼠;为了比较对照小鼠与实验小鼠中的B细胞水平,将B细胞水平用T细胞水平进行标准化并且将对照小鼠中的B/T细胞的比视为100%。在(B)中,打开和闭合的符号分别代表对照组(n=6)和252-3抗体治疗组(n=6)中的糖尿病发病率。
图11示出252-3抗体在DBA/1小鼠中消减外周血B细胞(A)和抑制CIA(B)的活性。在(A)中,每个符号表示一只小鼠;为了比较对照小鼠与实验小鼠中的B细胞水平,将B细胞水平用T细胞水平进行标准化并且将对照小鼠中的B/T细胞的比视为100%。在(B)中,打开和闭合的符号分别表示对照组(n=12)和252-3抗体治疗组(n=12)中的CIA评分的平均值;箭头指示抗体注射的日期。
发明详述
本发明提供使用CD37结合分子消减B细胞和治疗与异常B细胞活性和/或与结合B细胞通路的异常T细胞刺激相关的疾病的方法。
I.定义
为了有助于理解本发明,在下文中定义一些术语和短语。
除非另外指明,如本文所用的术语CD37是指任何天然CD37。CD37还被称为GP52-40、白细胞抗原CD37以及四次跨膜蛋白-26。术语“CD37”涵盖“全长的”、未加工的CD37以及从在细胞中加工而产生的任何形式的CD37。所述术语还涵盖CD37的天然发生的变体,例如,剪接变体、等位基因变体以及同工型。本文所描述的CD37多肽可以从多种来源(如从人组织类型或从另外来源)分离,或通过重组或合成方法来制备。
术语“抗体”意指通过在免疫球蛋白分子的可变区内的至少一个抗原识别位点来识别并特异性地结合靶标(如蛋白质、多肽、肽、糖类、多核苷酸、脂质或前述的组合)的免疫球蛋白分子。如本文所用,术语“抗体”涵盖完整的多克隆抗体、完整的单克隆抗体、抗体片段(如Fab、Fab'、F(ab')2以及Fv片段)、单链Fv(scFv)突变体、多特异性抗体(如从至少两个完整的抗体产生的双特异性抗体)、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、包含抗体的抗原决定部分的融合蛋白,以及包含抗原识别位点的任何其它修饰的免疫球蛋白分子,只要所述抗体表现出所需的生物活性。抗体可为以下五种主要类别的免疫球蛋白中的任何一种:IgA、IgD、IgE、IgG以及IgM(基于其重链恒定区的鉴定而分别被称为α、δ、ε、γ和μ),或其亚类(同种型)(例如,IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1以及IgA2)。不同类别的免疫球蛋白具有不同的且众所周知的亚单位结构和三维构型。抗体可为裸的或与其它分子如毒素、放射性同位素等等缀合的。
“封闭性”抗体或“拮抗剂”抗体是抑制或减少它所结合的抗原(如CD37)的生物活性的一种抗体。在一些实施方案中,封闭性抗体或拮抗剂抗体基本上或完全地抑制抗原的生物活性。生物活性可以减少10%、20%、30%、50%、70%、80%、90%、95%或甚至100%。
术语“抗CD37抗体”或“结合CD37的抗体”是指能够以足够的亲和力结合CD37的抗体,以使得所述抗体适用于在靶向CD37中用作诊断剂和/或治疗剂。抗CD37抗体与不相关的非CD37蛋白的结合程度可小于与CD37的结合的约10%,如(例如)通过放射免疫测定法(RIA)测定的。在某些实施方案中,结合CD37的抗体具有≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM或≤0.1nM的解离常数(Kd)。
术语“抗体片段”是指完整抗体的一部分并且是指完整抗体的抗原决定可变区。抗体片段的实例包括,但不限于Fab、Fab'、F(ab')2以及Fv片段、线性抗体、单链抗体以及由抗体片段形成的多特异性抗体。
“单克隆抗体”是指在单一抗原决定簇或表位的高度特异性识别和结合中涉及的同质性抗体群。这与通常包含针对不同抗原决定簇的不同抗体的多克隆抗体形成对照。术语“单克隆抗体”涵盖完整与全长单克隆抗体以及抗体片段(如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv)、单链(scFv)突变体、包含抗体部分的融合蛋白、以及包含抗原识别位点的任何其它修饰的免疫球蛋白分子。此外,“单克隆抗体”是指以任何数量的方式形成的这类抗体,包括但不限于通过杂交瘤、噬菌体选择、重组表达以及转基因动物。
术语“人源化抗体”是指作为包含最少非人(例如,鼠)序列的特异性免疫球蛋白链、嵌合免疫球蛋白或其片段的非人(例如,鼠)抗体形式。通常,人源化抗体是其中来自互补决定区(CDR)的残基被来自非人物种(例如,小鼠、大鼠、兔、仓鼠)的CDR的具有所需的特异性、亲和力以及能力的残基置换的人免疫球蛋白(Jones等,1986,Nature,321:522-525;Riechmann等,1988,Nature,332:323-327;Verhoeyen等,1988,Science,239:1534-1536)。在一些情况下,人免疫球蛋白的Fv构架区(FR)残基被来自非人物种的抗体中的具有所需的特异性、亲和力以及能力的相对应残基置换。人源化抗体可以通过Fv构架区中的和/或所置换的非人类残基内的另外残基的取代来进行进一步修饰,以便改善和优化抗体特异性、亲和力和/或能力。一般来说,人源化抗体将大致上包含所有的至少一个并且通常两个或三个可变域,所述可变域含有所有或大致上所有对应于非人免疫球蛋白的CDR区,而所有或大致上所有FR区是人免疫球蛋白共有序列的那些。人源化抗体还可以包含免疫球蛋白恒定区或域的至少一部分(Fc),通常为人免疫球蛋白的一部分。用于产生人源化抗体的方法的实例描述于美国专利5,225,539中。
抗体的“可变区”是指抗体轻链的可变区或抗体重链的可变区,单独地抑或组合。重链和轻链的可变区各自由通过三个互补决定区(CDR)(还被称为高变区)连接的四个构架区(FR)组成。每个链中的CDR通过FR紧密保持在一起,并且与来自另一链的CDR一起有助于抗体的抗原结合位点的形成。存在至少两种用于确定CDR的技术:(1)基于跨物种序列变异的方法(即,Kabat等.Sequences of Proteins of Immunological Interest,(第5版,1991,National Institutes of Health,Bethesda Md.));和(2)基于抗原-抗体复合物的晶体学研究的方法(Al-lazikani等(1997)J.Molec.Biol.273:927-948))。此外,在本领域中有时使用这两种方法的组合来确定CDR。
当提及可变域中的残基时,通常使用Kabat编号系统(大约轻链的残基1至107和重链的残基1至113)(例如,Kabat等,Sequences of Immunological Interest.第5版.PublicHealth Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991))。
如Kabat中的氨基酸位置编号是指Kabat等,Sequences of Proteins ofImmunological Interest,第5版.Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,Md.(1991)中用于抗体的编译的重链可变域或轻链可变域的编号系统。使用这种编号系统,实际线性氨基酸序列可以包含对应于可变域的FR或CDR的缩短或向其中的插入的几个或另外氨基酸。例如,重链可变域可以包含在H2的残基52之后的单一氨基酸插入(根据Kabat的残基52a)和在重链FR残基82之后的多个插入残基(例如,根据Kabat的残基82a、82b以及82c等等)。对于给定抗体,可以通过在具有同源性的区域处抗体序列与“标准”Kabat编号的序列的比对来确定残基的Kabat编号。而Chothia是指结构环的位置(Chothia和Lesk J.Mol.Biol.196:901-917(1987))。当使用Kabat编号规则编号时,取决于Chothia CDR-H1环的长度,所述环的末端在H32与H34之间变化(这是因为Kabat编号方案将插入安置在H35A和H35B处;如果35A和35B都不存在,那么所述环在32处终止;如果仅35A存在,那么所述环在33处终止;如果35A与35B都存在,那么所述环在34处终止)。AbM高变区代表Kabat CDR与Chothia结构环之间的折衷,并且被Oxford Molecular's AbM抗体建模软件使用。
术语“人抗体”意指由人产生的抗体或使用本领域中已知的任何技术制成的具有对应于由人产生的抗体的氨基酸序列的抗体。人抗体的这个定义包括完整或全长抗体、其片段和/或包含至少一个人重和/或轻链多肽的抗体,例如像包含鼠轻链和人重链多肽的抗体。
术语“嵌合抗体”是指其中免疫球蛋白分子的氨基酸序列衍生自两种或更多种物种的抗体。通常,轻链与重链二者的可变区对应于衍生自一种哺乳动物(例如,小鼠、大鼠、兔等等)的抗体的具有所需的特异性、亲和力以及能力的可变区,而恒定区与衍生自另一物种(通常是人)的抗体中的序列是同源的以避免在所述物种中引起免疫反应。
术语“表位”或“抗原决定簇”在本文中可互换使用并且是指能够被特定抗体识别并特异性地结合的抗原的那部分。当所述抗原是多肽时,表位可以由连续氨基酸和通过蛋白质的三级折叠而并置的非连续氨基酸形成。由连续氨基酸形成的表位通常在蛋白质变性时保留,而通过三级折叠形成的表位通常在蛋白质变性时丧失。在独特的空间构象中表位通常包含至少3个并且更通常至少5个或8至10个氨基酸。
“结合亲和力”总体上是指一个分子(例如,抗体)的单一结合位点与它的结合配偶体(例如,抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另外指明,否则如本文所用,“结合亲和力”是指反映结合对的成员(例如,抗体与抗原)之间的1:1相互作用的固有结合亲和力。分子X对它的配偶体Y的亲和力通常可以由解离常数(Kd)表示。可以通过本领域已知的常见方法来测量亲和力,包括本文所描述的那些方法。低亲和力抗体通常缓慢地结合抗原并且倾向于容易解离,而高亲和力抗体通常更快地结合抗原并且倾向于保持结合时间更长。测量结合亲和力的多种方法是本领域已知的,其中的任何方法可以用于本发明的目的。具体的说明性实施方案在下文进行描述。
当本文提及结合亲和力时使用的“或更好”是指在分子与它的结合配偶体之间更强的结合。当本文使用时,“或更好”是指由更小的数值Kd值表示的更强的结合。例如,对抗原具有“0.6nM或更好”的亲和力的抗体,所述抗体对所述抗原的亲和力是<0.6nM,即0.59nM、0.58nM、0.57nM等等或小于0.6nM的任何值。
“特异性地结合”通常意指抗体经由它的抗原结合域而结合表位,并且所述结合需要在所述抗原结合域与所述表位之间的一些互补性。根据这一定义,当抗体经由它的抗原结合域结合一个表位比它将结合随机的、不相关的表位更容易时,可以说所述抗体是“特异性地结合”所述表位。术语“特异性”在本文用于形容某一抗体结合某一表位的相对亲和力。例如,可以认为抗体“A”比抗体“B”对给定表位具有更高的特异性,或可以说抗体“A”以比它对相关表位“D”的更高的特异性而结合表位“C”。
“优先结合”意指抗体特异性地结合一个表位比它将结合相关的、相似的、同源的或类似的表位更容易。因此,“优先结合”给定表位的抗体将比结合相关表位更可能结合所述给定表位,即使这种抗体可能与所述相关表位交叉反应。
如果抗体优先地结合给定表位到它在某种程度上阻断参考抗体结合所述表位的程度,那么可以说它“竞争性地抑制”所述参考抗体与所述表位的结合。竞争性抑制可以通过本领域已知的任何方法来确定,例如,竞争性ELISA测定。可以说抗体竞争性地抑制参考抗体与给定表位的结合至少90%、至少80%、至少70%、至少60%或至少50%。
如本文所用,短语“大致上相似”或“大致上相同”表示两个数值(通常一个数值与本发明的抗体相关并且另一个数值与参考/比较抗体相关)之间的足够高的相似度,以使得本领域技术人员将认为在通过所述值(例如,Kd值)测量的生物学特性的背景下这两个值之间的差异几乎没有或没有生物学和/或统计性显著性。所述两个值之间的差异可以随着参考/比较抗体的值的变化而小于约50%、小于约40%、小于约30%、小于约20%或小于约10%。
被“分离的”多肽、抗体、多核苷酸、载体、细胞、或组合物是呈在自然界中未发现的形式的多肽、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物。分离的多肽、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物包括已经被纯化到不再呈它们在自然界被发现的形式的程度的那些。在一些实施方案中,被分离的抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物是基本上纯的。
如本文所用,“基本上纯的”是指至少50%纯的(即,不含污染物)、至少90%纯的、至少95%纯的、至少98%纯的或至少99%纯的材料。
如本文所用的术语“免疫缀合物”或“缀合物”是指连接细胞结合剂(即,抗CD37抗体或其片段)并由以下通式定义的化合物或其衍生物:C-L-A,其中C-细胞毒素、L=接头、并且A=细胞结合剂或抗CD37抗体或抗体片段。免疫缀合物还可以由以下呈相反顺序的通式来定义:A-L-C。
“接头”是能够将化合物(通常是药物,如美登木素)以稳定的、共价的方式连接至细胞结合剂如抗CD37抗体或其片段的任何化学部分。在化合物或抗体保持活性的条件下,接头可以易感于或大致上抵抗酸诱导的裂解、光诱导的裂解、肽酶诱导的裂解、酯酶诱导的裂解以及二硫键裂解。适合的接头是本领域熟知的并且包括,例如,二硫基、硫醚基、酸不稳定性基团、光不稳定性基团、肽酶不稳定性基团以及酯酶不稳定性基团。接头还包括如本文所描述述的和本领域已知的带电荷的接头及其亲水形式。
术语“癌症”和“癌性的”是指或描述哺乳动物中的生理状态,其中细胞群以未调控的细胞生长为特征。癌症的实例包括,但不限于癌瘤(carcinoma)、淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤以及白血病。“肿瘤(Tumor)”和“赘生物(neoplasm)”是指由过度细胞生长或增殖所产生的一个或多个细胞,良性的(非癌性的)抑或恶性的(癌性的),包括癌前病变。可以治疗和/或预防的“癌症”或“致瘤性”疾病的实例包括B细胞淋巴瘤,包括NHL、前体B细胞成淋巴细胞性白血病/淋巴瘤和成熟B细胞瘤,如B细胞慢性淋巴细胞性白血病(CLL)/小淋巴细胞性淋巴瘤(SLL)、B细胞幼淋巴细胞性白血病、淋巴浆细胞性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤(MCL)、滤泡性淋巴瘤(FL)(包括低度恶性、中度恶性以及高度恶性FL)、皮肤滤泡中心淋巴瘤、边缘区B细胞淋巴瘤(MALT型、结节型以及脾型)、毛细胞白血病、弥漫性大B细胞淋巴瘤、伯基特氏(Burkitt's)淋巴瘤、浆细胞瘤、浆细胞骨髓瘤、移植后淋巴组织增生性病症以及间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)。非癌性细胞是不会导致肿瘤或赘生物的形成或癌症的发展的细胞。然而,非癌性细胞可以导致疾病,例如自身免疫性疾病,并且包括,例如自身反应性B细胞。
术语“癌细胞”、“肿瘤细胞”以及语法同等术语是指来源于肿瘤或癌前病变的总细胞群,包括非致瘤性细胞(包括肿瘤细胞群块)和致瘤性干细胞(癌干细胞)二者。如本文所用,术语“肿瘤细胞”当仅仅是指缺乏更新和分化能力的那些肿瘤细胞时,将由术语“非致瘤性”修饰,以区分那些肿瘤细胞和癌干细胞。
术语“自身反应性”是指针对生物的自身细胞、组织、蛋白质、抗体或其它物质而产生免疫反应的细胞、组织、蛋白质、抗体或其它物质。
术语“受试者”是指待成为具体治疗的接受者的任何动物(例如,哺乳动物),包括但不限于人、非人灵长类、啮齿类等。通常,提及人受试者时术语“受试者”和“患者”在本文可互换使用。
与一种或多种另外治疗剂“联合”施用包括同时(并行)施用和以任何顺序的连续施用。
术语“药物制剂”是指处于允许活性成分的生物活性有效的形式并且不含有对进行所述制剂施用的受试者具有不可接受的毒性的另外组分的制剂。所述制剂可为无菌的。
如本文所公开的抗体的“有效量”是足以执行明确说明的目的的量。根据所说明的目的,“有效量”可以凭经验并以常规方式来确定。
术语“治疗有效量”是指有效“治疗”受试者或哺乳动物中的疾病或病症的抗体或其它药物的量。在一些实施方案中,药物的治疗有效量可以减少B细胞的数目;减少自身反应性B细胞的数目;减少疾病的症状;或减缓疾病的进展。参见本文中“治疗”的定义。“预防有效量”是指在剂量和持续时间上有效实现所需预防结果所需要的量。通常但不一定地,由于预防剂量在疾病前或疾病早期阶段用于受试者,所以预防有效量将小于治疗有效量。
词语“标记”当在本文使用时是指直接地或间接地与抗体缀合以便产生“标记的”抗体的可检测化合物或组合物。所述标记本身是可检测的(例如,放射性同位素标记或荧光标记),或在酶标记的情况下,可以催化可检测的底物化合物或组合物的化学改变。
术语如“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”或“治疗(to treat)”或“缓和(alleviating)”或“缓和(to alleviate)”是指治愈、减缓、减轻所诊断的病理病况或病症的症状和/或阻止其进展的治疗措施。因此,需要治疗的那些包括已经诊断患有或疑似患有所述病症的那些。预防(Prophylactic)或防止(preventative)措施是指防止和/或减缓所靶向的病理病况或病症的发展的治疗措施。因此,需要预防或防止措施的那些包括易患所述病症的那些和其中待预防所述病症的那些。在某些实施方案中,如果患者显示出以下一种或多种,则受试者成功地进行了“治疗”:减少的B细胞;减少的自身反应性B细胞;减少的B细胞活性;减少的异常B细胞活性;减少的非恶性B细胞、减少的非癌性B细胞、减少的免疫球蛋白水平;减少的发病率和死亡率;生命质量的改善;或多种作用的某一组合。
如本文可互换使用的“多核苷酸”或“核酸”是指具有任何长度的核苷酸的聚合物,并且包括DNA和RNA。所述核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、修饰的核苷酸或碱基和/或它们的类似物、或可以通过DNA或RNA聚合酶并入至聚合物中的任何基质。多核苷酸可以包含修饰的核苷酸,如甲基化的核苷酸和它们的类似物。如果存在,可以在聚合物的组装之前或之后给予对核苷酸结构的修饰。核苷酸的序列可以被非核苷酸组分间断。多核苷酸可以在聚合之后进行进一步修饰,如通过与标记组分缀合。其它类型的修饰包括,例如,“加帽(cap)”、用类似物取代一种或多种天然发生的核苷酸、核苷酸间修饰,例如像,具有不带电荷的键联(例如,膦酸甲酯、磷酸三酯、磷酰胺酸酯(phosphoamidate)、氨基甲酸酯(cabamate),等等)和具有带电荷的键联(例如,硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯,等等)的那些、含有侧悬部分(例如像,蛋白质(例如,核酸酶、毒素、抗体、信号肽、多聚-L-赖氨酸,等等))的那些、具有嵌入剂(例如,吖啶、补骨脂素)的那些、含有螯合剂(例如,金属、放射性金属、硼、氧化金属,等等)的那些、含有烷化剂(alkylator)的那些、具有修饰的键联(例如,α端基异构核酸,等等)的那些、以及一种或多种多核苷酸未修饰形式。此外,通常存在于糖类中的任何羟基可以被(例如)膦酸酯基、磷酸酯基置换、被标准保护基保护或被活化以提供与另外核苷酸的另外键联,或可以与固体载体缀合。5'和3'末端OH可以被磷酸化或被胺或具有1至20个碳原子的有机封端基团部分而取代。其它羟基还可以衍生化成标准保护基。多核苷酸还可以包含本领域众所周知的核糖或脱氧核糖的类似形式,包括,例如,2'-O-甲基-、2'-O-烯丙基、2'-氟-或2'-叠氮基-核糖、碳环糖类似物、α-端基异构糖、差向异构糖(如阿拉伯糖、木糖或来苏糖)、吡喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖、无环类似物以及无碱基核苷类似物(如甲基核苷)。一个或多个磷酸二酯键联可以被可选的连接基置换。这些可选的连接基包括,但不限于,其中磷酸酯被P(O)S(“硫代磷酰胺酯(thioate)”)、P(S)S(“二硫代磷酰胺酯(dithioate)”)、(O)NR2(“酰胺化物(amidate)”)、P(O)R、P(O)OR'、CO或CH2(“甲缩醛(formacetal)”)置换的实施方案,其中每个R或R'独立地是H或任选含有醚(--O--)键联的取代的或未取代的烷基(1-20个C)、芳基、烯基、环烷基、环烯基或芳烷基(araldyl)。多核苷酸中并非所有的键联都需要一致。前文描述适用于本文所提及的所有多核苷酸,包括RNA和DNA。
