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CN105879058B - 一种结核病基因药物及其制备方法 - Google Patents

一种结核病基因药物及其制备方法 Download PDF

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CN105879058B CN201610303281.7A CN201610303281A CN105879058B CN 105879058 B CN105879058 B CN 105879058B CN 201610303281 A CN201610303281 A CN 201610303281A CN 105879058 B CN105879058 B CN 105879058B
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Abstract

本发明公开了一种结核病基因药物及其制备方法，所述结核病基因药物以腺病毒为基因表达载体，表达细胞内颗粒溶素蛋白以及细胞外颗粒溶素蛋白，所述细胞内颗粒溶素蛋白以及细胞外颗粒溶素蛋白的表达量在2:8至8:2之间。所述方法包括：制备细胞内颗粒溶素蛋白基因穿梭质粒以及细胞外颗粒溶素蛋白基因穿梭质粒；制备表达细胞内颗粒溶素蛋白的第一腺病毒和表达细胞外颗粒溶素蛋白的第二腺病毒；并按照数量比例2:8至8:2混合，即制得本发明提供的基因药物。本发明提供的基因药物通过联合细胞内和细胞外颗粒溶素重组腺病毒，一次性给药，相对于单独使用细胞内和细胞外颗粒溶素重组腺病毒，能更好地治疗原发性结核病，甚至耐多药结核病。

Description

一种结核病基因药物及其制备方法
技术领域
本发明属于生物医药领域，更具体地，涉及一种结核病基因药物及其制备方法。
背景技术
腺病毒(Ad)作为一种常见的基因表达载体，可用于介导外源基因在机体的表达。目前，近25％基因药物的临床试验方案，均是基于重组腺病毒(rAd)构建，显示其在医学上的重要地位和安全性；而且，国内、外已经批准用于临床的四种基因药物和疫苗中，中国批准的两种都是以rAd为基础，并证实其安全性。rAd制备简单、产生的病毒滴度高，并可以经呼吸道吸入、肌注和局部注射等多种途径应用。
结核病(Tuberculosis,TB)不仅是目前传染病中威胁全球人类健康的头号杀手，而且是严重影响全球和中国人民健康的重大公共卫生问题之一。每年全世界TB新发病例960万，150万人因TB而死亡。尽管异烟肼、利福平等一线和卡那霉素等二线抗TB药物在临床上应用广泛，但治疗周期长达6个月以上，患者的依从性差，导致临床上结核分枝杆菌(M.tb)对这些药物的耐药性较为常见。尤其是耐多药结核病(MDR-TB)的流行，对TB的有效治疗提出显著挑战。然而，新型抗TB化学药物的研制尚不能满足TB治疗的需求。因此，开发基因药物用于治疗TB，具有重要意义和实践价值。
前期，我们构建了一种表达细胞内颗粒溶素的重组腺病毒，用于TB动物模型的治疗，证实其可以直接杀伤寄居在小鼠肺脏巨噬细胞内的M.tb，从而对小鼠TB模型具有治疗作用。机体感染M.tb后，主要导致肺 脏感染，但仍不清楚M.tb在肺脏的具体寄居部位。尽管M.tb被公认是兼性胞内寄生菌，在体内不仅寄居在细胞内，也可寄居在细胞外，但在不同疾病类型如：原发性TB、MDR-TB或潜伏感染状况下，尚不清楚M.tb在机体的细胞内、外的寄生情况和数量。前述的重组腺病毒的优势在于仅对细胞内寄生的M.tb治疗有效，但游离在细胞外的M.tb仍可导致疾病。因此，应用前述的重组腺病毒为基础的TB基因治疗药物的疗效仍有待提高。
发明内容
针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明提供了一种TB基因药物及其制备方法，其目的在于通过在腺病毒基因组中整合细胞内及细胞外颗粒溶素蛋白表达系统，通过优化剂量比例，同时杀伤细胞内、外的M.tb，从而提供一种高效治疗TB的基因药物，尤其适用于MDR-TB的治疗和潜伏感染的防治，由此解决现有技术没有基于重组腺病毒的TB基因治疗药物的技术问题。
为实现上述目的，按照本发明的一个方面，提供了一种TB基因药物，所述TB基因药物以腺病毒为基因表达载体，表达细胞内颗粒溶素蛋白以及细胞外颗粒溶素蛋白，所述细胞内颗粒溶素蛋白以及细胞外颗粒溶素蛋白的表达量在2:8至8:2之间。
优选地，所述TB基因药物，其腺病毒滴度在1010PFU/ml至1012PFU/ml之间。
优选地，所述TB基因药物，其包括用于表达细胞内颗粒溶素蛋白的第一重组腺病毒以及用于表达细胞外颗粒溶素蛋白的第二重组腺病毒。
