CN105801705B - 含胰高血糖素样肽-1和免疫球蛋白杂合Fc的融合多肽及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及胰高血糖素样肽‑1及免疫球蛋白杂合Fc融合多肽，更具体地涉及一种基于适合胰高血糖素样肽‑1或其类似物的免疫球蛋白杂合Fc的发现并且相比于现有的融合多肽具有增加半衰期和优秀效能的融合多肽、包含上述融合多肽的糖尿病治疗用组合物以及用于制备糖尿病治疗用药剂的上述融合多肽的用途。相比于现有的胰高血糖素样肽‑1，本发明的融合多肽具有增加的半衰期，并具有优秀的降血糖效能以及对二肽基肽酶‑4的抵抗性，在治疗糖尿病时，相比于现有的药剂，表现出优秀的药物效能，可有效地适用于医药品。

Description

含胰高血糖素样肽-1和免疫球蛋白杂合Fc的融合多肽及其 用途

技术领域

本发明涉及胰高血糖素样肽-1(GLP-1)及免疫球蛋白杂合Fc(Fc)融合多肽，更具体地涉及一种基于适合胰高血糖素样肽-1或其类似物的免疫球蛋白杂合Fc的发现并且相比于现有的融合多肽具有增加半衰期和优秀效能的融合多肽、包含上述融合多肽的糖尿病治疗用组合物以及用于制备糖尿病治疗用药剂的上述融合多肽的用途。并且，用于对上述融合多肽进行编码的多核苷酸、包含上述多核苷酸的表达载体以及包含上述表达载体的宿主细胞也包含在本发明的范围。

背景技术

糖尿病是由于受到环境影响而使得胰岛素分泌出现问题或者胰岛素功能出现异常而导致血液中的葡萄糖无法成为细胞的能量源，而是以高比重残留在血液中的表现出高血糖症(hyperglycemia)症状的代谢性疾病，糖尿病伴有各种并发症，成为现代社会最要重的慢性疾病。

糖尿病大致分为一型糖尿病(Type 1diabetes)和二型糖尿病(Type 2diabetes)。一型糖尿病占全部糖尿病患者的不足10％，主要在小儿患者中发病，报告显示，一型糖尿病的发病原因是由于自体免疫疾病等导致胰腺β细胞遭受破坏，无法实现胰岛素合成及分泌而导致发病，需要终生注射胰岛素。相反地，二型糖尿病占全部糖尿病患者的90％以上，主要在成人患者中发病，尤其，超重和肥胖成人更易发病，报告显示，二型糖尿病的发病原因是胰腺的胰岛素分泌障碍及胰岛素抵抗性。

为了治疗这种糖尿病，根据以往的方式，基本采用运动疗法或食疗法，但通过这种方式难以调节血糖的情况下，将实施糖尿病治疗剂的单独或并用服药方法。参考美国糖尿病学会(ADA)的指南，首次选择的药剂为二甲双胍(metformin)，第二次、第三次药物为磺酰脲(sulfonylurea)类、格列奈(glinide)类、噻唑烷二酮(thiazolidinedione)类以及二肽基肽酶-4(DPP-4)抑制剂等，之后使用胰高血糖素样肽-1(glucagon like peptide-1)激动剂(agonist)等注射剂或胰岛素注射剂。

但是，在目前临床使用的现有口服用糖尿治疗剂的情况下，除了可持续保持血糖的正常化这一积极作用之外，当长期服用时，将导致各种副作用，例如诱发低血糖、腹泻、体重增加、心血管疾病、慢性肝炎等，而且最终导致胰腺的β细胞遭受破坏，最后需要注射胰岛素。并且，注射胰岛素作为最后的治疗方法，需要每天实施2～3次皮下注射，不仅很不方便，而且还可能引发作为最大副作用的低血糖诱发。

为了完善这种存在问题，近年来作为下一代糖尿病治疗剂的重要药剂就是胰高血糖素样肽-1。胰高血糖素样肽-1及其类似物和衍生物在针对二型糖尿病治疗的临床试验中表现出很好的可行性，刺激胰岛素分泌、阻碍胰高血糖素的分泌、阻碍胃空腹化、阻碍胃运动性或肠运动性以及减轻体重等，诱导诸多生物学效果。并且，在长期服用的情况下，也具有胰腺保护功能，不存在低血糖风险，可长期保持合理血糖。

但是，在生物体内，借助称为二肽基肽酶-4的酶，上述胰高血糖素样肽-1被切割而导致失去活性，由此，具有非常短的生物体内半衰期，很难作为治疗剂开发。对此，为了既保持生物学活性，同时为了延长胰高血糖素样肽-1的半衰期，或者为了减少身体的缩氨酸的去除率，实施了各种接近法。即，目前正在积极地开展着各种胰高血糖素样肽-1类似物的开发活动，还尝试了向免疫球蛋白Fc位点结合胰高血糖素样肽-1的接近法(美国专利US7,452,966B2等)。

但是，即便如此，目前为止试图结合免疫球蛋白Fc的技术在半衰期的局限、抗体依赖细胞介导的细胞毒作用(ADCC)诱导方程、二肽基肽酶-4相关稳定性等方面还不足以商用化。

对此，本发明人将作为本发明人的现有专利的中国专利CN 101687933中制备的免疫球蛋白杂合Fc技术与胰高血糖素样肽-1相结合，选择胰高血糖素样肽-1特异性地优化的免疫球蛋白Fc，制备出既具有增加的半衰期，又具有优秀的降血糖效能及对于二肽基肽酶-4的抵抗性的融合多肽，由此完成本发明。

发明内容

[技术问题]