术语“载体”意指能够在宿主细胞中递送并任选地表达一种或多种目标基因或序列的构建体。载体的实例包括,但不限于,病毒载体、裸DNA或RNA表达载体、质粒、粘粒或噬菌体载体、与阳离子凝缩剂相关的DNA或RNA表达载体、包封在脂质体中的DNA或RNA表达载体、以及某些真核细胞(如生产细胞)。
术语“多肽”、“肽”以及“蛋白质”在本文可互换使用,以指具有任何长度的氨基酸的聚合物。所述聚合物可以为直链的或支链的,它可以包含修饰的氨基酸,并且它可以被非氨基酸间断。所述术语还涵盖已经天然修饰或通过干预修饰的氨基酸聚合物;例如,二硫键形成、糖基化、脂质化、乙酰化、磷酸化,或任何其它操作或修饰,如与标记组分缀合。在所述定义内还包括,例如,含有氨基酸的一种或多种类似物(包括,例如,非天然氨基酸,等等)的多肽、以及本领域已知的其它修饰。应了解,因为本发明的多肽基于抗体,所以在某些实施方案中,所述多肽可以作为单链或缔合的链而存在。
在两种或更多种核酸或多肽的背景中的术语“相同的”或“同一性”百分比是指当针对最大对应进行比较和比对时(如果必要,引入空位),两个或更多个序列或子序列是相同的或具有相同的指定百分比的核苷酸或氨基酸残基,而不考虑任何保守性氨基酸取代作为序列同一性的一部分。可以使用序列比较软件或算法或通过目视检查来测量同一性百分比。可以用于获得氨基酸或核苷酸序列的比对的不同算法和软件是本领域已知的。序列比对算法的一个这样的非限制性实例是在Karlin等,1990,Proc.Natl.Acad.Sci.,87:2264-2268中进行描述的、在Karlin等,1993,Proc.Natl.Acad.Sci.,90:5873-5877中进行修改的并且并入至NBLAST和XBLAST程序(Altschul等,1991,Nucleic Acids Res.,25:3389-3402)中的算法。在某些实施方案中,可以如Altschul等,1997,Nucleic Acids Res.25:3389-3402中所述而使用Gapped BLAST。BLAST-2、WU-BLAST-2(Altschul等,1996,Methods inEnzymology,266:460-480)、ALIGN、ALIGN-2(Genentech,South San Francisco,California)或Megalign(DNASTAR)是可以用于比对序列的另外可公开获得的软件程序。在某些实施方案中,两个核苷酸序列之间的同一性百分比使用GCG软件中的GAP程序来确定(例如,使用NWSgapdna.CMP矩阵和40、50、60、70或90的空位权重以及1、2、3、4、5或6的长度权重)。在某些替代实施方案中,合并Needleman和Wunsch算法(J.Mol.Biol.(48):444-453(1970))的GCG软件包中的GAP程序可以用于确定两个氨基酸序列之间的同一性百分比(例如,使用Blossum 62矩阵抑或PAM250矩阵和16、14、12、10、8、6或4的空位权重以及1、2、3、4、5的长度权重)。或者,在某些实施方案中,使用Myers和Miller算法(CABIOS,4:11-17(1989))来确定核苷酸或氨基酸序列之间的同一性百分比。例如,可以使用ALIGN程序(版本2.0)和使用具有残基表、12的空位长度罚分以及4的空位罚分的PAM120来确定同一性百分比。可以由本领域技术人员确定用于通过具体比对软件达到最大比对的适当参数。在某些实施方案中,使用比对软件的默认参数。在某些实施方案中,第一氨基酸序列与第二氨基酸序列的同一性百分比“X”计算为100×(Y/Z),其中Y是在所述第一序列和第二序列的比对中评分为一致匹配的氨基酸残基的数目(如通过目视检查或具体序列比对程序来比对),并且Z是所述第二序列中的残基的总数目。如果第一序列的长度比第二序列长,那么所述第一序列与第二序列的同一性百分比将比所述第二序列与所述第一序列的同一性百分比长。
作为非限制性实例,在某些实施方案中,可以使用Bestfit程序(Wisconsin序列分析包,Unix版本8,Genetics Computer Group,University Research Park,575ScienceDrive,Madison,WI 53711)来确定任何特定多核苷酸是否与参考序列具有一定百分比的序列同一性(例如,至少80%相同、至少85%相同、至少90%相同并且在一些实施方案中至少95%、96%、97%、98%或99%相同)。Bestfit使用Smith和Waterman的局部同源性算法(Advances in Applied Mathematics 2:482 489(1981)),以找到两个序列之间具有同源性的最佳片段。当根据本发明使用Bestfit或任何其它序列比对程序来确定特定序列是否与参考序列例如95%相同时,设定参数,以使得在参考核苷酸序列的全长上计算同一性百分比并且允许同源性中的空位高达所述参考序列中核苷酸总数的5%。
在一些实施方案中,本发明的两种核酸或多肽是基本上相同的,意味着当针对最大对应进行比较和比对时,如使用序列比较算法或通过目视检查所测量,它们具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%并且在一些实施方案中至少95%、96%、97%、98%、99%核苷酸或氨基酸残基同一性。同一性可以存在于长度为至少约10、约20、约40至约60个残基或其间的任何整数值的序列的区域,并且可存在于比60至80个残基长的区域,例如,至少约90至100个残基,并且在一些实施方案中,所述序列在所比较的序列的全长(例如像核苷酸序列的编码区)上基本上相同。
“保守性氨基酸取代”是以下取代,其中一个氨基酸残基被具有相似侧链的另一个氨基酸残基置换。具有相似侧链的氨基酸残基的家族已经在本领域中进行了定义,包括碱性侧链(例如,赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如,天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如,甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如,丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β分支侧链(例如,苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)以及芳香族侧链(例如,酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。例如,以苯丙氨酸取代酪氨酸是保守性取代。在一些实施方案中,本发明的多肽和抗体的序列中的保守性取代不会消除含有所述氨基酸序列的多肽或抗体与抗原(即,所述多肽或抗体所结合的CD37)的结合。鉴别不会消除抗原结合的核苷酸和氨基酸保守性取代的方法是本领域熟知的(参见,例如,Brummell等,Biochem.32:1180-1187(1993);Kobayashi等.Protein Eng.12(10):879-884(1999);以及Burks等.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:.412-417(1997))。
除非上下文另外清楚地规定,如本公开和权利要求中使用的单数形式“一个(种)(a)、”“一个(种)(an)”以及“所述(the)”包括复数形式。
应理解无论本文何处的实施方案用语言“包含(comprising)”来描述,都还提供以“由……组成”和/或“主要由……组成”描述的另外类似的实施方案。
如本文的短语如“A和/或B”中使用的术语“和/或”意图包括“A和B”、“A或B”、“A”以及“B”。同样地,如在短语如“A、B和/或C”中使用的术语“和/或”意图涵盖以下各实施方案:A、B以及C;A、B或C;A或C;A或B;B或C;A和C;A和B;B和C;A(单独);B(单独);以及C(单独)。
II.CD37结合剂
本发明提供特异性地结合CD37的药剂。这些药剂在本文被称为“CD37结合剂”。示例性CD37结合剂已经在美国公布申请号2011/0256153中进行了描述,所述专利以引用的方式整体并入本文。
人、猕猴以及鼠CD37的全长氨基酸序列是本领域已知的并且还如分别由SEQ IDNO:1至3所表示地在本文提供。
人CD37:
MSAQESCLSLIKYFLFVFNLFFFVLGSLIFCFGIWILIDKTSFVSFVGLAFVPLQIWSKVLAISGIFTMGIALLGCVGALKELRCLLGLYFGMLLLLFATQITLGILISTQRAQLERSLRDVVEKTIQKYGTNPEETAAEESWDYVQFQLRCCGWHYPQDWFQVLILRGNGSEAHRVPCSCYNLSATNDSTILDKVILPQLSRLGHLARSRHSADICAVPAESHIYREGCAQGLQKWLHNNLISIVGICLGVGLLELGFMTLSIFLCRNLDHVYNRLAYR(SEQ ID NO:1)
猕猴CD37:
MSAQESCLSLIKYFLFVFNLFFFVILGSLIFCFGIWILIDKTSFVSFVGLAFVPLQIWSKVLAISGVFTMGLALLGCVGALKELRCLLGLYFGMLLLLFATQITLGILISTQRAQLERSLQDIVEKTIQRYHTNPEETAAEESWDYVQFQLRCCGWHSPQDWFQVLTLRGNGSEAHRVPCSCYNLSATNDSTILDKVILPQLSRLGQLARSRHSTDICAVPANSHIYREGCARSLQKWLHNNLISIVGICLGVGLLELGFMTLSIFLCRNLDHVYNRLRYR(SEQ ID NO:2)
鼠CD37(NP_031671):
MSAQESCLSLIKYFLFVFNLFFFVLGGLIFCFGTWILIDKTSFVSFVGLSFVPLQTWSKVLAVSGVLTMALALLGCVGALKELRCLLGLYFGMLLLLFATQITLGILISTQRVRLERRVQELVLRTIQSYRTNPDETAAEESWDYAQFQLRCCGWQSPRDWNKAQMLKANESEEPFVPCSCYNSTATNDSTVFDKLFFSQLSRLGPRAKLRQTADICALPAKAHIYREGCAQSLQKWLHNNIISIVGICLGVGLLELGFMTLSIFLCRNLDHVYDRLARYR(SEQ ID NO:3)
在某些实施方案中,CD37结合剂是抗体、免疫缀合物或多肽。在一些实施方案中,CD37结合剂是人源化抗体。
在某些实施方案中,CD37结合剂能够诱导补体依赖性细胞毒性。能够诱导补体依赖性细胞毒性的CD37结合剂的实例在(例如)美国公布申请号2011/0256153中公开,所述专利以引用的方式整体并入本文。例如,用CD37结合剂处理细胞可以导致使细胞生存力减少至未处理细胞的细胞生存力的小于约80%、小于约70%、小于约60%、小于约50%、小于约40%或小于约35%的CDC活性。用CD37结合剂处理细胞还可以导致使细胞生存力减少至未处理细胞的细胞生存力的约70%至80%、约60%至70%、约50%至60%、约40%至50%或约30%至40%的CDC活性。在一些具体实施方案中,CD37结合剂能够在Ramos细胞中诱导补体依赖性细胞毒性。
在某些实施方案中,CD37结合剂能够诱导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。能够诱导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)的CD-37结合剂的实例在(例如)美国公布申请号2011/0256153中公开,所述专利以引用的方式整体并入本文。例如,用CD37结合剂处理细胞可以导致产生至少约15%、至少约20%、至少约25%、至少约30%、至少约35%、至少约40%、至少约45%、至少约50%或至少约60%细胞溶解的ADCC活性。用CD37结合剂处理细胞可以导致产生约10%至20%、约20%至30%、约30%至40%或约40%至50%细胞溶解的ADCC活性。用CD37结合剂处理细胞还可以导致产生约10%至50%、约20%至50%、约30%至50%或约40%至50%细胞溶解的ADCC活性。在一些具体实施方案中,CD37结合剂能够在Daudi、Ramos和/或Granata-519细胞中诱导ADCC。
在一些实施方案中,CD37结合剂能够诱导细胞凋亡。在一些实施方案中,CD37结合剂能够在不存在交联剂的情况下诱导细胞凋亡。能够在不存在交联剂的情况下在体外诱导细胞凋亡的CD37结合剂的实例在(例如)美国公布申请号2011/0256153中公开,所述专利以引用的方式整体并入本文。例如,用CD37结合剂处理细胞可以诱导至少约15%、至少约20%、至少约25%、至少约30%、至少约35%、至少约40%、至少约45%、至少约50%或至少约55%的细胞中的细胞凋亡。在一些具体实施方案中,CD37结合剂能够在Ramos细胞和/或Raji细胞中诱导细胞凋亡。
在一些实施方案中,CD37结合剂能够消减B细胞。在一些实施方案中,B细胞是自身反应性B细胞。在一些实施方案中,B细胞不是癌细胞。在一些实施方案中,B细胞不是肿瘤细胞。在一些实施方案中,B细胞不是癌性细胞。在一些实施方案中,B细胞过量表达CD37。在一些实施方案中,B细胞不过量表达CD37。
用CD37结合剂处理细胞可以导致至少约25%、至少约30%、至少约35%、至少约40%、至少约45%、至少约50%、至少约55%、至少约60%、至少约65%、至少约70%或至少约75%的B细胞的消减。
在一些实施方案中,CD37结合剂在B细胞被消减的相同条件下不会消减T细胞。例如,用CD37结合剂处理细胞可以导致小于约20%、小于约15%、小于约10%或小于约5%的T细胞的消减。在某些实施方案中,CD37结合剂消减至少约25%的B细胞并且消减小于约10%的T细胞。在某些实施方案中,CD37结合剂消减至少约30%的B细胞并且消减小于约5%的T细胞。
在一些实施方案中,CD37结合剂在B细胞被消减的相同条件下不会消减单核细胞。例如,用CD37结合剂处理细胞可以导致小于约20%、小于约15%、小于约10%或小于约5%的单核细胞的消减。在某些实施方案中,CD37结合剂消减至少约25%的B细胞并且消减小于约10%的单核细胞。在某些实施方案中,CD37结合剂消减至少约30%的B细胞并且消减小于约5%的单核细胞。
在某些实施方案中,特异性地结合人CD37的免疫缀合物或其它药剂经由细胞毒性剂触发细胞死亡。例如,在某些实施方案中,将人CD37的抗体与美登木素缀合,所述美登木素通过蛋白质内化而在表达CD37的细胞中被活化。在某些替代实施方案中,所述药剂或抗体未与美登木素或其它细胞毒性分子缀合。
CD37结合剂包括CD37抗体如CD37-3、CD37-12、CD37-38、CD37-50、CD37-51、CD37-56以及CD37-57及其片段、变体以及衍生物。CD37结合剂还包括与选自由以下组成的组的抗体特异性地结合相同CD37表位的CD37结合剂:CD37-3、CD37-12、CD37-38、CD37-50、CD37-51、CD37-56以及CD37-57。CD37结合剂还包括竞争性地抑制选自由以下组成的组的抗体的CD37结合剂:CD37-3、CD37-12、CD37-38、CD37-50、CD37-51、CD37-56以及CD37-57。
在一些具体实施方案中,CD37结合剂可通过它们结合嵌合CD37多肽的能力来表征,所述嵌合CD37多肽包括美国公布申请号2011/0256153(所述专利以引用的方式整体并入本文)中描述的以及在以下表中提供的鼠/人和猕猴/人嵌合多肽。
在一些具体实施方案中,CD37结合剂与CD37的结合不需要人CD37氨基酸109-138。因此,一些CD37结合剂结合包含SEQ ID NO:184的氨基酸序列的多肽。在其它实施方案中,CD37结合剂与CD37的结合被人CD37氨基酸202-243的突变破坏。因此,一些CD37结合剂不会结合包含SEQ ID NO:185的氨基酸序列的多肽。
在一些实施方案中,CD37结合剂结合SEQ ID NO:184的多肽并且结合SEQ ID NO:186的多肽,但不会结合SEQ ID NO:185的多肽。
在一些实施方案中,CD37结合剂结合SEQ ID NO:187的多肽。在一些实施方案中,CD37结合剂结合SEQ ID NO:187的多肽和SEQ ID NO:188的多肽。在一些实施方案中,CD37结合剂结合SEQ ID NO:187的多肽和SEQ ID NO:189的多肽。
在一些实施方案中,CD37结合剂结合SEQ ID NO:190的多肽,但不会结合SEQ IDNO:191的多肽。在一些实施方案中,CD37结合剂结合SEQ ID NO:192的多肽,但不会结合SEQID NO:191的多肽。
某些CD37结合剂所结合的CD37肽片段包括,但不限于,包含SEQ ID NO:1的氨基酸200-243、SEQ ID NO:1的氨基酸202-220或SEQ ID NO:1的氨基酸221-243、主要由其组成或由其组成的CD37片段。在一些实施方案中,CD37结合剂特异性地结合包含SEQ ID NO:1的氨基酸202-243的人CD37表位。在一些实施方案中,CD37结合剂与CD37的结合需要SEQ ID NO:1的氨基酸202-243。在一些实施方案中,CD37结合剂与CD37的结合需要SEQ ID NO:1的氨基酸200-220。在一些实施方案中,CD37结合剂与CD37的结合需要SEQ ID NO:1的氨基酸221-243。
具有上述结合特性的CD37结合剂的实例在美国公布申请号2011/0256153中进行了描述,所述专利以引用的方式整体并入本文。
CD37结合剂还包括包含CD37-3、CD37-12、CD37-38、CD37-50、CD37-51、CD37-56或CD37-57的重链和轻链CDR序列的CD37结合剂。CD37-38、CD37-50、CD37-51、CD37-56以及CD37-57的重链和轻链CDR包含相关序列。因此,CD37结合剂还可以包含以下重链和轻链CDR序列,所述重链和轻链CDR序列包含通过CD37-38、CD37-50、CD37-51、CD37-56以及CD37-57的比对所获得的共有序列。CD37-3、CD37-12、CD37-38、CD37-50、CD37-51、CD37-56以及CD37-57的CDR序列和CD37-38、CD37-50、CD37-51、CD37-56以及CD37-57的共有序列在以下表1和表2中进行描述。
