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CN105997978B - 一种金属有机骨架化合物抗肿瘤血管生成剂及其使用方法 - Google Patents

一种金属有机骨架化合物抗肿瘤血管生成剂及其使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了铁金属有机骨架化合物（Fe‑MIL‑101）新的用途，首次发现Fe‑MIL‑101抗血管生成作用，首次发现Fe‑MIL‑101可有效抑制血管内皮细胞的增殖、迁移和小管形成，说明Fe‑MIL‑101具有抗血管生成活性，可作为血管生成抑制剂使用。并且Fe‑MIL‑101对正常细胞的毒性弱，可作为选择性血管生成抑制剂使用。

Description

一种金属有机骨架化合物抗肿瘤血管生成剂及其使用方法
技术领域
本发明涉及金属有机骨架材料的应用技术领域，具体涉及一种金属有机骨架化合物在肿瘤血管生成抑制剂中的应用。
背景技术
长久以来，肿瘤依然是世界范围内主要的死亡之一。尽管已有较为成熟的治疗方法，但很多类型的肿瘤缺乏早期症状，同时对放疗和化疗不敏感，尤其是许多化疗药可损伤机体的免疫系统，会对患者产生毒副作用及耐药性。特别是肿瘤发展到中晚期，往往出现肿瘤治疗的速度远远赶不上肿瘤转移扩散的速度。因此，抗肿瘤治疗一直面临着严峻的挑战。为到达较好的肿瘤治疗效果，新型有效的抗肿瘤药物与联合治疗策略十分必要。
抗血管生成被认为是治疗恶性肿瘤具有重大医学价值的策略之一。当肿瘤体积超过2 mm3时进入血管期，新生血管的生成为肿瘤的生长提供必需的营养供给和代谢产物排泄，从而使肿瘤体积呈指数倍数生长，同时新生血管通透性增强，肿瘤细胞可穿透血管转移至其他部位。因此，血管生成与肿瘤的生长、转移及复发密切相关。阻断肿瘤血管生成、切断肿瘤组织获得营养途径已经成为新的抗肿瘤治疗靶点，而且也成为抗肿瘤治疗中热门的研究内容。血管生成抑制的出现为抗肿瘤治疗提供了一种新手段，但是随着临床应用范围的扩大和应用时间的延长抑制剂的一些毒副作用也逐步显现出来，贝伐单抗又称阿瓦斯汀（Bevacizumab, Avastin）是美国第一个获得批准上市的抑制肿瘤血管生成的药物，它通过与血管内皮生长因子（VEGF）结合并阻断其生物活性。目前被广泛用于临床治疗中，但其效果并不令人满意，并伴有许多严重副作用。癌症的转移是多种生长因子共同调控的结果。因此，发展能够同时抑制多种生长因子的新型血管生成抑制剂也许能解决这一难题。
金属基质蛋白酶（MMP）是锌离子依赖性的内源性蛋白酶家族，能水解细胞外基质，在肿瘤的侵袭和转移、血管生成中起着重要作用。肿瘤的转移也伴随着蛋白酶水解细胞外基质的过程。因此，在细胞微环境中下调或降低MMP蛋白酶活性对抑制血管生成以及肿瘤的侵袭和转移是至关重要的。以MMP-2 和MMP-9 为标靶的抑制剂已被广泛用于肿瘤转移的动物模型以及人类癌症的临床研究，例如吡啶酮乙醇胺（PO）负载Fe3O4 纳米颗粒（Fe3O4@PONPs）具有抑制MMP-2 的活性。富勒烯-基纳米材料Gd@C82(OH)22以及中空介孔碳纳米胶囊（HMCNs）作为有效的抗血管生成抑制剂，就是通过下调多种包括MMP-2、MMP-9的抗血管生成因子。
铁是所有生物体中一个至关重要的微量元素。铁配合物是有效的细胞毒性药物。铁活性化合物在作用机理，生物分布和细胞毒性方面不同于当前使用的铂类药物，而且它们对抗那些化疗敏感性差或传统铂类药物产生了抗药性的癌症是有效的，至少大体是有效的。但至今未发现有关铁基配合物作为抗肿瘤药物，靶向作用于血管生成，血管内皮细胞和肿瘤细胞，强大抗肿瘤效果的报道。
金属有机骨架化合物(Metal-Organic Frameworks, MOFs)是利用含氧的多齿有机配体与金属离子通过自由组装形成的具有周期性网络结构的配体化合物。近年来，由于MOFs能展示可调控的多孔性和异常的高比表面，可被广泛应用于生物医学的多个领域，如药物的封装，传递，运输和释放，甚至利用MOFs实现基因治疗疾病。研究表明，RNA干扰沉默VEGF的表达被证实了抑制了肿瘤血管生成以及阻碍了肿瘤的生长。因此，利用含铁离子的金属有机骨架化合物制备新型抗肿瘤血管生成抑制剂以增强抗肿瘤治疗的效果。但是，相对于大量的合成及应用研究，目前关于MOFs材料作为抗癌药物载体及其细胞毒性研究都还非常有限，更无关于其自身抗血管生成、抑制基质金属蛋白酶MMPs的研究报道。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中存在的金属有机骨架化合物合成复杂、成本高、效果不好等缺点，提供一种合成简单、成本低、特异性强的金属有机骨架化合物。
所述的血管生成抑制剂的Langmuir和BET比表面积分别为5400 m2 g-1 和3710 m2 g-1。
所述的血管生成抑制剂的有效浓度为6.25-25 µg mL-1。
所述的血管生成为肿瘤病变组织的血管新生和肿瘤导致的血管新生。
所述的肿瘤为人非小细胞肺癌（A549）和人卵巢癌（SKOV3）；血管生成所用的的血管内皮细胞为人脐静脉血管内皮细胞（HUVEC）；用于对比的正常细胞为小鼠胚胎成纤细胞（BABL-3T3）。
所述的血管生成抑制剂具有选择性抑制癌细胞和血管内皮细胞增殖但对正常细胞毒性较弱的作用。
所述的血管生成抑制剂具有抑制癌细胞和血管内皮细胞迁移的作用，具有抑制体外血管生成的作用以及下调细胞微环境中基质金属蛋白酶（MMP-2和MMP-9）的表达的作用。
所述的血管生成抑制剂具有抑制体外VEGF和人卵巢癌细胞（SKOV3）分泌液（CM）诱导的人静脉血管内皮细胞管形形成，其效果强于传统的酪氨酸激酶抑制剂（SU5416）。