本发明的一个目的是提供融合多肽，上述融合多肽包括：(a)胰高血糖素样肽-1或其类似物，以及(b)包含有限数量的IgD铰链区域的免疫球蛋白Fc多肽。

本发明的再一个目的是提供以上述融合多肽作为有效成分来包含的糖尿病治疗用药物组合物。

本发明的另一个目的是提供用于制备糖尿病治疗用药剂的上述融合多肽的用途。

本发明的还有一个目的是提供用于对上述融合多肽进行编码的多核苷酸、包含上述多核苷酸的表达载体以及包含上述表达载体的宿主细胞。

[解决问题的手段]

为了实现上述目的，作为本发明的一个实施方式，提供融合多肽，上述融合多肽包括：(a)胰高血糖素样肽-1或其类似物；以及(b)包含有限数量的IgD铰链区域的免疫球蛋白Fc多肽。

具体而言，上述融合多肽可包括：(a)胰高血糖素样肽-1或其类似物，以及(b)免疫球蛋白Fc多肽；其中，上述免疫球蛋白Fc多肽可包括(i)从序号25的C-末端开始由35个至49个连续的氨基酸序列构成的分离的IgD铰链区域；以及(ii)由序号29的氨基酸序列构成的CH2及CH3区域。

优选地，上述胰高血糖素样肽-1或其类似物的C-末端可与免疫球蛋白Fc多肽的N-末端相结合，在免疫球蛋白Fc多肽内，IgD铰链区域的C-末端可与CH2及CH3区域的N-末端相结合。由此，从N-末端沿着C-末端方向可依次与胰高血糖素样肽-1或其类似物、IgD铰链区域以及CH2和CH3区域相结合。在本发明中，“融合多肽”表示上述胰高血糖素样肽-1等生物学活性分子与免疫球蛋白Fc多肽相结合的形态，可与“Fc融合多肽”、“结合蛋白质”等术语混用。

本发明的术语“胰高血糖素样肽-1(glucagon like peptide-1)”是由消化器官分泌的激素的长促胰岛素的一种蛋白质，依赖摄取而从肠管内的L细胞中分泌，可增加胰腺的胰岛素分泌，抑制胰高血糖素的分泌，由此，可以起到抑制餐后血糖上升的作用。如此，目前胰高血糖素样肽-1的糖尿病治疗用途已广为所知，也可参与食欲的生理调节，还具有体重减少效果。

一方面，上述天然胰高血糖素样肽-1在生物体内被加工，使得前6个氨基酸从分子中被切割。因此，依据本发明所属行业的惯例，胰高血糖素样肽-1的氨基末端指定为7号、羧基-末端指定为37号。在根据上述加工而不具有胰岛素分泌功能的形态的胰高血糖素样肽-1(1-37)中，能够以胰高血糖素样肽-1(7-37)形态被处理，并成为活性型胰高血糖素样肽-1(7-37)(序号1的氨基酸序列及序号33的核酸序列)，在生物体内进行补充变形，使得C-末端甘氨酸残基被去除，以磺胺基替代，进而成为胰高血糖素样肽-1(7-36)酰胺(序号13的氨基酸序列及序号35的核酸序列)的形态。因此，胰高血糖素样肽-1(7-37)羟基(OH)和胰高血糖素样肽-1(7-36)酰胺相当于两种天然型胰高血糖素样肽-1。

但是，在生物体内，借助二肽基肽酶-4而以非常快的速度被切割，导致失去活性等，以药物开发的过程中存在很多困难，为了增加生物体内的半衰期，持续进行了各种尝试。对此，尝试了通过使上述胰高血糖素样肽-1发生突变，减少通过二肽基肽酶-4的切割，进而制备胰高血糖素样肽-1类似物，由此，上述胰高血糖素样肽-1类似物为了实现上述目的，可无局限性地使用本发明所属行业公开的类似物。

具体而言，8号位置的氨基酸的置换可减少二肽基肽酶-4使胰高血糖素样肽-1失去活性的速度，22号位置的氨基酸的置换可减少分子凝集的可能性并增加分子的效能，36号位置的氨基酸的置换可减少在将结合蛋白质向人体反复持续注射之后诱导中和免疫反应的风险。因此，虽不限于此，但可使用上述8号、22号及36号位置的氨基酸被置换的形态的类似物，除此之外，还可以使用如美国专利US 7,452,966B2等公开的33号、34号及37号位置的氨基酸被置换的形态的类似物。

作为更具体的一个例子，优选地，上述胰高血糖素样肽-1的类似物可借助二肽基肽酶-4而发生切割位点的突变。二肽基肽酶-4在上述胰高血糖素样肽-1的8号及9号氨基酸之间切割胰高血糖素样肽-1，由此，作为8号氨基酸的丙氨酸(A)被置换成甘氨酸(G)或缬氨酸(V)的胰高血糖素样肽-1类似物可减少因二肽基肽酶-4的切割。

并且，作为22号氨基酸的上述甘氨酸(G)可被谷氨酸(E)置换，作为36号氨基酸的精氨酸(R)可被甘氨酸(G)置换。

由此，优选地，上述胰高血糖素样肽-1类似物可以是从胰高血糖素样肽-1(7-37)中8号、22号和/或36号氨基酸被置换的形态的具有序号2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12的氨基酸序列的胰高血糖素样肽-1类似物，可以是从胰高血糖素样肽-1(7-36)中8号、22号和/或36号氨基酸被置换的形态的具有序号14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24的氨基酸序列的胰高血糖素样肽-1类似物。并且，更优选地，可以是作为借助二肽基肽酶-4的切割位点的8号氨基酸被突变的具有序号2、3、6、7、8、9、11、12、14、15、18、19、20、21、23或24的氨基酸序列的胰高血糖素样肽-1类似物，最优选地，可以是作为8号氨基酸的丙氨酸(A)置换成甘氨酸(G)的具有序号2的氨基酸序列的胰高血糖素样肽-1类似物。具有序号2的氨基酸序列的上述胰高血糖素样肽-1类似物可由序号34的核酸序列进行编码。在本发明的一实施例中，利用具有序号2的氨基酸序列的上述胰高血糖素样肽-1类似物确认其效能。上述胰高血糖素样肽-1类似物的突变位置如下表所示。

