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CN105980576B - 用于源自乳腺癌的骨转移癌的预后和治疗的方法 - Google Patents

用于源自乳腺癌的骨转移癌的预后和治疗的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及用于HER2+乳腺癌中的骨转移的预后的方法，其包括测定MAF基因在原发性肿瘤样品中是否扩增。类似地，本发明还涉及用于测定就其他器官中的转移而言发展骨转移的趋势的方法，其包括测定MAF基因表达水平、扩增或易位。本发明还涉及用于预测患有乳腺癌的受试者中的早期骨转移的方法。本发明还涉及作为用于治疗HER2+乳腺癌转移的治疗试剂的c‑Maf抑制剂。本发明涉及用于预测骨转移和预测患有骨转移的受试者的临床结果的试剂盒。最后，本发明涉及用于对患有乳腺癌的受试者进行分型和用于将患有乳腺癌的受试者分类成同类者的方法。

Description

用于源自乳腺癌的骨转移癌的预后和治疗的方法
关于序列表
与本申请一起提交的电子递交的序列表(“3190_011PC01_SequenceListing_ascii.txt”，48,430字节，于2014年10月7日创建)的内容通过引用全文并入本文。
发明背景
发明领域
在一个实施方案中，本发明涉及基于测定原发性肿瘤样品中的MAF基因水平和/或16q23或16q22-24基因座扩增或易位，预后ERBB2阳性(人上皮受体2阳性，HER2+)乳腺癌中的骨转移。类似地，在一个实施方案中，本发明还涉及用于设计患有ERBB2阳性(人上皮受体2阳性，HER2+)乳腺癌的受试者中的定制疗法的方法，其包括测定MAF基因表达水平和/或16q23或16q22-24基因座扩增或易位。最后，在另一个实施方案中，本发明涉及使用c-Maf抑制剂作为HER2+乳腺癌转移特别是骨转移的治疗中的治疗试剂。
背景技术
乳腺癌是全世界第二大最常见的癌症类型(10.4％；在肺癌之后)，和第五大最常见的癌症死亡原因(在肺癌、胃癌、肝癌和结肠癌之后)。在女性中，乳腺癌是最常见的癌症死亡原因。在2005年，乳腺癌引起全世界502,000例死亡(癌症死亡的7％；所有死亡的几乎1％)。全世界的病例数目已从二十世纪七十年代开始显著增加，部分是由于西方世界的现代生活方式导致的现象。
乳腺癌根据TNM系统被分类为阶段。(参见American Joint Committee onCancer.AJCC Cancer Staging Manual.第6版New York，NY:Springer，2002，其通过引用全文并入本文)。预后与阶段分类的结果紧密相关，并且阶段分类还用于将患者指定至临床试验和医疗实践中的治疗。用于分类成阶段的信息如下：
·TX：原发性肿瘤无法进行评估。T0：不存在肿瘤的证据。Tis：原位癌，无侵袭。T1：肿瘤是2cm或更少。T2：肿瘤超过2cm但小于5cm。T3：肿瘤超过5cm。T4：在乳腺或皮肤的壁中生长的任何尺寸的肿瘤，或炎性乳腺癌。
·NX：附近的淋巴结无法进行评估。N0：癌症未扩散至局部淋巴结。N1：癌症已扩散至1至3个腋窝淋巴结或一个内乳淋巴结。N2：癌症已扩散至4至9个腋窝淋巴结或多个内乳淋巴结。N3：应用下述之一：
■癌症已扩散至10个或更多个腋窝淋巴结，或癌症已扩散至锁骨下淋巴结，或癌症已扩散至锁骨上淋巴结或癌症影响腋窝淋巴结且已扩散至内乳淋巴结，或癌症影响4个或更多个腋窝淋巴结并且最低限度量的癌症在内乳淋巴结或前哨淋巴结活组织检查中。
·MX：远处扩散(转移)的存在无法进行评估。M0：不存在远处扩散。M1：已产生扩散至不包括锁骨上淋巴结的远处器官。
大多数患有实体瘤的患者在转移后死亡的事实意味着理解允许肿瘤转移的分子和细胞机制是至关重要的。近期出版物已证实转移如何通过复杂而知之甚少的机制引起的，以及不同转移细胞类型如何具有朝向特定器官的向性。这些组织特异性转移细胞具有一系列获得功能，从而允许其定殖特定器官。
所有细胞均具有在其表面上、在其胞质中和在细胞核中的受体。某些化学信使例如激素与所述受体结合，并且这引起细胞中的变化。存在可以影响乳腺癌细胞的三种重要受体：雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)和HER2/neu。出于命名具有任何这些受体的细胞的目的，当受体存在时，对其放置正号，并且如果受体不存在，则放置负号：ER阳性(ER+)、ER阴性(ER-)、PR阳性(PR+)、PR阴性(PR-)、HER2阳性(HER2+)和HER2阴性(HER2-)。受体状态已成为所有乳腺癌的关键评价，因为它决定使用特异性治疗例如他莫西芬或曲妥珠单抗的适合性。
无监督基因表达阵列概况分析已通过鉴定固有亚型例如管腔A型、管腔B型、HER2+/ER-和基底样亚型，提供乳腺癌异质性的生物学证据。
HER2+癌症被定义为过表达基因HER2(包括不同水平的过表达)的肿瘤。该亚组占所有类型乳腺癌的30％。它与增加的疾病复发和不良预后强相关。过表达还已知在卵巢癌、胃癌和侵袭性形式的子宫癌例如子宫浆液性子宫内膜癌中发生。
当肿瘤用可能的辅助激素疗法(使用他莫西芬或芳香酶抑制剂)、化学疗法和/或放射疗法局部化时，用于治疗乳腺癌的重点是手术。目前，在手术后的治疗建议(辅助疗法)遵循一定模式。该模式因每两年在瑞士的St.Gallen举行世界会议以讨论全世界多中心研究的实际结果而经历变化。类似地，所述模式也根据美国国立卫生研究院(NationalInstitute of Health)(NIH)的共识标准进行审查。基于这些标准，超过85-90％不具有淋巴结中的转移的患者将是接受辅助全身疗法的候选人。HER2+患者对针对HER2的辅助靶向疗法易感。HER2是单克隆抗体曲妥珠单抗(作为赫赛汀销售)的靶。曲妥珠单抗仅在其中HER2是过表达的癌症中有效。抑制HER2和HER3受体二聚化的备选单克隆抗体例如培妥珠单抗、与药物T-DM1和小抑制剂组合的抗体是潜在的靶向治疗选项。HER2测试在乳腺癌患者中执行，以评估预后且测定用于曲妥珠单抗疗法的适合性。重要的是曲妥珠单抗局限于HER2阳性个体，因为它是昂贵的且已与心脏毒性相关。对于HER2肿瘤，曲妥珠单抗的风险明显超过利益。
测试通常对活组织检查样品执行，所述活组织检查样品通过细针抽吸、中心穿刺活组织检查、真空辅助乳腺活组织检查或手术切除获得。免疫组织化学用于测量样品中存在的HER2蛋白质的量。备选地，荧光原位杂交(FISH)可以用于测量存在的基因拷贝数。
目前，基于特异性基因的表达，PCR测定法例如Oncotype DX或微阵列测定法例如MammaPrint可以预测乳腺癌复发的风险。在2007年2月，MammaPrint测定法已成为获得美国食品药品监督管理局(Food and Drug Administration)正式批准的第一个乳腺癌指示剂。
专利申请EP1961825-A1描述了用于预测乳腺癌转移至骨、肺、肝或脑的发生的方法，其包括测定肿瘤组织样品中的一种或多种标志物就其在对照样品中的相应表达水平而言的表达水平，在所述标志物中包括MAF。然而，此文件需要同时测定几种基因，以允许测定乳腺癌患者的存活，并且用于预测无骨转移的生存性的基因标记的能力之间的关联并无统计学意义。
专利申请US2011/0150979描述了用于预测基底样乳腺癌的预后的方法，其包括检测FOXC1的水平。
专利申请US2010/0210738涉及用于预后患有三重阴性乳腺癌的受试者中的癌症的方法，其包括检测样品中一系列基因的表达水平，所述基因是随机上调或下调的。
专利申请US2011/0130296涉及在三重阴性乳腺癌的诊断和预后中有用的标志物基因的鉴定。
存在鉴定新标志物的需要，所述新标志物允许预测患有三重阴性乳腺癌的受试者发展转移的概率。新预后因子的鉴定将充当选择最合适治疗中的指导。
发明概述
在一个方面，本发明涉及用于预测Her2+乳腺癌在患有所述癌症的受试者中的骨转移的体外方法，其包括
i)测定所述受试者的样品中MAF基因的表达水平，和
ii)将步骤i)中获得的表达水平与参考值进行比较，
其中所述基因相对于所述参考值增加的表达水平指示发展骨转移的风险增加。在一些实施方案中，增加的表达水平通过基因座扩增覆盖。在一些实施方案中，增加的表达水平通过基因座易位覆盖。
在另一个方面，本发明涉及用于预测患有骨转移性HER2+乳腺癌的患者的临床结果的体外方法，其包括
i)定量所述受试者的样品中MAF基因的表达水平，和
ii)将步骤i)中获得的表达水平与参考值进行比较，
其中所述基因相对于所述参考值增加的表达水平指示不良临床结果。
在另一个方面，本发明涉及用于设计用于患有HER2+乳腺癌的受试者的定制疗法的体外方法，其包括
i)定量所述受试者的样品中的MAF基因表达水平，和
ii)将步骤i)中获得的表达水平与参考值进行比较，
其中如果表达水平相对于所述参考值增加，则所述受试者对接受旨在预防、抑制和/或治疗骨转移的疗法易感。在此方法的特定方面，受试者随后施用预防、抑制和/或治疗骨转移的至少一种治疗药物。如果表达水平相对于所述参考值不增加，则所述受试者对接受旨在预防、抑制和/或治疗骨转移的疗法不易感。在此方法的特定方面，受试者随后不施用预防、抑制和/或治疗骨转移的至少一种治疗药物。
在另一个方面，本发明涉及用于测定患有乳腺癌例如HER2+乳腺癌的受试者中的骨转移风险的方法，其包括测定所述受试者的样品中MAF基因的表达水平，其中所述基因的表达水平超过平均值加一个标准差指示早期骨转移的风险增加。在此方法的特定方面，受试者随后施用预防或抑制骨转移的至少一种治疗药物。
在另一个方面，本发明涉及用于设计用于患有HER2+乳腺癌伴随骨转移的受试者的定制疗法的体外方法，其包括
i)定量所述受试者的骨转移样品中的MAF基因表达水平，和
ii)将步骤(i)中获得的表达水平与参考值进行比较，
其中如果MAF基因表达水平相对于所述参考值增加，则所述受试者对接受用于预防骨降解的疗法易感。在此方法的特定方面，受试者随后施用预防、抑制和/或治疗骨转移的至少一种治疗药物。
如果MAF基因表达水平相对于所述参考值不增加，则所述受试者对接受用于预防骨降解的疗法不易感。在此方法的特定方面，受试者随后不施用预防、抑制和/或治疗骨转移的至少一种治疗药物。
在另一个方面，本发明涉及用于预测Her2+乳腺癌在患有所述癌症的受试者中的骨转移的体外方法，其包括相对于参考基因拷贝数，测定MAF基因在所述受试者的样品中是否扩增，其中就所述参考基因拷贝数而言MAF基因的扩增指示发展骨转移的风险增加。在此方法的特定方面，受试者随后施用预防或抑制骨转移的至少一种治疗药物。
在另一个方面，本发明涉及用于预测乳腺癌例如HER2+乳腺癌在患有所述癌症的受试者中的骨转移的体外方法，其包括测定MAF基因在所述受试者的样品中是否易位，其中MAF基因的易位指示发展骨转移的风险增加。在此方法的特定方面，受试者随后施用预防或抑制骨转移的至少一种治疗药物。
在另一个方面，本发明涉及用于预测患有HER2+乳腺癌的患者的临床结果的体外方法，其包括相对于参考基因拷贝数，测定MAF基因在所述受试者的样品中是否扩增，其中就所述参考基因拷贝数而言MAF基因的扩增指示不良临床结果。在此方法的特定方面，受试者随后施用预防、抑制和/或治疗骨转移的至少一种治疗药物。如果未观察到这样的扩增，则受试者随后不施用预防、抑制和/或骨转移的至少一种治疗药物。在另一个实施方案中，本发明涉及用于预测患有HER2+乳腺癌的患者的临床结果的体外方法，其包括测定MAF基因在所述受试者的样品中是否易位，其中MAF基因(即t(14,16))的易位指示不良临床结果。在一些实施方案中，本发明涉及设计用于具有MAF扩增或易位的患者的定制疗法。在一些实施方案中，定制疗法是预防、抑制和/或治疗骨转移的至少一种治疗药物。
在另一个方面，本发明涉及用于预防来自HER2+乳腺癌的骨转移的c-Maf抑制试剂。
在另一个方面，本发明涉及c-Maf抑制试剂或者能够避免或防止骨降解的试剂，其用于治疗受试者中的骨转移，所述受试者患有HER2+乳腺癌，并且在转移样品中具有就对照样品而言升高的MAF水平。
在另一个方面，本发明涉及用于预测Her2+乳腺癌在患有所述癌症的受试者中的骨转移的试剂盒，该试剂盒包括：a)用于定量所述受试者的样品中的MAF表达水平的手段；和b)用于比较所述样品中定量的MAF表达水平与参考MAF表达水平的手段。本发明还涉及这样的试剂盒预测Her2+乳腺癌在患有所述癌症的受试者中的骨转移的用途。在一个实施方案中，随后基于使用试剂盒的结果，给受试者施用或不施用预防、抑制和/或治疗骨转移的至少一种治疗药物。
例如，KRAS突变患者不接受抗EGFR疗法(即西妥昔单抗)，因为它靶向KRAS上游的受体，因此突变使得任何上游动作无效，并且患者不获益于疗法。对于KRAS为野生型的患者确实获益于药物的使用，因为其阻断RAS途径。在另一个方面，本发明涉及用于预测Her2+乳腺癌在患有所述癌症的受试者中的骨转移的试剂盒，该试剂盒包括：a)用于测定所述受试者的样品中的MAF基因易位、16q23或16q22-24基因座扩增或易位的手段；和b)用于比较所述样品与参考MAF样品中的MAF基因易位、16q23或16q22-24基因座扩增或易位的手段。本发明还涉及这样的试剂盒预测乳腺癌在患有所述癌症的受试者中的骨转移的用途。在一个实施方案中，随后基于使用试剂盒的结果，给受试者施用或排除预防、抑制和/或治疗骨转移的至少一种治疗药物。
在另一个方面，本发明涉及用于预测Her2+乳腺癌在患有所述癌症的受试者中的骨转移的试剂盒，该试剂盒包括：a)用于定量所述受试者的样品中的MAF基因扩增、16q23或16q22-24基因座扩增或易位的手段；和b)用于比较所述样品与参考中的MAF基因扩增水平、16q23或16q22-24基因座扩增或易位的手段。
在另一个方面，本发明涉及用于预测患有来自HER2+乳腺癌的骨转移的受试者的临床结果的试剂盒，该试剂盒包括：a)用于定量所述受试者的样品中MAF的表达水平的手段；和b)用于比较所述样品中定量的MAF表达水平与参考MAF表达水平的手段。本发明还涉及这样的试剂盒预测患有来自HER2+乳腺癌的骨转移的受试者的临床结果的用途。在一个实施方案中，随后基于使用试剂盒的结果，给受试者施用或不施用预防、抑制和/或治疗骨转移的至少一种治疗药物。
在另一个方面，本发明涉及用于确定患有Her2+乳腺癌的受试者的疗法的试剂盒，该试剂盒包括：a)用于定量所述受试者的样品中MAF的表达水平的手段；b)用于比较所述样品中定量的MAF表达水平与参考MAF表达水平的手段；和c)用于基于定量的表达水平与参考表达水平的比较，确定用于预防和/或减少所述受试者中的骨转移的疗法的手段。本发明还涉及这样的试剂盒用于确定用于患有乳腺癌的受试者的疗法的用途。在一个实施方案中，随后基于使用试剂盒的结果，给受试者施用或不施用预防、抑制和/或治疗骨转移的至少一种治疗药物。
在另一个方面，本发明涉及包括下述的试剂盒：i)用于定量患有HER2+乳腺癌的受试者的样品中MAF的表达水平的试剂；和ii)已预定为与骨转移的风险关联的一种或多种MAF表达水平指数。本发明还涉及这样的试剂盒预测Her2+乳腺癌在患有所述癌症的受试者中的骨转移的用途。在一个实施方案中，随后基于使用试剂盒的结果，给受试者施用或不施用预防、抑制和/或治疗骨转移的至少一种治疗药物。
在另一个方面，本发明涉及用于对患有Her2+乳腺癌的受试者的样品进行分型的体外方法，此方法包括：
a)提供来自所述受试者的样品；
b)定量所述样品中MAF的表达水平；
c)通过比较定量的MAF表达水平与预定的MAF表达参考水平来对所述样品进行分型；
其中所述分型提供与所述受试者中的骨转移风险相关的预后信息。在一个实施方案中，基于通过分型提供的预后信息，给受试者施用或不施用至少一种治疗试剂。
在另一个方面，本发明涉及用于预防或减少患有HER2+乳腺癌的受试者中的骨转移风险的方法，所述方法包括给所述受试者施用预防或减少骨转移的试剂，其中所述试剂依照由定量所述受试者中MAF的表达水平确定的治疗方案进行施用。
在另一个方面，本发明涉及将患有Her2+乳腺癌的受试者分类成同类者的方法，其包括：a)测定所述受试者的样品中MAF的表达水平；b)比较所述样品中MAF的表达水平与预定的MAF表达参考水平；和c)基于样品中的所述MAF表达水平，将所述受试者分类成同类者。在一个特定方面，同类者用于进行临床试验。
附图简述
图1：16q22-24，包含与乳腺癌原发性肿瘤中的骨转移发病率相关的MAF基因。
a)使用在16q22-24DNA扩增区内的16q23区域探针和CEP16(16q11.2)探针的FISH，以测量HER2+原发性乳腺癌组织中的16q22-24DNA扩增。不具有16q23扩增(情形1，16q23/CEP16 CNA<1.5个拷贝)和具有16q23扩增(情形2，16q23/CEP16 CNA>1.5个拷贝)的患者样品的代表性图像。
b)使用骨中复发前的死亡作为I、II和III期BC人原发性肿瘤数据集(n＝334)中的竞争事件，在任何时间的骨转移的累积发病率。基于1.5个16q23/CEP16拷贝/细胞的截断值，将患者根据16q23/CEP16 CNA阴性(<1.5)和16q23/CEP16 CNA阳性(>或＝1.5)组进行分层。评分最少50个细胞/核心和3个核心/肿瘤。HR-危害比，CI-置信区间。
发明详述
一般术语和表述的定义
当在本文中使用时，“和/或”应视为两个指定特征或组分各自含或不含另一种的特定公开内容。例如，“A和/或B”应视为(i)A、(ii)B以及(iii)A和B各自的特定公开内容，如同各自在本文中个别示出一样。
如本文使用的，“用于避免或防止骨降解的试剂”是指能够通过刺激成骨细胞增殖或抑制破骨细胞增殖或固定骨结构预防、抑制、治疗、减少或停止骨降解的任何分子。
如本文使用的，术语“基因的扩增”是指基因或基因片段的各个拷贝在个体细胞或细胞系中形成的过程。基因的拷贝不一定位于相同染色体中。复制区域通常称为“扩增子”。通常，所产生的mRNA量即基因表达水平也与特定基因的拷贝数成比例增加。
如本文使用的，“HER2+”指特征在于这样的肿瘤细胞的乳腺癌，所述肿瘤细胞具有表皮生长因子受体2型(HER2或ErbB2)(通常位于细胞表面上的受体)的可检测表达和/或HER2基因的扩增。如本文使用的，如果当用HercepTestTM试剂盒(Code K5204，Dako NorthAmerica，Inc.，Carpinteria，CA)(使用多克隆抗HER2一级抗体的半定量免疫组织化学测定)进行测试时，肿瘤细胞获得0或1+、或2+的测试结果得分，或如果它们是HER2 FISH阴性的，则它们视为HER2过表达阴性。
如本文使用的，“c-MAF基因”或“MAF”(v-maf肌肉腱膜纤维肉瘤癌基因同系物(禽类)，也称为MAF或MGC71685)是含有亮氨酸拉链的转录因子，其如同同二聚体或异二聚体起作用。取决于DNA结合位点，所编码蛋白质可以是转录激活物或阻遏物。编码MAF的DNA序列在NCBI数据库中在登录号NG_016440(SEQ ID NO:1(编码))中进行描述。MAF的基因组序列在SEQ ID NO:13中阐述。本发明的方法可以利用编码序列或基因组DNA序列。两种信使RNA由所述DNA序列转录，其各自产生两种MAF蛋白质同种型(α同种型和β同种型)之一。关于所述同种型各自的互补DNA序列分别在NCBI数据库中在登录号NM_005360.4(SEQ ID NO:2)和NM_001031804.2(SEQ ID NO:3)下进行描述。MAF基因预测癌症预后的用途在例如下述中发现：国际申请号PCT/IB2013/001204和PCT/ES2011/070693，以及美国申请号13/878,114和13/878,114(三重阴性乳腺癌和ER+乳腺癌)，国际申请号PCT/US2014/026154(肾细胞癌)，国际申请号PCT/US2014/028722(乳腺癌)，国际申请号PCT/US2013/044584(肺癌)，美国申请号14/050,262和国际申请号PCT/IB2013/002866(前列腺癌)，美国申请号14/213,670和国际申请号PCT/US2014/028569(转移性癌)，所述申请各自在此通过引用全文并入。
如本文使用的，“MAF抑制试剂”指能够通过阻止MAF基因的表达产物产生(中断MAF基因转录和/或阻断来自MAF基因表达的mRNA的翻译)和通过直接抑制c-Maf蛋白质活性两者来完全或部分抑制MAF基因表达的任何分子。MAF基因表达抑制剂可以使用基于c-Maf用于促进体外细胞增殖的能力的方法进行鉴定，如国际专利公开WO2005/046731(通过引用全文并入本文)中所示，基于抑制剂或测试化合物用于在表达c-Maf的细胞中阻断报道基因在细胞周期蛋白D2启动子或含有c-Maf应答区域(MARE或c-Maf应答元件)的启动子的控制下的转录能力的能力进行鉴定，如国际专利公开WO2008/098351中所述(通过引用全文并入本文)。c-Maf的变体还可以基于抑制剂用于在表达NFATc2和c-Maf的细胞中响应用PMA/离子霉素的刺激阻断报道基因在IL-4启动子的控制下的表达的能力进行鉴定，如美国公开号US2009/048117A中所述(通过引用全文并入本文)。
如本文使用的，雷帕霉素的哺乳动物靶(mTOR)或“mTor”指对应于EC 2.7.11.1的那些蛋白质。mTor酶是丝氨酸/苏氨酸蛋白质激酶，且调节细胞增殖、细胞运动性、细胞生长、细胞存活和转录。
如本文使用的，“mTor抑制剂”指能够通过阻止mTor基因的表达产物产生(中断mTor基因转录和/或阻断来自mTor基因表达的mRNA的翻译)和通过直接抑制mTor蛋白质活性两者来完全或部分抑制mTor基因表达的任何分子。包括具有双重或更多种靶并且其中包含mTor蛋白质活性的抑制剂。
如本文使用的，“Src”指对应于EC 2.7.10.2的那些蛋白质。Src是非受体酪氨酸激酶和原癌基因。Src可以在细胞生长和胚胎发育中起作用。
如本文使用的，“Src抑制剂”指能够通过阻止Src基因的表达产物产生(中断Src基因转录和/或阻断来自Src基因表达的mRNA的翻译)和通过直接抑制Src蛋白质活性两者来完全或部分抑制Src基因表达的任何分子。
如本文使用的，“前列腺素内过氧化物合酶2”、“环氧化酶2”或“COX-2”指对应于EC1.14.99.1的那些蛋白质。COX-2负责将花生四烯酸转换为前列腺素内过氧化物H2。
如本文使用的，“COX-2抑制剂”指能够通过阻止COX-2基因的表达产物产生(中断COX-2基因转录和/或阻断来自COX-2基因表达的mRNA的翻译)和通过直接抑制COX-2蛋白质活性两者来完全或部分抑制COX-2基因表达的任何分子。
如本文使用的，“结果”或“临床结果”指所得到的疾病和/或疾病进展的过程，并且特征可以在于复发、直到复发的时间段、转移、直到转移的时间段、转移灶数目、转移部位数目和/或由于疾病的死亡。例如，良好的临床结果包括治愈、阻止复发、阻止转移和/或在固定时间段内的存活(无复发)，并且不良临床结果包括疾病进展、转移和/或在固定时间段内的死亡。
如本文使用的，术语基因的“表达水平”指受试者的样品中由基因产生的基因产物的可测量数量，其中所述基因产物可以是转录产物或翻译产物。相应地，表达水平可以涉及核酸基因产物例如mRNA或cDNA或多肽基因产物。表达水平来源于受试者的样品和/或一种或多种参考样品，并且可以例如从头检测或对应于先前的测定。例如，如本领域技术人员已知的，可以使用微阵列方法、PCR方法(例如qPCR)和/或基于抗体的方法测定或测量表达水平。
如本文使用的，术语“基因拷贝数”指细胞中的核酸分子的拷贝数。基因拷贝数包括细胞的基因组(染色体)DNA中的基因拷贝数。在正常细胞(非肿瘤细胞)中，基因拷贝数通常是两个拷贝(染色体对的每个成员中的一个拷贝)。基因拷贝数有时包括取自细胞群体样品的基因拷贝数的一半。
当“增加的表达水平”指MAF基因的水平大于参考样品或对照样品中的水平时，它应理解为表达水平。增加的水平可以通过基因或者16q23或16q22-24染色体基因座扩增或易位引起，而不排除其他机制。特别地，当从患者中分离的样品中的表达水平是就参考或对照而言的至少约1.1倍、约1.5倍、约5倍、约10倍、约20倍、约30倍、约40倍、约50倍、约60倍、约70倍、约80倍、约90倍、约100倍或甚至更多时，样品可以视为具有高MAF表达水平。
如本文使用的，“探针”指与特定的目的核酸序列互补的寡核苷酸序列。在一些实施方案中，探针可以对于已知经历易位的染色体区域是特异性的。在一些实施方案中，探针具有特异性标记或标签。在一些实施方案中，标签是荧光团。在一些实施方案中，探针是DNA原位杂交探针，其标记基于铂与核酸和蛋白质的稳定配位结合。在一些实施方案中，探针在美国专利申请12/067532和美国专利申请12/181,399中描述，所述美国专利申请通过引用全文并入，或如Swennenhuis等人“Construction of repeat-free fluorescence in situhybridization probes”Nucleic Acids Research 40(3):e20(2012)中所述。
如本文使用的，“标签”或“标记”指与探针直接或间接结合的任何物理分子，从而允许探针或探测的位置被显现、标记或以其他方式捕捉。
如本文使用的，“易位”指染色体之间的不相等或相等量的染色体材料的交换。在一些情况下，易位在相同染色体上。在一些情况下，易位在不同染色体之间。易位在许多类型的癌症包括乳腺癌和白血病中以高频率发生。易位可以是初级相互易位或更复杂的次级易位。存在涉及免疫球蛋白重链(IgH)基因座的几个初级易位，其被认为构成许多癌症中的初始事件。(Eychène，A.，Rocques，N.和Puoponnot，C.，A new MAFia incancer.2008.Nature Reviews:Cancer.8:683-693.)