表1:可变重链CDR氨基酸序列
表2:可变轻链CDR氨基酸序列
CD37结合分子可为包含CD37-3、CD37-12、CD37-50、CD37-51、CD37-56或CD37-57的CDR(每个CDR可达四个(即,0、1、2、3或4个)保守性氨基酸取代)的特异性地结合CD37的抗体或抗原结合片段。
CD37结合分子可以包含本文所描述的单个可变轻链或可变重链中的一个。抗体和多肽还可以包含可变轻链与可变重链。鼠、嵌合以及人源化CD37-3、CD37-12、CD37-50、CD37-51、CD37-56以及CD37-57抗体的可变轻链和可变重链序列在以下表3和4中提供。
表3:可变重链氨基酸序列
表4:可变轻链氨基酸序列
还提供了包含以下的多肽:(a)与SEQ ID NO:55至71或177具有至少约90%序列同一性的多肽;和/或(b)与SEQ ID NO:72至87或178具有至少约90%序列同一性的多肽。在某些实施方案中,多肽包含与SEQ ID NO:55至87、177或178具有至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%或至少约99%序列同一性的多肽。因此,在某些实施方案中,多肽包含(a)与SEQ ID NO:55至71或177具有至少约95%序列同一性的多肽;和/或(b)与SEQ IDNO:72至87或178具有至少约95%序列同一性的多肽。在某些实施方案中,多肽包含(a)具有SEQ ID NO:55至71或177的氨基酸序列的多肽;和/或(b)具有SEQ ID NO:72至87或178的氨基酸序列的多肽。在某些实施方案中,多肽是抗体和/或所述多肽特异性地结合CD37。在某些实施方案中,多肽是特异性地结合CD37的鼠、嵌合或人源化抗体。在某些实施方案中,与SEQ ID NO:55至87、177或178具有一定百分比的序列同一性的多肽与SEQ ID NO:55至87的不同仅在于保守性氨基酸取代。
多肽可以包含本文所描述的单个轻链或重链中的一个。抗体和多肽还可以包含轻链与重链二者。鼠、嵌合以及人源化CD37-3、CD37-12、CD37-50、CD37-51、CD37-56以及CD37-57抗体的轻链和可变链序列在以下表5和6中提供。
表5:全长重链氨基酸序列
表6:全长轻链氨基酸序列
还提供了包含以下的多肽:(a)与SEQ ID NO:88至104或179具有至少约90%序列同一性的多肽;和/或(b)与SEQ ID NO:105至120或180具有至少约90%序列同一性的多肽。在某些实施方案中,多肽包含与SEQ ID NO:88至120、179或180具有至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%或至少约99%序列同一性的多肽.因此,在某些实施方案中,多肽包含(a)与SEQ ID NO:88至104或179具有至少约95%序列同一性的多肽,和/或(b)与SEQ ID NO:105至120或180具有至少约95%序列同一性的多肽。在某些实施方案中,多肽包含(a)具有SEQ ID NO:88至104或179的氨基酸序列的多肽;和/或(b)具有SEQ ID NO:105至120或180的氨基酸序列的多肽。在某些实施方案中,多肽是抗体和/或所述多肽特异性地结合CD37。在某些实施方案中,多肽是特异性地结合CD37的鼠、嵌合或人源化抗体。在某些实施方案中,与SEQ ID NO:88至120、179或180具有一定百分比的序列同一性的多肽与SEQ IDNO:88至120、179或180的不同仅在于保守性氨基酸取代。
在某些实施方案中,CD37抗体可为从选自由以下组成的组的杂交瘤产生的抗体:ATCC保藏名称PTA-10664,2010年2月18日保藏在ATCC;ATCC保藏名称PTA-10665,2010年2月18日保藏在ATCC;ATCC保藏名称PTA-10666,2010年2月18日保藏在ATCC;ATCC保藏名称PTA-10667,2010年2月18日保藏在ATCC;ATCC保藏名称PTA-10668,2010年2月18日保藏在ATCC;ATCC保藏名称PTA-10669,2010年2月18日保藏在ATCC;以及ATCC保藏名称PTA-10670,2010年2月18日保藏在ATCC(美国典型培养物保藏所(American Type Culture Collection)(ATCC),位于10801University Boulevard,Manassas,Virginia 20110)。在某些实施方案中,抗体包含从选自由以下组成的组的杂交瘤产生的抗体的VH-CDR和VL-CDR:PTA-10665、PTA-10666、PTA-10667、PTA-10668、PTA-10669以及PTA-10670。
在某些实施方案中,CD37抗体可以包含由重组质粒DNA phuCD37-3LC(ATCC保藏名称PTA-10722,2010年3月18日保藏在ATCC)编码的轻链。在某些实施方案中,CD37抗体可以包含由重组质粒DNA phuCD37-3HCv.1.0(ATCC保藏名称PTA-10723,2010年3月18日保藏在ATCC)编码的重链。在某些实施方案中,CD37抗体可以包含由重组质粒DNA phuCD37-3LC(PTA-10722)编码的轻链和由重组质粒DNA phuCD37-3HCv.1.0(PTA-10723)编码的重链。在某些实施方案中,CD37抗体可以包含由重组质粒DNA phuCD37-3LC(PTA-10722)编码的VL-CDR和由重组质粒DNA phuCD37-3HCv.1.0(PTA-10723)编码的VH-CDR。
单克隆抗体可以使用杂交瘤方法(如由Kohler和Milstein(1975)Nature 256:495所描述的那些)来制备。使用所述杂交瘤方法,将小鼠、仓鼠或其它适当的宿主动物如以上所描述进行免疫,以引发淋巴细胞产生特异性地结合免疫抗原的抗体。淋巴细胞还可以在体外进行免疫。在免疫之后,将淋巴细胞分离并且使用(例如)聚乙二醇与适合的骨髓瘤细胞系融合以形成杂交瘤细胞,然后可以选择所述杂交瘤细胞而远离未融合的淋巴细胞和骨髓瘤细胞。然后可以对产生特异性地针对选定抗原的单克隆抗体的杂交瘤(如通过免疫沉淀法、免疫印迹法或通过体外结合测定(例如,放射免疫测定法(RIA);酶联免疫吸附测定法(ELISA))确定)使用标准方法(Goding,Monoclonal Antibodies:Principles andPractice,Academic Press,1986)在体外培养抑或在动物中体内作为腹水肿瘤来进行繁殖。然后可以如以上针对多克隆抗体所描述的那样从培养基或腹水积水纯化所述单克隆抗体。
或者,还可以使用如美国专利4,816,567中所描述的重组DNA方法来制备单克隆抗体。将编码单克隆抗体的多核苷酸从成熟的B细胞或杂交瘤细胞分离,如通过RT-PCR使用特异性地扩增编码所述抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸引物;并且使用常规工序确定它们的序列。然后将编码重链和轻链的分离的多核苷酸克隆至适合的表达载体中,所述表达载体当转染至不另外产生免疫球蛋白的宿主细胞(如大肠杆菌细胞、猿COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞)中时,由所述宿主细胞产生单克隆抗体。此外,可以如所描述的那样从表达所需的物种的CDR的噬菌体展示文库分离所需的物种的重组单克隆抗体或其片段(McCafferty等,1990,Nature,348:552-554;Clackson等,1991,Nature,352:624-628;以及Marks等,1991,J.Mol.Biol.,222:581-597)。
可以使用重组DNA技术以许多不同的方式对编码单克隆抗体的多核苷酸进一步修饰以产生替代抗体。在一些实施方案中,(例如)小鼠单克隆抗体的轻链和重链的恒定域可以取代为:1)(例如)人抗体的那些区以产生嵌合抗体或2)非免疫球蛋白多肽以产生融合抗体。在一些实施方案中,所述恒定区被截断或去除以便产生单克隆抗体的所需的抗体片段。可变区的定点或高密度诱变可以用于优化单克隆抗体的特异性、亲和力等等。
在一些实施方案中,抗人CD37的单克隆抗体是人源化抗体。在某些实施方案中,当施用至人受试者时,这类抗体在治疗上用于减少抗原性和HAMA(人抗小鼠抗体)反应。可以使用本领域已知的不同技术来产生人源化抗体。在某些替代实施方案中,CD37的抗体是人抗体。
可以使用本领域已知的不同技术来直接地制备人抗体。可以生成体外免疫的或从产生针对靶标抗原的抗体的免疫个体分离的永生化人B淋巴细胞(参见,例如,Cole等,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,第77页(1985);Boemer等,1991,J.Immunol.,147(1):86-95;以及美国专利5,750,373)。此外,所述人抗体可以选自噬菌体文库,其中所述噬菌体文库表达人抗体,如(例如)以下中所描述的:Vaughan等,1996,Nat.Biotech.,14:309-314,Sheets等,1998,Proc.Nat’l.Acad.Sci.,95:6157-6162,Hoogenboom和Winter,1991,J.Mol.Biol.,227:381,以及Marks等,1991,J.Mol.Biol.,222:581。还在美国专利号5,969,108、6,172,197、5,885,793、6,521,404;6,544,731;6,555,313;6,582,915;6,593,081;6,300,064;6,653,068;6,706,484;以及7,264,963;以及Rothe等,2007,J.Mol.Bio.,376:1182(所述文献各自以引用的方式整体并入本文)中描述了用于抗体噬菌体文库的产生和使用的技术。亲和力成熟策略和链改组策略(Marks等,1992,Bio/Technology 10:779-783,以引用的方式整体并入)是本领域已知的并且可以用于产生高亲和力人抗体。
还可以在含有人免疫球蛋白基因座的转基因小鼠中来制备人源化抗体,在免疫时所述小鼠能够在不产生内源性免疫球蛋白的情况下产生人抗体的全部谱系。这个方法描述于美国专利5,545,807;5,545,806;5,569,825;5,625,126;5,633,425;以及5,661,016中。
本发明还涵盖特异性地识别CD37的双特异性抗体。双特异性抗体是能够特异性地识别和结合至少两种不同表位的抗体。所述不同表位可以在相同分子(例如,相同CD37)内抑或在不同分子上,以使得(例如)两种抗体都可以特异性地识别和结合CD37以及,例如,1)白细胞上的效应分子如T细胞受体(例如CD3)或Fc受体(例如CD64、CD32或CD16)或2)如在以下详细描述的细胞毒性剂。
示例性双特异性抗体可以结合两种不同的表位,其中至少之一源于本发明的多肽。或者,免疫球蛋白分子的抗-抗原臂可以与结合白细胞上的触发分子(如T细胞受体分子(例如CD2、CD3、CD28或B7))或IgG的Fc受体的臂组合,以便使细胞防御机制集中于表达特定抗原的细胞。双特异性抗体还可以用于将细胞毒性剂引导至表达特定抗原的细胞。这些抗体拥有抗原结合臂和结合细胞毒性剂或放射性核素螯合剂(如EOTUBE、DPTA、DOTA或TETA)的臂。用于制备双特异性抗体的技术是本领域常见的(Millstein等,1983,Nature 305:537-539;Brennan等,1985,Science 229:81;Suresh等,1986,Methods in Enzymol.121:120;Traunecker等,1991,EMBO J.10:3655-3659;Shalaby等,1992,J.Exp.Med.175:217-225;Kostelny等,1992,J.Immunol.148:1547-1553;Gruber等,1994,J.Immunol.152:5368;以及美国专利5,731,168)。还涵盖具有超过两个价态的抗体。例如,可以制备三特异性抗体(Tutt等,J.Immunol.147:60(1991))。因此,在某些实施方案中,CD37的抗体为多特异性。
在某些实施方案中提供用于(例如)增加组织渗透性的抗体片段。已知用于产生抗体片段的不同技术。传统上,这些片段经由完整抗体的蛋白水解消化而产生(例如Morimoto等,1993,Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117;Brennan等,1985,Science,229:81)。在某些实施方案中,重组产生抗体片段。Fab、Fv以及scFv抗体片段都可以在大肠杆菌或其它宿主细胞中表达并且从其分泌,从而允许产生大量这些片段。这类抗体片段还可以从以上所讨论的抗体噬菌体文库分离。所述抗体片段还可以是如(例如)美国专利5,641,870中所描述的线性抗体,并且可为单特异性或双特异性。用于产生抗体片段的其它技术对于熟练的从业人员将是清楚的。
根据本发明,多种技术可适于产生对CD37特异的单链抗体(参见美国专利号4,946,778)。此外,多种方法可适于构建Fab表达文库(Huse,等,Science 246:1275-1281(1989)),以允许快速和有效地鉴别具有所需对CD37的特异性的单克隆Fab片段或其衍生物、片段、类似物或同系物。可以通过本领域中的技术来产生抗体片段,所述抗体片段包括,但不限于:(a)通过抗体分子的胃蛋白酶消化产生的F(ab')2片段;(b)通过减少F(ab')2片段的二硫桥键产生的Fab片段、(c)通过用木瓜蛋白酶和还原剂处理抗体分子产生的Fab片段,以及(d)Fv片段。
修饰抗体以增加它的血清半衰期也是所需的,尤其是在抗体片段的情况下。这可以(例如)通过以下方式来实现:通过经由抗体片段中的适当区的突变将补救受体结合表位并入至所述抗体片段中,或通过将所述表位并入至肽标签中,所述肽标签然后与所述抗体片段在任一端或在中间融合(例如,通过DNA或肽合成)。
异缀合抗体也在本发明的范围内。异缀合抗体主要由两个共价连接的抗体组成。这类抗体已经(例如)被提出使免疫细胞靶向至非期望的细胞(美国专利号4,676,980)。预期可以使用合成蛋白质化学中的已知方法(包括涉及交联剂的那些)在体外制备所述抗体。例如,可以使用二硫键交换反应或通过形成硫醚键来构建免疫毒素。用于此目的的适合的试剂的实例包括亚氨基硫醇酯(iminothiolate)和甲基-4-巯基丁酰亚氨酸酯(methyl-4-mercaptobutyrimidate)。
出于本发明的目的,应当认识到修饰的抗体可以包含提供抗体与人CD37的多肽的缔合的任何类型的可变区。在此方面,所述可变区可以包括或源自可被诱导发生体液反应并且产生针对所需抗原的免疫球蛋白的任何类型的哺乳动物。这样,修饰的抗体的可变区可为(例如)人、鼠、非人灵长类(例如,食蟹猴、猕猴等等)或狼来源。在一些实施方案中,修饰的免疫球蛋白的可变区与恒定区都为人的。在其它实施方案中,相容的抗体的可变区(通常源自非人来源)可以被工程改造或特别地裁剪以改进结合特性或减少分子的免疫原性。在这方面,本发明中有用的可变区可以人源化或另外通过包含所引入的氨基酸序列来改变。
在某些实施方案中,重链与轻链二者中的可变域通过一个或多个CDR的至少部分置换并且必要时通过部分构架区置换和序列改变来进行改变。虽然CDR可以源自与构架区所源自的抗体相同类别或甚至亚类的抗体,但是设想CDR将源自不同类别的抗体并且可能源自来自不同物种的抗体。并非总是有必要用来自供体可变区的完整CDR置换所有的CDR,以将一个可变域的抗原结合能力转移至另一个可变域的抗原结合能力。相反,在一些情况下,仅需要转移对保持抗原结合位点的活性来说必要的那些残基。鉴于美国专利号5,585,089、5,693,761以及5,693,762中所提出的解释,通过进行常规实验抑或通过尝试与错误测试来获得具有减少的免疫原性的功能性抗体将很好在本领域普通技术人员的能力范围内。
虽然对可变区进行改变,但本领域技术人员将会认识到本发明的修饰的抗体将包含以下抗体(例如,全长抗体或其免疫反应性片段),即,其中一个或多个恒定区结构域的至少一部分缺失或以另外的方式改变以提供所需的生物化学特性,例如当与包含天然或未改变的恒定区的具有大约相同免疫原性的抗体进行比较时减少的血清半衰期。在一些实施方案中,修饰的抗体的恒定区将包含人恒定区。符合本发明的恒定区的修饰包括一个或多个结构域中的一个或多个氨基酸的添加、缺失或取代。即,本文所公开的修饰的抗体可以包括对三个重链恒定域(CH1、CH2或CH3)中的一个或多个和/或对轻链恒定域(CL)的改变或修饰。在一些实施方案中,预期其中一个或多个结构域被部分或全部缺失的修饰的恒定区。在一些实施方案中,修饰的抗体将包含结构域缺失的构建体或变体,其中整个CH2结构域已经被去除(ΔCH2构建体)。在一些实施方案中,省去的恒定区结构域将被短氨基酸间隔区(例如,10个残基)置换,所述间隔区提供通常由缺乏的恒定区所给予的一些分子柔性。
除它们的构型之外,本领域已知恒定区介导一些效应子功能。例如,补体的C1组分与抗体的结合激活补体系统。补体的激活在细胞病原体的调理和溶解中是重要的。补体的激活还刺激炎症反应并且还可涉及自身免疫性超敏反应。此外,抗体经由Fc区结合细胞,其中所述抗体Fc区上的Fc受体位点结合细胞上的Fc受体(FcR)。存在许多对于不同种类的抗体具有特异性的Fc受体,包括IgG(γ受体)、IgE(η受体)、IgA(α受体)以及IgM(μ受体)。抗体与细胞表面上的Fc受体的结合触发许多重要的和多种的生物反应,包括抗体包覆的颗粒的吞噬和破坏、免疫复合物的清除、杀伤细胞对抗体包覆的靶细胞的溶解(称为抗体依赖性细胞介导的细胞毒性,或ADCC)、炎症介质的释放、胎盘转移以及免疫球蛋白产生的控制。
在某些实施方案中,CD37结合抗体提供了改变的效应子功能,而改变的效应子功能反过来影响所施用的抗体的生物学特征。例如,恒定区结构域的缺失或失活(通过点突变或其它方法)可以减少循环修饰的抗体的Fc受体结合。在其它情况下,可以是,与本发明一致地,恒定区修饰可以减弱补体结合并且因此减少缀合的细胞毒素的血清半衰期和非特异性缔合。另外,恒定区的其它修饰可以用于消除二硫键或寡糖部分,所述二硫键或寡糖部分因增加的抗原特异性或抗体柔性而允许增强的定位。类似地,根据本发明的恒定区的修饰可以使用很好地在本领域技术人员的技术范围内的熟知的生物化学或分子工程技术来容易地进行。
在某些实施方案中,作为抗体的CD37结合剂不具有一种或多种效应子功能。例如,在一些实施方案中,抗体不具有抗体依赖性细胞毒性(ADCC)活性和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)活性。在某些实施方案中,抗体不会结合Fc受体和/或补体因子。在某些实施方案中,抗体不具有效应子功能。
应注意,在某些实施方案中,修饰的抗体可以被工程改造来使CH3结构域直接与对应的修饰抗体的铰链区融合。在其它构建体中,可能需要在铰链区与修饰的CH2和/或CH3结构域之间提供肽间隔区。例如,可以表达相容的构建体,其中CH2结构域已缺失并且剩下的CH3结构域(修饰的或未修饰的)通过5至20个氨基酸间隔区而连接至铰链区。可以添加这种间隔区以便(例如)确保恒定域的调控元件保持自由和可及或使铰链区保持柔性。然而,应注意,在一些情况下,氨基酸间隔区可证明为免疫原性并且引发针对构建体的非需要的免疫反应。因此,在某些实施方案中,添加至构建体的任何间隔区将是相对非免疫原性的,或甚至完全地省去,以便保持所修饰的抗体的所需的生物化学性质。