本发明的有益效果：材料合成方法简单、成本低以及特异性强；能够选择性抑制卵巢癌SKOV3细胞以及人血管内皮HUVEC细胞的增殖与迁移，对于正常细胞（小鼠胚胎成纤细胞BABL-3T3）的毒性较弱；抑制VEGF和SKOV3细胞分泌液（CM）刺激的人静脉血管内皮细胞小管形成；抑制基质金属蛋白酶MMP-2和MMP-9的表达。
附图说明
图1为本发明Fe-MIL-101材料XRD图。
图2为本发明Fe-MIL-101材料N2吸附脱附以及孔径分布图。
图3为本发明Fe-MIL-101材料SEM图。
图4为本发明Fe-MIL-101对A549、SKOV3、HUVEC和BABL-3T3细胞的抑制率图。
图5为本发明Fe-MIL-101抑制SKOV3和HUVEC细胞迁移图。
图6为本发明Fe-MIL-101对HUVEC细胞血管生成实验图。
图7为本发明Fe-MIL-101对HUVEC细胞中基质金属蛋白酶 MMP-2和MMP-9的表达实验图。
具体实施例
实施例1 Fe-MIL-101体外细胞毒性实验。
MTT法：取对数生长期的人非小细胞肺癌A549、人卵巢癌SKOV3、血管内皮HUVEC细胞以及正常BABL-3T3细胞，按1×104个/孔接种于96孔板中，当细胞生长达到80%融合后，分别加入3.12、6.25、12.5、25 µg mL−1的Fe-MIL-101，设3个复孔。作用72小时后，每孔中加入5µg mL-1 MTT继续培养4小时，吸取上清，每孔加入150 µL DMSO，水平震荡10分钟，然后使用酶标仪于490 nm波长测定每孔的吸光度(OD值)，每组实验重复三次。
按如下公式计算细胞抑制率：细胞抑制率% = [1-（[OD]test/[OD]control）]×100%，其中，[OD]test为实验组OD值，[OD]control为对照组OD值。IC50值即为细胞抑制率达到50%时药物的浓度。
结果与结论：请参照附图4，附图4是Fe-MIL-101对A549、SKOV3、HUVEC和BABL-3T3细胞的抑制率图。如图4所示，Fe-MIL-101对细胞的增殖抑制作用呈剂量依赖关系，特别是对SKOV3和HUVEC细胞的抑制作用最强。当Fe-MIL-101的浓度为12.5 µg mL−1时，对肿瘤细胞（A549和SKOV3）的抑制率超过30%，对HUVEC的抑制率接近80%；当Fe-MIL-101的浓度为25 µgmL−1时，对SKOV3和HUVEC细胞的抑制率分别大于50%和90%。通过计算Fe-MIL-101对A549、SKOV3、HUVEC和BABL-3T3细胞四种细胞的IC50值分别为54.3、67.8、23.6、9.9和78.3 µg mL−1。以上数据说明Fe-MIL-101的浓度为12.5 ～ 25µg mL−1浓度范围内对癌细胞和血管内皮细胞具有抑制作用。并且还发现Fe-MIL-101对SKOV3和HUVEC具有选择性抑制作用，而对正常细胞的毒性较弱。
实施例2 Fe-MIL-101对卵巢癌和血管内皮细胞迁移实验。
采用划痕法检测Fe-MIL-101对卵巢癌SKOV3细胞和血管内皮HUVEC细胞的迁移能力。SKOV3和HUVEC细胞分别接种于6孔板中（2×105细胞/孔），培养24小时后。用200 µL的枪头划痕，PBS冲洗三次，去除漂浮的细胞，加入25 µg mL−1的Fe-MIL-101与SKOV3细胞和HUVEC细胞作用0、6、12、24小时，显微镜观察向划痕处迁移的细胞数量。
结果与结论：请参照附图5，附图5是Fe-MIL-101抑制SKOV3和HUVEC细胞迁移图。如图2所示，Fe-MIL-101作用后，SKOV3和HUVEC细胞向划痕处迁移的细胞数明显少于对照组向划痕处迁移的细胞数，说明Fe-MIL-101对两种细胞的迁移具有抑制作用。
实施例3 Fe-MIL-101抑制HUVEC细胞血管生成实验。
先将50 µL Matrigel铺于96孔板中，37℃放置 30 min让其凝固，轻轻向其中加入100 µL HUVEC细胞悬液（2×105细胞/mL），分别加入12.5、25 µg mL−1的Fe-MIL-101、VEGF(10 ng mL−1)和SKOV3分泌刺激液（CM）以及血管生成抑制剂SU5416（20 µM），培养12小时，每隔6小时于显微镜观察并拍照。每组实验重复三次。
结果与结论：请参照附图6，附图6是Fe-MIL-101对HUVEC细胞小管生成实验图。如图6所示，在VEGF和SKOV3分泌刺激液（CM）实验组中，细胞形成良好的网状结构；在加入Fe-MIL-101的实验组中，小管的数量和长度随着Fe-MIL-101浓度的增加而急剧减少，并且Fe-MIL-101的抑制效果优于传统的酪氨酸激酶抑制剂SU5416（20 µM），Fe-MIL-101能抑制住肿瘤分泌液所刺激的血管生成，从而证实Fe-MIL-101是更具潜力的抑制剂。
实施4 Fe-MIL-101调节细胞中基质金属蛋白酶的表达实验。
蛋白免疫印迹法（SDS-PAGEA电泳）：提取的蛋白样品进行SDS-PAGEA凝胶电泳（浓缩胶4%，分离胶12%）分离，电泳条件：U=150 V，I=50 mA；随后进行湿法转膜，电泳条件：U=100V，I=50mA，将蛋白转移至PVDF膜上。5%的脱脂奶粉封闭膜上的非特异结合位点后，加入一抗MMP-2（1：200）、MMP-9（1：200）、GAPDH（1：3000）、β-actin（1：500）4℃孵育过夜。次日PBST洗三次，加入1:1000稀释的HRP标记的二抗，室温孵育1小时，PBST洗三次，显影曝光。
结果与结论：请参照附图7，附图7是Fe-MIL-101对HUVEC细胞中基质金属蛋白酶MMP-2和MMP-9的表达实验图。如图7所示， Fe-MIL-101抑制了MMP-2和MMP-9 蛋白的表达。实验结果提示Fe-MIL-101靶向性针对MMP-2和MMP-9酶。

