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CN105994937A - 一种绿色富有机硒饲料及其制备方法 - Google Patents

一种绿色富有机硒饲料及其制备方法 Download PDF

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CN105994937A
CN105994937A CN201610338359.9A CN201610338359A CN105994937A CN 105994937 A CN105994937 A CN 105994937A CN 201610338359 A CN201610338359 A CN 201610338359A CN 105994937 A CN105994937 A CN 105994937A
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刘金龙
郑威
温亮
刘欋霄
郑倬
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Agricultural And Economic Technology Institute Hubei Academy Of Agricultural Sciences
Hubei University for Nationalities
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Abstract

本发明涉及一种绿色富有机硒饲料及其制备方法，所述制备方法包括对含绞股蓝全草粉的发酵原料依次进行有氧发酵和无氧发酵生产发酵液的步骤。发酵原料中加入绞股蓝全草粉组分，经过发酵产生的绞股蓝多糖和小肽能够提供畜禽免疫力，促进畜禽生长，提高猪肉质量，绞股蓝中的甜味物质还能够提高饲料的适口性。有氧发酵后紧接无氧发酵，发酵液对多种细菌有抑制治疗作用，可有效防止生物饲料在储藏过程中产生霉毒素，防止生物饲料变质，防止畜禽肠道细菌感染，延缓和改善慢性肠炎，提高畜禽生活质量。

Description

一种绿色富有机硒饲料及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物饲料技术领域，尤其涉及一种绿色富有机硒饲料及其制备方法。
背景技术
饲料原料和全价饲料中多种霉菌毒素往往同时存在，由于不同毒素间具有协同作用，将加剧饲料毒素的毒性作用和猪中毒症状的严重程度。目前的市售饲料大部分添加各种抗生素、合成激素、抗氧化剂、防霉剂、着色剂、增味剂、保健与代谢药物，生产出的猪肉腥臭味大，猪肉抗生素、合成激素、重金属超标，基本无猪肉香味，该种猪肉被人体吸收后，会严重影响人体健康。
研究证明生物饲料能有效的解决上述问题。中国专利CN104222610A公开了选用植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、地衣芽孢杆菌乳酸杆菌发酵饲料，饲料配方原料由浓缩料、玉米、菜粕、豆粕、当归、黄芪组成，中国专利CN103875893A公开了使用地衣芽孢杆菌、酿酒酵母、粪肠球菌、枯草芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌、益生元、小肽制剂、甘露寡糖、硫酸锌、硫酸亚铁、硫酸铜、维生素E、维生素A、维生素D、亚硒酸钠、碘化钾、硫酸钴、硫酸锰、石粉等发酵脱水干燥组成的多菌种复合微生物饲料添加剂。此两篇专利不涉及规模化生产，产品质量不稳定，也没有全面考虑用益生菌组方设计生产出生产生物饲料的技术。
发明内容
本发明的目的是针对现有的全价饲料和已有的生物饲料微生物益生菌配方不全面，生产饲料产品不稳定等问题，提出一种绿色富有机硒饲料及其制备方法，本申请的技术方案能够比较好的解决现有技 术存在的问题。
为了实现上述目的，本发明的技术方案之一是：
一种绿色富有机硒饲料的制备方法，包括对含绞股蓝全草粉的发酵原料依次进行有氧发酵和无氧发酵生产发酵液的步骤。
所述绞股蓝全粉是将绞股蓝全草经膨化、粉碎后过50-70目(优选60目)筛得到。
本发明的发酵原料中添加有绞股蓝全草粉，绞股蓝全草含蛋白质23-25％，绞股蓝人参皂苷5％以上，绞股蓝总皂苷具有降血糖、抗氧化、抗肿瘤、调节免疫、保护神经、降血脂、降低胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白，提高高密度脂蛋白的功效，以绞股蓝为原料发酵得到的饲料能够提高猪肉的ω-3含量，降低ω-6含量。蛋白和绞股蓝全草纤维经益生菌发酵后降解为小肽和绞股蓝多糖，可以减少饲料中蛋白的添加量，能够促进畜禽(尤其是猪)的生长，提高畜禽肉质质量。此外，绞股蓝中的香甜物质还能够提高饲料的适口性。
除此之外，绞股蓝是喜阴物质，主产我国，其可在林下和高杆作物株行间种植，例如，与玉米套作不影响玉米产量且绞股蓝也生产茂盛，每亩可收全草300kg以上，绞股蓝不与农作物争地，原料来源广泛，是生产优质猪肉理想的饲料原料，农民在作物田间套种植绞股蓝可提高收入。
