CN105713069B

CN105713069B - 一种溶杆菌素的纯化方法

Info

Publication number: CN105713069B
Application number: CN201610139791.5A
Authority: CN
Inventors: 吴绵斌; 王涛; 林建平; 杨立荣
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2016-03-11
Filing date: 2016-03-11
Publication date: 2019-01-15
Anticipated expiration: 2036-03-11
Also published as: CN105713069A

Abstract

本发明公开了一种溶杆菌素的纯化方法，包括以下步骤：(1)提供生产溶杆菌素的发酵液；(2)除去发酵液中的菌体；(3)以XAD1600树脂为填料，进行第一次吸附层析，以水为流动相，收集合并流穿液和洗脱液I；(4)以SP207树脂为填料，进行第二次吸附层析，以体积浓度大于5％的乙醇溶液为流动相，获得洗脱液II；(5)将洗脱液II浓缩、冻干。本发明纯化方法能够高效低成本地从枯草芽孢杆菌发酵液中纯化提取溶杆菌素，最终得率能够达到89％，并且所得溶杆菌素纯度达到99％，适用于产业化分离提取溶杆菌素。

Description

一种溶杆菌素的纯化方法

技术领域

本发明涉及药物分离提取技术领域，特别是涉及一种溶杆菌素的纯化方法。

背景技术

抗菌肽(AMPs)是一类带正电的两亲性(同时具有疏水性部位和亲水性部位)小分子肽类物质，抗菌肽之间的主要差异在于氨基酸组成和肽链的长度(6～100个氨基酸)。抗菌肽是大多数生物包括人类在内的先天免疫系统不可缺少的一部分。从生物合成角度分析，抗菌肽主要分为两类：非核糖体途径合成的抗菌肽和核糖体途径合成的抗菌肽。从生化性质和结构特点的角度分析，抗菌肽通常分为阳离子抗菌肽、阴离子抗菌肽、芳香族抗菌肽以及来源于氧结合蛋白的肽类。

抗菌肽通常含12～50个氨基酸残基。虽然不同来源的抗菌肽一级结构差异性很大，但也有共性：(1)N端富含极性氨基酸，特别是碱性氨基酸如赖氨酸和精氨酸，这一特征使抗菌肽具有表面活性剂活性；绝大多数抗菌肽的第二位氨基酸残基是色氨酸，它对抗菌肽杀菌活性的高低起着至关重要的作用；(2)C末端通常酰胺化。抗菌肽结构和构型的研究是对抗菌肽进行高效、快捷分离纯化的基础，也是对其进行作用机理和结构改造的前提，目前已有大量基于抗菌肽结构分析与预测对抗菌肽进行从头设计并得到新型、高效、特异抗菌肽的研究报道。

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)能分泌多种具有潜在生物医药工程利用价值的低分子量的抗菌肽和细菌素类的抗菌活性物质，其中包括溶杆菌素(Bacilysin)。溶杆菌素是一种结构最简单的二肽之一，对许多的细菌和真菌具有抑制作用。其分子结构中含有一个N末端的L-丙氨酸和C末端的一个非常见氨基酸L-anticapsin。溶杆菌素被敏感菌株通过细胞壁肽转运酶(peptide permease)转运至胞内，然后被胞内肽酶(peptidase)水解成L-alanine和L-anticapsin，L-anticapsin通过抑制己糖胺通路(hexosaminebiosynthesis pathway)中的第一步关键酶6-磷酸葡萄糖胺合成酶，从而影响细菌肽聚糖(peptidoglycan)和真菌甘露糖蛋白(mannoprotein)合成，导致细胞原生质体或细胞壁裂解来杀死细胞。其杀菌机理独特且具有广谱抗菌活性，因此在医学和农业上具有潜在应用价值。

目前常见的抗菌肽大多来源于细菌的发酵产物。常规的抗菌肽分离与纯化工艺大都存在着以下的不足：(1)由于发酵培养基的成分比较复杂，发酵过程中，经过物理、化学的相互作用培养基各种成分可能会发生进一步的反应，造成发酵终产物成分的变化。(2)通过微生物的自身代谢产抗菌肽时，除了目标产物以外，还会有其他的代谢产物这又会增加提取过程的难度。(3)多肽类分子量小、易酶解、提取工艺复杂，且各种肽类物质的纯化策略因自身理化性质的差异而千变万化，这些令分离纯化存在成本高、得率低、工序繁琐、保活难等问题。