[表1]

本发明意识到如上所述的胰高血糖素样肽-1或其类似物难以作为糖尿病治疗药物实现合理使用，为了解决这种问题，开发出适合胰高血糖素样肽-1的免疫球蛋白Fc多肽，并制备出与此相结合的融合多肽，这就是本发明的技术特征具体而言，通过显著增加胰高血糖素样肽-1的生物体内的半衰期，使得胰高血糖素样肽-1在生物体内持续发挥药物效能。补充地，上述融合多肽在血清内的稳定性、二肽基肽酶-4抵抗性以及药理学属性等方面也非常优秀。

为此，在本发明中，首先通过将在作为现有专利的中国专利CN 101687933中制备的根据免疫球蛋白杂合Fc技术的杂合Fc5与上述胰高血糖素样肽-1相结合，来制备融合多肽。在本发明中使用的术语“杂合(hybrid)”表示相互不同来源的两个以上的免疫球蛋白Fc片段编码序列存在于单链免疫球蛋白Fc片段。上述杂合Fc5为包含30个氨基酸长度的IgD铰链区域的杂合Fc，当适用于大蛋白质(Large protein)时，表现出非常大的半衰期增加效果，关于相对长度短的短肽(Short peptide)，例如当适用于本发明的胰高血糖素样肽-1时，相比于如上所述的适用于大蛋白质的情况，半衰期增加效果不大，由此，制备出效果进一步得到改良的融合多肽。

在本发明中使用的术语“免疫球蛋白Fc片段”或“免疫球蛋白Fc”表示包括免疫球蛋白的重链恒定区域(CH)，免疫球蛋白的重链及轻链的可变区域及轻链恒定区域(CL)表示不包括蛋白质。上述Fc还可包括铰链区域，根据本发明的目的，虽然包括重链恒定区域2(CH2)及重链恒定区域3(CH3)，但是可包含或不包含重链恒定区域(CH1)。

本发明的免疫球蛋白Fc片段可从N-末端沿着C-末端方向包括铰链区域、CH2结构域区域及CH3结构域区域。具体而言，本发明的免疫球蛋白Fc片段可以是杂合免疫球蛋白Fc片段，由此，上述铰链区域可包括人类Ig铰链区域，上述CH2结构域区域可包括人类IgD和IgG4CH2结构域的氨基酸残基部分，上述CH3结构域区域可包括人类IgG4CH3结构域的氨基酸残基部分。

本发明的可与胰高血糖素样肽-1或其类似物相结合的合适的免疫球蛋白Fc多肽，其特征在于，包含35至49个氨基酸长度的IgD铰链区域。上述铰链区域的主要作用是当与胰高血糖素样肽-1等生物学活性分子相结合时，通过保持其柔性(flexibility)，来保持其结构。具体而言，在作为IgD铰链区域的序号25的氨基酸序列(以序号36的核酸序列进行编码)中，从C-末端沿着N-末端方向，可包括具有35至49个连续的氨基酸序列的分离的IgD铰链区域。并且，优选地，在序号25的氨基酸序列中，可以是从C-末端沿着N-末端方向的具有35至40个连续的氨基酸序列的IgD铰链区域，更优选地，可以是具有35个或40个连续的氨基酸序列的IgD铰链区域，更优选地，可以是具有40个连续的氨基酸序列的IgD铰链区域。在序号25的上述氨基酸序列中，由35个连续的氨基酸序列构成的IgD铰链区域表示为序号26、由40个连续的氨基酸序列构成的IgD铰链区域表示为序号27、由49个连续的氨基酸序列构成的IgD铰链区域表示为序号28、对序号26的氨基酸序列进行编码的核酸序列表示为序号37、对序号27的氨基酸序列进行编码的核酸序列表示为序号38、对序号28的氨基酸序列进行编码的核酸序列表示为序号39。

在本发明中，与如上所述的IgD铰链区域相结合的免疫球蛋白Fc CH2及CH3区域虽不改变本发明的融合多肽的药理学及药物效能，或者除非引起抗体依赖细胞介导的细胞毒作用(ADCC)和/或补体依赖细胞毒性(CDC)等细胞毒性，否则可以无限制使用，优选地，可使用本发明人开发的IgD及IgG4的杂合Fc CH2及CH3区域。具体而言，可使用由序号29的氨基酸序列或以序号40的核酸序列进行编码的氨基酸序列构成的CH2及CH3区域。

通过如上所述的胰高血糖素样肽-1或其类似物与包含IgD铰链区域及CH2及CH3区域的免疫球蛋白Fc多肽相结合而最终构成本发明的融合多肽。

虽然不对此进行限定，但作为例子，本发明的融合多肽可由选自由序号30至32组成的组中的氨基酸序列构成，更具体地，可由序号30或31的氨基酸序列构成，或者可由序号31的氨基酸序列构成。序号30的上述氨基酸序列为本发明的序号2的胰高血糖素样肽-1类似物、序号26的IgD铰链区域及序号29的CH2及CH3区域相结合的形态并以“胰高血糖素样肽-1-杂合Fc8”表示，序号31的氨基酸序列为本发明的序号2的胰高血糖素样肽-1类似物、序号27的IgD铰链区域及序号29的CH2及CH3区域相结合的形态并以“胰高血糖素样肽-1-杂合Fc9”表示，序号32的氨基酸序列为本发明的序号2的胰高血糖素样肽-1类似物、序号28的IgD铰链区域及序号29的CH2及CH3区域相结合的形态并以“胰高血糖素样肽-1-杂合Fc11”表示。