为了确保发酵饲料的质量，以重量份计，所述发酵原料包括1-10份玉米面，1-5份豆饼或花生饼，1-5份面粉，1-3份绞股蓝全草粉，0.5-1.5份麦麸，0-3份含硒或不含硒玉米秆，0.1-1份鱼粉，0.3-1.5份食盐，0.0005-0.002份Fe3+，0.0005-0.003份Zn2+，0.00005-0.0003份Mg2+。
为了满足不同生长阶段畜禽的饲喂需求，本申请对发酵原料进行了进一步的优化，在一种优选的实施方式中，以重量份计，所述发酵原料包括6-10份玉米面，3-5份豆饼或花生饼，1-3份面粉，2-3份绞 股蓝全草粉，0.5-1.5份麦麸，1-3份含硒或不含硒玉米秆，0.3-1份鱼粉，0.5-1.5份食盐，0.001-0.002份Fe3+，0.001-0.003份Zn2+，0.0001-0.0003份Mg2+。
上述配方的发酵原料经过有氧发酵、无氧发酵后得到的饲料，由于饲料中粗粮占的比例大，粗蛋白质比例高，纤维含量高，能够满足消化功能健全的生长猪的生长需求，且饲料原料成本较低。
此外，有研究证明，动物消化道酶分泌量不足和酶活性偏低在很大程度上限制了营养物质的消化，容易影响动物生长和生产性能潜力的发挥。本发明的发酵原料经益生菌发酵后，饲料中一部分蛋白质降解为氨基酸、生长肽、抗菌肽，一部分纤维降解成半纤维和多糖，淀粉降解成营养型低聚糖，和高于四糖以上的功能性低聚糖，这些小分子营养物有助于猪的吸收，减少猪自身酶的分泌，有利于提高饲料的转化利用率，增强猪的免疫力，促进生长猪的生长。
在另一种优选的实施方式中，以重量份计，所述发酵原料包括1-3份玉米面，1-3份豆饼或花生饼，3-5份面粉，1-2份绞股蓝全草粉，0.5-1份麦麸，0.2-0.5份鱼粉，0.3-0.8份食盐，0.0005-0.001份Fe3+，0.0005-0.0015份Zn2+，0.00005-0.00015份Mg2+。
上述配方的发酵原料经过有氧发酵、无氧发酵后得到的饲料中精细粮占的比例大，蛋白含量高，粗纤维含量少，可满足消化功能不健全的断奶猪的需求。饲料原料经益生菌有氧发酵、无氧发酵后将饲料中蛋白质和纤维降和淀粉部分降解为氨基酸、生长肽、抗菌肽、杀菌肽、半纤维、多糖；经益生菌发酵的饲料消除了霉菌毒素，消除了过多的金属离子；经益生菌发酵的饲料生产出了猪生长需要多种酶、酵素、多种维生素和味精类物质，使断奶猪喜食，更容易吸收饲料营养、提高饲料利用率，降低肉料比；发酵饲料中的益生菌降解自由基物质，减少消除肠道内的臭气物质，提高断奶猪抗病力，较少减轻断奶猪疾病发生率，有效防治断奶猪爆发性疾病发生。
上述金属元素，如Fe3+，Zn2+，Mg2+，可由本领域常用的物质提供，本发明优选采用乳酸铁、葡萄糖酸锌，葡萄糖酸镁、葡萄酸钙等有机铁、锌、镁、钙，相比硫酸亚铁、硫酸氢钙、硫酸镁、硫酸锌等无机物，有助于克服饲料中金属离子超标造成的破坏猪肠道绒毛和益生菌平衡，损伤猪的免疫系统的问题，采用有机物还可以避免饲料中维生素失效速度加快，克服过多的金属离子被猪肝吸收造成的不可逆蓄积毒害的问题。
为了保证发酵质量，在发酵前，还包括对发酵原料进行灭菌处理的步骤，所述灭菌处理为：将发酵原料在60-82℃灭菌25-35min，优选为在60-82℃灭菌30min。
所述有氧发酵分为三个阶段，第一阶段为：向发酵原料中接入CICC 32288菌株种子液，发酵6-12h；第二阶段为：向发酵液中接入CICC 10063和CICC 10089菌株的种子液，发酵6-12h；第三阶段为：向发酵液中接入CICC 22585、CICC 22635、CICC 22607、和CICC10064菌株的种子液，发酵6-12h；
优选地，第二阶段，CICC 10063和CICC 10089菌株的种子液按1:(0.8-1.2)(优选1：1)的体积比加入；第三阶段，CICC 22585、CICC 22635、CICC 22607、和CICC 10064菌株的种子液按1:(0.8-1.2):(0.8-1.2):(0.8-1.2)(优选1:1:1:1)的体积比加入。
进一步优选地，第一、二阶段，种子液的接入量为5-10％，第三阶段，种子液的接入量为1-5％。
优选地，有氧发酵阶段中维持氧含量为70-100％。
本发明采用好氧功能益生菌群发酵原料，使用3组好氧功能益生菌群发酵生产饲料，有氧发酵益生菌将原料中的部分纤维水解成多糖，将部分蛋白质降解为朊和氨基酸及肽，由于肽比游离氨基酸消化更快、吸收更多，因此提高饲料的可消化性和利用率，降低肉料比例，直接降低喂猪成本，提高猪肉质量；此外，生产的生物饲无霉毒素、无农 残、有鲜味、适口性好。
具体地，CICC 22607为枯草芽孢杆菌，能够产生鸟苷及鸟苷酸；CICC 10064为谷氨酸棒杆菌，能够产生L-谷氨酸和L-赖氨酸，此组益生菌是能够为饲料增加鲜味物质的菌群；
CICC 22635为枯草芽胞杆菌枯草亚种，能够产L-精氨酸(能刺激垂体释放生长激素物质)；CICC 22585为枯草芽胞杆菌枯草亚种，能够产赖氨酸(具有促进发育、增强免疫功能，并有提高中枢神经组织功能的作用)，此组益生菌是生产饲料的营养强化剂，促长的菌群；