因此，有必要提供一种高效的产业化分离提取抗菌肽的方法，解决传统提取工艺使用过程中所带来的问题。

发明内容

为了解决现有技术中的缺点，本发明提供了一种高效的适合产业化分离纯化溶杆菌素的方法。

一种溶杆菌素的纯化方法，包括以下步骤：

(1)提供生产溶杆菌素的发酵液；

(2)除去发酵液中的菌体；

(3)以XAD1600树脂为填料，进行第一次吸附层析，以水为流动相，收集合并流穿液和洗脱液I；

(4)以SP207树脂为填料，进行第二次吸附层析，以体积浓度大于5％的乙醇溶液为流动相，获得洗脱液II；

(5)将洗脱液II浓缩、冻干。

本发明最关键的部分是两步吸附层析中填料的选择，第一次吸附层析使用的填料为XAD1600，是一种非极性大孔吸附树脂，起初步纯化的作用。当然经过实验，发现选择其他种类的非极性大孔吸附树脂也是可以的，但相对来说效果没有XAD1600那么好。第二次吸附层析使用的填料为SP207树脂，是一种有部分离子交换功能的大孔吸附树脂，经实验发现，选择其他种类的大孔吸附树脂都不能达到要求，所以SP207树脂是必须的。

优选的，所述第一次吸附层析和第二次吸附层析前进行浓缩。浓缩使用纳滤膜过滤器，纳滤膜过滤器可以将处理液中的水分、无机盐等杂质透出，而有效成分由于分子量相对较大而被截留。浓缩后的体积根据层析上样体积需要确定。

所述发酵液由枯草芽孢杆菌发酵获得。溶杆菌素为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)分泌的抗菌肽，所以本发明方法的发酵液获得并不局限于本发明所使用的枯草芽孢杆菌特定菌株。

所述除去发酵液中的菌体的方法为用陶瓷膜过滤器进行过滤。陶瓷膜过滤器具有热稳定性好，耐化学腐蚀性能优越，机械强度高并且过滤效果好等优点。

步骤(3)中第一次吸附层析使用XAD1600树脂为填料，溶杆菌素纯化的模式为流穿模式，即溶杆菌素不与填料结合，而杂质与填料结合，所以使用水为流动相，而溶杆菌素在流穿液和以水为流动相时获得的洗脱液中。

优选的，步骤(3)中，第一次吸附层析洗脱流速为10～25mL/min，洗脱2.5～5BV。最优选的，步骤(3)中，洗脱流速为20mL/min，洗脱3BV。当洗脱流速过快或过慢时，洗脱效果都会变差，而洗脱体积太小则不能将溶杆菌素全部洗脱下来，洗脱体积太大则增加后续处理的工作量。其中BV为所用填料的体积。

步骤(4)中第二次吸附层析使用SP207树脂为填料，溶杆菌素纯化的模式为结合-洗脱模式，即溶杆菌素与填料结合，为提高纯度，一般在洗脱前需要采用水清洗，与填料不结合或结合很弱的杂质在流穿液和以水为流动相清洗时去除，然后用洗脱溶液洗脱获得溶杆菌素，而与填料结合很强的杂质也不能被洗脱下来。

优选的，步骤(4)中，第二次吸附层析洗脱流速为0.3～1BV/h。最优选的，步骤(4)中，洗脱流速为0.5BV/h。

优选的，步骤(4)中，第二次吸附层析上样方法采用静态吸附。优选的，所述静态吸附的时间为100～140min。最优选的，所述静态吸附的时间为120min。

优选的，步骤(4)中，第二次吸附层析上样方法采用动态上样，上样体积≤2.5BV。

优选的，步骤(4)中，洗脱液采用体积浓度10％的乙醇溶液。当乙醇浓度过低时，洗脱强度较弱，洗脱液体积会增加；过高时，容易将杂质也洗脱下来。

本发明在经过小试发酵实验摸索好条件后，使用500L发酵罐这样的中试级发酵实验，相应的，后续纯化步骤也都是在小试摸索条件后，经中试级实验验证的。所以本发明纯化方法适用于溶杆菌素的产业化生产。