除整个恒定区结构域的缺失之外,将认识到本发明的抗体可以通过少数或甚至单个氨基酸的部分缺失或取代来提供。例如,在CH2结构域的选定区域中的单个氨基酸的突变可能足以实质上减少Fc结合。类似地,可能需要仅仅缺失控制待调节的效应子功能(例如,补体CLQ结合)的一个或多个恒定区结构域的那一部分。恒定区的这类部分缺失可以改进抗体的选定特征(血清半衰期),同时使与该恒定区结构域完整相关联的其它所需的功能保持不变。此外,正如以上所提到的,所公开的抗体的恒定区可以通过增强所得到的构建体的特性的一个或多个氨基酸的突变或取代来进行修饰。在此方面,有可能破坏由保守结合位点(例如Fc结合)提供的活性,同时基本上保持所修饰的抗体的构型和免疫原性特性。某些实施方案可以包括将一个或多个氨基酸添加至恒定区以增强所需的特征,如减少或增加效应子功能或提供更多细胞毒素或碳水化合物附着。在这类实施方案中,可能希望插入或复制衍生自选定恒定区结构域的特异性序列。
本发明进一步包括基本上与本文所提出的嵌合、人源化以及人抗体、或其抗体片段同源的变体和等效物。这些可以包括,例如,保守性取代突变,即,一个或多个氨基酸被相似的氨基酸取代。例如,保守性取代是指一种氨基酸被相同通用分类内的另一种氨基酸取代,例如像,一种酸性氨基酸被另一种酸性氨基酸取代、一种碱性氨基酸被另一种碱性氨基酸取代或一种中性氨基酸被另一种中性氨基酸取代。预期保守性氨基酸取代是本领域熟知的。
本发明的多肽可以是包含抗人CD37的抗体或其片段的重组多肽、天然多肽、或合成多肽。本领域中将认识到可以改变本发明的一些氨基酸序列,而不对蛋白质的结构或功能产生显著影响。因此,本发明进一步包括显示出实质性活性或包含抗CD37蛋白的抗体或其片段的区域的多肽变体。这类突变体包括缺失、插入、翻转、重复以及类型取代。
可以进一步修饰多肽和类似物以便包含非蛋白质通常部分的另外的化学部分。这些衍生的部分可以改善蛋白质的溶解度、生物半衰期或吸收。所述部分还可以减少或消除蛋白质的任何希望的副作用等。关于那些部分的综述可以在REMINGTON'S PHARMACEUTICALSCIENCES,第20版,Mack Publishing Co.,Easton,PA(2000)中找到。
本文所描述的分离的多肽可以通过本领域已知的任何适合的方法来产生。这类方法的范围从直接蛋白质合成方法至构建编码分离的多肽序列的DNA序列并在适合的转化宿主中表达那些序列。在一些实施方案中,使用重组技术,通过分离或合成编码目标野生型蛋白的DNA序列来构建DNA序列。任选地,可以通过位点特异性诱变对序列进行诱变处理以提供其功能类似物。参见,例如,Zoeller等,Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 81:5662-5066(1984)和美国专利号4,588,585。
在一些实施方案中,编码目标多肽的DNA序列将使用寡核苷酸合成仪通过化学合成来进行构建。这类寡核苷酸可以基于所需的多肽的氨基酸序列并选择在宿主细胞中有利的那些密码子来进行设计,目标重组多肽将在所述宿主细胞中产生。标准方法可以应用于合成编码目标分离的多肽的分离的多核苷酸序列。例如,完整氨基酸序列可以用于构建反向翻译的基因。此外,可以合成含有编码特定的分离多肽的核苷酸序列的DNA低聚物。例如,可以合成编码所需的多肽的部分的一些小寡核苷酸并且然后连接。各个寡核苷酸通常包含用于互补组装的5'或3'突出端。
一旦组装(通过合成、定点诱变或另外方法),编码特定的目标分离多肽的多核苷酸序列将被插入至表达载体中并且可操作地连接至适于蛋白质在所需的宿主中的表达之用的表达控制序列。适当的组装可以通过核苷酸测序、限制性酶切作图以及生物活性多肽在适合的宿主中的表达得到证实。如本领域所熟知的,为了获得转染的基因在宿主中的高表达水平,所述基因必须可操作地连接至在选定的表达宿主中具有功能的转录和翻译表达控制序列。
在某些实施方案中,重组表达载体用于扩增和表达编码抗人CD37的抗体或其片段的DNA。重组表达载体是可复制的DNA构建体,所述构建体具有编码抗CD37抗体或其片段的多肽链的合成或cDNA衍生的DNA片段,可操作地连接源自哺乳动物、微生物、病毒或昆虫基因的适合的转录或翻译调控元件。转录单元总体上包含以下各项的组装:(1)在基因表达中具有调控作用的一个或多个基因元件,例如,转录启动子或增强子、(2)转录成mRNA并且翻译成蛋白质的结构或编码序列,以及(3)如以下详细描述的适当的转录和翻译起始和终止序列。这类调控元件可以包括操纵基因序列以控制转录。可以另外并入通常由复制起点赋予的在宿主中复制的能力和有助于转化体的识别的选择基因。当DNA区在功能上彼此相关时,它们被可操作地连接。例如,如果信号肽(分泌前导序列)的DNA表达为参与多肽的分泌的前体,那么它可操作地连接至所述多肽的DNA;如果启动子控制编码序列的转录,那么它可操作地连接至所述编码序列;或如果核糖体结合位点被定位以允许翻译,那么它可操作地连接至编码序列。意图在酵母表达系统中使用的结构元件包含使宿主细胞能够细胞外分泌翻译的蛋白质的前导序列。或者,当重组蛋白在无前导序列或转运序列的情况下表达时,它可以包括N末端甲硫氨酸残基。所述残基可以任选地随后从所表达的重组蛋白裂解以提供最终产物。
表达控制序列和表达载体的选择将取决于宿主的选择。可以采用范围广泛的表达宿主/载体组合。用于真核宿主的有用的表达载体包括,例如,包含来自SV40、牛乳头瘤病毒、腺病毒以及巨细胞病毒的表达控制序列的载体。用于细菌宿主的有用的表达载体包括已知的细菌质粒,如来自大肠杆菌的质粒(包括pCR 1、pBR322、pMB9及其衍生物)、广宿主范围质粒(如M13)和丝状单链DNA噬菌体。
用于表达CD37结合多肽或抗体(或CD37蛋白以用作抗原)的适合的宿主细胞包括在适当的启动子控制下的原核生物、酵母、昆虫或高等真核细胞。原核生物包括革兰氏阴性或革兰氏阳性生物,例如大肠杆菌或杆菌。高等真核细胞包括如以下所描述的哺乳动物源的已建立的细胞系。还可以采用无细胞翻译系统。用于细菌、真菌、酵母以及哺乳动物细胞宿主的适当的克隆和表达载体由Pouwels等(Cloning Vectors:A Laboratory Manual,Elsevier,N.Y.,1985)进行描述,所述文献的相关公开内容特此以引用的方式并入。关于蛋白质产生(包括抗体产生)的方法的另外信息可以在(例如)美国专利公布号2008/0187954、美国专利号6,413,746和6,660,501、以及国际专利公布号WO 04009823中找到,所述专利各自特此以引用的方式整体并入本文。
还有利地采用不同哺乳动物或昆虫细胞培养系统来表达重组蛋白。可以进行重组蛋白质在哺乳动物细胞中的表达,因为这类蛋白质通常正确折叠、适当修饰并且为完全功能性。适合的哺乳动物宿主细胞系的实例包括由Gluzman(Cell 23:175,1981)描述的猴肾细胞的COS-7系和能够表达适当的载体的其它细胞系,包括,例如,L细胞、C127、3T3、中国仓鼠卵巢(CHO)、HeLa以及BHK细胞系。哺乳动物表达载体可以包含非转录元件如复制起点、连接待表达的基因的适合的启动子以及增强子、和其它5'或3'旁侧非转录序列、以及5'或3'非翻译序列,如必需核糖体结合位点、多聚腺苷酸化位点、剪接供体和受体位点以及转录终止序列。用于在昆虫细胞中产生异源蛋白的杆状病毒系统由Luckow和Summers,Bio/Technology 6:47(1988)综述。
由转化的宿主产生的蛋白质可以根据任何适合的方法进行纯化。这类标准方法包括色谱法(例如,离子交换、亲和力以及定大小柱色谱法(sizing columnchromatography))、离心、差别溶解度或通过用于蛋白质纯化的任何其它标准技术。亲和标签如六聚组氨酸、麦芽糖结合域、流感外壳序列(influenza coat sequence)以及谷胱甘肽-S-转移酶可以附接至蛋白质以便允许通过适当的亲和柱来容易地纯化。分离的蛋白质还可以使用如蛋白水解、核磁共振以及x射线晶体学的技术进行物理表征。
例如,来自将重组蛋白分泌至培养基中的系统的上清液可以首先使用商业上可获得的蛋白质浓缩过滤器(例如,Amicon或Millipore Pellicon超滤单元)进行浓缩。在浓缩步骤之后,可以将浓缩物施加至适合的纯化基质。或者,可以采用阴离子交换树脂,例如,具有二乙基氨基乙基(DEAE)侧基的基质(matrix)或基材(substrate)。所述基质可以是丙烯酰胺、琼脂糖、葡聚糖、纤维素或蛋白质纯化中通常采用的其它类型。或者,可以采用阳离子交换步骤。适合的阳离子交换剂包括含有磺丙基或羧甲基的各种不溶性基质。最后,采用疏水RP-HPLC介质(例如,具有甲基或其它脂肪族侧基的硅胶)的一种或多种反相高效液相色谱(RP-HPLC)步骤可以用于进一步纯化CD37结合剂。呈各种组合的一些或全部前述纯化步骤还可以用于提供同质重组蛋白。
在细菌培养中产生的重组蛋白可以通过(例如)初始从细胞团块提取、接着一次或多次浓缩、盐析、水离子交换或尺寸排阻色谱步骤来进行分离。高效液相色谱法(HPLC)可以用于最终纯化步骤。在重组蛋白的表达中采用的微生物细胞可以通过任何方便的方法进行破坏,包括冻融循环、超声处理、机械破碎或使用细胞溶解剂。
本领域已知的用于纯化抗体和其它蛋白质的方法还包括,例如,美国专利公布号2008/0312425、2008/0177048以及2009/0187005中所描述的那些,所述专利各自特此以引用的方式整体并入本文。
在某些实施方案中,CD7结合剂是非抗体的多肽。用于鉴别和产生以高亲和力结合蛋白质靶标的非抗体多肽的多种方法是本领域已知的。参见,例如,Skerra,Curr.Opin.Biotechnol.,18:295-304(2007),Hosse等,Protein Science,15:14-27(2006),Gill等,Curr.Opin.Biotechnol.,17:653-658(2006),Nygren,FEBS J.,275:2668-76(2008),以及Skerra,FEBS J.,275:2677-83(2008),所述文献各自以引用的方式整体并入本文。在某些实施方案中,噬菌体展示技术已经用于鉴别/产生CD37结合多肽。在某些实施方案中,多肽包含选自由以下组成的组的类型的蛋白质支架:蛋白质A、脂质运载蛋白、纤连蛋白域、锚蛋白共有重复域以及硫氧还蛋白。
在一些实施方案中,所述药剂是非蛋白质分子。在某些实施方案中,所述药剂是小分子。在非蛋白质CD37结合剂的鉴别中有用的组合化学库和技术是本领域技术人员已知的。参见,例如,Kennedy等,J.Comb.Chem,10:345-354(2008),Dolle等,J.Comb.Chem.,9:855-902(2007),以及Bhattacharyya,Curr.Med.Chem.,8:1383-404(2001),所述文献各自以引用的方式整体并入本文。在某些另外实施方案中,所述药剂是碳水化合物、糖胺聚糖、糖蛋白或蛋白聚糖。
在某些实施方案中,所述药剂是核酸适体。适体是多核苷酸分子,其已经基于它们结合另一个分子的能力进行选择(例如,从随机或诱变池)。在一些实施方案中,适体包含DNA多核苷酸。在某些替代实施方案中,适体包含RNA多核苷酸。在某些实施方案中,适体包含一个或多个修饰的核酸残基。产生和筛选用于结合蛋白质的核酸适体的方法是本领域熟知的。参见,例如,美国专利号5,270,163、美国专利号5,683,867、美国专利号5,763,595、美国专利号6,344,321、美国专利号7,368,236、美国专利号5,582,981、美国专利号5,756,291、美国专利号5,840,867、美国专利号7,312,325、美国专利号7,329,742、国际专利公布号WO 02/077262、国际专利公布号WO 03/070984、美国专利申请公布号2005/0239134、美国专利申请公布号2005/0124565以及美国专利申请公布号2008/0227735,所述专利各自以引用的方式整体并入本文。
III.免疫缀合物
本发明还针对缀合物(本文还被称为免疫缀合物),其包含与药物或前药连接或缀合的如本文所公开的抗CD37抗体、抗体片段以及它们的功能等效物。适合的药物或前药是本领域已知的。药物或前药可以是细胞毒性剂。在本发明的细胞毒性缀合物中使用的细胞毒性剂可为导致细胞的死亡或诱导细胞死亡或以某种方式降低细胞生存力的任何化合物,并且包括,例如,美登木素和美登木素类似物。其它适合的细胞毒性剂是,例如,苯二氮紫杉烷类、CC-1065和CC-1065类似物、倍癌霉素和倍癌霉素类似物、烯二炔类(如卡奇霉素)、多拉司他汀以及多拉司他汀类似物(包括奥利斯他汀)、托马霉素衍生物、来普霉素(leptomycin)衍生物、甲氨蝶呤、顺铂、卡铂、道诺红菌素(daunorubicin)、阿霉素(doxorubicin)、长春新碱(vincristine)、长春花碱(vinblastine)、美法仑(melphalan)、丝裂霉素(mitomycin)C、苯丁酸氮芥(chlorambucil)以及吗啉代阿霉素(morpholinodoxorubicin)。
这类缀合物可以通过使用连接基以便将药物或前药连接至抗体或功能等效物来制备。适合的连接基是本领域熟知的并且包括(例如)二硫基、硫醚基、酸不稳定性基团、光不稳定性基团、肽酶不稳定性基团以及酯酶不稳定性基团。
药物或前药可以(例如)通过二硫键连接至抗CD37抗体或其片段。接头分子或交联剂包含可以与抗CD37抗体或其片段反应的反应性化学基团。用于与细胞结合剂反应的反应性化学基团可以是N-琥珀酰亚胺酯和N-磺基琥珀酰亚胺酯。此外,接头分子包含反应性化学基团,所述反应性化学基团可以是可以与药物反应以形成二硫键的二硫代吡啶基。接头分子包括,例如,3-(2-吡啶基二硫代)丙酸N-琥珀酰亚胺酯(SPDP)(参见,例如,Carlsson等,Biochem.J.,173:723-737(1978))、4-(2-吡啶基二硫代)丁酸N-琥珀酰亚胺酯(SPDB)(参见,例如,美国专利号4,563,304)、4-(2-吡啶基二硫代)2-磺基丁酸N-琥珀酰亚胺酯(磺基-SPDB)(参见美国公布号20090274713)、4-(2-吡啶基二硫代)戊酸N-琥珀酰亚胺酯(SPP)(参见,例如CAS登录号341498-08-6)、2-亚氨基硫烷或乙酰基琥珀酸酐。例如,抗体或细胞结合剂可以用交联剂进行修饰并且然后使由此产生的含有游离或受保护的硫醇基的抗体或细胞结合剂与含有二硫键或硫醇基的美登木素反应以产生缀合物。所述缀合物可以通过色谱法进行纯化,所述色谱法包括但不限于HPLC、尺寸排阻、吸附、离子交换和亲和捕捉、渗析或切向流过滤。
在本发明的另一方面,抗CD37抗体经由二硫键和聚乙二醇间隔区连接至细胞毒性药物,从而增强免疫缀合物的效力、溶解度或功效。这类可裂解的亲水性接头在WO2009/0134976中进行描述。这种接头设计的另外益处是抗体-药物缀合物的所需的高单体比和最小聚集。在这方面具体涵盖经由二硫基(-S-S-)连接的细胞结合剂与药物的缀合物,其带有聚乙二醇间隔区((CH2CH2O)n=1-14),药物负载数在2至8的窄范围,这描述了其显示对细胞相对高效力的生物活性并且具有高缀合产率和高单体比的所需生物化学特性,同时具有最小蛋白质聚集。
在这方面具体涵盖了式(I)的抗CD37抗体药物缀合物或式(I')的缀合物:
CB–[Xl–(–CH2–CH2O–)n–Y–D]m (I)
[D-Y-(–CH2–CH2O–)n–Xl]m-CB (I')
其中:
CB表示抗CD37抗体或片段;
D表示药物;
X表示经由硫醚键、酰胺键、氨基甲酸酯键或醚键附接至细胞结合剂的脂肪族、芳香族或杂环单元;
Y表示经由二硫键附接至所述药物的脂肪族、芳香族或杂环单元;
l是0或1;
m是2至8的整数;并且
n是1至24的整数。
在一些实施方案中,m是2至6的整数。
在一些实施方案中,m是3至5的整数。
在一些实施方案中,n是2至8的整数。或者,如(例如)美国专利号6,441,163和7,368,565中所公开的,所述药物可以首先进行修饰以引入适合与细胞结合剂反应的反应性酯。含有活化的接头部分的这些药物与细胞结合剂的反应提供产生细胞结合剂药物缀合物的另一种方法。还可以使用PEG连接基将美登木素连接至抗CD37抗体或片段,如(例如)美国专利6,716,821中所提出的。这些PEG不可裂解的连接基在水中和在非水溶剂中都可溶,并且可以用于将一种或多种细胞毒性剂连接至细胞结合剂。示例性PEG连接基包括异双功能PEG接头,所述接头通过在一端处的功能性巯基或二硫基和在另一端处的活化酯而在接头的相反端与细胞毒性剂和细胞结合剂反应。作为使用PEG连接基合成细胞毒性缀合物的一般例子,再次参见美国专利6,716,821,所述专利以引用的方式整体并入本文。合成开始于携带反应性PEG部分的一种或多种细胞毒性剂与细胞结合剂的反应,从而导致每个反应性PEG部分的末端活化酯被细胞结合剂的氨基酸残基置换,从而产生包含通过PEG连接基共价键合至细胞结合剂的一种或多种细胞毒性剂的细胞毒性缀合物。或者,所述细胞结合可以用双功能PEG交联剂进行修饰以便引入反应性二硫化物部分(如吡啶基二硫化物),所述二硫化物部分然后可以用含有硫醇的美登木素处理以提供缀合物。在另一种方法中,所述细胞结合可以用双功能PEG交联剂进行修饰以便引入硫醇部分,所述硫醇部分然后可以用含有反应性二硫化物(如吡啶基二硫化物)的美登木素进行处理以提供缀合物。
还可以制备具有不可裂解的连接的抗体-美登木素缀合物。这类交联剂在本领域中有所描述(参见美国公布号20050169933)并且包括但不限于,4-(马来酰亚胺基甲基)环己烷羧酸N-琥珀酰亚胺酯(SMCC)。在一些实施方案中,如文献种所描述的将抗体用交联剂如4-(N-马来酰亚胺基甲基)-环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯(SMCC)、磺基-SMCC、马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)、磺基-MBS或碘乙酸琥珀酰亚胺酯进行修饰,以引入1至10个反应性基团(Yoshitake等,Eur.J.Biochem.,101:395-399(1979);Hashida等,J.Applied Biochem.,56-63(1984);以及Liu等,Biochem.,18:690-697(1979))。修饰的抗体然后与含有硫醇的美登木素衍生物反应以产生缀合物。缀合物可以通过穿过SephadexG25柱的凝胶过滤或通过渗析或切向流过滤来进行纯化。修饰的抗体用含有硫醇的美登木素(1至2摩尔当量/马来酰亚胺基)进行处理并且抗体-美登木素缀合物通过穿过SephadexG-25柱的凝胶过滤、陶瓷羟基磷灰石柱色谱法、渗析或切向流过滤或其方法的组合来进行纯化。通常,平均每个抗体连接1至10个美登木素。一种方法是用4-(N-马来酰亚胺基甲基)-环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯(SMCC)修饰抗体以便引入马来酰亚胺基,接着所修饰的抗体与含有硫醇的美登木素反应以得到硫醚连接的缀合物。再次得到具有每个抗体分子1至10个药物分子的缀合物。以相同方式制备抗体、抗体片段以及其它蛋白质的美登木素缀合物。