优选地，所述TB基因药物，其第一腺病毒，其重组腺病毒基因组的E1缺失区整合有用于表达细胞内颗粒溶素蛋白的第一序列，所述第一序列为：
(1)由SEQ ID No.1所示的基因序列；或
(2)与序列SEQ ID No.1限定的氨基酸序列同源性在80％值100％编码相同功能蛋白质的氨基酸序列；或
(3)SEQ ID No.1限定的氨基酸序列经增加、缺失或替换一个或多个氨基酸，表达产物具有与序列SEQ ID No.1表达蛋白具有同等活性的基因序列。
优选地，所述TB基因药物，其第二腺病毒，其重组腺病毒基因组的E1缺失区整合有用于表达细胞外颗粒溶素的第二序列。
所述第二序列为：
A、由SEQ ID No.2所示的基因序列；或
B、与序列SEQ ID No.2限定的氨基酸序列同源性在80％值100％编码相同功能蛋白质的氨基酸序列；或
C、SEQ ID No.2限定的氨基酸序列经增加、缺失或替换一个或多个氨基酸，表达产物具有与序列SEQ ID No.2表达蛋白具有同等活性的基因序列。
按照本发明的另一个方面，提供了一种所述TB基因药物的制备方法，其包括以下步骤：
步骤1、将表达细胞内颗粒溶素蛋白的第一序列以及表达细胞外颗粒溶素蛋白的第二序列分别整合到穿梭质粒上，形成细胞内颗粒溶素蛋白基因穿梭质粒以及细胞外颗粒溶素蛋白基因穿梭质粒；
步骤2、将步骤1获得的细胞内颗粒溶素蛋白基因穿梭质粒以及细胞外颗粒溶素蛋白基因穿梭质粒分别与骨架质粒共转染宿主细胞，获得表达细胞内颗粒溶素蛋白的第一腺病毒和表达细胞外颗粒溶素蛋白的第二腺病毒；
步骤3、将第一腺病毒与第二腺病毒分别纯化，并按照数量比例2:8至8:2混合，即制得本发明提供的基因药物。
优选地，所述的制备方法，其将腺病毒滴度稀释到1010PFU/ml至 1012PFU/ml之间。
优选地，所述的制备方法，其第一序列为：
(1)由SEQ ID No.1所示的基因序列；或
(2)与序列SEQ ID No.1限定的氨基酸序列同源性在80％值100％编码相同功能蛋白质的氨基酸序列；或
(3)SEQ ID No.1限定的氨基酸序列经增加、缺失或替换一个或多个氨基酸，表达产物具有与序列SEQ ID No.1表达蛋白具有同等活性的基因序列。
优选地，所述的制备方法，其第二序列为：
A、由SEQ ID No.2所示的基因序列；或
B、与序列SEQ ID No.2限定的氨基酸序列同源性在80％值100％编码相同功能蛋白质的氨基酸序列；或
C、SEQ ID No.2限定的氨基酸序列经增加、缺失或替换一个或多个氨基酸，表达产物具有与序列SEQ ID No.2表达蛋白具有同等活性的基因序列。
按照本发明的另一方面，提供了一种TB治疗型疫苗，其包括本发明提供的TB基因药物。
总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，能够取得下列有益效果：
本发明提供的一种TB基因药物，通过联合细胞内和细胞外颗粒溶素重组腺病毒，一次性给药，相对于单独使用细胞内和细胞外颗粒溶素重组腺病毒，能更好地治疗原发性TB，甚至MDR-TB。而且，能清除潜伏感染者体内的M.tb，具有良好效果，可作为成人TB的治疗型疫苗。优选地，采用对正常细胞无毒性的颗粒溶素表达基因，大大提高了TB基因药物的安全性能。
附图说明
图1是颗粒溶素重组腺病毒的结构示意图及表达证实。细胞内颗粒溶素重组腺病毒(rAdhGLi)的结构示意图(图1A)及在感染的HEK293细胞中颗粒溶素mRNA水平的证实表达图(图1B)；细胞外颗粒溶素重组腺病毒(rAdhGLs)的结构示意图(图1C)及在感染的HEK293细胞中颗粒溶素mRNA水平的证实表达图(图1D)。
图2是不同比例rAdhGLi和rAdhGLs联合治疗原发性TB小鼠模型两个月后的治疗效果(n＝6)。其中图2A是10rAdhGLi+0rAdhGLs(rAdhGLi:rAdhGLs＝10:0)、8rAdhGLi+2rAdhGLs(rAdhGLi:rAdhGLs＝8:2)、5rAdhGLi+5rAdhGLs(rAdhGLi:rAdhGLs＝5:5)、2rAdhGLi+8rAdhGLs(rAdhGLi:rAdhGLs＝2:8)及0rAdhGLi+10rAdhGLs(rAdhGLi:rAdhGLs＝0:10)分别治疗原发性TB小鼠模型的肺脏菌落计数结果；图2B是10rAdhGLi+0rAdhGLs(rAdhGLi:rAdhGLs＝10:0)、8rAdhGLi+2rAdhGLs(rAdhGLi:rAdhGLs＝8:2)、5rAdhGLi+5rAdhGLs(rAdhGLi:rAdhGLs＝5:5)、2rAdhGLi+8rAdhGLs(rAdhGLi:rAdhGLs＝2:8)及0rAdhGLi+10rAdhGLs(rAdhGLi:rAdhGLs＝0:10)分别治疗原发性TB小鼠模型的脾脏菌落计数结果。PBS组和野生型腺病毒AdNull分别为阴性对照。Bar表示P<0.05。
图3rAdhGLi和rAdhGLs联合治疗小鼠MDR-TB模型两周后的治疗效果(n＝6)。其中图3a是rAdhGLi和rAdhGLS单独治疗，以及rAdhGLi+rAdhGLS联合治疗治疗小鼠MDR-TB模型的肺脏菌落计数结果；图3b是治疗小鼠MDR-TB模型的脾脏菌落计数结果。PBS组和RHZ治疗组(异烟肼:H、利福平:R和毗嗪酰胺:Z)分别为阴性对照。Bar表示P<0.05。
图4rAdhGLi和rAdhGLs联合治疗小鼠MDR-TB的肺脏病理的HE染色(scale bar，400μm)和抗酸染色(AF,scale bar，50μm)。PBS组和RHZ治疗组分别为阴性对照。
图5rAdhGLi和rAdhGLs联合治疗TB潜伏感染小鼠的治疗效果(n＝6)。其中图5a是rAdhGLi和rAdhGLs单独治疗，以及rAdhGLi+rAdhGLs联合治疗组治疗TB潜伏感染小鼠的肺脏菌落计数结果；图5b是治疗TB潜伏感染小鼠的脾脏菌落计数结果。PBS组和野生型腺病毒AdNull分别为阴性对照。Bar表示P<0.05。
图6rAdhGLi和rAdhGLs联合治疗治疗TB潜伏感染小鼠的肺脏病理HE染色(scalebar，400μm)和抗酸染色(AF,scale bar，50μm)。PBS组和野生型腺病毒AdNull分别为阴性对照。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
本发明提供的TB基因药物，其以腺病毒为基因表达载体，表达细胞内颗粒溶素蛋白以及细胞外颗粒溶素蛋白，所述细胞内颗粒溶素蛋白以及胞外颗粒溶素蛋白的表达量在2:8至8:2之间。
优选地，所述TB基因药物，其腺病毒的滴度在1010PFU/ml至1012PFU/ml之间。
所述TB基因药物，优选包括用于表达细胞内颗粒溶素蛋白的第一重组腺病毒以及用于表达细胞外颗粒溶素蛋白的第二重组腺病毒。
所述第一腺病毒，其重组腺病毒基因组的E1确失区整合有用于表达细胞内颗粒溶素蛋白的第一序列。
所述第一序列为：
(1)由SEQ ID No.1所示的基因序列；或
(2)与序列SEQ ID No.1限定的氨基酸序列同源性在80％值100％编 码相同功能蛋白质的氨基酸序列；或
(3)SEQ ID No.1限定的氨基酸序列经增加、缺失或替换一个或多个氨基酸，表达产物具有与序列SEQ ID No.1表达蛋白具有同等活性的基因序列。
所述第二腺病毒，其重组腺病毒基因组的E1确失区整合有用于表达细胞外颗粒溶素蛋白的第二序列。
所述第二序列为：
A、由SEQ ID No.2所示的基因序列；或
B、与序列SEQ ID No.2限定的氨基酸序列同源性在80％值100％编码相同功能蛋白质的氨基酸序列；或
C、SEQ ID No.2限定的氨基酸序列经增加、缺失或替换一个或多个氨基酸，表达产物具有与序列SEQ ID No.2表达蛋白具有同等活性的基因序列。
本发明提供的TB基因药物，其制备方法包括以下步骤：
步骤1、将表达细胞内颗粒溶素蛋白的第一序列以及表达细胞外颗粒溶素蛋白的第二序列分别整合到穿梭质粒上，形成细胞内颗粒溶素蛋白基因穿梭质粒(pDChGLi)以及细胞外颗粒溶素蛋白基因穿梭质粒(pDChGLs)；
所述第一序列，优选为：
(1)由SEQ ID No.1所示的基因序列；或
(2)与序列SEQ ID No.1限定的氨基酸序列同源性在80％值100％编码相同功能蛋白质的氨基酸序列；或
(3)SEQ ID No.1限定的氨基酸序列经增加、缺失或替换一个或多个氨基酸，表达产物具有与序列SEQ ID No.1表达蛋白具有同等活性的基因序列。
所述第二序列，优选为：
A、由SEQ ID No.2所示的基因序列；或
B、与序列SEQ ID No.2限定的氨基酸序列同源性在80％值100％编码相同功能蛋白质的氨基酸序列；或
C、SEQ ID No.2限定的氨基酸序列经增加、缺失或替换一个或多个氨基酸，表达产物具有与序列SEQ ID No.2表达蛋白具有同等活性的基因序列。
步骤2、将步骤1获得的细胞内颗粒溶素蛋白基因穿梭质粒(pDChGLi)以及细胞外颗粒溶素蛋白基因穿梭质粒(pDChGLs)分别与骨架质粒共转染宿主细胞，获得表达细胞内颗粒溶素蛋白的第一腺病毒(rAdhGLi)和表达细胞外颗粒溶素蛋白的第二腺病毒(rAdhGLs)；
步骤3、将第一腺病毒与第二腺病毒分别纯化，并按照数量比例2:8至8:2混合，即制得本发明提供的基因药物。
优选地，所述基因药物的制备方法，将腺病毒滴度稀释到1010PFU/ml至1012PFU/ml之间。