本发明纯化方法能够高效低成本地从枯草芽孢杆菌发酵液中纯化提取溶杆菌素，最终得率能够达到89％，并且所得溶杆菌素纯度达到99％，适用于产业化分离提取溶杆菌素。

附图说明

图1为本发明纯化方法工艺路线图；

图2为枯草芽孢杆菌小试实验中一级种子发酵过程中还原性糖、细胞干重、总糖和抗生素效价的变化曲线图；

图3为枯草芽孢杆菌中试生产发酵实验中溶氧、pH和抗生素效价的变化曲线图；

图4为纳滤膜过滤过程滤过液与截留液的液相分析图；

其中1：纳滤膜过滤过程滤过液的液相分析图，2：纳滤膜过滤过程截留液的液相分析图，

图5为SP207树脂静态吸附曲线图；

图6为不同浓度洗脱剂静态解吸SP207树脂曲线图；

图7为bacilysin在SP207树脂上的穿透曲线图；

图8为SP207树脂的动态穿透曲线图；

图9为HPLC-CAD检测bacilysin成品纯度图；

图10为bacilysin成品的质谱图。

具体实施方式

本发明实施例中涉及到的菌株有：

(1)枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ZJU007，保藏于位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中科院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC No.4140，保藏时间2010年9月03日；该菌株已在申请号为201010521030.9，名为“一种枯草芽孢杆菌菌株及其应用”的前期申请专利中公开。

(2)白色念珠菌，保藏于位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中科院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为ATCC10231-3147。

培养基：

(1)斜面培养基：LB培养基。

(2)种子培养基(每L配方)：15g葡萄糖，10g酵母粉，1g K₂HPO₄，0.5g MgSO₄，0.01gFeSO₄，10g NaCl，加H₂O至约800mL，调pH至7.0后加0.4g CaCO₃，定容到1L。

(3)发酵培养基(每L配方)：2.72g酵母粉，26.67g可溶性淀粉，3.95g(NH₄)₂SO₄，2.4g K₂HPO₄，10g NaCl，0.5g MgSO₄，0.72g CaCO₃，0.02g CuSO₄，0.02g FeSO₄，0.02gMnSO₄，加ddH₂O至约800mL，调pH至6.5后定容到1L。

(4)白色念珠菌培养基(每L配方)：20g葡萄糖，10g蛋白胨，20g琼脂，加H₂O溶解，定容到1L。

实施例1枯草芽孢杆菌小量发酵实验

取1环经活化的菌种，接入到种子瓶中，500mL锥形瓶中装100mL培养基，初始pH值7.0，30℃下200RPM培养24h。再将种子液以10％(v/v)的接种量接入到5L发酵罐(装液量为60％)中，发酵罐通气量400L/h，转速200RPM，28℃发酵50h，每隔4h取样一次用于检测。

从图2可以看到，在0～28h阶段pH值一直下降，这主要是因为菌体处于生长期，菌体利用发酵液中的营养物质，呼吸作用释放出CO₂以及分解作用产生有机酸。28～48h阶段pH趋于稳定，此阶段，菌体也处于稳定期。菌体接入发酵罐后，发酵液中的总糖浓度随菌体生长的进行而逐渐下降，在8～28h阶段总糖消耗速度较快，而此时菌体也处于对数生长期，菌体浓度在第28h达到最大，并维持在一个较稳定的水平，直到发酵44h以后才开始下降，可能与菌体在这期间开始发生自溶有关。当菌体快速增长时，发酵液效价也提高很快，说明此菌株产生抗生素过程与菌体生长偶联。发酵过程中发酵液效价在第28h达到最高，确定该菌株的发酵周期为24h。

实施例2枯草芽孢杆菌中试生产发酵实验

取1环经活化的菌种，接入到种子瓶中，2L锥形瓶(2瓶)中装600mL培养基，初始pH值7.0，28℃下200RPM培养10h。再将种子液以4％(v/v)的接种量接入到500L发酵罐(装液量为60％)中，发酵罐通气量43.6m³/h，转速62RPM，28℃发酵10h。此时，将500L种子罐中的发酵液移入3t发酵罐中进行发酵。发酵罐通气量18.3m³/h，转速31RPM，28℃发酵26h。