如本文使用的，“多倍体”或“多倍性”指示细胞含有超过两个拷贝的目的基因。在一些情况下，目的基因是MAF。在一些实施方案中，多倍性与目的基因的表达累积相关。在一些实施方案中，多倍性与基因组不稳定性相关。在一些实施方案中，基因组不稳定性可以导致染色体易位。
如本文使用的，“全基因组测序”是对生物体的整个基因组在单一时间进行测序的过程。参见例如Ng.，P.C.amd Kirkness，E.F.，Whole Genome Sequencing.2010.Methodsin Molecular Biology.628:215-226。
如本文使用的，“外显子组测序”是对生物体的DNA的整个编码区进行测序的过程。在外显子组测序中，对mRNA进行测序。基因组的非翻译区不包括在外显子组测序中。参见例如Choi，M.等人，Genetic diagnosis by whole exome capture and massively parallelDNA sequencing.2009.PNAS.106(45):19096–19101。
如本文使用的，“转移”应理解为癌症从它在其中起始的器官到不同器官的传播。它一般通过血液或淋巴系统发生。当癌细胞扩散且形成新肿瘤时，后者称为继发性或转移性肿瘤。形成继发性肿瘤的癌细胞很像原始肿瘤的那些。如果乳腺癌例如扩散(转移)至肺，则继发性肿瘤由恶性乳腺癌细胞形成。肺中的疾病是转移性乳腺癌而不是肺癌。在本发明的方法的特定实施方案中，转移是已扩散(转移)至骨的HER2+乳腺癌。
如本文使用的，“预测”指患有HER2+乳腺癌的受试者将发展到远处器官的转移的可能性的测定。如本文使用的，“良好预后”指示受试者预期(例如预测)存活和/或在设定时间段内不具有复发或远处转移或处于具有复发或远处转移的低风险中。术语“低”是相对术语，并且在本申请的背景下，指就临床结果(复发、远处转移等)而言的“低”表达组的风险。“低”风险可以视为比异质癌症患者群体的平均风险更低的风险。在Paik等人(2004)的研究中，总体“低的”复发风险被视为低于15百分比。风险还将根据时间段而改变。时间段可以是例如在癌症的初始诊断之后或在作出预后之后五年、十年、十五年或甚至二十年。
如本文使用的，“不良预后”指示受试者预期例如预测为无法存活和/或在设定时间段内具有复发或远处转移或处于具有复发或远处转移的高风险中。术语“高”是相对术语，并且在本申请的背景下，指就临床结果(复发、远处转移等)而言的“高”表达组的风险。“高”风险可以视为比异质癌症患者群体的平均风险更高的风险。在Paik等人(2004)的研究中，总体“高的”复发风险视为被高于15百分比。风险还将根据时间段而改变。时间段可以是例如在癌症的初始诊断之后或在作出预测之后五年、十年、十五年或甚至二十年。
如本文使用的，“参考值”指用作用于通过患者或从患者中收集的样品的实验室检查获得的值/数据的参考的实验室值。参考值或参考水平可以是绝对值；相对值；具有上限和/或下限的值；一系列值；平均值；中值、平均数值或者与特定对照或基线值相比较的值。参考值可以基于个体样品值，例如得自来自待测试受试者的样品的值，但在较早的时间点。参考值可以基于大量样品，例如来自实足年龄匹配组的受试者群体，或基于包括或排除待测试样品的样品库。
如本文使用的，“受试者”或“患者”指分类为哺乳动物的所有动物，并且包括但不限于家畜和农场动物、灵长类动物和人，例如，人类、非人灵长类动物、牛、马、猪、绵羊、山羊、狗、猫或啮齿类动物。优选地，受试者是任何年龄或种族的人类男性或女性。
如本文使用的，术语“治疗”指任何类型的疗法，其旨在终止、预防、改善或减少对如本文描述的临床病况的易感性。在优选实施方案中，术语“治疗”指如本文定义的病症或病况的预防治疗(即减少对临床病况的易感性的疗法)。因此，“治疗(treatment)”、“治疗(treating)”及其等价术语指获得所需药理学或生理学效应，包括哺乳动物包括人中的病理病况或病症的任何治疗。效应在完全或部分预防病症或其症状方面可以是预防性的，和/或在病症和/或可归于病症的不利效应的部分或完全治愈方面可以是治疗性的。即，“治疗”包括(1)预防病症在受试者中发生或复发，(2)抑制病症，例如使其发展停滞，(3)停止或终止病症或至少与之相关的症状，以使得宿主不再患有病症或其症状，例如引起病症或其症状消退，例如通过恢复或修复丧失、缺失或缺陷的功能，或者刺激无效过程，或者(4)减轻、缓和或改善病症或与之相关的症状，其中改善以广义使用以指参数例如炎症、疼痛或免疫缺陷的量级的至少减少。
如本文使用的，“样品”或“生物样品”意指从受试者中分离的生物材料。生物样品可以含有适合于测定MAF基因的表达水平的任何生物材料。样品可以从任何合适的生物组织或流体中分离，所述生物组织或流体例如是肿瘤组织、血液、血浆、血清、尿或脑脊髓液(CSF)。
“肿瘤组织样品”应理解为源于原发性HER2+乳腺癌肿瘤的组织样品。所述样品可以通过常规方法例如活组织检查，使用相关医学技术熟练人员熟知的方法来获得。
“溶骨性骨转移”指其中在转移灶附近产生骨吸收(骨密度的进行性丧失)的一类转移灶，所述骨吸收起因于破骨细胞活性通过肿瘤细胞的刺激，并且特征在于剧烈疼痛、病理性骨折、高钙血症、脊髓压迫症和起因于神经压迫的其他综合征。
用于基于MAF的表达水平预测HER2+乳腺癌的骨转移的方法
在HER2+乳腺癌的样品中MAF的表达水平与患有骨转移的风险关联。此外，HER2+原发性肿瘤中MAF的基因表达与骨转移复发显著关联，并且与无骨转移存活和存活反关联。此外，MAF表达水平以剂量依赖性方式预测骨转移。
在第一个方面，本发明涉及用于预测Her2+乳腺癌在患有所述癌症的受试者中的骨转移的体外方法(下文称为本发明的第一种方法)，其包括
i)测定所述受试者的样品中MAF基因的表达水平，和
ii)将步骤i)中获得的表达水平与参考值进行比较，
其中所述基因相对于所述参考值增加的表达水平指示发展骨转移的风险增加。
本发明的方法包括在第一个步骤中测定来自受试者的样品中的MAF基因表达水平。在优选实施方案中，样品是肿瘤组织样品。
用于获得活组织检查样品的方法包括将肿瘤拆分成大块，或显微解剖，或本领域已知的其他细胞分离方法。肿瘤细胞可以另外通过用小号针抽吸的细胞学手段来获得。为了简化样品保存和处理，样品可以在福尔马林中固定且在石蜡中浸泡，或首先冷冻并随后借助于在允许速冻的高低温介质中浸没而在组织冷冻介质例如OCT化合物中浸泡。
在优选实施方案中，本发明的第一种方法包括仅定量作为单一标志物的MAF基因表达水平，即此方法不涉及测定任何另外标志物的表达水平。
如本领域技术人员理解的，基因表达水平可以通过测量所述基因或由所述基因编码的蛋白质的信使RNA水平，以及含有所述基因的基因组区域拷贝或易位数目进行定量。
为此目的，生物样品可以进行处理以在物理或机械上破坏组织或细胞结构，将细胞内组分释放到水溶液或有机溶液内，用于制备核酸。核酸借助于本领域技术人员已知的商购可得的方法进行提取(Sambrook，J.等人，“Molecular cloning:a LaboratoryManual”，第3版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，N.Y.，第1-3卷。)
因此，MAF基因表达水平可以由来自所述基因的转录的RNA(信使RNA或mRNA)或备选地由所述基因的互补DNA(cDNA)进行定量。因此，在本发明的特定实施方案中，MAF基因表达水平的定量包括MAF基因的信使RNA或所述mRNA的片段、MAF基因的互补DNA或所述cDNA的片段、或其混合物的定量。
基本上任何常规方法均可用于本发明的范围内，用于检测且定量由MAF基因编码或其相应的cDNA的mRNA水平。经由非限制性举例说明，由所述基因编码的mRNA水平可以使用常规方法进行定量，例如包括mRNA扩增和所述mRNA扩增产物的定量的方法，例如电泳和染色，或备选地，通过Southern印迹且使用合适的探针、Northern印迹且使用目的基因(MAF)或其相应的cDNA的mRNA的特异性探针、用S1核酸酶作图、RT-PCR、杂交、微阵列等，优选借助于使用合适标志物的实时定量PCR。类似地，对应于由MAF基因编码的所述mRNA的cDNA水平还可以借助于使用常规技术进行定量；在这种情况下，本发明的方法包括下述步骤：借助于相应mRNA的逆转录(RT)合成相应的cDNA，随后扩增和定量所述cDNA扩增产物。用于定量表达水平的常规方法可以例如在Sambrook等人，2001(在上文引用)中发现。这些方法是本领域已知的，并且本领域技术人员将熟悉每种技术必需的标准化。例如，使用多路PCR生成的表达测量应通过比较待测量基因的表达与所谓的“看家”基因或其表达已知由癌症调节的其他对照基因而进行标准化，所述“看家”基因的表达在所有样品上应是恒定的，因此提供针对其比较的基线表达。
在特定实施方案中，MAF基因表达水平借助于定量聚合酶链反应(PCR)或DNA/RNA阵列或核苷酸杂交技术进行定量。
另外，MAF基因表达水平还可以借助于定量由所述基因编码的蛋白质(c-Maf蛋白质(c-Maf)[NCBI，登录号O75444]，或c-Maf蛋白质的任何功能等价变体)的表达水平进行定量。存在两种c-Maf蛋白质同种型，由403个氨基酸(SEQ ID NO:4)构成的α同种型(NCBI，NP_005351.2)和由373个氨基酸(SEQ ID NO:5)构成的β同种型(NCBI，NP_001026974.1)。MAF基因表达水平可以借助于定量c-Maf蛋白质同种型中任一种的表达水平进行定量。因此，在特定实施方案中，由MAF基因编码的蛋白质水平的定量包括c-Maf蛋白质的定量。
在本发明的上下文中，“c-Maf蛋白质的功能等价变体”应理解为(i)c-Maf蛋白质(SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5)的变体，其中氨基酸残基中的一个或多个置换为保守或非保守氨基酸残基(优选保守氨基酸残基)，其中这样的置换的氨基酸残基可以是或不是由遗传密码编码的氨基酸残基，或(ii)包含一个或多个氨基酸的插入或缺失且具有与c-Maf蛋白质相同的功能(即充当DNA结合转录因子)的变体。c-Maf蛋白质的变体可以使用基于c-Maf用于促进体外细胞增殖的能力的方法进行鉴定，如国际专利申请WO2005/046731(通过引用全文并入本文)中所述的，基于所谓的抑制剂用于在表达MAF的细胞中阻断报道基因在细胞周期蛋白D2启动子或含有MAF应答区(MARE或MAF应答元件)的启动子的控制下的转录能力的能力的方法进行鉴定，如WO2008098351(通过引用全文并入本文)中所述，或基于所谓的抑制剂用于阻断在表达NFATc2和MAF的细胞中响应用PMA/离子霉素的刺激在IL-4启动子的控制下的报道基因表达的能力的方法进行鉴定，如US2009048117A(通过引用全文并入本文)中所述。
根据本发明的变体优选与c-Maf蛋白质同种型(SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5)中任一种的氨基酸序列具有至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％的序列相似性。变体和先前定义的特定c-Maf蛋白质序列之间的相似性程度使用本领域技术人员广泛已知的算法和计算机过程进行测定。两个氨基酸序列之间的相似性优选使用BLASTP算法[BLAST Manual，Altschul，S.等人，NCBI NLM NIHBethesda，Md.20894，Altschul，S.等人，J.Mol.Biol.215:403-410(1990)]进行测定。
c-Maf蛋白质表达水平可以通过任何常规方法进行定量，所述常规方法允许检测且定量来自受试者的样品中的所述蛋白质。作为非限制性举例说明，所述蛋白质水平可以例如通过使用具有c-Maf结合能力的抗体(或其含有抗原决定簇的片段)和所形成的复合物的后续定量进行定量。在这些测定法中使用的抗体可以是或不是经标记的。可以使用的标记物的举例说明性例子包括放射性同位素、酶、荧光团、化学发光试剂、酶底物或辅因子、酶抑制剂、颗粒、染料等。存在可以用于本发明中的广泛范围的已知测定法，其使用未标记的抗体(一级抗体)和标记的抗体(二级抗体)；这些技术包括Western印迹或Western转移、ELISA(酶联免疫吸附测定)、RIA(放射免疫测定)、竞争性EIA(竞争性酶免疫测定法)、DAS-ELISA(双抗体夹心ELISA)、免疫细胞化学和免疫组织化学技术、基于包括特异性抗体的蛋白质微阵列或生物芯片的使用的技术或基于以诸如浸渍片形式的胶体沉淀的测定法。用于检测且定量所述c-Maf蛋白质的其他方法包括亲和色谱技术、配体结合测定法等。当使用免疫学方法时，已知以高亲和力结合c-Maf蛋白质的任何抗体或试剂可用于检测其量。然而，抗体例如多克隆血清、杂交瘤上清液或单克隆抗体、抗体片段、Fv、Fab、Fab’和F(ab’)2、scFv、人源化双抗体、三抗体、四抗体、纳米抗体、α体、订书肽(stapled peptide)、环肽和抗体的使用是优选的。这些是市场上的商业抗c-Maf蛋白质抗体，其可以用于本发明的背景中，例如抗体ab427、ab55502、ab55502、ab72584、ab76817、ab77071(Abcam plc，330SciencePark，Cambridge CB4 0FL，United Kingdom)，AbD Serotec的O75444单克隆抗体(不含叠氮化物的小鼠抗人MAF单克隆抗体，Unconjugated，Clone 6b8)等。存在供应抗c-Maf抗体的许多商业公司，例如Abnova Corporation、Bethyl Laboratories、Santa CruzBiotechnology、Bioworld Technology、GeneTex等。
在特定实施方案中，c-Maf蛋白质水平借助于Western印迹、ELISA或蛋白质阵列进行定量。
在另一个特定实施方案中，c-Maf蛋白质水平由外来体、循环DNA或循环肿瘤细胞进行定量。外来体是在体内和体外由大多数细胞类型分泌的40-100nm膜囊泡。外来体在称为多泡体(MVB)的特定胞内体群体中通过向内出芽到区室的腔内而形成。在MVB与质膜融合后，这些内部囊泡被分泌。外来体可以通过本领域众所周知的几种方法从不同的细胞系或体液中分离(Théry C.等人，Curr Protoc Cell Biol.2006Apr；Chapter 3:Unit 3.22)(其完整内容通过引用并入本文)。几种商业试剂盒可用于分离外来体，例如ExoQuickTM或ExoTestTM。
本发明的第一种方法包括在第二个步骤中将在来自受试者的样品(例如肿瘤样品)中获得的MAF基因表达水平与参考值进行比较。
在来自患有乳腺癌例如HER2+乳腺癌的受试者的样品中的MAF基因表达水平已进行测量且与参考值相比较后，如果所述基因的表达水平相对于所述参考值增加，则可以得出结论所述受试者具有发展骨转移的更大趋势。
MAF基因表达水平的测定必须与参考值关联。
在实施方案中，如本文预期的参考值可以传达MAF的绝对数量。在另一个实施方案中，来自测试受试者的样品中的任何一种或多种生物标志物的数量可以相对于参考值直接测定(例如就增加或减少、或者增加倍数或减少倍数而言)。有利地，这可以允许将来自受试者的样品中的任何一种或多种生物标志物的数量与参考值进行比较(换言之，测量来自受试者的样品中的任何一种或多种生物标志物相对参考值的相对数量)，而无需首先测定所述一种或多种生物标志物的分别的绝对数量。
在优选实施方案中，参考值是对照样品或参考样品中的MAF基因表达水平。取决于待分析的肿瘤类型，对照或参考样品的确切性质可以改变。因此，在待评估预后的情况下，则参考样品是来自患有HER2+乳腺癌(其仍未转移)的受试者的样品，或对应于来自患有HER2+乳腺癌(其仍未转移)的受试者的活组织检查样品中的肿瘤组织集合中测量的MAF基因表达水平的中值的样品。
所述参考样品通常通过组合来自受试者群体的等量样品来获得。一般地，典型参考样品将得自临床上充分证明并且在其中转移灶的不存在得到充分表征的受试者。在这样的样品中，生物标志物(MAF基因)的正常水平(参考浓度)可以例如通过提供在参考群体上的平均浓度进行测定。当测定标志物的参考浓度时，可以考虑各种考虑因素。在这样的考虑因素中有患者的年龄、体重、性别、一般身体状况等等。例如，优选根据前述考虑因素例如根据各种年龄类别分类的等量的一组至少约2、至少约10、至少约100至优选超过约1000个受试者视为参考组。参考水平所来源于的样品集合优选通过患有与研究的患者目标相同类型的癌症的受试者形成。
在特定实施方案中，用于MAF表达的“增加”或“减少”表达的参考值通过经由常规手段计算超过MAF表达水平的百分位数进行测定，所述常规手段涉及在从受试者中分离的一个或几个样品中执行测定法，所述受试者的疾病通过上文提及的方法中的任一种得到充分证明。“减少”水平的MAF随后可以优选指定给其中MAF表达水平等于或低于正常群体中的约第50百分位数的样品，包括例如，等于或低于正常群体中的约第60百分位数，等于或低于正常群体中的约第70百分位数，等于或低于正常群体中的约第80百分位数，等于或低于正常群体中的约第90百分位数，等于或低于正常群体中的约第95百分位数。“增加的”MAF基因表达水平随后可以优选指定给其中MAF基因表达水平等于或大于正常群体中的约第50百分位数的样品，包括例如，等于或大于正常群体中的约第60百分位数，等于或大于正常群体中的约第70百分位数，等于或大于正常群体中的约第80百分位数，等于或大于正常群体中的约第90百分位数，等于或大于正常群体中的约第95百分位数。
本领域技术人员将理解原发性乳腺肿瘤的转移趋势预测无需对于待鉴定的所有受试者(即对于100％的受试者)均为正确的。然而，该术语要求使得能够鉴定统计上显著部分的受试者(例如同类者研究中的同类者)。部分是否是统计上显著的可以通过本领域技术人员使用各种众所周知的统计评估工具，例如置信区间的测定、p值的测定、斯氏T检验、曼怀二氏检验等，以简单方式进行测定。细节在Dowdy和Wearden，Statistics for Research，John Wiley and Sons，New York1983中提供。优选的置信区间为至少约90％、至少约95％、至少约97％、至少约98％或至少约99％。p值优选为0.1、0.05、0.01、0.005或0.0001。更优选地，群体至少约60％、至少约70％、至少约80％或至少约90％的受试者可以通过本发明的方法适当地进行鉴定。
在另外一个实施方案中，对骨的转移是溶骨性骨转移。
在另外一个实施方案中，超过平均值的MAF表达水平指示骨转移的风险增加，所述风险与MAF表达水平成比例。因此，患有乳腺癌的受试者中的骨转移风险是剂量依赖性的。
用于基于MAF的表达水平预测患有来自HER2+乳腺癌的骨转移的患者的临床结果 的方法
在另一个方面，本发明涉及用于预测患有骨转移性HER2+乳腺癌的患者的临床结果的体外方法(下文称为本发明的第二种方法)，其包括：
i)定量所述受试者的样品中MAF基因的表达水平，和
ii)将步骤i)中获得的表达水平与参考值进行比较，
其中所述基因相对于所述参考值增加的表达水平指示不良临床结果。
本发明的第二种方法包括在第一个步骤中定量患有HER2+乳腺癌的受试者的样品中的MAF基因表达水平。在优选实施方案中，样品是肿瘤组织样品。
在优选实施方案中，本发明的第二种方法包括仅定量作为单一标志物的MAF基因表达水平，即此方法不涉及测定任何另外的标志物的表达水平。
在第二个步骤中，在受试者的肿瘤样品中获得的MAF基因表达水平与参考值相比较。在优选实施方案中，参考值是对照样品中的所述基因的表达水平。MAF基因表达水平的测定必须与对照样品或参考样品的值关联。取决于待分析的肿瘤类型，对照样品的确切性质可以改变。因此，在涉及本发明的第二种方法的情况下，则参考样品是患有乳腺癌的受试者(其未患有骨转移)的样品，或对应于患有乳腺癌的受试者(其未患有转移)的活组织检查样品中的肿瘤组织集合中测量的MAF基因表达水平的中值的样品。
在样品中的MAF基因表达水平得到测量且与对照样品相比较后，如果所述基因的表达水平就其在对照样品中的表达水平而言是增加的，则它指示不良临床结果。
在具体实施方案中，骨转移是溶骨性转移。
在另一个具体实施方案中，MAF基因表达水平的定量包括定量所述基因的信使RNA(mRNA)或所述mRNA的片段、所述基因的互补DNA(cDNA)或所述cDNA的片段。在更优选的实施方案中，表达水平借助于定量聚合酶链反应(PCR)或者DNA或RNA阵列进行定量。
在另一个实施方案中，MAF基因表达水平的定量包括定量由所述基因编码的蛋白质或其变体的水平。在另外一个更优选的实施方案中，蛋白质水平借助于Western印迹、免疫组织化学、ELISA或蛋白质阵列进行测定。
在另一个实施方案中，参考样品是来自未患有转移的受试者的HER2+乳腺癌的肿瘤组织样品。
对于测定患者的临床结果广泛接受的任何参数均可用于本发明中，包括但不限于：
·无疾病进展，如本文使用的，其描述了完全缓解的受试者比例，所述受试者在研究下的时间段期间无疾病复发。
·无疾病存活(DFS)，如本文使用的，应理解为在疾病治疗后在其期间受试者存活且无疾病征兆的时间长度。
·客观应答，如在本发明中使用的，其描述了在其中观察到完全或部分应答的被治疗受试者的比例。
·肿瘤对照，如在本发明中使用的，其涉及在其中观察到完全应答、部分应答、轻微应答或稳定疾病≥6个月的被治疗受试者的比例。
·无进展存活，如本文使用的，其定义为从治疗开始到癌症生长的首次测量的时间。
·进展时间(TTP)，如本文使用的，其涉及在疾病治疗后直至疾病开始恶化的时间。术语“进展”先前已得到定义。
·六个月无进展存活或“PFS6”率，如本文使用的，其涉及在疗法起始后的前六个月中无进展的受试者的百分比，和
·存活中值，如本文使用的，其涉及在加入研究的一半受试者仍存活时的时间。
如本文涉及临床结果使用的，术语“不良”或“良好”意指受试者将显示有利或不利的结果。如本领域技术人员将理解的，这样的概率评估尽管是优选的，但可能并非对于待诊断的约100％受试者均是正确的。然而，该术语要求统计上显著部分的受试者可以被鉴定为具有关于给定结果的倾向。部分是否是统计上显著的可以通过本领域技术人员使用各种众所周知的统计评估工具，例如置信区间的测定、p值测定、斯氏t检验、曼怀二氏检验等，来容易地测定。细节在Dowdy和Wearden，Statistics for Research，John Wiley&Sons，NewYork 1983中提供。优选的置信区间为至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％至少约95％。p值优选为0.05、0.01、0.005或0.0001或更少。更优选地，群体至少约60百分比、至少约70百分比、至少约80百分比或至少约90百分比的受试者可以通过本发明方法适当地进行鉴定。
用于设计患有HER2+乳腺肿瘤的患者中的定制疗法的方法
如现有技术已知的，待施用于患有癌症的受试者的治疗取决于癌症是否是恶性肿瘤，即它是否具有经历转移的高概率，或癌症是否是良性肿瘤。在第一个假设中，选择的治疗是全身治疗例如化学疗法，并且在第二个假设中，选择的治疗是局限性治疗例如放射疗法。
因此，如本发明中描述的，考虑到HER2+癌细胞中的MAF基因过表达与骨转移的存在相关，MAF基因的表达水平可用于就用于患有所述癌症的受试者的最合适疗法而言作出决策。
因此，在另一个方面，本发明涉及用于设计用于患有HER2+乳腺癌的受试者的定制疗法的体外方法(下文称为本发明的第三种方法)，其包括
i)定量所述受试者的肿瘤样品(例如肿瘤组织样品、循环肿瘤细胞、循环肿瘤DNA或肿瘤衍生的外来体)中的MAF基因表达水平，和
ii)将i)中获得的表达水平与参考值进行比较，
其中如果表达水平相对于所述参考值增加，则所述受试者对接受旨在预防和/或治疗骨转移的疗法易感。如果表达水平相对于所述参考值不增加，则所述受试者对接受旨在预防和/或治疗骨转移的疗法不易感。在一些实施方案中，样品是肿瘤衍生的样品，包括：肿瘤样品、循环肿瘤样品、循环肿瘤DNA或肿瘤衍生的外来体。
在特定实施方案中，骨转移是溶骨性转移。
本发明的第三种方法包括在第一个步骤中定量患有HER2+乳腺癌的受试者中的样品中的MAF基因表达水平。在优选实施方案中，样品是肿瘤组织样品。
在另一个特定实施方案中，本发明的第三种方法包括仅定量作为单一标志物的MAF基因表达水平，即此方法不涉及测定任何另外的标志物的表达水平。
在本发明的第三种方法的情况下，样品可以是受试者的原发性肿瘤组织样品。
在第二个步骤中，在受试者的肿瘤样品中获得的MAF基因表达水平与参考值相比较。在优选实施方案中，参考值是对照样品中的所述基因的MAF基因表达水平。MAF基因表达水平的测定必须与对照样品或参考样品的值相关。取决于待分析的肿瘤类型，对照样品的确切性质可以改变。因此，优选地，参考样品是患有HER2+乳腺癌(其仍未转移)的受试者的样品，或对应于患有HER2+乳腺癌(其仍未转移)的受试者的活组织检查样品中的肿瘤组织集合中测量的MAF基因表达水平的中值。
在样品中的MAF基因表达水平已进行测量且与参考值相比较后，如果所述基因的表达水平相对于所述参考值增加，则可以得出结论所述受试者对接受或不接受旨在预防(如果受试者还未经历转移)和/或治疗转移或不预防和/或治疗转移(如果受试者已经历转移)的疗法易感。
当癌症已转移时，可以使用全身治疗包括但不限于化学疗法、激素治疗、免疫疗法或其组合。另外，可以使用放射疗法和/或手术。治疗的选择一般取决于原发性癌症的类型、大小、转移灶位置、患者年龄、一般健康和先前使用的治疗类型。
全身治疗是到达整个身体的那些治疗并且可代表旨在预防或抑制(如果受试者还未经历转移)和/或治疗转移(如果受试者已经历转移)的疗法，例如：
-化疗为使用药剂来破坏癌症细胞。所述的药剂通常通过口腔或静脉内途径给予。有时，化疗与放射治疗一起使用。用于乳腺癌症的合适的化疗治疗包括但不限于：蒽环类抗生素(阿霉素,表柔比星,聚乙二醇脂质体阿霉素),紫杉烷(紫杉醇,多西他奇,白蛋白纳米颗粒结合的紫杉醇),5-氟尿嘧啶(连续输注5-FU,卡培他滨),长春花生物碱(长春瑞滨,长春碱),吉西他滨,铂盐(顺铂,卡波铂),环磷酰胺,依托泊苷,以及上述一种或多种的组合，例如环磷酰胺/蒽环类抗生素+/-5-氟尿嘧啶方案(例如阿霉素/环磷酰胺(AC),表柔比星/环磷酰胺,(EC)环磷酰胺/表柔比星/5-氟尿嘧啶(CEF),环磷酰胺/阿霉素/5-氟尿嘧啶(CAF),5-氟尿嘧啶/表柔比星/环磷酰胺(FEC)),环磷酰胺/甲氨蝶呤/5-氟尿嘧啶(CMF),蒽环类抗生素/紫杉烷(例如阿霉素/紫杉醇或阿霉素/多西他奇),多西他奇/卡培他滨,吉西他滨/紫杉醇,紫杉烷/铂方案(例如紫杉醇/卡波铂或多西他奇/卡波铂)。
-免疫治疗为有助于患者的免疫系统本身与癌症战斗的治疗。有多种类型的免疫治疗用于治疗患者的转移。这些治疗包括但不限于细胞因子、单克隆抗体和抗肿瘤疫苗。
