CN105779322B - 枯草芽孢杆菌菌株及微生态制剂和应用 - Google Patents
枯草芽孢杆菌菌株及微生态制剂和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一株降低养殖场废水氨氮浓度的枯草芽孢杆菌菌株，该菌株为保藏编号为CGMCC No.10055，于2014年11月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。本发明菌株能够有效地去除氨氮废水尤其是养殖场废水的氨氮，达到净化水质，解决养殖场废水带来的环境污染问题。
Description
技术领域
本发明属于微生物领域，具体涉及一株降低养殖场废水氨氮浓度的枯草芽孢杆菌菌株及其应用。
背景技术
随着社会的发展，养猪产业规模化、集约化，随之带来一个非常重要的问题是养殖动物粪水的无害化处理问题，并成为制约生态养殖的一个的重要影响因素。养殖废水是一株富含氮磷、有机物、高悬浮物、高COD的高溶度有机废水，目前对养殖废水的处理主要包括：物化、生化和自然生态等治理技术。其中微生物处理养殖场废水，成本低，效果持久，对环境负荷小，容易形成养殖场废水池小生境的生态平衡。
CN 102267787A是利用微生物制剂、微生物吸附剂及滤食性鱼类对沼液进行强化处理，但需每日按照沼液量来投加微生物制剂，如果沼液日处理量大时，成本较高。CN10270283A是以厌氧菌和好氧菌株木霉和酵母菌为主要菌株，通过固定化包埋技术，实现高效修复畜禽养殖的污水。上述专利最终目的是达标排放，而不能实现降低养殖废水氨氮浓度，且投菌量大，成本高，不易大规模推广。
发明内容
本发明的目的在于提供一种降低养殖场废水氨氮浓度的枯草芽孢杆菌菌株及微生态和应用。
本发明的枯草芽孢杆菌菌株是从福建养猪场猪粪处理池分离并筛选得到的具有降低氨氮作用的菌株。
1、该菌株的分离：
（1）于福建养猪场废水池中采集大量的样品，且对样品进行如下操作：取5g样品并加入至10 ml 液体LB培养基中，混匀，95℃水浴10 min，于30℃、160rpm富集培养12h。
（2）分别取1ml步骤1所得的富集液并分别进行梯度稀释，选用稀释度为10-3,10-4,10-5,10-6,10-7，分别取0.1ml所得的稀释液并分别均匀涂布于LB固体培养基平板上（重复3次），之后置于30℃生化培养箱内培养12h；
(3)挑取步骤2所得的单菌落转入新的LB固体培养基平板上进行纯化培养，之后将纯化后所得的所有菌株分别接种于氨氮选择培养基中，并将氨氮选择培养基都置于170rpm、30℃条件下培养，每隔4h检测各氨氮选择培养基中的氨氮浓度、以及总氮浓度，其中氨氮浓度、以及总氮浓度下降最为迅速的异氧氨化培养基中所接种的菌株即为所要筛选获得的菌株。
其中，氨氮选择培养基的组分为：(NH4)2SO4 0.471g/L、MgSO4·7H2O 0.0472 g/L、FeSO4·7H2O、NaCl 0.188g/L、MnSO4· H2O 0.006g/L 、KH2PO4 0.28g/L 、CaCO3 0.471g/L。
完全溶解后加水定容至1000mL、pH7.2。
LB培养基的组分为：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，完全溶解后加水定容至1000mL、pH7.2。
2、该菌株鉴定：
将所获得的菌株送至中国科学院微生物研究所对其理化特性等进行鉴定，鉴定为枯草芽孢杆菌。
将该枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2014年11月25日，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.10055。
本发明还提供一种降低养殖场废水氨氮浓度的微生态制剂，其含有本发明所述的枯草芽孢杆菌菌株。
其中，所述枯草芽孢杆菌菌株的活菌数为107-109CFU/Kg。
优选的，本发明的微生态制剂还含有辅料，所述辅料优选自沸石粉、硅藻土、米糠、锯末、饼粕粉、秸杆粉、果渣、蘑菇渣、酒糟、糠醛渣和/或茶渣。
本发明还提供所述枯草芽孢杆菌菌株的发酵培养基，其主要成分为大豆10~30 g/L，蔗糖10~30 g/L，NaCl 5~10g/L，pH 6.5~8.0。
本发明还提供所述的微生态制剂的制备方法，包括如下步骤：