在本发明的另一方面,CD37抗体通过PEG间隔区的中间物经由不可裂解的键连接至药物。包含在药物与抗CD37抗体或片段之间形成接头的亲水性PEG链的适合的交联剂也是本领域已知的,或是商业上可获得的(例如,来自Quanta Biodesign,Powell,Ohio)。适合的含有PEG的交联剂还可以使用本领域技术人员已知的标准合成化学技术从商业上可获得的PEG本身来合成。可以通过在美国专利公布20090274713中和在WO2009/0134976中详细描述的方法使药物与含有双功能PEG的交联剂反应以得到下式的化合物:Z–Xl–(–CH2–CH2–O–)n–Yp–D,所述化合物可以然后与细胞结合剂反应以提供缀合物。或者,所述细胞结合可以用双功能PEG交联剂进行修饰以便引入硫醇反应性基团(如马来酰亚胺或卤代乙酰胺),所述硫醇反应性基团可以然后用含有硫醇的美登木素进行处理以提供缀合物。在另一种方法中,所述细胞结合可以用双功能PEG交联剂进行修饰以便引入硫醇部分,所述硫醇部分然后可以用硫醇反应性美登木素(如携带马来酰亚胺或卤代乙酰胺的美登木素)进行处理以提供缀合物。
因此,本发明的另一方面是式(II)或式(II')的抗CD37抗体药物缀合物:
CB–[Xl–(–CH2–CH2–O–)n–Yp–D]m (II)
[D-Yp–(–CH2–CH2–O–)n–Xl]m-CB (II')
其中,CB表示抗CD37抗体或片段;
D表示药物;
X表示经由硫醚键、酰胺键、氨基甲酸酯键或醚键键合至细胞结合剂的脂肪族、芳香族或杂环单位;
Y表示经由选自由以下组成的组的共价键键合至药物的脂肪族、芳香族或杂环单位:硫醚键、酰胺键、氨基甲酸酯键、醚键、胺键、碳-碳键以及腙键;
l是0或1;
p是0或1;
m是2至15的整数;并且
n是1至2000的整数。
在一些实施方案中,m是2至8的整数;并且
在一些实施方案中,n是1至24的整数。
在一些实施方案中,m是2至6的整数。
在一些实施方案中,m是3至5的整数。
在一些实施方案中,n是2至8的整数。适合的含有PEG的接头的实例包括具有用于与抗CD37抗体或其片段反应的N-琥珀酰亚胺酯部分或N-磺基琥珀酰亚胺酯部分以及用于与化合物反应的基于马来酰亚胺基或卤代乙酰基的部分的接头。可以通过本文所描述的方法将PEG间隔区并入本领域已知的任何交联剂中。
本文所公开的许多接头在美国专利公布号20050169933和20090274713中以及在WO2009/0134976中进行详细描述,所述专利的内容以引用的方式整体并入本文。
本发明包括以下方面,其中约2至约8个药物分子(“药物负载数”)(例如,美登木素)连接至抗CD37抗体或其片段。如本文所用,“药物负载数”是指可以附接至细胞结合剂(例如,抗CD37抗体或其片段)的药物分子(例如,美登木素)的数目。一方面,可以附接至细胞结合剂的药物分子的数目可以平均为约2至约8个(例如,1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1)。可以使用N2’-脱乙酰基-N2’-(3-巯基-1-氧代丙基)-美登素(DM1)和N2’-脱乙酰基-N2’-(4-巯基-4-甲基-1-氧代戊基)美登素(DM4)。
因此,一方面,免疫缀合物包含每个抗体1个美登木素。另一方面,免疫缀合物包含每个抗体2个美登木素。另一方面,免疫缀合物包含每个抗体3个美登木素。另一方面,免疫缀合物包含每个抗体4个美登木素。另一方面,免疫缀合物包含每个抗体5个美登木素。另一方面,免疫缀合物包含每个抗体6个美登木素。另一方面,免疫缀合物包含每个抗体7个美登木素。另一方面,免疫缀合物包含每个抗体8个美登木素。
一方面,免疫缀合物包含每个抗体约1至约8个美登木素。另一方面,免疫缀合物包含每个抗体约2至约7个美登木素。另一方面,免疫缀合物包含每个抗体约2至约6个美登木素。另一方面,免疫缀合物包含每个抗体约2至约5个美登木素。另一方面,免疫缀合物包含每个抗体约3至约5个美登木素。另一方面,免疫缀合物包含每个抗体约3至约4个美登木素。
一方面,包含免疫缀合物的组合物具有每个抗体平均附接约2至约8个(例如,1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1)个药物分子(例如,美登木素)。一方面,包含免疫缀合物的组合物具有每个抗体平均约1至约8个药物分子(例如,美登木素)。一方面,包含免疫缀合物的组合物具有每个抗体平均约2至约7个药物分子(例如,美登木素)。一方面,包含免疫缀合物的组合物具有每个抗体平均约2至约6个药物分子(例如,美登木素)。一方面,包含免疫缀合物的组合物具有每个抗体平均约2至约5个药物分子(例如,美登木素)。一方面,包含免疫缀合物的组合物具有每个抗体平均约3至约5个药物分子(例如,美登木素)。一方面,包含免疫缀合物的组合物具有每个抗体平均约3至约4个药物分子(例如,美登木素)。
一方面,包含免疫缀合物的组合物具有每个抗体平均附接约2±0.5、约3±0.5、约4±0.5、约5±0.5、约6±0.5、约7±0.5或约8±0.5个药物分子(例如,美登木素)。一方面,包含免疫缀合物的组合物具有每个抗体平均约3.5±0.5个药物分子(例如,美登木素)。
抗CD37抗体或其片段可以通过使双功能交联试剂与所述抗CD37抗体或其片段反应来进行修饰,从而导致接头分子共价附接至抗CD37抗体或其片段。如本文所用,“双功能交联试剂”是将细胞结合剂共价连接至药物(如本文所描述的药物)的任何化学部分。在另一种方法中,连接部分的一部分由药物提供。在这方面,药物包含为用于将细胞结合剂连接至药物的更大接头分子的一部分的连接部分。例如,为了形成美登木素DM1,对在美登素的C-3羟基处的侧链进行修饰以具有游离的巯基(SH)。美登素的这种硫醇化的形式可以与修饰的细胞结合剂反应以形成缀合物。因此,最终接头是由两种组分组装,其中之一由交联试剂提供,而另一者由来自DM1的侧链提供。
药物分子还可以通过中间载体分子如血清白蛋白而连接至抗体分子。
如本文所用,表达“连接至细胞结合剂”或“连接至抗CD37抗体或其片段”是指包含经由适合的连接基结合至细胞结合剂抗CD37抗体或片段的至少一种药物衍生物或其前体的缀合物分子。一种连接基是SMCC。
在某些实施方案中,在本发明中有用的细胞毒性剂是美登木素和美登木素类似物。适合的美登木素的实例包括美登醇和美登醇类似物的酯。包括抑制微管形成并且对哺乳动物细胞具有高毒性的任何药物,如美登醇和美登醇类似物。
适合的美登醇酯的实例包括具有修饰的芳香环的那些和具有在其它位置处的修饰的那些。这类适合的美登木素在美国专利号4,424,219;4,256,746;4,294,757;4,307,016;4,313,946;4,315,929;4,331,598;4,361,650;4,362,663;4,364,866;4,450,254;4,322,348;4,371,533;5,208,020;5,416,064;5,475,092;5,585,499;5,846,545;6,333,410;7,276,497以及7,473,796中进行公开。
在某些实施方案中,本发明的免疫缀合物利用含有硫醇的美登木素(DM1)(正式称为N2’-脱乙酰基-N2’-(3-巯基-1-氧代丙基)-美登素)作为细胞毒性剂。DM1由以下结构式(III)表示:
在另一个实施方案中,本发明的缀合物利用含有硫醇的美登木素N2’-脱乙酰基-N2’(4-甲基-4-巯基-1-氧代戊基)-美登素(例如,DM4)作为细胞毒性剂。DM4由以下结构式(IV)表示:
另一种包含含有位阻硫醇键的侧链的美登木素是N2’-脱乙酰基-N-2’(4-巯基-1-氧代戊基)-美登素(称为DM3),由以下结构式(V)表示:
美国专利号5,208,020和7,276,497中所教导的每一种美登木素也可以用于本发明的缀合物中。在这方面,5,208,020和7,276,697的全部公开以引用的方式并入本文。
美登木素上的许多位置可以用作化学地连接所述连接部分的位置。例如,具有羟基的C-3位置、用羟甲基修饰的C-14位置、用羟基修饰的C-15位置以及具有羟基的C-20位置都预期是有用的。在一些实施方案中,C-3位置用作化学地连接所述连接部分的位置,并且在一些具体实施方案中,美登醇的C-3位置用作化学地连接所述连接部分的位置。
以下示出一些缀合物的结构表示:
用于产生这类抗体-美登木素缀合物的一些描述提供于美国专利号6,333,410、6,441,163、6,716,821以及7,368,565中,所述专利各自整体并入本文。
一般来说,可以将抗体在水缓冲液中的溶液与摩尔过量的携带反应性基团的具有二硫化物部分的美登木素一起孵育。反应混合物可以通过添加过量的胺(如乙醇胺、牛磺酸)来淬灭。美登木素-抗体缀合物然后可以通过凝胶过滤来纯化。
每个抗体分子所结合的美登木素分子的数目可以通过用分光光度法测量在252nm和280nm下吸光度的比来确定。美登木素分子/抗体的平均数目可以是(例如)约1至10、2至5、3至4或约3.5。一方面,美登木素分子/抗体的平均数目为约3.5±0.5。
蒽环类化合物和其衍生物、中间体以及其修饰的型式还可以用于制备抗CD37免疫缀合物。例如,阿霉素、阿霉素衍生物、阿霉素中间体以及修饰的阿霉素可以用于抗CD37缀合物中。示例性化合物描述于WO 2010/009124中,所述专利以引用的方式整体并入本文。这类化合物包括(例如)下式的化合物:
其中R1是氢原子、羟基或甲氧基并且R2是C1-Cs烷氧基;或其药学上可接受的盐。
对于抗体与美登木素或其它药物的缀合物,可以体外评价它们抑制各种非需要的细胞系的增殖的能力。例如,细胞系如人淋巴瘤细胞系Daudi和人淋巴瘤细胞系Ramos可以容易地用于评估这些化合物的细胞毒性。待评估的细胞可以暴露于化合物4至5天并且通过已知方法以直接测定来测量细胞的存活分数。然后可以从所述测定的结果计算IC50值。
根据本文所描述的一些实施方案,免疫缀合物可以被内化至细胞中。因此当免疫缀合物被表达CD37的细胞吸收或内化时,它可以发挥治疗作用。在一些具体实施方案中,免疫缀合物包含通过可裂解的接头连接至细胞毒性剂的抗体、抗体片段或多肽,并且所述细胞毒性剂从所述抗体、抗体片段或多肽裂解,其中它被表达CD37的细胞内化。
在一些实施方案中,免疫缀合物能够消减B细胞,例如,自身反应性B细胞。例如,在一些实施方案中,用免疫缀合物处理导致至少约25%、至少约30%、至少约35%、至少约40%、至少约45%、至少约50%、至少约55%、至少约60%、至少约65%、至少约70%或至少约75%的B细胞的消减。
在本发明的另一方面,siRNA分子可以连接至本发明的抗体而不是药物。siRNA可以通过通常用于寡核苷酸的修饰的方法来连接至本发明的抗体(参见,例如,美国专利公布20050107325和20070213292)。因此呈其3’或5’亚磷酰胺形式的siRNA可以与携带羟基官能度的交联剂的一端反应,以便在所述siRNA与所述交联剂之间得到酯键。类似地,siRNA亚磷酰胺与携带末端氨基的交联剂的反应导致所述交联剂通过胺连接至所述siRNA。或者,siRNA可以通过标准化学方法来衍生以便引入硫醇基团。这种含有硫醇的siRNA可以与已经进行修饰而引入活性二硫化物或马来酰亚胺部分的抗体反应,以便产生可裂解的或不可裂解的缀合物。1至20个之间的siRNA分子可以通过这种方法连接至抗体。
III.多核苷酸
在某些实施方案中,本发明涵盖包含编码特异性地结合CD37的多肽或这种多肽的片段的多核苷酸的多核苷酸。例如,本发明提供包含编码人CD37的抗体或编码这种抗体的片段的核酸序列的多核苷酸。本发明的多核苷酸可以呈RNA形式或呈DNA形式。DNA包括cDNA、基因组DNA以及合成DNA;并且可为双链或单链,并且如果是单链,则可为编码链或非编码(反义)链。
在某些实施方案中,多核苷酸是分离的。在某些实施方案中,多核苷酸是基本上纯的。
本发明提供包含编码多肽的多核苷酸的多核苷酸,所述多肽包含选自由SEQ IDNO:4至120组成的组的序列。
本发明进一步提供包含选自以下表7至10中所示的那些的序列的多核苷酸。
表7:可变重链多核苷酸序列
表8:可变轻链多核苷酸序列
表9:全长重链多核苷酸序列
表10:全长轻链多核苷酸序列
还提供了与SEQ ID NO:121至170、182或183具有至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%或至少约99%序列同一性的多核苷酸。因此,在某些实施方案中,多核苷酸包含(a)与SEQ ID NO:121至135、152至161或182具有至少约95%序列同一性的多核苷酸,和/或(b)与SEQ ID NO:136至151、162至170或183具有至少约95%序列同一性的多核苷酸。在某些实施方案中,多核苷酸包含(a)具有SEQ ID NO:121至135、152至161或182的核酸序列的多核苷酸;和/或(b)具有SEQ ID NO:136至151、162至170或183的核酸序列的多核苷酸。
在一些实施方案中,多核苷酸编码由重组质粒DNA phuCD37-3LC(ATCC保藏名称PTA-10722,2010年3月18日保藏在ATCC)编码的轻链或与由phuCD37-3LC(PTA-10722)编码的轻链至少约85%、至少约90%、至少约95%或至少约99%相同的轻链。在一些实施方案中,多核苷酸编码由重组质粒DNA phuCD37-3HCv.1.0(ATCC保藏名称PTA-10723,2010年3月18日保藏在ATCC)编码的重链或与由phuCD37-3HCv.1.0(PTA-10723)编码的重链至少约85%、至少约90%、至少约95%或至少约99%相同的重链。在某些实施方案中,多核苷酸是重组质粒DNA phuCD37-3LC(PTA-10722)或重组质粒phuCD37-3HCv.1.0(PTA-10723)。
在某些实施方案中,多核苷酸包含用于在相同阅读框中与帮助(例如)多肽从宿主细胞表达和分泌的多核苷酸融合的成熟多肽的编码序列(例如,作为用于控制多肽从所述细胞的转运的分泌序列的前导序列)。具有前导序列的多肽是前蛋白并且可以具有由宿主细胞裂解的前导序列以便形成所述多肽的成熟形式。多核苷酸还可以编码蛋白原,所述蛋白原是成熟蛋白质加上另外5'氨基酸残基。具有原序列的成熟蛋白质是蛋白原并且是蛋白质的无活性形式。一旦原序列裂解,就保留活性成熟蛋白质。
在某些实施方案中,多核苷酸包含用于在相同阅读框中与标记序列融合的成熟多肽的编码序列,所述标记序列允许(例如)所编码的多肽的纯化。例如,在细菌宿主的情况下,标记序列可以是由pQE-9载体供给的六聚组氨酸标签以提供与所述标记融合的成熟多肽的纯化,或当使用哺乳动物宿主(例如COS-7细胞)时,标记序列可以是源自流感血凝素蛋白的血凝素(HA)标签。
本发明进一步涉及以上所描述的编码(例如)片段、类似物以及衍生物的多核苷酸的变体。
多核苷酸变体可以包含在编码区、非编码区或二者中的改变。在一些实施方案中,多核苷酸变体包含产生沉默取代、添加或缺失但不会改变所编码的多肽的特性或活性的改变。在一些实施方案中,核苷酸变体通过由于遗传密码的简并而引起的沉默取代来产生。多核苷酸变体可以出于多种原因产生,例如,用于优化具体宿主的密码子表达(将人mRNA中的密码子改变成被细菌宿主(如大肠杆菌)偏爱的那些)。
还提供包含本文所描述的多核苷酸的载体和细胞。
IV.使用方法和药物组合物
本发明的CD37结合剂(包括抗体、免疫缀合物以及多肽)在多种应用中有用,包括但不限于,治疗性治疗方法,如癌症(如B细胞恶性肿瘤)、自身免疫性疾病以及炎性疾病的治疗。在某些实施方案中,所述药剂适用于消减B细胞。在某些实施方案中,所述药剂适用于消减自身反应性B细胞。在某些实施方案中,所述药剂适用于消减外周B细胞。在某些实施方案中,所述药剂适用于预防不适当的T细胞刺激。T细胞刺激可能与B细胞通路有关。使用的方法可以是体外、离体或体内方法。在某些实施方案中,CD37结合剂或抗体或免疫缀合物、或多肽是它所结合的人CD37的拮抗剂。
一方面,本发明的抗CD37抗体和免疫缀合物适用于检测生物样本中CD37的存在。如本文所用的术语“检测”涵盖定量或定性检测。在某些实施方案中,生物样本包含细胞或组织。在某些实施方案中,这类组织包括相对于其它组织在更高水平下表达CD37的组织,例如,B细胞和/或B细胞相关的组织。
一方面,本发明提供一种检测生物样本中CD37的存在的方法。在某些实施方案中,所述方法包括将所述生物样本与抗CD37抗体在允许所述抗CD37抗体与CD37结合的条件下相接触,并且检测所述抗CD37抗体与CD37之间是否形成复合物。
一方面,本发明提供一种诊断与CD37的增加表达相关的病症的方法。在某些实施方案中,所述方法包括将测试细胞与抗CD37抗体相接触;通过检测抗CD37抗体与CD37的结合确定所述测试细胞的CD37表达水平(定量地抑或定性地);以及将所述测试细胞的CD37表达水平与由对照细胞(例如,与所述测试细胞相同的组织来源的正常细胞或在可比得上这种正常细胞的水平下表达CD37的细胞)的CD37表达水平进行比较,其中与所述对照细胞相比的所述测试细胞的CD37表达的更高水平指示与增加的CD37表达相关的病症的存在。在某些实施方案中,测试细胞从疑似患有自身免疫性病症或炎性病症的个体获得。在一些实施方案中,所述病症与CD37的增加的表达相关。在一些实施方案中,所述病症与B细胞的增加的数目相关。在一些实施方案中,所述病症与B细胞的增加的活性相关。
在某些实施方案中,如以上所描述的那些的诊断或检测的方法包括检测抗CD37抗体与细胞的表面上或从在其表面上表达CD37的细胞获得的膜制备物中表达的CD37的结合。在某些实施方案中,所述方法包括将细胞与抗CD37抗体在允许所述抗CD37抗体与CD37的结合的条件下相接触,以及检测所述抗CD37抗体与所述细胞表面上的CD37之间是否形成复合物。用于检测抗CD37抗体与细胞表面上表达的CD37的结合的示例性测定是“FACS”测定。
某些其它方法可以用于检测抗CD37抗体与CD37的结合。这类方法包括,但不限于,本领域熟知的抗原结合测定,如蛋白质印迹(western blot)、放射性免疫测定、ELISA(酶联免疫吸附测定),、“夹心法(sandwich)”免疫测定、免疫沉淀法测定、荧光免疫测定、蛋白质A免疫测定以及免疫组织化学法(IHC)。
在某些实施方案中,抗CD37抗体是被标记的。标记包括,但不限于,直接检测的标记或部分(如荧光、发色团、电子致密、化学发光以及放射性标记)和间接检测的部分(如酶或配体),例如通过酶促反应或分子间相互作用而间接检测。
在某些实施方案中,抗CD37抗体被固定在不溶性基质上。固定需要将抗CD37抗体与在溶液中保持游离的任何CD37分离。这通常通过以下方式完成:在测定工序之前通过吸附至水不溶性基质或表面(Bennich等,美国专利号3,720,760)或通过共价偶联(例如,使用戊二醛交联)而使抗CD37抗体不溶,抑或或通过在抗CD37抗体与CD37之间形成复合物之后使抗CD37抗体不溶(例如,通过免疫沉淀)。
诊断或检测的任何上述实施方案可以使用本发明的免疫缀合物代替抗CD37抗体或除抗CD37抗体之外使用本发明的免疫缀合物来进行。