CICC 31188为产朊假丝酵母，能够降解黄曲霉、赭曲霉，它能以尿素和硝酸作为氮源生产蛋白质消除饲料原料中的氮素化肥残基农残等有害物，变害为利，CICC 10063为解淀粉芽胞杆菌，能够产蛋白酶，将蛋白降解成蛋白胨、氨肽基酸，并能降解黄曲霉，赭曲霉、农残等有害物；CICC 10089为枯草芽胞杆菌，能够产生半纤维素酶，并能降解黄曲霉，赭曲霉、农残等有害物，该组益生菌为降农残，分解消除霉毒素，并分解纤维变多糖，分解蛋白质变为功能肽、氨基酸营养物质的菌群。
所述无氧发酵分为两个阶段，第一阶段为：有氧发酵结束后，向发酵液中接入CICC6257，CICC 6129，CICC 6119，ICC6241，和CICC 21240菌株的种子液，发酵3-18h；第二阶段为，向发酵液中接入CICC 6258，CICC 6239菌株的种子液，发酵3-12h；
优选地，第一阶段，CICC 6257，CICC 6129，CICC 6119，ICC6241，和CICC 21240菌株的种子液按1:(0.8-1.2):(0.8-1.2):(0.8-1.2):(0.8-1.2)(优选1:1:1:1:1)的体积比加入；第二阶段，CICC 6258、CICC 6239种子液按1：(0.8-1.2)(优选1：1)体积比加入。进一步优选地，两个阶段菌株的接种量为1-10％。
其中，无氧发酵菌群CICC 6257为植物乳杆菌，其对多种细菌有抑菌作用；CICC6192为长双歧杆菌；CICC 6119为罗伊氏乳杆菌， 治疗家禽肠道细菌感染；CICC 6258为乳杆菌，对多种细菌有抑菌作用；CICC 6241为嗜酸乳杆菌，CICC 6239为短乳杆菌，产乳酸，风味物质好；CICC 21240为枯草芽胞杆菌，抗多种真菌。本发明的无氧菌群发酵饲料自然产生出无害的抗致病真菌、抗致病细菌、提高饲料的适口性、有效防止饲料霉变、提高猪的免疫力、抗病性，有效防止猪肠道疾病、提高饲料利用率功效，还保证生物饲料在1-12个月保质期内不变质，不霉变。
为了进一步保证发酵质量，所述有氧发酵和无氧发酵均在25-30℃，pH 5.5-7，90-220转/min搅拌转速条件下进行。
其中，所述7种有氧菌和7种无氧菌均为本领域常用菌株，可市购获得，例如可购自中国工业微生物菌种保藏管理中心。
优选地，在发酵结束后，还包括向发酵液中加入有机硒和/或低聚木糖的步骤。
硒是能中和或转化自由基的物质，在饲料中添加硒有助于提高畜禽肉质质量，但是在饲料中添加无机硒会出现吸收和利用不理想的状况，生物利用率低，毒性大，中毒量和有效量之间范围小，因而无机硒的使用受到严格限制。有机硒与无机硒相比，具有食用安全，无毒副作用，吸收利用率高(95％)，营养价值高(如高水平的维生素，高质量的蛋白等)等优点，与昂贵的硒酵母相比，具有成本低的优势。低聚木糖具有促进动物消化道内有益菌的繁殖，抑制有害菌生长，改善微生物菌群平衡，提高动物免疫力，提高饲料利用率的功效。
本发明在发酵液中加入有机硒和低聚木糖能够与发酵液中的物质发挥协同作用，提高饲料的营养价值，提高饲料的利用率。本发明所述的有机硒和低聚木糖均可采用普通市售产品。
优选地，所述有机硒的加入量为0.1-0.5mg/kg，所述低聚木糖的加入量为0.7-1.4g/kg。
本发明优选地，所述有机硒是以含有机硒的发酵液形式加入的， 所述含有机硒的发酵液是以为发酵菌，对含硒培养基发酵而得，枯草芽孢杆菌SE201412的保藏编号为CCTCCNo.M2015708。此种方式发酵得到的有机硒具有安全，利用率高的优势。
其中，所述发酵菌为枯草芽孢杆菌(Bacillus Subtilis)SE201412，已于2015年11月26日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC；地址：中国武汉，武汉大学；邮编：430072)，保藏编号CCTCC No.M2015708。
所述含有机硒的发酵液可通过如下方式发酵得到：按照1-10％的接种量，将枯草芽孢杆菌SE201412接种到10g/L蛋白胨，3g/L牛肉膏，5g/L氯化钠，7g/L亚硒酸钠，pH7.2组成的培养基中，于150-190r/min，溶氧80％-100％，28-32℃条件下发酵18-22h，发酵过程控制pH 6-7，即得。
本发明的饲料中有机硒含量为0.1-0.5mg/kg，饲养猪时，日用量100μg-250μg/猪，饲喂1-2个月即可产出含有机硒0.2mg/kg以上的绿色富有机硒猪肉。与使用酵母硒相比，成本低10倍以上，与使用毒性强的亚硒酸钠相比，本发明的饲料更加安全，成本更低。
本发明的技术方案之二是：上述任意一种方法制备得到的绿色富有机硒饲料。
本发明的技术方案之三是：上述任意一种绿色富有机硒饲料在猪饲养中的应用。
该饲料中含有有机硒，不含霉毒素、农残、抗生素、致病菌，含水量在10-42％，含粗蛋白12-50％，赖氨酸0.5-2.8％，粗纤维8-22％，粗灰分8-22％，料肉比2.4-2.7，采用此饲料饲喂猪的方法可采用本领域常规方法，断奶猪饲喂4-4.5个月后，重量可达100-120kg/头，猪肉含有机硒，成本比全价饲料低10％。
本发明的方法可以采用申请号为201510736852.1，名称为卧式固体发酵系统和申请号为201510736364.1，名称为立式固体发酵系统的 设备实现，使用热风杀菌，增温发酵，使用无菌空气降温恒温技术，能够有效杀灭生物饲料中的致病菌，霉毒素，农残，具有发酵效果好，成本低，规模化，工业化的优势。