在本发明的一实施例中，首先通过将由本发明人开发的现有的包含由30个氨基酸序列构成的IgD铰链区域的杂合Fc5与胰高血糖素样肽-1相结合而制备出胰高血糖素样肽-1-杂合Fc5(图1)，其半衰期与现有的胰高血糖素样肽-1单独缩氨酸比较结果，半衰期实现了增加。但是，相比于将杂合Fc5适用于大蛋白质的情况下所表现出的效果，当杂合Fc5适用于作为长度短的短肽的胰高血糖素样肽-1时，所表现出的半衰期增加效果不高。

由此，本发明人试图找到当适用于胰高血糖素样肽-1时可表现出高于杂合Fc5的优秀的效能的免疫球蛋白Fc多肽，结果发现，针对如胰高血糖素样肽-1等长度短的缩氨酸的情况，当增加铰链区域的长度时，可以制备出具有优秀的半衰期和优秀的活性的融合多肽。即，在上述IgD铰链区域中存在着易于被蛋白酶(protease)分解并且对上述酶反应敏感的切割位点，在与免疫球蛋白Fc多肽相结合的生理活性蛋白质的尺寸大的情况下，上述切割位点不被暴露，从而不会导致出现问题，但在胰高血糖素样肽-1等长度短的缩氨酸的情况下，切割位点被暴露，通过Fc多肽结合，未出现预期的半衰期增加效果。但是，对此分析得出，当增加铰链区域的长度时，具有解决这种问题的可能性。

对此，在本发明的一实施例中，制备出具有由40个氨基酸序列构成的IgD铰链区域的杂合Fc9(图3)，并以此为基础，制备出具有由35个氨基酸序列构成的IgD铰链区域的杂合Fc8及具有由49个氨基酸序列构成的IgD铰链区域的杂合Fc11，最终制备出胰高血糖素样肽-1-杂合Fc9、胰高血糖素样肽-1-杂合Fc8及胰高血糖素样肽-1-杂合Fc11融合多肽。并且，对所制备的本发明的上述融合多肽的药代动力学数据(PK Profile)进行测定的结果，具有高于胰高血糖素样肽-1独立缩氨酸以及胰高血糖素样肽-1-杂合Fc5的半衰期(图4及图5)，表现出更有效的药物效能。

并且，作为在上述融合多肽中具有代表性的融合多肽，以胰高血糖素样肽-1-杂合Fc9为对象与现有的胰高血糖素样肽-1-杂合Fc5进行各种效能对比结果，显示出在血清内稳定性(图6)、二肽基肽酶-4抵抗性(图7)以及药效动力学特性(PD Profile)(图8)的所有方面均表现出明显的优秀性。

同时，在本发明的再一实施例中，针对上述胰高血糖素样肽-1-杂合Fc9，比较胰高血糖素样肽-1-连接体-IgG4-mut(美国专利US 7,452,966B2)和抑制抗体依赖细胞介导的细胞毒作用(ADCC)活性的能力的结果，胰高血糖素样肽-1-杂合Fc9的抑制抗体依赖细胞介导的细胞毒作用(ADCC)活性的能力优秀(图9)。实质上，上述胰高血糖素样肽-1-连接体-IgG4-mut为了抑制抗体依赖细胞介导的细胞毒作用(ADCC)，使得免疫球蛋白Fc的部分氨基酸位点发生突变，而本发明的胰高血糖素样肽-1-杂合Fc9具有更高的抗体依赖细胞介导的细胞毒作用(ADCC)的抑制能力。

综合这种结果，相比于现有的胰高血糖素样肽-1，本发明的融合多肽具有增加的半衰期，具有优秀的降血糖效能及对二肽基肽酶-4的抵抗性，可有效地用于糖尿病治疗。

对此，作为本发明的再一个实施方式，提供以上述融合多肽作为有效成分而包含的糖尿病治疗用药物组合物。并且，作为另一个实施方式，本发明的提供用于制备糖尿病治疗用药剂的上述融合多肽的用途。此时，上述糖尿病可以是二型糖尿病。

本发明的融合多肽包含现有的作为糖尿病治疗剂广为所知的胰高血糖素样肽-1或其类似物，可有效地用于糖尿病治疗，相比于现有的药剂，本发明的融合多肽具有增加的半衰期、优秀的降血糖效能，还增加了对二肽基肽酶-4的抵抗性，相比于现有的药物具有优秀的Profile，可适用于医药品。

本发明的融合多肽可广泛地用于治疗各种疾病及症状。本发明的融合多肽首先作用于以“胰高血糖素样肽-1受体”提及的受体，并发挥它们的生物学效果。因此，本发明的融合多肽可以治疗对胰高血糖素样肽-1受体刺激或者胰高血糖素样肽-1化合物的投入做出友好反应的疾病和/或症状的对象体。这种对象体被称为“需要胰高血糖素样肽-1化合物的治疗”或者“需要胰高血糖素样肽-1受体的刺激”。包括具有非胰岛素依赖性糖尿病、胰岛素依赖性糖尿病、中风(参照WO 00/16797)、心肌梗死(参照WO 98/08531)、肥胖(参照WO 98/19698)、术后异变(参照美国专利第6,006,753号)、功能性消化不良以及肠易激综合征(参照WO 99/64060)的对象体。需要胰高血糖素样肽-1化合物的预防性治疗的对象体，例如还包括具有非胰岛素依赖性糖尿病发病风险的对象体(参照WO 00/07617)。具有受损的葡萄糖耐性或受损的绝食葡萄糖的对象体、体重超过该对象体的身高体型有关正常体重的约25％的对象体、接受局部胰腺切除手术的对象体、父母中的至少一位患有非胰岛素依赖性糖尿病的对象体、曾患有妊娠性糖尿病的对象体以及曾患有急性或慢性胰腺炎的对象体等，具有非胰岛素依赖性糖尿病发病风险。

本发明中记载的融合多肽的有效量是指向需要胰高血糖素样肽-1受体的刺激的对象体投入融合多肽时能够实现既不诱发副作用又能够达到目标治疗和/或预防效果的许可量。“目标治疗效果”包括下列各项的至少一种。1)减轻疾病或症状有关各征象；2)延迟疾病或症状有关征象的开始出现；3)相比于不治疗的情况，寿命增加；以及4)相比于不治疗的情况，生活质量提高。例如，用于治疗糖尿病的本发明的融合多肽的“有效量”，相比于未治疗的情况，可以更好地控制血糖浓度，可延迟视网膜症、神经障碍或肾疾病等糖尿病并发症的发病。用于预防糖尿病的融合多肽的“有效量”，相比于未治疗的情况，可延迟需要以磺酰脲类、噻唑烷二酮类、胰岛素和(或)双胍类等抗低血糖药物进行治疗的上升的血糖水平的发病。

在本发明的一实施例中，通过半衰期的确认证明了药代动力学数据的实验之外，经确认，本发明的融合多肽还具有优秀的糖尿病治疗药物效能。具体而言，在体内(invivo)实验中，对胰高血糖素样肽-1-杂合Fc9融合多肽的药效动力学特性(PD profile)进行确认的结果，相比于胰高血糖素样肽-1-杂合Fc5，具有明显优秀的降血糖效能(图8)，在体外(in vitro)实验中，也表现出对二肽基肽酶-4的明显优秀的抵抗性，证明了在二肽基肽酶-4有关稳定性方面也具有优秀的效能(图7)。在糖尿病治疗中，血液中的葡萄糖含量的保持很重要，考虑到二肽基肽酶-4抑制剂通常用作糖尿病制冷剂，本发明的融合多肽在治疗糖尿病的过程中可以用作优秀的药物。

在本发明中，术语“治疗”是指通过注射本发明的融合多肽或包含融合多肽的药物组合物，使得糖尿病的症状好转或使其趋于好转的所有行为。

若本发明的药物组合物可表现出糖尿病的治疗效果，则能够以各种重量％包含融合多肽作为有效成分。

并且，本发明的药物组合物还可以包括根据通常的方法的适当的载体、赋形剂或稀释剂。作为可包含在本发明的组合物的载体、赋形剂及稀释剂包括但不限于乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、木糖醇、赤藓醇、麦芽糖醇、淀粉、合金橡胶、藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁及矿物油。

本发明的药物组合物可根据通常的方法以散剂、颗粒剂、锭剂、胶囊剂、悬浊液、乳状液、浆液、气雾剂等口服型剂型、外用剂、栓剂或灭菌注射溶液的形态剂型化后使用。具体而言，在剂型化的情况下，可使用通常的填充剂、稀释剂、结合剂、湿润剂、崩解剂、表面活性剂等稀释剂或赋形剂来制备。用于口服的固体制剂有锭剂、丸剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂等，在这种固体制剂中，上述化合物可杂合至少一种赋形剂来制备，例如，淀粉、碳酸钙、蔗糖、乳糖、明胶等。并且，除了单纯的赋形剂之外，还可以使用硬脂酸镁、滑石等润滑剂。用于口服的液状制剂有悬浮剂、内用液剂、乳剂、浆剂等，除了通常使用的作为单纯稀释剂的水、液体石蜡之外，还可以包括各种赋形剂，例如湿润剂、甜味剂、芳香剂、保鲜剂等。非口服制剂包括灭菌的水溶液、非水性溶剂、悬浮剂、乳剂、冻干制剂及栓剂。作为非水性溶剂、悬浮剂，可使用丙二醇、聚乙二醇、橄榄油等植物性油、油酸乙酯等可注射的乙酯等。作为栓剂的制剂，可使用合成脂肪酸酯、聚乙二醇、吐温61、可可脂、羟基香茅醛、甘油明胶等。

本发明的组合物以药学上有效的量用药。上述药学上的有效量是指以可适用于医学治疗的合理受益/风险比例足以治疗疾病，且不引发副作用的量，有效用量水平可根据包括患者的健康状态、疾病的类型、重症程度、药物的活性、对药物的敏感性、用药方法、用药时间、用药路径及排除比例、治疗期限、配合或并用药物的要素以及其他医学领域中普遍认知的要素而决定。

并且，本发明的药物组合物可单独使用或者与表现出糖尿病治疗效果的其他药物配合使用。本发明的药学组合物可通过各种路径向大鼠、小鼠、家畜、人类等哺乳动物用药。上述用药表示以所有合适的方法向患者提供规定的物质，只要能够到达目标组织，本发明的组合物的用药路径不受限制。例如，包括但不限于关节内注射、腹腔内注射、静脉内注射、肌肉内注射、皮下注射、皮内注射、口服、局部注射、鼻内注射、肺内注射、直肠内注射。

优选地，本发明的融合多肽以四周一次、两周一次或一周一次的周期用药。根据所治疗的疾病，融合多肽可每周2至3次的更加频繁的周期用药。

作为还有一个实施方式，本发明提供用于对上述融合多肽进行编码的多核苷酸、包含上述多核苷酸的表达载体以及保护上述表达载体的宿主细胞。

本发明的特征在于上述融合多肽，对上述融合多肽进行编码的多核苷酸、包含上述多核苷酸的表达载体以及保护上述表达载体的宿主细胞同样包含在本发明的范围，只要可表现上述融合多肽，其类型不受限制。