颗粒溶素属于皂角素样蛋白(saposin-like protein,SAPLIP)家族成员，是由人细胞毒性T细胞(CTLs)、γδT淋巴细胞及自然杀伤(NK)细胞表达的一种蛋白因子，与穿孔素及颗粒酶共同存在于这些细胞的溶细胞颗粒中，并随溶细胞颗粒分泌产生。通过溶细胞颗粒中的穿孔素在靶细胞表面打孔后，颗粒溶素进入靶细胞内，可与细胞内的病原微生物接触，是目前唯一的存在于溶细胞颗粒中的、可直接杀伤细胞内包括M.tb在内的病原微生物的蛋白质分子，在机体抗感染免疫中具有重要作用。但是，颗粒溶素的分子量较小，仅为9kDa，本身并不能穿透细胞膜，只有在穿孔素的帮助下，它才能进入细胞并杀伤细胞内吞噬的细菌，这无疑阻碍了临床应用颗粒溶素作为基因药物杀伤病原微生物、尤其是M.tb。尽管如此，目前仍不清楚在不同的疾病状态下，M.tb在感染机体内具体是寄居在细胞内、还是在细胞外，或同时寄居细胞内外及各自的比例。
腺病毒作为一种常见的基因表达载体，可用于介导外源基因在机体的表达。因此，本发明综合利用重组腺病毒表达载体和颗粒溶素各自的优势，建立表达颗粒溶素的重组腺病毒，作为TB治疗的基因药物，以满足TB治疗的临床需要。
然而，现有的整合有颗粒溶素的重组腺病毒，如果整合完整序列的颗粒溶素基因，则对正常细胞也有毒性作用，因此本发明通过分子克隆技术将颗粒溶素基因序列剪切修饰，得到如序列表SEQ ID No.1所示的基因序列，已通过实验证实其对动物整体水平或细胞水平均具有安全性。然而，单纯利用细胞内颗粒溶素的重组腺病毒，仅能杀伤寄居在细胞内的M.tb，而对细胞外寄居的M.tb无效。因此本发明增加了细胞外颗粒溶素蛋白表达基因，其连接颗粒溶素蛋白与TPA信号肽，得到能在细胞外表达的颗粒溶素蛋白基因序列，如序列表SEQ ID No.2所示的基因序列，其表达的颗粒溶素氨基酸见表SEQ ID No.3。结合细胞内、细胞外分泌的颗粒溶素，本发明提供的基因药物，治疗原发性TB和MDR-TB具有突破性的疗效；更为重要的是，能清除潜伏在感染者体内的M.tb，从而起到良好的控制潜伏感染的效果。
实验显示，本发明提供的重组颗粒溶素腺病毒应用于制备TB治疗型疫苗，在小鼠原发感染M.tb、MDR-TB和潜伏感染M.tb模型都获得显著的治疗效果，能有效防治TB。
以下为实施例：
实施例1细胞内颗粒溶素重组腺病毒(rAdhGLi)和细胞外颗粒溶素重组腺病毒(rAdhGLs)的包装和纯化
1)按照常规分子克隆技术，分别将SEQ ID No.1和SEQ ID No.2的基因序列克隆入腺病毒-大肠杆菌穿梭载体pDC316，获得重组质粒pDChGLi和pDChGLs，经酶切鉴定和测序证实。
2)将质粒pDChGLi(或pDChGLs)和骨架质粒pBHGloxΔE1,3Cre(1:1) 共转染HEK293细胞，包装重组病毒rAdhGLi(或rAdhGLs)。
(1)接种生长状态良好的HEK293细胞于六孔板，每孔5×105个细胞，37℃，5％CO2细胞培养箱中培养18-24小时，使细胞的汇合度达到90％左右。弃培养基，每孔加入1mL不含抗生素的DMEM完全培养基。
(2)DNA-LipofectamineTM 2000复合物的制备：用125μL不含血清的DMEM培养基，分别稀释2μg质粒pDChGLi(或pDChGLs)和2μg质粒pBHGloxΔE1,3Cre(1:1)，终体积250μL，吹打混匀；取10μL LipofectamineTM 2000加入到240μL不包含血清的DMEM培养基中，总体积250μL，吹打混匀，室温孵育5分钟；将混合稀释的质粒加入到等量稀释的LipofectamineTM2000中，吹打混匀，室温孵育20分钟，以便允许复合物的形成。
(3)将混匀后的质粒-LipofectamineTM 2000复合物共500μL逐滴加入到含细胞的培养基中，混和均匀。37℃，CO2培养箱孵育过夜。
(4)24小时后，弃培养基，更换2mL新鲜DMEM完全培养基。
(5)48小时后，胰酶消化细胞，转移入更大的培养皿扩大培养。这时起细胞将产生细胞病变效应，并产生病毒，以及感染更多的细胞。以后每2-3天更换新鲜DMEM完全培养基。
(6)转染后第十天，观察细胞单层是否有洞，如有细胞死亡，细胞病变效应(CPE)区域达80％，即可收集。如无明显CPE，可补充新鲜培养基，继续观察，直至CPE达80％。
(7)收集病毒，将部分已发生病变但尚且贴壁的细胞轻轻地吹打下来，收集细胞。-80℃放置30分钟后置于37℃水浴解融15分钟，重复冻融2次。3000rpm室温离心15分钟，将上清分装至1.5mL无菌EP管中-80℃冻存。
3)大量制备重组腺病毒rAdhGLi或rAdhGLs
(1)在75cm2培养瓶中扩大培养HEK293细胞，使其密度达到70％- 100％。