本发明涉及到的原料或菌株均可市购获得。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件可以相互组合，即得本发明各较佳实施例。
附图说明
图1为菌株SE201412显微镜(1000X)观察照片；
图2为菌株SE201412的平板菌落形态；
图3为菌株SE201412进化树。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。本发明所采用的所有原料均为已知的市售品，涉及到的检测方法或操作如无特殊说明均为本领域的常规检测方法或操作。
以下实施例中涉及到的有氧菌和无氧菌的种子液通过如下发酵培养方式获得：
1、CICC 10063
(1)试管培养基配方：NaCl 10.0g，牛肉膏20.0g，蛋白胨20.0g，琼脂40.0g，蒸馏水2.0L，pH7.2，无菌操作接种200支试管种。30℃培养18h。
(2)1吨种子液生产：配制发酵液：NaCl 5000g，牛肉膏10000g，蛋白胨10000g，蒸馏水1000L，pH7.2，发酵罐管消、空消，发酵液实消后，在无菌条件下将200支试管种接入发酵罐内发酵，罐内氧气含量70％-100％，ph控制5.5-7，搅拌转速90转/min-220转/min，控温恒定30℃，发酵18h后下罐无菌条件下接入饲料发酵罐发酵。
2、CICC 31188
(1)试管培养基配方：A、取大麦或小麦若干，用水洗净，浸 水6-12小时，至15℃阴暗处发芽，上面盖纱布一块，每日早、中、晚淋水一次，麦根伸长至麦粒的两倍时，即B、将干麦芽磨碎，一份麦芽加四份水，在65℃水浴中糖化3-4小时，糖化程度可用碘滴定之。加水约20mL，调匀至生泡沫时为止，然后倒在糖化液中搅拌煮沸后再过滤；C、将糖化液用4-6层纱布过滤，滤液如混浊不清，可用鸡蛋白澄清，方法是将一个鸡蛋白加水约20mL，调匀至生泡沫时为止，然后倒在糖化液中搅拌煮沸后再过滤。D、将滤液稀释到5-6波美度2.0L，pH约6.4，加入40g琼脂。121℃灭菌30min，摆斜面，冷凉，无菌操作接种200支试管种。30℃培养72h。
(2)1吨种子液生产：配制发酵液：取5-6波美度麦芽汁培养基1000L，pH自然，发酵罐管消、空消，发酵液实消后，在无菌条件下将200支试管种接入发酵罐内发酵，罐内氧气含量70％-100％，ph控制5.5-7，搅拌转速90转/min-220转/min，控温恒定30℃，发酵18h后下罐无菌条件下接入饲料发酵罐发酵72h。
3、CICC 22635
(1)试管培养基配方：蛋白胨10.0g，牛肉浸取物6.0g，NaCl10.0g，琼脂30.0g，蒸馏水2.0L，pH7.0。无菌操作接种200支试管种。30℃培养18h。
(2)1吨种子液生产：配制发酵液：蛋白胨5000.0g，牛肉浸取物3000.0g，NaCl5000.0g，蒸馏水2000.0L，pH7.0。发酵罐管消、空消，发酵液实消后，在无菌条件下将200支试管种接入发酵罐内发酵，罐内氧气含量80％-100％，ph控制5.5-7，搅拌转速90转/min-220转/min,控温恒定30℃，发酵18h后下罐无菌条件下接入饲料发酵罐发酵。
4、CICC 22585
(1)试管培养基配方：蛋白胨10.0g，牛肉浸取物6.0g，NaCl10.0g，琼脂30.0g，蒸馏水2.0L，pH7.0。无菌操作接种200 支试管种。30℃培养18h。
(2)1吨种子液生产：配制发酵液：蛋白胨5000.0g，牛肉浸取物3000.0g，NaCl5000.0g，蒸馏水2000.0L，pH7.0。发酵罐管消、空消，发酵液实消后，在无菌条件下将200支试管种接入发酵罐内发酵，罐内氧气含量80％-100％，ph控制5.5-7，搅拌转速90转/min-220转/min,控温恒定30℃，发酵18h后下罐无菌条件下接入饲料发酵罐发酵。
5、CICC 22607
(1)试管培养基配方：蛋白胨10.0g，牛肉浸取物6.0g，NaCl10.0g，琼脂30.0g，蒸馏水2.0L，pH7.0。无菌操作接种200支试管种。30℃培养18h。
(2)1吨种子液生产：配制发酵液：蛋白胨5000.0g，牛肉浸取物3000.0g，NaCl5000.0g，蒸馏水2000.0L，pH7.0。发酵罐管消、空消，发酵液实消后，在无菌条件下将200支试管种接入发酵罐内发酵，罐内氧气含量80％-100％，ph控制5.5-7，搅拌转速90转/min-220转/min,控温恒定30℃，发酵18h后下罐无菌条件下接入饲料发酵罐发酵。
6、CICC 10064
(1)试管培养基配方：蛋白胨10.0g，牛肉浸取物6.0g，NaCl10.0g，琼脂30.0g，蒸馏水2.0L，pH7.0。无菌操作接种200支试管种。30℃培养18h。
(2)1吨种子液生产：配制发酵液：蛋白胨5000.0g，牛肉浸取物3000.0g，NaCl5000.0g，蒸馏水2000.0L，pH7.0。发酵罐管消、空消，发酵液实消后，在无菌条件下将200支试管种接入发酵罐内发酵，罐内氧气含量50％-100％，ph控制5.5-7，搅拌转速90转/min-220转/min,控温恒定30℃，发酵18h后下罐无菌条件下接入饲料发酵罐发酵。