上述多核苷酸不受限制，例如可以由对“胰高血糖素样肽-1-杂合Fc8”进行编码的序号41的核酸序列、对“胰高血糖素样肽-1-杂合Fc9”进行编码的序号42的核酸序列或对“胰高血糖素样肽-1-杂合Fc11”进行编码的序号43的核酸序列构成，或者还可以由序号42的核酸序列构成。

由于密码子的简并性(degeneracy)或者考虑到试图表现上述融合多肽的生物所偏好的密码子，上述多核苷酸可在不改变所表现的融合多肽的氨基酸序列的范围内实现各种变形。

[发明的效果]

相比于现有的胰高血糖素样肽-1，本发明的融合多肽具有增加的半衰期，并具有优秀的降血糖效能及对二肽基肽酶-4的抵抗性，在治疗糖尿病的过程中，相比于现有药剂，表现出优秀的药物效能，可有效地用作医药品。

附图说明

图1为与胰高血糖素样肽-1-杂合Fc5的制备有关的图，表示胰高血糖素样肽-1-杂合Fc5的概要图及胰高血糖素样肽-1-杂合Fc5的序列。

图2为证明胰高血糖素样肽-1缩氨酸和胰高血糖素样肽-1-杂合Fc5的药代动力学数据的图。

图3为与胰高血糖素样肽-1-杂合Fc9的制备有关的图，表示胰高血糖素样肽-1-杂合Fc5及胰高血糖素样肽-1-杂合Fc9的序列及概要图。

图4为与胰高血糖素样肽-1-杂合Fc5及胰高血糖素样肽-1-杂合Fc9的药代动力学数据有关的图，表示各时间段的血液内残存的蛋白质量及药物浓度曲线下面积(AUC)值。

图5为与胰高血糖素样肽-1-杂合Fc5、胰高血糖素样肽-1-杂合Fc8及胰高血糖素样肽-1-杂合Fc9的药代动力学数据有关的图，表示各时间段的血液内残存的蛋白质量。

图6为证明胰高血糖素样肽-1-杂合Fc5及胰高血糖素样肽-1-杂合Fc9的血清内稳定性的图，表示各反应时间段的残存的蛋白质量及时间曲线图的曲线下面积(AUC)值。

图7为证明胰高血糖素样肽-1-杂合Fc5及胰高血糖素样肽-1-杂合Fc9的二肽基肽酶-4的抵抗性的图，表示各反应时间段的残存的蛋白质量及时间曲线图的曲线下面积(AUC)值。

图8为与胰高血糖素样肽-1-杂合Fc5及胰高血糖素样肽-1-杂合Fc9的药效动力学特性有关的图，通过测定血液中葡萄糖浓度变化，求出曲线下面积值，并以对比阴性对照组的曲线下面积值含量％表示。

图9为比较胰高血糖素样肽-1-杂合Fc9及胰高血糖素样肽-1-连接体-IgG4-mut的抗体依赖细胞介导的细胞毒作用(ADCC)抑制能力的图，证明对Fcγ受体的结合能力。

具体实施方式

下面，将通过下述实施例对本发明进行更加详细的说明。这些实施例仅仅是为了例示本发明，本发明的范围不受这些实施例的限制。

实施例1：胰高血糖素样肽-1-杂合Fc5的制备及其药代动力学数据确认

胰高血糖素样肽-1(Glucagon like peptide-1)是糖尿病治疗中有效的蛋白质，在生物体内，胰高血糖素样肽-1借助二肽基肽酶-4而以非常快的速度被切割，半衰期约为3至5分钟，时间非常短，因此，若作为药物开发，则存在很多困难。对此，实施了很多如何在生物体内增加半衰期的尝试。

对此，首先为了减少借助上述二肽基肽酶-4的切割，基于胰高血糖素样肽-1(7-37)，在丙氨酸中，将作为借助二肽基肽酶-4的切割位点的8号氨基酸置换成甘氨酸，进而制备胰高血糖素样肽-1类似物(序号2)。接着，将在作为本发明人的现有专利的中国专利CN101687933中制备的杂合Fc5(hybrid Fc 5)多肽与上述胰高血糖素样肽-1类似物缩氨酸相结合，制备出胰高血糖素样肽-1-杂合Fc5融合多肽(图1)。上述胰高血糖素样肽-1-杂合Fc5融合多肽的全部序列如图1所示。

为了确认所制备的上述胰高血糖素样肽-1-杂合Fc5融合多肽的药代动力学特性(pharmacokinetic profile，PK profile)，将合成的胰高血糖素样肽-1作为对照组，执行如下实验。

针对每组四只雄性Sprague Dawley Rats，通过静脉(IV)注射路径，分别注射蛋白质(胰高血糖素样肽-1及胰高血糖素样肽-1-杂合Fc5)。在注射前和注射后的0.08、0.16、0.5、1、2、4、6、12、24、48、72及96小时分别采取血液。为了实现凝结，血液样品在室温保管30分钟。以3000rpm实施10分钟的离心分离之后，提取各样品的血清，保存在超低温冷冻库(deep freezer)。样品使用胰高血糖素样肽-1试剂盒(ALPCO，cat#43-GP1HU-E01)进行稀释和定量，使得能够在标准曲线的直线上进行分析。

其结果，如图2所示，在未结合杂合Fc多肽的胰高血糖素样肽-1单独缩氨酸的情况下，半衰期为4分钟，但相比之下，在结合胰高血糖素样肽-1及杂合Fc5的胰高血糖素样肽-1-杂合Fc5多肽的情况下，半衰期为8小时以上，比前者增加约116倍。