如图3(1)所示，当种子罐发酵到10h时，溶氧降低到最低，此时菌体生长最为旺盛，已经达到移种的标准。如图3(2)所示，当二级种子移入发酵罐中，经过短暂的适应期后(<4h)，发酵菌株迅速进入生长，溶氧急剧下降，进入指数期。由于细菌发酵过程中，要消耗葡萄糖、淀粉等碳源，除了会产生CO₂，也会产生其他的酸类物质，因此在菌体急剧生长的时候，发酵液的pH会伴随着同时降低。这也在发酵曲线上得到体现。而此时，有效的活性组分也会慢慢的产生。当发酵达到18-20h左右的时候，此时菌体生长达到稳定期，溶氧和pH基本上保持不变，而此时抗生素的产量也即将达到最大。由于微生物产抗生素的同时也会对自身造成影响(例如导致菌体裂解等)，因此在发酵时间达到26h的时候，结束发酵。由发酵曲线可以明显看出，当发酵放大以后，由于传氧、传质等效率的提高，抗生素的产量也会明显的提高(大约提高1000U)。

实施例3抗生素生物效价测定

采用管碟法，将37℃恒温培养2天的白色念珠菌斜面，用30mL无菌生理盐水洗下制成菌悬液，取2mL至100mL于50℃左右的固体培养基中，混匀后吸取20mL至直径9cm的培养皿中，冷却后放置牛津杯于培养基表面，取150μL待测液加入牛津杯中，37℃培养18h，测量透明抑菌圈直径，换算成相应的活性：

制霉菌素标准曲线：r²＝1.2297U-1.58778，R²＝0.9998

(其中U：制霉菌素效价(U/mL)，r：抑菌圈半径(cm)，制霉菌素(效价6593U/mL)，根据以上关系式可以计算抗生素相应的效价。)

实施例4 SP207大孔树脂纯化溶杆菌素条件优化

用SP207大孔树脂(孔体积1.1mL/g，比表面积930m²/g，最频度半径粒度分布≥0.25mm，≥90％，有效粒径≥0.25mm)对经陶瓷膜过滤器和XAD1600非极性大孔吸附树脂纯化后的粗品进行纯化。通过图5可以发现，处理好的粗品采用静态吸附方式时，当吸附时间达到120min的时候，基本上就达到饱和吸附的状态。当达到饱和吸附后，分别将树脂用去离子水清洗2遍。然后分别用5％，10％，20％，30％，50％和70％的乙醇静解吸。从图6中，可以发现，单位质量的解吸液抑菌圈大小随着乙醇的浓度提高，也会有所提高。当乙醇浓度达到10％的时候，其单位质量的抑菌圈最大。表明bacilysin的解吸较为充分，但是当乙醇浓度超过10％的时候，其单位质量的抑菌圈出现下滑的趋势，表明当乙醇增大在将bacilysin洗脱下来的同时，也同时会把一部分吸附到树脂上的杂质也洗脱下来，因此在后续的实验中采用10％的乙醇作为bacilysin洗脱条件。

当对SP207树脂进行动态上样的时候，如图7所示，当上样体积小于2.5BV的时候，基本上bacilysin都能被完全吸附在树脂上。当上样体积在2.5BV到4BV的时候bacilysin的吸附量会慢慢变小，表现在穿透液的抑菌率慢慢的提高，直到树脂达到饱和吸附。因此，在采用动态吸附的时候，SP207色谱柱的上样量定为2.5BV的发酵液处理粗品。通过对洗脱流速进行简单的优化，发现当流速太小或者太大时，bacilysin都不能被有效的洗脱下来，只有当流速适宜(0.5BV/h)时，其洗脱效果比较理想(图8)。并且当流速较小时，还会出现一定的拖尾现象，导致洗脱体积会相应的变大。因此在后续的大规模提取bacilysin时，洗脱流速定为0.5BV/h。