在某些实施方案中用CD37结合剂治疗的疾病是自身免疫性或炎性疾病。在某些实施方案中,自身免疫性或炎性疾病选自由以下组成的组:银屑病、皮肤炎、系统性硬皮病和硬化症、与炎性肠病相关的反应、克罗恩氏疾病、溃疡性结肠炎、呼吸窘迫综合征、成人呼吸窘迫综合征(ARDS)、皮炎、脑膜炎、脑炎、葡萄膜炎、结肠炎、肾小球性肾炎、过敏性病状、湿疹、哮喘、涉及T细胞的浸润和慢性炎症反应的病状、动脉粥样硬化、白细胞粘附缺陷症、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮(SLE)、糖尿病、多发性硬化、雷诺氏综合征、自身免疫性甲状腺炎、变应性脑脊髓炎、斯耶格伦氏综合征、幼年发病型糖尿病、与由细胞因子和T淋巴细胞介导的急性和迟发型超敏反应相关的免疫反应、结核病(tuberculosis)、肉样瘤病(sarcoidosis)、多发性肌炎、肉芽肿病、血管炎、恶性贫血(pernicious anemia)(阿狄森氏疾病(Addison's disease))、涉及白细胞渗出的疾病、中枢神经系统(CNS)炎性病症、多器官损伤综合征、溶血性贫血、重症肌无力、抗原-抗体复合物介导的疾病、抗肾小球基底膜病、抗磷脂综合征、变应性神经炎、格雷夫斯氏疾病、莱伯特-伊顿肌无力综合征(Lambert-Eaton myasthenic syndrome)、大疱性类天疱疮、天疱疮、自身免疫性多发性内分泌病(autoimmune polyendocrinopathies)、莱特尔氏疾病、僵人综合征(stiff-mansyndrome)、白赛氏疾病、巨细胞动脉炎、免疫复合物性肾炎(immune complex nephritis)、IgA肾病、IgM多发性神经病、特发性血小板减少性紫癜(ITP)以及自身免疫性血小板减少症。。
在一些实施方案中,自身免疫性或炎性疾病选自由以下组成的组:类风湿性关节炎(RA)、狼疮、免疫性血小板减少性紫癜、纯红细胞再生障碍、自身免疫性贫血、冷凝集素病、具有严重胰岛素抵抗的B型综合征、混合型冷球蛋白血症、重症肌无力、韦格纳氏肉芽肿病、显微镜下多血管炎(MPA)、难治性寻常天疱疮、皮肤肌炎、斯耶格仑氏综合征、活动性II型混合冷球蛋白血症、寻常天疱疮、自身免疫性神经病、副肿瘤性眼阵挛-肌阵挛综合征以及复发-缓解型多发性硬化(RRMS)。
在某些实施方案中,自身免疫性疾病或炎性疾病以CD37结合剂(例如,抗体)所结合的表达CD37的细胞为特征。
本发明提供治疗自身免疫性和炎性疾病的方法,所述方法包括对受试者(例如,需要治疗的受试者)施用治疗有效量的CD37结合剂。在某些实施方案中,受试者是人。
本发明进一步提供用于使用本文所描述的抗体或其它药剂消减B细胞(例如,自身反应性B细胞)的方法。在某些实施方案中,消减B细胞的方法包括将B细胞与CD37结合剂(例如,抗体)在体外相接触。例如,将表达CD37的细胞系在添加有所述抗体或其它药剂的培养基中进行培养以消减所述细胞。在一些实施方案中,将细胞从患者样本(例如像组织活检切片、胸腔积液或血液样本)分离并且在添加有CD37结合剂的培养基中进行培养以消减所述细胞。
在一些实施方案中,消减B细胞(例如自身反应性B细胞)的方法包括将所述细胞与CD37结合剂(例如,抗体)在体内相接触。在某些实施方案中,将细胞与CD37结合剂相接触是在动物模型中进行。例如,可以将CD37结合剂施用至表达一种或多种CD37的异种移植物,所述异种移植物已经在免疫功能不全的小鼠(例如,NOD/SCID小鼠)中生长。在一些实施方案中,将细胞从患者样本(例如像组织活检、胸腔积液或血液样本)分离并且注射至免疫功能不全的小鼠中,然后向所述小鼠施用CD37结合剂以消减B细胞。在一些实施方案中,在将细胞引入至动物中的同时或不久之后施用CD37结合剂。在另外实例中,可以在体内将CD37结合剂施用至表达一种或多种CD37抗原的小鼠。在一些实施方案中,这些小鼠可以进行工程改造以便除鼠CD37之外表达人CD37或表达人CD37而不是鼠CD37。在一些实施方案中,这些小鼠是疾病模型,例如,用于自身免疫性疾病的模型。在一些实施方案中,施用CD37结合剂在体内消减B细胞。在一些实施方案中,CD37结合剂预防T细胞刺激。在一些实施方案中,施用CD37结合剂预防或减轻自身免疫性疾病。
在某些实施方案中,B细胞过量表达CD37。在其它实施方案中,B细胞不过量表达CD37。在一些实施方案中,B细胞不是癌细胞。在一些实施方案中,B细胞不是肿瘤细胞。在一些实施方案中,B细胞不是癌性细胞。
本发明进一步提供包含一种或多种本文所描述的CD37结合剂的药物组合物。在某些实施方案中,所述药物组合物进一步包含药学上可接受的媒介物。这些药物组合物在治疗人患者中的自身免疫性和炎性疾病中发现用途。
在某些实施方案中,通过将本发明的纯化的抗体或药剂与药学上可接受的媒介物(例如载体、赋形剂)组合来制备用于储存和使用的制剂(Remington,The Science andPractice of Pharmacy第20版Mack Publishing,2000)。适合的药学上可接受的媒介物包括,但不限于,无毒缓冲剂,如磷酸、柠檬酸以及其它有机酸;盐,如氯化钠;抗氧化剂,包括抗坏血酸和甲硫氨酸;防腐剂(例如,十八烷基二甲基苄基氯化铵;氯化六甲双铵;氯化苯甲烷铵;氯化苄乙氧铵;苯酚、丁醇或苄醇;对羟基苯甲酸烷基酯,如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯;邻苯二酚;间苯二酚;环己醇;3-戊醇和间甲酚);低分子量多肽(例如,小于约10个氨基酸残基);蛋白质如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白;亲水聚合物如聚乙烯吡咯烷酮;氨基酸,如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸;碳水化合物类,如单糖、二糖、葡萄糖、甘露糖或糊精;螯合剂,如EDTA;糖类,如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇;成盐反离子,如钠;金属络合物(例如Zn-蛋白质络合物);以及非离子型表面活性剂,如TWEEN或聚乙二醇(PEG)。
本发明的药物组合物可以以任何数量的方式进行施用以用于局部性抑或全身性治疗。施用可以是局部(如施用至粘膜,包括阴道递送和直肠递送),如透皮贴剂、软膏剂、洗剂、乳膏剂、凝胶剂、滴剂、栓剂、喷雾剂、液体和粉末;肺部(例如,通过吸入或吹入粉末或气雾剂,包括通过喷雾器;气管内的、鼻内的、表皮的以及透皮的);口服;或肠胃外,包括静脉内、动脉内、皮下、腹膜内或肌内注射或输注;或颅内(例如,鞘内或心室内)施用。
本发明的抗体或免疫缀合物可以与具有抗自身免疫性或炎性特性的第二化合物组合在药物组合制剂或剂量方案中作为联合治疗。所述药物组合制剂或剂量方案的第二化合物可以对所述组合的CD37结合剂具有互补活性以使得它们不会不利地影响彼此。还提供包含CD37结合剂和第二药剂的药物组合物。例如,CD37结合剂可以与CD20结合剂(如利妥昔单抗)组合施用。在其它实施方案中,CD37结合剂可以与以下各项组合施用:水杨酸盐;非类固醇抗炎药物如吲哚美辛(indomethacin)、苯基丁氮酮(phenylbutazone)、苯乙酸衍生物(例如,布洛芬(ibuprofen)和非诺洛芬(fenoprofen))、萘乙酸(萘普生(naproxen))、吡咯烷酸(pyrrolealkanoic acid)(托美丁(tometin))、吲哚乙酸(苏林酸(sulindac))、卤代邻氨基苯甲酸(甲氯灭酸钠(meclofenamate sodium))、吡罗西康(piroxicam)、佐美酸(zomepirac)以及二氟尼柳(diflunisal);抗疟疾药如氯喹(chloroquine);金盐(goldsalts);青霉胺(penicillamine);或免疫抑制剂如甲氨蝶呤或皮质类固醇。在一些实施方案中,CD37结合剂与选自由以下组成的组的第二治疗剂组合施用:甲氨蝶呤、抗CD20治疗剂、抗IL-6受体治疗剂、抗IL-12/23p40治疗剂、化学治疗剂、免疫抑制剂、抗干扰素β-1a治疗剂、醋酸格拉替雷、抗α4-整联蛋白治疗剂、芬戈莫德、抗-BLys治疗剂、CTLA-Fc或抗TNF治疗剂。在一些实施方案中,CD37结合剂与作为针对选自由以下组成的组的抗原的抗体的第二治疗剂组合施用:CD3、CD14、CD19、CD20、CD22、CD25、CD28、CD30、CD33、CD36、CD38、CD40、CD44、CD52、CD55、CD59、CD56、CD70、CD79、CD80、CD103、CD134、CD137、CD138以及CD152。在一些实施方案中,CD37结合剂与作为针对选自由以下组成的组的靶标的抗体的第二治疗剂组合施用:IL-2、IL-6、IL-12、IL-23、IL-12/23p40、IL-17、IFNγ、TNFα、IFNα、IL-15、IL-21、IL-1a、IL-1b、IL-18、IL-8、IL-4、GM-CSF、IL-3以及IL-5。在一些实施方案中,CD37结合剂与甲氨蝶呤组合施用。
对于疾病的治疗,本发明的抗体或药剂的适当剂量取决于待治疗的疾病的类型、疾病的严重程度和病程、疾病的反应性、抗体或药剂是出于治疗还是预防的目的施用、以前的治疗、患者的临床病史等,都由主治医师判断。抗体或药剂可以一次或在持续从几天至几个月的一系列治疗内施用,或直到实现治愈或疾病状态减少。最优给药方案可以从患者体内的药物累积的测量进行计算并且将取决于单个抗体或药剂的相对效力。施用医师可以容易地确定最佳剂量、给药方法以及重复率。在某些实施方案中,剂量从每kg体重0.01μg至100mg,并且可以每天、每周、每月或每年给予一次或多次。在某些实施方案中,抗体或其它CD37结合剂每两周给予一次或每三周一次。在某些实施方案中,抗体或其它CD37结合剂的剂量从每kg体重约0.1mg至约20mg。治疗医师可以基于所测量的药物在体液或组织中的停留时间和浓度来估算剂量的重复率。
联合治疗可以提供“协同作用”并且证明“协同性”,即当一起使用活性成分时实现的作用大于单独使用所述化合物所产生的作用的总和。当活性成分是:(1)以组合单位剂量制剂的形式共同配制和同时施用或递送;(2)作为单独的制剂交替地或并行地递送;或(3)通过一些其它方案时,可以获得协同作用。在交替治疗中递送的情况下,当化合物按顺序地施用或递送(例如通过在单独注射器中的不同注射)时,可以获得协同作用。通常,在交替治疗期间,有效剂量的每种活性成分按顺序(即连续地)施用,而在联合治疗中,有效剂量的两种或更多种活性成分一起施用。
VI.包含CD37结合剂的试剂盒
本发明提供包含本文所描述的抗体、免疫缀合物或其它药剂并且可以用于进行本文所描述的方法的试剂盒。在某些实施方案中,试剂盒包含在一个或多个容器中的至少一种纯化的抗CD37的抗体。在一些实施方案中,所述试剂盒包含进行检测测定所必要的和/或足够的所有组件,包括所有对照物、用于进行测定的指导,以及用于结果的分析和呈现的任何必要的软件。还可以包括描述本发明的配体检测方法中的试剂盒组件或用于其使用的一组说明的标记或指示。所述说明可以与试剂盒或其组件的包装说明书和/或包装相关联。本领域技术人员将容易地认识到本发明的所公开的抗体、免疫缀合物或其它药剂可以容易地并入至本领域熟知的已确定的试剂盒形式中的一种中。这类试剂盒还可以包括,例如,其它化合物和/或组合物、用于施用所述化合物和/或组合物的一个或多个装置,以及呈由管控药物或生物产品的制造、使用或销售的政府机构规定的形式的书面说明。
进一步提供了包含CD37结合剂(例如,CD37结合抗体)和第二药剂的试剂盒。在某些实施方案中,所述第二药剂是利妥昔单抗。在某些实施方案中,所述第二药剂是甲氨蝶呤。
***
本公开的实施方案可以进一步通过参考以下非限制性实施例来界定,所述实施例详细描述了本公开的某些抗体的制备和用于使用本公开的抗体的方法。对于本领域技术人员将清楚的是:可以在不背离本公开的范围的情况下实践对材料与方法的许多修改。
实施例
应理解,本文所描述的实施例和实施方案仅是出于说明的目的,并且根据其的各种修改或变化将建议给本领域技术人员并且包括在本申请的精神和范围内。
出于所有的目的,本文所引用的所有出版物、专利、专利申请、互联网网站以及登录号/数据库序列(包括多核苷酸与多肽序列二者)以引用的方式整体并入本文,其引用的程度犹如每个单个出版物、专利、专利申请、互联网网站或登录号/数据库序列被明确地和单独地指出以引用的方式如此并入。
实施例1
正常人PBMC中的CD37表达
据报道CD37抗原从前B阶段至外周成熟B细胞阶段在B细胞上表达,而在B细胞祖细胞和终末分化的浆细胞上不存在。(Link等,1987,J Pathol.152:12-21)。此外,CD37抗原在T细胞、骨髓细胞以及粒细胞上仅被弱表达(Schwartz-Albiez等.1988,J.Immunol.,140(3)905-914)。
使用流式细胞仪测定与荧光标记的抗体来测量抗体(包括之前在美国公布申请号2011/0256153中所描述的某些CD37抗体和免疫缀合物,所述申请以引用的方式整体并入本文)结合至正常人B细胞的能力。此外,来自BD Biosciences的商业上可获得的QuantiBRITE系统用于基于结合至细胞的抗体的数目(ABC)估算抗原密度。来自BD Biosciences的QuantiBRITE系统利用以下试剂:在100μg/mL下供应的抗CD20-PE和作为冻干的PE标记珠粒供应的QuantiBRITE PE。此外,用PE标记huCD37-3抗体以便获得具有大约1:1的Ab:PE比例的抗体-PE缀合物。
从Research Blood Components(Brighton,MA,US)获得来自健康供体的新鲜血沉棕黄层作为正常血细胞的来源。通过离心一单位的全血并且收集血浆与红血细胞之间的界面来制备血沉棕黄层。这种未纯化的血沉棕黄层包含PBMC、嗜中性白细胞、血小板、红血细胞以及血浆并且在其被抽吸同一天用于实验。使用如下的Ficoll-Paque通过标准密度梯度离心来从血沉棕黄层制备外周血单核细胞(PBMC)。将血液用含有5mM EDTA的1×HBSS 1:3稀释并且将高达30mL添加至50mL锥形管。将10mL的Ficoll-Paque(GE Healthcare)缓慢添加至每个管的底部。将样本在500×g下在无制动的情况下在室温离心30分钟以获得血浆下面的一层PBMC并去除红血细胞和大多数粒细胞。将PBMC转移至新的管并且通过在室温在400×g下离心10分钟来用含有5mM EDTA的1×HBSS洗涤两次。染色缓冲液(1×HBSS、1%BSA、0.1%叠氮化钠)然后用于使PBMC团块以6.25×106细胞/mL重悬。将80μL细胞转移至圆底96孔板以实现5×105细胞/测定并且添加20μL人血清(Sigma H4522)以阻断Fc受体介导的结合并在黑暗中与细胞在冰上孵育20分钟。从Miltenyi获得的荧光标记的抗体用于鉴别PBMC群体:抗CD3-别藻蓝蛋白(allophycocyanin)(APC)用于鉴别T细胞,抗CD19-APC用于B细胞,抗CD56-APC用于自然杀伤(NK)细胞,并且抗CD14-APC用于单核细胞。
将细胞使用20μL huCD37-3-PE在大约10μg/mL终浓度下进行共染色以用于CD37表达。同样地,将细胞使用20μL抗CD20-PE进行共染色以用于CD20表达。作为对照,在10μg/mL下使用非结合的PE标记的huIgG1同种型对照抗体。在黑暗中在冰上进行染色1小时。将样本用染色缓冲液洗涤两次并且固定在200μL于1×PBS中的1%甲醛中。将样本在黑暗中贮存在4℃直到采集,这在样本制备的4天内进行。
就在样本采集之前将新鲜管的QuantiBRITE珠粒用0.5mL染色缓冲液在供应管中进行重构。在FACSCalibur流式细胞仪(BD Biosciences)上采集样本。补偿控制与每个测定一起进行以便选择适当的仪器设定并且对于每个样本收集至少10,000个事件。对于细胞样本与珠粒样本采集二者保持相同的荧光和补偿的仪器设定以允许精确比较。CellQuest(版本5.2.1,BD Biosciences)用于采集控制和分析。
QuantiBRITE分析利用具有与已知数目的PE分子缀合的4个珠粒群体的珠粒标准。对于数据分析,在FSC-H/SSC-H散点图上在珠粒单峰周围绘制G1门。这种门控的珠粒群体随后使用FL2-H的直方图进行分析以估算PE染色的水平。在四个珠粒群体(M1-M4)的峰周围绘制单独的标记并且确定每个珠粒群体的FL2的几何均数。在双对数坐标图中将每个珠粒的FL2几何均数针对批次特定的PE/珠粒值进行绘图。使用以下等式进行线性回归以获得标准曲线:y=mx+c,其中“m”等于斜率并且“c”等于y轴截距。
对于PBMC样本分析,在SSC-H/FL4-H点阵图上目标阳性荧光细胞群周围绘制G1门。这种门控的细胞群随后使用FL2-H的直方图进行分析以估算PE标记的抗体染色的水平。对于用抗CD37-PE或抗CD20-PE染色的每个血细胞样本和未染色的对照样本确定FL2几何均数。将FL2的所有几何均数值针对珠粒标准曲线绘图并且推断每细胞PE的值。由于两种抗体-PE缀合物都在大约1:1的PE:抗体比,每细胞PE的值对应于每细胞结合的抗体的数目的值(ABC)。对于每个测定用两份重复样本进行实验。从每个血细胞群的几个测定来确定平均值和标准偏差。
在来自4个独立供体的正常血细胞中评价CD37表达。将结果与作为对照物的CD20染色、未染色的细胞以及非结合huIgG-PE缀合物进行比较。在图1的直方图中给出正常B细胞的典型染色谱的实例。计算针对CD37和CD20的4个不同实验的平均ABC值并且在表1中列出。
表1:人PBMC样本上CD37和CD20表达的ABC值
发现最高整体CD37染色水平在CD19+B细胞中在大约77,000ABC下。此外,发现CD37染色在所检查的其它PBMC群体中在较低水平,其中CD14+单核细胞显示在大约5,000ABC下的CD37染色,CD56+NK细胞在3,000ABC下,并且CD3+T细胞在2,000ABC下。用非结合huIgG-PE对照物染色导致对于B细胞、T细胞以及NK细胞大约70至90并且对于单核细胞大约200的ABC值。在相同四个供体中,与CD37相比来评价CD20表达。根据所公布的发现,CD20染色主要局限于CD19+B细胞,其ABC值为大约95,000ABC。CD20表达水平仅略高于CD37表达水平。在所检查的其它PBMC群体中仅观察到极微CD20染色,其中CD14+单核细胞显示在794ABC下的CD20染色,CD56+NK细胞在264ABC下并且CD3+T细胞在336ABC下。
这个结果表明高CD37表达主要局限于外周血液样本中的B细胞,而外周T细胞、NK细胞以及单核细胞上仅少量表达。这与所公布的发现((Moore等.1986,J Immunol.137(9):3013-8;Schwartz-Albiez等.1988,J.Immunol.,140(3)905-914)一致。此外,我们发现外周B细胞上的CD37表达水平与CD20表达的水平类似。这种表达模式强烈地暗示,CD37导向疗法可以适合用于靶向疾病如B细胞恶性肿瘤、自身免疫性疾病、炎性疾病或与CD20导向疗法的用途类似的其它免疫系统病症中的B细胞。
实施例2A
使用纯化的PBMC的体外B细胞消减
根据公布的用利妥昔单抗进行的研究(Vugmeyster等.Cytometry A.2003;52(2):101-9和Vugmeyster等.Int Immunopharmacol.2004;4(8):1117-24),使用体外测定用人PBMC测量人源化抗体消减B细胞的能力。阿伦单抗(Alemtuzumab)(Campath)用作阳性对照,因为据报道它有效地在体内和体外消减淋巴细胞(Hale,Blood.1983年10月;62(4):873-82和Waldmann,Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci.2005年9月29日;360(1461):1707-11)。