Claims (4)

1.一种金属有机骨架化合物在制备肿瘤血管生成抑制剂中的应用，其特征在于：所述的金属有机骨架化合物为Fe-MIL-101，其Langmuir和BET比表面积分别为5400m2g-1和3710m2g-1，有效浓度为12.5-25μg mL-1；
所述的肿瘤为人卵巢癌SKOV3；血管生成所用的血管内皮细胞为人脐静脉血管内皮细胞HUVEC；用于对比的正常细胞为小鼠胚胎成纤细胞BABL-3T3。
2.根据权利要求1所述的金属有机骨架化合物在制备肿瘤血管生成抑制剂中的应用，其特征在于，所述的血管生成为肿瘤病变组织的血管新生和肿瘤导致的血管新生。
3.根据权利要求1所述的金属有机骨架化合物在制备肿瘤血管生成抑制剂中的应用，其特征在于，所述的血管生成抑制剂具有选择性抑制癌细胞和血管内皮细胞增殖但对正常细胞毒性较弱的作用。
4.根据权利要求1所述的金属有机骨架化合物在制备肿瘤血管生成抑制剂中的应用，其特征在于，所述的血管生成抑制剂具有抑制癌细胞和血管内皮细胞迁移的作用；具有抑制体外小管形成以及下调细胞微环境中基质金属蛋白酶MMP-2和MMP-9的表达的作用。
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