在另一个方面，治疗为Alpharadin(二氯化镭-223)。Alpharadin使用由镭-223衰变产生的α辐射以杀死癌细胞。镭-223作为钙-模拟物凭借其性质本能地自靶向骨转移。α辐射具有2-10个细胞的极短的射程(与目前的放疗(其基于β或γ辐射)相比)，因此对周围的健康组织产生较少的损伤(特别是骨髓)。由于镭-223与钙具有相似的性质，所以镭-223被吸引至身体中钙用于建造骨的地方，包括快速异常的骨生长的位点，例如患有晚期的去势抵抗性前列腺癌的男性的骨骼转移中所见。在注射镭-223之后，镭-223在血流中被携带至异常骨生长的部位。身体中癌症起始的地方称为原发性肿瘤。这些细胞的一些细胞可以脱离，并在血流中被携带至身体的另一个部分。然后，癌细胞可以安顿在身体的该部分并形成新的肿瘤。如果发生这种情况，则称为继发癌症或转移。患有晚期前列腺癌的大部分患者在他们的骨中遭受最大的疾病负担。使用镭-223的目的是选择性地靶向这种继发癌症。未被骨吸收的任何镭-223快速地按照路线到达内脏并被排出。
在另一个方面，治疗为mTor抑制剂。在一些方面，mTor抑制剂为双重mTor/PI3激酶抑制剂。在一些方面，mTor抑制剂用于预防或抑制转移。在一些方面，mTor抑制剂选自：ABI009(西罗莫司)、雷帕霉素(西罗莫司)、Abraxane(紫杉醇)、Absorb(依维莫司)、Afinitor(依维莫司)、Afinitor和Gleevec、AS703026(pimasertib)、Axxess(乌米莫司)、AZD2014、BEZ235、Biofreedom(乌米莫司)、BioMatrix(乌米莫司)、BioMatrixflex(乌米莫司)、CC115、CC223、ComboBio-engineeredSirolimusElutingStentORBUSNEICH(西罗莫司)、CuraxinCBLC102(阿的平)、DE109(西罗莫司)、DS3078、EndeavorDES(佐他莫司)、EndeavorResolute(佐他莫司)、Femara(来曲唑)、Hocena(安卓奎诺尔)、INK128、Inspiron(西罗莫司)、IPI504(瑞他霉素盐酸盐)、KRN951(tivozanib)、ME344、MGA031(teplizumab)、MiStentSES(西罗莫司)、MKC1、Nobori(乌米莫司)、OSI027、OVI123(虫草素)、Palomid529、PF04691502、Promus Element(依维莫司)、PWT33597、Rapamune(西罗莫司)、Resolute DES(佐他莫司)、RG7422、SAR245409、SF1126、SGN75(vorsetuzumab mafodotin)、Synergy(依维莫司)、Taltorvic(地磷莫司)、Tarceva(厄洛替尼)、Torisel(替西罗莫司)、Xience Prime(依维莫司)、Xience V(依维莫司)、Zomaxx(佐他莫司)、Zortress(依维莫司)、ZotarolimusEluting Peripheral Stent MEDTRONIC(佐他莫司)、AP23841、AP24170、ARmTOR26、BN107、BN108、Canstatin GENZYME(canstatin)、CU906、EC0371、EC0565、KI1004、LOR220、NV128、Rapamycin ONCOIMMUNE(西罗莫司)、SB2602、Sirolimus PNP SAMYANGBIOPHARMACEUTICALS(西罗莫司)、TOP216、VLI27、VS5584、WYE 125132、XL388、Advacan(依维莫司)、AZD8055、Cypher Select Plus Sirolimus eluting Coronary Stent(西罗莫司)、Cypher Sirolimus eluting coronary stent(西罗莫司)、Drug Coated Balloon(西罗莫司)、E-Magic Plus(西罗莫司)、Emtor(西罗莫司)、Esprit(依维莫司)、Evertor(依维莫司)、HBF0079、LCP-Siro(西罗莫司)、Limus CLARIS(西罗莫司)、mTOR抑制剂CELLZOME、Nevo Sirolimus eluting Coronary Stent(西罗莫司)、nPT-mTOR、Rapacan(西罗莫司)、Renacept(西罗莫司)、ReZolve(西罗莫司)、Rocas(西罗莫司)、SF1126、Sirolim(西罗莫司)、Sirolimus NORTHCHINA(西罗莫司)、Sirolimus RANBAXY(西罗莫司)、SirolimusWATSON(西罗莫司)Siropan(西罗莫司)、Sirova(西罗莫司)、Supralimus(西罗莫司)、Supralimus-Core(西罗莫司)、Tacrolimus WATSON(他克莫司)、TAFA93、TemsirolimusACCORD(替西罗莫司)、Temsirolimus SANDOZ(替西罗莫司)、TOP216、Xience Prime(依维莫司)、Xience V(依维莫司)。在特定的方面中，mTor抑制剂为Afinitor(依维莫司)(http://www.afinitor.com/index.jsp？usertrack.filter_applied＝true&NovaId＝4029462064338207963；最后一次登录11/28/2012)。在另一个方面，依维莫司与芳香酶抑制剂结合(参见例如等人，Everolimus in Postmenopausal Hormone-Receptor PositiveAdvanced Breast Cancer.2012.N.Engl.J.Med.366(6):520-529，其通过引用并入本文)。在另一个方面，mTor抑制剂可以通过本领域已知的方法识别(参见例如Zhou，H.等人Updates of mTor inhibitors.2010.Anticancer Agents Med.Chem.10(7):571-81，其通过引用并入本文)。在一些方面，mTor抑制剂在激素受体为阳性的患者中用于治疗、预防或抑制转移(参见例如Zhou，H.等人Updates of mTor inhibitors.2010.Anticancer AgentsMed.Chem.10(7):571-81，其通过引用并入本文)。在一些实施方案中，患者是ER+。在一些方面，mTor抑制剂用于治疗或预防或抑制患有晚期乳腺癌的患者中的转移。在一些方面，mTor抑制剂与第二种治疗组合使用。在一些方面，第二种治疗是本文描述的任何治疗。
在另一个方面，所述的治疗为Src激酶抑制剂。在一些方面，Src抑制剂用于预防或抑制转移。在一些方面，Src激酶抑制剂选自：AZD0530(塞卡替尼)、Bosulif(博舒替尼)、ENMD981693、KD020、KX01、Sprycel(达沙替尼)、Yervoy(伊匹木单抗)、AP23464、AP23485、AP23588、AZD0424、c-Src激酶抑制剂KISSEI、CU201、KX2361、SKS927、SRN004、SUNK706、TG100435、TG100948、AP23451、Dasatinib HETERO(达沙替尼)、Dasatinib VALEANT(达沙替尼)、Fontrax(达沙替尼)、Src激酶抑制剂KINEX、VX680(tozasertib lactate)、XL228和SUNK706。在一些实施方案中，Src激酶抑制剂为达沙替尼。在另一个方面，Src激酶抑制剂可以通过本领域已知的方法来鉴定(参见例如Sen，B.和Johnson，F.M.Regulation of SrcFamily Kinases in Human Cancers.2011.J.Signal Transduction.2011:14页，其通过引用并入本文)。在一些方面，Src激酶抑制剂用于治疗或预防或抑制对于SRC应答标记(SRS)阳性的患者中的转移。在一些方面，患者是SRS+和ER-。(参见例如Zhang，CH.-F等人LatentBone Metastasis in Breast Cancer Tied to Src-Dependent survivalsignals.2009.Cancer Cell.16:67-78，其通过引用并入本文)。在一些方面，Src激酶抑制剂用于治疗或预防或抑制具有晚期乳腺癌的患者中的转移。在一些方面，Src激酶抑制剂与第二种治疗组合使用。在一些方面，第二种治疗是本文描述的任何治疗。
在另一个方面，所述的治疗为COX-2抑制剂。在一些方面，COX-2抑制剂用于预防或抑制转移。在一些实施方案中，COX-2抑制剂选自：ABT963、Acetaminophen ER JOHNSON(对乙酰氨基酚)、Acular X(酮咯酸氨丁三醇)、BAY1019036(阿司匹林)、BAY987111(苯海拉明、甲氧萘丙酸钠)、BAYl1902(吡罗昔康)、BCIBUCH001(布洛芬)、Capoxigem(阿利考昔)、CS502、CS670(培比洛芬)、Diclofenac HPBCD(双氯芬酸)、Diractin(酮洛芬)、GW406381、HCT1026(硝基氟吡洛芬)、Hyanalgese-D(双氯芬酸)、HydrocoDex(对乙酰氨基酚、美沙芬、氢可酮)、Ibuprofen Sodium PFIZER(布洛芬钠)、具有Acetaminophen PFIZER的Ibuprofen(对乙酰氨基酚、布洛芬)、Impracor(酮洛芬)、IP880(双氯芬酸)、IP940(吲哚美辛)、ISV205(双氯芬酸钠)、JNS013(对乙酰氨基酚、盐酸曲马多)、Ketoprofen TDS(酮洛芬)、LTNS001(naproxenetemesil)、Mesalamine SALIX(马沙拉嗪)、Mesalamine SOFAR(马沙拉嗪)、Mesalazine(马沙拉嗪)、ML3000(利克飞龙)、MRX7EAT(依托度酸)、Naproxen IROKO(萘普生)、NCX4016(硝基阿司匹林)、NCX701(硝基对乙酰氨基酚)、Nuprin SCOLR(布洛芬)、OMS103HP(盐酸阿米替林、酮洛芬、盐酸羟甲唑啉)、Oralease(双氯芬酸)、OxycoDex(美沙芬、氧可酮)、P54、PercoDex(对乙酰氨基酚、美沙芬、氧可酮)、PL3100(萘普生、卵磷脂)、PSD508、R-酮洛芬(酮洛芬)、Remura(溴芬酸钠)、ROX828(酮咯酸氨丁三醇)、RP19583(赖氨酸酮基布洛芬)、RQ00317076、SDX101(R-依托度酸)、TDS943(双氯芬酸钠)、TDT070(酮洛芬)、TPR100、TQ1011(酮洛芬)、TT063(S-氟比洛芬)、UR8880(西米考昔)、V0498TA01A(布洛芬)、VT122(依托度酸、普萘洛尔)、XP20B(对乙酰氨基酚、右旋丙氧芬)、XP21B(双氯芬酸钾)、XP21L(双氯芬酸钾)、Zoenasa(乙酰半胱氨酸、马沙拉嗪)、Acephen、Actifed Plus、Actifed-P、Acular、Acular LS、Acular PF、Acular X、Acuvail、Advil、Advil AllergySinus、Advil Cold and Sinus、Advil Congestion Relief、Advil PM、Advil PM Capsule、Air Salonpas、Airtal、Alcohol-Free NyQuil Cold &Flu Relief、Aleve、Aleve ABDIIBRAHIM、Aleve-D、Alka-Seltzer、Alka-Seltzer BAYER、Alka-Seltzer Extra Strength、Alka-Seltzer Lemon-Lime、Alka-Seltzer Original、Alka-Seltzer Plus、Alka-Seltzerplus Cold and Cough、Alka-Seltzer plus Cold and Cough Formula、Alka-SeltzerPlus Day and Night Cold Formula、Alka-Seltzer Plus Day Non-Drowsy ColdFormula、Alka-Seltzer Plus Flu Formula、Alka-Seltzer Plus Night Cold Formula、Alka-Seltzer Plus Sinus Formula、Alka-Seltzer Plus Sparkling Original ColdFormula、Alka-Seltzer PM、Alka-Seltzer Wake-Up Call、Anacin、Anaprox、AnaproxMINERVA、Ansaid、Apitoxin、Apranax、Apranax abdi、Arcoxia、Arthritis FormulaBengay、Arthrotec、Asacol、Asacol HD、Asacol MEDUNA ARZNEIMITTEL、Asacol ORIFARM、Aspirin BAYER、Aspirin Complex、Aspirin Migran、AZD3582、Azulfidine、Baralgan M、BAY1019036、BAY987111、BAYl1902、BCIBUCH001、Benadryl Allergy、Benadryl Day andNight、Benylin 4 Flu、Benylin Cold and Flu、Benylin Cold and Flu Day and Night、Benylin Cold and Sinus Day and Night、Benylin Cold and Sinus Plus、Benylin Dayand Night Cold and Flu Relief、Benylin1 All-In-One、Brexin、Brexin ANGELINI、Bromday、Bufferin、Buscopan Plus、Caldolor、Calmatel、Cambia、Canasa、Capoxigem、Cataflam、Celebrex、Celebrex ORIFARM、Children’s Advil Allergy Sinus、Children’sTylenol、Children’s Tylenol Cough and Runny Nose、Children’s Tylenol plus cold、Children’s Tylenol plus Cold and Cough、Children’s Tylenol plus cold andstuffy nose、Children’s Tylenol plus Flu、Children’s Tylenol plus cold&allergy、Children’s Tylenol plus Cough&Runny Nose、Children’s Tylenol plus Cough&SoreThroat、Children’s Tylenol plus multi symptom cold、Clinoril、Codral Cold andFlu、Codral Day and Night Day Tablets、Codral Day and Night Night Tablets、Codral Nightime、Colazal、Combunox、Contac Cold plus Flu、Contac Cold plus FluNon-Drowsy、Coricidin D、Coricidin HBP Cold and Flu、Coricidin HBP Day and NightMulti-Symptom Cold、Coricidin HBP Maximum Strength Flu、Coricidin HBP NighttimeMulti-Symptom Cold、Coricidin II Extra Strength Cold and Flu、CS502、CS670、Daypro、Daypro Alta、DDS06C、Demazin Cold and Flu、Demazin Cough、Cold and Flu、Demazin day/night Cold and Flu、Demazin PE Cold and Flu、Demazin PE day/nightCold and Flu、Diclofenac HPBCD、Dimetapp Day Relief、Dimetapp Multi-Symptom Coldand Flu、Dimetapp Night Relief、Dimetapp Pain and Fever Relief、Dimetapp PESinus Pain、Dimetapp PE Sinus Pain plus Allergy、Dipentum、Diractin、Disprin Cold‘n’Fever、Disprin Extra、Disprin Forte.Disprin Plus、Dristan 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Nighttime Liquid、Tylenol ColdMulti Symptom Severe、Tylenol Cold Non-Drowsiness Formula、Tylenol Cold SevereCongestion Daytime、Tylenol Complete Cold、Cough and Flu Night time、Tylenol FluNighttime、Tylenol Menstrual、Tylenol PM、Tylenol Sinus Congestion&Pain Daytime、Tylenol Sinus Congestion&Pain Nighttime、Tylenol Sinus Congestion&Pain Severe、Tylenol Sinus Severe Congestion Daytime、Tylenol Ultra Relief、Tylenol withCaffeine and Codeine phosphate、Tylenol with Codeine phosphate、Ultra StrengthBengay Cream、Ultracet、UR8880、V0498TA01A、Vicks NyQuil Cold and Flu Relief、Vicoprofen、Vimovo、Voltaren Emulgel、Voltaren GEL、Voltaren NOVARTIS CONSUMERHEALTH GMBH、Voltaren XR、VT122、Xefo、Xefo Rapid、Xefocam、Xibrom、XL3、Xodol、XP20B、XP21B、XP21L、Zipsor和Zoenasa。在另一个方面，COX-2抑制剂可以通过本领域已知的方法进行鉴定(参见例如Dannhardt，G.和Kiefer，W.Cyclooxygenase inhibitors-currentstatus and future prospects.2001.Eur.J.Med.Chem.36:109-126，其通过引用并入本文)。在一些方面，COX-2抑制剂用于治疗或预防或抑制患有晚期乳腺癌的患者中的转移。在一些方面，COX-2抑制剂与第二种治疗组合使用。在一些方面，第二种治疗是本文描述的任何治疗。在一些方面，COX-2抑制剂与选自下述的第二种治疗组合使用：地诺单抗、择泰(http://www.us.zometa.com/index.jsp？usertrack.filter_applied＝true&NovaId＝2935376934467633633；最后一次登录12/2/2012)、Carbozantinib或卡博替尼、阻断PTHLH(甲状旁腺激素样激素)或PTHrP(甲状旁腺激素相关蛋白质)的抗体或肽以及依维莫司。
在另一个方面，用于避免和/或防止骨降解的治疗试剂包括，但不限于：
-甲状旁腺激素(PTH)和甲状旁腺激素样激素(PTHLH)抑制剂(包括阻断抗体)或其重组形式(对应于PTH的氨基酸7-34的特立帕肽)。该激素通过刺激破骨细胞或增加其活性来起作用。
-雷奈酸锶：是备选经口治疗，并且构成称为“双重作用骨试剂”(DABA)的药物组的部分，因为它们刺激成骨细胞增殖且抑制破骨细胞增殖。
-“雌激素受体调节剂”(SERM)指干扰或抑制雌激素与受体的结合的化合物，与机制无关。雌激素受体调节剂的例子包括(除了别的以外)：雌激素孕激素、雌二醇、屈洛昔芬、雷洛昔芬、拉索昔芬、TSE-424、他莫昔芬、艾多昔芬、L Y353381、LY117081、托瑞米芬、氟维司群、4-[7-(2,2-二甲基-1-氧代丙氧基-4-甲基-2-[4-[2-(1-哌啶基)乙氧基]苯基]-2H-1-苯并吡喃-3-基]-苯基-2,2-二甲基丙酸4,4'二羟基二苯甲酮-2,4-二硝基苯基腙和SH646。
-降钙素：通过降钙素受体直接抑制破骨细胞活性。降钙素受体已在破骨细胞的表面上得到鉴定。
-双膦酸盐：是用于预防和治疗伴随骨吸收和重吸收的疾病例如骨质疏松症和具有骨转移的癌症(伴随或不伴随高钙血症，与乳腺癌和前列腺癌相关)的一组药用产品。可以用于借助于本发明的第五种方法设计的疗法中的双膦酸盐的例子包括，但不限于含氮双膦酸盐(例如帕米膦酸盐、奈立膦酸盐、奥帕膦酸盐、阿仑膦酸盐、伊班膦酸盐、利塞膦酸盐、伊卡膦酸盐、唑来膦酸盐或唑来膦酸等)和非含氮双膦酸盐(例如依替膦酸盐、氯膦酸盐、替鲁膦酸盐等)。
-“组织蛋白酶K抑制剂”指干扰组织蛋白酶K半胱氨酸蛋白酶活性的化合物。组织蛋白酶K抑制剂的非限制性例子包括4-氨基-嘧啶-2-腈衍生物(在国际专利申请WO 03/020278中在名称Novartis Pharma GMBH下描述)、公开WO 03/020721(Novartis PharmaGMBH)和公开WO 04/000843(ASTRAZENECA AB)中所述的吡咯并嘧啶，以及AxysPharmaceuticals的公开PCT WO 00/55126、Merck Frosst Canada&Co.和AxysPharmaceuticals的WO 01/49288中所述的抑制剂。
-“DKK-1(Dickkopf-1)抑制剂”如本文使用的是指能够减少DKK-1活性的任何化合物。DKK-1是在成人骨中占优势表达且在具有溶骨性病损的骨髓瘤患者中上调的可溶性Wnt途径拮抗剂。靶向DKK-1的试剂可以在预防多发性骨髓瘤患者中的溶骨性疾病中起作用。来自Novartis的BHQ880是全新的全人抗DKK-1中和抗体。临床前研究支持BHQ880促进骨形成和从而抑制肿瘤诱导的溶骨性疾病的假设(Ettenberg S.等人，American Associationfor Cancer Research Annual Meeting.April 12–16，2008；San Diego，Calif.Abstract)。
-“MET和VEGFR2双重抑制剂”如本文使用的是指被设计为阻断MET驱动的肿瘤逃逸的MET和VEGF途径的强力双重抑制剂的任何化合物。MET不仅在肿瘤细胞和内皮细胞中表达，还在成骨细胞(骨形成细胞)和破骨细胞(骨去除细胞)中表达。HGF与所有这些细胞类型上的MET结合，给予MET途径在多重自分泌和旁分泌环中的重要作用。MET在肿瘤细胞中的活化看起来在转移性骨病损的建立中是重要的。同时，成骨细胞和破骨细胞中的MET途径的活化可以导致骨转移的病理特点，包括异常骨生长(即增生病损)或破坏(即溶解性病损)。因此，靶向MET途径可以是阻止转移性骨病损的建立和进展中的可行策略。卡博替尼(Exelixis，Inc)以前称为XL184(CAS 849217-68-1)，是MET和VEGF途径的强力双重抑制剂，其被设计为阻断MET驱动的肿瘤逃避。在多个临床前研究中，卡博替尼已显示杀死肿瘤细胞、减少转移且抑制血管生成(支持肿瘤生长必需的新血管的形成)。另一种合适的双重抑制剂是E7050(N-[2-氟-4-({2-[4-(4-甲基哌嗪-1-基)哌啶-1-基]羰基氨基吡啶-4-基}氧基)苯基]-N′-(4-氟苯基)环丙烷-1,1-二甲酰胺(2R,3R)-酒石酸酯)(CAS 928037-13-2)或Foretinib(也称为GSK1363089、XL880、CAS 849217-64-7)。
-“RANKL抑制剂”如本文使用的是指能够减少RANK活性的任何化合物。RANKL在间质和T淋巴细胞的成骨细胞膜的表面上发现，并且这些T淋巴细胞是已证实具有分泌其的能力的唯一细胞。它的主要功能是破骨细胞(牵涉骨吸收的细胞)的活化。RANKL抑制剂可以通过下述来起作用：阻断RANKL与其受体(RANK)的结合，通过阻断RANKL的转录或翻译来阻断RANK介导的信号传导或减少RANKL的表达。适用于本发明的RANKL拮抗剂或抑制剂包括但不限于：
○一种合适的RANK蛋白质，其能够结合RANKL并包含RANK蛋白质的整个细胞外结构域或其片段。可溶性的RANK可以包含鼠科或人RANK多肽的信号肽和细胞外结构域，或者备选地，可以使用信号肽被除去的成熟形式的蛋白质。
○具有RANKL结合能力的骨保护素或其变体。
○RANKL特异性反义分子。
○能够加工RANKL的所转录的产物的核酶。
○特异性抗RANKL抗体。“抗RANKL抗体或定向针对RANKL的抗体”在本文中可理解为所有以下抗体：其能够与核因子κB(RANKL)的活化受体的配体特异性结合，从而抑制一种或多种RANKL的功能。可以使用本领技术人员已知的任何方法来制备抗体。因此，通过使用待抑制的蛋白质来免疫动物，从而制备多克隆抗体。单克隆抗体使用Kohler、Milstein等人(Nature,1975,256:495)所述的方法来制备。适用于本发明的内容的抗体包括包含可变抗原结合区和恒定区的完整抗体，片段“Fab”、“F(ab′)2”和“Fab`”、Fv、scFv，双抗体和双特异性抗体。
○特异性抗RANKL纳米抗体。纳米抗体为抗体衍生的治疗蛋白质，其包含天然形成的重链抗体的独特的结构和功能性质。纳米抗体的技术最初是由以下发现发展来的：骆驼科(骆驼和美洲驼)拥有缺乏轻链的完整的功能抗体。纳米抗体的一般结构为：
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
其中FR1至FR4为构架区1至4，CDR1至CDR3为互补性决定区1至3。这些重链抗体包含单一的可变结构域(VHH)和2个恒定结构域(CH2和CH3)。重要的是，克隆的且分离的VHH结构域为完全稳定的多肽，其容留了原始重链抗体的全部抗原结合能力。这些新发现的具有独特结构和功能性质的VHH结构域形成了新一代治疗抗体(Ablynx将其命名为纳米抗体)的基础。