从Research Blood Components(Brighton,MA,US)获得来自健康供体的新鲜血沉棕黄层作为本研究内所有实验的正常血细胞来源。通过离心一单位的全血并且收集血浆与红血细胞之间的界面来制备血沉棕黄层。这种未纯化的血沉棕黄层包含PBMC、嗜中性白细胞、血小板、红血细胞以及血浆并且在其被抽吸的同一天用于实验。使用如下的Ficoll-Paque通过标准密度梯度离心来从血沉棕黄层制备外周血单核细胞(PBMC)。将血液用含有5mM EDTA的1×HBSS 1:3稀释并且将高达30mL添加至50mL锥形管。将10mL的Ficoll-Paque(GE Healthcare)缓慢添加至每个管的底部。将样本在500×g下在无制动的情况下在室温离心30分钟以获得血浆下面的一层PBMC并去除红血细胞和大多数粒细胞。将PBMC转移至新的管并且通过在室温、在400×g下离心10分钟而用含有5mM EDTA的1×HBSS洗涤两次。染色缓冲液(1×HBSS、1%BSA、0.1%叠氮化钠)然后用于使PBMC团块在初始血容量中重悬以实现原始细胞密度。
为了评估huCD37-3、huCD37-3-SMCC-DM1、huCD37-50、huCD37-50-SMCC-DM1、利妥昔单抗、阿伦单抗(Campath)以及TRU-016对PBMC消减的作用,将90μL纯化的细胞添加至12×75mm聚苯乙烯管并且用10μL每种样本或huIgG同种型对照抗体的100μg/mL溶液在37℃、在增湿的5%CO2孵化器中孵育1小时。最终抗体(Ab)浓度在染色缓冲液中在100μL的最终体积中是10μg/mL。对于每个处理制备三个独立的样本。
为了鉴别PBMC的群体,所有样本在用从(例如)BD Biosciences或Miltenyi获得的10至20μL荧光标记的Ab的Ab孵育之后立即进行共染色。抗CD3-PerCP-Cy5.5用于鉴别T细胞,抗CD19-APC用于B细胞,并且抗CD14-FITC用于单核细胞。在总共150μL中在黑暗中在室温进行染色30分钟。将CountBright绝对计数珠粒(Invitrogen)进行涡旋并且以每管50μL添加至每种样本。对于PBMC制备样本,将细胞用1mL染色缓冲液洗涤一次并且在400×g下离心3至5分钟。用1mL吸量管去除上清液并且浆细胞重悬在500μL于1×PBS中的1%甲醛中。将样本在4℃在黑暗中贮存直到采集,这在样本制备的4天内进行。
TreeStar FlowJo软件(版本PC 7.5)用于数据分析。在FSC-H与SSC-H点阵图上CountBright珠粒群体周围绘制门以确定所述样本的总珠粒计数。为了确定每种目标PBMC群体的总计数,在SSC-H与FL(x)-H点阵图上阳性荧光群体周围绘制单独的门,其中x是目标通道。确切地说,样本中T细胞的总计数通过门控SSC-H与FL3-H点阵图上的阳性群体来发现;对于B细胞,阳性群体在SSC-H与FL4-H点阵图上发现;对于NK细胞,使用SSC-H与FL2-H点阵图;对于单核细胞,使用SSC-H与FL1-H点阵图。确定对于B细胞的CD19+细胞(CD3+细胞对于T细胞,CD56+细胞对于NK细胞,或CD14+细胞对于单核细胞)相对于珠粒的比率并且乘以100。然后通过取处理的样本中细胞与珠粒比相对于同种型对照处理的样本中细胞与珠粒比的比率、用1减去这个值并且乘以100来计算消减百分比。这对应于以下式:消减百分比=100×(1–处理的样本的细胞与珠粒比/对照样本的细胞与珠粒比)。以相同方式分析所有细胞类型的数据。
对于所测试的两个供体,用huCD37-3、huCD37-3-SMCC-DM1、huCD37-50或huCD37-50-SMCC-DM1处理纯化的PBMC样本导致B细胞的大约55%至70%消减(参见图2)。T细胞或单核细胞存在小于10%的消减。B细胞限制的消减作用指示这种活性与B细胞上的高CD37表达有关联。相比之下,用抗CD20抗体利妥昔单抗处理导致B细胞的大约30%至40%消减。用抗CD37SMIPTMTRU-016处理导致B细胞的仅20%至30%消减。阿伦单抗处理导致B细胞的60%至70%、T细胞的55%至65%以及单核细胞的40%至65%的消减。
实施例2B
使用纯化的PBMC的体外B细胞消减的剂量反应
为了评价抗体和缀合物的剂量反应,将来自2个供体的纯化的PBMC用5倍样本稀释系列进行孵育。将每个样本稀释液以每管10μL添加至90μL纯化的细胞重复三份,并且在37℃在增湿的5%CO2孵化器中孵育1小时。最终浓度在从10μg/mL至0.13ng/mL的范围。相同量的非结合huIgG Ab用作同种型对照。
对于所测试的两个供体,用huCD37-3-SMCC-DM1处理纯化的PBMC样本导致B细胞消减活性的明显的剂量反应(参见图3A和3B)。用huCD37-3-SMCC-DM1孵育引起大约60%的B细胞的体外消减,其EC50为40至75ng/mL。对于所测试的另外供体,用huCD37-3、huCD37-38、huCD37-50以及huCD37-56抗体处理纯化的PBMC样本也导致B细胞消减活性的明显的剂量反应(参见图3C)。用这些抗体孵育引起大约60%至70%的B细胞的体外消减,其EC50为20至30ng/mL。
实施例2C
使用全血的体外B细胞消减
根据所公布的用利妥昔单抗进行的研究(Vugmeyster等.Cytometry A.2003;52(2):101-9和Vugmeyster等.Int Immunopharmacol.2004;4(8):1117-24),使用体外测定用全血测量人源化抗体消减B细胞的能力。
从Research Blood Components(Brighton,MA,US)获得来自健康供体的新鲜血沉棕黄层作为本研究内所有实验的正常血细胞的来源。为了评估huCD37-3、huCD37-3-SMCC-DM1、利妥昔单抗、阿伦单抗(Campath)以及TRU-016对全血基质中的外周血细胞(PBC)的作用,将90μL来自血沉棕黄层的全血与以上所详细说明的Ab或同种型对照在100μL的总体积中进行孵育。对于每个Ab处理制备三个独立的样本。
为了鉴别血细胞群,所有样本在用从(例如)BD Biosciences或Miltenyi获得的10至20μL荧光标记的Ab的Ab孵育之后立即进行共染色。抗CD3-PerCP-Cy5.5用于鉴别T细胞,抗CD19-APC用于B细胞,抗CD56-PE用于NK细胞,并且抗CD14-FITC用于单核细胞。在总共150μL中在黑暗中在室温进行染色30分钟。将CountBright绝对计数珠粒(Invitrogen#C36950)进行涡旋并且以每管50μL添加至每个样本以允许细胞计数的标准化。
在细胞染色之后,将2mL的BD FACS溶解液(BD Biosciences,根据制造商的说明在dH2O中1:10稀释)添加至每个样本以便溶解存在的RBC。将样本在室温在黑暗中孵育15至20分钟,在400×g下离心3至5分钟,并且重悬在500μL于1×PBS中的1%甲醛中。将样本在黑暗中贮存在4℃直到采集,这在样本制备的4天内进行。在BD FACSCalibur上采集样本。补偿对照与每个测定一起进行以便确认仪器设定。对于每个样本使用BD CellQuest软件(版本5.2)采集总共160,000个未门控的事件。TreeStar FlowJo软件(版本PC 7.5)如以上所描述用于数据分析。
对于所测试的供体,用huCD37-3、huCD37-3-SMCC-DM1、huCD37-50或huCD37-50-SMCC-DM1处理纯化的PBMC样本导致B细胞的大约40%消减(参见图4)。T细胞、NK细胞或单核细胞存在小于10%的消减。如纯化的PBMC所见的,体外消减局限于B细胞,从而指示所述活性与B细胞上的高CD37表达有关联。相比之下,用抗CD20抗体利妥昔单抗或抗CD37SMIPTMTRU-016处理导致B细胞的小于10%消减。阿伦单抗处理导致40%的B细胞、80%的T细胞、15%的NK细胞以及20%的单核细胞的消减。
实施例2D
使用全血的体外B细胞消减的剂量反应
为了评价抗体和缀合物的剂量反应,将来自2个供体的全血用10倍样本稀释系列进行孵育。将每个样本稀释液以每管10μL添加至90μL纯化的细胞重复三份,并且在37℃在增湿的5%CO2孵化器中孵育1小时。最终浓度在从10μg/mL至0.1ng/mL的范围。相同量的非结合huIgG Ab用作同种型对照。
对于所测试的两个供体,用huCD37-3或huCD37-3-SMCC-DM1处理全血样本导致B细胞消减活性的明显的剂量反应(参见图5A和5B)。此外,针对一个供体测试了huCD37-50并且也显示出B细胞消减活性的类似剂量反应(参见图5B)。用huCD37-3、huCD37-3-SMCC-DM1或huCD37-50孵育引起大约30%-45%的B细胞的体外消减的最大反应,其EC50为40至120ng/mL。
除以上所描述的体外实验之外,可以在表达huCD37的小鼠(实施例3中所描述的)中和在猴中针对与猕猴CD37交叉反应的抗体来测试CD37抗体在体内消减B细胞的能力。
实施例2E
使用人PBMC的体外细胞因子释放研究
使用与2.5ng/mL至250μg/mL浓度下的化合物孵育18至20小时的来自健康人供体的外周血单核细胞(PBMC),针对IFN-γ(干扰素)、TNF-α(肿瘤坏死因子)以及IL-6(白细胞介素-6)通过酶联免疫斑点(ELISpot)测量体外细胞因子释放。ELISpot方法被设计成在孵育的全部时长期间通过将细胞因子捕捉至测定板上来测量分泌细胞因子的细胞的数目。在所有测定中,包括阳性对照抗CD3抗体CD3-2和阴性非结合同种型huIgG对照抗体。阿伦单抗和利妥昔单抗进行比较使用,因为据报道二者都诱导患者中的细胞因子释放(Wing.J Clin Invest.98:2819-26(1996)和Winkler,Blood 94:2217-2224(1999))。选择测定条件以反映与抗体治疗剂相关的条件。所测试的250μg/mL的最高浓度对应于在输注10mg/kg抗体之后患者血浆中的抗体(例如像针对CD20的利妥昔单抗)的最大血清浓度。
如在图6和7中可看出,使用来自两个不同供体的PBMC,阳性对照抗CD3抗体诱导非常高水平的IFN-γ、TNF-α以及IL-6的释放。在相同测定中,阿伦单抗引起中度细胞因子释放,而用来自两个不同供体的PBMC,利妥昔单抗引起适度的细胞因子释放。与此相反,huCD37-3、huCD37-50、huCD37-3-SMCC-DM1或huCD37-50-SMCC-DM1没有在我们的测定中引起显著细胞因子释放。
这强调所描述的CD37靶向性抗体或缀合物作为治疗剂的效用,因为它们将高度活性(如B细胞消减)与就细胞因子释放而言的良好安全性相结合。
实施例3
评价针对CD37的抗体或缀合物的活性的体内模型
已知B细胞消减改善自身免疫性疾病。事实上,利妥昔单抗已被批准用于类风湿性关节炎治疗(Edwards JC等.Nat Rev Immunol.6:119(2006))。在动物模型中,使用抗B细胞抗原(如CD20、CD19以及CD79)的抗体的B细胞消减已经显示抑制或改善一些自身免疫性疾病,包括系统性红斑性狼疮(SLE)、实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE;多发性硬化症的小鼠模型)、1型糖尿病(T1D)以及类风湿性关节炎(RA)。CD37抗原在人B细胞中以高水平表达。因此,针对CD37抗原的抗体或免疫缀合物可能潜在地消减B细胞并且因此有用于治疗多发性自身免疫性疾病。
为了测试CD37靶向性抗体和免疫缀合物治疗人自身免疫性疾病的效用,可以使用一些鼠类自身免疫性疾病模型在小鼠中研究这类CD37靶向性抗体和自身免疫性缀合物的活性。
例如,可以使用CD37敲除小鼠或其它物种如大鼠和仓鼠来产生抗鼠CD37抗体,并且可以选择有效地在体内消减B细胞的抗体。抗CD37抗体的治疗潜力可以在代表人自身免疫性疾病的小鼠模型中进行测试,例如,NOD小鼠中的自发性T1D模型、野生型C57/B16小鼠中的髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)肽诱导的EAE模型、DBA/1小鼠中的胶原诱导的类风湿性关节炎模型或MRL/lpr小鼠中的自发性系统性红斑狼疮(SLE)模型。在以下提供鼠CD37抗体的实例和它们在自身免疫性疾病的不同动物模型中的治疗功效。
或者,还可以在已经被工程改造以表达人CD37抗原的鼠类自身免疫性疾病模型中来测试抗人CD37抗体和免疫缀合物的治疗潜力。这类表达人CD37(huCD37)的小鼠可以使用标准敲入(KI)或转基因(Tg)方法来产生。例如,为了产生huCD37KI小鼠,可以将人CD37cDNA插入至C57/B16胚胎干(ES)细胞中的鼠CD37基因座中。纯合huCD37KI小鼠将在内源性鼠CD37启动子的调控下表达人CD37cDNA,因此huCD37的表达模式将模拟内源性muCD37的表达模式。不同方法利用含有人CD37基因的细菌人工染色体(BAC),所述人CD37基因可以随机地插入至小鼠基因组中。这种转基因方法已被成功地用于产生huCD20Tg小鼠,从而导致抗原的B细胞特异性高水平表达。
基于C57/B16背景的所得到的表达huCD37的小鼠可以用于进一步开发一些自身免疫性疾病模型。例如,C57/B16菌株背景中的MOG肽免疫可以在两周内诱导严重EAE。此外,通过将表达huCD37的小鼠与C57/B16FcγRIIB敲除小鼠一起育种而引入FcγRIIB敲除表型将会产生在用胶原II抗原免疫时自发地发展SLE并且发展RA的小鼠模型。或者,将表达huCD37的C57/B16小鼠回交至NOD或MRL/lpr背景中持续10代可以分别提供自发性T1D和SLE模型。
实施例4A
抗muCD37单克隆抗体克隆252-3的产生
为了发展CD37靶向性抗体和免疫缀合物可以抑制自身免疫性疾病的概念验证,通过用300-19免疫CD37敲除C57Bl/6小鼠来产生抗鼠CD37(muCD37)单克隆抗体,所述300-19是内源性地表达muCD37抗原的鼠前B细胞系。每两周以每小鼠5×106细胞的剂量皮下注射免疫原持续5次。在被杀死用于杂交瘤产生之前三天,免疫的小鼠接受另一剂量的抗原的腹腔内注射。根据标准工序以1P3细胞:3脾细胞的比将脾细胞与鼠骨髓瘤P3X63Ag8.653细胞(P3细胞)进行融合(J.F.Kearney等.1979,J Immunol,123:1548-1550)。将融合的细胞在37℃在5%CO2孵化器中在含有次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸腺嘧啶脱氧核苷(HAT)(SigmaAldrich)的RPMI-1640选择性培养基中培养,直到杂交瘤克隆准备好用于抗体筛选。
筛选用来自野生型小鼠和CD37敲除小鼠的脾细胞、使用流式细胞结合测定来进行。将脾细胞用抗CD45R(B220)抗体进行复染色以便鉴别组成性地表达CD37抗原的B细胞。结合野生型、但是不结合CD37敲除B细胞的产生杂交瘤的抗体通过有限稀释进行亚克隆。获得一个稳定的亚克隆(克隆252-3)。将252-3杂交瘤在含有低IgG血清的培养基中扩增并且使用标准方法用蛋白质A/G色谱法纯化所述抗体。
实施例4B
抗muCD37单克隆抗体克隆252-3的表征
用IsoStrip小鼠单克隆抗体同种型试剂盒(Roche Diagnostics Corporation,Indianapolis,IN)将纯化的252-3单克隆抗体鉴别为小鼠IgG2a。为了确定与muCD37抗原的结合亲和力,将不同浓度的252-3抗体与300-19细胞在4℃孵育30分钟,所述300-19细胞是表达muCD37抗原的鼠前B细胞系。然后洗涤细胞并且用抗muIgG-PE缀合物(JacksonImmunoresearch,West Grove,PA)在4℃复染色30分钟。将所述细胞最终洗涤、固定在福尔马林中并且使用FACS阵列(BD Bioscience,San Jose,CA)通过流式细胞术进行分析。将流式细胞术数据使用FlowJo(Tree Star Inc.,Ashland,OR)进行分析并且在半对数图中将几何平均荧光强度针对抗体浓度绘图(图8)。通过非线性回归产生剂量反应曲线并且使用GraphPad Prism(GraphPad Software Inc.,La Jolla,CA)来计算所述曲线的EC50值(其对应于抗体的表观解离常数(Kd))。据发现252-3抗体的Kd是14nM。相反,252-3抗体未结合至表达人CD37抗原的人肿瘤细胞。然后252-3抗体用作鼠类自身免疫性疾病模型中的替代抗体,以证实CD37靶向性抗体用于治疗自身免疫性疾病的治疗潜力(实施例5-7)。
实施例5
抗muCD37单克隆抗体抑制实验性自身免疫性脑脊髓炎
实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)是中枢神经系统(CNS)的炎性脱髓鞘疾病(包括人中的多发性硬化症)的动物模型。鼠类EAE通常通过以下方式来进行诱导:用脊髓匀浆、脑提取物或CNS蛋白质如髓鞘蛋白或肽免疫,接着注射百日咳毒素以打破血脑屏障并允许免疫细胞可及CNS组织。这种免疫导致脑和脊髓中的脱髓鞘的多个小的播散性损害,从而引起尾麻痹,然后肢体麻痹。
为了测试抗muCD37抗体在EAE模型中的活性,我们首先研究了252-3抗体在体内消减B细胞的能力。将C57Bl/6小鼠用25mg/kg的252-3抗体或多克隆鼠IgG(JacksonImmunoresearch,West Grove,PA)进行腹腔内注射作为对照。在不同时间点收集外周血并且通过流式细胞术针对B细胞和T细胞水平进行分析。与别藻蓝蛋白(APC)缀合的抗小鼠CD45R(B220)抗体(ebioscience,San Diego,CA)和与异硫氰酸荧光素(FITC)缀合的抗CD3ε抗体(ebioscience,San Diego,CA)分别用于染色B细胞群和T细胞群。通过计算每个样本的B细胞与T细胞的比来评估B细胞消减并且通过将鼠IgG处理的样本的平均B/T比设定成100%来将所述B/T比标准化。将标准化的B/T细胞比针对muIgG对照小鼠和252-3抗体处理的小鼠绘图(图9A)。结果显示用252-3抗体处理的小鼠的B细胞水平在抗体注射之后的几小时内迅速地减少。B细胞消减在3小时时达到约70%并且在第3天时达到最大值(>95%)。在第3天之后,B细胞水平缓慢地增加并且在第14天时达到约60%的正常水平。这个数据表明252-3抗体可以迅速地且有效地消减外周血B细胞,并且这种作用在抗体注射之后持续至少7天。
第二个研究测试了252-3抗体抑制EAE的能力。在这个研究中,在C57Bl/6小鼠中通过第0天时将在完全弗氏佐剂(来自Hooke Laboratories,Lawrence,MA的EAE试剂盒)中乳化的MOG35-55肽皮下免疫至上背部和下背部中以及抗原免疫之后2小时和24小时时两次腹腔内注射百日咳毒素来诱导EAE。在免疫之后第7天开始每天检查小鼠的EAE病征。使用以下标准在0至5的标尺上对疾病严重程度评分。
在抗原免疫之后的12至18天之间所有小鼠开始显现EAE的病征。在疾病发作时,将小鼠随机化并且以25mg/kg剂量腹腔内注射一次252-3抗体或多克隆muIgG。对于每个组招募总共10只小鼠。在研究结束(疾病发作之后18天)时,基于每只小鼠的疾病发作的日期将数据进行同步。疾病进展图(图9B)显示来自两组的小鼠都具有EAE的复发-缓解形式。在第一波临床症状期间,对照小鼠达到3的平均值,而用252-3抗体处理的小鼠具有2的平均值。这两组之间的疾病严重程度的差异在疾病发作之后持续超过2周。总起来看,此数据表明252-2抗体处理迅速消减B细胞群并且减轻EAE。
实施例6
抗muCD37单克隆抗体抑制NOD小鼠中的1型糖尿病
1型糖尿病(T1D)或幼年型糖尿病或胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)由针对产胰岛素的胰腺β细胞的自身免疫性反应而引起。β细胞的破坏减少胰岛素产生并且增加葡萄糖水平,而增加的葡萄糖水平产生不同临床症状。北欧和美国的T1D发病率在8/100,000与17/100,000之间。胰岛素补充是所述疾病的最常见的治疗。
