CN105950552A

CN105950552A - 一种分泌抗原特异性抗体浆细胞的分离方法

Info

Publication number: CN105950552A
Application number: CN201610356287.0A
Authority: CN
Inventors: 赖增祖; 叶欣; 徐健; 杨奎东
Original assignee: Ai Ke Bio Tech Ltd Ningbo
Current assignee: Ai Ke Bio Tech Ltd Ningbo
Priority date: 2016-05-26
Filing date: 2016-05-26
Publication date: 2016-09-21

Abstract

本发明公开了一种分泌抗原特异性抗体浆细胞的分离方法，通过使用浆细胞标记物CD38或CD138单抗与抗IgG抗体交联的双功能抗体和交联有特定抗原的磁珠分离得到分泌抗原特异性抗体的浆细胞。本发明能够准确获得将分泌抗原特异性的抗体浆细胞，极大地减少了工作量，成功率较高。

Description

一种分泌抗原特异性抗体浆细胞的分离方法

技术领域

本发明属于单克隆抗体技术领域，具体涉及一种分泌抗原特异性抗体浆细胞的分离方法以及一种高通量制备抗原特异性单克隆抗体的方法。

背景技术

自1986年第一个抗体应用于治疗以来，至今已有50多个抗体药应用于临床治疗，到2020年将有大约70个抗体药物进入临床治疗应用，预计其市场将达到1250亿美元。加上临床诊断用的检测抗体和实验室科研用的抗体。抗体的市场将远远大约1250亿美元。由于多数的单克隆抗体来源于小鼠，小鼠抗体对于人是外源蛋白，具有很高的免疫原性，容易引起人抗鼠抗体的免疫反应，人抗鼠抗体的免疫反应大大阻碍了鼠源性抗体在临床治疗中的应用。现在主要是有两种方法解决这个难题。第一是用基因工程的方法对鼠源性抗体进行人源化。第二制备人源性的抗体。

人源性抗体的获得主要是通过抗体杂交瘤技术，噬菌体显示文库技术和对人B细胞的转化的途径。

(1) 利用人抗体基因转基因小鼠作为平台，通过杂交瘤抗体技术。在人抗体基因转基因小鼠中小鼠抗体基因已被敲除，因此人抗体基因转基因小鼠中抗体是人源性抗体。杂交瘤抗体技术于1975年由英国科学家Kother and Milstein 发明。自杂交瘤抗体技术杂交瘤抗体技术发明以来的40多年的时间里，通过杂交瘤单克隆抗体制备了大量单克隆抗体，这些单克隆抗体于科研、临床诊断、临床疾病治疗得到了广泛的应用。杂交瘤抗体技术是将分泌抗原特异性抗体的B细胞和某些药物过敏的小鼠骨髓瘤细胞融合形成的杂交瘤细胞，该杂交瘤细胞既具有B细胞分泌抗体的功能又具有骨髓瘤细胞无限增殖的特性，经过筛选可获得分泌抗原特异性抗体的杂交瘤细胞株。利用杂交瘤细胞株可以无限的生产抗体。

(2) 噬菌体展示技术将不同抗体的重链和轻链可变区展示在噬菌体的表面。利用靶抗原进行筛选，可获得能结合靶抗原的抗体。利用基因工程技术，将人的抗体的重链和轻链可变区基因克隆并表达展示在噬菌体的表面，建立人抗体噬菌体展示文库。利用目标抗原进行筛选，可得到特异结合目标抗原的人抗体。噬菌体抗体显示文库的成功与否决定于抗体的可变区序列的来源。序列的多样性，以及CDRs的多样性。由于无法利用目标对人进行免疫。用来构建人抗体噬菌体显示文库的人抗体的重链和轻链可变区基因主要是从未经免疫的人的B细胞克隆获得。因为没有经过体细胞突变的亲和成熟过程，有这种方法制备的抗体的亲和很低，特异性也不高。而且由于噬菌体的粘性较高。在筛选抗体特异性抗体时容易获得假阳性的菌株。特别是细胞表面抗原的抗体。

(3)利用EB病毒转化人B细胞也是一种获得人源抗体的途径。但EB病毒转化人B细胞的成功率也不高。而且小鼠的B细胞对EB病毒不敏感。虽然发明了无病毒转化技术，但成功率比杂交瘤技术低得多。