在一个实施方案中，RANKL抑制剂选自RANKL特异性抗体、RANKL特异性纳米抗体和骨保护素。在具体实施方案中，抗RANKL抗体是单克隆抗体。在一个更加具体的实施方案中，抗RANKL抗体是地舒单抗(Pageau，Steven C.(2009).mAbs 1(3):210-215，CAS编号615258-40-7)(其整个内容通过引用在此并入)。地舒单抗是全人单克隆抗体，其与RANKL结合且阻止其活化(它不与RANK受体结合)。地舒单抗的各个方面由美国专利号6,740,522；7,411,050；7,097,834；7,364,736(其整个内容通过引用全文在此并入)涵盖。在另一个实施方案中，RANKL抑制剂是结合与地舒单抗相同的表位的抗体、抗体片段或融合构建体。
在优选实施方案中，抗RANKL纳米抗体是如WO2008142164(其整个内容通过引用并入本申请)中所述的纳米抗体中的任一种。在一个更加优选的实施方案中，抗RANKL抗体是ALX-0141(Ablynx)。ALX-0141已被设计为抑制与闭经后骨质疏松症、类风湿性关节炎、癌症和某些用药相关的骨丢失，并且恢复健康骨代谢的平衡。
在优选实施方案中，预防骨降解的试剂选自双膦酸盐、RANKL抑制剂、PTH和PTHLH抑制剂或PRG类似物、雷奈酸锶、DKK-1抑制剂、MET和VEGFR2双重抑制剂、雌激素受体调节剂、镭-223降钙素和组织蛋白酶K抑制剂。在更优选的实施方案中，预防骨降解的试剂是双膦酸盐。在一个更加优选的实施方案中，双膦酸盐是唑来膦酸。
在一个实施方案中，施用CCR5拮抗剂以预防或抑制原发性乳腺癌肿瘤向骨的转移。在一个实施方案中，CCR5拮抗剂是大分子。在另一个实施方案中，CCR5拮抗剂是小分子。在一些实施方案中，CCR5拮抗剂是马拉韦罗(Velasco-Veláquez，M.等人2012.CCR5Antagonist Blocks Metastasis of Basal Breast Cancer Cells.CancerResearch.72:3839-3850.)。在一些实施方案中，CCR5拮抗剂是维克韦罗。(Velasco-Veláquez，M.等人2012.CCR5 Antagonist Blocks Metastasis of Basal Breast CancerCells.Cancer Research.72:3839-3850.)。在一些方面，CCR5拮抗剂是阿拉韦罗(DemarestJ.F.等人2005.Update on Aplaviroc:An HIV Entry Inhibitor TargetingCCR5.Retrovirology 2(Suppl.1):S13)。在一些方面，CCR5拮抗剂是螺哌啶CCR5拮抗剂。(Rotstein D.M.等人2009.Spiropiperidine CCR5 antagonists.Bioorganic&MedicinalChemistry Letters.19(18):5401-5406。在一些实施方案中，CCR5拮抗剂是INCB009471(Kuritzkes，D.R.2009.HIV-1entry inhibitors:an overview.Curr.Opin.HIV AIDS.4(2):82-7)。
在优选实施方案中，MET和VEGFR2双重抑制剂选自卡博替尼、Foretinib和E7050。
在优选实施方案中，镭223疗法是alpharadin。
备选地，可以进行组合治疗，其中将来自上述那些的超过一种试剂组合以治疗和/或预防转移，或所述试剂可以与其他补充物例如钙或维生素D或与激素治疗组合。
用于预测乳腺癌患者中的早期骨转移的方法。
在另一个方面，本发明涉及用于测定患有乳腺癌例如HER2+乳腺癌的受试者中的骨转移风险的体外方法，其包括测定所述受试者的样品中MAF基因的表达水平，其中所述基因的表达水平超过平均值加一个标准差指示早期骨转移的风险增加。
在优选实施方案中，骨转移是极早期骨转移。
在优选实施方案中，骨转移是溶骨性转移。
如本文使用的，“早期骨转移”涉及在患有乳腺癌的患者的手术后5年前出现的骨转移。
如本文使用的，“极早期骨转移”是指在患有癌症的患者中，在手术后的5年之前出现的骨转移。
本发明的第四种方法包括在第一个步骤中定量患有乳腺癌例如HER2+乳腺癌的受试者样品中的MAF基因表达水平。在优选实施方案中，样品是肿瘤组织样品。
在优选实施方案中，本发明的第四种方法包括仅定量作为单一标志物的MAF基因表达水平，即此方法不涉及测定任何另外标志物的表达水平。MAF基因表达水平可以如先前对于本发明的第一种方法公开的进行定量。
在优选实施方案中，乳腺癌是HER2+乳腺癌。
在第二个步骤中，所述基因的表达水平超过平均值加一个标准差指示早期骨转移的风险增加。
如本文使用的，“平均水平”指MAF表达水平的单一值(作为平均值、众数或中值)，其概括或代表一组不等值的一般意义。在优选实施方案中，平均水平对应于得自乳腺癌肿瘤的代表性同类者的表达水平的平均值。患者同类者通过年龄进行定义，其代表尝试评估的个体受试者。
如本文使用的，“标准差”指数字集合的分散性的量度。例如，MAF的平均标准水平的标准差是在乳腺肿瘤样品中发现的MAF水平的集合的分散性。数据分散得越开，偏差越高。标准差可以通过在频率分布中的观察值与其平均值的平方偏差的平均值的平均根而获得。
在来自患有乳腺癌例如HER2+乳腺癌的受试者的样品中MAF基因表达水平已得到测量且与平均水平相比较后，如果所述基因的表达水平就平均水平而言超过平均值加一个标准差，则可以得出结论所述受试者具有发展早期骨转移的更大趋势。
用于设计具有骨转移的HER2+乳腺癌患者中的定制疗法的方法
在另一个方面，本发明涉及用于设计用于具有骨转移的HER2+乳腺癌受试者中的定制疗法的体外方法(下文称为本发明的第五种方法)，其包括
i)定量所述受试者的骨转移样品中的MAF基因表达水平，和
ii)将步骤(i)中获得的表达水平与参考值进行比较，
其中如果MAF基因表达水平相对于所述参考值增加，则所述受试者对接受旨在预防骨降解的疗法易感。
在优选实施方案中，骨转移是溶骨性转移。
本发明的第五种方法包括在第一个步骤中，定量患有HER2+乳腺癌的受试者的样品中的MAF基因表达水平(或MAF易位或扩增)。在本发明的第五种方法的情况下，样品可以是来自骨转移的组织样品。
在优选实施方案中，本发明的第五种方法包括仅定量作为单一标志物的MAF基因表达水平，即此方法不涉及测定任何另外标志物的表达水平。
在第二个步骤中，在受试者的肿瘤样品中获得的MAF基因表达水平(或MAF易位或扩增)与参考值相比较。在优选实施方案中，参考值是对照样品中的MAF基因表达水平。取决于待分析的肿瘤类型，对照样品的确切性质可以改变。因此，在涉及本发明的第五种方法的情况下，则参考样品是来自患有HER2+乳腺癌的受试者(其未患有转移)的样品，或对应于患有HER2+乳腺癌的受试者(其未患有转移)的活组织检查样品中的肿瘤组织集合中测量的MAF基因表达水平的中值的样品。
在样品中的MAF基因表达水平得到测量且与参考值(例如对照样品的MAF基因表达水平)相比较后，如果所述基因的表达水平就参考值而言是增加的，则这指示所述受试者对接受旨在避免或防止骨降解的疗法易感。
用于避免和/或防止骨降解的试剂的举例说明性例子包括，尽管并不限于：
-甲状旁腺激素(PTH)和甲状旁腺激素样激素(PTHLH)抑制剂(包括阻断抗体)或其重组形式(对应于PTH的氨基酸7-34的特立帕肽)。该激素通过刺激破骨细胞或增加其活性来起作用。
-雷奈酸锶：是备选经口治疗，并且构成称为“双重作用骨试剂”(DABA)的药物组的部分，因为它们刺激成骨细胞增殖且抑制破骨细胞增殖。
-“雌激素受体调节剂”(SERM)指干扰或抑制雌激素与受体的结合的化合物，与机制无关。雌激素受体调节剂的例子包括(除了别的以外)：雌激素孕激素、雌二醇、屈洛昔芬、雷洛昔芬、拉索昔芬、TSE-424、他莫昔芬、艾多昔芬、L Y353381、LY117081、托瑞米芬、氟维司群、4-[7-(2,2-二甲基-1-氧代丙氧基-4-甲基-2-[4-[2-(1-哌啶基)乙氧基]苯基]-2H-1-苯并吡喃-3-基]-苯基-2,2-二甲基丙酸4,4'二羟基二苯甲酮-2,4-二硝基苯基腙和SH646。
-降钙素：通过降钙素受体直接抑制破骨细胞活性。降钙素受体已在破骨细胞的表面上得到鉴定。
-双膦酸盐：是用于预防和治疗伴随骨吸收和重吸收的疾病例如骨质疏松症和具有骨转移的癌症(伴随或不伴随高钙血症，与乳腺癌和前列腺癌相关)的一组药用产品。可以用于借助于本发明的第五种方法设计的疗法中的双膦酸盐的例子包括，但不限于含氮双膦酸盐(例如帕米膦酸盐、奈立膦酸盐、奥帕膦酸盐、阿仑膦酸盐、伊班膦酸盐、利塞膦酸盐、伊卡膦酸盐、唑来膦酸盐或唑来膦酸等)和非含氮双膦酸盐(例如依替膦酸盐、氯膦酸盐、替鲁膦酸盐等)。
-Alpharadin(二氯化镭-223)。Alpharadin使用由镭-223衰变产生的α辐射以杀死癌细胞。镭-223作为钙-模拟物凭借其性质本能地自靶向骨转移。α辐射具有2-10个细胞的极短的射程(与目前的放疗(其基于β或γ辐射)相比)，因此对周围的健康组织产生较少的损伤(特别是骨髓)。由于镭-223与钙具有相似的性质，所以镭-223被吸引至身体中钙用于建造骨的地方，包括快速异常的骨生长的位点，例如患有晚期的去势抵抗性前列腺癌的男性的骨骼转移中所见。在注射镭-223之后，镭-223在血流中被携带至异常骨生长的部位。身体中癌症起始的地方称为原发性肿瘤。这些细胞的一些细胞可以脱离，并在血流中被携带至身体的另一个部分。然后，癌细胞可以安顿在身体的该部分并形成新的肿瘤。如果发生这种情况，则称为继发癌症或转移。患有晚期前列腺癌的大部分患者在他们的骨中遭受最大的疾病负担。使用镭-223的目的是选择性地靶向这种继发癌症。未被骨吸收的任何镭-223快速地按照路线到达内脏并被排出。
-“组织蛋白酶K抑制剂”指干扰组织蛋白酶K半胱氨酸蛋白酶活性的化合物。组织蛋白酶K抑制剂的非限制性例子包括4-氨基-嘧啶-2-腈衍生物(在国际专利申请WO 03/020278中在名称Novartis Pharma GMBH下描述)、公开WO 03/020721(Novartis PharmaGMBH)和公开WO 04/000843(ASTRAZENECA AB)中所述的吡咯并嘧啶，以及AxysPharmaceuticals的公开PCT WO 00/55126、Merck Frosst Canada&Co.和AxysPharmaceuticals的WO 01/49288中所述的抑制剂。
-“DKK-1(Dickkopf-1)抑制剂”如本文使用的是指能够减少DKK-1活性的任何化合物。DKK-1是在成人骨中占优势表达且在具有溶骨性病损的骨髓瘤患者中上调的可溶性Wnt途径拮抗剂。靶向DKK-1的试剂可以在预防多发性骨髓瘤患者中的溶骨性疾病中起作用。来自Novartis的BHQ880是全新的全人抗DKK-1中和抗体。临床前研究支持BHQ880促进骨形成和从而抑制肿瘤诱导的溶骨性疾病的假设(Ettenberg S.等人，American Associationfor Cancer Research Annual Meeting.April 12–16，2008；San Diego，Calif.Abstract)。
-“MET和VEGFR2双重抑制剂”如本文使用的是指被设计为阻断MET驱动的肿瘤逃逸的MET和VEGF途径的强力双重抑制剂的任何化合物。MET不仅在肿瘤细胞和内皮细胞中表达，还在成骨细胞(骨形成细胞)和破骨细胞(骨去除细胞)中表达。HGF与所有这些细胞类型上的MET结合，给予MET途径在多重自分泌和旁分泌环中的重要作用。MET在肿瘤细胞中的活化看起来在转移性骨病损的建立中是重要的。同时，成骨细胞和破骨细胞中的MET途径的活化可以导致骨转移的病理特点，包括异常骨生长(即增生病损)或破坏(即溶解性病损)。因此，靶向MET途径可以是阻止转移性骨病损的建立和进展中的可行策略。卡博替尼(Exelixis，Inc)以前称为XL184(CAS 849217-68-1)，是MET和VEGF途径的强力双重抑制剂，其被设计为阻断MET驱动的肿瘤逃避。在多个临床前研究中，卡博替尼已显示杀死肿瘤细胞、减少转移且抑制血管生成(支持肿瘤生长必需的新血管的形成)。另一种合适的双重抑制剂是E7050(N-[2-氟-4-({2-[4-(4-甲基哌嗪-1-基)哌啶-1-基]羰基氨基吡啶-4-基}氧基)苯基]-N′-(4-氟苯基)环丙烷-1,1-二甲酰胺(2R,3R)-酒石酸酯)(CAS 928037-13-2)或Foretinib(也称为GSK1363089、XL880、CAS 849217-64-7)。
-“RANKL抑制剂”如本文使用的是指能够减少RANK活性的任何化合物。RANKL在间质和T淋巴细胞的成骨细胞膜的表面上发现，并且这些T淋巴细胞是已证实具有分泌其的能力的唯一细胞。它的主要功能是破骨细胞(牵涉骨吸收的细胞)的活化。RANKL抑制剂可以通过下述来起作用：阻断RANKL与其受体(RANK)的结合，通过阻断RANKL的转录或翻译来阻断RANK介导的信号传导或减少RANKL的表达。适用于本发明的RANKL拮抗剂或抑制剂包括但不限于：
○一种合适的RANK蛋白质，其能够结合RANKL并包含RANK蛋白质的整个细胞外结构域或其片段。可溶性的RANK可以包含鼠科或人RANK多肽的信号肽和细胞外结构域，或者备选地，可以使用信号肽被除去的成熟形式的蛋白质。
○具有RANKL结合能力的骨保护素或其变体。
○RANKL特异性反义分子。
○能够加工RANKL的所转录的产物的核酶。
○特异性抗RANKL抗体。“抗RANKL抗体或定向针对RANKL的抗体”在本文中可理解为所有以下抗体：其能够与核因子κB(RANKL)的活化受体的配体特异性结合，从而抑制一种或多种RANKL的功能。可以使用本领技术人员已知的任何方法来制备抗体。因此，通过使用待抑制的蛋白质来免疫动物，从而制备多克隆抗体。单克隆抗体使用Kohler、Milstein等人(Nature,1975,256:495)所述的方法来制备。适用于本发明的内容的抗体包括包含可变抗原结合区和恒定区的完整抗体，片段“Fab”、“F(ab′)2”和“Fab`”、Fv、scFv，双抗体和双特异性抗体。
○特异性抗RANKL纳米抗体。纳米抗体为抗体衍生的治疗蛋白质，其包含天然形成的重链抗体的独特的结构和功能性质。纳米抗体的技术最初是由以下发现发展来的：骆驼科(骆驼和美洲驼)拥有缺乏轻链的完整的功能抗体。纳米抗体的一般结构为：
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
其中FR1至FR4为构架区1至4，CDR1至CDR3为互补性决定区1至3。这些重链抗体包含单一的可变结构域(VHH)和2个恒定结构域(CH2和CH3)。重要的是，克隆的且分离的VHH结构域为完全稳定的多肽，其容留了原始重链抗体的全部抗原结合能力。这些新发现的具有独特结构和功能性质的VHH结构域形成了新一代治疗抗体(Ablynx将其命名为纳米抗体)的基础。
在一个实施方案中，RANKL抑制剂选自RANKL特异性抗体、RANKL特异性纳米抗体和骨保护素。在具体实施方案中，抗RANKL抗体是单克隆抗体。在一个更加具体的实施方案中，抗RANKL抗体是地舒单抗(Pageau，Steven C.(2009).mAbs 1(3):210-215，CAS编号615258-40-7)(其整个内容通过引用在此并入)。地舒单抗是全人单克隆抗体，其与RANKL结合且阻止其活化(它不与RANK受体结合)。地舒单抗的各个方面由美国专利号6,740,522；7,411,050；7,097,834；7,364,736(其整个内容通过引用全文在此并入)涵盖。在另一个实施方案中，RANKL抑制剂是结合与地舒单抗相同的表位的抗体、抗体片段或融合构建体。
在优选实施方案中，抗RANKL纳米抗体是如WO2008142164(其整个内容通过引用并入本申请)中所述的纳米抗体中的任一种。在一个更加优选的实施方案中，抗RANKL抗体是ALX-0141(Ablynx)。ALX-0141已被设计为抑制与闭经后骨质疏松症、类风湿性关节炎、癌症和某些用药相关的骨丢失，并且恢复健康骨代谢的平衡。
在优选实施方案中，预防骨降解的试剂选自双膦酸盐、RANKL抑制剂、PTH和PTHLH抑制剂或PRG类似物、雷奈酸锶、DKK-1抑制剂、MET和VEGFR2双重抑制剂、雌激素受体调节剂、镭-223降钙素和组织蛋白酶K抑制剂。在更优选的实施方案中，预防骨降解的试剂是双膦酸盐。在一个更加优选的实施方案中，双膦酸盐是唑来膦酸。
在一个实施方案中，施用CCR5拮抗剂以预防或抑制原发性乳腺癌肿瘤向骨的转移。在一个实施方案中，CCR5拮抗剂是大分子。在另一个实施方案中，CCR5拮抗剂是小分子。在一些实施方案中，CCR5拮抗剂是马拉韦罗(Velasco-Veláquez，M.等人2012.CCR5Antagonist Blocks Metastasis of Basal Breast Cancer Cells.CancerResearch.72:3839-3850.)。在一些实施方案中，CCR5拮抗剂是维克韦罗。(Velasco-Veláquez，M.等人2012.CCR5 Antagonist Blocks Metastasis of Basal Breast CancerCells.Cancer Research.72:3839-3850.)。在一些方面，CCR5拮抗剂是阿拉韦罗(DemarestJ.F.等人2005.Update on Aplaviroc:An HIV Entry Inhibitor TargetingCCR5.Retrovirology 2(Suppl.1):S13)。在一些方面，CCR5拮抗剂是螺哌啶CCR5拮抗剂。(Rotstein D.M.等人2009.Spiropiperidine CCR5 antagonists.Bioorganic&MedicinalChemistry Letters.19(18):5401-5406。在一些实施方案中，CCR5拮抗剂是INCB009471(Kuritzkes，D.R.2009.HIV-1entry inhibitors:an overview.Curr.Opin.HIV AIDS.4(2):82-7)。
在优选实施方案中，MET和VEGFR2双重抑制剂选自卡博替尼、Foretinib和E7050。
在优选实施方案中，镭223疗法是alpharadin。
备选地，可以进行组合治疗，其中将来自上述那些的超过一种试剂组合以治疗和/或预防转移，或所述试剂可以与其他补充物例如钙或维生素D或与激素治疗组合。
基于检测MAF基因的扩增预后HER2+乳腺癌中的转移的方法
在另一个方面，本发明涉及用于预测HER2+乳腺癌在患有所述癌症的受试者中的骨转移的体外方法(下文称为本发明的第六种方法)，其包括相对于参考基因拷贝数，测定MAF基因在所述受试者的样品中是否扩增，其中就所述参考基因拷贝数而言MAF基因的扩增指示发展骨转移的风险增加。
在一些实施方案中，扩增是在16q23基因座处的区域中。在一些实施方案中，扩增是在约Chr.16-约79,392,959bp至约79,663,806bp(从着丝粒到端粒)之间的染色体区域的任何部分中。在一些实施方案中，所述的扩增在大约Chr.16-79,392,959bp至大约79,663,806bp之间的基因组区域，但是排除了DNA重复元件。在一些实施方案中，使用针对该区域的特异性探针来测量扩增。
在特定的实施方案中，可以通过测定包含所述的基因的染色体区域的扩增来测定MAF基因的扩增的程度。优选地，其扩增表明MAF基因发生扩增的染色体区域为基因座16q22-q24，其包括MAF基因。基因座16q22-q24位于染色体16中，在该染色体的长臂中，并且在分带22和分带24之间的范围内。该区域相当于NCBI数据库中的邻接片段NT_010498.15和NT_010542.15。在另一个优选的实施方案中，可以通过使用MAF基因的特异性探针来测定MAF基因扩增的程度。在另一个优选的实施方案中，通过使用VysisLSIIGH/MAF双色双融合探针(包括针对14q32和16q23的探针)来测定MAF基因的扩增。
本发明的第六种方法包括在第一个步骤中测定MAF基因是否在受试者的样品中扩增。在优选实施方案中，样品是肿瘤组织样品。为此，肿瘤样品中MAF基因的扩增相对于对照样品进行比较。
在特定实施方案中，用于预测患有HER2+乳腺癌的受试者中发展骨转移趋势的本发明的第六种方法包括测定所述受试者的样品中的MAF基因拷贝数，并且比较所述拷贝数与对照或参考样品的拷贝数，其中如果MAF拷贝数就对照样品的MAF拷贝数而言更大，则受试者具有发展骨转移的更大趋势。
对照样品分别指患有HER2+乳腺癌的受试者(其未患有转移)的样品，或对应于患有HER2+乳腺癌的受试者(其未患有转移)的活组织检查样品中的肿瘤组织集合中测量的MAF基因拷贝数的中值的样品。所述参考样品通常通过组合来自受试者群体的等量样品获得。如果MAF基因拷贝数就对照样品中的所述基因的拷贝数而言增加，则受试者具有发展转移的更大趋势。
在优选实施方案中，当MAF基因拷贝数高于参考样品或对照样品具有的拷贝数时，MAF基因就参考基因拷贝数而言是扩增的。在一个例子中，如果MAF基因的基因组拷贝数相对于对照样品在测试样品中增加至少约2-(即约6个拷贝)、约3-(即约8个拷贝)、约4-、约5-、约6-、约7-、约8-、约9-、约10-、约15-、约20-、约25-、约30-、约35-、约40-、约45-或约50-倍，则MAF基因被认为是“扩增的”。在另一个例子中，如果MAF基因的基因组拷贝数/细胞为至少约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19、约20、约21、约22、约23、约24、约25、约26、约27、约28、约29、约30等等，则MAF基因被认为是“扩增的”。
在特定实施方案中，扩增或拷贝数借助于原位杂交或PCR进行测定。
用于测定MAF基因或染色体区域16q22-q24是否是扩增的方法是现有技术中广泛已知的。所述方法包括但不限于原位杂交(ISH)(例如荧光原位杂交(FISH)、显色原位杂交(CISH)或银染原位杂交(SISH))、基因组比较杂交或聚合酶链反应(例如实时定量PCR)。对于任何ISH方法，扩增或拷贝数可以通过计数染色体或核中的荧光点、着色点或银染点进行测定。
荧光原位杂交(FISH)为用于检测和定位染色体中特定DNA序列的存在或缺如的细胞生成技术。FISH使用荧光探针，该探针仅与染色体的一些部分结合，所述的探针与所述的染色体显示出高度的序列相似性。在典型的FISH方法中，使用荧光分子或半抗原来标记DNA探针，所述的荧光分子或半抗原通常为荧光染料-dUTP(fluor-dUTP)、地高辛-dUTP、生物素-dUTP或半抗原-dUTP形式，使用酶反应(例如切口平移或PCR)将荧光分子或半抗原引入至DNA中。将含有遗传材料(染色体)的样品放置在载玻片上，并通过甲酰胺处理使其变性。然后，在本领域的技术人员所测定的合适的条件下将标记的探针与含有遗传材料的样品杂交。杂交后，直接(在使用荧光团(fluorine)来标记探针的情况下)或间接(使用荧光标记的抗体来检测半抗原)观察样品。
在CISH的情况下，使用地高辛、生物素或荧光素来标记探针，并将其与含有遗传材料的样品在合适的条件下杂交。
可以使用能够与DNA结合的任何标志或标记分子来标记在本发明的第四方法中使用的标记，从而得以检测核酸分子。用于进行所述的标记的标记物的实例包括但不限于放射性同位素、酶底物、辅因子、配体、化学发光试剂、荧光团、半抗原、酶和它们的组合。用于标记的方法和用于选择用于不同目的的合适标记的指南可以例如在Sambrook等人(Molecular Cloning:A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，New York，1989)和Ausubel等人(Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley and Sons，NewYork，1998)中发现。
在通过直接测定MAF基因的扩增、16q23基因座的扩增或通过测定基因座16q23-q24的扩增来测定扩增的存在后，并且在与对照样品中的所述基因的扩增相比较后，如果检测到MAF基因的扩增，则它指示受试者具有发展骨转移的更大趋势的事实。
MAF基因的扩增的测定需要与对照样品或参考样品的值关联，所述对照样品或参考样品的值对应于在患有HER2+乳腺癌的受试者(其未患有转移)的样品中测量的MAF基因的扩增水平，或对应于患有HER2+乳腺癌的受试者(其未患有转移)的活组织检查样品中的肿瘤组织集合中测量的MAF基因扩增的中值。所述参考样品通常通过组合来自受试者群体的等量样品来获得。一般而言，典型参考样品得自在临床上得到充分证明并且其中转移的不存在得到充分表征的受试者。参考水平来源于的样品集合优选由患有与研究的患者对象相同类型的癌症的受试者构成。在已建立此中值后，患者的肿瘤组织中c-MAF的扩增水平可以与该中值相比较，并且因此，如果存在扩增，则受试者具有发展转移的更大趋势。
在优选实施方案中，骨转移是溶骨性骨转移。如本文使用的，表达“溶骨性骨转移”指其中在转移灶附近产生骨吸收(骨密度的进行性丧失)的一类转移，所述骨吸收起因于破骨细胞活性通过肿瘤细胞的刺激，并且特征在于剧烈疼痛、病理性骨折、高钙血症、脊髓压迫症和起因于神经压迫的其他综合征。
基于检测MAF基因的易位预后HER2+乳腺癌中的转移的方法
在另一个方面，本发明涉及用于预测患有HER2+乳腺癌的患者的临床结果的体外方法，其包括测定MAF基因在所述受试者的样品中是否易位，其中MAF基因的易位指示不良临床结果。
在另一个方面，本发明涉及用于预测患有HER2+乳腺癌的患者的临床结果的体外方法，其包括测定MAF基因在所述受试者的样品中是否易位，其中MAF基因的易位指示不良临床结果。
在一些实施方案中，易位的基因来自在16q23基因座处的区域。在一些实施方案中，易位的基因来自在约Chr.16-约79,392,959bp至79,663,806bp(从着丝粒到端粒)之间的染色体区域的任何部分。在一些实施方案中，易位的基因来自在约Chr.16-约79,392,959bp至79,663,806bp之间的基因组区域，但排除DNA重复元件。在一些实施方案中，使用针对该区域的特异性探针来测量易位。
在特定实施方案中，MAF基因的易位可以借助于测定含有所述基因的染色体区域的易位进行测定。在一个实施方案中，易位是t(14,16)易位。在另一个实施方案中，易位的染色体区域来自基因座16q22-q24。基因座16q22-q24位于染色体16中，在该染色体的长臂中，并且在分带22和分带24之间的范围内。该区域对应于NCBI数据库中的邻接片段NT_010498.15和NT_010542.15。在优选实施方案中，MAF基因易位至染色体14的基因座14q32，导致易位t(14,16)(q32,q23)。这种易位将MAF基因放置紧靠IgH基因座中的强增强子，其在一些情况下导致MAF的过表达。(Eychène，A.，Rocques，N.和Puoponnot，C.，A new MAFia incancer.2008.Nature Reviews:Cancer.8:683-693.)
在优选实施方案中，MAF基因的易位可以借助于使用针对所述易位特异性的探针进行测定。在一些实施方案中，易位使用双色探针进行测量。在一些实施方案中，易位使用双融合探针进行测量。在一些实施方案中，易位使用双色、双融合探针进行测量。在一些实施方案中，易位使用两种分开的探针进行测量。
在另一个优选实施方案中，MAF基因的易位使用Vysis LSIIGH/MAF双色双融合探针(http://www.abbottmolecular.com/us/products/analyte-specific-reage nt/fish/vysis-lsi-igh-maf-dual-color-dual-fusion-probe.html；最后一次登录11/5/2012)进行测定，其包括针对14q32和16q23的探针。在另一个优选实施方案中，MAF基因的易位使用下述进行测定：Kreatech diagnostics MAF/IGH gt(14；16)融合探针(http://www.kreatech.com/products/repeat-freetm-poseidontm-fish-probes/hematology/maf-igh-gt1416-fusion-probe.html；最后一次登录11/5/2012)、Abnova MAF FISH探针(http://www.abnova.com/products/products_detail.asp？Catalog_id＝FA0375；最后一次登录11/5/2012)、Cancer Genetics Italia IGH/MAF双色、双融合易位探针(http://www.cancergeneticsitalia.com/dna-fish-probe/ighmaf/；最后一次登录11/5/2012)、Creative Bioarray IGH/MAF-t(14；16)(q32；q23)FISH探针(http://www.creative-bioarray.com/products.asp？cid＝35&page＝10；最后一次登录11/5/2012)、通过FISH的Arup Laboratories多发性骨髓瘤组(http://www.aruplab.com/files/technical-bulletins/Multiple％20Myeloma％20％28MM％29％20by％20FISH.pdf；最后一次登录11/5/2012)、对于16q23或14q32特异性的Agilent探针(http://www.genomics.agilent.com/ProductSearch.aspx？chr＝16&start＝79483700&end＝79754340；最后一次登录11/5/2012；http://www.genomics.agilent.com/ProductSearch.aspx？Pageid＝3000&ProductID＝637；最后一次登录11/5/2012)、对于16q23或14q32特异性的Dako探针(http://www.dako.com/us/ar42/psg42806000/baseproducts_surefish.htm？setCountry＝true&purl＝ar42/psg42806000/baseproducts_surefish.htm？undefined&submit＝Accept％20country；最后一次登录11/5/2012)、Cytocell IGH/MAF易位双融合探针(http://www.zentech.be/uploads/docs/products_info/prenatalogy/cytocell％202012-2013％20catalogue％5B3％5D.pdf；最后一次登录11/5/2012)、Metasystems XLIGH/MAF易位-双融合探针(http://www.metasystems-international.com/index.php？option＝com_joodb&view＝article&joobase＝5&id＝12％3Ad-5029-100-og&Itemid＝272；最后一次登录11/5/2012)、Zeiss FISH探针XL，100μl，IGH/MAFB
(https://www.micro-shop.zeiss.com/？s＝440675675dedc6&l＝en&p＝uk&f＝r&i＝5000&o＝&h＝25&n＝1&sd＝000000-0528-231-uk；最后一次登录11/5/2012)或Genycell Biotech IGH/MAF双融合探针(http://www.google.com/url？sa＝t&rct＝j&q＝&esrc＝s&source＝web&cd＝1&ved＝0CCQQFjAA&url＝http％3A％2F％2Fwww.genycell.es％2Fimages％2Fproductos％2Fbrochures％2Flphmie6_86.ppt&ei＝MhGYUOi3GKWH0QGlt4DoDw&usg＝AFQjCNEqQMbT8vQGjJbi9riEf3lVgoFTFQ&sig2＝V5IS8juEMVHB18Mv2Xx_Ww；最后一次登录11/5/2012)。
在一些实施方案中，在探针上的标记是荧光团。在一些实施方案中，在探针上的荧光团是橙色的。在一些实施方案中，在探针上的荧光团是绿色的。在一些实施方案中，在探针上的荧光团是红色的。在一些情况下，在探针上的荧光团是黄色的。在一些实施方案中，一种探针用红色荧光团进行标记，并且一种探针用绿色荧光团进行标记。在一些实施方案中，一种探针用绿色荧光团进行标记，并且一种探针用橙色荧光团进行标记。在一些情况下，在探针上的荧光团是黄色的。例如，如果MAF特异性探针用红色荧光团进行标记，并且IGH特异性探针用绿色荧光团进行标记，如果看见白色，则这指示信号重叠并且易位已发生。
在一些实施方案中，荧光团是SpectrumOrange。在一些实施方案中，荧光团是SpectrumGreen。在一些实施方案中，荧光团是DAPI。在一些实施方案中，荧光团是PlatinumBright405。在一些实施方案中，荧光团是PlatinumBright415。在一些实施方案中，荧光团是PlatinumBright495。在一些实施方案中，荧光团是PlatinumBright505。在一些实施方案中，荧光团是PlatinumBright550。在一些实施方案中，荧光团是PlatinumBright547。在一些实施方案中，荧光团是PlatinumBright570。在一些实施方案中，荧光团是PlatinumBright590。在一些实施方案中，荧光团是PlatinumBright647。在一些实施方案中，荧光团是PlatinumBright495/550。在一些实施方案中，荧光团是PlatinumBright415/495/550。在一些实施方案中，荧光团是DAPI/PlatinumBright495/550。在一些实施方案中，荧光团是FITC。在一些实施方案中，荧光团是Texas Red。在一些实施方案中，荧光团是DEAC。在一些实施方案中，荧光团是R6G。在一些实施方案中，荧光团是Cy5。在一些实施方案中，荧光团是FITC、Texas Red和DAPI。在一些实施方案中，DAPI复染剂用于显现易位、扩增或拷贝数改变。
本发明的一个实施方案包括这样的方法，其中在第一个步骤中，测定MAF基因在受试者的样品中是否易位。在优选实施方案中，样品是肿瘤组织样品。
在特定实施方案中，用于预后患有HER2+乳腺癌的受试者中发展骨转移的趋势的本发明方法包括测定其中MAF基因是易位的所述受试者的样品中的MAF基因拷贝数，并且比较所述拷贝数与对照或参考样品的拷贝数，其中如果MAF拷贝数就对照样品的MAF拷贝数而言更多，则受试者具有发展骨转移的更大趋势。
用于测定MAF基因或染色体区域16q22-q24是否易位的方法是现有技术中广泛使用的，并且包括先前对于MAF扩增描述的那些。所述方法包括但不限于原位杂交(ISH)(例如荧光原位杂交(FISH)，显色原位杂交(CISH)或银染原位杂交(SISH))，基因组的比较杂交或聚合酶链反应(例如实时定量PCR)。对于任何ISH方法，扩增、拷贝数或易位可以通过计数染色体或核中的荧光点、着色点或银染点进行测定。在其他实施方案中，拷贝数改变和易位的检测可以通过使用全基因组测序、外显子组测序或通过使用任何PCR衍生的技术进行检测。例如，PCR可以对基因组DNA的样品执行，以检测易位。在一个实施方案中，使用定量PCR。在一个实施方案中，PCR用对于MAF基因特异性的引物和对于IGH启动子区特异性的引物执行；如果产生产物，则易位已发生。
在一些实施方案中，在测定MAF基因的易位后，测定MAF基因的扩增和拷贝数。在一些实施方案中，探针用于测定细胞对于MAF基因是否是多倍体。在一些实施方案中，多倍体的测定通过测定是否存在来自目的基因的超过2种信号来作出。在一些实施方案中，多倍体通过测量来自对于目的基因特异性的探针的信号且将其与着丝粒探针或其他探针相比较进行测定。
基于检测MAF基因的扩增预后HER2+乳腺癌中的临床结果的方法
在另一个方面，本发明涉及用于预测患有HER2+乳腺癌的患者的临床结果的体外方法(下文称为本发明的第七种方法)，其包括相对于参考基因拷贝数，测定MAF基因在所述受试者的样品中是否扩增，其中就所述参考基因拷贝数而言MAF基因的扩增指示不良临床结果。
本发明的第七种方法包括在第一个步骤中测定MAF基因是否在受试者的样品中扩增。MAF扩增的测定基本上如本发明的第五种方法中所述进行。在优选实施方案中，样品是肿瘤组织样品。在优选实施方案中，MAF基因的扩增借助于测定基因座16q23或16q22-q24的扩增进行测定。在另一个优选实施方案中，MAF基因的扩增借助于使用MAF基因特异性探针进行测定。
在第二个步骤中，本发明的第七种方法包括比较所述拷贝数与对照或参考样品的拷贝数，其中如果MAF拷贝数就对照样品的MAF拷贝数而言更多，则这指示不良临床结果。
在优选实施方案中，当MAF基因拷贝数高于参考样品或对照样品具有的拷贝数时，MAF基因就参考基因拷贝数而言是扩增的。在一个例子中，如果MAF基因的基因组拷贝数相对于对照样品在测试样品中增加至少约2-(即约6个拷贝)、约3-(即约8个拷贝)、约4-、约5-、约6-、约7-、约8-、约9-、约10-、约15-、约20-、约25-、约30-、约35-、约40-、约45-或约50-倍，则MAF基因被认为是“扩增的”。在另一个例子中，如果MAF基因的基因组拷贝数/细胞为至少约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19、约20、约21、约22、约23、约24、约25、约26、约27、约28、约29、约30等等，则MAF基因被认为是“扩增的”。
在另一个实施方案中，参考基因拷贝数是来自未患有骨转移的受试者的HER2+乳腺癌的样品中的基因拷贝数。
在另一个实施方案中，扩增借助于原位杂交或PCR进行测定。
用于设计具有HER2+乳腺肿瘤的患者中的定制疗法的方法
如现有技术已知的，待施用于患有癌症的受试者的治疗取决于癌症是否是恶性肿瘤，即它是否具有经历转移的高概率，或癌症是否是良性肿瘤。在第一个假设中，选择的治疗是全身治疗例如化学疗法，并且在第二个假设中，选择的治疗是局限性治疗例如放射疗法。
因此，如本申请中描述的，考虑到HER2+乳腺癌细胞中的MAF基因扩增或易位与骨转移的存在关联，MAF基因扩增或易位可用于就用于患有所述癌症的受试者的最合适疗法而言作出决策。在优选实施方案中，MAF基因的扩增借助于测定基因座16q23或16q22-q24的扩增进行测定。在另一个优选实施方案中，MAF基因的扩增借助于使用MAF基因特异性探针进行测定。
因此，在另一个方面，本发明涉及用于设计用于患有HER2+乳腺癌的受试者的定制疗法的体外方法(下文称为本发明的第三种方法)，其包括
iii)定量所述受试者的样品中的MAF基因扩增或易位，和
iv)将i)中获得的基因扩增或易位与参考值进行比较，
其中如果MAF基因扩增或易位相对于所述参考值增加，则所述受试者对接受旨在预防和/或治疗骨转移的疗法易感。如果MAF基因扩增或易位相对于所述参考值不增加，则所述受试者对接受旨在预防和/或治疗骨转移的疗法不易感。
在优选实施方案中，MAF基因的扩增借助于测定基因座16q23或16q22-q24的扩增进行测定。在另一个优选实施方案中，MAF基因的扩增借助于使用MAF基因特异性探针进行测定。
在特定实施方案中，骨转移是溶骨性转移。
本发明的另一种方法包括定量患有HER2+乳腺癌的受试者的样品中的MAF基因扩增或易位。在优选实施方案中，样品是肿瘤组织样品。
在另一个特定实施方案中，本发明的方法包括仅定量作为单一标志物的MAF基因扩增或易位，即此方法不涉及测定任何另外标志物的表达水平。
在本发明的该特定方法的情况下，样品可以是受试者的原发性肿瘤组织样品。
在第二个步骤中，在受试者的肿瘤样品中获得的MAF基因扩增或易位与参考值相比较。在优选实施方案中，参考值是对照样品中的所述基因的MAF基因扩增或易位。MAF基因扩增或易位的测定必须与对照样品或参考样品的值相关。取决于待分析的肿瘤类型，对照样品的确切性质可以改变。因此，优选地，参考样品是患有HER2+乳腺癌(其仍未转移)的受试者的样品，或对应于患有HER2+乳腺癌(其仍未转移)的受试者的活组织检查样品中的肿瘤组织集合中测量的MAF基因扩增或易位的样品。
在样品中的MAF基因扩增或易位已进行测量且与参考值相比较后，如果所述基因的扩增或易位相对于所述参考值增加，则可以得出结论所述受试者对接受或不接受旨在预防(如果受试者仍未经历转移)和/或治疗转移或不预防和/或治疗转移(如果受试者已经历转移)的疗法易感。
当癌症已转移时，可以使用全身治疗包括但不限于化学疗法、激素治疗、免疫疗法或其组合。另外，可以使用放射疗法和/或手术。治疗的选择一般取决于原发性癌症的类型、大小、转移灶位置、患者年龄、一般健康和先前使用的治疗类型。
全身治疗是到达整个身体且可以代表旨在预防(如果受试者仍未经历转移)和/或治疗转移(如果受试者已经历转移)的疗法，例如：
-化疗为使用药剂来破坏癌症细胞。所述的药剂通常通过口腔或静脉内途径给予。有时，化疗与放射治疗一起使用。用于乳腺癌症的合适的化疗治疗包括但不限于：蒽环类抗生素(阿霉素,表柔比星,聚乙二醇脂质体阿霉素),紫杉烷(紫杉醇,多西他奇,白蛋白纳米颗粒结合的紫杉醇),5-氟尿嘧啶(连续输注5-FU,卡培他滨),长春花生物碱(长春瑞滨,长春碱),吉西他滨,铂盐(顺铂,卡波铂),环磷酰胺,依托泊苷,以及上述一种或多种的组合，例如环磷酰胺/蒽环类抗生素+/-5-氟尿嘧啶方案(例如阿霉素/环磷酰胺(AC),表柔比星/环磷酰胺,(EC)环磷酰胺/表柔比星/5-氟尿嘧啶(CEF),环磷酰胺/阿霉素/5-氟尿嘧啶(CAF),5-氟尿嘧啶/表柔比星/环磷酰胺(FEC)),环磷酰胺/甲氨蝶呤/5-氟尿嘧啶(CMF),蒽环类抗生素/紫杉烷(例如阿霉素/紫杉醇或阿霉素/多西他奇),多西他奇/卡培他滨,吉西他滨/紫杉醇,紫杉烷/铂方案(例如紫杉醇/卡波铂或多西他奇/卡波铂)。
-免疫治疗为有助于患者的免疫系统本身与癌症战斗的治疗。有多种类型的免疫治疗用于治疗患者的转移。这些治疗包括但不限于细胞因子、单克隆抗体和抗肿瘤疫苗。
在另一个方面，治疗为Alpharadin(二氯化镭-223)。Alpharadin使用由镭-223衰变产生的α辐射以杀死癌细胞。镭-223作为钙-模拟物凭借其性质本能地自靶向骨转移。α辐射具有2-10个细胞的极短的射程(与目前的放疗(其基于β或γ辐射)相比)，因此对周围的健康组织产生较少的损伤(特别是骨髓)。由于镭-223与钙具有相似的性质，所以镭-223被吸引至身体中钙用于建造骨的地方，包括快速异常的骨生长的位点，例如患有晚期的去势抵抗性前列腺癌的男性的骨骼转移中所见。在注射镭-223之后，镭-223在血流中被携带至异常骨生长的部位。身体中癌症起始的地方称为原发性肿瘤。这些细胞的一些细胞可以脱离，并在血流中被携带至身体的另一个部分。然后，癌细胞可以安顿在身体的该部分并形成新的肿瘤。如果发生这种情况，则称为继发癌症或转移。患有晚期前列腺癌的大部分患者在他们的骨中遭受最大的疾病负担。使用镭-223的目的是选择性地靶向这种继发癌症。未被骨吸收的任何镭-223快速地按照路线到达内脏并被排出。
在另一个方面，治疗为mTor抑制剂。在一些方面，mTor抑制剂为双重mTor/PI3激酶抑制剂。在一些方面，mTor抑制剂用于预防或抑制转移。在一些方面，mTor抑制剂选自：ABI009(西罗莫司)、雷帕霉素(西罗莫司)、Abraxane(紫杉醇)、Absorb(依维莫司)、Afinitor(依维莫司)、Afinitor和Gleevec、AS703026(pimasertib)、Axxess(乌米莫司)、AZD2014、BEZ235、Biofreedom(乌米莫司)、BioMatrix(乌米莫司)、BioMatrixflex(乌米莫司)、CC115、CC223、ComboBio-engineeredSirolimusElutingStentORBUSNEICH(西罗莫司)、CuraxinCBLC102(阿的平)、DE109(西罗莫司)、DS3078、EndeavorDES(佐他莫司)、EndeavorResolute(佐他莫司)、Femara(来曲唑)、Hocena(安卓奎诺尔)、INK128、Inspiron(西罗莫司)、IPI504(瑞他霉素盐酸盐)、KRN951(tivozanib)、ME344、MGA031(teplizumab)、MiStentSES(西罗莫司)、MKC1、Nobori(乌米莫司)、OSI027、OVI123(虫草素)、Palomid529、PF04691502、Promus Element(依维莫司)、PWT33597、Rapamune(西罗莫司)、Resolute DES(佐他莫司)、RG7422、SAR245409、SF1126、SGN75(vorsetuzumab mafodotin)、Synergy(依维莫司)、Taltorvic(地磷莫司)、Tarceva(厄洛替尼)、Torisel(替西罗莫司)、Xience Prime(依维莫司)、XienceV(依维莫司)、Zomaxx(佐他莫司)、Zortress(依维莫司)、ZotarolimusEluting Peripheral Stent MEDTRONIC(佐他莫司)、AP23841、AP24170、ARmTOR26、BN107、BN108、Canstatin GENZYME(canstatin)、CU906、EC0371、EC0565、KI1004、LOR220、NV128、Rapamycin ONCOIMMUNE(西罗莫司)、SB2602、Sirolimus PNP SAMYANGBIOPHARMACEUTICALS(西罗莫司)、TOP216、VLI27、VS5584、WYE 125132、XL388、Advacan(依维莫司)、AZD8055、Cypher Select Plus Sirolimus eluting Coronary Stent(西罗莫司)、Cypher Sirolimus eluting coronary stent(西罗莫司)、Drug Coated Balloon(西罗莫司)、E-Magic Plus(西罗莫司)、Emtor(西罗莫司)、Esprit(依维莫司)、Evertor(依维莫司)、HBF0079、LCP-Siro(西罗莫司)、Limus CLARIS(西罗莫司)、mTOR抑制剂CELLZOME、Nevo Sirolimus eluting Coronary Stent(西罗莫司)、nPT-mTOR、Rapacan(西罗莫司)、Renacept(西罗莫司)、ReZolve(西罗莫司)、Rocas(西罗莫司)、SF1126、Sirolim(西罗莫司)、Sirolimus NORTHCHINA(西罗莫司)、Sirolimus RANBAXY(西罗莫司)、SirolimusWATSON(西罗莫司)Siropan(西罗莫司)、Sirova(西罗莫司)、Supralimus(西罗莫司)、Supralimus-Core(西罗莫司)、Tacrolimus WATSON(他克莫司)、TAFA93、TemsirolimusACCORD(替西罗莫司)、Temsirolimus SANDOZ(替西罗莫司)、TOP216、Xience Prime(依维莫司)、Xience V(依维莫司)。在特定的方面中，mTor抑制剂为Afinitor(依维莫司)(http://www.afinitor.com/index.jsp？usertrack.filter_applied＝true&NovaId＝4029462064338207963；最后一次登录11/28/2012)。在另一个方面，依维莫司与芳香酶抑制剂结合(参见例如等人，Everolimus in Postmenopausal Hormone-Receptor PositiveAdvanced Breast Cancer.2012.N.Engl.J.Med.366(6):520-529，其通过引用并入本文)。在另一个方面，mTor抑制剂可以通过本领域已知的方法识别(参见例如Zhou，H.等人Updates of mTor inhibitors.2010.Anticancer Agents Med.Chem.10(7):571-81，其通过引用并入本文)。在一些方面，mTor抑制剂在激素受体为阳性的患者中用于治疗、预防或抑制转移(参见例如Zhou，H.等人Updates of mTor inhibitors.2010.Anticancer AgentsMed.Chem.10(7):571-81，其通过引用并入本文)。在一些实施方案中，患者是ER+。在一些方面，mTor抑制剂用于治疗或预防或抑制患有晚期乳腺癌的患者中的转移。在一些方面，mTor抑制剂与第二种治疗组合使用。在一些方面，第二种治疗是本文描述的任何治疗。
在另一个方面，所述的治疗为Src激酶抑制剂。在一些方面，Src抑制剂用于预防或抑制转移。在一些方面，Src激酶抑制剂选自：AZD0530(塞卡替尼)、Bosulif(博舒替尼)、ENMD981693、KD020、KX01、Sprycel(达沙替尼)、Yervoy(伊匹木单抗)、AP23464、AP23485、AP23588、AZD0424、c-Src激酶抑制剂KISSEI、CU201、KX2361、SKS927、SRN004、SUNK706、TG100435、TG100948、AP23451、Dasatinib HETERO(达沙替尼)、Dasatinib VALEANT(达沙替尼)、Fontrax(达沙替尼)、Src激酶抑制剂KINEX、VX680(tozasertib lactate)、XL228和SUNK706。在一些实施方案中，Src激酶抑制剂为达沙替尼。在另一个方面，Src激酶抑制剂可以通过本领域已知的方法来鉴定(参见例如Sen，B.和Johnson，F.M.Regulation of SrcFamily Kinases in Human Cancers.2011.J.Signal Transduction.2011:14页，其通过引用并入本文)。在一些方面，Src激酶抑制剂用于治疗或预防或抑制对于SRC应答标记(SRS)阳性的患者中的转移。在一些方面，患者是SRS+和ER-。(参见例如Zhang，CH.-F等人LatentBone Metastasis in Breast Cancer Tied to Src-Dependent survivalsignals.2009.Cancer Cell.16:67-78，其通过引用并入本文)。在一些方面，Src激酶抑制剂用于治疗或预防或抑制具有晚期乳腺癌的患者中的转移。在一些方面，Src激酶抑制剂与第二种治疗组合使用。在一些方面，第二种治疗是本文描述的任何治疗。