将所述枯草芽孢杆菌菌种在大豆液体培养基中摇瓶发酵培养，其中，所述的大豆液体培养基的主要成分是：大豆10~30 g/L，蔗糖10~30 g/L，NaCl 5~10g/L，发酵温度为30~40℃，发酵时间为24~78h，pH值6.5~8.0，转速为150~200rpm，培养完成后，分离取沉淀，按重量比1:10~20与辅料混合，烘干即得。
优选的，所述制备方法还可包括烘干后粉碎过60~100目筛的步骤。
其中，所述枯草芽孢杆菌菌种的接种量为体积百分比5~10%。
本发明还提供所述枯草芽孢杆菌菌株或者述的微生态制剂在降低养殖场废水氨氮浓度，净化水质中的应用。
本发明菌株枯草芽孢杆菌CGMCC No. 10055在以硫酸铵为唯一氮源的氨氮选择培养液中培养生长时，氨氮初始浓度约为100mg/L，经过12h培养NH4-N和TN浓度下降，12h时NH4-N和TN分别下降至35.25mg/L和53.7 mg/L，氨氮去除率达64.8 mg/L，总氮去除率达41.83 mg/L；24h时NH4-N和TN分别下降至30.6mg/L和61.3mg/L，氨氮去除率达69.4mg/L，总氮去除率达41.90mg/L，说明芽孢杆菌具有较强的去除氨氮的能力。将本发明菌株枯草芽孢杆菌CGMCC No. 10055以5%接种量接种于100mL的养殖废水中，在氨氮初始浓度为450.63mg/L、总氮初始浓度为480.26的养殖废水中培养24h时，养殖废水中氨氮浓度下降至250.64mg/L，氨氮去除率为35.40%；本发明菌株能够有效地去除氨氮废水尤其是养殖场废水的氨氮，在实际生产中可控制猪场对周围环境的污染，有着显著的环境效益。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1 本发明枯草芽孢杆菌降低氨氮能力测定
A、试验材料
供试菌株：枯草芽孢杆菌菌株CGMCC No. 10055
B、试验方法
以1%接种量将枯草芽孢杆菌CGMCC No. 10055接种于200ml新鲜的氨氮选择培养基（该处氨氮选择培养基与上述的氨氮选择培养基完全一致）中，并于30℃、160rpm条件下培养24h，且每隔4h检测氨氮培养基中氨氮浓度（NH4-N）、以及总氮（TN）浓度；于此同时，设置空白对照组。其中氨氮采用纳氏分光光度法；总氮采用过硫酸钾紫外分光光度法。
C、试验结果
如表1所示，枯草芽孢杆菌CGMCC No. 10055在以硫酸铵为唯一氮源的氨氮选择培养液中培养生长时，氨氮初始浓度约为100mg/L，经过12h培养NH4-N和TN浓度下降，12h时NH4-N和TN分别下降至35.25mg/L和53.7 mg/L，氨氮去除率达64.8 mg/L，总氮去除率达41.83 mg/L；24h时NH4-N和TN分别下降至30.6mg/L和61.3mg/L，氨氮去除率达69.4mg/L，总氮去除率达41.90mg/L，说明芽孢杆菌具有较强的去除氨氮的能力。
表1 枯草芽孢杆菌CGMCC No. 10055的去氮效果（mg/L）
实施例2 本发明枯草芽孢杆菌对实际污水的降低氨氮的效果
A、试验材料
供试污水：福建星星养猪场养殖废水；
B、试验方法
在养殖废水中加入乙酸钠作为碳源，乙酸钠终浓度2mg/mL，以5%接种量将枯草芽孢杆菌接种于100mL的养殖废水中，并于30℃、170rpm条件下培养，24h后检测养殖废水中的氨氮浓度（NH4-N）、以及总氮（TN）浓度；于此同时，以不接菌液的养殖废水为空白对照组。其中，氨氮采用纳氏分光光度法；总氮采用过硫酸钾紫外分光光度法。
C、试验结果
如表2所示，芽孢杆菌在氨氮初始浓度为450.63mg/L、总氮初始浓度为480.26 mg/L的养殖废水中培养24h时，养殖废水中氨氮浓度下降至250.64mg/L，氨氮去除率为35.40%；总氮浓度下降至310.25mg/L，总氮去除率35.4%；空白对照组氨氮浓度下降至368.93mg/L，氨氮去除率为18.13%；总氮浓度下降至445.31 mg/L，总氮去除率7.3%。与对照组相比实验组氨氮浓度下降118.29mg/L，总氮浓度下降135.06 mg/L有效去除氨氮，去除率达到44.38%，有效总氮去除率达到35.4%。从而说明，实际污水虽然成分复杂、有害物质多，增加了微生物脱氮的难度，但是本发明枯草芽孢杆菌对实际污水仍具有较佳的降低氨氮的效果。