7、CICC 10089
(1)试管培养基配方：NaCl 10.0g，牛肉膏20.0g，蛋白胨20.0g，琼脂40.0g，蒸馏水2.0L，pH7.2。无菌操作接种200支试管种。30℃培养18h。
(2)1吨种子液生产：配制发酵液：蛋白胨10000.0g，牛肉浸取物1000.0g，NaCl5000.0g，蒸馏水2000.0L，pH7.0。发酵罐管消、空消，发酵液实消后，在无菌条件下将200支试管种接入发酵罐内发酵，罐内氧气含量600％-100％，ph控制5.5-7，搅拌转速90转/min-220转/min,控温恒定30℃，发酵18h后下罐无菌条件下接入饲料发酵罐发酵。
8、CICC 6239
(1)试管培养基配方：酪胨10.0g，牛肉粉8.0g，酵母粉4.0g，葡萄糖20.0g，硫酸镁0.2g，乙酸钠5.0g，柠檬酸三铵2.0g，磷酸氢二钾2.0g，硫酸锰0.05g，琼脂15.0g，蒸馏水1000mL。pH6.2±0.2。121℃湿热灭菌15min，无菌操作接种100支试管种。好氧，37℃培养18h。
(2)0.5吨种子液生产：配制发酵液：酪胨5000.0g，牛肉粉4000.0g，酵母粉2000.0g，葡萄糖10000.0g，硫酸镁100g，乙酸钠2500.0g，柠檬酸三铵1000.0g，磷酸氢二钾1000.0g，硫酸锰25g，蒸馏水500.0L，pH自然。发酵罐管消、空消，发酵液实消后，在无菌条件下将100支试管种接入发酵罐内发酵，罐内氧气含量70％-100％，ph自然，搅拌转速90转/min-220转/min,控温恒定37℃，发酵18h后下罐无菌条件下接入饲料发酵罐发酵。
9、CICC 6257
(1)试管培养基配方：酪胨10.0g，牛肉粉8.0g，酵母粉4.0g，葡萄糖20.0g，硫酸镁0.2g，乙酸钠5.0g，柠檬酸三铵2.0g，磷酸氢二钾2.0g，硫酸锰0.05g，吐温80 1.0g，蒸馏水1000mL。 pH6.2±0.2。无菌操作接种100支试管种。37℃培养18h。
(2)0.5吨种子液生产：配制发酵液：酪胨10000.0g，牛肉粉8000.0g，酵母粉4000.0g，葡萄糖20000.0g，硫酸镁200g，乙酸钠5000.0g，柠檬酸三铵2000.0g，磷酸氢二钾2000.0g，硫酸锰50g，蒸馏水1000mL。pH6.2±0.2。发酵罐管消、空消，发酵液实消后，在无菌条件下将200支试管种接入发酵罐内发酵，罐内氧气含量600％-100％，ph控制5.5-7，搅拌转速90转/min-220转/min,控温恒定37℃，发酵18h后下罐无菌条件下接入饲料发酵罐发酵。
10、CICC 6258
(1)试管培养基配方：酪胨10.0g，牛肉粉8.0g，酵母粉4.0g，葡萄糖20.0g，硫酸镁0.2g，乙酸钠5.0g，柠檬酸三铵2.0g，磷酸氢二钾2.0g，硫酸锰0.05g，琼脂15.0g，蒸馏水1000mL。pH6.2±0.2。121℃湿热灭菌15min，无菌操作接种100支试管种。好氧，37℃培养18h。
(2)0.5吨种子液生产：配制发酵液：酪胨5000.0g，牛肉粉4000.0g，酵母粉2000.0g，葡萄糖10000.0g，硫酸镁100g，乙酸钠2500.0g，柠檬酸三铵1000.0g，磷酸氢二钾1000.0g，硫酸锰25g，蒸馏水500.0L，pH自然。发酵罐管消、空消，发酵液实消后，在无菌条件下将100支试管种接入发酵罐内发酵，罐内氧气含量70％-100％，ph自然，搅拌转速90转/min-220转/min,控温恒定37℃，发酵18h后下罐无菌条件下接入饲料发酵罐发酵。
11、CICC 6119
(1)试管培养基配方：酪胨10.0g，牛肉粉8.0g，酵母粉4.0g，葡萄糖20.0g，硫酸镁0.2g，乙酸钠5.0g，柠檬酸三铵2.0g，磷酸氢二钾2.0g，硫酸锰0.05g，蒸馏水1000mL。pH6.2±0.2。蒸馏水1.0L，琼脂15g，121℃湿热灭菌15min，无菌操作接种100支试管种。好氧，37℃培养18h。
(2)0.5吨种子液生产：配制发酵液：酪胨5000.0g，牛肉粉4000.0g，酵母粉2000.0g，葡萄糖10000.0g，硫酸镁100g，乙酸钠2500.0g，柠檬酸三铵1000.0g，磷酸氢二钾1000.0g，硫酸锰25g，蒸馏水500.0L，pH自然。发酵罐管消、空消，发酵液实消后，在无菌条件下将100支试管种接入发酵罐内发酵，罐内氧气含量60％-100％，pH控制5.5-7，搅拌转速90转/min-220转/min,控温恒定37℃，发酵18h后下罐无菌条件下接入饲料发酵罐发酵。
12、CICC 21240
(1)试管培养基配方：蛋白胨5.0g，牛肉浸取物3.0g，NaCl 5.0g，琼脂15.0g，蒸馏水1.0L，pH7.0，蒸馏水1000mL。pH6.2±0.2。蒸馏水1.0L，琼脂15g，121℃湿热灭菌15min，无菌操作接种100支试管种。好氧，37℃培养18h。
