CN105925728B - 一种塞内加谷病毒实时荧光定量pcr检测引物及试剂盒 - Google Patents
一种塞内加谷病毒实时荧光定量pcr检测引物及试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于生物检测技术领域，公开了一种塞内加谷病毒实时荧光定量PCR检测引物及试剂盒；首先通过设计并筛选得到一种塞内加谷病毒实时荧光定量PCR检测引物和探针，所述上游引物、下游引物和探针的序列如SEQ ID NO：1～3所示；利用该引物和探针可特异性扩增出来塞内加谷病毒，实时荧光定量可通过实时监测PCR过程中双链DNA荧光染料与PCR扩增产物的结合情况，采集荧光数据，根据CT值来鉴别SVV；利用所述方法进行PCR扩增后即可鉴别SVV，准确性高、特异性好，重复性好，可以准确、快速、高效地进行鉴定SVV，有利于在临床实践中推广应用。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，更具体地，涉及一种塞内加谷病毒实时荧光定量PCR检测引物及试剂盒。
背景技术
塞内加谷病毒（Seneca Valley virus SVV）是单股正链RNA病毒，是小核糖核酸病毒科Senecavirus病毒属的典型代表。其最初被认为是PER.C6细胞培养物中的污染物，随后在美国和加拿大的猪群中被分离，2007年在美国一屠宰场的猪群中出现水疱性疾病临床症状，约80%的猪出现跛足，PCR检测猪口蹄疫、猪水疱病、水疱性口炎和水疱性疹均为阴性，而SVV却为阳性，从而被认为是原发性水疱性疾病。近期猪塞内加谷病毒（SVV）在巴西猪群中的感染与爆发，证明了猪塞内加谷病毒很有可能是猪的原发性水疱性疾病病原之一。2015年我国及巴西出现了几次SVV感染猪群并出现严重的临床发病及死亡症状，造成严重的经济损失。SVV在临床上所引起的临床症状与其他一些猪的水泡病极为相似，在临床和组织病理学上很难区分，这就给该病的确诊带来一定难度，其鉴别诊断通常需借助实验室诊断技术，传统的检测方法费时费力，操作方法繁琐，不利于疾病的及时诊断治疗。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术中塞内加谷病毒检测所存在的上述缺陷，提供一种特异性检测塞内加谷病毒实时荧光定量PCR的引物。
本发明的第二个目的是提供含上述检测引物的试剂盒。
本发明的目的是通过以下技术方案予以实现的：
一种塞内加谷病毒实时荧光定量PCR检测引物和探针，所述上游引物、下游引物和探针的序列如SEQ ID NO：1～3所示。
优选地，所述探针的5’端标记的是荧光报告基团；3’端标记的是淬灭基团。
更优选地，所述荧光报告基团为FAM，所述淬灭基团为TAMAR。
本发明还提供含有所述塞内加谷病毒实时荧光定量PCR检测引物和探针的试剂盒。
优选地，所述上游引物、下游引物和探针的浓度为10 μM。
优选地，所述试剂盒还包括PCR反应缓冲液、荧光染料、阳性标准品。
更优选地，所述阳性标准品的制备方法是从SVV细胞病毒抽提RNA并反转录成cDNA，再经PCR将SVV-3C基因扩增出来，得到与目的片段大小一致的扩增产物。PCR产物回收后，经与PMD19-T载体连接、转化、扩增含有目的片段的重组质粒，经菌液PCR以及测序鉴定，证实已成功地构建了SVV重组质粒标准品，命名为PMD19-T-3C，作为阳性标准品待用。
优选地，所述试剂盒进行荧光定量PCR的反应体系为：Premix Ex Taq（ProbeqPCR）（2×）10μL、10 μM，0.4μL上游引物、10 μM，0.4μL下游引物、ROX Reference Dye II（50×）0.2μL、10 μM，0.8μL探针、DNA模板2.0μL、ddH2O 6.2μL。
优选地，所述试剂盒进行进行荧光定量PCR的反应条件为：95℃ 30 秒，95℃ 5秒，60℃ 34 秒，40个循环。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明通过设计并筛选得到一种塞内加谷病毒实时荧光定量PCR检测引物和探针，所述上游引物、下游引物和探针的序列如SEQ ID NO：1～3所示；利用该引物和探针可特异性扩增出来塞内加谷病毒，实时荧光定量可通过实时监测PCR过程中双链DNA荧光染料与PCR扩增产物的结合情况，采集荧光数据，根据CT值来鉴别SVV；利用所述方法进行PCR扩增后即可鉴别SVV，准确性高、特异性好，重复性好，可以准确、快速、高效地进行鉴定SVV，有利于在临床实践中推广应用。
附图说明
图1为重组质粒标准品PMD19-T-3C的PCR扩增结果。
图2为实时荧光定量PCR的标准曲线。
图3为实时荧光定量PCR的灵敏性试验；其中1为1×109copies/μL；2为1×108copies/μL；3为1×107copies/μL；4为1×106copies/μL；5为1×105copies/μL；6为1×104copies/μL；7为1×103copies/μL；8为1×102copies/μL；9为1×101copies/μL；10为1×100copies/μL；11为阴性对照。