在另一个方面，所述的治疗为COX-2抑制剂。在一些方面，COX-2抑制剂用于预防或抑制转移。在一些实施方案中，COX-2抑制剂选自：ABT963、Acetaminophen ER JOHNSON(对乙酰氨基酚)、Acular X(酮咯酸氨丁三醇)、BAY1019036(阿司匹林)、BAY987111(苯海拉明、甲氧萘丙酸钠)、BAYl1902(吡罗昔康)、BCIBUCH001(布洛芬)、Capoxigem(阿利考昔)、CS502、CS670(培比洛芬)、Diclofenac HPBCD(双氯芬酸)、Diractin(酮洛芬)、GW406381、HCT1026(硝基氟吡洛芬)、Hyanalgese-D(双氯芬酸)、HydrocoDex(对乙酰氨基酚、美沙芬、氢可酮)、Ibuprofen Sodium PFIZER(布洛芬钠)、具有Acetaminophen PFIZER的Ibuprofen(对乙酰氨基酚、布洛芬)、Impracor(酮洛芬)、IP880(双氯芬酸)、IP940(吲哚美辛)、ISV205(双氯芬酸钠)、JNS013(对乙酰氨基酚、盐酸曲马多)、Ketoprofen TDS(酮洛芬)、LTNS001(naproxenetemesil)、Mesalamine SALIX(马沙拉嗪)、Mesalamine SOFAR(马沙拉嗪)、Mesalazine(马沙拉嗪)、ML3000(利克飞龙)、MRX7EAT(依托度酸)、Naproxen IROKO(萘普生)、NCX4016(硝基阿司匹林)、NCX701(硝基对乙酰氨基酚)、Nuprin SCOLR(布洛芬)、OMS103HP(盐酸阿米替林、酮洛芬、盐酸羟甲唑啉)、Oralease(双氯芬酸)、OxycoDex(美沙芬、氧可酮)、P54、PercoDex(对乙酰氨基酚、美沙芬、氧可酮)、PL3100(萘普生、卵磷脂)、PSD508、R-酮洛芬(酮洛芬)、Remura(溴芬酸钠)、ROX828(酮咯酸氨丁三醇)、RP19583(赖氨酸酮基布洛芬)、RQ00317076、SDX101(R-依托度酸)、TDS943(双氯芬酸钠)、TDT070(酮洛芬)、TPR100、TQ1011(酮洛芬)、TT063(S-氟比洛芬)、UR8880(西米考昔)、V0498TA01A(布洛芬)、VT122(依托度酸、普萘洛尔)、XP20B(对乙酰氨基酚、右旋丙氧芬)、XP21B(双氯芬酸钾)、XP21L(双氯芬酸钾)、Zoenasa(乙酰半胱氨酸、马沙拉嗪)、Acephen、Actifed Plus、Actifed-P、Acular、Acular LS、Acular PF、Acular X、Acuvail、Advil、Advil AllergySinus、Advil Cold and Sinus、Advil Congestion Relief、Advil PM、Advil PM Capsule、Air Salonpas、Airtal、Alcohol-Free NyQuil Cold&Flu Relief、Aleve、Aleve ABDIIBRAHIM、Aleve-D、Alka-Seltzer、Alka-Seltzer BAYER、Alka-Seltzer Extra Strength、Alka-Seltzer Lemon-Lime、Alka-Seltzer Original、Alka-Seltzer Plus、Alka-Seltzerplus Cold and Cough、Alka-Seltzer plus Cold and Cough Formula、Alka-SeltzerPlus Day and Night Cold Formula、Alka-Seltzer Plus Day Non-Drowsy ColdFormula、Alka-Seltzer Plus Flu Formula、Alka-Seltzer Plus Night Cold Formula、Alka-Seltzer Plus Sinus Formula、Alka-Seltzer Plus Sparkling Original ColdFormula、Alka-Seltzer PM、Alka-Seltzer Wake-Up Call、Anacin、Anaprox、AnaproxMINERVA、Ansaid、Apitoxin、Apranax、Apranax abdi、Arcoxia、Arthritis FormulaBengay、Arthrotec、Asacol、Asacol HD、Asacol MEDUNA ARZNEIMITTEL、Asacol ORIFARM、Aspirin BAYER、Aspirin Complex、Aspirin Migran、AZD3582、Azulfidine、Baralgan M、BAY1019036、BAY987111、BAYl1902、BCIBUCH001、Benadryl Allergy、Benadryl Day andNight、Benylin 4 Flu、Benylin Cold and Flu、Benylin Cold and Flu Day and Night、Benylin Cold and Sinus Day and Night、Benylin Cold and Sinus Plus、Benylin Dayand Night Cold and Flu Relief、Benylin1 All-In-One、Brexin、Brexin ANGELINI、Bromday、Bufferin、Buscopan Plus、Caldolor、Calmatel、Cambia、Canasa、Capoxigem、Cataflam、Celebrex、Celebrex ORIFARM、Children’s Advil Allergy Sinus、Children’sTylenol、Children’s Tylenol Cough and Runny Nose、Children’s Tylenol plus cold、Children’s Tylenol plus Cold and Cough、Children’s Tylenol plus cold andstuffy nose、Children’s Tylenol plus Flu、Children’s Tylenol plus cold&allergy、Children’s Tylenol plus Cough&Runny Nose、Children’s Tylenol plus Cough&SoreThroat、Children’s Tylenol plus multi symptom cold、Clinoril、Codral Cold andFlu、Codral Day and Night Day Tablets、Codral Day and Night Night Tablets、Codral Nightime、Colazal、Combunox、Contac Cold plus Flu、Contac Cold plus FluNon-Drowsy、Coricidin D、Coricidin HBP Cold and Flu、Coricidin HBP Day and NightMulti-Symptom Cold、Coricidin HBP Maximum Strength Flu、Coricidin HBP NighttimeMulti-Symptom Cold、Coricidin II Extra Strength Cold and Flu、CS502、CS670、Daypro、Daypro Alta、DDS06C、Demazin Cold and Flu、Demazin Cough、Cold and Flu、Demazin day/night Cold and Flu、Demazin PE Cold and Flu、Demazin PE day/nightCold and Flu、Diclofenac HPBCD、Dimetapp Day Relief、Dimetapp Multi-Symptom Coldand Flu、Dimetapp Night Relief、Dimetapp Pain and Fever Relief、Dimetapp PESinus Pain、Dimetapp PE Sinus Pain plus Allergy、Dipentum、Diractin、Disprin Cold‘n’Fever、Disprin Extra、Disprin Forte.Disprin Plus、Dristan Cold、DristanJunior、Drixoral Plus、Duexis、Dynastat、Efferalgan、Efferalgan Plus Vitamin C、Efferalgan Vitamin C、Elixsure IB、Excedrin Back and Body、Excedrin Migraine、Excedrin PM、Excedrin Sinus Headache、Excedrin Tension Headache、Falcol、Fansamac、Feldene、FeverAll、Fiorinal、Fiorinal with Codeine、Flanax、FlectorPatch、Flucam、Fortagesic、Gerbin、Giazo、Gladio、Goody’s Back and Body Pain、Goody’s Cool Orange、Goody’s Extra Strength、Goody’s PM、Greaseless Bengay、GW406381、HCT1026、He Xing Yi、Hyanalgese-D、HydrocoDex、Ibuprofen Sodium PFIZER、Ibuprofenwith、Acetaminophen PFIZER、Icy Hot SANOFI AVENTIS、Impracor、Indocin、Indomethacin APP PHARMA、Indomethacin MYLAN、Infants’Tylenol、IP880、IP940、Iremod、ISV205、JNS013、Jr.Tylenol、Junifen、Junior Strength Advil、Junior StrengthMotrin、Ketoprofen TDS、Lemsip Max、Lemsip Max All in One、Lemsip Max All Night、Lemsip Max Cold and Flu、Lialda、Listerine Mouth Wash、Lloyds Cream、Lodine、Lorfit P、Loxonin、LTNS001、Mersyndol、Mesalamine SALIX、Mesalamine SOFAR、Mesalazine、Mesasal GLAXO、Mesasal SANOFI、Mesulid、Metsal Heat Rub、MidolComplete、Midol Extended Relief、Midol Liquid Gels、Midol PM、Midol Teen Formula、Migranin COATED TABLETS、ML3000、Mobic、Mohrus、Motrin、Motrin Cold and SinusPain、Motrin PM、Movalis ASPEN、MRX7EAT、Nalfon、Nalfon PEDINOL、Naprelan、Naprosyn、Naprosyn RPG LIFE SCIENCE、Naproxen IROKO、NCX4016、NCX701、NeoProfen LUNDBECK、Nevanac、Nexcede、Niflan、Norgesic MEDICIS、Novalgin、Nuprin SCOLR、Nurofen、NurofenCold and Flu、Nurofen Max Strength Migraine、Nurofen Plus、Nuromol、NyQuil withVitamin C、Ocufen、OMS103HP、Oralease、Orudis ABBOTT JAPAN、Oruvail、Osteluc、OxycoDex、P54、Panadol、Panadol Actifast、Paradine、Paramax、Parfenac、Pedea、Pennsaid、Pentasa、Pentasa ORIFARM、Peon、Percodan、Percodan-Demi、PercoDex、Percogesic、Perfalgan、PL2200、PL3100、Ponstel、Prexige、Prolensa、PSD508、R-Ketoprofen、Rantudil、Relafen、Remura、Robaxisal、Rotec、Rowasa、ROX828、RP19583、RQ00317076、Rubor、Salofalk、Salonpas、Saridon、SDX101、Seltouch、sfRowasa、Shinbaro、Sinumax、Sinutab、Sinutab、、sinus、Spalt、Sprix、Strefen、Sudafed Cold and Cough、Sudafed Head Cold and Sinus、Sudafed PE Cold plus Cough、Sudafed PE Pressureplus Pain、Sudafed PE、Severe Cold、Sudafed PE Sinus Day plus Night Relief DayTablets、Sudafed PE Sinus Day plus Night Relief Night Tablets、Sudafed PE Sinusplus Anti-inflammatory Pain Relief、Sudafed Sinus Advance、Surgam、Synalgos-DC、Synflex、Tavist allergy/sinus/headache、TDS943、TDT070、Theraflu Cold and SoreThroat、Theraflu Daytime Severe Cold and Cough、Theraflu Daytime WarmingRelief、Theraflu Warming Relief Caplets Daytime Multi-Symptom Cold、TherafluWarming Relief Cold and Chest Congestion、Thomapyrin、Thomapyrin C、ThomapyrinEffervescent、Thomapyrin Medium、Tilcotil、Tispol、Tolectin、Toradol、TPR100、TQ1011、Trauma-Salbe、Trauma-Salbe Kwizda、Treo、Treximet、Trovex、TT063、Tylenol、Tylenol Allergy Multi-Symptom、Tylenol Back Pain、Tylenol Cold&Cough Daytime、Tylenol Cold&Cough Nighttime、Tylenol Cold and Sinus Daytime、Tylenol Cold andSinus Nighttime、Tylenol Cold Head Congestion Severe、Tylenol Cold MultiSymptom Daytime、Tylenol Cold Multi Symptom Nighttime Liquid、Tylenol ColdMulti Symptom Severe、Tylenol Cold Non-Drowsiness Formula、Tylenol Cold SevereCongestion Daytime、Tylenol Complete Cold、Cough and Flu Night time、Tylenol FluNighttime、Tylenol Menstrual、Tylenol PM、Tylenol Sinus Congestion&Pain Daytime、Tylenol Sinus Congestion&Pain Nighttime、Tylenol Sinus Congestion&Pain Severe、Tylenol Sinus Severe Congestion Daytime、Tylenol Ultra Relief、Tylenol withCaffeine and Codeine phosphate、Tylenol with Codeine phosphate、Ultra StrengthBengay Cream、Ultracet、UR8880、V0498TA01A、Vicks NyQuil Cold and Flu Relief、Vicoprofen、Vimovo、Voltaren Emulgel、Voltaren GEL、Voltaren NOVARTIS CONSUMERHEALTH GMBH、Voltaren XR、VT122、Xefo、Xefo Rapid、Xefocam、Xibrom、XL3、Xodol、XP20B、XP21B、XP21L、Zipsor和Zoenasa。在另一个方面，COX-2抑制剂可以通过本领域已知的方法进行鉴定(参见例如Dannhardt，G.和Kiefer，W.Cyclooxygenase inhibitors-currentstatus and future prospects.2001.Eur.J.Med.Chem.36:109-126，其通过引用并入本文)。在一些方面，COX-2抑制剂用于治疗或预防或抑制患有晚期乳腺癌的患者中的转移。在一些方面，COX-2抑制剂与第二种治疗组合使用。在一些方面，第二种治疗是本文描述的任何治疗。在一些方面，COX-2抑制剂与选自下述的第二种治疗组合使用：地诺单抗、择泰(http://www.us.zometa.com/index.jsp？usertrack.filter_applied＝true&NovaId＝2935376934467633633；最后一次登录12/2/2012)、Carbozantinib或卡博替尼、阻断PTHLH(甲状旁腺激素样激素)或PTHrP(甲状旁腺激素相关蛋白质)的抗体或肽以及依维莫司。
在另一个方面，用于避免和/或防止骨降解的治疗试剂包括，但不限于：
-甲状旁腺激素(PTH)和甲状旁腺激素样激素(PTHLH)抑制剂(包括阻断抗体)或其重组形式(对应于PTH的氨基酸7-34的特立帕肽)。该激素通过刺激破骨细胞或增加其活性来起作用。
-雷奈酸锶：是备选经口治疗，并且构成称为“双重作用骨试剂”(DABA)的药物组的部分，因为它们刺激成骨细胞增殖且抑制破骨细胞增殖。
-“雌激素受体调节剂”(SERM)指干扰或抑制雌激素与受体的结合的化合物，与机制无关。雌激素受体调节剂的例子包括(除了别的以外)：雌激素孕激素、雌二醇、屈洛昔芬、雷洛昔芬、拉索昔芬、TSE-424、他莫昔芬、艾多昔芬、L Y353381、LY117081、托瑞米芬、氟维司群、4-[7-(2,2-二甲基-1-氧代丙氧基-4-甲基-2-[4-[2-(1-哌啶基)乙氧基]苯基]-2H-1-苯并吡喃-3-基]-苯基-2,2-二甲基丙酸4,4'二羟基二苯甲酮-2,4-二硝基苯基腙和SH646。
-降钙素：通过降钙素受体直接抑制破骨细胞活性。降钙素受体已在破骨细胞的表面上得到鉴定。
-双膦酸盐：是用于预防和治疗伴随骨吸收和重吸收的疾病例如骨质疏松症和具有骨转移的癌症(伴随或不伴随高钙血症，与乳腺癌和前列腺癌相关)的一组药用产品。可以用于借助于本发明的第五种方法设计的疗法中的双膦酸盐的例子包括，但不限于含氮双膦酸盐(例如帕米膦酸盐、奈立膦酸盐、奥帕膦酸盐、阿仑膦酸盐、伊班膦酸盐、利塞膦酸盐、伊卡膦酸盐、唑来膦酸盐或唑来膦酸等)和非含氮双膦酸盐(例如依替膦酸盐、氯膦酸盐、替鲁膦酸盐等)。
-“组织蛋白酶K抑制剂”指干扰组织蛋白酶K半胱氨酸蛋白酶活性的化合物。组织蛋白酶K抑制剂的非限制性例子包括4-氨基-嘧啶-2-腈衍生物(在国际专利申请WO 03/020278中在名称Novartis Pharma GMBH下描述)、公开WO 03/020721(Novartis PharmaGMBH)和公开WO 04/000843(ASTRAZENECA AB)中所述的吡咯并嘧啶，以及AxysPharmaceuticals的公开PCT WO 00/55126、Merck Frosst Canada&Co.和AxysPharmaceuticals的WO 01/49288中所述的抑制剂。
-“DKK-1(Dickkopf-1)抑制剂”如本文使用的是指能够减少DKK-1活性的任何化合物。DKK-1是在成人骨中占优势表达且在具有溶骨性病损的骨髓瘤患者中上调的可溶性Wnt途径拮抗剂。靶向DKK-1的试剂可以在预防多发性骨髓瘤患者中的溶骨性疾病中起作用。来自Novartis的BHQ880是全新的全人抗DKK-1中和抗体。临床前研究支持BHQ880促进骨形成和从而抑制肿瘤诱导的溶骨性疾病的假设(Ettenberg S.等人，American Associationfor Cancer Research Annual Meeting.April 12–16，2008；San Diego，Calif.Abstract)。
-“MET和VEGFR2双重抑制剂”如本文使用的是指被设计为阻断MET驱动的肿瘤逃逸的MET和VEGF途径的强力双重抑制剂的任何化合物。MET不仅在肿瘤细胞和内皮细胞中表达，还在成骨细胞(骨形成细胞)和破骨细胞(骨去除细胞)中表达。HGF与所有这些细胞类型上的MET结合，给予MET途径在多重自分泌和旁分泌环中的重要作用。MET在肿瘤细胞中的活化看起来在转移性骨病损的建立中是重要的。同时，成骨细胞和破骨细胞中的MET途径的活化可以导致骨转移的病理特点，包括异常骨生长(即增生病损)或破坏(即溶解性病损)。因此，靶向MET途径可以是阻止转移性骨病损的建立和进展中的可行策略。卡博替尼(Exelixis，Inc)以前称为XL184(CAS 849217-68-1)，是MET和VEGF途径的强力双重抑制剂，其被设计为阻断MET驱动的肿瘤逃避。在多个临床前研究中，卡博替尼已显示杀死肿瘤细胞、减少转移且抑制血管生成(支持肿瘤生长必需的新血管的形成)。另一种合适的双重抑制剂是E7050(N-[2-氟-4-({2-[4-(4-甲基哌嗪-1-基)哌啶-1-基]羰基氨基吡啶-4-基}氧基)苯基]-N′-(4-氟苯基)环丙烷-1,1-二甲酰胺(2R,3R)-酒石酸酯)(CAS 928037-13-2)或Foretinib(也称为GSK1363089、XL880、CAS 849217-64-7)。
-“RANKL抑制剂”如本文使用的是指能够减少RANK活性的任何化合物。RANKL在间质和T淋巴细胞的成骨细胞膜的表面上发现，并且这些T淋巴细胞是已证实具有分泌其的能力的唯一细胞。它的主要功能是破骨细胞(牵涉骨吸收的细胞)的活化。RANKL抑制剂可以通过下述来起作用：阻断RANKL与其受体(RANK)的结合，通过阻断RANKL的转录或翻译来阻断RANK介导的信号传导或减少RANKL的表达。适用于本发明的RANKL拮抗剂或抑制剂包括但不限于：
○一种合适的RANK蛋白质，其能够结合RANKL并包含RANK蛋白质的整个细胞外结构域或其片段。可溶性的RANK可以包含鼠科或人RANK多肽的信号肽和细胞外结构域，或者备选地，可以使用信号肽被除去的成熟形式的蛋白质。
○具有RANKL结合能力的骨保护素或其变体。
○RANKL特异性反义分子。
○能够加工RANKL的所转录的产物的核酶。
○特异性抗RANKL抗体。“抗RANKL抗体或定向针对RANKL的抗体”在本文中可理解为所有以下抗体：其能够与核因子κB(RANKL)的活化受体的配体特异性结合，从而抑制一种或多种RANKL的功能。可以使用本领技术人员已知的任何方法来制备抗体。因此，通过使用待抑制的蛋白质来免疫动物，从而制备多克隆抗体。单克隆抗体使用Kohler、Milstein等人(Nature、1975、256:495)所述的方法来制备。适用于本发明的内容的抗体包括包含可变抗原结合区和恒定区的完整抗体，片段“Fab”、“F(ab′)2”和“Fab`”、Fv、scFv，双抗体和双特异性抗体。
○特异性抗RANKL纳米抗体。纳米抗体为抗体衍生的治疗蛋白质，其包含天然形成的重链抗体的独特的结构和功能性质。纳米抗体的技术最初是由以下发现发展来的：骆驼科(骆驼和美洲驼)拥有缺乏轻链的完整的功能抗体。纳米抗体的一般结构为：
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
其中FR1至FR4为构架区1至4，CDR1至CDR3为互补性决定区1至3。这些重链抗体包含单一的可变结构域(VHH)和2个恒定结构域(CH2和CH3)。重要的是，克隆的且分离的VHH结构域为完全稳定的多肽，其容留了原始重链抗体的全部抗原结合能力。这些新发现的具有独特结构和功能性质的VHH结构域形成了新一代治疗抗体(Ablynx将其命名为纳米抗体)的基础。
在一个实施方案中，RANKL抑制剂选自RANKL特异性抗体、RANKL特异性纳米抗体和骨保护素。在具体实施方案中，抗RANKL抗体是单克隆抗体。在一个更加具体的实施方案中，抗RANKL抗体是地舒单抗(Pageau，Steven C.(2009).mAbs 1(3):210-215，CAS编号615258-40-7)(其整个内容通过引用在此并入)。地舒单抗是全人单克隆抗体，其与RANKL结合且阻止其活化(它不与RANK受体结合)。地舒单抗的各个方面由美国专利号6,740,522；7,411,050；7,097,834；7,364,736(其整个内容通过引用全文在此并入)涵盖。在另一个实施方案中，RANKL抑制剂是结合与地舒单抗相同的表位的抗体、抗体片段或融合构建体。
在优选实施方案中，抗RANKL纳米抗体是如WO2008142164(其整个内容通过引用并入本申请)中所述的纳米抗体中的任一种。在一个更加优选的实施方案中，抗RANKL抗体是ALX-0141(Ablynx)。ALX-0141已被设计为抑制与闭经后骨质疏松症、类风湿性关节炎、癌症和某些用药相关的骨丢失，并且恢复健康骨代谢的平衡。
在优选实施方案中，预防骨降解的试剂选自双膦酸盐、RANKL抑制剂、PTH和PTHLH抑制剂或PRG类似物、雷奈酸锶、DKK-1抑制剂、MET和VEGFR2双重抑制剂、雌激素受体调节剂、镭-223降钙素和组织蛋白酶K抑制剂。在更优选的实施方案中，预防骨降解的试剂是双膦酸盐。在一个更加优选的实施方案中，双膦酸盐是唑来膦酸。