(2)0.5吨种子液生产：配制发酵液：蛋白胨2500.0g，牛肉浸取物1500.0g，NaCl2500.0g，蒸馏水500.0L，pH自然。发酵罐管消、空消，发酵液实消后，在无菌条件下将100支试管种接入发酵罐内发酵，罐内氧气含量80％-100％，pH自然，搅拌转速90转/min-220转/min,控温恒定37℃，发酵18h后下罐无菌条件下接入饲料发酵罐发酵。
13、CICC 6192
(1)试管培养基配方：肉汁10g，蛋白胨5g，酵母粉3g，D(+)-葡萄糖5g，淀粉1g，NaCl5g，NaAc 3g，L-半胱氨酸盐酸盐0.5g，蒸馏水1.0L，琼脂15g，121℃湿热灭菌15min，无菌操作接种100支试管种。厌氧，37℃培养18h。
(2)0.5吨种子液生产：配制发酵液：肉汁5000g，蛋白胨2500g，酵母粉1500g，D(+)-葡萄糖2500g，淀粉500g，NaCl 2500g，NaAc1500g，L-半胱氨酸盐酸盐250g，蒸馏水1000.0L，pH自然。发酵罐管消、空消，发酵液实消后，在无菌条件下将200支试管种接入 发酵罐内发酵，罐内抽成无氧气状态，pH控制5.5-7，搅拌转速90转/min-220转/min，控温恒定37℃，发酵18h后下罐无菌条件下接入饲料发酵罐发酵。
14、CICC 6241
(1)试管培养基配方：酪胨10.0g，牛肉粉8.0g，酵母粉4.0g，葡萄糖20.0g，硫酸镁0.2g，乙酸钠5.0g，柠檬酸三铵2.0g，磷酸氢二钾2.0g，硫酸锰0.05g，蒸馏水1000mL。pH6.2±0.2。蒸馏水1.0L，琼脂15g，121℃湿热灭菌15min，无菌无氧操作接种100支试管种。厌氧，37℃培养18h。
(2)0.5吨种子液生产：配制发酵液：酪胨5000.0g，牛肉粉4000.0g，酵母粉2000.0g，葡萄糖10000.0g，硫酸镁100g，乙酸钠2500.0g，柠檬酸三铵1000.0g，磷酸氢二钾1000.0g，硫酸锰25g，蒸馏水500.0L，pH自然。发酵罐管消、空消，发酵液实消后，在无菌条件下将100支试管种接入发酵罐内发酵，罐内抽成无氧气状态，pH控制5.5-7，搅拌转速90转/min-220转/min，控温恒定37℃，发酵18h后下罐无菌条件下接入饲料发酵罐发酵。
绞股蓝全草粉的制备方法为：将干燥的绞股蓝全草用膨化机常温膨化，粉粹后过60目筛，备用。
枯草芽孢杆菌SE201412的分离鉴定方法如下：
分离：从湖北恩施市盐业复烤厂发酵烟草废弃物中取材料1g，在无菌超净工作台上，用无菌水振荡稀释10-1-10-8，用移液管取0.1ml-0.2ml移入已灭菌倒有专用培养基(自来水1000ml，硒(由亚硒酸钠提供)5g、20g葡萄糖、15g蛋白胨、5g氯化钠、0.5g牛肉膏升、酵母膏0.25％、磷酸氢二钾0.1％、PH 7.5)的培养皿上，用涂布棒涂匀，无菌培养，选取在高硒培养基上生长旺盛的单菌落。
鉴定：经鉴定，该菌株形态或生理生化特征是：革兰氏染色阳性、细胞杆状、直径＜1um、如图1所示，形成芽孢，不膨大，无伴胞晶体； 接触酶、氧化酶阳性，好氧生长，VP试验阳性，VP＜PH6试验阳性，VP＞PH7试验阴性，甲基红试验阴性，利用葡萄糖、木糖、L-阿拉伯糖、甘露醇产酸；利用葡萄糖不产气；利用柠檬酸盐，还原硝酸盐，水解淀粉、液化明胶、分解酪素。在PH6、7％NaCl、70℃均生长。
根据细胞形态、生化实验结果和基因序列测定结果，该菌株SE201412鉴定为枯草芽孢杆菌Bacillus Subtilis，已于2015年11月26日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC；地址：中国武汉，武汉大学；邮编：430072)，保藏编号CCTCC No.M2015708。
该菌株的显微镜观察照片、平板菌落形态、进化树分别如图1、图2、图3所示。表1列出了该菌株16S rRNA基因测序BLAST结果，表2，表3列出了该菌株的生理生化特性。
表1菌株SE201412 16S rRNA基因测序BLAST结果
表2菌株SE201412生理生化特性–酶活、碳源同化
+：阳性反应；-：阴性反应
表3菌株SE201412生理生化特性--利用碳源产酸
+：阳性反应；-：阴性反应；W：弱阳性
水溶性有机硒的制备方法为：
(1)枯草芽孢杆菌SE201412试管种活化培养：将10g蛋白胨、3g牛肉膏、5g氯化钠溶于1L蒸馏水中，调节pH为7.2，然后加入琼脂，加温溶解均匀后分装于烧瓶内并用封口膜封口，置伽马射线辐照机灭菌辐照剂量2.5kGy灭菌，然后置微波器中将培养基加热成流体，即得培养基；每根试管中倒入10ml培养基，摆斜面，冷却，凝固，置超净工作台，接入用冰箱储藏的益生菌No.M Se2015708，每根试管用接种环接一环，塞上泡沫塞，置28℃～32℃条件下培养3-5天，用于种子液生产。
(2)枯草芽孢杆菌SE201412种子液培养：将1000g蛋白胨，300g牛肉膏、500g氯化钠溶于100L自来水中，调节其pH为7.2，用伽马 射线辐照机2.5kGy灭菌后，接入步骤(1)的试管种，控制搅拌速度150～190转/min，溶氧80％-100％，pH6～7，温度28℃～32℃发酵20h。
(3)水溶性有机硒制备：将10000g蛋白胨，3000g牛肉膏，5000g氯化钠，0.3kg亚硒酸钠溶于1000L自来水中，并调节其pH为7.2，即得发酵培养基；将所述发酵培养基置伽马射线辐照机2.5kGy灭菌，接入步骤(2)的种子液100L，控制搅拌速度150～190转/min，溶氧80％-100％，pH6～7，温度28℃～32℃发酵20h，即得200mg/L有机硒菌液体。
实施例1
一种绿色富有机硒饲料的制备方法，包括如下步骤：
(1)配制发酵原料：将玉米面8吨、豆饼4吨、面粉2吨、绞股蓝全草粉2.4吨，麦麸1吨，玉米秆2吨，进口鱼粉0.6吨、食盐1吨、乳酸铁1.4kg、葡萄糖酸锌2kg、葡萄糖酸镁0.170kg混合均匀，即得；
(2)有氧发酵：将步骤(1)的发酵原料接入发酵罐中，在60-82℃下灭菌30min，将培养好的CICC 31188产朊假丝酵母种子液按罐内物料10％量通过无菌雾化器喷入罐内发酵，发酵12h，然后将CICC 10063、CICC 10089枯草芽胞杆菌(等份混合后)按物料的8％量喷雾入发酵罐内，发酵8h；通过发酵系统喷菌液口将培养好的CICC 22635枯草芽胞杆菌枯草亚种、CICC 22585枯草芽胞杆菌枯草亚种、CICC22607枯草芽胞杆菌、CICC 10064谷氨酸棒杆菌等份混合后按物料的3％喷雾入发酵罐内，有氧发酵8h；整个有氧发酵过程中，控制罐内氧气含量70％-100％，pH 5.5-7，搅拌转速200转/min，温度30℃；
(3)无氧发酵：有氧发酵结束后，通过发酵系统喷菌液口将培养好的CICC 6257植物乳杆菌益生菌种子液、CICC 6192长双歧杆菌种子液，CICC 6119罗伊氏乳杆菌种子液、CICC 6241嗜酸乳杆菌种子液，CICC 21240枯草芽胞杆菌种子液等份混合后按物料的7％喷雾入发酵罐内发酵，无氧发酵15h；通过发酵系统喷菌液口将培养好的CICC 6258 乳杆菌种子液等份混合后按物料的1％-10％加入发酵罐中，整个无氧发酵过程中，温度25℃-30℃，pH 5.5-7，搅拌转速200转/min，发酵3h-12h；
(4)加入有机硒和低聚木糖：结束无氧发酵前，通过发酵罐喷淋口在无菌条件下喷入CCTCC No.M2015708菌生产的有机硒发酵液和低聚木糖，搅拌均匀，使物料含有机硒0.2mg/kg-0.5mg/kg，低聚木糖达到0.7g/kg-1.4g/kg，然后用30℃-60℃无菌热空气搅拌烘干至含水量10％以下下罐包装即得。
该饲料适用于生长猪食用。
实施例2
一种绿色富有机硒饲料的制备方法，该实施例的方法同实施例1，其区别仅在于发酵原料不同，本实施例的发酵原料为：1.7吨玉米面，1.5吨豆饼，3.36吨面粉，1.5吨绞股蓝全草粉，0.7吨麦麸，0.3吨鱼粉，0.5吨食盐，0.7kg乳酸铁，1kg葡萄糖酸锌，0.085kg葡萄糖酸镁。
该实施例的饲料适用于断奶猪食用。
实施例3
该实施例使用申请号为201510736852.1，名称为卧式固体发酵系统进行发酵生产。发酵原料和发酵方法同实施例1。
(1)调试机器：首先开机调试校正将20吨卧式固体发酵系统的无菌热冷风发生辅机和中央控制台自动控温电极、控氧气电极、控ph电极、控搅拌速度仪表---升温121℃热空气进行罐体管道消灭菌20min-30min和管道灭菌20min-30min，空消结束后吹4℃-8℃无菌冷风将罐体管道冷却到常温，用常温无菌空气维持管道0.5pa正压---升温121℃热空气进行罐体内空消灭菌20min-30min和管道灭菌20min-30min，空消结束后吹4℃-8℃无菌冷风将罐体冷却到90℃---通过自动加料管道系统将配好的物料输入发酵罐中，升温60～82℃热空气进行罐体内巴氏灭菌30min并维持0.5pa正压。
(2)有氧发酵：将步骤(1)的发酵原料接入发酵罐中，在60-82℃下灭菌30min，将培养好的CICC 31188产朊假丝酵母种子液按罐内物料6％量通过无菌雾化器喷入罐内发酵，发酵7h，然后将CICC 10063、CICC 10089枯草芽胞杆菌(等份混合后)按物料的10％量喷雾入发酵罐内，发酵12h；通过发酵系统喷菌液口将培养好的CICC 22635枯草芽胞杆菌枯草亚种、CICC 22585枯草芽胞杆菌枯草亚种、CICC22607枯草芽胞杆菌、CICC 10064谷氨酸棒杆菌等份混合后按物料的1％喷雾入发酵罐内，有氧发酵6h；整个有氧发酵过程中，控制罐内氧气含量70％-100％，pH 5.5-7，搅拌转速200转/min，温度30℃；
(3)无氧发酵：有氧发酵结束后，通过发酵系统喷菌液口将培养好的CICC 6257植物乳杆菌益生菌种子液、CICC 6192长双歧杆菌种子液，CICC 6119罗伊氏乳杆菌种子液、CICC 6241嗜酸乳杆菌种子液，CICC 21240枯草芽胞杆菌种子液等份混合后按物料的2％喷雾入发酵罐内发酵，无氧发酵5h；通过发酵系统喷菌液口将培养好的CICC 6258乳杆菌种子液等份混合后按物料的1％-10％加入发酵罐中，整个无氧发酵过程中，温度25℃-30℃，pH5.5-7，搅拌转速200转/min，发酵3h-12h；
(4)加入有机硒和低聚木糖：结束无氧发酵前，通过发酵罐喷淋口在无菌条件下喷入CCTCC No.M2015708菌生产的有机硒发酵液和低聚木糖，搅拌均匀，使物料含有机硒0.2mg/kg-0.5mg/kg，低聚木糖达到0.7g/kg-1.4g/kg，然后用30℃-60℃无菌热空气搅拌烘干至含水量10％以下下罐包装即得。