图4为实时荧光定量PCR的特异性试验，其中1为SVV；2为FMDV；3为SVDV；4为VSV；5为PRRSV；6为PCV；7为PRV；8为PK-15细胞。
具体实施方式
下面将结合说明书附图和具体实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤、条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。若无特别说明，实施例中所用的实验方法均为本领域技术人员所熟知的常规方法和技术，试剂或材料均为通过商业途径得到。
实施例1 标准阳性模板的制备
一、病毒总RNA的抽提
按Invitrogen公司TRIZOL LS Reagent RNA提取试剂盒使用说明书进行。在1.5mL eppendorf管中加入250 µL已分装好的细胞繁殖所得的病毒液上清和750 µL TRIZOL，充分混匀，室温放置10 min；加入200 µL的氯仿，剧烈摇动15sec，室温静置5min，4℃，12000rpm离心15 min；将上清转移到新的1.5 mL eppendorf管中，加入500 µL异戊醇，充分混匀，室温放置10min，4℃，12000 rpm离心10 min；弃去上清液，沉淀用冰预冷的70%乙醇1000 µL，轻轻混匀，洗涤一次，4℃，12000 rpm离心10 min；弃去上清液，风干；用20 µL DEPC处理的三蒸水溶解RNA，-80℃保存或直接用于反转录。
二、引物设计
根据GenBank中SVV-001（DQ641257）的3C区域基因序列，设计PCR引物：上游引物P1: 5’-ATCCTTTTGCTGCCCATGTG-3’，下游引物P2: 5’-AGAACTCTACCCAACGCCTC-3’，利用该引物扩增3C基因，反应体系如下：PremixTaq 25μL、上游引物P1 1μL、下游引物P2 1μL、模板DNA 1μL，最后用ddH2O补足反应体系总体积为50μL。
扩增程序为：（1）94℃预变性5min，（2）94℃变性1min，57℃退火30 s，72℃延伸30s，共32个循环；（3）72℃延伸10min。
回收PCR产物（参照Omega公司E.Z.N.A.® Gel Extraction Kit的使用说明书），进行琼脂糖凝胶电泳，鉴定为正确的目标片段，用于后续的克隆。
三、目的基因的克隆
（1）回收产物连接pMD19-T载体
参照pMD®19-T Vector试剂盒说明书，连接反应体系为：纯化的PCR产物2μL、pMD19-T vector 0.5μL、Solution I 2.5μL；最终连接反应体系的总体积为5μL。将上述反应体系混匀并稍作离心后，4℃连接过夜。
（2）连接产物转化
将（1）的连接产物5μL轻轻地加到50μL的大肠杆菌感受态细胞中，冰浴30min；42℃热休克90s然后迅速转移到冰浴中冷却2min；加到200μL LB液体培养基中，37℃，160rpm振摇培养45min，使大肠杆菌复苏，抗性基因表达；将以上复苏的感受态细胞均匀涂布Amp+/LB固体培养基平皿，37℃培养过夜。
（3）重组子的PCR鉴定与筛选
从（2）过夜培养的平板中挑取三个单菌落，分别接种于1mL含有100μg/mL Amp+的LB液体培养基中，37℃，220rpm振摇培养6h以上（OD600值0.3～0.4）；取菌液进行PCR鉴定，产物用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测；取20μL鉴定阳性的菌液以1：100的比例接种到2mL Amp+的LB液体培养基中，37℃，220rpm振摇培养过夜。
（4）重组质粒的提取与鉴定
参照Omega公司E.Z.N.A.® Plasmid Mini Kit I的说明书，对过夜培养菌液进行质粒抽提，用1%琼脂糖凝胶电泳检测质粒抽提效果。
将重组质粒抽提产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，鉴定结果见图1，经鉴定阳性的重组pMD19-T质粒送北京奥科生物科技有限责任公司进行核苷酸序列测定。
实施例2 引物与TaqMan探针的设计与筛选
根据SVV基因序列中的3C保守片段设计特异引物和TaqMan探针，由华大公司合成，引物和探针序列见表1，探针的5’端标记的荧光报告基团为FAM，3’端标记的淬灭基团为TAMRA。
由表1中的引物和探针，对SVV进行PCR，结果发现：其他3对引物有出现非特异性扩增或引物二聚体，不符合实验要求，因此只有引物1和引物2可以作为特异性扩增检测SVV的引物。
实施例3 荧光定量PCR反应条件优化和标准曲线制作