(2)弃培养基，缓慢加入初次包装rAdhGLi或rAdhGLs病毒悬液2mL/培养瓶。感染1小时后，加入DMEM完全培养基。
(3)当大部分细胞都出现病变现象后(约3-4天)，收集细胞及培养基。通过-80℃放置30分钟后置于37℃水浴解融15分钟，重复冻融3次充分裂解细胞释放病毒颗粒。3000rpm，4℃离心10分钟，收集含有病毒颗粒的上清液，-80℃保存备用。
4)CsCl密度梯度离心纯化病毒颗粒
(1)每100mL收集的病毒上清中加入50mL病毒沉淀液(20％EG8000，2.5M NaCl)，冰浴1小时以沉淀病毒。12000rpm离心20分钟，弃上清，将沉淀物悬浮在10mL密度为1.10g/mL的CsCl溶液中(溶剂为20mM Tris-HCl，pH 8.0)4℃7000rpm离心5分钟，收集病毒悬浮液。
(2)在超速离心管中加入2.0mL的1.40g/mL CsCl溶液(溶剂同上)，再加入3.0mL1.30g/mL的CsCl溶液。最后加入5mL的病毒悬浮液，22800rpm，4℃离心2.5小时。收集密度在1.30-1.40g/mL之间的病毒条带至透析袋中。在透析缓冲液(50g蔗糖，10mL 1M pH为8.0的Tris-HCl液，2mL 1M MgCl2溶液定容至1000mL)中，4℃透析过夜，中间更换透析液一次。
5)基因药物和疫苗制备：
收集病毒，加入病毒保存液，分装，即制成相应的基因药物和疫苗。保存于-80℃，备用。
6)重组腺病毒滴度检测
(1)24孔板中加入1mL 5.0×105个/mL的细胞悬液，37℃、5％CO2培养。
(2)准备好10倍梯度稀释的病毒样品，然后依次将10-5至10-8稀释的病毒液加入24孔板中，每孔加入100μL。
(3)感染48小时。去除培养液，沿着24孔板侧壁缓缓加入预冷的甲醇500μL，-20℃固定20分钟。
(4)使用PBS轻轻的冲洗细胞3次，每次5分钟。
(5)加入200μL 1％BSA 37℃封闭1小时。
(6)加入200μL的一抗溶液至每个孔中，37℃孵育1小时。
(7)使用PBS轻轻的冲洗细胞3次，每次5分钟。
(8)加入200μL的二抗至每孔，37℃孵育1小时。
(9)使用PBS轻轻的冲洗细胞3次，每次5分钟。
(10)加入200μL新配置的工作液至每孔，室温孵育5-10分钟。
(11)弃工作液，使用PBS清洗2次，每孔加入1mL PBS。
(12)每孔随机选择5个视野，使用光学显微镜10×物镜下计算阳性细胞个数。
(13)计算每孔阳性细胞的平均个数和病毒滴度。
实施例2RT-qPCR证实rAdhGLi或rAdhGLs感染细胞后，颗粒溶素mRNA水平的表达
1)AdNull、rAdhGLi和rAdhGLs分别感染HEK293细胞
(1)胰蛋白酶消化状态良好的HEK293T细胞，加入DMEM完全培养基重悬并计数，以5×105的细胞总数接种于六孔板的每一个孔中，补加DMEM完全培养基至2ml，置入37℃CO2培养箱中培养18-24h。
(2)弃去每孔旧培养基，加入2ml不含抗生素DMEM完全培养基,AdNull、rAdhGLi和rAdhGLs分别以MOI值为10的感染计量感染HEK293T，培养72h。
(3)用无菌1.5ml EP收集细胞悬液，1000rpm/min离心10min，弃上清收集细胞沉淀，用无菌PBS洗涤细胞2次，离心弃上清，每个EP管中加入1ml Trizol冰上反复吹打混匀，使细胞充分裂解，冻存在-80℃冰箱备用。
2)细胞总RNA提取：
(1)取出放置在-80℃冰箱中的标本，室温放置5-10min，使其充分融化。
(2)4℃下12000rpm离心5min，用新的EP管收集上清。
(3)以每1ml Trizol加入0.2ml氯仿的比例，每管加入0.2ml的氯仿，剧烈摇荡离心管15sec，4℃下12000rpm离心15min。
(4)吸取上层水相于一新EP管中，加入等体积的异丙醇，室温放置10分钟后，4℃下12000rpm离心10min。
(5)弃去上清液，每EP管内加入1ml-20℃预冷75％乙醇(750μl乙醇+250μl DEPC水)，上下颠倒EP管数次混匀后，4℃下8000rpm离心5min。
(6)小心弃去上清液，室温干燥10-15min，然后加入20μl DEPC水，使RNA溶解到DEPC水中。
3)RT-qPCR检测AdNull、rAdhGLi和rAdhGLs分别感染HEK293细胞后颗粒溶素mRNA表达水平：
(1)引物设计：根据设计的颗粒溶素基因序列，设计定量PCR的引物序列如下：
颗粒溶素上游引物序列：5’GATAAGCCCACCCAGAGAAG 3’
颗粒溶素下游引物序列：5’GATCTGCTGGGCAGTTTCTC 3’
内参β-actin上游引物序列：5’TTCTACAATGAGCTGCGTG 3’