在一个实施方案中，施用CCR5拮抗剂以预防或抑制原发性乳腺癌肿瘤向骨的转移。在一个实施方案中，CCR5拮抗剂是大分子。在另一个实施方案中，CCR5拮抗剂是小分子。在一些实施方案中，CCR5拮抗剂是马拉韦罗(Velasco-Veláquez，M.等人2012.CCR5Antagonist Blocks Metastasis of Basal Breast Cancer Cells.CancerResearch.72:3839-3850.)。在一些实施方案中，CCR5拮抗剂是维克韦罗。(Velasco-Veláquez，M.等人2012.CCR5 Antagonist Blocks Metastasis of Basal Breast CancerCells.Cancer Research.72:3839-3850.)。在一些方面，CCR5拮抗剂是阿拉韦罗(DemarestJ.F.等人2005.Update on Aplaviroc:An HIV Entry Inhibitor TargetingCCR5.Retrovirology 2(Suppl.1):S13)。在一些方面，CCR5拮抗剂是螺哌啶CCR5拮抗剂。(Rotstein D.M.等人2009.Spiropiperidine CCR5 antagonists.Bioorganic&MedicinalChemistry Letters.19(18):5401-5406。在一些实施方案中，CCR5拮抗剂是INCB009471(Kuritzkes，D.R.2009.HIV-1entry inhibitors:an overview.Curr.Opin.HIV AIDS.4(2):82-7)。
在优选实施方案中，MET和VEGFR2双重抑制剂选自卡博替尼、Foretinib和E7050。
在优选实施方案中，镭223疗法是alpharadin。
备选地，可以进行组合治疗，其中将来自上述那些的超过一种试剂组合以治疗和/或预防转移，或所述试剂可以与其他补充物例如钙或维生素D或与激素治疗组合。
用于使用c-Maf抑制试剂治疗来自HER2+乳腺癌的骨转移的方法
在另一个方面，本发明涉及用于治疗或预防来自HER2+乳腺癌的骨转移的c-Maf抑制试剂(下文，本发明的抑制试剂)。
在另一个方面，本发明涉及c-Maf抑制试剂用于制造用于治疗或预防来自HER2+乳腺癌的骨转移的药剂的用途。
在另一个方面，本发明涉及用于治疗或预防有此需要的受试者中来自HER2+乳腺癌的骨转移的方法，其包括给所述受试者施用c-Maf抑制试剂。
在另一个方面，本发明涉及用于预防或减少患有HER2+乳腺癌的受试者中的骨转移风险的方法，所述方法包括给所述受试者施用预防或减少骨转移的试剂，其中所述试剂依照由定量所述受试者中的c-Maf表达水平确定的治疗方案施用。
作为非限制性举例说明，适用于本发明的c-Maf抑制试剂包括反义寡核苷酸、干扰RNA(siRNA)、催化性RNA、特异性核酶、抑制性抗体或纳米抗体、显性失活c-Maf变体或者来自表1或2的化合物。
反义寡核苷酸
本发明的其他方面涉及分离的“反义”核酸来抑制表达的用途，例如用于抑制核酸的转录和/或翻译，其中所述的核酸编码了其活性有待抑制的c-Maf。反义核酸可以通过常规碱基互补性，或者例如在双螺旋的大沟中通过特异性的相互作用而与双链DNA结合的情况下，与药品的潜在靶物结合。通常，这些方法是指常用于本领域中的技术范围，并且它们包括可以基于与寡核苷酸序列特异性结合的任何方法。
本发明的反义构建体可以作为例如表达质粒分布，当该表达质粒在细胞中转录时，其产生了与编码c-Maf的细胞mRNA的至少一个独特部分互补的RNA。备选地，反义构建体为体外形成的寡核苷酸探针，当将该探针引入细胞中时，对基因的表达产生抑制，与靶物核酸的mRNA和/或基因序列杂交。此类寡核苷酸探针优选为修饰的寡核苷酸，其对内切核酸酶具有抗性(例如外切核酸酶和/或外切核酸酶)，并因此是体内稳定的。用作反义寡核苷酸的核酸分子的实例为氨基磷酸酯、磷硫酰和甲基膦酸酯的DNA类似物(还参见美国专利号5,176,996；5,264,564；和5,256,775)(其各自通过引用全文并入本文)。另外，用于构建可用于反义疗法中的寡聚物的一般接近法已例如在Van der Krol等人，BioTechniques 6:958-976，1988；和Stein等人，Cancer Res 48:2659-2668，1988中综述。
关于反义寡核苷酸，优选为由翻译起始位点衍生的寡脱氧核糖核苷酸区域，例如在靶物基因的约-10至约+10之间。反义接近(antisense approximation)涉及与编码靶物多肽的mRNA互补的寡核苷酸设计(DNA或RNA)。反义寡核苷酸与转录mRNA结合，并防止翻译。
与mRNA的5’末端(非翻译5’序列直至/并包含起始密码子AUG)互补的寡核苷酸必须以最高效的方式发挥抑制翻译的功能。然而，最近显示与mRNA的非翻译3’序列互补的序列也有效地抑制mRNA翻译(Wagner，Nature 372:333，1994)。因此，在非翻译的5’或3’区域、基因的非编码区域中可以使用互补的寡核苷酸来抑制该mRNA的翻译。与mRNA的非翻译5’区域互补的寡核苷酸必须包含起始密码子AUG的互补序列。与mRNA的编码区域互补的寡核苷酸是低效的翻译抑制剂，但是也可以根据本发明使用它们。如果将所述的寡核苷酸设计成能够与mRNA的5’区域、3’区域或编码区域杂交，则反义核酸必须具有至少6个核苷酸长，并且优选为低于大约100个核苷酸长，更优选为低于大约50、25、17或10个核苷酸长。
优选地，进行体外研究来定量反义寡核苷酸抑制基因表达的能力。优选地，这些研究使用能够区分反义基因抑制与寡核苷酸的非特异性生物作业之间的对照。此外，优选地，这些研究将靶物RNA或蛋白质的水平与RNA或蛋白质的内部对照的水平比较。可以将使用反义寡核苷酸获得的结果与使用对照寡核苷酸获得结果比较。优选地，对照寡核苷酸与待检测的寡核苷酸具有近似相同的长度，并且所述的寡核苷酸序列除了被认为必须防止与靶物序列特异性杂交以外，与所述的反义序列没有不同。
反义寡核苷酸可以为单链或双链DNA或RNA，或者它们的嵌合混合物、衍生物或修饰形式。所述的寡核苷酸在碱基、糖基或磷酸主链中可以被修饰，从而例如改善分子的稳定性、其杂交能力等。所述的寡核苷酸可以包含其他的结合基团，例如肽(例如用于将寡核苷酸指示于宿主细胞的受体)，或者用于促进运送通过细胞膜(参见例如Letsinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86:6553-6556，1989；Lemaitre等人，Proc.Natl.Acad.Sci.84:648-652，1987；PCT公开号WO 88/09810)或血脑屏障(参见例如PCT公开号WO 89/10134)、嵌入剂(参见例如Zon，Pharm.Res.5:539-549，1988)的试剂，或者用于插入试剂(例如参见Zon、Pharm.Res.5:539-549、1988)。对于该目的而言，可以将寡核苷酸与另一种分子缀合，例如肽、运送试剂、引发杂交的裂解剂等。
反义寡核苷酸可以包含修饰碱基的至少一个基团。反义寡核苷酸还可以包含选自阿拉伯糖、2-氟代阿拉伯糖、木酮糖和己糖中的至少一个修饰的糖基。此外，反义寡核苷酸还可以包含与中性肽相似的主链。此类分子称为肽核酸(PNA)寡聚体，并且例如在Perry-O’Keefe等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.93:14670，1996，和Eglom等人，Nature 365:566，1993中描述。
在另一个实施方案中，所述的反义寡核苷酸包含至少一个修饰的磷酸主链。在另一个实施方案中，反义寡核苷酸为α-异头寡核苷酸。
尽管可以使用与靶物mRNA序列的编码区域互补的反义寡核苷酸，但是还可以使用与所述的非翻译区域互补的那些反义寡核苷酸。
在一些情况下，可能难以达到抑制内源mRNA翻译的足够细胞内浓度的反义物。因此，优选的接近使用重组DNA构建体，其中反义寡核苷酸处于强pol III或pol II启动子的控制之下。
备选地，可以通过指示与基因调节区域(即，启动子和/或增强子)互补的脱氧核糖核苷酸序列形成三股螺旋结构、从而防止在身体的靶物细胞内发生基因转录来减少靶物基因的表达(一般参见Helene，Anticancer Drug Des.6(6):569-84，1991)。在某些实施方案中，反义寡核苷酸为反义吗啉。
siRNA
小干扰RNA或siRNA是能够通过RNA干扰来抑制靶物基因表达的试剂。siRNA是化学合成的，可以通过体外转录获得的，或者可以在靶物细胞中体内合成的。通常，siRNA由15至40个核苷酸长的双链RNA组成，并且可以包含1至6个核苷酸的3’和/或5’突出区域。突出区域的长度取决于siRNA分子的总长度。siRNA通过在转录后降解或沉默靶物基因来起作用。
本发明的siRNA与MAF编码基因的mRNA或者与编码所述的蛋白质的基因序列基本上同源的。“基本上同源的”可理解为以下序列：其与靶物mRNA充分互补或相似，使得siRNA能够通过RNA干扰而降解靶物mRNA。适用于引起所述的干扰的siRNA包括RNA形成的siRNA，以及包含不同化学修饰的siRNA，例如：
-其中核苷酸之间的键不同于天然形成的那些键(例如硫代磷酸酯键)的siRNA。
-RNA链与功能试剂(例如荧光团)的缀合物。
-RNA链末端的修饰，特别是通过在2’位置处具有不同羟基官能团修饰的3’末端。
-在2’位置处具有修饰的糖(例如O-烷基化的残基)的核苷酸(2’-O-甲基核糖或2’-O-氟代核糖)。
-具有修饰的碱基的核苷酸，例如卤化的碱基(例如5-溴尿嘧啶和5-碘尿嘧啶)、烷基化的碱基(例如7-甲基鸟苷)。
siRNA可以以(即)具有上述特征的双链RNA的形式使用。备选地，使用含有siRNA的正义和反义链序列的载体可以处于用于在所关注的细胞中表达的合适的启动子的控制之下。
适用于表达siRNA的载体为以下这些：其中，编码2条siRNA链的2个DNA区域串联排列于一个和相同的DNA链中，通过间隔区域分开，所述的间隔区域在转录时形成环，并且其中单一的启动子指示DNA分子转录，从而产生shRNA。
备选地，可以使用以下载体，其中形成siRNA的每条链都是由不同转录单元的转录而形成的。这些载体相应地分成异向转录载体和汇聚转录载体。在异向转录载体中，编码各DNA链(形成siRNA)的转录单元以串联方式位于载体中，使得各DNA链的转录取决于其可以相同或不同的启动子(Wang，J.等人，2003，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，100:5103-5106和Lee，N.S.等人，2002，Nat.Biotechnol.，20:500-505)。在汇聚转录载体中，产生siRNA的DNA区域形成了DNA区域的正义和反义链，其中所述的DNA区域位于2个逆转录启动子的侧翼。在正义和反义RNA链转录后，反义RNA链将形成用于形成功能siRNA的杂合物。已经描述了具有逆转录启动子系统的载体，其中使用2个U6启动子(Tran，N.等人，2003，BMC Biotechnol.，3:21)、小鼠U6启动子和人H1启动子(Zheng，L.等人，2004，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，135-140和WO 2005026322)，以及人U6启动子和小鼠H1启动子(Kaykas，A.和Moon，R.，2004，BMCCell Biol.，5:16)。
适用于由汇聚或异向表达载体表达siRNA的启动子包括与将表达siRNA的细胞相容的任何启动子或启动子对。因此，适用于本发明的启动子包括但不必限于：组成型启动子，例如由真核病毒(例如多瘤病毒、腺病毒、SV40、CMV、禽肉瘤病毒、B型肝炎病毒)的基因组衍生的那些启动子，金属硫蛋白基因启动子，单纯疱疹病毒的胸苷激酶基因启动子、逆转录病毒LTR区域，免疫球蛋白基因启动子，肌动蛋白基因启动子，EF-1α基因启动子；以及诱导型启动子，其中蛋白质的表达取决于分子或外源信号(例如四环素系统，NFκB/UV光系统，Cre/Lox系统)的加入，所述的启动子例如热休克基因启动子，在WO/2006/135436中所述的可调节的RNA聚合酶II启动子，以及特异组织启动子(例如在WO2006012221中所述的PSA启动子)。在优选的实施方案中，所述的启动子为RNA聚合酶III启动子，其以组成型方式起作用。RNA聚合酶III启动子在数量有限的基因中发现，例如5S RNA、tRNA、7SL RNA和U6snRNA。与其他的RNA聚合酶III启动子不同，III型启动子不需要任何基因内序列，而是需要在5’方向上在位置-34和-23中包含TATA盒的序列，-66至-47之间的近端序列元件或PSE，以及在一些情况下在位置-265和-149之间的远端序列元件或DSE。在优选的实施方案中，III型RNA聚合酶III启动子为人或鼠科H1和U6基因启动子。在更优选的实施方案中，启动子为人或鼠科的2个U6启动子、小鼠U6启动子和人H1启动子、或者人U6启动子和小鼠H1启动子。在本发明的内容中，ERα基因启动子或细胞周期蛋白D1基因启动子是特别适合的，并且因此它们尤其优选在乳腺肿瘤中，优选在HER2+乳腺肿瘤中特异性表达目的基因。
siRNA可以由所谓的shRNA(短发夹RNA)在细胞内形成，其中所述的shRNA特征为形成siRNA的反平行链通过环区域或发夹区域连接。shRNA可以通过质粒或病毒编码，特别是逆转录病毒，并且处于启动子的控制之下。适用于表达shRNA的启动子为在上文中在表达siRNA的段落中所述的那些。
适用于表达siRNA和shRNA的载体包括：原核表达载体，例如pUC18、pUC19、Bluescript及其衍生物、mp18、mp19、pBR322、pMB9、CoIEl、pCRl、RP4、噬菌体和穿梭载体(例如pSA3和pAT28)；酵母表达载体，例如2-微米质粒型载体、整合质粒、YEP载体、着丝粒质粒等；昆虫细胞表达载体，例如pAC系列载体和pVL系列载体；植物表达载体，例如pIBI、pEarleyGate、pAVA、pCAMBIA、pGSA、pGWB、pMDC、pMY、pORE系列载体等等；以及基于病毒载体(腺病毒、与腺病毒有关的病毒以及逆转录病毒，特别是慢病毒)的更高级真核细胞表达载体或非病毒载体，例如pcDNA3、pHCMV/Zeo、pCR3.1、pEFl/His、pIND/GS、pRc/HCMV2、pSV40/Zeo2、pTRACER-HCMV、pUB6/V5-His、pVAXl、pZeoSV2、pCI、pSVL和pKSV-10、pBPV-1、pML2d和pTDTl。在优选的实施方案中，所述的载体为慢病毒载体。
本发明的siRNA和shRNA可以使用一系列本领域的技术人员已知的技术来获得。对于作为设计siRNA的基础的核苷酸序列的区域没有限定，并且其可以含有编码序列的区域(起始密码子和终止密码子之间)，或者备选地，其可以含有非翻译的5’或3’区域的序列(优选为25至50个核苷酸长并且相对于起始密码子在3’方向的位置中的任何位置)。设计siRNA的一种方式涉及AA(N19)TT基序的识别，其中N可以为MAF基因序列中的任何核苷酸；以及具有高的G/C含量的那些序列的选择。如果未发现所述的基序，则可以识别NA(N21)基序，其中N可以为任何核苷酸。
MAF特异性siRNA包括WO2005046731中所述的siRNA，其链之一是ACGGCUCGAGCAGCGACAA(SEQ ID NO:6)。其他MAF特异性siRNA序列包括但不限于CUUACCAGUGUGUUCACAA(SEQ ID NO:7)、UGGAAGACUACUACUGGAUG(SEQ ID NO:8)、AUUUGCAGUCAUGGAGAACC(SEQ ID NO:9)、CAAGGAGAAAUACGAGAAGU(SEQ ID NO:10)、ACAAGGAGAAAUACGAGAAG(SEQ ID NO:11)和ACCUGGAAGACUACUACUGG(SEQ ID NO:12)。
DNA酶
另一方面，本发明还考虑DNA酶抑制本发明的MAF基因的表达的用途。DNA酶并入了反义和核酶技术的一些机械特征。设计DNA酶，使得它们能够识别与反义寡核苷酸相似的特定的靶物核酸序列，而且类似于核酶，它们能够催化并特异性地切割靶物核酸。
核酶
此外还可以使用以下核酶分子，该分子被设计用于催化切割靶物mRNA的转录产物，从而防止mRNA的翻译，其中所述的mRNA编码了其活性有待抑制的c-MAF。核酶为能够催化特异性RNA切割的酶RNA分子(关于综述，参见Rossi，Current Biology 4:469-471，1994)。核酶的作用机制涉及核酶分子序列与互补靶物RNA的特异性杂交，然后发生核酸内切的切割事件。核酶分子的组成优选地包含与靶物mRNA互补的一个或多个序列以及负责切割mRNA的公知序列或功能等价序列(参见例如美国专利号5093246)。
在本发明中使用的核酶包括锤头核酶、核糖核酸内切酶RNA(下文中称为“Cech型核酶”)(Zaug等人，Science 224:574-578，1984)。
核酶可以通过修饰寡核苷酸形成(例如改善稳定性、靶向作用等)，并且它们应该分布于体内表达靶物基因的细胞上。优选的分布方法涉及使用DNA构建体，该DNA构建体在强组成型pol III或pol II启动子的控制之下“编码”核酶，使得转染的细胞产生足量的核酶以破坏内源靶物信使并抑制翻译。由于与其他反义分子不同，核酶是起催化作用的，所以需要低的细胞内浓度来达到其效率。
抑制抗体
在本发明的上下文中，“抑制抗体”应理解为能够与c-Maf蛋白质特异性结合且抑制所述蛋白质的一种或多种功能(优选与转录相关的那些)的任何抗体。抗体可以使用本领域技术人员已知的方法中的任一种进行制备，所述方法中的一些已在上文提及。因此，多克隆抗体借助于用待抑制的蛋白质免疫接种动物进行制备。单克隆抗体使用由Kohler，Milstein等人(Nature，1975，256:495)描述的方法进行制备。在本发明的上下文中，合适的抗体包括包含可变抗原结合区和恒定区的完整抗体、“Fab”、“F(ab′)2”和“Fab`”、Fv、scFv片段、双抗体、双特异性抗体、α体、环肽和订书肽。在鉴定具有c-Maf蛋白质结合能力的抗体后，将使用抑制试剂鉴定测定法选择能够抑制该蛋白质活性的那些抗体。
抑制肽
如本文使用的，术语“抑制肽”指能够与c-M蛋白质结合且抑制其如上文已说明的活性的那些肽，即，使c-Maf不能活化基因转录。
失活c-Maf显性体
由于来自MAF家族的蛋白质能够与AP-1家族的其他成员(例如Fos和Jun)同源二聚化和异源二聚化，抑制c-Maf活性的一种方式通过使用失活的显性体，该显性体能够与c-Maf二聚化，但是缺乏活化转录的能力。因此，失活c-MAF显性体可以为任意一种小maf蛋白质，该蛋白质存在于细胞中并缺乏三分之二的氨基末端(其包含反式激活结构域，例如mafK、mafF、mafg和pi 8)(Fujiwara等人(1993)Oncogene 8，2371-2380；Igarashi等人(1995)J.Biol.Chem.270，7615-7624；Andrews等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90，11488-11492；Kataoka等人(1995)Mol.Cell.Biol.15，2180-2190)(Kataoka等人(1996)Oncogene 12，53-62)。
备选地，失活c-MAF显性体包括c-Maf变体，其保持与其他蛋白质二聚化的能力，但是缺乏活化转录的能力。这些变体为例如缺乏位于蛋白质N末端的c-Maf反式激活结构域的那些变体。因此，失活c-MAF显性变体包括例如其中至少氨基酸1至122、至少氨基酸1-187、或者至少氨基酸1至257已经除去的变体(考虑了在US6274338中所述的人MAF的编号)。
本发明考虑了失活c-MAF显性变体和编码Maf的多核苷酸(处于适用于在靶物细胞中表达的启动子的操作控制之下)的用途。可以用于调节本发明的多核苷酸转录的启动子可以是组成型启动子，即，在基础水平下指导转录的启动子；或者诱导型启动子，其中转录活性需要外部信号。适用于转录的组成型启动子为(除了别的以外)CMV启动子、SV40启动子、DHFR启动子、小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)启动子、1a延伸因子(EFla)启动子、白蛋白启动子、ApoA1启动子、角蛋白启动子、CD3启动子、免疫球蛋白重链或轻链启动子、神经丝启动子、神经元特异性烯醇化酶启动子、L7启动子、CD2启动子、肌球蛋白轻链激酶启动子、HOX基因启动子、胸苷激酶启动子、RNA聚合酶II启动子、MyoD基因启动子、磷酸甘油酸酯激酶(PGK)基因启动子、低密度脂蛋白(LDL)启动子、肌动蛋白基因启动子。在优选的实施方案中，调节反式激活因子的表达的启动子为PGK基因启动子。在优选的实施方案中，调节本发明的多核苷酸转录的启动子为T7噬菌体的RNA聚合酶启动子。
优选地，可以用于本发明的背景下的诱导型启动子是响应诱导剂并且能够促进位于3'位置中的基因的活化的那些，其在不存在诱导剂的情况下显示零或可忽略不计的基础表达。取决于诱导剂的类型，诱导型启动子分类为Tet开/关启动子(Gossen，M.和H.Bujard(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89:5547-5551；Gossen，M.等人，1995，Science 268:1766-1769；Rossi，F.M.V.和H.M.Blau，1998，Curr.Opin.Biotechnol.9:451-456)；Pip开/关启动子(US 6287813)；抗孕素依赖性启动子(US 2004132086)、蜕皮激素依赖性启动子(Christopherson等人，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89:6314-6318；No等人，1996，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，93:3346-3351，Suhr等人，1998，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，95:7999-8004和WO9738117)、金属硫蛋白依赖性启动子(WO8604920)和雷帕霉素依赖性启动子(Rivera等人，1996，Nat.Med.2:1028-32)。
适合于表达编码失活c-Maf显性变体的多核苷酸的载体包括衍生自原核表达载体的载体，例如pUC18、pUC19、Bluescript及其衍生物、mp18、mp19、pBR322、pMB9、CoIEl、pCRl、RP4，噬菌体和穿梭载体例如pSA3和pAT28，酵母表达载体例如2微米型质粒载体、整合质粒、YEP载体、着丝粒质粒等等，昆虫细胞表达载体例如pAC系列载体和pVL系列载体，植物表达载体例如pIBI、pEarleyGate、pAVA、pCAMBIA、pGSA、pGWB、pMDC、pMY、pORE系列载体等等，以及基于病毒载体(腺病毒、与腺病毒相关的病毒以及反转录病毒且特别是慢病毒)的高等真核细胞表达载体或非病毒载体，例如pSilencer 4.1-CMV(Ambion)、pcDNA3、pcDNA3.1/hygpHCMV/Zeo、pCR3.1、pEFl/His、pIND/GS、pRc/HCMV2、pSV40/Zeo2、pTRACER-HCMV、pUB6/V5-His、pVAXl、pZeoSV2、pCI、pSVL和pKSV-10、pBPV-1、pML2d和pTDTl。
小分子
适用于本发明的其他c-Maf抑制化合物包括：
表1：具有c-Maf抑制能力的小分子
Figure BDA0000998006460000821
Figure BDA0000998006460000831
Figure BDA0000998006460000841
Figure BDA0000998006460000851
Figure BDA0000998006460000861
其他c-Maf抑制剂在专利申请WO2005063252(通过引用全文并入本文)中描述，例如下表中所示的那些(表2)。
表2:c-Maf抑制剂
Figure BDA0000998006460000871
Figure BDA0000998006460000881
Figure BDA0000998006460000891
Figure BDA0000998006460000901
在优选实施方案中，骨转移是溶骨性转移。
c-Maf抑制试剂通常与药学可接受的载体组合施用。
术语“载体”是指活性组分一起施用的稀释剂或赋形剂。此类药物载体可以为无菌液体，例如水和油，包括石油、动物油、植物油或合成来源的油，例如花生油、豆油、矿物油、芝麻油等。水或水性盐溶液以及水性葡萄糖和甘油溶液(特别是可注射溶液)优选用作载体。合适的药物载体在E.W.Martin，1995的“Remington’s Pharmaceutical Sciences”中描述。优选地，本发明的载体是经过州或联邦政府管理机构批准的或者在美国药典或在动物及更特别是在人类中普通认可使用的其他药典中列举的。
用于制造本发明药物组合物所需的药物剂型的载体和辅助物质将取决于(除了其他因素以外)所选的药物剂型。根据本领域技术人员已知的常规方法来制造药物组合物的所述的药物剂型。用于施用活性组分、待使用的赋形剂的不同方法以及用于生产它们的工艺的综述可以在“Tratado de Farmacia Galénica”，C.Faulíi Trillo，Luzán 5，S.A.1993版本中发现。药物组合物的实例包括用于口服、局部或胃肠外施用的任何固体组合物(片剂、药丸、胶囊、颗粒等)或液体组合物(溶液、悬液或乳液)。此外，如果有必要的话，所述的药物组合物可以包含稳定剂、悬浮剂、防腐剂、表面活性剂等。