对引物浓度、探针浓度和退火温度条件最优化，Real-Time PCR 20 μL反应体系为Premix Ex Taq（Probe qPCR）（2×）10 μL，各特异性上、下游引物（10 μM）各0.4 μL，ROXReference Dye II（50×）0.2 μL，荧光探针(10 μM)0.8 μL，DNA模板2.0 μL，ddH2O 6.2 μL。最佳反应条件为：95℃ 30 s，95℃ 5 s，60℃ 34 s，40个循环。
测定标准重组阳性质粒的OD260nm和OD280nm值及其比值，计算质粒浓度，并换算成拷贝数，以双蒸水10倍系列稀释成7个梯度（108～103copies/μL）。以此为模板，建立20μL反应体系，根据优化后的PCR反应体系，在ABI 7500型荧光定量PCR仪上扩增，所得标准曲线见图2。结果，扩增曲线与Ct值之间的线性关系紧密，相关系数（R2）可达0.999。
实施例4 实时荧光定量PCR的灵敏性试验
SVV阳性标准品10倍系列稀释作为模板进行实时荧光定量PCR（l×100～l×109copies/μL，共10个梯度，以确定它们的检出下限。结果，以PMD19-T-3C标准品为模板，荧光定量PCR的检出下限为1×102 copies/μL（图3）。
实施例5实时荧光定量PCR的特异性试验
以SVV、FMDV、SVDV、VSV、PRRSV、PCV、PRV、PEDV和正常PK-15细胞的cDNA或DNA为模板，应用所建立的实施例3优化的反应体系和反应条件进行实时荧光定量PCR扩增，结果发现该PCR扩增只有SVV呈阳性（图4）。
实施例6 实时荧光定量PCR的重复性试验
将SVV的阳性标准品质粒进行109、107、105 copies/μL共3个梯度为模板，进行组内和组间重复性检验，每个梯度都要重复5次，共做3次反应。对SVV所建立起来的方法进行PMD19-T-3C标准品质粒重复性检验。结果表2所示：组内和组间的变异系数（CV）均小于0.96%。
实施例7 试剂盒的组成
按照下列组成配制用于检测猪塞内加谷病毒的试剂盒：10 μM引物1、10 μM引物2、10 μM探针、ROX Reference Dye II（50×）、Premix Ex Taq（Probe qPCR）（2×）。
该试剂盒的一种反应体系可以为：Premix Ex Taq（Probe qPCR）（2×）10μL、10 μM，0.4μL引物1、10 μM，0.4μL引物2、ROX Reference Dye II（50×）0.2μL、10 μM，0.8μL探针、DNA模板2.0μL、ddH2O 6.2μL，反应总体积为20μL。
利用该试剂盒进行实时荧光定量PCR的反应条件为：95℃ 30 秒，95℃ 5 秒，60℃34 秒，40个循环。
SEQUENCE LISTING
<110> 华南农业大学
<120> 一种塞内加谷病毒实时荧光定量PCR检测引物及试剂盒
<130>
<160> 8
<170> PatentIn version 3.3
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<211> 18
<212> DNA
<213> 引物1
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<213> 引物4
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<212> DNA
<213> 引物6
<400> 8
tagggctctg tagaacta 18
Claims (6)
1.一种塞内加谷病毒实时荧光定量PCR检测引物和探针，其特征在于，上游引物、下游引物和探针的序列如SEQ ID NO：1～3所示；所述探针的5’端标记的是荧光报告基团FAM；3’端标记的是淬灭基团TAMAR。
2.含有权利要求1所述塞内加谷病毒实时荧光定量PCR检测引物和探针的试剂盒。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述上游引物、下游引物和探针的浓度为10μM。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括PCR反应缓冲液、荧光染料、阳性标准品。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒进行荧光定量PCR的反应体系为：2×Premix Ex Taq10μL，10μM上游引物0.4μL，10μM下游引物0.4μL，50×ROXReference Dye II0.2μL，10μM探针0.8μL，DNA模板2.0μL，ddH2O 6.2μL。
6.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒进行荧光定量PCR的反应条件为：95℃30秒，95℃5秒，60℃34秒，40个循环。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |