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CN105969895A - 一种使用逆转录pcr检测hla-b*5801基因表达的检测方法及试剂盒 - Google Patents

一种使用逆转录pcr检测hla-b*5801基因表达的检测方法及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明是属于基因工程技术领域，特别是关于一种使用逆转录PCR方法检测HLA‑B*5801基因表达的检测方法，及用于进行该检测方法的HLA‑B*5801 RT‑PCR检测试剂盒，本发明的技术方案特征包括：筛选一段特异性的引物，该引物翻译的产物仅仅针对HLA‑B*5801的序列；以及将该引物用于针对HLA‑B*5801的蛋白翻译序列的cDNA片段进行的RT‑PCR检测。本发明的RT‑PCR检测方法及试剂盒，是针对HLA‑B*5801翻译区的RNA或cDNA的检测，对比针对HLA‑B*5801基因的DNA序列的检测，更能直接检测到HLA‑B*5801蛋白的表达。

Description

一种使用逆转录PCR检测HLA-B*5801基因表达的检测方法及 试剂盒
技术领域
本发明是属于基因工程技术领域，特别是关于一种使用逆转录PCR方法检测HLA-B*5801基因表达的检测方法，及用于进行该检测方法的HLA-B*5801RT-PCR检测试剂盒。
背景技术
近年来，随着我国经济快速发展，人们生活水平持续，日常饮食结构和习惯逐渐发生改变，饮食结构的改变导致了痛风和高尿酸血症这类自身免疫性疾病正逐渐成为常见的多发病。
痛风是由于血尿酸水平过高而造成尿酸盐结晶在关节中沉积而导致的一种急性关节炎。据近年各地高尿酸血症患病率的报道，目前我国约有高尿酸血症者1.2亿，其发病率已经达到了人群的10％，在发病率呈上升趋势的同时，发病年龄也开始呈现低龄化趋势。据不完全统计，我国每年有近100万人因痛风致残。痛风已成为严重影响人们身体健康的疾病之一。此外高尿酸血症及痛风还会引发严重的相关疾病，如肾功能障碍、缺血性心脏病、肾结石、肥胖症、高血脂症、糖尿病、高血压等。
目前控制痛风及血尿酸水平过高主要依靠别嘌呤醇和丙磺舒类药物。别嘌呤醇为痛风患者治疗中的一线药，但其一个显着的缺点是患者易发生过敏。过敏患者可以发生严重的剥脱性皮炎，包括Stevens-John综合征(SJS)及中毒性表皮坏死症(TEN)，甚至可危及患者的生命。别嘌呤醇药疹因潜伏期长，病情重，易复发和病死率高而受到重视，因此对于即将使用别嘌呤醇的患者对于其发生过敏风险的预测极其重要。
HLA-B*5801为一个可用于预测别嘌呤醇使用过程中是否会出现过敏的一个基因。HLA-B*5801为一种白细胞分化抗原。近年来，国内外很多研究都证实它和使用别嘌呤醇患者发生严重过敏的风险存在强烈的相关性，如表1所示。而2012年美国风湿病学会(ACR)关于痛风患者的指南中也指出，HLA-B*5801可作为一种有效的预测手段，用于判断痛风患者能否使用别嘌呤 醇。研究报道亚洲人群和欧洲人群的别嘌呤醇诱导的严重药物不良反应与HLA-B*5801之间存在强烈的关联性。有研究表明，HLA-B*5801与别嘌呤醇诱导的过敏反应的敏感性和特异性分别为100％和87％。因此，检测痛风患者是否携带HLA-B*5801，对于指导用药有重要的意义。世界不同人种HLA-B*5801的平均携带率差异，非洲人2-4％，白种人1-6％，亚洲人3-15％，华人8.8-10.9％。美国FDA及日本，中国台湾地区等地的医疗监管部门已明确要求医生在对亚裔人群使用别嘌呤醇前，必须进行HLA-B*5801基因检测，并且此项检测已纳入医保范围。
由于HLA-B*5801在痛风患者中的重要价值刚被确立，目前诊断手段尚不成熟，主要检测方法有DNA测序法和PCR检测(主要针对DNA)方法。目前应用于HLA-B*5801的检测试剂盒，主要是通过直接测序法及DNA的Q-PCR检测方法。直接测序或者是PCR-SBT都是需要通过测序仪针对HLA-B位点进行测序，虽然结果较为准确，但是由于目的基因与其家族成员存在高度相似性，测序结果较容易出现套峰，并且测序技术需要购置测序仪，过程繁琐，耗时较长，不利于快速检测基因分型，准确指导临床用药。
目前已有针对HLA-B*5801基因的DNA的PCR检测方法，例如我国专利公布号103484533A公开了一种检测HLA-B*5801等位基因的方法，包括利用三对特异性引物和一对内参引物，或一对特异性引物和二条荧光探针，及一对内参引物和一条相应荧光探针进行PCR-SSP扩增，再通过琼脂糖凝胶电泳分析，或荧光PCR分析待测样本是否携带HLA-B*5801等位基因。专利公布号104017898A公开了一种快速检测HLA-B*5801基因的引物、试剂盒及方法，其特征是采用多重引物的组合设计，完全覆盖HLA-B*5801基因的SNP位点，来增强特异性结合，防止假阳性检测结果的产生。专利公布号104232781A公开了一种检测HLA-B*5801等位基因的TaqMan探针实时荧光PCR方法，特点是设计特异性扩增HLA-B*5801等位基因的引物探针组合，将目的基因与内参基因加入一管中进行双通道荧光PCR反应，通过扩增曲线分析结果。
目前我国市场上具备临床资质的HLA-B*5801等位基因测试盒，仅中国台湾地区世基生物医学股份有限公司的试剂盒(2015年刚获批，CE认证，CFDA 认证)。目前针对DNA的Q-PCR检测方法，虽然可以通过荧光结果判读实验结果，但是针对的是HLA-B*5801的全长DNA序列，而不是针对发挥功能的蛋白序列，并且DNA的合成产物不仅仅包括翻译区的外显子，还包括非编码区的内含子序列，因此缺少检测的特异性。
药物诱发的不良反应的遗传学基础成为近年来药物遗传学研究的热点，并发现人类的HLA基因的单核苷酸多态性变异与多种药物不良事件相关。HLA分子在免疫反应中扮演这重要的角色，它可以将药物抗原(通常为8-10个多肽)呈递TCR，可以识别专一的T细胞并引起免疫反应。所有有核细胞表面均表达I类HLA分子，包括HLA-A,HLA-B及HLA-C等8个基因座位。其中HLA-B位点上有800多个基因型，是人类最复杂的遗传多肽系统，并且成员之间序列相似性极高，即使是同一种血清型B58，也有31种等位基因存在，其中HLA-B*5801与HLA-B*5802，HLA-B*5803等成员仅有一个氨基酸的差异，并且出现杂合子的概率远大于纯合子，故对于HLA-B*5801基因型的检测鉴定新方法的研究有着重要的意义。根据HLA的命名原则，主要是通过特异性的蛋白进行分类命名，因而针对特定目标蛋白序列的检测及翻译区的RNA或cDNA的检测，可以增加检测蛋白的特异性。
发明内容
本发明目的是开发一种新的针对HLA-B*5801蛋白翻译序列的cDNA片段的RT-PCR检测方法，其主要解决的技术手段是：筛选一段特异性的引物，并将其应用于针对HLA-B*5801的cDNA的逆转录PCR，即RT-PCR简易的基因型检测方法，并且该引物翻译的产物系仅仅针对HLA-B*5801的序列。
本发明的一目的在于提供一种使用逆转录PCR方法检测HLA-B*5801基因表达的检测方法，所述检测方法包含如下步骤：
(1)提取样本的RNA；
(2)将所获得的RNA进行RT-PCR逆转录成一cDNA片段；
(3)设计针对该cDNA片段的cDNA特异性引物和一对内参引物；
(4)在荧光PCR仪上进行荧光Q-PCR扩增反应，或与该特异性引物进行PCR 扩增反应；
(5)根据目的基因及内参基因的CT值的差值，或通过琼脂糖凝胶电泳分析是否有预定的PCR扩增产物出现，判断目的基因HLA-B*5801是否为阳性。