因此获得高亲和力的特异性抗体还是多由杂交抗体技术来制备。当用纯化的蛋白质抗原或其他抗原免疫小鼠时，抗原经过加工递呈激活小鼠的T细胞和B细胞，在T细胞的参与下，B细胞经过增殖，分化，体细胞突变的亲和成熟过程最终变成能分泌抗原特异性抗体的B细胞（浆细胞）。浆细胞是B细胞分化的终极细胞。浆细胞表面不表达抗原受体。浆细胞是经过体细胞突变的亲和成熟过程。因此浆细胞分泌的抗体亲和力一般都比较高。浆细胞分化成熟后进入血液和骨髓。由于浆细胞生命周期较短，血液中的浆细胞会不断的凋亡，从尔使得血液中抗体的浓度下降。但在骨髓中的浆细胞，有部分能存活下来，这些细胞不断的产生抗体，以维持血浆中抗体的浓度。

尽管杂交瘤抗体技术早在1975年就发明，但40年来杂交瘤抗体技术并没有多大的发展和变化。杂交瘤的形成率很低问题还没有解决。用纯化的蛋白质抗原免疫小鼠时小鼠可产生10⁵-10⁶抗原特异性的B细胞，这些抗原特异性的B细胞分泌的抗体分别识别抗原上不同的抗原决定簇，对于每个抗原决定簇，抗体的数量是不一样的，有些是主要的抗原决定簇，因此这些主要的抗原决定簇激活形成较多分泌这些抗原决定簇特异性的抗体的B细胞。但是由于利用杂交瘤技术制备抗体时成功率低，一般一个融合后能形成100个能分泌抗体的杂交瘤，这也仅仅占总分泌抗原特异性抗体的B细胞的0.1%。如何更快更有效获得更多的结合目标蛋白抗原的不同位点的抗体对加速抗体药物的开发具有非常重要的意义。抗体治疗的靶位点多是蛋白质（蛋白受体，蛋白受体结合物以及酶），每个蛋白质都有多个抗原位点，抗体结合蛋白抗原的位点不同，其作用也就不同，有些位点能激活蛋白受体的功能，有些能抑制蛋白受体的功能。人们可以根据疾病机理，治疗的途径取选择所要的抗体。

中国专利申请201110119289.5公开了一种单克隆抗体制备方法，采用向淋巴B细胞培养微孔中加入固相化抗原的磁颗粒微球，磁力分离磁颗粒微球至对应微孔板，免疫化学发光法或免疫荧光方法检测出分泌特异抗体的单个B细胞，通过单细胞RT-PCR及巢式PCR的方法扩增出抗体轻、重链可变区基因并重组至包含抗体恒定区的表达质粒，转染宿主细胞表达单克隆抗体。该方法先进行鉴定阳性克隆，而后再从阳性克隆中克隆抗体的可变区基因，由于B 细胞的数量巨大，筛选工作非常艰难。同时由于检测和克隆的分离，容易造成B细胞的丢失。

中国专利申请CN201280016777.6公开了一种用浆细胞制备抗体的技术。该技术应用浆细胞的荧光染料标记浆细胞。而后将所有的浆细胞分离出来，再进行基因克隆，由于抗原特异性抗体的浆细胞占总的浆细胞比例相对较低，因此特异性比较差，效率比较低。该技术比较耗时，工作量大，需要大量的筛选板，人工很难完成这样的筛选，因此必须要全自动的机器来完成筛选。

发明内容

本发明针对现有技术不足，利用单个细胞抗体基因克隆技术，抗体表达技术和单细胞分离培养技术高通量的从浆细胞中制备抗原特异性的高亲和力抗体。

本发明具体技术方案

一种分泌抗原特异性抗体浆细胞的分离方法，包括如下步骤：

（1）使用特定抗原免疫接种人或动物后，获得淋巴细胞后，分离得到浆细胞；

（2）向浆细胞中加入浆细胞特异性标志物的单抗与抗IgG抗体交联的双功能抗体，从而在浆细胞表面形成抗IgG抗体亲和层，在体外培养时，浆细胞分泌的IgG抗体一经分泌就被捕捉在细胞表面；

（3）加入交联有特定抗原的磁珠，形成浆细胞-双功能抗体复合物-IgG抗体-特定抗原-磁珠复合物；

（4）对浆细胞-双功能抗体复合物-IgG抗体-特定抗原-磁珠复合物进行磁性分离，得到分泌抗原特异性抗体的浆细胞。

上述特定抗原是指为了获得目的抗体所用的抗原。

所述淋巴细胞是指动物或人免疫后，采集自淋巴液、淋巴组织、血细胞样品或骨髓。

浆细胞的分离方法为本领域常规方法，可利用浆细胞分离试剂盒来完成（CD138+Plasma Cell Isolation Kit, mouse，Plasma Cell Isolation Kit II, human MiltenylBiotec）。