对本发明实施例1生产的饲料进行检测，结果如表4所示：
表4：饲料检测结果
备注：方法依据为GB/T 13090-2006，GB/T 13083-2002，GB/T 13085-2005，GB/T13084-2006，GB/T 5009.17-2003，GB/T 5009.11-2003，GB/T 5009.123-2003，GB/T5009.15-2003，GB/T 5009.12-2010，SB/T 10387-2004，GB/T 20764-2006，农业部1025号公告-26-2008，农业部1063-6-2008号公告；GB/T 21316-2007，GB/T 8381.7-2009，NY/T1372-2007。
采用本发明实施例1的饲料饲喂生长猪，生产的猪肉送往农业部食品质量监督检验测试中心(成都)检测，结果如表5所示：
表5：猪肉检测结果
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种绿色富有机硒饲料的制备方法，其特征在于：包括对含绞股蓝全草粉的发酵原料依次进行有氧发酵和无氧发酵生产发酵液的步骤。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：以重量份计，所述发酵原料包括1-10份玉米面，1-5份豆饼或花生饼，1-5份面粉，1-3份绞股蓝全草粉，0.5-1.5份麦麸，0-3份含硒或不含硒玉米秆，0.1-1份鱼粉，0.3-1.5份食盐，0.0005-0.002份Fe3+，0.0005-0.003份Zn2+，0.00005-0.0003份Mg2+。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于：所述绞股蓝全草粉是将绞股蓝全草经膨化、粉碎后过50-70目筛得到。
4.根据权利要求1-3任一项所述的制备方法，其特征在于：所述有氧发酵分为三个阶段，第一阶段为：向发酵原料中接入CICC 31188产朊假丝酵母菌株种子液，发酵6-12h；第二阶段为：向发酵液中接入CICC 10063解淀粉芽孢杆菌和CICC 10089枯草芽孢杆菌菌株的种子液，发酵6-12h；第三阶段为：向发酵液中接入CICC 22585枯草芽孢杆菌亚种、CICC 22635枯草芽孢杆菌亚种、CICC 22607枯草芽孢杆菌、和CICC 10064谷氨酸棒杆菌菌株的种子液，发酵6-12h；
优选地，第二阶段，CICC 10063解淀粉芽孢杆菌和CICC 10089枯草芽孢杆菌菌株的种子液按1:(0.8-1.2)的体积比加入；第三阶段，CICC 22585枯草芽孢杆菌亚种、CICC 22635枯草芽孢杆菌亚种、CICC 22607枯草芽孢杆菌、和CICC 10064谷氨酸棒杆菌菌株的种子液按1:(0.8-1.2):(0.8-1.2):(0.8-1.2)的体积比加入；
进一步优选地，第一、二阶段，种子液的接入量为5-10％，第三阶段，种子液的接入量为1-5％。
5.根据权利要求1-4任一项所述的制备方法，其特征在于：所述无氧发酵分为两个阶段，第一阶段为：有氧发酵结束后，向发酵液 中接入CICC 6257植物乳杆菌，CICC 6129长双岐杆菌，CICC 6119罗伊氏乳杆菌，ICC6241嗜酸乳杆菌，和CICC 21240枯草芽孢杆菌菌株的种子液，发酵3-18h；第二阶段为，向发酵液中接入CICC 6258乳杆菌、CICC 6239短乳杆菌株的种子液，发酵3-12h；
优选地，第一阶段，CICC 6257植物乳杆菌，CICC 6129长双岐杆菌，CICC 6119罗伊氏乳杆菌，ICC6241嗜酸乳杆菌，和CICC 21240枯草芽孢杆菌菌株的种子液按1:(0.8-1.2):(0.8-1.2):(0.8-1.2):(0.8-1.2)的体积比加入；第二阶段，CICC 6258乳杆菌、CICC 6239短乳杆菌株种子液按1：(0.8-1.2)体积比加入；
进一步优选地，两个阶段菌株的接种量均为1-10％。
6.根据权利要求1-5任一项所述的制备方法，其特征在于：所述有氧发酵和无氧发酵在25-30℃，pH 5.5-7，90-220转/min搅拌下进行。
7.根据权利要求1-6任一项所述的制备方法，其特征在于：还包括向发酵结束后的发酵液中加入有机硒和/或低聚木糖，烘干发酵液的步骤；
优选地，所述有机硒的加入量为0.1-0.5mg/kg，所述低聚木糖的加入量为0.7-1.4g/kg。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于：所述有机硒以含有机硒的发酵液形式加入，所述含有机硒的发酵液是以枯草芽孢杆菌SE201412为发酵菌，对含硒培养基发酵而得，枯草芽孢杆菌SE201412的保藏编号为CCTCC No.M2015708。
9.权利要求1-8任一项所述的制备方法得到的绿色富有机硒饲料。
10.权利要求9所述的绿色富有机硒饲料在猪饲养中的应用。
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