综合上述提取工艺条件的优化，初步确定大规模提取bacilysin的工艺条件为：上样体积2.5BV，洗脱液10％乙醇，洗脱流速：0.5BV/h。

实施例5溶杆菌素纯化

首先将实施例2所得发酵液1.5t利用陶瓷膜过滤器(YNTSH-ST-M1，过滤孔径范围为0.05～1.4μm)进行过滤，将发酵液中的菌体过滤掉，并回收滤过液共获得1.7t(由于发酵液过完陶瓷膜过滤器后还有大量发酵液在陶瓷膜过滤器里面，需要用纯水冲洗陶瓷膜过滤器，所以造成过滤后的体积比过滤前大)。由表1效价测试结果可以发现，陶瓷膜过滤基本不会对发酵液中的有效成分，即抗菌肽bacilysin造成损失。表明该过程的有效性。

利用纳滤膜过滤器(杭州瑞纳膜工程有限公司，RM-T-1，截留分子量200)将滤过液进行浓缩，浓缩后所得浓缩液体积为500L。将上述浓缩液，进行XAD1600非极性大孔吸附树脂(200L，AMBERLITE XAD^TM，XAD1600，比表面积≥800m²/g，特征孔径调和粒径350～450μm，均一系数(D90/D40)≤1.25)层析，上样方式为动态上样，流速为160L/h，上样完成后首先用纯水做流动相，流速20mL/min，洗脱3BV，然后用80％(v/v)的乙醇做流动相洗脱3BV，分别收集水溶性与脂溶性部位，其中，溶杆菌素在水相中，体积400L。取样水溶性与脂溶性部位，分别测定其干重与抑菌活力，结果如表1所示。由表1可以发现，发酵液中大约有37.3％的极性物质被吸附到大孔树脂上，而目标产物在这一过程中几乎没有损失。

表1发酵液预处理结果分析表

*效价测试时，所有样品的体积调整到与原发酵液一致。

将通过大孔树脂XAD1600处理的发酵液，再经过纳滤膜过滤器浓缩(杭州瑞纳膜工程有限公司，RM-T-1，截留分子量200)，浓缩后所得浓缩液体积为400L。为了验证该步骤的有效性，分别对滤过液和截留液进行抗真菌实验，结果滤过液未发现具有抗真菌活性。进而又通过液相色谱检测，也未在纳滤过程中滤过液中检测到bacilysin(图4(1))，而在截留液中能够检测到bacilysin的存在(图4(2))。证明纳滤浓缩工艺可应用在此bacilysin的提取过程中。

用SP207大孔树脂按上述优化条件对浓缩后的粗品进行纯化，获得洗脱液体积150L。

将所得洗脱液用纳滤膜过滤器浓缩，浓缩到12L。利用真空冷冻干燥机，对得到的样品进行冻干。最终得率达到89％。

实施例6 bacilysin成品确认和纯度检测

分别利用高效液相色谱与电喷雾检测器连用的方法，对得到的bacilysin样品进行纯度的检测以及质谱的测定。由图10的质谱图可以确定，得到的样品即为bacilysin，分子量为270。进而由图9可以表明得到的样品纯度达到99％以上。

Claims

1.一种溶杆菌素的纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)提供生产溶杆菌素的发酵液；

(2)除去发酵液中的菌体；

(5)将洗脱液II浓缩、冻干，

所述发酵液由枯草芽孢杆菌发酵获得。

2.如权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，第一次吸附层析和第二次吸附层析前进行浓缩。

3.如权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述除去发酵液中的菌体的方法为用陶瓷膜过滤器进行过滤。

4.如权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，步骤(3)中，第一次吸附层析洗脱流速为10～25mL/min，洗脱2.5～5BV。

5.如权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，步骤(4)中，第二次吸附层析洗脱流速为0.3～1BV/h。

6.如权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，步骤(4)中，第二次吸附层析上样方法采用静态吸附。

7.如权利要求6所述的纯化方法，其特征在于，所述静态吸附的时间为100～140min。

8.如权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，步骤(4)中，第二次吸附层析上样方法采用动态上样，上样体积≤2.5BV。

9.如权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，步骤(4)中，洗脱液采用体积浓度10％的乙醇溶液。