实施例2：胰高血糖素样肽-1-杂合Fc9、胰高血糖素样肽-1-杂合Fc8及胰高血糖素样肽-1-杂合Fc11的制备

试图制备半衰期大于胰高血糖素样肽-1-杂合Fc5的半衰期并且在其他活性方面也优秀的融合多肽。

具体而言，通过在杂合Fc5中对IgD铰链区域进行各种调节，制备出具有更加优秀的半衰期和更加优秀的活性的融合多肽，实验证明，在增加IgD铰链区域的氨基酸的情况下，有可能满足这种条件。

由此，使具有由30个氨基酸构成的铰链的杂合Fc5的铰链区域的氨基酸增加，首先制备出具有由40个氨基酸构成的铰链(序号27)的杂合Fc9(图3)，接着，分别制备出具有由35个氨基酸构成的铰链(序号26)的杂合Fc8及和具有由49个氨基酸构成的铰链(序号28)的杂合Fc11。同时，将上述杂合Fc9、杂合Fc8及杂合Fc11分别与胰高血糖素样肽-1类似物缩氨酸相结合，分别制备出胰高血糖素样肽-1-杂合Fc9(序号31)、胰高血糖素样肽-1-杂合Fc8(序号30)及胰高血糖素样肽-1-杂合Fc11(序号32)融合多肽。

实施例3：胰高血糖素样肽-1-杂合Fc9、胰高血糖素样肽-1-杂合Fc8及胰高血糖素样肽-1-杂合Fc11、药代动力学数据确认

3-1：胰高血糖素样肽-1-杂合Fc9的药代动力学数据确认

首先，通过比较在实施例2中制备的胰高血糖素样肽-1-杂合Fc9融合多肽的半衰期与在实施例1中制备的胰高血糖素样肽-1-杂合Fc5融合多肽的半衰期，试图确认药代动力学数据。

针对每组四只雄性Sprague Dawley Rats，通过皮下(SC)注射路径，分别注射蛋白质。在注射前和注射后的2、6、12、26、48、72、96、120、144及168小时分别采取血液。为了实现凝结，血液样品在室温保管30分钟。以3000rpm实施10分钟的离心分离之后，提取各样品的血清，保存在超低温冷冻库。样品使用胰高血糖素样肽-1试剂盒(IBL，Cat#27784A)进行稀释和定量，使得能够在标准曲线的直线上进行分析。

其结果以各时间段的血液内残存的蛋白质量及药物浓度曲线下面积(AUC，AreaUnder the Curve)值表示。如图4所示，相比于胰高血糖素样肽-1-杂合Fc5，在胰高血糖素样肽-1-杂合Fc9中表现出约为前者12倍的曲线下面积值。基于这种结果可知，相比于胰高血糖素样肽-1-杂合Fc5，胰高血糖素样肽-1-杂合Fc9的半衰期进一步增加，表现出更加有效的药物效能。

3-2：胰高血糖素样肽-1-杂合Fc8的药代动力学数据确认

接着，将胰高血糖素样肽-1-杂合Fc8融合多肽的半衰期与胰高血糖素样肽-1-杂合Fc9融合多肽进行比较，试图确认胰高血糖素样肽-1-杂合Fc8的药代动力学数据。以胰高血糖素样肽-1-杂合Fc5、胰高血糖素样肽-1-杂合Fc9及胰高血糖素样肽-1-杂合Fc8为对象，执行与上述实施例3-1相同的实验。

其结果，如图5所示，胰高血糖素样肽-1-杂合Fc9及胰高血糖素样肽-1-杂合Fc8显示出相似水平的药代动力学数据，胰高血糖素样肽-1-杂合Fc8表现水平略高。相比于作为对照组的胰高血糖素样肽-1-杂合Fc5，胰高血糖素样肽-1-杂合Fc8表现出显著优秀的水平。基于这种结果可知，胰高血糖素样肽-1-杂合Fc8的半衰期同样进一步增加，表现出更加有效的药物效能。

实施例4：胰高血糖素样肽-1-杂合Fc9的补充性效能确认

以下，将以相比于上述实施例3中的作为对照组的胰高血糖素样肽-1-杂合Fc5显示出优秀的药代动力学数据的融合多肽中的胰高血糖素样肽-1-杂合Fc9为对象，试图确认补充性的各种效能。作为对照组，使用胰高血糖素样肽-1-杂合Fc5。

4-1：胰高血糖素样肽-1-杂合Fc9的血清内稳定性确认

为了针对胰高血糖素样肽-1-杂合Fc5及胰高血糖素样肽-1-杂合Fc9，确认血清内分解因子相关稳定性，执行大鼠血清内稳定性试验。

首先，使用大鼠血清稀释两种试验物质，将准备的各样品放入37℃恒温器中，使反应0、6、10、24、48小时之后，采用酶联免疫吸附实验(ELISA)方法定量各物质。

其结果以各时间段的血液内残存的蛋白质量及时间曲线图的曲线下面积(AUC，Area Under the Curve)值表示。如图6所示，相比于胰高血糖素样肽-1-杂合Fc5，在胰高血糖素样肽-1-杂合Fc9中表现出约为前者1.2倍的曲线下面积值。基于这种结果可知，相比于胰高血糖素样肽-1-杂合Fc5，胰高血糖素样肽-1-杂合Fc9的血清内稳定性更加优秀。

4-2：胰高血糖素样肽-1-杂合Fc9的二肽基肽酶-4抵抗性确认

为了确认胰高血糖素样肽-1-杂合Fc5及胰高血糖素样肽-1-杂合Fc9对作为主要代谢酶的二肽基肽酶-4(Sigma，#D4943-1VL)的抵抗性以及相关稳定性，执行了二肽基肽酶-4抵抗性试验。