表2 枯草芽孢菌株CGMCC No. 10055对实际污水的脱氮效果（mg/L）
实施例4 本发明枯草芽孢杆菌粉制备
将所述枯草芽孢杆菌CGMCC No.10055菌种按体积百分比5%接种于大豆液体培养基中摇瓶发酵培养，其中，所述的大豆液体培养基的主要成分是：大豆20 g/L，蔗糖20 g/L，NaCl 10g/L，发酵温度为37℃，发酵时间为48h，pH值7.0，转速为200rpm，培养完成后，分离取沉淀，按重量比1:10与沸石粉混合，烘干即得。
实施例4 本发明枯草芽孢杆菌粉对养殖场废水的降低氨氮的效果
A、试验材料
供试菌粉：枯草芽孢杆菌菌株CGMCC No. 10055，活菌数为108CFU/Kg
供试污水：福建星星养猪场养殖废水；
B、试验方法
选择猪场污水池进行试验，污水池水深1.5 m，面积为25m2，试验前，污水池氨氮初始浓度为450.63mg/L、总氮初始浓度为480.26 mg/L，按5%添加量将枯草芽孢杆菌菌株CGMCC No. 10055菌粉均匀泼洒于污水池中，每隔4h检测养殖废水中的氨氮浓度（NH4-N）、以及总氮（TN）浓度；于此同时，以不添加任何菌粉的猪场污水池为空白对照组。其中，氨氮采用纳氏分光光度法；总氮采用过硫酸钾紫外分光光度法。
C、试验结果
如表3所示，枯草芽孢杆菌菌株CGMCC No. 10055菌粉在氨氮初始浓度为450.63mg/L、总氮初始浓度为480.26 mg/L的污水池中施用24h时后，养殖废水中氨氮浓度下降至224.65mg/L，氨氮去除率为50.15%；总氮浓度下降至265.84 mg/L，总氮去除率为44.65%，空白对照组氨氮浓度与总氮浓度无明显变化。与对照组相比，实验组氨氮浓度下降224.65mg/L，总氮浓度下降214.42 mg/L，说明本发明枯草芽孢杆菌菌株CGMCC No. 10055菌粉能够有效去除氨氮，去除率达到50.15%，有效总氮去除率达到44.65%。从而说明，实际污水虽然成分复杂、有害物质多，增加了微生物脱氮的难度，但是枯草芽孢杆菌菌株CGMCCNo. 10055菌粉对实际污水仍具有较佳的降低氨氮的效果。
表3 枯草芽孢菌株CGMCC No. 10055菌粉对实际污水的脱氮效果（mg/L）
综上可知，在利用本发明的枯草芽孢杆菌CGMCC No. 10055能够快速地减低养殖场废水中的氨氮浓度，成本低廉，能够快速持久地解决养殖场废水带来的环境污染问题。
综上可知，在利用本发明的枯草芽孢杆菌CGMCC No. 10055能够快速地减低养殖场废水中的氨氮浓度，成本低廉，能够快速持久地解决养殖场废水带来的环境污染问题。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (5)
1.一种微生态制剂在降低猪养殖场废水氨氮浓度中的应用，其特征在于，所述微生态制剂由枯草芽孢杆菌CGMCCNo.10055发酵制成；所述发酵的培养基的主要成分为大豆10~30g/L，蔗糖10~30g/L，NaCl 5~10g/L，pH 6.5~8.0；所述枯草芽孢杆菌菌株的活菌数为107-109 CFU/Kg。
2.根据权利要求1所述的微生态制剂在降低猪养殖场废水氨氮浓度中的应用，其特征在于，所述微生态制剂还含有辅料，所述辅料选自沸石粉、硅藻土、米糠、锯末、饼粕粉、秸杆粉、果渣、蘑菇渣、酒糟、糠醛渣和/或茶渣。
3.根据权利要求1所述的微生态制剂在降低猪养殖场废水氨氮浓度中的应用，其特征在于，所述微生态制剂的制备方法包括如下步骤：将所述枯草芽孢杆菌菌种在大豆液体培养基中摇瓶发酵培养，其中，所述的大豆液体培养基的主要成分是：大豆10~30g/L，蔗糖10~30g/L，NaCl 5~10g/L，发酵温度为30~40℃，发酵时间为24~78h，pH值6.5~8.0，转速为150~200rpm，培养完成后，分离取沉淀，按重量比1：10~20与辅料混合，烘干即得。
4.根据权利要求3所述的微生态制剂在降低猪养殖场废水氨氮浓度中的应用，其特征在于，所述微生态制剂的制备方法还包括烘干后粉碎过60~100目筛的步骤。
5.根据权利要求3或4所述的微生态制剂在降低猪养殖场废水氨氮浓度中的应用，其特征在于，所述微生态制剂的制备方法步骤中，所述枯草芽孢杆菌菌种的接种量为体积百分比5~10%。
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