非肥胖型糖尿病(NOD)小鼠自发地发展T1D并且已被广泛地用于模拟人疾病。在NOD小鼠中,疾病开始于早在4周龄时胰岛的白细胞浸润(称为胰岛炎)。胰岛炎迅速进展,从而导致胰岛的破坏和糖尿病在12至15周龄时开始。据报道在胰岛炎的早期使用抗CD20抗体的B细胞消减延迟了疾病发作(Hu等,J Clin Inves.117,3857(2007)),从而表明B细胞在NOD小鼠中的疾病发病机制中起关键作用。
为了测试抗muCD37抗体的活性,将252-3抗体在25mg/kg下每10天腹腔内注射至六只雌性NOD小鼠中,共注射4次,在5周龄时开始(n=6)。将对照小鼠(n=6)用多克隆鼠IgG(Jackson Immunoresearch,West Grove,PA)进行注射。在最后注射之后三天,通过流式细胞术检查外周血中的B细胞和T细胞水平。与别藻蓝蛋白(APC)缀合的抗小鼠CD45R(B220)抗体(ebioscience,San Diego,CA)和与异硫氰酸荧光素(FITC)缀合的抗CD3ε抗体(ebioscience,San Diego,CA)分别用于染色B细胞群和T细胞群。如以上所描述的将B/T细胞比标准化至鼠IgG对照处理的样本并且将标准化的B/T细胞比针对muIgG对照小鼠和252-3抗体处理的小鼠进行绘图(图10A)。结果显示与对照小鼠相比,用252-3抗体处理的小鼠的B细胞水平显著地减少,从而表明252-3抗体有效地消减NOD小鼠中的外周血B细胞。为了检查抗muCD37抗体对B细胞消减的作用,在12周龄开始每周测量血糖水平。在连续两周中血糖水平≥250mg/dL的小鼠被视为患糖尿病的。图10B中的数据显示对照小鼠在第15周时开始发展糖尿病并且83%的小鼠在第22周时具有糖尿病。相比之下,用252-3抗体处理的小鼠在第17周时开始发展糖尿病并且仅50%的小鼠在第27周时为患糖尿病的。这一数据显示252-3抗体的处理有效地消减NOD小鼠中的B细胞、延迟糖尿病的发生并且显著地减少疾病发病率。
实施例7
抗muCD37单克隆抗体抑制胶原诱导的关节炎
胶原诱导的关节炎(CIA)是广泛地用于调查疾病发病机制并验证治疗靶标的类风湿性关节炎(RA)的动物模型。通常在小鼠或大鼠中通过用佐剂中的自体或异源II型胶原来诱导关节炎。这种免疫引发针对抗原的强烈的T细胞和B细胞反应,从而导致增生性滑膜炎,并伴有多形核细胞和单核细胞的浸润、血管翳形成、软骨降解、骨侵蚀以及纤维变性。
因为不同小鼠菌种对抗体介导的B细胞消减具有不同的易感性(Ahuja等,J.Immunol.,179:3351-3361(2007)),为了测试抗muCD37抗体在CIA模型中的活性,我们首先研究252-3抗体消减DBA/1小鼠中的B细胞的能力。将小鼠用25mg/kg的252-3抗体或多克隆鼠IgG(Jackson Immunoresearch,West Grove,PA)进行腹腔内注射作为对照。在不同时间点收集外周血并且通过流式细胞术针对B细胞和T细胞水平进行分析。与别藻蓝蛋白(APC)缀合的抗小鼠CD45R(B220)抗体(ebioscience,San Diego,CA)和与异硫氰酸荧光素(FITC)缀合的抗CD3ε抗体(ebioscience,San Diego,CA)分别用于染色B细胞群和T细胞群。如以上所描述计算标准化的B/T细胞比并且在muIgG对照小鼠与252-3抗体处理的小鼠之间进行比较(图11A)。结果显示252-3抗体在抗体注射之后1天和3天中显著地将外周血B细胞水平降低至约20%和约8%,并且这种低B细胞水平在抗体注射之后7天时被保持。这一数据表明252-3抗体可以迅速地且有效地消减外周血B细胞,并且这种作用在抗体注射之后持续至少7天。
第二个研究测试了252-3抗体抑制CIA的能力。在这个研究中,在DBA/1小鼠中通过第0天时用鸡胶原/CFA(完全弗氏佐剂)和第21天时鸡胶原/IFA(不完全弗氏佐剂)的皮下免疫(Hooke Laboratories,Lawrence,MA)来诱导CIA。在免疫之后第21天开始每天检查小鼠的CIA病征。使用以下标准在0至16的标尺(对于每只爪,基于0至4的评分)上对CIA严重程度评分:
在关节炎症状发作时,将小鼠随机分成两组并且用252-3抗体或多克隆muIgG在10mg/kg剂量下连续三天进行腹腔内注射。每个组总共招募12只小鼠。在研究结束(疾病发作之后21天)时,基于每只小鼠的疾病发作的日期将数据同步。疾病进展图(图11B)显示对照小鼠中的疾病严重程度从第1天时2的平均评分迅速增加至第7天时的9.5的平均评分。相比之下,用252-3抗体处理的小鼠中的疾病进展显著更慢,其中第7天时具有4.4的平均评分。总起来看,这一数据表明252-2抗体处理显著地消减B细胞群并且减轻CIA。
总之,使用替代抗muCD37抗体的以上实验提供了CD37靶向性抗体或包含CD37抗体的免疫缀合物可以抑制动物模型中的自身免疫性疾病的证据。
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应当认识到详述部分、而不是摘要部分意图用于解释权利要求。摘要可以提出一个或多个而不是所有如由发明人考虑到的本发明的示例性实施方案,并且因此不意图以任何方式限制本发明和所附权利要求。
以上已经借助于说明指定功能及其关系的实施的功能性组成模块描述了本发明。这些功能性组成模块的界限已经出于描述的方便而在本文进行任意界定。只要指定功能及其关系适当地履行,可以界定替代界限。
具体实施方案的前文描述将如此全面地揭示本发明的总体性质,以至于其他人可以在不脱离本发明的总体概念、在无过度实验的情况下,通过应用本领域的技术内的知识而容易地针对不同应用来修改和/或改编这类具体实施方案。因此,基于本文所呈现的教义和指导,这类改编和修改意图处于所公开的实施方案的等同物的意义和范围内。应理解本文的措辞或术语是出于描述而不是限制的目的,以使得本说明书的术语或措辞应由技术人员根据所述教义和指导进行解释。
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本说明书中所提及的所有出版物、专利以及专利申请以引用的方式并入本文,其引用的程度犹如每个独立的出版物、专利或专利申请被具体地和单独地指出以引用的方式并入。

Claims (40)

1.特异性地结合CD37的抗体或其抗原结合片段在制备用于治疗患有自身免疫性疾病或炎性疾病的患者的药物中的用途,其中所述抗体或其抗原结合片段包含分别选自由以下组成的组的重链可变区(VH)互补决定区(CDR)-1、VH CDR-2、VH CDR-3和轻链可变区(VL)CDR-1、VL CDR-2和VL CDR-3多肽序列:
(a)SEQ ID NO:4、5和6以及SEQ ID NO:28、29和30;
(b)SEQ ID NO:7、8和9以及SEQ ID NO:31、32和33;
(c)SEQ ID NO:10、11和12以及SEQ ID NO:34、35和36;
(d)SEQ ID NO:13、14和15以及SEQ ID NO:37、40和39;
(e)SEQ ID NO:16、17和18以及SEQ ID NO:41、42和43;
(f)SEQ ID NO:19、20和21以及SEQ ID NO:44、47和46;
(g)SEQ ID NO:22、23和24以及SEQ ID NO:48、51和50;和
(h)SEQ ID NO:25、26和27以及SEQ ID NO:52、53和54。
2.特异性地结合CD37的抗体或其抗原结合片段在制备用于消减非癌性B细胞的药物中的用途,其中所述抗体或其抗原结合片段包含分别选自由以下组成的组的VH CDR1、VHCDR2、VH CDR3和VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3多肽序列:
(a)SEQ ID NO:4、5和6以及SEQ ID NO:28、29和30;
(b)SEQ ID NO:7、8和9以及SEQ ID NO:31、32和33;
(c)SEQ ID NO:10、11和12以及SEQ ID NO:34、35和36;
(d)SEQ ID NO:13、14和15以及SEQ ID NO:37、40和39;
(e)SEQ ID NO:16、17和18以及SEQ ID NO:41、42和43;
(f)SEQ ID NO:19、20和21以及SEQ ID NO:44、47和46;
(g)SEQ ID NO:22、23和24以及SEQ ID NO:48、51和50;和
(h)SEQ ID NO:25、26和27以及SEQ ID NO:52、53和54。
3.如权利要求1所述的用途,其中所述抗体或其抗原结合片段是人源化的。
4.如权利要求3所述的用途,其中所述抗体或其抗原结合片段是表面重构的。
5.如权利要求1所述的用途,其中所述抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区,所述重链可变区和轻链可变区分别包含如下所示的多肽序列:
(a)SEQ ID NO:55和SEQ ID NO:72;
(b)SEQ ID NO:56和SEQ ID NO:73;
(c)SEQ ID NO:57和SEQ ID NO:74;
(d)SEQ ID NO:58和SEQ ID NO:74;
(e)SEQ ID NO:59和SEQ ID NO:75;
(f)SEQ ID NO:60和SEQ ID NO:76;
(g)SEQ ID NO:61和SEQ ID NO:77;
(h)SEQ ID NO:62和SEQ ID NO:78;
(i)SEQ ID NO:63和SEQ ID NO:79;
(j)SEQ ID NO:65和SEQ ID NO:81;
(k)SEQ ID NO:66和SEQ ID NO:82;
(l)SEQ ID NO:67和SEQ ID NO:83;
(m)SEQ ID NO:69和SEQ ID NO:85;和
(n)SEQ ID NO:71和SEQ ID NO:87。
6.如权利要求1所述的用途,其中所述抗体由选自由以下组成的组的杂交瘤产生:ATCC保藏名称PTA-10664,2010年2月18日保藏在ATCC;ATCC保藏名称PTA-10665,2010年2月18日保藏在ATCC;ATCC保藏名称PTA-10666,2010年2月18日保藏在ATCC;以及ATCC保藏名称PTA-10668,2010年2月18日保藏在ATCC。
7.如权利要求1所述的用途,其中所述抗体或其抗原结合片段能够诱导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性。
8.如权利要求1所述的用途,其中所述抗体或其抗原结合片段包含Fab、Fab'、F(ab')2、单链Fv或scFv、二硫键连接的Fv、胞内抗体、IgGΔCH2、微抗体、F(ab')3、四链抗体、三链抗体、双链抗体、DVD-Ig、mAb2、(scFv)2或scFv-Fc。
9.如权利要求1-8中任一项所述的用途,其中所述抗体或其抗原结合片段经由接头连接至细胞毒性剂以形成免疫缀合物,其中所述接头是可裂解的接头或不可裂解的接头,以及其中所述细胞毒性剂是:美登木素、美登木素类似物、阿霉素、修饰的阿霉素、苯二氮紫杉烷类、CC-1065、CC-1065类似物、倍癌霉素、倍癌霉素类似物、卡奇霉素、多拉司他汀、多拉司他汀类似物、奥利斯他汀、托马霉素衍生物、以及来普霉素衍生物或所述细胞毒性剂的前药。
10.如权利要求9所述的用途,其中所述接头是亲水性接头或基于二羧酸的接头。
11.如权利要求9所述的用途,其中所述接头是:4-(2-吡啶基二硫代)戊酸N-琥珀酰亚胺酯;4-(2-吡啶基二硫代)丁酸N-琥珀酰亚胺酯;4-(2-吡啶基二硫代)-2-磺基丁酸N-琥珀酰亚胺酯;4-(马来酰亚胺基甲基)环己烷羧酸N-琥珀酰亚胺酯;4-(马来酰亚胺基甲基)环己烷羧酸N-磺基琥珀酰亚胺酯;4-(碘代乙酰基)-氨基苯甲酸N-琥珀酰亚胺酯;或N-琥珀酰亚胺基-[(N-马来酰亚胺基丙酰胺基)-四乙二醇]酯(NHS-PEG4-马来酰亚胺)。
12.如权利要求11所述的用途,其中所述接头是4-(马来酰亚胺基甲基)环己烷羧酸N-琥珀酰亚胺酯。
13.如权利要求9所述的用途,其中所述细胞毒性剂是美登木素。
14.如权利要求13所述的用途,其中所述细胞毒性剂是N(2')-脱乙酰基-N(2')-(3-巯基-1-氧代丙基)-美登素或N(2')-脱乙酰基-N(2')-(4-巯基-4-甲基-1-氧代戊基)-美登素。
15.如权利要求9所述的用途,其中所述免疫缀合物包含2至6个细胞毒性剂。
16.如权利要求9所述的用途,其中所述抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO:57所示的重链可变区序列和如SEQ ID NO:74所示的轻链可变区序列。
17.如权利要求16所述的用途,其中所述接头是4-(马来酰亚胺基甲基)环己烷羧酸N-琥珀酰亚胺酯。
18.如权利要求16所述的用途,其中所述细胞毒性剂是N(2')-脱乙酰基-N(2')-(3-巯基-1-氧代丙基)-美登素或N(2')-脱乙酰基-N(2')-(4-巯基-4-甲基-1-氧代戊基)-美登素。
19.如权利要求17所述的用途,其中所述细胞毒性剂是N(2')-脱乙酰基-N(2')-(3-巯基-1-氧代丙基)-美登素或N(2')-脱乙酰基-N(2')-(4-巯基-4-甲基-1-氧代戊基)-美登素。
20.如权利要求19所述的用途,其中所述细胞毒性剂是N(2')-脱乙酰基-N(2')-(3-巯基-1-氧代丙基)-美登素。
21.如权利要求9所述的用途,其中所述抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO:65所示的重链可变区序列和如SEQ ID NO:81所示的轻链可变区序列。
22.如权利要求21所述的用途,其中所述接头是4-(马来酰亚胺基甲基)环己烷羧酸N-琥珀酰亚胺酯。
23.如权利要求21所述的用途,其中所述细胞毒性剂是N(2')-脱乙酰基-N(2')-(3-巯基-1-氧代丙基)-美登素或N(2')-脱乙酰基-N(2')-(4-巯基-4-甲基-1-氧代戊基)-美登素。
24.如权利要求22所述的用途,其中所述细胞毒性剂是N(2')-脱乙酰基-N(2')-(3-巯基-1-氧代丙基)-美登素或N(2')-脱乙酰基-N(2')-(4-巯基-4-甲基-1-氧代戊基)-美登素。
25.如权利要求23所述的用途,其中所述细胞毒性剂是N(2')-脱乙酰基-N(2')-(3-巯基-1-氧代丙基)-美登素。
26.如权利要求9所述的用途,其中所述自身免疫性疾病或炎性疾病选自由以下组成的组:类风湿性关节炎、多发性硬化症、I型糖尿病、特发性炎性肌病、系统性红斑性狼疮(SLE)、重症肌无力、格雷夫斯氏病、皮肌炎、多发性肌炎、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、胃炎、桥本氏甲状腺炎、哮喘、银屑病、银屑病性关节炎、皮肤炎、系统性硬皮病和硬化症、炎性肠病(IBD)、呼吸窘迫综合征、脑膜炎、脑炎、葡萄膜炎、肾小球肾炎、湿疹、动脉粥样硬化、白细胞粘附缺陷症、雷诺氏综合征、斯耶格伦氏综合征、莱特尔氏病、白塞氏病、免疫复合物性肾炎、IgA肾病、IgM多发性神经病、免疫介导的血小板减少症、急性特发性血小板减少性紫癜、慢性特发性血小板减少性紫癜、溶血性贫血、重症肌无力、狼疮性肾炎、特应性皮炎、寻常型天疱疮、眼阵挛-肌阵挛综合征、纯红细胞再生障碍、混合型冷球蛋白血症、强直性脊柱炎、丙型肝炎相关的冷球蛋白血症性血管炎、慢性局灶性脑炎、大疱性类天疱疮、甲型血友病、膜性增殖性肾小球肾炎、成人和幼年型皮肌炎、成人多发性肌炎、慢性荨麻疹、原发性胆汁性肝硬化、视神经脊髓炎、格雷夫斯氏甲状腺机能障碍、大疱性类天疱疮、膜性增殖性肾小球肾炎、丘-施综合征、幼年发病型糖尿病、溶血性贫血、特应性皮炎、系统性硬化症、斯耶格伦氏综合征和肾小球性肾炎、皮肌炎、ANCA、再生障碍性贫血、自身免疫性溶血性贫血(AIHA)、因子VIII缺乏症、甲型血友病、自身免疫性中性粒细胞减少症、卡斯特氏综合征、古德帕斯丘氏综合征、实体器官移植排斥反应、移植物抗宿主疾病(GVHD)、自身免疫性肝炎、淋巴细胞性间质性肺炎、HIV、闭塞性细支气管炎(非移植)、格林-巴利综合征、大血管性血管炎、巨细胞(高安氏(Takayasu's)动脉炎、中等血管性血管炎、川崎氏病、结节性多动脉炎、韦格纳氏肉芽肿病、显微镜下多血管炎(MPA)、欧门氏综合征、慢性肾功能衰竭、急性传染性单核细胞增多症、HIV以及疱疹病毒相关的疾病。
27.如权利要求9所述的用途,其中所述自身免疫性疾病或炎性疾病是多发性硬化症。
28.如权利要求9所述的用途,其中所述自身免疫性疾病或炎性疾病是糖尿病。
29.如权利要求9所述的用途,其中所述自身免疫性疾病或炎性疾病是类风湿性关节炎。
30.一种特异性地结合CD37的抗体或其抗原结合片段,其中所述抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO:171、172或181和173所示的以及如SEQ ID NO:174、175和176所示的VHCDR1、VH CDR2和VH CDR3序列以及VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3多肽序列。
31.如权利要求30所述的抗体或其抗原结合片段,其中所述抗体或其抗原结合片段包含分别如SEQ ID NO:177所示的和如SEQ ID NO:178所示的重链可变区序列和轻链可变区序列。
32.免疫缀合物,其包含如权利要求30或31所述的抗体或其抗原结合片段、接头和细胞毒性剂,其中所述接头是可裂解的接头或不可裂解的接头,以及其中所述细胞毒性剂是:美登木素、美登木素类似物、阿霉素、修饰的阿霉素、苯二氮紫杉烷类、CC-1065、CC-1065类似物、倍癌霉素、倍癌霉素类似物、卡奇霉素、多拉司他汀、多拉司他汀类似物、奥利斯他汀、托马霉素衍生物、以及来普霉素衍生物或所述细胞毒性剂的前药。
33.如权利要求32所述的免疫缀合物,其中所述接头是亲水性接头或基于二羧酸的接头。
34.如权利要求32所述的免疫缀合物,其中所述接头是:4-(2-吡啶基二硫代)戊酸N-琥珀酰亚胺酯;4-(2-吡啶基二硫代)丁酸N-琥珀酰亚胺酯;4-(2-吡啶基二硫代)-2-磺基丁酸N-琥珀酰亚胺酯;4-(马来酰亚胺基甲基)环己烷羧酸N-琥珀酰亚胺酯;4-(马来酰亚胺基甲基)环己烷羧酸N-磺基琥珀酰亚胺酯;4-(碘代乙酰基)-氨基苯甲酸N-琥珀酰亚胺酯;或N-琥珀酰亚胺基-[(N-马来酰亚胺基丙酰胺基)-四乙二醇]酯(NHS-PEG4-马来酰亚胺)。
35.如权利要求34所述的免疫缀合物,其中所述接头是4-(马来酰亚胺基甲基)环己烷羧酸N-琥珀酰亚胺酯。
36.如权利要求32所述的免疫缀合物,其中所述细胞毒性剂是美登木素。
37.如权利要求36所述的免疫缀合物,其中所述细胞毒性剂是N(2')-脱乙酰基-N(2')-(3-巯基-1-氧代丙基)-美登素或N(2')-脱乙酰基-N(2')-(4-巯基-4-甲基-1-氧代戊基)-美登素。
38.如权利要求32所述的免疫缀合物,其中所述免疫缀合物包含2至6个细胞毒性剂。
39.使用如权利要求30或31所述的抗体或抗原结合片段消减在包含B细胞的细胞群中的B细胞的体外或离体方法。
40.使用如权利要求32所述的免疫缀合物消减在包含B细胞的细胞群中的B细胞的体外或离体方法。
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