按照计划反应时间(0、2、8、24、48小时)，将两种试验物质和二肽基肽酶-4放入37℃的恒温器，分别定量物质。

其结果以各时间段的血液内残存的蛋白质量及时间曲线图的曲线下面积(AUC)值表示。如图7所示，相比于胰高血糖素样肽-1-杂合Fc5，在胰高血糖素样肽-1-杂合Fc9中表现出约为前者7倍以上的二肽基肽酶-4抵抗性。基于这种结果可知，相比于胰高血糖素样肽-1-杂合Fc5，可切割胰高血糖素样肽-1的二肽基肽酶-4效果稳定性方面，胰高血糖素样肽-1-杂合Fc9也显著优秀。

4-3：胰高血糖素样肽-1-杂合Fc9的PD Profile确认

为了确认所制备的胰高血糖素样肽-1-杂合Fc5及胰高血糖素样肽-1-杂合Fc9的药效动力学特性，执行如下实验。

针对每组十只CD-1小鼠，通过皮下(SC)注射路径，分别注射蛋白质后，每隔0、1、2、4及8天，投入葡萄糖，测定血液中葡萄糖的变化，确认血糖减少能力。

在每个测定日，从投入葡萄糖之后的1分钟至180分钟期间，测定血液中葡萄糖的浓度变化，求出各试验日的曲线下面积值，并对比阴性对照组(vehicle)，表示胰高血糖素样肽-1-杂合Fc5及胰高血糖素样肽-1-杂合Fc9的曲线下面积含量％。

其结果，如图8所示，在胰高血糖素样肽-1-杂合Fc5的情况下，从第二天开始，血糖减少能力消失并恢复正常化(normalization)，相反地，在胰高血糖素样肽-1-杂合Fc9的情况下，直到第八天还保持着血液中葡萄糖含量低的状态。这种结果意味着在使用胰高血糖素样肽-1-杂合Fc9的情况下，直到第八天也能够保持血糖减少能力。

综上可知，如下表所示，相比于胰高血糖素样肽-1-杂合Fc5，胰高血糖素样肽-1-杂合Fc9在完成试验的所有方面均表现出更优秀的效能。

[表2]

实施例5：与胰高血糖素样肽-1-连接体-IgG4-mut的抗体依赖细胞介导的细胞毒作用(ADCC)抑制能力比较

接着，对于通过上述实施例在各方面均表现出优秀的效能的胰高血糖素样肽-1-杂合Fc9融合多肽，通过与现有的融合多肽进行有关抗体依赖细胞介导的细胞毒作用(ADCC)抑制能力的比较，试图证明其优秀性。

以美国专利US 7,452,966B2公开的胰高血糖素样肽-1-连接体-IgG4-mut作为对照组，它是一种IgG4位点3处突变而阻碍抗体依赖细胞介导的细胞毒作用(ADCC，AntibodyDependent Cell-mediated Cytotoxicity)的多肽。

上述胰高血糖素样肽-1-连接体-IgG4-mut及本发明的胰高血糖素样肽-1-杂合Fc9均在结构上包括IgG4的CH2-CH3部位，不存在补体依赖细胞毒性(ComplementDependent Cytotoxicity)相关安全性问题，但存在抗体依赖细胞介导的细胞毒作用相关安全性问题，因此，为了对此进行确认，测定在诱发抗体依赖细胞介导的细胞毒作用的过程中起到重要作用的Fcγ受体相关结合能力，为此，执行了利用表面等离子谐振(SPR，Bio-rad，#Proteon XPR36)的结合力试验。

首先，通过NHS/EDC反应，利用醋酸盐缓冲液，向胺配对的伯乐碎片(bio-radchip)的各通道滴落Fcγ受体，使配体固定化。作为阴性对照组的概念，滴落添加有吐温20的磷酸盐缓冲盐水(Phosphate Buffered Saline)。向结合有各Fcγ受体的碎片上滴落各试验物质，测定结合力。

其结果，如图9所示，胰高血糖素样肽-1-连接体-IgG4-mut为了消除免疫球蛋白Fc部位的残余效应功能，使多个氨基酸位点变形，在诱发抗体依赖细胞介导的细胞毒作用的主要Fcγ受体上表现出高于胰高血糖素样肽-1-杂合Fc9的结合能力，由此可知，具有潜在的可引发细胞毒性的可能性。相反地，相比于胰高血糖素样肽-1-连接体-IgG4-mut，胰高血糖素样肽-1-杂合Fc9与所有Fcγ受体的结合能力低，由此可知，在长期用药时，可实现进一步的安全性。

Claims (11)

1.一种融合多肽，其特征在于，所述融合多肽由序号30或31的氨基酸序列构成。

2.根据权利要求1所述的融合多肽，其特征在于，所述融合多肽由序号31的氨基酸序列构成。

3.一种糖尿病治疗用药物组合物，其特征在于，包含权利要求1或2所述的融合多肽作为有效成分。

4.根据权利要求3所述的糖尿病治疗用药物组合物，其特征在于，所述糖尿病为二型糖尿病。

5.根据权利要求3所述的糖尿病治疗用药物组合物，其特征在于，所述组合物具有降血糖效能，增加对二肽基肽酶-4的抵抗性。

6.权利要求1或2所述的融合多肽在制备用于治疗糖尿病的药物中的用途。

7.一种多核苷酸，编码权利要求1或2所述的融合多肽。

8.根据权利要求7所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸由序号41或42的核酸序列构成。

9.根据权利要求7所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸由序号42的核酸序列构成。

10.一种表达载体，其特征在于，包括权利要求7的多核苷酸。

11.一种宿主细胞，其特征在于，包括权利要求10的表达载体。