内参β-actin下游引物序列：5’CTCAAACATGATCTGGGTC 3’
(2)RNA浓度测定：另取3支1.5ml EP管，分别加入98μl的DEPC水，再分别加入2μl的RNA，用eppendoff核酸蛋白检测仪进行RNA纯度和浓度的测定。
(3)总RNA逆转录成cDNA：每1μg RNA采用Thermo Scientific公司的逆转录试剂盒逆转录成cDNA，操作按说明书进行：
按以下反应体系加入
总RNA 1μg
oligo(dT)18primer 1μl
加入无RNA酶的ddH2O补足至12μl；混匀后瞬时离心，PCR仪65℃下放置5min，然后迅速置于冰上5min。
继续加入
总体积20μl，混匀后瞬时离心，放入PCR仪中42℃60min，70℃5min。
(4)定量PCR反应
定量PCR反应体系如下表所示。
表定量PCR反应体系
PCR反应程序如下表所示。
表PCR反应程序
(5)实验结果见图1：其中图1B为RT-qPCR检测rAdhGLi的颗粒溶素mRNA表达水平，rAdhGLi相对于野生型对照病毒AdNull高表达颗粒溶素；图1D为RT-qPCR检测rAdhGLs的颗粒溶素mRNA表达水平，rAdhGLs相对于野生型对照病毒AdNull高表达颗粒溶素，且和rAdhGLi相比的水平相当。
实施例4重组腺病毒rAdhGLi和rAdhGLs联合治疗小鼠M.tb H37Rv的原发感染
1)原发实验动物模型的建立及分组：
SPF级C57BL/6小鼠，雌性，6-8周龄。
小鼠适应环境后，腹腔注射0.8％戊巴比妥钠120μl，即0.96mg/每15g小鼠体重麻醉小鼠。5-10分钟后小鼠处于麻醉状态，分别用H37Rv标准毒株，用量程为50μl的滴鼻针，取10μl滴鼻感染所有小鼠。次日处死小鼠3只，肺脏细菌计数，确定感染实际约剂量为200CFU/只。
H37Rv感染小鼠2周后，根据实验需要，将实验动物随机分为5组，每组6只：阴性对照PBS组；对照病毒AdNull组；10rAdhGLi+0rAdhGLs(rAdhGLi:rAdhGLs＝10:0)治疗组、8rAdhGLi+2rAdhGLs(rAdhGLi:rAdhGLs＝8:2)治疗组、5rAdhGLi+5rAdhGLs(rAdhGLi:rAdhGLs＝5:5治疗组)、2rAdhGLi+8rAdhGLs(rAdhGLi:rAdhGLs＝2:8)治疗组及0rAdhGLi+10rAdhGLs (rAdhGLi:rAdhGLs＝0:10)治疗组。
腹腔注射0.8％戊巴比妥钠120μl，即0.96mg/每15g小鼠体重麻醉小鼠。5-10分钟后，小鼠处于麻醉状态。PBS组:取10μl无菌PBS滴鼻每只小鼠；AdNull组:取病毒滴度为1*109PFU，体积15μl滴鼻每只小鼠；rAdhGLi+rAdhGLS治疗组:分别按照相应的比例,取病毒滴度为1.00*1011PFU/ml rAdhGLi和病毒滴度为1.10*1011PFU/ml rAdhGLs，每组均配制成总病毒1*109PFU，滴鼻治疗各组中的每只小鼠。整个实验过程中治疗仅一次。
2)肺脏和脾脏的荷菌量分析
治疗2个月后，处死各组小鼠。以75％酒精浸泡消毒10min，无菌取出肺脏和脾脏，称取全肺脏重量和用于病理分析的肺脏重量；将剩余肺脏和全部脾脏，按照每脏器分别加入2ml无菌1×PBS，在无菌匀浆器内充分并研磨，转移到5ml无菌管中，振荡器充分混匀。取100μl原液加入到900μl PBS中做倍比稀释，振荡器充分混匀后，取4个稀释度的菌液各100μl涂布含有100mg/L氨苄青霉素、50mg/L羧苄青霉素、2.5mg/L两性霉素B和25mg/L多黏菌素B的7H11固体培养皿中。同1个稀释度的菌液分别涂布三格平板。剩余原液保存在-80℃冰箱备用。平皿放于37℃培养箱培养3～4周后进行菌落计数。根据计数结果，计算成单个脏器所含菌落总数，以Log10(CFU)进行荷菌量分析。计算各组的均值和标准误。
实验结果见图2，治疗2个月后各组小鼠肺脏和脾脏的荷菌量。其中PBS阴性对照组和野生型病毒AdNull对照组小鼠的肺脏和脾脏的荷菌量相当，无统计学差异，即：腺病毒本身不影响感染小鼠的荷菌量。单独使用rAdhGLi(10rAdhGLi+0rAdhGLs，rAdhGLi:rAdhGLs＝10:0)治疗组或rAdhGLS(0rAdhGLi+10rAdhGLs，rAdhGLi:rAdhGLs＝0:10)治疗组，肺脏和脾脏的荷菌量也分别显著低于PBS阴性对照组和对照病毒AdNull组(p＜0.05)。而且，rAdhGLi的治疗效果优于rAdhGLS(p＜0.05)。这些结果， 一方面表明细胞内颗粒溶素腺病毒和细胞外颗粒溶素腺病毒，依据各自杀伤细胞内、或细胞外的M.tb的作用，均对原发TB具有治疗效果；另一方面也表明机体在TB原发感染小鼠模型，M.tb主要是寄居在细胞内，一部分寄居在细胞外，为本专利申请的联合不同比例的细胞内、外颗粒溶素腺病毒治疗提供了理论基础。