进一步的，所述样本为取自待测患者血液的白细胞，但不局限于白细胞，样本可为取自待测患者血液、组织等的各种细胞。作为优选的，所述的样本为取自待测患者血液的白细胞。
进一步的，所述cDNA特异性引物包括上游引物,含有以下至少80％相似序列：5’-GGGGAGACACGGAACATGAAG-3’(SEQ ID NO.1)及下游引物，含有以下至少80％相似序列：5’-GTTGTAGTAGCGGAGCGCGA-3’(SEQ ID NO.2)。作为优选的，所述的特异性引物包含SEQ IDNO.1与2所示的特异性引物对85％、90％、95％或99％相似的序列。
进一步的，所述内参引物包括上游引物，含有以下至少80％相似序列：5’-AGAAAATCTGGCACCACACC-3’(SEQ ID NO.3)及下游引物，含有以下至少80％相似序列：5’-AGAGGCGTACAGGGATAGCA-3’(SEQ ID NO.4)。作为优选的，所述内参引物包含SEQ ID NO.3与4所示的内参引物对，或含有85％、90％、95％或99％相似的序列。
进一步的，所述荧光Q-PCR扩增反应方法为可应用于任何荧光Q-PCR法，例如，但不局限于SYBR Green法或Eva Green法等荧光Q-PCR方法。作为优选的，可应用于所述荧光Q-PCR扩增反应方法的荧光染料，包括，但不局限于SYBR Green、Eva Green、RTGreen等。
本发明的另一目的在于提供一种检测HLA-B*5801基因转录序列的cDNA片段的RT-PCR检测试剂盒，所述试剂盒包含一对针对该cDNA片段的特异性引物和一对内参引物，及用于进行定量荧光PCR反应或一般PCR反应的酶和试剂组合。
进一步的，所述的特异性引物包含SEQ ID NO.1与2所示的特异性引物对，或含有至少80％相似序列，且该内参引物包含SEQ ID NO.3与4所示的内参引物对，或含有至少80％相似序列。作为优选的，所述的特异性引物包含 SEQ ID NO.1与2所示的特异性引物对，或含有85％、90％、95％或99％相似的序列，且该内参引物包含SEQ ID NO.3与4所示的内参引物对，或含有85％、90％、95％或99％相似的序列。
进一步的，所述用于进行荧光PCR反应的酶和试剂包括Buffer(10X)、热启动酶、UNG酶、dNTP、EVA Green(20X)、MgCl2，其最终浓度分别为1X、0.01～1.0U/μl、0.001～0.1U/μl、0.01～0.1mM、0.25X～2X、0.5～5.0mM。
本发明的又一目的在于提供一种检测HLA-B*5801基因转录序列的cDNA片段的引物组合，该引物组合包含选自以下至少80％相似序列：SEQ ID NO.1与2、SEQ ID NO.5与6所示的特异性引物对。作为优选的，该引物组合包含SEQ ID NO.1与2或SEQ ID NO.5与6所示的特异性引物对，或含有85％、90％、95％或99％相似的序列。
进一步的，该引物组合进一步包含SEQ ID NO.3与4所示的内参引物对，或含有至少80％相似序列。作为优选的，所述的内参引物对包含SEQ ID NO.3与4所示的内参引物对，或含有85％、90％、95％或99％相似的序列。
进一步的，所述的用于进行定量荧光PCR反应的荧光标记系统包括所有可能用以实现本发明使用逆转录PCR方法检测HLA-B*5801基因表达的检测方法的目标的所有系统。作为优选的，所述的荧光染料包括，但不局限于SYBR Green、Eva Green、RTGreen等。
术语“HLA-B*5801抗原”为一种白细胞分化抗原，存在于所有有核细胞表面，B基因座位上的58家族成员，与别嘌呤醇的用药过敏存在直接相关性。
术语“逆转录PCR”或“RT-PCR”在本文中是指一种用于检测目的基因的cDNA的检测方法，通过在检测方法中加入荧光素，观察荧光信号的强弱，判断目的基因的表达量。
在以下说明及附属的图式，将详细列述本发明的一或多项具体实施例。本发明的其他特征、目的与优点，将从这些详细描述与图式，以及从权利要求中显而易见。
附图说明
图1为本发明HLA-B*5801特异性引物用Q-PCR方法检测5个阳性样本与5个阴性样本获取的荧光扩增曲线图；
其中，曲线P-1、P-2、P-3、P-4、P-5分别为5个阳性样本的荧光扩增曲线，曲线N-1、N-2、N-3、N-4、N-5分别为5个阴性样本的荧光扩增曲线。
图2为内参引物β-actin用Q-PCR方法检测阳性样本与阴性样本获取的荧光曲线图；
其中，曲线P1-P5分别为5个阳性样本的荧光扩增曲线，曲线N1-N5分别为5个阴性样本的荧光扩增曲线。
图3为SYBR Green法Q-PCR检测一个阳性样本和一个阴性样本获取的荧光扩增曲线图；
其中：1为阳性样本内参基因扩增曲线、2为阴性样本内参基因扩增曲线、3为阳性样本目的基因扩增曲线、4为阴性样本目的基因扩增曲线。
图4为EVA Green法Q-PCR检测一个阳性样本和一个阴性样本获取的荧光扩增曲线图；
其中：1为阳性样本内参基因扩增曲线、2为阴性样本内参基因扩增曲线、3为阳性样本目的基因扩增曲线、4为阴性样本目的基因扩增曲线。
具体实施方式
1.Trizol提取RNA
取1-2ml EDTA抗凝血加入红细胞裂解液，10分钟后于250g离心5min，收集离心管底白细胞，收集的白细胞加入1ml Trizol，充分吹打，使细胞沉淀溶解，室温静置5分钟。(加完一管即吹打，勿将标本全部加完后再吹打，尤其标本含红细胞时。)每使用1ml Trizol加入0.2mL氯仿，剧烈振荡15秒，室温放置2-3分钟后，于2-8℃12000g离心15分钟。离心后，样品分为三层：底层为红色有机相(酚-氯仿相)，上层为无色水相和一个中间层，RNA主要在水相中。小心吸出上层水相(通常取到450-500μl)转移到新的无Rnase的EP微量离心管中。用异丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRizol 加入0.5ml异丙醇，“8”字法颠倒混匀，室温放置10分钟后，于2-8℃12000g离心10分钟。离心前常看不出RNA沉淀，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀，移去上清。用无RNA酶的75℅乙醇洗涤RNA沉淀，混匀。每使用1ml Trizol加1ml75℅乙醇，2-8℃不超过7500g离心5分钟，弃上清，尽量吸干。室温(或超净工作台)放置干燥RNA沉淀后，加入20-50μl DEPC水，在55-60℃放置10分钟使RNA完全溶解。另取1μl RNA在紫外分光亮度计测定RNA的纯度和浓度。RNA样品的纯度：1.8<A260/A280<2.0。
2.逆转录PCR扩增(RT-PCR)制备cDNA
使用前先将所有冷冻试剂解冻。开始实验前将所有试剂轻度离心。实验开始后保持将所有试剂置于冰上。将无菌、无核酸酶、薄管壁的PCR管置于冰上，以20μl反应体系为例，按照以下组分准备模板-引物混合物。其中Oligo(dT)18引物(瓶5)、随机六聚核苷酸引物(瓶6)购自德国罗氏公司。
成分 体积 最终浓度
总RNA 0.2～10μl 1μg
Oligo(dT)18引物(瓶5) 1μl 2.5μM
随机六聚核苷酸引物(瓶6) 2μl 60μM
水，无RNA酶(瓶7) 0～9.8μl
总体积 13μl
在65℃条件下加热反应管10分钟，使模板-引物混合物变性。此步骤可确保RNA二级结构变性。立即将反应管置于冰上冷却。在含有模板-引物混合物的反应管中加入下表中其余的RT反应液组分。其中，Transcriptor逆转录酶反应缓冲液(5X)(瓶2)、ProtectorRNase抑制剂(瓶3)、dNTP(瓶4)、Transcriptor逆转录酶(瓶1)等购自德国罗氏公司。
在反应管中将试剂小心混匀，反应时使用带加热盖的加热模块，防止液体挥发。用以下程序进行PCR。
25℃ 10分钟
50℃ 60分钟
85℃ 5分钟
获得的cDNA产物将用于以下的方法，作为模板。
3.SYBR Green法Q-PCR
在本实施例中用于发明中所设计的序列特异性引物和内参引物为：
HLA-B*5801特异性引物：上游：5’-GGGGAGACACGGAACATGAAG-3’(SEQ ID NO.1)；下游：5’-GTTGTAGTAGCGGAGCGCGA-3’(SEQ ID NO.2)。
内参引物：上游：5’-AGAAAATCTGGCACCACACC-3’(SEQ ID NO.3)；下游：5’-AGAGGCGTACAGGGATAGCA-3’(SEQ ID NO.4)。
将反应管置于冰上，在20μl单个反应体系中，依次加入下表中的反应液组分。其中SYBR Green I(20X)购自康为世纪。
试剂 体积 最终浓度
SYBR Green Master(ROX) 10μl 1X
上游F引物(30μM) 0.2μl 300nM
下游R引物(30μM) 0.2μl 300nM
水，PCR等级 7.6μl
总体积 18μl
用移液枪将混合液小心混匀，请勿漩涡。移取18μl PCR混合液至PCR反应管或PCR微板孔中。加入2μl于前述第2步骤所获得的cDNA产物作为模板。使用透光的PCR管盖或用自黏箔封闭PCR板。用以下程序进行荧光PCR测定：
4.结果判读
本方法采用的是在荧光PCR仪器上直接观察目的基因以及内参基因的CT值的差值，判断结果是否为阳性，操作过程不需应用到测序仪，时间较短，并且能直观判断结果。参见图1所示的结果，在本发明较佳的实验体系，使用内参基因β-actin作为内对照，分析的样本用上述的特异性引物与内参引物同时进行Q-PCR，观察目的基因的CT值与内参基因的CT值，若样本的目的基因的CT值减去内参基因β-actin的CT值相减小于7，则判断为阳性，若大于7，或目的基因的CT大于35，则判断为阴性，结果如图3。
5.EVA Green法Q-PCR
本发明的检测方法还可以采用EVA Green荧光染料操作系统实现Q-PCR检测。
HLA-B*5801特异性引物：上游：5’-GGGGAGACACGGAACATGAAG-3’(SEQ ID NO.1)；下游：5’-GTTGTAGTAGCGGAGCGCGA-3’(SEQ ID NO.2)。
内参引物：上游：5’-AGAAAATCTGGCACCACACC-3’(SEQ ID NO.3)；下游：5’-AGAGGCGTACAGGGATAGCA-3’(SEQ ID NO.4)。
将反应管置于冰上，在20μl单个反应体系中，依次加入下表中的反应液组分。其中，热启动酶(5.0U/μl)购自TAKARA，UNG酶(1U/μl)购自Thermo，EVA Green(20X)购自美国Biotium。
试剂 体积 最终浓度
Buffer(10X) 2μl 1X
热启动酶(5.0U/μl) 0.4～4μl 0.01U～1.0U/μl
UNG酶(1U/μl) 0.2～2μl 0.001U～0.1U/μl
dNTP(2.5mM) 0.08～0.8μl 0.01～0.1mM
EVA Green(20X) 0.25～2μl 0.25X～2X
MgCl2(25mM) 0.4～4μl 0.5～5.0mM
上游F引物(10μM) 0.1～1μl 50～500nM
下游R引物(10μM) 0.1～1μl 50～500nM
水(PCR级) 1.2～14.47μl
总体积 18μl
用移液枪将混合液小心混匀，请勿漩涡。移取18μl PCR混合液至PCR反应管或PCR微板孔中。加入2μl于前述第2步骤所获得的cDNA产物作为模板。使用透光的PCR管盖或用自黏箔封闭PCR板。用以下程序进行荧光PCR测定：
结果判读