上述浆细胞特异性标志物为CD38或CD138。优选接种对象为人时，浆细胞特异性标志物选择CD38，优选接种对象为鼠时，浆细胞特异性标志物选择CD138。

CD38和CD138是浆细胞表面的特异性标志物，CD38抗体能够与浆细胞细胞膜表面的CD38特异性结合；CD138抗体能够与浆细胞细胞膜表面的CD138特异性结合，抗IgG抗体能够与动物体内的抗体特异性结合。

所述浆细胞特异性标志物的单抗与抗IgG抗体交联的抗体，如CD38单抗－抗IgG双功能抗体或者CD138单抗－抗IgG双功能抗体可以通过化学交联法通过交联剂制得。

可采用本领域常规技术制备交联有特定抗原的磁珠。

本发明另一目的在于提供一种高通量制备抗原特异性单克隆抗体的方法，采用上所述方法制备得到分泌抗原特异性抗体的浆细胞，利用单细胞PCR基因克隆技术克隆每个浆细胞的抗体重链和轻链可变区基因，通过基因序列和氨基酸序列的分析，以甑辩不同的抗体。将具有不同氨基酸序列的抗体基因克隆到表达载体中。然后重组到特定的原核表达载体中，再转化大肠杆菌进行表达，对表达产物利用目标抗原进行筛选，可得到特异结合目标抗原的抗体库。

本发明另一目的在于提供一种用于分离分泌抗原特异性抗体浆细胞的试剂盒，其特征在于包括CD38或CD138单抗与抗IgG抗体交联的双功能抗体和交联有特定抗原的磁珠。

本发明另一目的在于提供一种高通量制备抗原特异性单克隆抗体的试剂盒，其特征在于包括CD38或CD138单抗与抗IgG抗体交联的双功能抗体、交联有特定抗原的磁珠、DNA抽提体系、PCR扩增体系和表达体系。

本发明利用浆细胞分离技术和基因工程抗体技术进行结合建立的一种产生高亲和力抗体的方法。首先将浆细胞从血液中或骨髓中分离出来，再从浆细胞分离分泌抗原特异性抗体的浆细胞。将分泌抗原特异性抗体的浆细胞分离到小孔中，形成一个细胞每个小孔，利用单细胞PCR基因克隆技术，克隆抗体的V_H、V_L基因。将这些抗体基因在大肠杆菌中进行表达。本方法特异性高，可高效制备大量的结合抗原不同位点的特异性抗体。本方法与现有技术相比，能够先将分泌抗原特异性的抗体浆细胞分离出来，再进行基因克隆，而现有技术下是将所有的浆细胞分离出来，因此本发明目标明确，能够准确获得将分泌抗原特异性的抗体浆细胞，极大地减少了工作量，成功率较高。

具体实施方式

以人白蛋白作为抗原为例，说明本发明技术方案。

实施例1 浆细胞的制备

将弗氏完全佐剂与人白蛋白溶液按1：1的比例混合制成乳剂。腹腔注射免疫6-8周龄雌性Balb/c小鼠（每只小鼠100微升，含10微克人白蛋白）。两周后以不完全弗氏佐剂腹腔注射10微克人白蛋白加强免疫小鼠。两周后取血测定抗体的效价。经尾静脉注射10微克人白蛋白加强免疫小鼠，四天后，将小鼠处死，分离脾脏细胞。利用浆细胞分离试剂盒（CD138+Plasma Cell Isolation Kit, mouse，Miltenyl Biotec）从脾脏细胞中分离浆细胞。

实施例2 双功能抗体的制备

使用化学交联的方法将CD138单克隆抗体和鼠抗IgG单克隆抗体共价交联制备双功能抗体。以BS3(Thermo Scientific, Cat. #21580)作为交联剂，相关实验参照该试剂的操作说明进行。交联后的抗体用亲和柱分离。

实施例3 抗原与磁珠的交联

将人白蛋白通过化学交联的方法和磁珠进行交联。制备抗原磁珠交联物，用于分离分泌人白蛋白特异性抗体的浆细胞。将人白蛋白溶解于反应缓冲液（0.05 M MES, 0.5 MNaCl, pH 6.0）中，使得终浓度为1mg/ml。用终浓度为2mM EDC和5mM磺基-NHS激活磁珠表面的羧基。将活化后的的磁珠与抗原混合，室温下震荡孵育2小时。在磁场下将磁珠沉淀下来，弃上清，用缓冲液洗磁珠2次。