就医药的使用而言，可以发现前药、盐、溶剂化物或包合物形式的c-Maf抑制剂，其可以是单独的或者与其他活性剂组合的，并且可以与药物可接受的赋形剂一起配制。优选用于本发明的赋形剂包括糖、淀粉、纤维素、橡胶和蛋白质。在特定的实施方案中，本发明的药物组合物将配制成固体药物剂型(例如片剂、胶囊、药物、颗粒、栓剂、无菌晶体或无定形固体，其可以再构建从而提供液体形式等)，液体药物剂型(例如溶液、悬液、乳液、酏剂、洗剂、软膏等)，或半固体药物剂型(凝胶、软膏、乳膏等)。本发明的药物组合可以通过任何途径施用，包括但不限于口服途径、静脉内途径、肌肉途径、动脉内途径、髓内途径、鞘内途径、心室内途径、经皮途径、皮下途径、腹膜内途径、鼻内途径、肠内途径、局部途径、舌下途径或直肠途径。用于施用活性组分的不同方式、待使用的赋形剂及其制造工艺的综述可以在Tratado de Farmacia Galénica，C.Faulíi Trillo，Luzán 5，S.A.，1993版本，和Remington’s Pharmaceutical Sciences(A.R.Gennaro，Ed.)，第20版，Williams&WilkinsPA，USA(2000)中找到。药物可接受的载体的实例在本领域的现状下是已知的，并且包括磷酸盐缓冲盐水溶液、水、乳液(例如油/水乳液)、不同类型的润湿剂、无菌溶液等。包含所述的载体的组合物可以通过本领域现状下已知的常规工艺配制。
在施用核酸(siRNA、编码siRNA或shRNA的多核苷酸、编码失活MAF显性体的多核苷酸)的情况下，本发明考虑了特别制备用于施用所述的核酸的药物组合物。所述的药物组合物可以包含所述的裸核酸，即，缺乏保护核酸免于被身体的核酸酶降解的化合物的情况，这势必产生这样的益处：消除了与转染使用的试剂有关的毒性。适用于裸化合物的施用途径包括血管内途径、肿瘤内途径、颅内途径、腹膜内途径、脾内途径、肌肉内途径、视网膜下途径、皮下途径、粘膜途径、局部途径和口服途径(Templeton，2002，DNA Cell Biol.，21:857-867)。备选地，可以施用形成了脂质体的一部分的核酸，其中所述的脂质体与胆固醇缀合，或者与能够促进易位通过细胞膜的化合物缀合，所述的化合物例如为衍生自HIV-1TAT蛋白质的Tat肽、黑腹果蝇(D.melanogaster)触角控制基因所编码的蛋白质的同源结构域的第三螺旋结构、单纯疱疹病毒VP22蛋白质、精氨酸寡聚体和在WO07069090中所述的肽(Lindgren，A.等人，2000，Trends Pharmacol.Sci，21:99-103，Schwarze，S.R.等人，2000，Trends Pharmacol.Sci.，21:45-48，Lundberg，M等人，2003，Mol Therapy8:143-150，以及Snyder，E.L.和Dowdy，S.F.，2004，Pharm.Res.21:389-393)。备选地，可以施用形成了质粒载体或病毒载体的一部分的多核苷酸，所述的载体优选为基于腺病毒的载体，在腺相关病毒或逆转录病毒中，例如基于鼠科白血病病毒(MLV)或慢病毒(HIV、FIV、EIAV)的病毒。
c-Maf抑制试剂或含有其的药物组合物可以以小于10mg/千克体重，优选小于约、约2、约1、约0.5、约0.1、约0.05、约0.01、约0.005、约0.001、约0.0005、约0.0001、约0.00005或约0.00001mg/kg体重的剂量施用。单位剂量可以通过注射、吸入或局部施用进行施用。
剂量取决于待治疗病况的严重性和应答，并且它可在几天和几个月之间改变，或直至病况消退。可以通过周期性地测量试剂在患者的身体中的浓度来测定最佳剂量。可以由EC50值来测定最佳剂量，EC50值是通过在动物模型中之前的体外或体内检测而获得的。可以每日一次或者低于每日一次，优选约每2天、约每4天、约每8天或约每30天小于一次进行施用。备选地，可以施用起始剂量，随后为一个或几个维持剂量，一般为小于起始剂量的量。维持方案可以涉及用范围为约0.01μg-约1.4mg/kg体重/天，例如约10、约1、约0.1、约0.01、约0.001或约0.00001mg/kg体重/天的剂量治疗患者。维持剂量优选最多约每5天、约每10天或约每30天施用一次。治疗必须继续一段时间，所述时间根据患者患有的病症类型、其严重性和患者状况而改变。在治疗后，必须监控患者的进展，或测定在疾病不响应治疗的情况下剂量是否应增加，或如果观察到疾病的改善或如果观察到不希望有的副作用，测定剂量是否应减少。
具有升高的MAF水平伴随骨转移的乳腺癌患者中的骨降解的治疗或预防
在另一个方面，本发明涉及用于治疗受试者中的骨转移的c-Maf抑制试剂或者能够避免或防止骨降解的试剂，所述受试者患有HER2+乳腺癌，并且在转移样品中具有就对照样品而言升高的MAF水平。
在另一个方面，本发明涉及c-Maf抑制试剂或者能够避免或防止骨降解的试剂用于制造用于治疗受试者中的骨转移的药剂的用途，所述受试者患有HER2+乳腺癌，并且在转移样品中具有就对照样品而言升高的MAF水平。
备选地，本发明涉及预防和/或治疗受试者中的降解的方法，所述受试者患有HER2+乳腺癌，并且在转移样品中具有就对照样品而言升高的MAF水平，所述方法包括给所述受试者施用c-Maf抑制试剂或者能够避免或防止骨降解的试剂。
在特定实施方案中，骨转移是溶骨性转移。
适合于本发明中所述的治疗方法的c-Maf抑制试剂或者能够避免或防止骨降解的试剂已在上文定制疗法方法的背景中详细描述。
参考或对照样品是患有HER2+乳腺癌的受试者(其未患有转移)的样品，或对应于患有HER2+乳腺癌的受试者(其未患有转移)的活组织检查样品中的肿瘤组织集合中测量的MAF基因表达水平的中值的样品。
用于测定或定量MAF水平就对照样品而言是否是升高的方法已与本发明的第一种方法相关详细描述，并且可同样应用于避免或防止骨降解的试剂。
备选地，可以进行组合治疗，其中组合来自上文提及那些的多于一种用于避免或防止骨降解的试剂，以治疗和/或预防转移，或所述试剂可以与其他补充物例如钙或维生素D或激素组合。
用于避免或防止骨降解的试剂通常与药学可接受的载体组合施用。术语“载体”和载体的类型已在上文对于c-Maf抑制试剂、以及其中它们可以被施用的形式和剂量进行定义，并且可同样应用于避免或防止骨降解的试剂。
下述实施例举例说明了本发明并且不限制其范围。
本发明的试剂盒
在另一个方面，本发明涉及用于预测Her2+乳腺癌在患有所述癌症的受试者中的骨转移的试剂盒，该试剂盒包括：a)用于定量所述受试者的样品中的MAF表达水平的手段；和b)用于比较所述样品中定量的MAF表达水平与参考MAF表达水平的手段。
在另一个方面，本发明涉及用于预测患有来自HER2+乳腺癌的骨转移的受试者的临床结果的试剂盒，该试剂盒包括：a)用于定量所述受试者的样品中MAF的表达水平的手段；和b)用于比较所述样品中定量的MAF表达水平与参考MAF表达水平的手段。
在另一个方面，本发明涉及用于确定患有HER2+乳腺癌的受试者的疗法的试剂盒，该试剂盒包括：a)用于定量所述受试者的样品中MAF的表达水平的手段；b)用于比较所述样品中定量的MAF表达水平与参考MAF表达水平的手段；和c)用于基于定量的表达水平与参考表达水平的比较来确定用于预防和/或减少所述受试者中的骨转移的疗法的手段。
在另一个方面，本发明涉及包括下述的试剂盒：i)用于定量患有HER2+乳腺癌的受试者的样品中MAF的表达水平的试剂；和ii)已预定为与骨转移的风险关联的一种或多种MAF表达水平指数。
用于定量所述受试者的样品中MAF的表达水平的手段已在先前详细描述，包括16q23和16q22-24基因座扩增和易位。
在优选实施方案中，用于定量表达的手段包括特异性结合和/或扩增MAF基因的一组探针和/或引物。
在特定实施方案中，乳腺癌是HER2+乳腺癌。
本发明的方法的所有特定实施方案均可应用于本发明的试剂盒及其用途。
用于对患有乳腺癌的受试者样品进行分型的方法
在另一个方面，本发明涉及用于对患有乳腺癌的受试者样品进行分型的体外方法，此方法包括：
a)提供来自所述受试者的样品；
b)定量所述样品中MAF的表达水平；
c)通过比较定量的MAF表达水平与预定的MAF表达的参考水平，来分型所述样品；
其中所述分型提供与所述受试者中的骨转移风险相关的预后信息。
用于定量所述受试者的样品中MAF的表达水平的手段已在先前详细描述，包括16q23和16q22-24基因座扩增和易位。
在特定实施方案中，乳腺癌是HER2+乳腺癌。
在优选实施方案中，样品是肿瘤组织样品。
用于分类患有乳腺癌的受试者的方法
在另一个方面，本发明涉及用于将患有乳腺癌的受试者分类成同类者的方法，其包括：a)测定所述受试者的样品中MAF的表达水平；b)比较所述样品中MAF的表达水平与预定的MAF表达参考水平；和c)基于样品中的所述MAF表达水平，将所述受试者分类成同类者。
用于定量所述受试者的样品中MAF的表达水平的手段已在先前详细描述，包括16q23和16q22-24基因座扩增和易位。
在特定实施方案中，乳腺癌是HER2+乳腺癌。
在优选实施方案中，样品是肿瘤组织样品。
在优选实施方案中，所述同类者包括至少一个其他个体，其已被测定为具有与所述参考表达水平相比较可比较的MAF表达水平。
在另一个优选实施方案中，所述样品中的所述MAF表达水平相对于所述预定参考水平是增加的，并且其中同类者的成员被分类为具有增加的骨转移风险。
在另一个优选实施方案中，所述同类者用于进行临床试验。在优选实施方案中，样品是肿瘤组织样品。
实施例
实施例1
实验程序和数据集
乳腺癌原发性肿瘤样品同类者：
所使用的乳腺癌同类者包括来自患者的超过334个原发性乳腺癌样本，所述患者具有I、II或III期BC和临床注释的随访，包括转移部位(Rojo F.，Ann Oncol(2012)23(5):1156-1164)。组织微阵列根据标准程序进行加工。乳腺癌肿瘤分类成各种亚型，包括ER+、三重阴性和HER2+，并且随后执行适当的统计分析，以测试这些肿瘤中的MAF(MAF)表达和16q22-24扩增是否与目的亚型中的骨转移事件关联。
该同类者中的统计分析基于下述前提：
A)累积发病率
对于图1b，在将Cox原因特异性比例风险模型与竞争事件(在任何时间的骨转移前死亡)拟合并且执行似然比检验后，获得p值。
B)基线特征的比较(表S1)。
年龄差异用斯氏t检验进行测试。所有其他变量用Fisher’s精确检验进行测试。
通过FISH测定验证16q22-24 DNA基因组扩增预测骨转移的预后能力。
为了进一步验证16q22-24基因组扩增特异性预测骨转移风险的能力，我们借助于FISH(我们使用商购可得的测定16q23基因组区域的诊断探针，IGH/MAF Abbot Vysis探针，并且使用着丝粒chr 16探针16q11.2(CEP16)标准化16q23拷贝数)，在由来自患者的334个原发性乳腺癌样本组成的集合中，分析16q22-24染色体区域基因组增益，所述患者具有I、II或III期BC和注释的随访(Rojo F.，Ann Oncol(2012)23(5):1156-1164)。组织微阵列根据标准程序进行加工。载玻片与MAF(16q23)一起温育，并且使用CEP16探针独立地染色。应用DAPI复染剂且用适当的显微镜获取图像。基于50个细胞/肿瘤的平均值，患者根据16q23/CEP16<1.5FISH分层为阴性组，并且根据16q23/CEP16>1.5FISH分层为阳性组(图1a)。
在I、II和III期BC人原发性肿瘤集合(n＝334)中，测定关于在任何时间的骨转移(连续线)和在骨中复发前的死亡(虚线)的累积发病率曲线图(图1b)，并且显示统计学显著性。
基于MAF表达水平确定诊断有HER2+的受试者中的治疗方案
肿瘤组织样品得自诊断为患有HER2+乳腺癌的受试者。将样品切割成薄组织切片并且包埋在石蜡中。每个石蜡切片固定在载玻片上。载玻片与抗MAF抗体一起温育。对于与MAF结合的抗体的显现和检测，使用与荧光染料缀合的抗体。载玻片通过提供荧光染料的激发光束进行显现。荧光信号的图像通过荧光显微镜获得。肿瘤样品中MAF的相对表达水平通过比较肿瘤样品中的荧光信号与参考样品的信号来获得。肿瘤样品中的强度与参考样品中的强度关联，其中与参考样品相比较在肿瘤样品中的更高强度与患有转移至骨的原发性乳腺癌的受试者的风险增加相关联。备选地，使用原位杂交技术或相似技术测定16q22-24基因座、16q23基因座或MAF基因扩增或易位。
基于骨转移的风险增加的预后，对受试者施用抗RANKL抗体地舒单抗作为用于骨转移的预防治疗。将120mg地舒单抗皮下(SC)施用于受试者，每月一次共6个月。每3个月120mg SC，持续接下来的4年半。口服钙(至少500mg)和维生素D(至少400IU)持续5年。在5年后，受试者没有任何骨转移迹象。基于没有骨转移的风险增加的预后，患者不施用该抗RANKL抗体。
应理解本文所述的实施例和实施方案仅用于说明的目的，并且根据本发明的多种修改或改变对于本领域的技术人员而言是启示性的，而且包含在本申请的精神和范围内。
对于所有目的而言，所有公开、专利、专利申请、网址和登录号/数据库序列(包括本文所述的多核苷酸和多肽序列)以引用方式全文并入本文，如同每份单独的公开、专利、专利申请、网址或登录号/数据库序列明确且分别地表明以引用方式并入本文。
表S1.根据16q23 CNA的基线特征
Figure BDA0000998006460000991
缩写：HER2，人表皮生长受体2，n.a.不可用。
Figure IDA0000998006510000011
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Claims (65)

1.用于定量受试者的肿瘤样品中MAF基因的表达水平、扩增或拷贝数的物质在制备用于体外预测HER2+乳腺癌在患有癌症的受试者中的骨转移的制剂中的用途，其中所述预测包括
i)测定受试者的样品中MAF基因的表达水平、扩增或拷贝数，和
ii)将步骤i)中获得的表达水平、扩增或拷贝数与参考值进行比较，
其中所述基因相对于所述参考值增加的表达水平、扩增或拷贝数指示发展骨转移的风险增加。
2.用于定量受试者的肿瘤样品中MAF基因的表达水平、扩增或拷贝数的物质在制备用于体外预测患有来自HER2+乳腺癌的骨转移的受试者的临床结果的制剂中的用途，其中所述预测包括
i)定量受试者的样品中MAF基因的表达水平、扩增或拷贝数，和
ii)将步骤i)中获得的表达水平、扩增或拷贝数与参考值进行比较，
其中所述基因相对于所述参考值增加的表达水平、扩增或拷贝数指示不良临床结果。
3.用于定量受试者的肿瘤样品中MAF基因的表达水平、扩增或拷贝数的物质在制备用于体外设计用于患有HER2+乳腺癌的受试者的定制疗法的制剂中的用途，其中所述设计包括
i)定量受试者的样品中的MAF基因表达水平、扩增或拷贝数，和
ii)将步骤i)中获得的表达水平、扩增或拷贝数与参考值进行比较，
其中如果表达水平、扩增或拷贝数相对于所述参考值增加，则所述受试者对接受旨在预防和/或治疗骨转移的疗法易感。
4.用于定量受试者的肿瘤样品中MAF基因的表达水平、扩增或拷贝数的物质在制备用于体外设计用于患有HER2+乳腺癌的受试者的定制疗法的制剂中的用途，其中所述设计包括
i)定量受试者的样品中的MAF基因表达水平、扩增或拷贝数，和
ii)将i)中获得的表达水平、扩增或拷贝数与参考值进行比较，
其中如果表达水平、扩增或拷贝数相对于所述参考值不增加，则所述受试者对接受旨在预防和/或治疗骨转移的疗法不易感。
5.根据权利要求1的用途，其中所述基因的表达水平、扩增或拷贝数超过平均值指示骨转移的风险增加，并且这种风险与MAF表达的水平成比例。
6.用于定量受试者的肿瘤样品中MAF基因的表达水平、扩增或拷贝数的物质在制备用于测定患有HER2+乳腺癌的受试者中的骨转移风险的制剂中的用途，所述测定包括测定受试者的样品中MAF基因的表达水平、扩增或拷贝数，其中所述基因的表达水平、扩增或拷贝数超过平均值加一个标准差指示早期骨转移的风险增加。
7.根据权利要求1-6中任一项的用途，其中所述骨转移是溶骨性转移。
8.用于定量受试者的肿瘤样品中MAF基因的表达水平、扩增或拷贝数的物质在制备用于体外设计用于患有HER2+乳腺癌伴随骨转移的受试者的定制疗法的制剂中的用途，其中所述设计包括
i)定量受试者的骨转移样品中的MAF基因表达水平、扩增或拷贝数，和
ii)将步骤(i)中获得的表达水平、扩增或拷贝数与参考值进行比较，
其中如果MAF基因表达水平、扩增或拷贝数相对于所述参考值增加，则所述受试者对接受旨在避免或预防骨降解的疗法易感。
9.用于定量受试者的肿瘤样品中MAF基因的表达水平、扩增或拷贝数的物质在制备用于体外设计用于患有HER2+乳腺癌伴随骨转移的受试者的定制疗法的制剂中的用途，其中所述设计包括
i)定量受试者的骨转移样品中的MAF基因表达水平、扩增或拷贝数，和
ii)将步骤(i)中获得的表达水平、扩增或拷贝数与参考值进行比较，
其中如果MAF基因表达水平、扩增或拷贝数相对于所述参考值不增加，则所述受试者对接受旨在避免或预防骨降解的疗法不易感。
10.根据权利要求8或9的用途，其中旨在避免或预防骨降解的疗法选自双膦酸盐、RANKL抑制剂、PTH抑制剂、PTHLH抑制剂、雷奈酸锶、DKK-1抑制剂、MET和VEGFR2双重抑制剂、雌激素受体调节剂、降钙素、镭-223和组织蛋白酶K抑制剂，和/或预防和/或治疗转移的疗法选自c-MAF抑制剂、包括但不限于化学疗法、激素治疗、免疫疗法、放射疗法、手术的全身治疗、mTor抑制剂、Src激酶抑制剂、CCR5拮抗剂、COX-2抑制剂和Alpharadin。
11.根据权利要求10的用途，其中所述RANKL抑制剂选自RANKL特异性抗体和骨保护素。
12.根据权利要求11的用途，其中所述RANKL特异性抗体是地舒单抗。
13.根据权利要求11的用途，其中所述RANKL特异性抗体是RANKL特异性纳米抗体。
14.根据权利要求13的用途，其中所述RANKL特异性纳米抗体是ALX-0141。
15.根据权利要求10的用途，其中所述双膦酸盐是唑来膦酸。
16.根据权利要求10的用途，其中所述MET和VEGFR2双重抑制剂是卡博替尼。
17.根据权利要求10的用途，其中所述镭-223是alpharadin。
18.根据权利要求1-6、8和9中任一项的用途，其中测定MAF基因表达水平、扩增或拷贝数包括定量基因的信使RNA(mRNA)或mRNA的片段、基因的互补DNA(cDNA)或cDNA的片段。
19.根据权利要求18的用途，其中所述表达水平、扩增或拷贝数借助于定量聚合酶链反应(PCR)、DNA阵列、RNA阵列或核苷酸杂交技术进行定量。
20.根据权利要求1-6、8和9中任一项的用途，其中测定MAF基因表达水平、扩增或拷贝数包括定量由基因编码的蛋白质或其变体的水平。
21.根据权利要求20的用途，其中所述蛋白质水平借助于Western印迹、ELISA、免疫组织化学或蛋白质阵列进行定量。
22.根据权利要求1-4、8和9中任一项的用途，其中所述参考值是来自未患有转移的受试者的HER2+乳腺癌样品中的MAF基因表达水平。
23.用于定量受试者的肿瘤样品中MAF基因的表达水平、扩增或拷贝数的物质在制备用于预测HER2+乳腺癌在患有癌症的受试者中的骨转移的制剂中的用途，所述预测包括相对于参考基因拷贝数，测定MAF基因在受试者的样品中是否扩增，其中就参考基因拷贝数而言MAF基因的扩增指示发展骨转移的风险增加。
24.用于定量受试者的肿瘤样品中MAF基因的表达水平、扩增或拷贝数的物质在制备用于预测HER2+乳腺癌在患有癌症的受试者中的骨转移的制剂中的用途，所述预测包括测定MAF基因在受试者的样品中是否易位。
25.根据权利要求23或24的用途，其中所述骨转移是溶骨性转移。
26.权利要求24的用途，其中基因座16q23或16q22-q24是易位的。
27.权利要求24的用途，其中基因座16q23或16q22-q24易位至染色体14的基因座14q32。
28.权利要求24的用途，包括进一步测定相对于参考基因拷贝数，MAF基因在患有癌症的受试者的样品中是否扩增，其中就参考基因拷贝数而言MAF基因的扩增指示发展骨转移的风险增加。
29.权利要求23或24的用途，其中MAF基因的扩增和/或易位借助于测定基因座16q23或16q22-q24的扩增和/或易位进行测定。
30.根据权利要求23或24的用途，其中MAF基因的扩增和/或易位借助于使用MAF基因特异性探针进行测定。
31.根据权利要求30的用途，其中所述MAF基因特异性探针是Vysis LSI/IGH MAF双色双融合探针。
32.根据权利要求23的用途，其中所述参考基因拷贝数是来自未患有转移的受试者的HER2+乳腺癌的肿瘤组织样品中的基因拷贝数。
33.根据权利要求23的用途，其中所述扩增借助于原位杂交或PCR进行测定。
34.根据权利要求23或24的用途，包括进一步测定受试者样品对于所述MAF基因是否是多倍体。
35.根据权利要求1-6、8和9中任一项的用途，其中所述样品是肿瘤组织样品、循环肿瘤细胞或循环肿瘤DNA。
36.c-Maf抑制试剂或者能够避免或预防骨降解的试剂在制备用于治疗受试者中的骨转移的制剂中的用途，所述受试者患有HER2+乳腺癌，并且在转移性肿瘤组织样品中具有就对照样品而言升高的MAF水平。
37.根据权利要求36的试剂的用途，其中试剂选自MAF特异性siRNA、MAF特异性反义寡核苷酸、显性失活c-Maf变体、催化性RNA、DNA酶、抑制性抗体、抑制肽、c-Maf特异性小分子、c-Maf特异性抗体、c-Maf特异性抗体样分子、c-Maf特异性α体。
38.根据权利要求37的试剂的用途，其中所述DNA酶是c-Maf特异性核酶。
39.根据权利要求37的试剂的用途，其中所述抑制性抗体是c-Maf抑制性抗体。
40.根据权利要求39的试剂的用途，其中所述c-Maf抑制性抗体是c-Maf抑制性纳米抗体。
41.根据权利要求37的试剂的用途，其中所述抑制肽是c-Maf特异性的结构上约束的肽或c-Maf特异性订书肽。
42.根据权利要求36的试剂的用途，其中试剂选自双膦酸盐、RANKL抑制剂、PTH抑制剂、PTHLH抑制剂、雷奈酸锶、DKK-1抑制剂、MET和VEGFR2双重抑制剂、雌激素受体调节剂、降钙素、镭-223和组织蛋白酶K抑制剂。
43.根据权利要求42的试剂的用途，其中所述RANKL抑制剂选自RANKL特异性抗体和骨保护素。
44.根据权利要求43的试剂的用途，其中所述RANKL特异性抗体是地舒单抗。
45.根据权利要求43的试剂的用途，其中所述RANKL特异性抗体是RANKL特异性纳米抗体。
46.根据权利要求45的试剂的用途，其中所述RANKL特异性纳米抗体是ALX-0141。
47.根据权利要求42的试剂的用途，其中所述双膦酸盐是唑来膦酸。
48.根据权利要求42的试剂的用途，其中所述MET和VEGFR2双重抑制剂是卡博替尼。
49.根据权利要求42的试剂的用途，其中所述镭-223是alpharadin。
50.根据权利要求36-49中任一项的试剂的用途，其中所述骨转移是溶骨性转移。
51.用于定量受试者的肿瘤样品中MAF基因的表达水平、扩增或拷贝数的物质在制备用于对患有HER2+乳腺癌的受试者的样品进行分型的制剂中的用途，所述分型包括：
(a)定量受试者的样品中MAF的表达水平、扩增或拷贝数；
(b)通过比较定量的MAF表达水平、扩增或拷贝数与预定的MAF表达参考水平来对所述样品进行分型；
其中所述分型提供与所述受试者中的骨转移风险相关的预后信息。
52.用于定量受试者的肿瘤样品中MAF基因的表达水平、扩增或拷贝数的物质在制备用于将患有HER2+乳腺癌的受试者分类成同类者的制剂中的用途，所述分类包括：a)测定受试者的样品中MAF的表达水平、扩增或拷贝数；b)比较所述样品中MAF的表达水平、扩增或拷贝数与预定的MAF表达参考水平；和c)基于样品中的MAF表达水平、扩增或拷贝数，将受试者分类成同类者。
53.根据权利要求52的用途，其中所述同类者包括至少一个其他个体，其已被测定为具有与所述参考表达水平、扩增或拷贝数相比较可比较的MAF表达水平、扩增或拷贝数。
54.根据权利要求53的用途，其中在将受试者分类成同类者后，基于其MAF表达水平、扩增或拷贝数给受试者施用疗法。
55.根据权利要求51或52的用途，其中样品中的MAF表达水平、扩增或拷贝数相对于预定参考水平、扩增或拷贝数是增加的，并且其中同类者的成员被分类为具有增加的骨转移风险。
56.根据权利要求52的用途，其中所述同类者用于进行临床试验。
57.根据权利要求51或52的用途，其中所述样品是肿瘤组织样品。
58.根据权利要求51或52的用途，其中MAF基因、16q23或16q22-16q24染色体区域是扩增或易位的。
59.权利要求3或4的用途，其中旨在预防和/或治疗骨转移的疗法是mTor抑制剂。
60.权利要求59的用途，其中所述mTor抑制剂是依维莫司。
61.权利要求3或4的用途，其中旨在预防和/或治疗骨转移的疗法是Src激酶抑制剂。
62.权利要求61的用途，其中所述Src激酶抑制剂是达沙替尼。
63.权利要求3或4的用途，其中旨在预防和/或治疗骨转移的疗法是COX-2抑制剂。
64.权利要求63的用途，其中将第二种治疗与所述COX-2抑制剂组合使用。
65.权利要求3或4的用途，其中旨在预防和/或治疗骨转移的疗法是Alpharadin。
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