本方法采用的是在荧光PCR仪器上直接观察目的基因以及内参基因的CT值的差值，判断结果是否为阳性，操作过程不需应用到测序仪，时间较短，并且能直观判断结果。参见图4所示的结果，于本发明较佳的实验体系，使用内参基因β-actin作为内对照，分析的样本用上述的特异性引物与内参引物同时进行Q-PCR，观察目的基因的CT值与内参基因的CT值，若样本的目的基因的CT值减去内参基因β-actin的CT值相减小于7，则判断为阳性，若大于7，或目的基因的CT大于35，则判断为阴性，结果如图4。
6.其他具体实施方式
除了上述的通过荧光PCR的方法，对HLA-B*5801的基因型直观的判断是否携带该基因，还可以通过将前述第2步骤所获得的cDNA产物作为模板，与同一段特异性的引物进行普通PCR，所得PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳，分析是否有75bp左右大小的扩增产物，而进行阳性或阴性结果的判断。
通过普通PCR结合凝胶电泳的方法，鉴定出针对cDNA的三个较为特异的引物序列，其中包括上述所提及的HLA-B*5801特异性引物，还包括以下一对特异性引物：
上游：5’-GGGAGACACGGAACATGAAGG-3’(SEQ ID NO.5)；
下游：5’-TTGTAGTAGCGGAGCGCGA-3’(SEQ ID NO.6)
综合上述，本发明是针对翻译HLA-B*5801蛋白的cDNA序列上的多态性 集中位点设计的特异性引物，因此针对的是HLA-B*5801蛋白翻译前的RNA序列，对比DNA序列，更能直接的检测到HLA-B*5801蛋白的表达。由于别嘌呤醇的药物过敏主要是与HLA-B*5801的蛋白功能相关，因而直接检测HLA-B*5801蛋白的表达，更能直接且准确的反映测试患者是否携带HLA-B*5801基因。
本说明书中所揭示的全部特征可以任何组合方式组合。本说明书中所揭示的各别特征可由依相同、相等或类似目的的替代特征取代。因此，除非另行清楚地指示，所揭示的各特征仅为一系列同等物或类似特征的实例。
从前述的说明，习于该项技艺具有通常知识者可容易地确定本发明的基本特征，且在未偏离其范围下，可进行本发明的各种改变与修饰，以使其适于各种不同用途与状况。因此，于权利要求内亦包含其他具体实施方式。
序列表
<110> 厦门敖依生物科技有限公司、厦门金诺威生物科技有限公司
<120> 一种使用逆转录PCR检测HLA-B*5801基因表达的检测方法及试剂盒
<130>
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 上游引物
<400> 1
ggggagacac ggaacatgaa g 21
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 下游引物
<400> 2
gttgtagtag cggagcgcga 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 上游引物
<400> 3
agaaaatctg gcaccacacc 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 下游引物
<400> 4
agaggcgtac agggatagca 20
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 上游引物
<400> 5
gggacacacggaacatgaagg 21
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 下游引物
<400> 6
ttgtagtagcggagcgcga 19

Claims (12)

1.一种使用逆转录PCR检测HLA-B*5801基因表达的检测方法，其特征在于，所述检测方法包含如下步骤：
（1）提取样本的RNA；
（2）将所获得的RNA进行RT-PCR逆转录成一cDNA片段；
（3）设计针对该cDNA片段的cDNA特异性引物和一对内参引物；
（4）在荧光PCR仪上进行荧光Q-PCR扩增反应，或与该特异性引物进行PCR扩增反应；
（5）根据目的基因及内参基因的CT值的差值，或通过琼脂糖凝胶电泳分析是否有预定的PCR扩增产物出现，判断目的基因HLA-B*5801是否为阳性。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述cDNA特异性引物包括上游引物,含有以下至少80%相似序列：5’-GGGGAGACACGGAACATGAAG-3’(SEQ ID NO.1)及下游引物，含有以下至少80%相似序列：5’-GTTGTAGTAGCGGAGCGCGA-3’(SEQ ID NO.2)。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述内参引物包括上游引物，含有以下至少80%相似序列：5’-AGAAAATCTGGCACCACACC-3’(SEQ ID NO.3) 及下游引物，含有以下至少80%相似序列：5’-AGAGGCGTACAGGGATAGCA-3’(SEQ ID NO.4)。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述样本为取自待测患者血液的白细胞。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述荧光Q-PCR扩增反应方法为SYBRGreen 法、Eva Green法或RTGreen法。
6.一种检测HLA-B*5801基因表达的RT-PCR检测试剂盒，用于进行根据权利要求1所述的检测方法的步骤(4)，其特征在于，所述试剂盒包含一对针对该cDNA片段的特异性引物和一对内参引物，及用于进行荧光PCR反应或一般PCR反应的酶和试剂组合。
7.根据权利要求6所述的RT-PCR检测试剂盒，其特征在于，所述特异性引物包含SEQ IDNO.1与2所示的特异性引物对，或含有至少80%相似序列；且该内参引物包含SEQ ID NO.3与4所示的内参引物对，或含有至少80%相似序列。
8.根据权利要求6所述的RT-PCR检测试剂盒，其特征在于，所述用于进行荧光PCR反应的荧光染料，包括SYBR Green、Eva Green或RTGreen。
9.根据权利要求6所述的RT-PCR检测试剂盒，其特征在于，所述用于进行荧光PCR反应的试剂为SYBR Green Master（ROX）。
10.根据权利要求6所述的RT-PCR检测试剂盒，其特征在于，所述用于进行荧光PCR反应的酶和试剂包括Buffer（10X）、热启动酶、UNG酶、dNTP、EVA Green（20X）、MgCl2，其最终浓度分别为1X、0.01～1.0U/μl、0.001～0.1U/μl、0.01～0.1mM、0.25X～2X 、0.5～5.0mM。
11.一种检测HLA-B*5801基因转录序列的cDNA片段的引物组合，其特征在于，所述引物组合包含选自下列的特异性引物对，含有以下至少80%相似序列：
(1) 上游引物5’- GGGGAGACACGGAACATGAAG-3’(SEQ ID NO.1) 与下游引物5’-GTTGTAGTAGCGGAGCGCGA-3’(SEQ ID NO.2), 或
(2) 上游引物5’-GGGAGACACGGAACATGAAGG-3’(SEQ ID NO.5) 与下游引物5’-TTGTAGTAGCGGAGCGCGA-3’(SEQ ID NO.6)。
12.根据权利要求11所述的引物组合，其特征在于，所述引物组合还包含SEQ ID NO.3与4所示的内参引物对，或含有至少80%相似序列。
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