特别值得注意的是，不同剂量比例的rAdhGLi+rAdhGLS联合治疗组小鼠的肺脏和脾脏的荷菌量，均显著低于PBS阴性对照组和对照病毒AdNull组(p＜0.001)；而且，不同比例联合组相互之间无显著差异；尤其是，这些联合治疗组的肺脏和脾脏的荷菌量，均显著低于rAdhGLi(10rAdhGLi+0rAdhGLs，rAdhGLi:rAdhGLs＝10:0)治疗组或rAdhGLS(0rAdhGLi+10rAdhGLs，rAdhGLi:rAdhGLs＝0:10)治疗组(p＜0.001)。因此，不同剂量比例的rAdhGLi+rAdhGLS联合治疗组小鼠肺脏和脾脏的荷菌量最低，即联合rAdhGLi+rAdhGLS治疗TB原发感染小鼠模型的效果最好。
实施例5联合重组腺病毒rAdhGLi和rAdhGLs治疗小鼠MDR-TB
1)实验动物模型的建立及分组：
SPF级C57BL/6小鼠，雌性，6-8周龄，14-16g，动物合格证No.11401300025148，许可证号SCXK(京)2014-0004。
实验动物随机分为5组，每组6只：阴性对照PBS组；rAdhGLi治疗组；rAdhGLS治疗组；rAdhGLi+rAdhGLS联合治疗组(rAdhGLi+s联合治疗组)和RHZ治疗组(异烟肼:H、利福平:R和毗嗪酰胺:Z)。
小鼠麻醉处理同前。取10μl MDR-TB菌悬液滴鼻感染滴鼻感染所有小鼠。次日处死3只小鼠，肺脏细菌计数，确定感染实际约剂量为60CFU/只。
2周后，同上麻醉。分别PBS组取10μl无菌PBS滴鼻每只小鼠；rAdhGLi治疗组和rAdhGLi单独治疗组和rAdhGLi+s联合治疗组的治疗剂量同前。RHZ治疗组采用标准化治疗方案，即10mg/kg/day RIF(利福平)、25 mg/kg/day INH(异烟肼)、150mg/kg/day PZA(吡嗪酰胺)联合治疗，灌胃，5天/周，1次/天。
2)肺脏和脾脏的荷菌量分析
治疗2周后，处死小鼠，以75％酒精浸泡消毒10min，无菌取出肺脏和脾脏。进行肺脏和脾脏脏器细菌计数，计数方法同前。
实验结果见图3，治疗两周后MDR-TB小鼠肺脏和脾脏的荷菌量。其中PBS阴性对照组和RHZ治疗组小鼠的肺脏和脾脏的荷菌量相当，无统计学差异，也证实标准化学治疗方案对MDR-TB无效。但是，单独rAdhGLi治疗组或rAdhGLS治疗组小鼠的肺脏(图3a)和脾脏(图3b)的荷菌量，均分别明显低于PBS阴性对照组和RHZ治疗组(p＜0.05)，即：rAdhGLi和rAdhGLS均对小鼠体内MDR-TB都具有直接杀伤作用，尽管在肺脏，rAdhGLi的治疗效应强于rAdhGLS(p＜0.05)。最重要的是，在所有组中，rAdhGLi+rAdhGLS联合治疗组小鼠肺脏和脾脏的荷菌量最低(p＜0.05)，既低于单独的rAdhGLi或rAdhGLS治疗组，也低于PBS阴性对照组和RHZ治疗组(p＜0.05)，即联合rAdhGLi+rAdhGLS治疗小鼠MDR-TB感染的效果最好。
3)肺脏组织病理学评价
每组随机采取3只小鼠左肺上叶，放入4％多聚甲醛固定，石蜡包埋，切片，分别HE染色和抗酸染色(AF)。由病理医师盲法评价肺部组织结构的破坏和炎性细胞浸润情况以及MDR-TB感染情况，并出具病理报告。
实验结果见图4。其中PBS阴性对照组和RHZ治疗组小鼠的肺组织的病变效应较重，明显炎性细胞浸润；抗酸染色后，可见PBS阴性对照组和RHZ治疗组肺组织切片中有大量的抗酸杆菌。rAdhGLi治疗组、rAdhGLS治疗组和rAdhGLi+rAdhGLS联合治疗组小鼠肺部组织病变，均较PBS阴性对照组和RHZ治疗组明显改善。其中，rAdhGLi+rAdhGLS联合治疗组效果最好，rAdhGLi治疗组和rAdhGLS治疗组次之，；抗酸染色 后，rAdhGLi治疗组和rAdhGLS治疗组肺组织切片有散在分布的抗酸杆菌，rAdhGLi+rAdhGLS联合治疗组未见抗酸杆菌。
实施例6联合重组腺病毒rAdhGLi和rAdhGLs控制小鼠M.tb H37Rv的潜伏感染
1)潜伏实验动物模型的建立及分组：
SPF级C57BL/6雌性小鼠，雌性，6-8周龄，18-20g，共33只小鼠。动物合格证No.42000500004938,许可证号SCXK2014-0004。饲养于Ventirack动物饲养柜。
先将30只小鼠用卡介苗经背部皮下免疫，免疫剂量为106CFU/只。4周后，同前麻醉小鼠。取10μl M.tb H37Rv菌悬液滴鼻感染所有小鼠。次日处死3只未免疫小鼠，肺脏细菌计数，确定感染实际约剂量为200CFU/只。