实施例4 分泌抗原特异性抗体浆细胞分离

向实施例1方法制得浆细胞中加入实施例2制得的CD138－鼠抗IgG双功能抗体，用于标记浆细胞，浆细胞细胞膜上CD138和CD138－鼠抗IgG双功能抗体结合，在浆细胞表面形成一个鼠抗IgG抗体的亲和层，在体外细胞培养一定时间，浆细胞分泌的抗体一旦分泌就被捕捉在浆细胞表面，最后加入实施例3制得的人白蛋白磁珠交联产物，摇床上颠倒混合反应15min，人白蛋白与捕捉在浆细胞表面的抗体结合，随后进行磁性分离，弃上清，分泌抗原特异性抗体的浆细胞存在于沉淀中。将细胞悬浮制成单细胞悬液。

实施例5 利用单细胞PCR技术克隆抗体V_H、V_L基因

将分离获得的分泌人白蛋白特异性抗体的浆细胞将细胞转置384孔板的小孔中，每个细胞每孔，利用单细胞PCR技术克隆抗体V_H、V_L基因。所用的引物如下。

VH 5’端引物：

(1)GGGAATTCATGRASTTSKGGYTMARCTKGRTTT （SEQ ID No：1）；

(2)GGGAATTCATGRAATGSASCTGGGTYWTYCTCTT （SEQ ID No：2）；

(3)ACTAGTCGACATGGACTCCAGGCTCAATTTAGTTTTCCT （SEQ ID No：3）；

(4)ACTAGTCGACATGAAATGCAGCTGGRTYATSTTCTT （SEQ ID No：4）；

(5)ACTAGTCGACATGGGATGGAGCTRTATCATSYTCTT （SEQ ID No：5）；

(6)ACTAGTCGACATGAACTTYGGGYTSAGMTTGRTTT （SEQ ID No：6）；

VH 3’端引物：CCCAAGCTTCCAGGGRCCARKGGATARACIGRTGG （SEQ ID No：7）。

VL5’端引物：

(1)GGGAATTCATGRAGWCACAKWCYCAGGTCTTT （SEQ ID No：8）；

(2)GGGAATTCATGGAGACAGACACACTCCTGCTAT （SEQ ID No：9）；

(3)ACTAGTCGACATGGAGWCAGACACACTSCTGYTATGGGT （SEQ ID No：10）；

(4)ACTAGTCGACATGAGGRCCCCTGCTCAGWTTYTTGGIWTCTT （SEQ ID No：11）；

(5)ACTAGTCGACATGAGTGTGCYCACTCAGGTCCTGGSGTT （SEQ ID No：12）；

(6)ACTAGTCGACATGAGIMMKTCIMTTCAITTCYTGGG （SEQ ID No：13）；

(7)ACTAGTCGACATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGGTGCT （SEQ ID No：14）。

VL3’端引物

(1)CCCAAGCTTACTGGATGGTGGGAAGATGGA （SEQ ID No：15）；

(2)CCCAAGCTTAGCTCYTCWGWGGAIGGYGGRAA （SEQ ID No：16）。

PCR条件如下：

36.25 μl 去离子水

5 μl 10X NovaTaq™ PCR 缓冲液

1 μl dNTPs (终浓度 0.2 mM)

2.5 μl 5' lea引物(10 pmol/μl)

2.5 μl 3' lea引物(10 pmol/μl)

1 μl (1.25 U) NovaTaqDNA Polymerase

5 μl cDNA

Denature 1 min at 94°C

Anneal 1 min at 50°C

Extend 2 min at 72°C

Final Extension 6 min at 72°C

实施例6 抗体的表达

将基因克隆获得的IgG抗体VH, VL可变区的基因进行测序，通过对VH，VL可变区的氨基酸序列分析判断抗体的异同。一般来说不同的抗体具有不同VH，VL可变区的氨基酸序列。将具有不同氨基酸序列的可变区VH，VL基因克隆到表达载体中，将所得的表达载体转化到大肠杆菌进行抗体分泌表达，分离纯化抗体后，用于下一步抗体特性的检测。