免疫8周后，根据实验需要，将实验动物随机分为5组，每组6只：阴性对照PBS组；对照病毒AdNull组；rAdhGLi治疗组；rAdhGLS治疗组；rAdhGLi+rAdhGLS联合治疗组(rAdhGLi+s联合治疗组)。同前麻醉小鼠。
分别PBS组取10μl无菌PBS滴鼻每只小鼠；各病毒组的剂量同前。
2)肺脏和脾脏的荷菌量分析
治疗4周后，处死小鼠，以75％酒精浸泡消毒10min，无菌取出肺脏和脾脏。同前进行脏器细菌计数。
实验结果见图5，各组小鼠肺脏和脾脏的荷菌量。其中PBS阴性对照组和对照病毒AdNull组小鼠的肺脏和脾脏的荷菌量相当，无统计学差异，即：腺病毒本身不影响小鼠荷菌量。值得注意的是，rAdhGLi治疗组、rAdhGLS治疗组和rAdhGLi+rAdhGLS联合治疗组小鼠的肺脏和脾脏的荷菌量，均分别明显低于PBS阴性对照组和对照病毒AdNull组(p＜0.05)；而且，rAdhGLS治疗组的肺脏和脾脏细菌荷菌量，略低于rAdhGLi治疗组，但无统计学差异。这些结果，一方面表明rAdhGLi和 rAdhGLS单独使用，均对小鼠体内的潜伏感染的M.tb具有直接杀伤作用；另一方面也表明在潜伏感染状态下，M.tb在感染机体内的定位，仍同时位于细胞内、外。最重要的是，在所有实验组中，rAdhGLi+rAdhGLS联合治疗组小鼠肺脏和脾脏的荷菌量，均最低(p＜0.05)，且显著低于rAdhGLi治疗组或rAdhGLS治疗组(p＜0.05)；特别是，该组2/6小鼠肺脏和脾脏细菌被完全清除。因此，联合rAdhGLi+rAdhGLS治疗小鼠潜伏感染的效果最好。
3)肺脏组织病理学评价
每组随机采取3只小鼠左肺上叶，放入4％多聚甲醛固定，石蜡包埋，切片，分别HE染色和抗酸染色(AF)。由病理医师盲法评价肺部组织结构的破坏和炎性细胞浸润情况以及结核分枝杆菌感染情况，并出具病理报告。
实验结果见图6。PBS阴性对照组和对照病毒AdNull组小鼠的肺组织的病变效应较重，明显炎性细胞浸润；抗酸染色后，PBS阴性对照组和对照病毒AdNull组肺组织切片散在分布少量的抗酸杆菌。rAdhGLi治疗组、rAdhGLS治疗组和rAdhGLi+rAdhGLS联合治疗组小鼠肺部组织病变，分别较PBS阴性对照组和对照病毒AdNull组明显改善，几乎接近于未感染状态；其中rAdhGLi+rAdhGLS联合治疗组效果最好，rAdhGLi治疗组和rAdhGLS治疗组次之；肺组织切片抗酸染色后，rAdhGLi治疗组、rAdhGLS治疗组和rAdhGLi+rAdhGLS联合治疗组，均未见抗酸杆菌。
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种结核病基因药物，其特征在于，所述结核病基因药物以腺病毒为基因表达载体，表达细胞内颗粒溶素蛋白以及细胞外颗粒溶素蛋白，所述细胞内颗粒溶素蛋白以及细胞外颗粒溶素蛋白的表达量在2∶8至8∶2之间；所述的结核病基因药物包括用于表达细胞内颗粒溶素蛋白的第一重组腺病毒以及用于表达细胞外颗粒溶素蛋白的第二重组腺病毒；所述第一腺病毒，其重组腺病毒基因组的E1缺失区整合有用于表达细胞内颗粒溶素蛋白的第一序列，所述第一序列为由SEQ ID No.1所示的基因序列；所述第二腺病毒，其重组腺病毒基因组的E1缺失区整合有用于表达细胞外颗粒溶素蛋白的第二序列，所述第二序列为由SEQ IDNo.2所示的基因序列。
2.如权利要求1所述的结核病基因药物，其特征在于，所述腺病毒滴度在1010PFU/ml至1012PFU/ml之间。
3.如权利要求1或2所述结核病基因药物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1、将表达细胞内颗粒溶素蛋白的第一序列以及表达细胞外颗粒溶素蛋白的第二序列分别整合到穿梭质粒上，形成细胞内颗粒溶素蛋白基因穿梭质粒以及细胞外颗粒溶素蛋白基因穿梭质粒；
步骤2、将步骤1获得的细胞内颗粒溶素蛋白基因穿梭质粒以及细胞外颗粒溶素蛋白基因穿梭质粒分别与骨架质粒共转染宿主细胞，获得表达细胞内颗粒溶素蛋白的第一腺病毒和表达细胞外颗粒溶素蛋白的第二腺病毒；
步骤3、将第一腺病毒与第二腺病毒分别纯化，并按照数量比例2∶8至8∶2混合，即制得本发明提供的基因药物。
4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，将腺病毒滴度稀释到1010PFU/ml至1012PFU/ml之间。
5.一种结核病治疗型疫苗，其特征在于，包括如权利要求1或2所述的结核病基因药物。
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