实施例7 阳性克隆的筛选

阳性克隆筛选利用ELISA法。简要的说，将抗人白蛋白包被ELISA板， 1微克每毫升，4度过夜。用洗液洗板3次，将封闭液加入小孔中，室温封闭2小时。倒掉封闭液，加入待测抗体，室温孵育2小时。用洗液洗板5次，加入碱性磷酸酶标记的抗IgG二抗，室温孵育1小时。用洗液洗板5次，加入底物进行显色，酶标仪读OD410。

实施例8 现有技术下抗人白蛋白单克隆抗体的制备

参考中国专利申请CN201280016777.6公开的方法分离实施例1方法制备的小鼠脾脏细胞中分泌特异性抗体的浆细胞。采用实施例5-7的方法，利用单细胞PCR基因克隆技术，从浆细胞中克隆抗体VH,VL基因。经过基因序列和氨基酸序列分析，将不同序列的基因克隆到表达载体中进行抗体的表达，利用ELISA筛选阳性克隆。

与本发明实施例2-7方法分离浆细胞和抗原特异性的高亲和力抗体的结果进行对比，结果如表1所示。

结果表明利用本发明的方法制备单克隆抗体的效率比较高，成功率较大。更容易获得结合不同位点的单克隆抗体。

SEQUENCE LISTING

<110> 宁波艾科生物科技有限公司

<120> 一种分泌抗原特异性抗体浆细胞的分离方法

<130>

<160> 16

<210> 1

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

GGGAATTCATGRASTTSKGGYTMARCTKGRTTT

<210> 2

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

GGGAATTCATGRAATGSASCTGGGTYWTYCTCTT

<210> 3

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ACTAGTCGACATGGACTCCAGGCTCAATTTAGTTTTCCT

<210> 4

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ACTAGTCGACATGAAATGCAGCTGGRTYATSTTCTT

<210> 5

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ACTAGTCGACATGGGATGGAGCTRTATCATSYTCTT

<210> 6

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ACTAGTCGACATGAACTTYGGGYTSAGMTTGRTTT

<210> 7

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

CCCAAGCTTCCAGGGRCCARKGGATARACIGRTGG

<210> 8

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

GGGAATTCATGRAGWCACAKWCYCAGGTCTTT

<210> 9

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

GGGAATTCATGGAGACAGACACACTCCTGCTAT

<210> 10

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

ACTAGTCGACATGGAGWCAGACACACTSCTGYTATGGGT

<210> 11

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

ACTAGTCGACATGAGGRCCCCTGCTCAGWTTYTTGGIWTCTT

<210> 12

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

ACTAGTCGACATGAGTGTGCYCACTCAGGTCCTGGSGTT

<210> 13

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

ACTAGTCGACATGAGIMMKTCIMTTCAITTCYTGGG

<210> 14

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

ACTAGTCGACATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGGTGCT

<210> 15

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

CCCAAGCTTACTGGATGGTGGGAAGATGGA

<210> 16

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

CCCAAGCTTAGCTCYTCWGWGGAIGGYGGRAA

Claims

1.一种分泌抗原特异性抗体浆细胞的分离方法，其特征在于包括如下步骤：

（1）使用特定抗原免疫接种人或动物后，获得淋巴细胞后，从淋巴细胞中分离得到浆细胞；

（2）向浆细胞中加入浆细胞特异性标志物的单抗与抗IgG抗体交联的双功能抗体，在浆细胞表面形成抗IgG抗体亲和层，在体外培养时，浆细胞分泌的IgG抗体一经分泌就被捕捉在细胞表面；

2.如权利要求1所述的分离方法，其特征在于所述浆细胞特异性标志物为CD38或CD138。

3.一种高通量制备抗原特异性单克隆抗体的方法，其特征在于采用权利要求1所述的方法制备得到分泌抗原特异性抗体的浆细胞，利用抗体库技术，克隆每个浆细胞全套抗体重链和轻链可变区基因，然后重组到特定的原核表达载体中，再转化大肠杆菌进行表达，对表达产物利用特定抗原进行筛选，可得到特异结合特定抗原的抗体库。

4.一种用于分离分泌抗原特异性抗体浆细胞的试剂盒，其特征在于包括CD38或CD138单抗与抗IgG抗体交联的双功能抗体和交联有特定抗原的磁珠。

5.一种高通量制备抗原特异性单克隆抗体的试剂盒，其特征在于包括CD38或CD138单抗与抗IgG抗体交联的双功能抗体、交联有特定抗原的磁珠、DNA抽提体系、PCR扩增体系和表达体系。